streptococcus lactis

8/3/2019 Streptococcus Lactis

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V o l . 1 5 7 , N o . 1OURNAL O F B A C T E R I O L O G Y , J a n . 1 9 8 4 , p . 2 8 - 3 40 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 4 / 0 1 0 0 2 8 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 4 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

P r o p e r t i e s o f a S t r e p t o c o c c u s l a c t i s S t r a i n T h a t F e r m e n t s L a c t o s eS l o w l yVAUGHAN L . CROW* AND TERENCE D . THOMAS

N ew Z e a l a n d D a i r y R e s e a r c h I n s t i t u t e , P a l m e r s t o n N o r t h , N ew Z e a l a n dR e c e i v e d 1 1 J u l y 1 9 8 3 / A c c e p t e d 6 O c t o b e r 1 9 8 3

S t r e p t o c o c c u s l a c t i s 7 9 6 2 , w h i c h f e r m e n t s l a c t o s e s l o w l y , h a s a l a c t o s e p h o s p h o e n o l p y r u v a t e - d e p e n d e n tp h o s p h o t r a n s f e r a s e system a n d l o w p h o s p h o - p - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y , i n a d d i t i o n t o h i g h P - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t y . L a c t o s e 6 ' - p h o s p h a t e a c c u m u l a t e d t o a h i g h c o n c e n t r a t i o n ( > 1 0 0 m M) i n c e l l s g r o w i n g on l a c t o s e .I n c o n t r a s t , l a c t i c s t r e p t o c o c c i , w h i c h f e r m e n t l a c t o s e r a p i d l y a n d us e o n l y t h e l a c t o s e - p h o s p h o t r a n s f e r a s es y s t e m f o r u p t a k e , c o n t a i n e d h i g h p h o s p h o - p - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y a n d l o w c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 9 t o 1 . 6 m M)o f l a c t o s e 6 ' - p h o s p h a t e . I t i s c o n c l u d e d t h a t r a t e - l i m i t i n g p h o s p h o - p - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i s p r i m a r i l yr e s p o n s i b l e f o r d e f e c t i v e l a c t o s e m e t a b o l i s m i n S . l a c t i s 7 9 6 2 .T h e p r i n c i p a l r e q u i r e m e n t o f l a c t i c s t r e p t o c o c c i ( S t r e p t o -c o c c u s c r e m o r i s a n d S t r e p t o c o c c u s l a c t i s ) u s e d a s s t a r t e r s i nm i l k f e r m e n t a t i o n s i s t h e r a p i d a n d h o m o l a c t i c f e r m e n t a t i o n

o f l a c t o s e . S t a r t e r s t r a i n s , w h i c h h a v e d o u b l i n g t i m e s o f3 2 t o 4 4 m i n w h e n g r o w i n g o n l a c t o s e i n c o m p l e x b r o t h( 2 2 ) , t r a n s p o r t l a c t o s e v i a a p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ( P E P ) -d e p e n d e n t p h o s p h o t r a n s f e r a s e s y s t e m ( P T S ) ( 1 6 , 2 6 ) . T h el a c t o s e - p h o s p h a t e ( L a c - 6 ' P ) f o r m e d i s h y d r o l y z e d b y p h o s -p h o - p - g a l a c t o s i d a s e ( P - P - G a l ) ( 1 2 ) , g i v i n g D - g l u c o s e a n d D -g a l a c t o s e 6 - p h o s p h a t e ( G a l - 6 P ) ( 2 6 ) . G a l - 6 P i s f u r t h e r m e t a b -o l i z e d t o t r i o s e p h o s p h a t e s b y t h e t h r e e e n z y m e s ( F i g . 1 ) o ft h e D - t a g a t o s e 6 - p h o s p h a t e ( T a g - 6 P ) p a t h w a y ( 2 ) . T h e l a c -t o s e - s p e c i f i c c o m p o n e n t s o f t h e P T S , P - P - G a l ( 1 7 ) , t o g e t h e rw i t h t h e e n z y m e s o f t h e T a g - 6 P p a t h w a y ( 4 ) , a r e c o d e d o n as i n g l e p l a s m i d i n s o m e s t a r t e r s t r a i n s .I n c o n t r a s t t o s t a r t e r s t r a i n s , s o m e S . l a c t i s s t r a i n s f e r m e n tl a c t o s e s l o w l y a n d p r o d u c e a v a r i e t y o f e n d p r o d u c t s ( 6 ) .T h e s e s t r a i n s , w h i c h h a v e b e e n d e s i g n a t e d w i l d t y p e s ( 6 ) ,a r e o f t e n a s s o c i a t e d w i t h p l a n t m a t e r i a l i n w h i c h f a s t f e r m e n -t a t i o n o f l a c t o s e ( a m a m m a l i a n s u g a r ) w o u l d n o t b e as e l e c t i v e a d v a n t a g e . W i l d - t y p e s t r a i n s c o n t a i n b o t h P - P - G a la n d P - g a l a c t o s i d a s e ( p - G a l ) ( 6 ) , w h e r e a s t h e a c t i v i t i e s o f t h el a c t o s e - P T S a n d t h e T a g - 6 P p a t h w a y e n z y m e s h a v e n o t b e e nd e t e r m i n e d . DNA h y b r i d i z a t i o n d a t a s u g g e s t t h a t w i l d - a n ds t a r t e r - t y p e s t r a i n s a r e i n d i s t i n g u i s h a b l e ( 9 ) a n d t h u s mayd i f f e r o n l y i n t h e i r p a t h w a y f o r l a c t o s e m e t a b o l i s m . I t h a sb e e n s u g g e s t e d t h a t s t a r t e r - t y p e o r g a n i s m s a r e o f r e c e n to r i g i n ( 1 1 ) a n d t h a t t h e i r e v o l u t i o n h a s i n v o l v e d a c q u i s i t i o no f t h e l a c t o s e p l a s m i d b y w i l d - t y p e s t r a i n s ( 1 7 ) , t h u s a l l o w i n gt h e a d a p t a t i o n t o m i l k f e r m e n t a t i o n .T h e b e s t - s t u d i e d s t r a i n t h a t f e r m e n t s l a c t o s e s l o w l y i s S .l a c t i s 7 9 6 2 , w h i c h w a s o r i g i n a l l y i s o l a t e d f r o m m i l k ( 2 1 ) .T h i s s t r a i n a p p e a r s t o t a k e u p l a c t o s e a s t h e f r e e s u g a r ( 1 7 ) ,h a s h i g h p - G a l a c t i v i t y ( 6 , 1 6 ) , a n d c o n t a i n s t h e e n z y m e s o fb o t h t h e T a g - 6 P a n d L e l o i r p a t h w a y s ( 2 ) . I t h a s a d o u b l i n gt i m e o f - 1 0 0 m i n when g r o w i n g o n l a c t o s e i n c o m p l e x b r o t h ,a n d o n l y -15% o f t h e l a c t o s e f e r m e n t e d a p p e a r s a s l a c t i ca c i d ( 2 2 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e d e f e c t i v e n a t u r e o fl a c t o s e f e r m e n t a t i o n i n S . l a c t i s 7 9 6 2 w a s i n v e s t i g a t e d .

MATERIALS A N D METHODSO r g a n i s m s a n d c u l t u r e c o n d i t i o n s . A l l s t r a i n s w e r e f r o mt h e c o l l e c t i o n h e l d a t t h e N ew Z e a l a n d D a i r y R e s e a r c h* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

