STOMATOLOŠKI FAKULTET UNIVERZITET U BEOGRADU

Matične ćelije

Prof.dr Vesna Danilović

stem ćelije

definicija

Matične ćelije predstavljaju nespecijalizovane ćelije koje imaju neograničenu sposobnost samoobnavljanja sopstvene populacije i mogućnost diferenciranja u veći broj specijalizovanih ćelija.

Najvažnije osobine

1. Neograničena sposobnost samoobnavljanja sopstvene populaciji

2. Mogućnost da se diferenciraju u različite ćelijske tipove (potentnost)

broj deoba fibroblasta čoveka in vitro je ograničen Hayflick-ov limit

Hayflick L. 1965

• Samoobnavljanje: obavezna asimetrična deoba, jedna ćelija ostaje identična majci, a druga se dalje diferencira.

• Stohastička diferencijacija: jedna ćerka ćelija razvija se u pravcu terminalno diferencirane ćelije, a druga se simetrično deli na dve identične stem ćelije

Life Sciences-HHMI Outreach. Copyright 2006 President and Fellows of Harvard College.

differentiatedcell

Self-renewal

Stem Cell

CellStem

Differentiation

Hijerarhija stem ćelija

• Totipotentne– imaju sposobnost diferencijacije u sve ćelijske tipove uključujuči i ekstraembrionalne strukture.

• Pluripotentne – imaju sposobnost diferencijacije u ćelije sva tri klicina lista.

• Multipotentne – imaju sposobnost diferencijacije u različite somatske ćelije.

• Unipotentne – imaju sposobnost diferencijacije u jedan tip ćelije.

Tipovi stem ćelijaEmbrionalne – potiču iz unutrašnje ćelijske mase

blastociste. Fetalne – potiču iz placente ili pupčane vrpceSomatske/adultne – nediferencirane ćelije u

odredjenim delovima “zrelih” tkiva. iPS ćelije – indukovane pluripotentne stem ćelije

generisane postupkom REPROGRAMIRANJA diferenciranih ćelija (npr. kloniranje)

embrionalne stem ćelije embrionalne ćelije karcinoma embrionalne germinativne ćelije

Vrste pluripotentnih stem ćelija

PRVA NEDELJA RAZVIĆAbrazdanje zigota, morula, blastocista, decidualna

reakcija

• 1. dana – 2 blastomere• 2. dana – 4 blastomere• 4. dana – 16/32

blastomere, obavijene zonom pelucidim - morula

5. dana formira se blastocista

• šupljina – blastocela• unutrašnja ćelijska masa

- embrioblast – embrion, amnion, alantois i žumančana kesa

• omotač – trofoblast – deo placente i horion

Embrionalne vs adultne stem ćelijepro et contra

• Totipotentne• Veliki broj• Izazivaju imunu reakciju• Pravne i etičke dileme

• Multi/pluripotentne• Limitiran broj, teška

izolacija• Nema imune reakcije –

autologne ćelije

embrionalne stem ćelije - protiv

• Teško ih je izolovati i kultivisati in vitro• Teško je održati čistu kulturu• Potencijal za tumorogeni rast i destrukciju tkiva

(sličnost sa adultnim stem ćelijama)• Problemi sa funkcionalnom diferencijacijom• Imunološka netolerancija• Skromni rezultati na animalnim modelima• Etički problemi

• Upotreba genetski i epigenetski nestabilnih embrionalnih stem ćelija štetna je po ljudsko zdravlje,

iPS ćelije – indukovane pluripotentne stem ćelije: reprogramiranje

Laboratorijski postupak kojim se funkcionalno zrele ćelije “reprogramiraju” i dobijaju karakteristike embrionalnih stem ćelija (indukovane pluripotentne stem ćelije IPS)

Nobelova nagrada za fiziologiju i medicinu 2012.

“Magic four”

uvodjenjem samo četiri gena: OCT3/4, Sox2, c-Myc, Klf4 postiže se dediferenciranje (Takahashi i Yamanaka, 2006)

Lokalizacija adultnih stem ćelija – uloga “niše”

• Adultne stem ćelije i progemitorne ćelije naseljavaju odredjena područja koja se označavaju kao ćelijske niše

• Niše funkcionišu kao mikrosredina koja reguliše rast i diferencijaciju rezidentnih stem ćelija

• Mutacije ćelija, signali koje primaju i promene u mikrosredini aktiviraju stem ćelije

Uloga “niše”

• Mirovanje• Samoobnavljanje• Diferencijacija• Migracija• Apoptoza

Uloga niše

Homeostaza u niši: ravnoteža izmedju samoobnavljanja i diferencijacije

• Veza izmedju ćelija niše, stem ćelija i komponenti matriksa ostvaruje se preko adhezivnih proteina- kadherina i β katenina

• Niša generiše faktore koji učestvuju u kontroli broja, proliferacija i determinacije stem ćelija.

