Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)

● Fluoreszenzmikroskopie

● Funktionsweise von STORM

● Nutzen von STORM

● Auswertung

● Experimente

● Ausblick

● Fazit

● Quellen

Fluoreszenzmikroskopie

Aufbau:

Fluoreszenzmikroskopie

Fluoreszenzfarbstoffe

Probe Ex(nm) Em(nm) MW Quantum yield

Cy2 489 506 714 0.12

Cy3 (512);550 570;(615) 767 0.15

Cy3B 558 572;(620) 658 0.67

Cy5 (625);650 670 792 0.28

Cy5.5 675 670 792 0.23

Cy7 743 767 818 0.28

Ex: Excitation (Anregung); Em: Emission; MW: Molecular weight

Funktionsweise von STORM

Funktionsweise von STORM

Nutzen von STORM

● Auflösung liegt weit unter der Beugungsgrenze (Motivation):

- Klassisch: ca. 500 nm Auflösung (vgl. Wellenlänge)

- mit STORM: ca. 20 nm Auflösung (50 nm in z-Richtung)

Nutzen von STORM

● Auflösung liegt weit unter der Beugungsgrenze (Motivation):

- Klassisch: ca. 500 nm Auflösung (vgl. Wellenlänge)

- mit STORM: ca. 20 nm Auflösung (50 nm in z-Richtung)

● Messung ist nichtinvasiv (photobleaching)

Nutzen von STORM

● Auflösung liegt weit unter der Beugungsgrenze (Motivation):

- Klassisch: ca. 500 nm Auflösung (vgl. Wellenlänge)

- mit STORM: ca. 20 nm Auflösung (50 nm in z-Richtung)

● Messung ist nichtinvasiv (photobleaching)

● geringe Messdauer

Nutzen von STORM

● Auflösung liegt weit unter der Beugungsgrenze (Motivation):

- Klassisch: ca. 500 nm Auflösung (vgl. Wellenlänge)

- mit STORM: ca. 20 nm Auflösung (50 nm in z-Richtung)

● Messung ist nichtinvasiv (photobleaching)

● geringe Messdauer

● 2-farbige Aufnahmen sind machbar

Nutzen von STORM (Auflösung)

Mikrotubuli sind als

röhrenförmige Proteinfilamente

Bestandteil des Cytoskeletts

eukaryotischer Zellen.

Sie dienen der mechanischen

Stabilisierung der Zelle und

sind verantwortlich für ihre

äußere Form.

Auswertung

1. Point spread function (PSF)

eines einzelnen Cy5-Moleküls:

- Gaußscher Fit über PSF ergibt

die registrierte Position (siehe 2.)

Nach 20 Durchgängen:

2. Registrierte Positionen eines

einzelnen Cy5-Moleküls:

20 nm

Flu

ores

cenc

e ( p

hoto

ns) 500

100

200

300

400

0

0

500

-500-1000

x – Achse [nm]

0

-500

5001000

y - Achse [nm]

Auswertung

3. Korrigierte Positionen eines

einzelnen Cy5-Moleküls

aufgrund von sample drift:

4. Histogramm der

Standardabweichung für

die Position eines einzelnen

Cy5-Moleküls:

20 nm

Standard deviation (nm)

Num

ber

of m

olec

ules

0

2

4

6666

8

10

12

20 4 6 8 10 12 14 16

Auswertung

5. Messungenauigkeit

σ = √[s2/N + a2/(12N) + 8πs4b2/(a2N2)] ≈ s/√N

s: Standardabweichung (siehe 4.)N: Anzahl der Photonen (siehe PSF)

a: Pixelgröße

b: Standardabweichung des Hintergrundrauschens

(theoretisch ist bei ca. 15.000 gesammelten Photonen unter idealen Bedingungen eine Auflösung von 1-2 nm möglich)

Experimente

● Auflösung in x-y-Ebene:

20-30 nm● Auflösung in z-Richtung:

50-75 nm● Radiale Reichweite:

500 nm● Reichweite in z-Richtung:

800 nm

Experimente

Experimente

● Drei individuelle DNA-Stränge werden mit zwei Cy3-Cy5 Paaren in einem Abstand von 135 (129, 100) Basenpaaren gekoppelt und mit Biotin an einer Streptavidin-Oberfläche befestigt. Cy3 dient der “Erholungsrate“ von Cy5.

Experimente

● Drei individuelle DNA-Stränge werden mit zwei Cy3-Cy5 Paaren in einem Abstand von 135 (129, 100) Basenpaaren gekoppelt und mit Biotin an einer Streptavidin-Oberfläche befestigt. Cy3 dient der “Erholungsrate“ von Cy5.

Fra

ctio

n of

mo l

ecul

es

Inter-switch distance (nm)

Experimente

Vier Cy3-Cy5 Paare auf einem DNA-Strang im Abstand von jeweils 46 nm. Unterschiedliche Paar bekommen zur besseren Unterscheidbarkeit unterschiedliche Symbole.

- Theoretische Präzision von 4 nm

- Gemessene Präzision von 8 nm

- Präzisionsverlust wegen nicht perfekter Korrektur des Drifts

20 nm 20 nm

Experimente

Kreisförmiger mit RecA beschichteter DNA-Strang, auf dem mit Fluoreszenzfarbstoff versehene Antikörper sitzen. Obere Aufnahmen wurden mit einem Reflektionsmikroskop gemacht.

300 nm 300 nm

Experimente

Weiße, gelbe und blaue

Pfeile zeigen uns Inter-

aktionen und Dehnungen

unterschiedlicher

Adhäsionskomplexe

einer lebenden Zelle.

Ausblick

● Verbesserung von STORM zu dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy)

- Größere Nutzung von herkömmlichen Farbstoffen, die nicht als Paar benutzt werden müssen (vgl. Cy5-Cy3 Paar) und durch Oxidation und Reduktion (ROXS) zum Leuchten gebracht werden.

- Bessere Beobachtung von lebenden Zellen möglich.

Fazit

● Bei kleinem Bereich langsamer als z.B. STED, bei größeren Bereichen hingegen schneller → große Bilder möglich.

● Viel höhere Auflösung als “normale“ Lichtmikroskopie.

● Ein Bild bei höchster Auflösung dauert nur wenige Minuten.

● Nichtinvasive Technik für lebende Zellen.

● 3D-Bilder mit guter Auflösung.

→ → Schnelle, praktikable und hochauflösende Schnelle, praktikable und hochauflösende Mikroskopietechnik!Mikroskopietechnik!

Quellen

● http://www.sciencemag.org/content/324/5933/1428.full

● http://www.microscopyu.com/articles/superresolution/stormintro.html

● https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fluoreszenzmikroskopie_2008-09-28.svg

● Video: http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/superresolution/storm/