I n s t i t u t e . S . l a c t i s 7 9 6 2 w a s o r i g i n a l l y o b t a i n e d f r o m t h eA m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M d . S . l a c t i s1 3 3 w a s r e c e i v e d f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e f o r R e s e a r c h i nD a i r y i n g , R e a d i n g , E n g l a n d , a s NCDO 4 9 6 ( = ATCC 1 1 4 5 4 ) .S t a t i c b a t c h c u l t u r e s w e r e g r o w n a t 3 0 C i n T 5 c o m p l e xb r o t h ( 2 4 ) w h i c h c o n t a i n e d e i t h e r 2 8 mM g a l a c t o s e , 2 8 mMg l u c o s e , o r 1 4 mM l a c t o s e , a n d t h e i n i t i a l pH w a s 7 . 2 .S t a n d a r d i z e d c a r b o h y d r a t e s o l u t i o n s w e r e f i l t e r s t e r i l i z e db e f o r e b e i n g a d d e d t o a u t o c l a v e d b r o t h . C e l l s w e r e g r o w nf o r a t l e a s t 2 0 g e n e r a t i o n s o n t h e a p p r o p r i a t e c a r b o h y d r a t eb e f o r e u s e i n e x p e r i m e n t s .E n z y m e a s s a y s . C e l l s g r o w i n g e x p o n e n t i a l l y w e r e h a r v e s t -e d w h e n t h e r e s i d u a l c a r b o h y d r a t e i n t h e m e d i u m w a s h a l ft h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n ( p H - 6 . 5 ) . C e l l s w e r e d i s r u p t e d i n2 0 mM p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 5 ) c o n t a i n i n g 5 0 mM N a C l , 1 0mM M g C 9 2 , a n d 1 mM d i t h i o e r y t h r i t o l b y s h a k i n g f o r 2 m i na t 0 t o 5 C w i t h g l a s s b e a d s i n a M i c k l e d i s i n t e g r a t o r . D e b r i sw a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 3 5 , 0 0 0 x g f o r 5 m i n . C e l le x t r a c t s w e r e s t o r e d o n i c e , a n d e n z y m e a s s a y s w e r e c o m -p l e t e d w i t h i n 4 h a f t e r p r e p a r a t i o n o f e x t r a c t s . A l l e n z y m e sa s s a y e d w e r e s t a b l e ( > 9 0 % ) f o r a t l e a s t 4 h .P - p - G a l a n d p - G a l a c t i v i t i e s w e r e a s s a y e d b y u s i n g o -n i t r o p h e n y l - p - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e ( O N P G ) o r O N P G - 6 -p h o s p h a t e ( O N P G - 6 P ) a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 4 ) , a n d c a l i -b r a t i o n s w i t h s t a n da r d a m o u n t s o f o - n i t r o p h e n y l ( O N P ) w e r ec a r r i e d o u t w h e n d i f f e r e n t a s s a y c o n d i t i o n s w e r e u s e d . T h es t a n d a r d a s s a y ( 1 m l ) f o r p h o s p h a t a s e a c t i v i t y c o n t a i n e d 1 0 0mM t r i e t h a n o l a m i n e h y d r o c h l o r i d e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) , 1 0 mMp - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e ( P N P P ) , 1 0 mM M g C l 2 , a n d 0 . 1 m lo f c e l l e x t r a c t . T h e r e a c t i o n ( a t 2 5 C ) was s t o p p e d b y t h ea d d i t i o n o f a n e q u a l v o l u m e o f 0 . 5 M N a 2 C O 3 , a n d t h ea m o u n t o f PNPP h y d r o l y z e d was d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n gt h e a b s o r b a n c e a t 4 0 5 n m ( 1 ) . One u n i t o f p h o s p h a t a s ea c t i v i t y w a s d e f i n e d a s t h e a m o u n t o f e n z y m e t h a t r e l e a s e d 1n m o f p - n i t r o p h e n o l p e r m i n . T h e t h r e e e n z y m e s o f t h e T a g -6 P p a t h w a y w e r e a s s a y e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 4 ) .T h e p r o c e d u r e f o r a s s a y i n g PTS a c t i v i t i e s i n p e r m e a b i -l i z e d c e l l s b y c o u p l i n g t o NADH o x i d a t i o n h a s b e e n d e -s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 4 ) . T h e o n l y m o d i f i c a t i o n was t h e u s e o f5 0 , u l o f t o l u e n e - a c e t o n e ( 1 : 9 , v o l / v o l ) p e r m l o f c e l l s u s p e n -s i o n when p e r m e a b i l i z i n g S . l a c t i s 7 9 6 2 , b e c a u s e t h e u s e o ft h e l a r g e r a m o u n t ( 1 0 0 [ l I ) g a v e l o w e r PTS a c t i v i t i e s w i t h t h i ss t r a i n . To m e a s u r e t h e p r o d u c t o f PTS a c t i v i t i e s i n p e r m e a b i -l i z e d c e l l s o f S . l a c t i s 7 9 6 2 , t h e PTS i n c u b a t i o n m i x t u r ec o n t a i n e d ( i n a t o t a l v o l u m e o f 6 m l ) : 5 mM P E P , 1 0 mMN a F , 5 0 mM s o d i u m - p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 2 ) , 5

2 8


2/7

S . LACTIS STRAIN THAT FERMENTS LACTOSE S L O W L Y 2 9L a c t o s e L a c t o s e

G a l - 6 P * IA P - P - G a l

( l o w a c t i v i t y )

I G a l - 6 P i s o m e r a s eT a g - 6 P

G l u c o s e G a l a c t o s e4 ( h i g h a c t i v i t y )

I Fl u c o s e - 6 P 0 - G l u c o s e 1 l P * *Gal-lPF r u - 6 P

IT a g - 6 P k i n a s e^ D i h y d r o x y a c e t o n e - P 4

TD P FD PTDP a l d o l a s e G l y c e r a l d e h y d e - 3 PTAG-6P PATHWAY

IF e r m e n t a t i o n p r o d u c t sF I G . 1 . L a c t o s e m e t a b o l i s m b y g r o w i n g c e l l s o f S . l a c t i s 7 9 6 2 i n w h i c h L a c - 6 ' P ( * ) a c c u m u l a t e s t o a h i g h c o n c e n t r a t i o n . T h e r o l e o f t h ePTS i n r e g u l a t i n g p e r m e a s e a c t i v i t y a n d t h e a m o u n t o f L a c - 6 ' P t h a t i s h y d r o l y z e d b y a p h o s p h a t a s e may b e i m p o r t a n t , b u t t h e i r c o n t r i b u t i o n st o l a c t o s e m e t a b o l i s m a r e u n k n o w n .

mM M g C 9 2 , 6 0 0 , u l o f p e r m e a b i l i z e d c e l l s u s p e n s i o n ( 5 t o 7m g [ d r y w e i g h t ] o f c e l l s p e r m l ) , a n d 5 mM l a c t o s e . A t 0 , 1 ,1 0 , 2 0 , a n d 3 0 m i n , 1 - m l s a m p l e s were r e m o v e d a n d p l a c e d i na b o i l i n g - w a t e r b a t h f o r 1 m i n . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n a t 1 3 , 5 0 0x g f o r 5 m i n , t h e s u p e r n a t a n t s w e r e r e m o v e d a n d s t o r e d a t- 7 0 0 C .E x t r a c t i o n a n d a s s a y o f i n t e r m e d i a t e s . C e l l s g r o w i n g e x p o -n e n t i a l l y w e r e e x t r a c t e d w i t h p e r c h l o r i c a c i d , a n d t h e i n t e r -m e d i a t e s w e r e a s s a y e d e n z y m a t i c a l l y i n n e u t r a l i z e d e x t r a c t s ,u s i n g a f l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t e r ( 1 5 , 2 5 ) . G a l - 1 P a n dG a l - 6 P w e r e a s s a y e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 5 ) . I n o n es e r i e s o f e x p e r i m e n t s , L a c - 6 ' P was e x t r a c t e d f r o m r e s t i n gc e l l s ( s e e F i g . 3 ) . A n e x p o n e n t i a l l y g r o w i n g c u l t u r e ( 3 0 m l )w a s m e m b r a n e f i l t e r e d , a n d t h e c e l l s w e r e w a s h e d r a p i d l y( 1 0 s m a x i m u m ) w i t h 4 m l o f 2 0 mM p h o s p h a t e b u f f e r ( p H6 . 5 ) c o n t a i n i n g 5 0 mM N a C l a n d 1 0 mM M g C l 2 a t 0 C . C e l l sw e r e t h e n r e s u s p e n d e d i n 3 0 m l o f t h e s a m e b u f f e r ( b u tp r e i n c u b a t e d a t 2 5 0 C ) a n d h e l d a t 2 5 0 C . A t t h e a p p r o p r i a t et i m e , a 2 5 - m l p o r t i o n was f i l t e r e d a n d e x t r a c t e d w i t h p e r -c h l o r i c a c i d ( 2 5 ) .T h e L a c - 6 ' P c o n c e n t r a t i o n was d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g

t h e r e l e a s e o f g l u c o s e a n d G a l - 6 P a f t e r P - P - G a l t r e a t m e n ta n d t h e r e l e a s e o f l a c t o s e a f t e r a l k a l i n e p h o s p h a t a s e t r e a t -m e n t . T h e a p p r o p r i a t e c o r r e c t i o n s w e r e made f o r f r e e g l u -c o s e , g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e , l a c t o s e , g a l a c t o s e , a n d G a l - 6 P .S a m p l e s f o r L a c - 6 ' P a n a l y s i s ( 2 0 0 , u l e a c h ) w e r e a d d e d t o 1 0 0p . l o f 1 M t r i e t h a n o l a m i n e h y d r o c h l o r i d e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) a n di n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 2 h w i t h e i t h e r 0 . 5 U ( 5 0 , u l ) o f P - P - G a l( S t r e p t o c o c c u s m u t a n s ) , 2 5 U ( 5 0 p . J ) o f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e( b o v i n e i n t e s t i n e ) , o r 5 0 [ L I w a t e r a s a c o n t r o l . A s a m p l e ( 1 0 0p , l ) w h i c h h a d b e e n t r e a t e d w i t h P - P - G a l was f u r t h e r i n c u b a t -e d f o r 2 h a t 3 7 C w i t h 1 0 U o f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e , w h e r e a sa s a m p l e ( 1 0 0 p . l ) w h i c h h a d b e e n t r e a t e d o n l y w i t h a l k a l i n e