• Razvojni signalni putevi i molekuli hh, Wnt, BMPs, FGF i Notch imaku ključnu ulogu u ravnoteži izmedju nediferenciranog i diferenciranog stanja.

• U normalnim uslovima niša čuva stem ćelije u “mirujućem” stanju, tako što obezbedjuje antiproliferativne signale.

• Bilo koja mutacija koja dovodi do rezistencije na antiproliferativne signale ili nezavisnost od njihovog delovanja može prouzrokovati nekontrolisanu proliferaciju ćelija i potencijalnu tumorogenezu

• Signali iz niše sprečavaju proliferaciju i diferencijaciju.• Mutacije iz ćelija niše ili stem ćelija dovode do

nekontrolisane proliferacije i moguće tumorogeneze.

• TGF β (transformig growth beta) i BMP (bone morphogenetic proteins) imaju snažan antiproliferativni efekat na ćelije.

• Wnt molekuli promovišu proliferaciju ćelija.• Narušavanje odnosa BMP/wnt je narušavanje

odnosa izmedju antiproliferativnih i proliferativnih signala,

Hemijski faktori niše

• Hormoni (npr parathormon, koji trigeruje BMPs koji ispoljavaju uticaj na diferencijaciju osteoblasta) Yu et al. , 2012.

• Joni (npr. kalcijum, koji utiče na naseljavanje koštane srži hemopoetskim ćelijama) Wang LD et al., 2011.

• ROS molekuli (reactive oxidative specimens), koji u malim koncentracijama promovišu samoobnavljanje progenitornih neuronskih ćelija. Kennedy et al., 2012.

Fizički faktori niše

• 1. oblik ćelije (npr. okrukli oblik favorizuje adipogenezu, dok ljuspast osteogenezu) McBeath et al., 2004.

• 2. elasticitet ECM (npr. elasticitet koštanog tkiva 10-100 Kpa favorizuje osteogenezu, dok elasticitet mozga od nekoliko stotina Kpa favorizuje neurogenezu) Engler AJ, et al., 2006.

• 3, topografska površina ECM (npr. nanotopografske karakteristike skafolda kod koštanih supstituenata favorizuju osteogenezu) Dalby et al., 2007.

Fizički faktori niše

• 1. sile istezanja i kompresije (Terraciano et al., 2007)

• 2. hidrostatski pritisak (Liu et al., 2010)• 3. sila gravitecije (Yuge et al., 2006)• 4. elektromagnetno polje (Tsai et al., 2009)• 5. parcijalni pritisak kiseonika (Serena et al.,

2009)

Osobine adultnih stem ćelija: Dediferencijacija

osobina somatskih MĆ/progenitornih ćelija da se vrate u prethodni, primitivniji stadijum, a zatim da se difereciraju u pravcu druge ćelijske linije

Transdiferencijacija:

sposobnost adultnih MĆ da se direktno, bez nakova dediferencijacije, diferenciraju u pravcu odredjenih ćelijskih linija

plasticitetOsobina MĆ da se transdiferenciraju u različite (brojne) ćelijske tipove pod uticajem transkripcionih regulacionih mehanizama. Heyworth C et al., 2002

1961. godina, tad je počelo…

Ernest Mc Culloh i James Till (1961) – prva funkcionalna klasifikacija MĆ u hemopoetskom sistemu što je postavilo temelj za dalja istraživanja u oblasti MĆ

Matične ćelije hematopoezeNajbolje proučene matične ćelije

Jedine koje se primenjuju u terapijske svrhe

Pogled unazad

• Kleinsmith i Pierce (1964) – otkriće MĆ u teratokarcinomima

• Evans i Kaufman (1981); Martin (1981) – izolovane su MĆ iz mišijih embriona i opisana je tehnika njihove kultivacije in vitro

• Thomson i sar. (1998) – izolovane su i kultivisane MĆ iz humanih blastocista

Pogled unazad

• Rebinhuoff i sar (2000); Cown i sar (2004) – ćelije iz humane blastociste koje se u diferencijacionom medijumu razvijaju u embrioidna telašca

• Korišćenjem ove metode dobijen je veliki broj linija embrionalnih matičnih ćelija koje imaju normalan kariotip, imaju visoku telomeraznu aktivnost, eksprimiraju markere karakteristične za matične ćelije i održavaju potencijal za diferencijaciju in vitro i in vivo.

