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Structure et Dynamique des Lipides.
Master de Chimie, (Chimie Moléculaire du Vivant), Université Bordeaux 1
Erick Dufourc, UMR5248 CBMN, CNRS-UBx-BxINP, (+33 5 4000 6818, : [email protected]
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 1
Structure et Dynamique des Lipides.
Master de Chimie, (Chimie Moléculaire du Vivant), Université Bordeaux 1
Introduction: les membranes
A. Classes de lipides
B. Extraction, purification et caractérisation des lipides membranaires
C. Structures cristallines D. Hydratation des lipides
E. Dynamique des lipides
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 2
Les membranes biologiques
cellule
mitochondrie
Réticulum sarcoplasmique et Golgi
Virus HIV
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 3
Les membranes biologiques
Membrane plasmique et réseau d’actine
Double couche de lipides
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 4
A. Classes de lipides
1. Glycérolipides (dérivés du glycérol)
2. Sphingolipides (dérivés de la sphingosine)
3. Stéroïdes (dérivés du cholestérol)
4. Autres
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 5
A. Classes de lipides
A1. Les glycérolipides (dérivés du squelette glycérol)
a) Glycérophospholipides
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
OP
O-O
baseO
Base = H2C
CH2
N+
CH3
CH3
CH3choline H2C
CH2
N+
H
H
Hethanolamine H2C
CHC
H
H
OHHO
glycérol
H
H2C
CHN+
H
H
HC
O O-sérine
HOOH
OH
OH
OH
inositol
Ø 1,2–diacyl-sn-glycerol-3-phospho-base
chaînes de 12 à 24 carbones
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 6
A. Classes de lipides
Glycérophospholipide particulier :
Ø diphosphatidylglycérol (cardiolopide)
O
O
CH2
CH
H2CO
O
OP O-
O
O
O
O
CH2
CH
H2CO
O
OP
O-O
CH2
CH
H2C
OH
O
Présent dans les mitochondries
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 7
A. Classes de lipides
Nomenclature IUPAC :
• 1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphocholine
ou aussi :
• 1,2-diacylphosphatidylcholine
• phosphatidylcholine (PC)
abréviations :
PA = phosphatic acid
PC = phosphatidylcholine
PE = phosphatidylethanolamine
PS = phosphatidylsérine
PG = phosphatidylglycérol
PI = phosphatidylinositol
CL = cardiolipine
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 8
A. Classes de lipides
Ø 1,2–dialkyl-sn-glycerol-3-phospho-base (liens éther, archébactéries)
OCH2
CH (R)
H2C O
O
PO-
O
baseO
Ø 1-alkenyl-2–acyl-sn-glycerol-3-phospho-base (plasmogène, myéline, RS cardiaque)
O CH2
CH (R)1
H2C O
O
O PO-
O
O base
Vinyl-éther
Ø 1-acyl-sn-glycerol-3-phospho-base (lysolipides)
O
O
CH2
CH1
(R)
H2C O
HO
PO-
O
O baseHydrolyse de la fonction ester, lyso PC, lyso PE, …
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 9
A. Classes de lipides
Ø 1,2–diacyl-sn-glycerol-3 –sucre
Ø 1,2–diacyl-sn-glycerol-3 –sucre-sucre
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
O O
HOOH
OH
CH2OH
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
O O
HOOH
OH
O
HOOH
OH
CH2OH
O
Monogalactosyldiglycéride (MGDG)
Galactose (Gal)
Digalactosyldiglycéride (DGDG)
Algues, bactéries (peu chez les animaux)
b) Glycéroglycolipides
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 10
A. Classes de lipides
A2. Les sphingolipides (dérivés du squelette sphingosine)
a) Céramides (N-acyl sphingosine)
Ø sphingosine
(R)
(S)
OH
CH2OH
NH2C15
(R)
(S)
OH
CH2OH
NH
O
Longueur et insaturations variables
Contenus dans la peau
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 11
A. Classes de lipides
b) Sphingophospholipides (N-acyl sphingosine)
Longueur et insaturations variables
Sphingomyéline (base = choline), retrouvé dans les globule rouges
(R)
(S)
OH
NH
O
baseO
PO
O
O-
Ø céramide-1-phospho-base
Base = • Choline
• Éthanolamine • Inositol
• Glycérol
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 12
A. Classes de lipides
b) Sphingoglycolipides
Longueur et insaturations variables
Ø céramide-1-sucre
(R)
(S)
OH
NH
O
sucre
Cérébrosides (retrouvés dans le cerveau)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 13
A. Classes de lipides
c) sphingoglycolipides (cérébrosides)
Longueur et insaturations variables
Présents à la surface des cellules : reconnaissance, groupes sanguins (avec protéines glycosilées)
Ø céramide-1-sucres
sucres = • glucose (Glc)
• galactose (Gal)
(R)
(S)
OH
NH
O
sucre
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 14
A. Classes de lipides
A3. Les stéroïdes
a) Dérivés du cholestérol (animaux)
HO
A B
C D
HO
A B
C D
Ø sulfate de cholestérol
O-O3S
Ø esters de cholestérol
O
O
Peau, spermatozoïdes
Ex: palmitate de cholestérol (transport du cholestérol)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 15
A. Classes de lipides
b) Phytostérols (végétaux)
Principaux squelettes Cholestane