p h o s p h a t a s e w a s i n c u b a t e d f o r 2 h a t 3 7 C w i t h 2 U o f 1 - G a l( E s c h e r i c h i a c o l i ) a n d 5 mM M g C l 2 . G l u c o s e 6 - p h o s p h a t e ,f r u c t o s e 6 - p h o s p h a t e , a n d g l u c o s e w e r e a s s a y e d , u s i n g af l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t e r , b y t h e s e q u e n t i a l a d d i t i o no f g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( b a k e r s ' y e a s t , 5 U ) ,p h o s p h o g l u c o s e i s o m e r a s e ( y e a s t , 4 U ) , a n d h e x o k i n a s e( b a k e r s ' y e a s t , 1 0 U ) t o t h e s a m e c u v e t t e c o n t a i n i n g 1 0 0 mMi m i d a z o l e h y d r o c h l o r i d e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) , 5 mM M g C l 2 , 2 mMA T P , 1 mM NADP+, a n d u p t o 1 0 0 p L I o f s a m p l e . I n a d d i t i o n ,when t h e L a c - 6 ' P c o n c e n t r a t i o n w a s s u f f i c i e n t l y h i g h , g l u -c o s e was d e t e r m i n e d w i t h G l u c o s t a t r e a g e n t s ( W o r t h i n g t o nD i a g n o s t i c s , F r e e h o l d , N . J . ) , w h e r e a s f o r l a c t o s e m e a s u r e -m e n t s t h e G l u c o s t a t r e a g e n t s w e r e m o d i f i e d b y t h e a d d i t i o no f M g C l 2 f i n a l ( c o n c e n t r a t i o n , 5 m M) a n d 0 . 8 U o f 1 3 - G a l p e rm l o f r e c o n s t i t u t e d G l u c o s t a t r e a g e n t .P a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f L a c - 6 ' P . L a c - 6 ' P w a s e x t r a c t e d f r o mS . l a c t i s 7 9 6 2 c e l l s g r o w i n g e x p o n e n t i a l l y i n T 5 b r o t h ( 2 8 mMl a c t o s e ) . C e l l s w e r e h a r v e s t e d f r o m 5 0 - m l c u l t u r e s a m p l e s( 0 . 7 t o 0 . 8 m g [ d r y w e i g h t ] o f b a c t e r i a p e r m l ; -1 8 mMr e s i d u a l l a c t o s e ) b y r a p i d f i l t r a t i o n w i t h membrane f i l t e r s( 4 7 - m m d i a m e t e r ; 0 . 8 - p . m p o r e d i a m e t e r ) a n d t h e n p l a c e d i n5 m l o f 0 . 6 M H C l 0 4 a t 0 C . A t o t a l o f 8 5 0 m l o f c u l t u r e w a st r e a t e d i n t h i s w a y , t h e c o m b i n e d e x t r a c t s w e r e n e u t r a l i z e dw i t h 6 M KOH, a n d t h e p r e c i p i t a t e w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u -g a t i o n . F r e e l a c t o s e was r e m o v e d b y p a s s a g e t h r o u g h ac o l u m n ( 1 2 b y 1 0 5 m m ) c o n t a i n i n g a s t r o n g b a s e i o n -e x c h a n g e r e s i n ( A G 1 - X 4 ; B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d ,C a l i f . ) a n d b y e l u t i o n w i t h 2 mM i m i d a z o l e h y d r o c h l o r i d eb u f f e r ( p H 7 . 5 ) . T h e a b s o r b e d L a c - 6 ' P was t h e n e l u t e d w i t h0 . 0 1 M H C l a n d 0 . 1 M N a C l . T h e L a c - 6 ' P f r a c t i o n ( 1 0 0 m l )w a s a d j u s t e d t o pH 8 . 2 w i t h 6 M KOH a n d m a i n t a i n e d a t t h i spH w h i l e 7 . 5 m l o f b a r i u m a c e t a t e ( 2 5 % [ w t / v o l ] ) w a s a d d e d .A f t e r 3 0 m i n a t 0 C , t h e i n s o l u b l e b a r i u m s a l t s w e r e r e m o v e d

V O L . 1 5 7 , 1 9 8 4

IA - G a l


3/7

3 0 CROW AND THOMAS

b y c e n t r i f u g a t i o n . T h e b a r i u m s a l t o f L a c - 6 ' P was p r e c i p i t a t -e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t b y t h e a d d i t i o n o f 4 v o l u m e s o f c ol d95% e t h a n o l . A f t e r 2 h a t 0 C , t h e p r e c i p i t a t e was c o l l e c t e db y c e n t r i f u g a t i o n a n d d i s s o l v e d i n t h e m i n i m u m v o l u m e o fwater ( 9 . 6 m l ) . R e s i n ( 0 . 4 8 g o f B i o - R a d A G 50W-X2h y d r o g e n f o r m ) was t h e n a d d e d t o remove t h e b a r i u m . T h er e s i n was r e m o v e d b y f i l t r a t i o n , a n d t h e f i l t r a t e was a d j u s t e dt o pH 7 . 1 w i t h 1 M NaOH. T h i s p a r t i a l l y p u r i f i e d L a c - 6 ' Ps o l u t i o n ( 6 5 l i m o l ) was s t o r e d a t - 7 0 C , a t e m p e r a t u r e a tw h i c h i t i s s t a b l e f o r a t l e a s t 6 m o n t h s . T hi s p r o c e d u r e gave6 0 t o 70% recovery o f L a c - 6 ' P . P r e v i o u s l y , L a c - 6 ' P h a s b e e np u r i f i e d f r o m S . l a c t i s o n l y i n s m a l l amounts ( 8 0 n m o l ; 2 6 ) .O t h e r p r o c e d u r e s . P r o t e i n was d e t e r m i n e d b y a m o d i f i c a -t i o n ( 1 0 ) o f t h e Lowry m e t h o d , u s i n g b o v i n e s e ru m a l b u m i nas t h e s t a n d a r d . T h e b a c t e r i a l d r y w e i g h t o f p e r m e a b i l i z e dc e l l s was d e t e r m i n e d d i r e c t l y , u s i n g m e m b r a n e f i l t e r s ( 2 3 ) .M a t e r i a l s . A l l b i o c h e m i c a l s were o b t a i n e d f r o m S i g m aC h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . , a n d were g r a d e s w i t h t h eh i g h e s t a n a l y t i c a l p u r i t y . T h e h i g h l y p u r i f i e d P - 1 - G a l , pre-p a r e d f r o m S . mutans, was f r o m R o b e r t C a l m e s , U n i v e r s i t yo f K e n t u c k y , L e x i n g t o n .

RESULTSP - G a l a n d P - . - G a l a c t i v i t i e s . B y u s i n g O N P d e r i v a t i v e s a ss u b s t r a t e s , h i g h 1 3 - G a l s p e c i f i c a c t i v i t y a n d l o w P - 1 - G a ls p e c i f i c a c t i v i t y h a v e b e e n r e p o r t e d i n S . l a c t i s 7 9 6 2 ( 6 , 7 ,1 9 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e a p p a r e n t P - 1 - G a l a c t i v i t yi s d u e t o O N P G c o n t a m i n a t i o n o f ONPG-6P ( 1 9 ) , s o t h a t S .l a c t i s 7 9 6 2 a c t u a l l y possesses o n l y 1 - G a l a c t i v i t y ( 1 7 ) . How-

ever, i n t h i s s t r a i n , t h e P - 1 - G a l a c t i v i t y was more s t a b l e t h a nt h e 1 - G a l a c t i v i t y , w h i c h s u g g e s t s t h a t a P - , 1 - G a l e x i s t s i n S .l a c t i s 7 9 6 2 ( 6 ) a n d s h o u l d r u l e o u t a c o m b i n a t i o n o f p h o s p h a -t a s e a n d 1 3 - G a l a c t i v i t i e s g i v i n g an a p p a r e n t P - 1 - G a l a c t i v i t y .T h e e x i s t e n c e o f even l o w P - 1 - G a l a c t i v i t y c o u l d b e o fi m p o - t a n c e , s o we a s s a y e d 1 3 - G a l , P - 1 - G a l , a n d p h o s p h a t a s ea c t i v i t i e s i n S . l a c t i s 7 9 6 2 u n d e r a v a r i e t y o f c o n d i t i o n s( T a b l e 1 ) t o d e t e r m i n e t h e n a t u r e o f t h e P - 1 - G a l a c t i v i t y .W i t h s t a n d a r d assay c o n d i t i o n s , t h e s p e c i f i c a c t i v i t i e s o f P -1 3 - G a l were l o w as c o m p a r e d w i t h 1 - G a l a c t i v i t i e s i n S . l a c t i s7 9 6 2 c e l l s g r ow n o n l a c t o s e o r g a l a c t o s e . The P - 1 - G a ls p e c i f i c a c t i v i t y i n a t y p i c a l s t r a i n w h i c h grew f a s t o n l a c t o s e( S . l a c t i s 1 3 3 ) was 1 6 t i m e s g r e a t e r t h a n t h a t i n S . l a c t i s 7 9 6 2 .T h e P - 1 - G a l f r o m b o t h S . l a c t i s 7 9 6 2 a n d 1 3 3 was m o r ea c t i v e i n t r i e n t h a n o l a m i n e b u f f e r t h a n i n t h e s t a n d a r d p h o s -TABLE 1 . S p e c i f i c a c t i v i t i e s o f P - p - G a l , 1 - G a l , a n d p h o s p h a t a s ei n c e l l e x t r a c t s f r o m S . l a c t i s 7 9 6 2 a n d 1 3 3 '

S u g a r i n S p a c t o f :S t r a i n g r o w t h me- PPhsGalb-GaPh o s edium phatase"

7 9 6 2 G a l a c t o s e 0 . 0 1 2 ( 0 . 0 3 1 d ) 0 . 6 6 ( 0 . 0 6 e ) 4 . 97 9 6 2 L a c t o s e 0 . 0 4 1 ( 0 . 1 0 4 d ) 0 . 4 9 ( 0 . 0 3 e ) 3 . 81 3 3 L a c t o s e 0 . 6 7 ( 1 . 0 4 d ) N I D 5 . 5

" C u l t u r e c o n d i t i o n s were 3 0 C i n T s medium c o n t a i n i n g 2 8 mMg a l a c t o s e or 1 4 mM l a c t o s e . E x p o n e n t i a l l y g r o w i n g c e l l s wereh a r v e s t e d when -6 0 % o f t h e sugar h a d b e e n f e r m e n t e d .S p e c i f i c a c t i v i t i e s ar e e x p r e s s e d as m i c r o m o l e s o f ONP r e l e a s e dper m i n u t e per m i l l i g r a m o f p r o t e i n .

' S p e c i f i c a c t i v i t i e s ar e e x p r e s s e d as n a n o m o l e s o f PN P r e l e a s e dper m i n u t e per m i l l i g r a m o f p r o t e i n .dT h e s t a n d a r d assay b u f f e r was r e p l a c e d b y 5 0 mM t r i e t h a n o l a -m i n e h y d r o c h l o r i d e b u f f e r ( p H 7 . 2 ) .eEDTA ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n , 5 m M) was a d d e d t o t h e s t a n d a r d

assay m i x t u r e .f ND, N o t d e t e c t a b l e .