Membranski markeri embrionalnih ćelija

1. SSEA markeri (stage specigic embryonic antigen). SSEA-3 je najizraženiji kod najprimitivnijih embrionalnih ćelija, dok je SSEA -1 karakterističan za proces diferencijacije

2. TRA (tumor rejection antigen) 3. CD9 – (cluster of diferentiation)4. HLA-1 (human leukocyte antigen)

Vrste adultnih stem ćelija

Hemopoetske stem ćelije: krv i imuni sistemMezenhimalne stem ćelije: koštano tkivo, hrskavice,

masno tkivo, tetive/ligamentiNeuralne stem ćelije: neuroni, glija ćelijeEpitelne stem ćelije: koža, sluznice

Mezenhimne matične ćelije (MMĆ)

• Freidenstain i sar, 1968 – predpostavio postojanje multipotentnih prethodnika nehemopoetskih MĆ

• Owen, 1985 – sistem stromalnih ćelija koje imaju mogićnost samoobnove i diferenciranja u različite ćelije (osteociti, hondrociti, adipociti i glatke mišićne ćelije)

• Caplan, 1991 – prvi upotrebio termin Mezenhimalne matične ćelije

Funkcionalne ososbine MMĆ

• MMĆ ne naseljavaju samo tkiva mezenhimnog porekla, a njihov potencijal za diferencijaciju je daleko širi (neuroni – ektoderm, insulociti - endoderm), tako da naziv ne odražava njihovu pravu prirodu.

• Ima ih u placenti, krvi pupčanika, masnom tkivu, pulpi zuba, potpornom aparatu zuba, koštanoj srži.

• Pokazuju niz sličnosti, ali i značajne razlike (Kern, 2006, Stenderup, 2003.)

Standardi za definisanje humanih MMĆ International Society for Cellular Therapy/

ISCT:

• 1. adherentnost za plastičnu podlogu pri standardnim uslovima kultivisanja

• 2. specifična ekspresija površinskih markera• 3. multipontentni potencijal diferencijacije (tri

mezenhimalne linije: osteoblasti, hondroblasti i adipociti)

Funkcionalne ososbine MMĆ

• Krajem devedesetih godina prošlog veka dokazana je njihova sposobnost diferencijacije u ćelije mezodermalnog, ali i ektodermalnog i endodermalnog porekla (Pittinger i sar. 1999)

Mobilisane MMĆ, pod uticajem faktora sredine ispoljavaju najmanje tri uloge u regeneraciji tkiva:

• 1.uloga tkivno specifične ćelije - npr. miokardiocite, glatke mišićne ćelije i endotelne ćelije (Gojo i sar. 2003; Psaltis i sar. 2008.)

• 2. funkcionalnih ćelija koje stvaraju mikrosredinu, neophodnu za regeneraciju (Aronin i Tuan, 2010)

• 3. regulatorne ćelije koje ispoljavaju trofičku i imunomodulatornu ulogu (Ankrum i Karp, 2010)

MMĆ poseduju antiinflmatorna i imunomodulatorna svojstva

• Nizak stepen ekspresije histokompatibilonog kompleksa (MHC) ima za posledicu izostanak aktivacije limfocita (Le Blanc i Rindgen, 2007)

• MMĆ suprimiraju aktivaciju i proliferaciju T i B Ly ( Jonnes i sar, 2007).

• MMĆ luče antiinflamatorne i antiapoptotične molekule (Le Blanc i Rindgen, 2007)

Mogućnost korišćenja transplantacije MMĆ u terapiji

• GVHD (graft versus host disease)• Autoimune bolesti: diabetes tipa 1 (Florina i

sar., 2009); reumatoidni artritis (Bouffi i sar., 2009); sistemski lupus eritematozus (Zhang i sar., 2010); multipla skleroza (Martino i sar., 2010)

Uloga MMĆ u regeneraciji

• Trofička uloga se ostvaruje preko trofičkih molekula: glikoproteina EEM, citokina i faktora rasta (Ankrum i Karp, 2010)

• Trofička uloga se ostvaruje putem direktnog kontakta sa ćelijama tkiva koje su naselile. Taj mehanizam nije sasvim razjašnjen (Plotnikov i sar., 2008)

• U inicijalnim fazama povrede onemogućena je diferencijacija MMĆ (van Poli i sar., 2008.)