Ergostane
Stigmastane
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 16
A. Classes de lipides
c) Hopanoïdes (bactéries) (OH)
OH
(OH)
A3. Autres
a) Acides gras et alcools
En général de 12 à 24 atomes de carbone
Handbook of phospholipids, Cevc, Dekker, 1993
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010
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A. Classes de lipides
b) Diacylglycérols
O
O
CH2
CH (S)
H2C OH
O
O
Hydrolyse des phospho et glycolipides
c) Lipides des archébactéries (sédiments pétroles, volcans)
R O CH2
CH
H2C X
R OOH2C
HC
CH2X
O Liens éther
R =
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 18
B. Extraction, purification des lipides
B1. Extraction
Membranes + 20 volumes MeOH/CHCl3 (1:2)
Filtration centrifugation
Extrait lipidique (lipides solubilisés)
Séparation de phases: Phase méthanolique :
Sphingolipides acides Sphingoglycolipides
Phase chloroformique :
Phospholipides Stérols
Lipides non membranaires (mono, di, triglycérides,
acides gras)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 19
B. Extraction, purification des lipides
B2. Purification
LE TG
AG DG
C MG
PL
Rf 1
0
Rf 1
LN PE PI PS PC
SPH LPL
0
Rf 1
G7 G6 G5 G4 G3 G2 G1
0
1 2 3
Plaque de verre
Gel de silice
Front d’élution
Dépot
Chromatographie : colonne (alumine, silice), plaque (couche mince) –TLC-, liquide haute performance –HPLC-
1. Heptane/éther/acide acétique (60/40/2) : lipides polaires/non polaires
2. Méthanol/acide acétique/eau (60/50/14) : phospholipides
3. Propanol/eau (7/3) : gangliosides
Eluants
Migration : capillarité Révélation : UV, Iode, PO4, NH2 Séparation : affinité gel solvant
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 20
B. Extraction, purification des lipides
B2. Purification
HPLC : colonne de silice ou greffée C18, C6, etc
Temps de rétention Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010
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B. Extraction, purification des lipides
B2. Purification
Caractérisation des chaînes hydrocarbonées : GPC (lipides hydrolysés, acides gras méthylés -volatils-)
Temps de rétention
I C12:0
C14:0
C16:0
C18:1
C18:2
La quantité d’acides gras dans un mélange est proportionnelle à la surface d’un pic
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 22
B. Extraction, purification des lipides
B2. Composition lipidique des membranes
En % Myéline Érythrocyte Mitochondrie Microsome E. coli
Cholestérol 25 25 5 6 0
Pl totaux 32 56 95 94 100
Dont PE 14 20 28 17 80
PS 7 11 0 0 0
PC 11 23 48 64 0
PI 0 2 8 11 0
PG 0 0 1 2 15
diPG 0 0 11 0 5
SP totaux 32 18 0 0 0
autres 11 1 0 0 0
Certaines membranes ne contiennent qu’une classe de lipides ex: E. coli Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010
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B. Extraction, purification des lipides
Composition en acides gras dans les phosphocholines (PC)
Membrane 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 20:1 20:4
Cerveau humain (mat. Blanche)
1,3 34,3 1,0 13,4 45,2 0,4 1,1 1,3
Cerveau humain (mat. grise)
2,9 45,0 3,1 9,3 31,4 0,4 0,7 4,1
Cerveau rat 0,3 45,0 1,4 13,8 32,3 0,4 5,1
Cerveau poulet 0,7 51,0 16,5 26,3 0,7 3,9
Erythrocytes h. 31,2 11,8 18,9 22,8 0,5 6,7
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 24
B. Extraction, purification des lipides
Composition en acides gras dans les phosphoéthalamines (PE)
Membrane 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 20:1 20:4
Cerveau humain (mat. Blanche)
5,9 0,4 30,4 8,7 0,5 0,5 13,4
Cerveau humain (mat. grise)
6,2 1,1 13,8 43,2 0,5 6,0 7,9
Cerveau rat 0,3 8,3 0,8 28,5 13,2 0,2 0,2 13,2
Cerveau poulet 1,6 17,9 1,1 28,5 12,4 0,4 12,6
Erythrocytes h. 12,9 11,5 11,5 18,1 7,1 0,7 23,7
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 25
C. Structures cristallines
Méthodes
• Glycérolipides (dérivés du glycérol)
• Sphingolipides (dérivés de la sphingosine)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 26
C. Structures cristallines
Méthodes
Croissance des cristaux
Diffraction des RX
Reconstruction 3D
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 27
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
a) Glycérophospholipides
Ø DMPC ou 1,2–dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
OP
O-O
baseO
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
OP
O-O
baseO
Système cristallin : monoclinique
β = 97° c = 55,4 Å
a = 8,72 Å
b = 8,92 Å
4 molécules par maille
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 28
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Structure en bicouche dans le cristal
P
N
Liaisons hydrogène
Dipoles P->N
29
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Ø DMPC
Épaisseur Bicouche = 54,9 Å Épaisseur zone polaire = 10,4 Å