TABLE 2 . S p e c i f i c a c t i v i t i e s o f s u g a r - P T S s , , 3 - G a l , a n d P - P - G a li n p e r m e a b i l i z e d c e l l s o f S . l a c t i s 7 9 6 2 "S u g a r i n S u g a r - P T S s p a c t b G a l a c t o s i d a s e s pg r o w t hm e d i u m L a c t o s e G l u - G a l a c - p - G a l P - P - G a lc o s e t o s e

L a c t o s e 9 8 . 0 ( 1 7 8 . 1 ) 1 4 8 . 3 1 2 . 0 2 7 8 . 0 1 1 . 4G a l a c t o s e 3 1 . 8 ( 6 4 . 3 ) 2 6 . 3 4 . 2 3 2 1 . 0 3 . 4G l u c o s e 0 . 3 2 9 . 7 1 . 3 0 . 9 0 . 2

a C u l t u r e c o n d i t i o n s , p r e p a r a t i o n o f p e r m e a b i l i z e d c e l l s , a n de n z y m e a s s a y p r o c e d u r e s a r e d e s c r i b e d i n t h e t e x t .b S p e c i f i c a c t i v i t i e s a r e e x p r e s s e d a s n a n o m o l e s o f NADH o x i -d i z e d ( P E P a n d c a r b o h y d r a t e d e p e n d e n t ) p e r m i n u t e p e r m i l l i g r a m( d r y w e i g h t ) o f c e l l s a n d a r e a n a v e r a g e o f a t l e a s t t h r e e s e p a r a t ee x p e r i m e n t s . V a l u e s i n p a r e n t h e s e s a r e s p e c i f i c a c t i v i t i e s d e t e r -m i n e d a f t e r p r e i n c u b a t i o n o f p e r m e a b i li z e d c e l l s w i t h l a c t o s e f o r 4 . 5m i n b e f o r e t h e r e a c t i o n w a s i n i t i a t e d w i t h P E P .' S p e c i f i c a c t i v i t i e s a r e e x p r e s s e d a s n a n o m o l e s o f O N P r e l e a s e dp e r m i n u t e p e r m i l l i g r a m ( d r y w e ig ht ) o f c e l l s .p h a t e b u f f e r , w h e r e a s t h e 1 - G a l a c t i v i t y f r o m S . l a c t i s 7 9 6 2w a s t h e s a m e i n b o t h b u f f e r s ( d a t a n o t s h o w n ) . EDTAs t r o n g l y i n h i b i t e d t h e 1 - G a l a c t i v i t y o f S . l a c t i s 7 9 6 2 ( T a b l e1 ) b u t d i d n o t a f f e c t t h e P - , B - G a l a c t i v i t y ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e a d d i t i o n o f 5 mM M g C l 2 o r 1 0 mM N aF d i d n o t a l t e r t h ea c t i v i t y o f e i t h e r P - , B - G a l o r 1 - G a l , w h e r e a s p h o s p h a t a s ea c t i v i t y w a s 40% l o w e r w h e n a s s a y e d i n t h e a b s e n c e o fa d d e d M g C l 2 a n d 90% l o w e r i n t h e p r e s e n c e o f 4 mM NaF( d a t a n o t s h o w n ) . T h e d i f f e r e n t r e s p o n s e s t o t h e a b o v e -m e n t i o n e d e f f e c t o r s , t o g e t h e r w i t h t h e d i f f e r e n t i a l i n d u c t i o no f P - , B - G a l a n d 1 - G a l d u r i n g g r o w t h o n g a l a c t o s e a n d l a c t o s e( T a b l e 1 ) , s u g g e s t t h a t t h e r e i s a l o w P - , B - G a l a c t i v i t y ( w i t hONPG-6P a s t h e s u b s t r a t e ) i n s t r a i n 7 9 6 2 . O N P G w a s n o td e t e c t a b l e ( u s i n g p u r i f i e d 1 3 - G a l f r o m E . c o l i ) i n t h e ONPG-6 P s u b s t r a t e .A l t h o u g h t h e p r e s e n c e o f T a g - 6 P p a t h w a y e n z y m e s i n S .l a c t i s 7 9 6 2 h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( 2 ) , we a s s a y e d t h e s ea c t i v i t i e s i n v i e w o f t h e l o w P - , B - G a l a c t i v i t y p r e s e n t i n s t r a i n7 9 6 2 . T h e s p e c i f i c a c t i v i t i e s ( m i c r o m o l e s o f s u b s t r a t e u t i -l i z e d p e r m i n p e r m i l l i g r a m o f p r o t e i n ) o f G a l - 6 P i s o m e r a s e ,T a g - 6 P k i n a s e , a n d t a g a t o s e 1 , 6 - d i p h o s p h a t e a l d o l a s e w e r e ,r e s p e c t i v e l y , 0 . 5 4 , 0 . 2 5 , a n d 0 . 4 8 when s t r a i n 7 9 6 2 w a sg r o w n o n g a l a c t o s e a n d 0 . 7 6 , 0 . 2 7 , a n d 0 . 7 2 w h e n s t r a i n 7 9 6 2w a s g r o w n o n l a c t o s e .P T S a c t i v i t i e s . T h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e l a c t o s e - P T S i nS . l a c t i s 7 9 6 2 ( T a b l e 2 ) w a s c o m p a r a b l e t o t h a t f o u n d i n S .l a c t i s s t r a i n s C I 0 a n d 1 3 3 ( 4 ) . H o w e v e r , u n l i k e t h e s e t w os t r a i n s ( 4 ) , S . l a c t i s 7 9 6 2 h a s h i g h 1 3 - G a l a c t i v i t y ( T a b l e s 1a n d 2 ) , s o i t i s p o s s i b l e t h a t a c o m b i n a t i o n o f 1 3 - G a l a c t i v i t ya n d g l u c o s e - P T S ( o r g a l a c t o s e - P T S ) ( o r b o t h ) a c t i v i t y c o u l dg i v e a n a p p a r e n t l a c t o s e - P T S a c t i v i t y . T h e Km v a l u e s f o r t h el a c t o s e - , g l u c o s e - , a n d g a l a c t o s e - P T S s i n S . l a c t i s 7 9 6 2g r o w n o n l a c t o s e w e r e 0 . 7 , 0 . 0 2 3 , a n d 2 1 . 7 m M, r e s p e c t i v e l y( d a t a n o t s h o w n ) . C e l l s g r o w n o n g a l a c t o s e g a v e s i m i l a rv a l u e s , a n d t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e PTS was h i g h w i t hg l u c o s e a n d l o w w i t h g a l a c t o s e a s t h e s u b s t r a t e s . T h i si n d i c a t e s t h a t o n l y t h e c o m b i n e d a c t i o n o f 1 - G a l a n d t h eg l u c o s e - P T S i s l i k e l y t o c o n t r i b u t e a p p a r e n t l a c t o s e - P T Sa c t i v i t y . P r e i n c u b a t i o n o f c e l l s w i t h l a c t o s e f o r 4 . 5 m i nb e f o r e t h e a d d i t i o n o f PEP g a v e h i g h e r l a c t o s e - P T S a c t i v i t y( T a b l e 2 ) t h a n t h a t i n t h e n o r m a l a s s a y i n w h i c h l a c t o s e wasa d d e d l a s t a n d t h e r e a c t i o n r a t e was r e c o r d e d 1 4 s l a t e r . T h i sl a c t o s e - P T S a c t i v i t y was a l s o s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h eg l u c o s e - P I T S a c t i v i t y , w h i c h was a t a maximum w i t h t h es t a n d a r d g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n ( 5 m M ) . T h u s , t h e h i g h e r

J . B A C T E R I O L .


4/7

S . LACTIS STRAIN THAT FERMENTS L ACTOSE SLOWLY 3 1

2E

0a0

c0

c

00c0

0

0 1 0 2 0 3 0I n c u b a t i o n t i m e ( m i n )

