stammzüchtung - ftp.tugraz.at
TRANSCRIPT
![Page 1: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/1.jpg)
Stammzüchtung
Selektion von natürlichen Varianten
Ungerichtete genetische Veränderungenzufallsverteilte induzierte Mutagenese
Kreuzungen – genetische RekombinationSexuelle KreuzungenInduzierte Zellfusionparasexuelle Systeme (Konjugation, Transduktion, Transformation)
(Gezielte) Genmanipulationen – Gentechnikin vitro Rekombination von DNA-Fragmenten
Einbau und funktionelle Expression von zusätzlicher DNA in Organismeneigenständig replizierende Vektoren – Integration in Chromosomen
Entfernen/Ausschalten von Geninformationin vitro Mutagenese (Gene für spezifische Proteine / Enzyme)
stellenspezifisch - random („directed evolution“)
![Page 2: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/2.jpg)
Gentechnische Modifikation
Ungerichtete MutationKreuzung
Gerichteter Transfer von zusätzlicher Geninformation
Verändern vonvorhandener Geninformation
Zufällige Kombination von Genen ausverschiedenen Individuen
Ungerichtete MutationKreuzung
Gentechnische Modifikation
![Page 3: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/3.jpg)
Zufallsverteile Mutationen BasensubstitutionenDeletionenInsertionen
Induzierte Mutagenese
- Behandlung mit ChemikalienAlkylierende SubstanzenBasenanaloge
- Einsatz von energiereicher StrahlungUVIonisierende Stahlung (Röntgen, )
![Page 4: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/4.jpg)
Evolutionäre Stammentwicklung
Herstellung von Variantenpools
Analyse einer geeigneten Anzahl von Klonen auf gewünschte EigenschaftSelektionsverfahrenScreeningverfahren
Auswahl von “Hits”
Re-screening – Bestätigung der verbesserten Eigenschaft
Weitere Runden
Einsatz in Laborprozess
Scale-up
![Page 5: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/5.jpg)
Screening – SelektionErkennen/Analyse – Wachstumsvorteil
Individuelle Auslese
Hoher Durchsatz – high throughput• Hoher Durchsatz an Klonen• geeignete analytische Verfahren• Automatisierung
Methoden:SchüttelkolbenverfahrenPlattentests auf EinzelkolonieebeneMikrotiterplattenverfahrenVerfahren auf Einzelzellebene - FACS
Rationales Screening und Selektionsverfahren
Gezielte, auf biochemischem/genetischem Wissen basierende Verfahren• Isolierung gezielter Stoffwechselmutanten• Reportersysteme• Wachstumsvorteil von gesuchten Mutanten• Genomics – Proteomics – Metabolomics
![Page 6: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/6.jpg)
Generation of Variants* Mutation* Recombination* Recombinant DNA
![Page 7: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/7.jpg)
Rationale Ansätze fürStammverbesserung
Wissen um ZusammenhängeIm Stoffwechsel
Regulation
Regulation der Genexpression
Regulation der Enzymaktivität
![Page 8: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/8.jpg)
Rationale Ansätze fürStammverbesserung
Wissen um Zusammenhängebei der Funktion vonim Stoffwechsel beteiligten Enzymen
Regulation der Enzymaktivität
![Page 9: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/9.jpg)
Renneberg, Biotechnologie für EinsteigerElsevier Spektrum, 2006
Ausschalten der Feedback-Regulation
![Page 10: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/10.jpg)
Anthranikian, Angewandte MikrobiologieSpringer 2006
Screening -Rationale Elemente
Auxotrophe Mutanten
Antimetabolit-resistente Mutanten
![Page 11: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/11.jpg)
Rekombinationsgenetik
Gezieltes Kreuzen von Organismen
Zellfusionen
Gentransfer durch parasexuelle Mechanismen
Immer notwendig:
Screening - Selektion
![Page 12: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/12.jpg)
Rekombinante DNA Technologie
Transgene Mikroorganismen
Transgene Pflanzen
Transgene Tiere
Gentherapie am Menschen
GVO
Gezielte Handhabung von Geninformation
![Page 13: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/13.jpg)
Herstellen von rekombinanten DNA Molekülen (Klonieren)
isolierteVektorDNA
geschnitteneVektor DNA
Ligation mitDNA Ligase
DNA Fragmente
Schneiden mit Restriktionsenzym
Einbringen in lebende Zellen
Ampr
Ampr
ori
orirekombinantesDNA Molekül
Amprori
![Page 14: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/15.jpg)
![Page 16: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/16.jpg)
Gewinnung von DNA Fragmenten
Isolierung aus Organismengesamte genomische DNADNA aus OrganellenMetagenomische DNAcDNA (über RNA)
PCR – Polymerase Kettenreaktionspezifische Genehomologe Familien (degenerierte Primer)
GensyntheseOligonukleotidesynthetische Gene
![Page 17: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/17.jpg)
Gentechnik – DNA Technologie
Jede mögliche Sequenzstruktur durchchemische de novo DNA Synthese
![Page 18: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/18.jpg)
Polymerase Chain Reaction
Leichter Zugangzu Genmaterial
Gentechnik – DNA Technologie
Primer-Annealing
PCR
Template-DNANukleotide
DNA Polymerase
Primer
t
T
Denaturierung
DNA Synthese
Thermocycler
![Page 19: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/19.jpg)
Stellenspezifische Mutagenese
******GAATTCCCGTACGATACATGAT******
******CTTAAGGGCATGCTATGTACTA****** CCGTACTATAC
CCGTACTATAC |||||| ||||
******CTTAAGGGCATGCTATGTACTA******
******GAATTCCCGTACTATACATGAT******
******CTTAAGGGCATGATATGTACTA******
DNA Stränge trennen undsynthetisches Oligonukleotidmit veränderter Basensequenzanlagern
in vitro Synthese des 2DNA Strangs, ausgehend vomsynthetischem Oligonukleotid
Gezielte Veränderung von Geninformation
![Page 20: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/20.jpg)
PromoterStructural gene
Terminator
Pre-/Signal Sequences
Selection marker
Replication genes
Expression Cassette
Vector
Fusion Domains / Tags
Regulator Region
Integration
Selection marker
E.coli
Replication genes
![Page 21: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/21.jpg)
Stammkonservierung
Serieller Transfer
Luftabschluss• Lagerung unter Mineralöl
Trocknungsverfahren• Trocknen an festen Trägern (Glaskugeln, Silicagel, Papier, Porcellan, Erde, etc)• Gefriertrocknen mit Schutzmedien (Milchpulver, etc)
Kryoverfahren• einfache gekühlte Lagerung (0 – 4 °C)• Einfrieren mit Schutzmedien (DMSO, Glycerin)
- schockgefrieren- einfrieren bei kontrollierten Raten- Tiefkühlschranklagerung (-20°C, -70°C)- Lagerung in flüssigem Stickstoff)
Erhalt der Leistungen von Biosystemen
Geeignete Verfahren
![Page 22: Stammzüchtung - ftp.tugraz.at](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac729afea7c50c3f0bd45a/html5/thumbnails/22.jpg)