F I G . 2 . P r o d u c t s f o r m e d b y p e r m e a b i l i z e d c e l l s ( l a c t o s e g r o w n ) o f S . l a c t i s 7 9 6 2 i n c u b a t e d w i t h l a c t o s e ( 5 m M) i n t h e a b s e n c e ( A ) a n dpresence ( B ) o f P E P . G l u c o s e - 6 P , g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e . F r u c t o s e - 6 P , f r u c t o s e 6 - p h o s p h a t e .l a c t o s e - P T S a c t i v i t y r e s u l t i n g f r o m p r e i n c u b a t i o n o f permea-b i l i z e d c e l l s w i t h l a c t o s e was p r o b a b l y d u e t o a c o m b i n a t i o no f l a c t o s e - P T S a n d g l u c o s e - P T S a c t i v i t i e s . From k i n e t i cc o n s i d e r a t i o n s ( d a t a n o t s h o w n ) , g l u c o s e - P T S a c t i v i t y w o u l dc o n t r i b u t e an e s t i m a t e d 5 0 a n d 3 0 % , r e s p e c t i v e l y , o f t h el a c t o s e - P T S o f l a c t o s e - a n d g a l a c t o s e - g r o w n c e l l s ( T a b l e 2 ) .To c o n f i r m t h e presence o f a l a c t o s e - P T S r e a c t i o n , t h ep h o s p h o r y l a t e d sugar p r o d u c t s were a n a l y z e d i n a r e a c t i o nm i x t u r e i n w h i c h b o t h NADH a n d t h e c o u p l i n g enz y me swere a b s e n t ( F i g . 2 b ) . I n t h e pre se nce o f P E P , p e r m e a b i l i z e dc e l l s o f S . l a c t i s 7 9 6 2 h a d f o r m e d 0 . 4 2 mM L a c - 6 ' P a f t e r a 3 0 -m i n i n c u b a t i o n , c o n f i r m i n g l a c t o s e - P T S a c t i v i t y . The i n i t i a lr a t e o f L a c - 6 ' P f o r m a t i o n was 7 0 t o 8 0 n m o l / m i n pe r mg ( d r yw e i g ht ) o f c e l l s , w h i c h i s c o m p a r a b l e t o t h e l a c t o s e - P T Sa c t i v i t y m e a s u r e d i n d i r e c t l y i n l a c t o s e - g r o w n c e l l s ( T a b l e 2 ) .Some o f t h e g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e f o r m e d ( F i g . 2 b ) wasi s o m e r i z e d t o f r u c t o s e 6 - p h o s p h a t e b y t h e enzyme g l u c o s e 6 -p h o s p h a t e i s o m e r a s e ( E C 5 . 3 . 1 . 9 ) w h i c h r e q u i r e s no c o f a c -t o r s . N o o t h e r s i g n i f i c a n t r e a c t i o n s o c c u r r e d s i n c e >96% o ft h e i n i t i a l g l u c o s e m o i e t y o f l a c t o s e was a c c o u n t e d f o r , a f t e r3 0 m i n o f i n c u b a t i o n , b y t h e p r o d u c t s shown i n F i g . 2 b . Theg a l a c t o s e m o i e t y o f l a c t o s e was c o m p l e t e l y a c c o u n t e d f o ra f t e r 3 0 m i n o f i n c u b a t i o n ( 1 . 6 mM l a c t o s e , 2 . 9 5 mM f r e eg a l a c t o s e , 0 . 4 2 mM L a c - 6 ' P , a n d 0 . 0 4 5 mM G a l - 6 P ) . T h e l o wc o n c e n t r a t i o n o f G a l - 6 P c o u l d b e d u e t o t h e l i m i t e d h y d r o l y -s i s o f L a c - 6 ' P b y P - 1 - G a l ( T a b l e s 1 a n d 2 ) o r t o t h e l o wg a l a c t o s e - P T S a c t i v i t y . A l t h o u g h G a l - 6 P i s o m e r a s e d o e s n o trequire an y c o f a c t o r s , n o T a g - 6 P w o u l d b e e x p e c t e d t o b ed e t e c t e d b e c a u s e o f t h e k i n e t i c s o f t h i s enzyme ( 3 ) . I n ac o n t r o l e x p e r i m e n t , p e r m e a b i l i z e d S . l a c t i s 7 9 6 2 c e l l s werei n c u b a t e d f o r 3 0 m i n ( F i g . 2 a ) e x c e p t t h a t l a c t o s e wasr e p l a c e d b y 1 0 mM G a l - 6 P . W i t h or w i t h o u t N a F , no f r e eg a l a c t o s e n o r any s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n G a l - 6 P was d e t e c t -e d . T h i s s u g g e s t s t h a t b o t h sugar p h o s p h a t e p h o s p h a t a s e a n dG a l - 6 P i s o m e r a s e a c t i v i t i e s were m i n i m a l u n d e r s t a n d a r dassay c o n d i t i o n s . I n a n o t h e r c o n t r o l ( F i g . 2 a ) , no p h o s p h o r y -l a t e d sugars were d e t e c t e d when l a c t o s e was h y d r o l y z e d .Th e i n i t i a l r a t e o f l a c t o s e h y d r o l y s i s b y p e r m e a b i l i z e d c e l l swas i n c r e a s e d f r o m 1 4 8 t o 2 3 7 n m o l / m i n per mg ( d r y w e i g h t )o f c e l l s b y t h e a d d i t i o n o f PEP ( F i g . 2 a a n d b ) .I n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f k e y m e t a bo l i t e s o f l a c t o s em e t a b o l i s m . The i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n o f L a c - 6 ' P i n

s t r a i n 7 9 6 2 g r o w i n g on l a c t o s e was >6 5 t i m e s t h a t f o u n d i ns t r a i n s E 8 , ML3, a n d ML 8 ( T a b l e 3 ) . I n c o n t r a s t t o s t r a i n7 9 6 2 , s t r a i n s E 8 , M L 3 , a n d ML 8 h a d h i g h P - 3 - G a l a c t i v i t i e s( r e s p e c t i v e l y , 1 2 3 . 6 , 8 4 . 9 , a n d 6 0 . 3 n m o l o f ONP r e l e a s e dpe r m i n pe r mg [ d r y w e i g h t ] o f c e l l s ) a n d no d e t e c t a b l e , - G a la c t i v i t y ( < 0 . 8 n m o l o f ONP r e l e a s e d pe r m i n pe r mg [ d r yw e i g h t ] o f c e l l s ) . T h e i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n o f G a l - 6 Pwas l o w e s t i n s t r a i n 7 9 6 2 ( T a b l e 3 ) . T h i s compound c o u l da r i s e f r o m e i t h e r l a c t o s e - P T S a n d P - 3 - G a l a c t i v i t i e s o r f r o m, B - G a l a n d g a l a c t o s e - P T S a c t i v i t i e s . I n s t r a i n s E 8 , ML3, a n dM L 8 , G a l - 6 P can o n l y a r i s e f r o m l a c t o s e - P T S a n d P - 1 3 - G a la c t i v i t i e s . The presence o f G a l - 1 P i n s t r a i n 7 9 6 2 ( T a b l e 3 ) i sc o n s i s t e n t w i t h t h e o p e r a t i o n o f t h e L e l o i r p a t h w a y d u r i n gl a c t o s e m e t a b o l i s m .M e t a b o l i s m o f L a c - 6 ' P b y S . l a c t i s 7 9 6 2 . T h e i n t r a c e l l u l a rL a c - 6 ' P was m e t a b o l i z e d when i n t a c t c e l l s were i n c u b a t e d i nb u f f e r ( h a l f - l i f e [ t 1 2 ] = 1 . 4 m i n ) ( F i g . 3 ) . By u s i n g t h i s v a l u e ,t h e i n i t i a l r a t e o f L a c - 6 ' P r e m o v a l was c a l c u l a t e d t o b e 6 2 . 6n m o l / m i n per mg ( d r y w e i g h t ) o f c e l l s i n w h i c h t h e i n v i v oc o n c e n t r a t i o n o f L a c - 6 ' P was 1 0 5 mM a n d 1 mg ( d r y w e i g h t )o f c e l l s h a d a v o l u m e o f 1 . 6 7 [ L I ( 2 5 ) .The p r o d u c t s o f L a c - 6 ' P m e t a b o l i s m were e x a m i n e d b yi n c u b a t i n g p e r m e a b i l i z e d c e l l s w i t h p a r t i a l l y p u r i f i e d L a c -6 ' P ( F i g . 4 ) . The r a t e o f L a c - 6 ' P d e c r e a s e was 2 4 n m o l l m i npe r mg ( d r y w e i g h t ) o f c e l l s , w h i c h was s i m i l a r t o t h e r a t e o fG a l - 6 P a n d g l u c o s e i n c r e a s e ( r e s p e c t i v e l y , 2 2 . 4 a n d 2 3 . 2

TABLE 3 . I n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i on s o f L a c -6 ' P , G a l -6 P , a n dG a l - l P i n l a c t i c s t r e p t o c o c c i g r o w i n g o n l a c t o s e "I n t r a c e l l u l a r c o n c n ( m M )S t r a i n L a c - 6 ' P G a l - 6 P G a l - 1 P

S . l a c t i s 7 9 6 2 1 0 5 9 . 1 0 . 5S . l a c t i s M L 3 a n d ML 8 0 . 9 - 1 . 6 1 4 . 0 - 1 9 . 0 N D bS . c r e m o r i s E 8a C u l t u r e c o n d i t i o n s a n d m e a s u r e m e n t o f i n t r a c e l l u l a r i n t e r m e d i -a t e c o n c e n t r a t i o n s a r e d e s c r i b e d i n t h e t e x t . F o r S . l a c t i s 7 9 6 2 , meanv a l u e s f r o m a t l e a s t t h r e e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s a r e g i v e n ; f o r t h eo t h e r t h r e e s t r a i n s , t h e r a n g e s o f mean v a l u e s a r e g i v e n . A ts a m p l i n g , t h e l a c t o s e c o n c e n t r a t i o n i n t h e medium w a s 6 t o 8 m M.b N D , N o t d e t e c t a b l e .

B5 ( + P E P )

L a c t o s e

4 -

3 -

2 -

1 G l u c o s e - 6 P G l u c o s e0 F r u c t o s 6

V O L . 1 5 7 , 1 9 8 4


5/7

3 2 CROW AND THOMAS

Eo 8 0i )N0r _ 6 0

00 4 0 -0

O 2 0

0L0 1 2 3 4 5I n c u b a t i o n t i m e ( m i n )

F I G . 3 . R a t e o f L a c - 6 ' P d i s a p p e a r a n c e i n S . l a c t i s 7 9 6 2 . C e l l sg r ow i n g o n l a c t o s e w e r e q u i c k l y h a r v e s t e d , w a s h e d , a n d i n c u b a t e di n b u f f e r a t 2 5 C a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . T h e r e w a s a n 1 8 t o 20%d r o p i n L a c - 6 ' P c o n c e n t r a t i o n d u r i n g t h e w a s h i n g s t e p ( i . e . , 1 0 0 %v a l u e i s 8 5 m M ) .n m o l / m i n p e r m g [ d r y w e i g h t ] o f c e l l s ) . ( S o m e G a l - 6 P [ 0 . 0 7m M] w a s i n t r od u c e d w i t h t h e p a r t i a l l y p u r i f i e d L a c - 6 ' Pp r e p a r a t i o n . ) T h e s e r a t e s w e r e n o t a l t e r e d w h e n N aF w a so m i t t e d f r o m t h e r e a c t i o n m i x t u r e . T h e g l u c o s e 6 - p h o s p h a t ec o n c e n t r a t i o n ( 0 . 1 m M; i n t r od u c e d w i t h t h e L a c - 6 ' P p r e p a -r a t i o n ) d i d n o t i n c r e a s e , a n d n o f r e e g a l a c t o s e o r l a c t o s e wasd e t e c t e d d u r i n g t h e i n c u b a t i o n p e r i o d . N o P E P , A D P , o rA TP w a s d e t e c t e d ( < 0 . 0 0 5 m M) i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e a f t e rL a c - 6 ' P w a s a d d e d . When p e r m e a b i l i z e d c e l l s w e r e i n c u b a t -e d w i t h e i t h e r 5 mM G a l - 6 P o r 5 mM g l u c o s e - 6 P , n o d e c r e a s e( w i t h o r w i t h o u t 1 0 mM N a F ) w a s o b s e r v e d i n t h e c o n c e n t r a -t i o n o f e i t h e r m e t a b o l i t e d u r i n g a 1 - h i n c u b a t i o n ( d a t a n o ts h o w n ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t P - 4 - G a l a c t i v i t y wasr e s p o n s i b l e f o r t h e d e g r a d a t i o n o f L a c - 6 ' P u n d e r t h e a s s a yc o n d i t i o n s u s e d a n d r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y o f i n v o l v e m e n t o fa s u g a r p h o s p h a t e p h o s p h a t a s e a c t i v i t y c o u p l e d w i t h 1 - G a la n d g a l a c t o s e - P T S a c t i v i t i e s .S p e c i f i c r a t e o f l a c t o s e u t i l i z a t i o n . S t r a i n 7 9 6 2 was g r o w n i nb a t c h c u l t u r e s ( i n i t i a l l a c t o s e c o n c e n t r a t i o n , 1 7 m M ) , b o t h a ta c o n s t a n t pH ( 6 . 5 0 . 0 5 ) a n d w i t h o u t pH c o n t r o l . T h es p e c i f i c r a t e o f l a c t o s e u t i l i z a t i o n d u r i n g e x p o n e n t i a l g r o w t h( 2 8 ) w a s 6 8 . 0 t o 7 1 . 1 n m o l / m i n p e r m g ( d r y w e i g h t ) o f c e l l s .

DISCUSSIONA l t h o u g h S . l a c t i s 7 9 6 2 i s t h e b e s t s t u d i e d o f t h e l a c t i cs t r e p t o c o c c i t h a t f e r m e n t l a c t o s e s l o w l y , l a c t o s e t r a n s p o r th a s o n l y b e e n i n d i r e c t l y e x a m i n e d w i t h a n o n - m e t a b o l i z a b l es u g a r a n a l o g ( t h i o m e t h y l - 1 - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e ) . T h i o -m e t h y l - , B - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e was r e p o r t e d t o a c c u m u l a t eu n c h a n g e d ( 1 3 ) , w h e r e a s i n a n o t h e r s t u d y ( 1 8 ) t h e p h o s p h a t ed e r i v a t i v e a c c u m u l a t e d a t a s l o w r a t e . We h a v e d e m o n s t r a t -e d , u s i n g t w o a s s a y m e t h o d s a n d l a c t o s e a s t h e s u b s t r a t e ,t h a t t h e l a c t o s e - P T S a c t i v i t y i s p r e s e n t i n s t r a i n 7 9 6 2 .F u r t h e r m o r e , t h e l e v e l o f a c t i v i t y i s c o m p a r a b l e t o t h a tf o u n d i n S . l a c t i s s t r a i n s w h i c h f e r m e n t l a c t o s e r a p i d l y ( 4 ) . I n

o n e a s s a y m e t h o d , PEP u t i l i z a t i o n was m e a s u r e d ; i n s t r a i n sw i t h n o 1 - G a l a c t i v i t y , t h e u t i l i z a t i o n o f PEP i s l a c t o s ed e p e n d e n t . H o w e v e r , i n a s t r a i n s u c h a s S . l a c t i s 7 9 6 2 i nw h i c h 1 - G a l a c t i v i t y i s p r e s e n t , t h e PEP u t i l i z a t i o n c o u l d b eg l u c o s e - o r g a l a c t o s e - d e p e n d e n t o r b o t h i f t h e i n i t i a l s u b -s t r a t e ( l a c t o s e ) i s h y d r o l y z e d q u i c k l y b y t h e p e r m e a b i l i z e dc e l l s . We c o n c l u d e d t h a t g l u c o s e - P T S c o n t r i b u t e d u p t o 50%o f t h e a c t i v i t y d e s c r i b e d a s l a c t o s e - P T S , b y u s i n g t h e a s s a yw h i c h m e a s u r e d PEP u t i l i z a t i o n ( T a b l e 2 ) . I t w a s t h e r e f o r ei m p o r t a n t t o c o n f i r m l a c t o s e - P T S a c t i v i t y b y a n o t h e r m e t h -o d . We h a v e d e m o n s t r a t e d t h e P E P - d e p e n d e n t f o r m a t i o n o fL a c - 6 ' P , t h e u n i q u e p r o d u c t o f l a c t o s e - P T S a c t i v i t y , w i t hp e r m e a b i l i z e d c e l l s o f s t r a i n 7 9 6 2 .T h e r e h a s b e e n some d o u b t a s t o w h e t h e r t h e l o w P - 4 - G a la c t i v i t y i n S . l a c t i s 7 9 6 2 ( 1 6 , 1 9 ) i s r e a l . H o w e v e r , i t i sa p p a r e n t f r o m t h e s t u d y b y F a r r o w ( 6 ) , a n d f u r t h e r s u p p o r t -e d b y o u r s t u d y , t h a t t h i s s t r a i n d o e s p o s s e s s l o w P - 1 3 - G a ls p e c i f i c a c t i v i t y , i n a d d i t i o n t o h i g h 1 - G a l a c t i v i t y . A l lp u bl i s h e d a s s a y s f o r P - 4 - G a l a c t i v i t y , e x c e p t a r a d i o a c t i v ea s s a y ( 2 6 ) , a n d e v e n m o s t a s s a y s f o r 1 - G a l a r e c a r r i e d o u tw i t h ONPG-6P a n d O NP G, r e s p e c t i v e l y , a n d n o t w i t h t h en a t u r a l s u b s t r a t e s . I n v i e w o f a r e p o r t t h a t a m u t a n t o f s t r a i n7 9 6 2 h a d a 1 - G a l w i t h n o a f f i n i t y f o r ONPG b u t s t i l l h a da c t i v i t y w i t h l a c t o s e ( 1 6 ) , a c r i t i c a l a s s e s s m e n t o f b o t h 1 - G a la n d P - 4 - G a l a c t i v i t i e s s h o u l d b e m a d e w i t h t h e n a t u r a ls u b s t r a t e s . L a c - 6 ' P h a s n o t b e e n u s e d r o u t i n e l y f o r P 4 3 - G a la s s a y , p r e s u m a b l y b e c a u s e i t i s n o t c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e .A u s e f u l s p i n - o f f f r o m o u r s t u d y i s t h e d e m o n s t r a t i o n t h a t S .l a c t i s 7 9 6 2 i s p o t e n t i a l l y a g o o d s o u r c e o f L a c - 6 ' P .We p r e p a r e d p a r t i a l l y p u r i f i e d L a c - 6 ' P a n d d e m o n s t r a t e dt h a t p e r m e a b i l i z e d c e l l s o f s t r a i n 7 9 6 2 h y d r o l y z e t h i s c o m -p o u n d t o g l u c o s e a n d G a l - 6 P , i . e . , t h e e x p e c t e d p r o d u c t sf r o m P - 4 - G a l h y d r o l y s i s . T h e i n i t i a l r a t e o f L a c - 6 ' P h y d r o l y -s i s w a s 2 3 n m o l / m i n p e r m g ( d r y w ei g ht ) o f c e l l s w h e n t h ei n i t i a l L a c - 6 ' P c o n c e n t r a t i o n w a s 4 . 9 4 m M. W i t h 5 mMl a c t o s e , t h e i n i t i a l r a t e o f h y d r o l y s i s w a s much f a s t e r ( 1 3 9n m o l / m i n p e r m g [ d r y w e i g h t ] o f c e l l s ) . T h u s , i n s t r a i n 7 9 6 2 ,, B - G a l a n d P - 4 - G a l h y d r o l y z e b o t h t h e n a t u r a l a n d s y n t h e t i cs u b s t r a t e s . T h e o t h e r u n i q u e e n z y m e s n e c e s s a r y f o r m e t a b o -l i s m o f L a c - 6 ' P a r e t h e t h r e e T a g - 6 P p a t h w a y e n z y m e s .T h e s e e n z y m e s a r e p r e s e n t i n c e l l e x t r a c t s o f s t r a i n 7 9 6 2 ( 2 ;t h i s s t u d y ) a t l e v e l s c o m p a r a b l e t o t h o s e i n S . l a c t i s s t r a i n sw h i c h f e r m e n t l a c t o s e r a p i d l y ( 2 , 4 ) .P o s s e s s i o n o f t h e l a c t o s e - P T S , P - 3 - G a l , a n d t h e t h r e e

EC0~ aU00

a -( oCa- i

a.

co( D ~b ca Oo _ucs

-

cCooc0 C . )00= 10 D

I n c u b a t i o n t i m e ( m i n )F I G . 4 . M e t a b o l i s m o f p a r t i a l l y p u r i f i e d L a c - 6 ' P b y p e r m e a -b i l i z e d c e l l s o f S . l a c t i s 7 9 6 2 . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a n d a s s a yp r o c e d u r e s a r e d e s c r i b e d i n t h e t e x t .



6/7

S . L A C T I S STRAIN THAT FERMENTS LACTOSE S L OW LY 3 3e n z y m e s o f t h e T A G - 6 P p a t h w a y a r e t h o u g h t t o b e p r e r e q u i -s i t e s f o r r a p i d , h o m o l a c t i c f e r m e n t a t i o n o f l a c t o s e b y g r o u pN s t r e p t o c o c c i ( 1 4 ) . T h e f u l l c o m p l e m e n t o f e n z y m e s t og e n e r a t e a n d m e t a b o l i z e L a c - 6 ' P a r e p r e s e n t i n S . l a c t i s7 9 6 2 . O f t h e s e e n z y m e s , o n l y P - p - G a l h a s l o w s p e c i f i ca c t i v i t y r e l a t i v e t o t h a t o f t h e s t r a i n s w h i c h f e r m e n t l a c t o s er a p i d l y . We c o n c l u d e t h a t r a t e - l i m i t i n g P - p - G a l a c t i v i t y i sp r i m a r i l y r e s p o n s i b l e f o r t h e s l o w m e t a b o l i s m o f l a c t o s e b yS . l a c t i s 7 9 6 2 .L a c t o s e i s t r a n s p o r t e d i n S . l a c t i s 7 9 6 2 b y b o t h a P T S a n da p e r m e a s e ( F i g . 1 ) . S i n c e P - p - G a l a c t i v i t y a p p e a r s t o l i m i tt h e r a t e o f l a c t o s e m e t a b o l i s m , c o m p a r i s o n o f t h e r a t e o fL a c - 6 ' P r e m o v a l i n i n t a c t w a s h e d c e l l s w i t h t h e o v e r a l l r a t eo f l a c t o s e u t i l i z a t i o n i n g r o w i n g c e l l s ( 6 8 t o 7 1 n m o l o fl a c t o s e p e r f h i n p e r mg [ d r y w e i g h t ] o f c e l l s ) s h o u l d i n d i c a t et h e r e l a t i v e c o n t r i b u t i o n o f t h e t w o t r a n s p o r t s y s t e m s i nv i v o . T h e i n i t i a l r a t e o f L a c - 6 ' P r e m n o v a l i n w a s h e d c e l l s w a s6 2 . 6 n m o l / m i n p e r m g ( d r y w e i g h t ) o f c e l l s . T h e r e f o r e , u p t o9 0 % o f t h e l a c t o s e c o u l d b e t a k e n u p b y t h e l a c t o s e - P T S i ns t r a i n 7 9 6 2 . L a c t o s e u p t a k e b y t h e p e r m e a s e , h y d r o l y s i s b yp - G a l , a n d m e t a b o l i s m v i a t h e L e l o i r p a t h w a y r n a y b el i m i t e d b y i n t e r f e r e n c e f r o m t h e P T S , a s i n e n t e r i c b a c t e r i a i nw h i c h t h e t r a n s p o r t o f n o n - P T S s u g a r s i s r e g u l a t e d b y t h ePTS s u g a r s ( f o r r e v i e w s , s e e r e f e r e n c e s 5 a n d 2 0 ) . H i g hi n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f L a c - 6 ' P may a l s o i n h i b i t t h e s ea c t i v i t i e s . I n t h i s r e g a r d , l a c t o s e - n e g a t i v e ( L a c - ) , g a l a c t o s e -d e f e c t i v e ( G a l d ) m u t a n t s o f S . l a c t i s g r o w i n g o n g a l a c t o s ec o n t a i n e d h i g h i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f G a l - 6 P a n dh a d r e d u c e d g r o w t h r a t e s c o m p a r e d w i t h t h e r a t e s o f t h ep a r e n t s t r a i n s ( 4 ) .I t w a s s u g g e s t e d i n 1 9 6 9 t h a t l a c t o s e may b e a c c u m u l a t e da s L a c - 6 ' P v i a t h e P E P - d e p e n d e n t s y s t e m i n S . l a c t i s 7 9 6 2a n d t h e n c l e a v e d b y a s p e c i f i c p h o s p h a t a s e ( 1 8 ) . I n s t r a i n7 9 6 2 , t h e p h o s p h a t a s e a c t i v i t y w i t h PNPP a s t h e s u b s t r a t ea n d t h e s u g a r p h o s p h a t e p h o s p h a t a s e i n S . l a c t i s 1 3 3 ( 2 7 ) a r eM g 2 ' d e p e n d e n t a n d s e n s i t i v e t o b o t h f l u o r i d e a n d EDTA.We d o n o t k n o w w h e t h e r t h e p h o s p h a t a s e a s s a y e d v i a PNPPo r a n y o t h e r p h o s p h a t a s e s i n s t r a i n 7 9 6 2 h y d r o l y z e L a c - 6 ' Pu n d e r i n v i v o c o n i d i t i o n s . When p a r t i a l l y p u r i f i e d L a c - 6 ' P i su s e d a s a s u b s t r a t e a t l o w c o n c e n t r a t i o n s ( F i g . 4 ) , t h ep r o d u c t s f o r m e d r u l e o u t s u g a r p h o s p h a t e p h o s p h a t a s e a c -t i v i t y . H o w e v e r , a s t h e p h o s p h a t a s e a c t i v i t y w i t h g l u c o s e 6 ' -p h o s p h a t e i n s t r a i n 1 3 3 h a s a h i g h Km a n d l o w V m a x ( 2 7 ) , a n yp o t e n t i a l p h o s p h a t a s e a c t i v i t y w i t h L a c - 6 ' P may o n l y b ed e t e c t a b l e i n s t r a i n 7 9 6 2 b y u s i n g h i g h c o n c e n t r a t i o n s o fr a d i o a c t i v e L a c - 6 ' P . T h e s e n s i t i v i t y r e q u i r e d f o r d e t e c t i o nmay i m p l y t h a t t h e c o n t r i b u t i o n o f p h o s p h a t a s e t o L a c - 6 ' Pm e t a b o l i s m i n g r o w i n g S . l a c t i s 7 9 6 2 c e l l s i s s m a l l . S u g a rp h o s p h a t e p h o s p h a t a s e s may h a v e t h e p o t e n t i a l t o m a i n t a i nt h e c o n c e n t r a t i o n o f s o m e i n t r a c e l l u l a r s u g a r p h o s p h a t e sw i t h i n p h y s i o l o g i c a l l y a c c e p t a b l e l i m i t s ( 8 ) . H o w e v e r , i ta p p e a r s t h a t i n a t l e a s t t w o e x a m p l e s o f S . l a c t i s t h ec a p a b i l i t y o f t h e e n z y m e ( s ) i s l i m i t e d , a s i n b o t h s t r a i n 7 9 6 2a n d s t r a i n 1 3 3 L a c - G a l d ( 4 ) g r o w i n g o n l a c t o s e a n d g a l a c -t o s e , r e s p e c t i v e l y , t h e s u g a r p h o s p h a t e s a r e a t a b n o r m a l l yh i g h c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 6 mM L a c - 6 ' P a n d 4 9 mM G a l - 6 P ,r e s p e c t i v e l y ) .B a s e d o n l a c t o s e f e r m e n t a t i o n r a t e s a n d d i s t r i b u t i o n o f P -p - G a l a n d p - G a l , 1 1 s t r a i n s o f l a c t i c s t r e p t o c o c c i , i n c l u d i n gs t r a i n 7 9 6 2 , w e r e g r o u p e d a s w i l d t y p e ( s l o w f e r m e n t a t i o n )a s o p p o s e d t o s t a r t e r t y p e ( r a p i d f e r m e n t a t i o n ) ( 6 ) . F r o m o u rs t u d i e s , i t i s e v i d e n t t h a t s t r a i n 7 9 6 2 may h a v e o r i g i n a l l yb e e n a f a s t f e r m e n t e r o f l a c t o s e t h a t l o s t m o s t o f i t s P - , - G a la c t i v i t y a n d s u b s e q u e n t l y a c q u i r e d o r e x p r e s s e d a p e r m e a s es y s t e m a n d p - G a l t o p a r t i a l l y c o m p e n s a t e . T h u s , s t r a i n 7 9 6 2 ,a n d s i m i l a r l a c t i c s t r e p t o c o c c i , s h o u l d n o t b e c l a s s i f i e d a s

w i l d - t y p e s t r a i n s . P a r t i a l l a c t o s e - f e r m e n t i n g r e v e r t a n t s a r o s ef r o m L a c - m u t a n t s o f t h e f a s t l a c t o s e - f e r m e n t i n g s t r a i n s S .l a c t i s C 2 a n d S . c r e m o r i s B 1 ( f o r a r e v i e w , s e e r e f e r e n c e 1 7 ) .T h e o r i g i n o f S . l a c t i s 7 9 6 2 c o u l d b e s i m i l a r t o t h e s er e v e r t a n t s w h i c h p a r t i a l l y f e r m e n t l a c t o s e . I s o l a t i o n o f a n S .l a c t i s 7 9 6 2 m u t a n t w i t h n o l a c t o s e - P T S , o r a t r a n s c o n j u g a n tw i t h P - p - G a l f r o m t h e l a c t o s e p l a s m i d o f a n o t h e r s t r a i n ,w o u l d b e l o g i c a l a p p r o a c h e s t o t ry t o c o n v e r t s t r a i n 7 9 6 2 t o af a s t f e r m e n t e r o f l a c t o s e .

ACKNOWLEDGMENTWe t h a n k J u d i t h C l e l a n d f o r e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .

LITERATURE CITED1 . B e r g m e y e r , H . U . , K . G a w e h n , a n d M . G r a s s l . 1 9 7 4 . P h o s p h a -t a s e , a l k a l i n e , p . 4 9 6 - 4 9 7 . I n H . U . B e r g m e y e r ( e d . ) , M e t h o d so f e n z y m a t i c a n a l y s i s , 2 n d e d . , v o l . 1 . V e r l a g C h e m i e , W e i n -h e i m , W e s t G e r m a n y .2 . B i s s e t t , D . L . , a n d R . L . A n d e r s o n . 1 9 7 4 . L a c t o s e a n d D -g a l a c t o s e m e t a b o l i s m i n g r o u p N s t r e p t o c o c c i : p r e s e n c e o fe n z y m e s f o r b o t h t h e D - g a l a c t o s e 1 - p h o s p h a t e a n d D - t a g a t o s e 6 -p h o s p h a t e p a t h w a y s . J . B a c t e r i o l . 1 1 7 : 3 1 8 - 3 2 0 .3 . B i s s e t t , D . L . , W. C . W e n g e r , a n d R . L . A n d e r s o n . 1 9 8 0 . L a c t o s ea n d D - g a l a c t o s e m e t a b o l i s m i n S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . I I .

I s o m e r i z a t i o n o f D - g a l a c t o s e 6 - p h o s p h a t e t o D - t a g a t o s e 6 - p h o s -p h a t e b y a s p e c i f i c D - g a l a c t o s e 6 - p h o s p h a t e i s o m e r a s e . J . B i o l .C h e m . 2 5 5 : 8 7 4 0 - 8 7 4 4 .4 . C r o w , V . L . , G . P . D a v e y , L . E . P e a r c e , a n d T . D . T h o m a s . 1 9 8 3 .P l a s m i d l i n k a g e o f t h e D - t a g a t o s e 6 - p h o s p h a t e p a t h w a y i nS t r e p t o c o c c u s l a c t i s : e f f e c t o n l a c t o s e a n d g a l a c t o s e m e t a b o -l i s m . J . B a c t e r i o l . 1 5 3 : 7 6 - 8 3 .5 . D i l l s , S . S . , A . A p p e r s o n , M . R . S c h m i d t , a n d M. H . S a i e r , J r .1 9 8 0 . C a r b o h y d r a t e t r a n s p o r t i n b a c t e r i a . M i c r o b i o l . R e v .4 4 : 3 8 5 - 4 1 8 .6 . F a r r o w , J . A . E . 1 9 8 0 . L a c t o s e h y d r o l y s i n g e n z y m e s i n S t r e p t o -c o c c u s l a c t i s a n d S t r e p t o c o c c u s c r e m o r i s a n d a l s o i n s o m e o t h e rs p e c i e s o f s t r e p t o c o c c i . J . A p p l . B a c t e r i o l . 4 9 : 4 9 3 - 5 0 3 .7 . F a r r o w , J . A . E . , a n d E . I . G a r v i e . 1 9 7 9 . S t r a i n s o f S t r e p t o c o c -c u s l a c t i s w h i c h c o n t a i n 0 - g a l a c t o s i d a s e . J . D a i r y R e s . 4 6 : 1 2 1 -1 2 5 .8 . F r a e i i k e l , D . G . 1 9 6 8 . T h e a c c u m u l a t i o n o f g l u c o s e 6 - p h o s p h a t ef r o m g l u c o s e a n d i t s e f f e c t i n a E s c h e r i c h i a c o l i m u t a n t l a c k i n gp h o s p h o g l u c o s e i s o m e r a s e a n d g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e -n a s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 3 : 6 4 5 1 - 6 4 5 7 .9 . G a r v i e , E . I . , J . A . E . F a r r o w , a n d B . A . P h i l l i p s . 1 9 8 1 . At a x o n o m i c s t u d y o f s o m e s t r a i n s o f s t r e p t o c o c c i w h i c h g r o w a t1 0 C b u t n o t a t 4 5 C i n c l u d i n g S t r e p t o c o c c u s l a c t i s a n d S t r e p t o -c o c c u s c r e m o r i s . Z e n t r a l b l . B a k t e r i o l . P a r a s i t e n k d . I n f e k -t i o n s k r . H y g . A b t . 1 O r i g . C 2 : 1 5 1 - 1 6 5 .1 0 . H a r t r e e , E . F . 1 9 7 2 . D e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n : a m o d i f i c a t i o n o ft h e L o w r y m e t h o d t h a t g i v e s a l i n e a r p h o t o m e t r i c r e s p o n s e .A n a l . B i o c h e m . 4 8 : 4 2 2 - 4 2 7 .1 1 . H i r s c h , A . 1 9 5 2 . T h e e v ol ut i on o f t h e l a c t i c s t r e p t o c o c c i . J .D a i r y R e s . 1 9 : 2 9 0 - 2 9 3 .1 2 . J o h n s o n , K . G . , a n d I . J . M c D o n a l d . 1 9 7 4 . 3 - D - P h o s p h o g a l a c t o -s i d e g a l a c t o h y d r o l a s e f r o m S t r e p t o c o c c u s c r e m o r i s H P : p u r i f i -c a t i o n a n d e n z y m e p r o p e r t i e s . J . B a c t e r i o l . 1 1 7 : 6 6 7 - 6 7 4 .1 3 . K a s h k e t , E . R . , a n d T . H . W i l s o n . 1 9 7 2 . R o l e o f m e t a b o l i ce n e r g y i n t h e t r a n s p o r t o f P - g a l a c t o s i d e s b y S t r e p t o c o c c u sl a c t i s . J . B a c t e r i o l . 1 0 9 : 7 8 4 - 7 8 9 .1 4 . L a w r e n c e , R . C . , T . D . T h o m a s , a n d B . E . T e r z a g h i . 1 9 7 6 .R e v i e w s o f t h e p r o g r e s s i n d a i r y s c i e n c e : c h e e s e s t a r t e r s . J .D a i r y k e s . 4 3 : 1 4 1 - 1 9 3 .1 5 . L o w r y , 0 . H . , a n d J . V . P a s s o n n e a u . 1 9 7 2 . A f l e x i b l e s y s t e m o fe n z y m a t i c a n a l y s i s , p . 1 6 8 - 1 7 0 . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N ewY o r k .1 6 . McKay, L . , A . M i l l e r I l I , W. E . S a n d i n e , a n d P . R . E l l i k e r . 1 9 7 0 .M e c h a n i s m s o f l a c t o s e u t i l i z a t i o n b y l a c t i c a c i d s t r e p t o c o c c i :e n z y m a t i c a n d g e n e t i c a n a ly s e s . J . B a c t e r i o l . 1 0 2 : 8 0 4 - 8 0 9 .1 7 . M c K a y , L . L . 1 9 8 2 . R e g u l a t i o n o f l a c t o s e m e t a b o l i s m i n d a i r ys t r e p t o c o c c i , p . 1 5 3 - 1 8 2 . I n R . D a v i e s ( e d . ) , D e v e l o p m e n t s i n

V O L . 1 5 7 , 1 9 8 4


7/7

3 4 CROW AND THOMAS

f o o d m i c r o b i o l o g y , v o l . 1 . A p p l i e d S c i e n c e P u b l i s h e r s , L o n d o n .1 8 . McKay, L . L . , L . A . W a l t e r , W. E . S a n d i n e , a n d P . R . E l l i k e r .1 9 6 9 . I n v o l v e m e n t o f p h o s p h o e n o l p y r u v a t e i n l a c t o s e u t i l i z a t i o nb y group N s t r e p t o c o c c i . J . B a c t e r i o l . 9 9 : 6 0 3 - 6 1 0 .1 9 . M o l s k n e s s , T . A . , D . R . L e e , W. E . S a n d i n e , a n d P . R . E l l i k e r .1 9 7 3 . f - D - P h o s p h o g a l a c t o s i d e g a l a c t oh y dr o la s e o f l a c t i c s t r e p -t o c o c c i . A p p l . M i c r ob i o l . 2 5 : 3 7 3 - 3 8 0 .2 0 . P o s t m a , P . W . , a n d S . R o s e m a n . 1 9 7 6 . T h e b a c t e r i a l p h o s p h o -e n o l p y r u v a t e : sugar p h o s p h o t r a n s f e r a s e s y s t e m . B i o c h i m .B i o p h y s . A c t a 4 5 7 : 2 1 3 - 2 5 7 .2 1 . R a h n , O . , C . P . H e g a r t y , a n d R . E . D e u e l . 1 9 3 8 . F a c t o r si n f l u e n c i n g t h e r a t e o f f e r m e n t a t i o n o f S t r e p t o c o c c u s l a c t i s . J .B a c t e r i o l . 3 5 : 5 4 7 - 5 5 8 .2 2 . T h o m a s , T . D . 1 9 7 6 . R e g u l a t i o n o f l a c t o s e f e r m e n t a t i o n i n gr o upN s t r e p t o c o c c i . A p p l. E n vi r o n . M i c r o b i o l . 3 2 : 4 7 4 - 4 7 8 .2 3 . T h o m a s , T . D . , D . C . E l l w o o d , a n d V . M. C . L o n g y e a r . 1 9 7 9 .C h a n g e f r o m h o m o - t o h e t e r o l a c t i c f e r m e n t a t i o n b y S t r e p t o c o c -cus l a c t i s r e s u l t i n g f r o m g l u c o s e l i m i t a t i o n i n a n a e r o b i c c h e m o -

s t a t c u l t u r e s . J . B a c t e r i o l . 1 3 8 : 1 0 9 - 1 1 7 .2 4 . T h o m a s , T . D . , B . D . W. J a r v i s , a n d N . A . S k i p p e r . 1 9 7 4 .L o c a l i z a t i o n o f p r o t e i n a s e ( s ) near t h e c e l l s u r f a c e o f S t r e p t o c o c -cu s l a c t i s . J . B a c t e r i o l . 1 1 8 : 3 2 9 - 3 3 3 .2 5 . T h o m a s , T . D . , K . W. T u r n e r , a n d V . L . C r o w . 1 9 8 0 . G a l a c t o s ef e r m e n t a t i o n b y S t r e p t o c o c c u s l a c t i s a n d S t r e p t o c o c c u i s cre-m o r i s : p a t h w a y s , p r o d u c t s , a n d r e g u l a t i o n . J . B a c t e r i o l .1 4 4 : 6 7 2 - 6 8 2 .2 6 . T h o m p s o n , J . 1 9 7 9 . L a c t o s e m e t a b o l i s m i n S t r e p t o c o c c u s l a c t i s :p h o s p h o r y l a t i o n o f g a l a c t o s e a n d g l u c o s e m o i e t i e s i n v i v o . J .B a c t e r i o l . 1 4 0 : 7 7 4 - 7 8 5 .2 7 . T h o m p s o n , J . , a n d B . M. C h a s s y . 1 9 8 2 . N o v e l p h o s p h o e n o l p y -r u v a t e - d e p e n d e n t f u t i l e c y c l e i n S t r e p t o c o c c u s l a c t i s : 2 - d e o x y -D - g l u c o s e u n c o u p l e s energy p r o d u c t i o n f r o m g r o w t h . J. B a c t e -r i o l . 1 5 1 : 1 4 5 4 - 1 4 6 5 .2 8 . T u r n e r , K . W . , a n d T . D . T h o m a s . 1 9 7 5 . U n c o u p l i n g o f g r o w t ha n d a c i d p r o d u c t i o n i n l a c t i c s t r e p t o c o c c i . N . Z . J . D a i r y S c i .T e c h n o l . 1 0 : 1 6 2 - 1 6 7 .


streptococcus lactis

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