Aire moléculaire = 38,9 Å
Tilt des chaînes = 12°
Section 2 chaînes = 38 Å2
Chaîne sn-2 coudée
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 30
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Ø DLPE ou 1,2–dilauroyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine
Système cristallin : monoclinique
β = 92° c = 9,95 Å
a = 47,7 Å
b = 7,87 Å
4 molécules par maille
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 31
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Ø DLPE ou 1,2–dilauroyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine
P
N
Épaisseur Bicouche = 47,7 Å Épaisseur zone polaire = 7,9 Å
Aire moléculaire = 38,6 Å
Tilt des chaînes = 0°
Section 1 chaîne = 19,3 Å2
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 32
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Ø Lyso PC ou 1-lauroyl-sn-glycerol-3-phosphocholine
O
O
CH2
CH1
(R)
H2C O
HO
PO-
O
O base
Système cristallin : monoclinique
β = 99,7° c = 10,94 Å
a = 24,82 Å
b = 9,53 Å
4 molécules par maille
interdigitation
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 33
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Ø Lyso PC ou 1-lauroyl-sn-glycerol-3-phosphocholine
Liaisons hydrogène
Épaisseur Bicouche = 24,5 Å Épaisseur zone polaire = 7,3 Å
Aire moléculaire = 52,1 Å2
Tilt des chaînes = 41°
Section 1 chaîne = 19,7 Å2
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 34
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Ø Lyso PE ou 1-lauroyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine
Système cristallin : monoclinique
β = 99,7° c = 10,94 Å
a = 24,82 Å
b = 9,53 Å
4 molécules par maille
Dipoles P-N à plat
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 35
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Ø Lyso PE ou 1-lauroyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine
Réseau de liaisons hydrogène N -> O
Épaisseur Bicouche = 37,1 Å Épaisseur zone polaire = 7,1 Å
Aire moléculaire = 34,8 Å2
Tilt des chaînes = 57,5°
Section 1 chaîne = 18,7 Å2
Projection sur a-b
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 36
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
OP
O-O
baseO
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
OP
O-O
baseO
base = H
Ø DMPA ou 1,2 dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphatidic acid
Système cristallin : monoclinique
β = 114,19° c = 43,98 Å
a = 5,44 Å
b = 7,95 Å
2 molécules par maille
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 37
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Ø DMPA ou 1,2 dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphatidic acid
Chaîne sn-1 coudée
Structure en chevron
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 38
C. Structures cristallines
C1. Les glycérolipides
Ø DMPA ou 1,2 dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphatidic acid
P
Na
Épaisseur Bicouche = 40,1 Å Épaisseur zone polaire = - Å
Aire moléculaire = 43,2 Å2
Tilt des chaînes = 31°
Section 1 chaîne = 18,6 Å2
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 39
C. Structures cristallines
C.1 Les glycérolipides
Ø 1,2–diacyl-sn-glycerol-3 –sucre
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
O O
HOOH
OH
CH2OH
Monogalactosyldiglycéride (MGDG)
Galactose (Gal)
Pas de structure cristalline connue
a) Glycéroglycolipides
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 40
C. Structures cristallines
C.2 Les sphingolipides
Pas de structure cristalline connue
a) Céramides (N-acyl sphingosine)
(R)
(S)
OH
CH2OH
NH
O
b) Sphingophospholipides (N-acyl sphingosine)
(R)
(S)
OH
NH
O
baseO
PO
O
O-
Ø céramide-1-phospho-base
Pas de structure cristalline connue
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 41
C. Structures cristallines
C.2 Les sphingolipides
c) Sphingoglycolipides (cérébrosides)
(R)
(S)
OH
NH
O
sucre
Système cristallin : monoclinique
β = 99° c = 46,46 Å
a = 11,2 Å
b = 9,26 Å
4 molécules par maille
Ø β-D-galactosyl-N-(2-D-hydroxyoctadecanoyl)-D-dihydrosphingosine
Galactosyl ceramide (Cer-Gal)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 42
C. Structures cristallines
C.2 Les sphingolipides
c) Sphingoglycolipides (cérébrosides)
Épaisseur Bicouche = 45,9 Å Épaisseur zone polaire = - Å
Aire moléculaire = 51,9 Å2
Tilt des chaînes = 49°
Section 1 chaîne = 19,1 Å2
liaisons hydrogène
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 43
C. Structures cristallines
C.2 Les sphingolipides
d) Glycosphingosine
Ø 1-O-(β-O-glucopyranosyl)-D-ribo-3,4-dihydroxy-2-aminoctadecane
(R)
(S)
OH
CH2OH
NH2
sucre
Système cristallin : orthorhombique
c = 49,71 Å a = 11,36 Å
b = 5,26 Å
4 molécules par maille
Épaisseur Bicouche = 24,9 Å Épaisseur zone polaire = - Å
Aire moléculaire = 59,8 Å2
Tilt des chaînes = 48°
Section 1 chaîne = 19,8 Å2
Bicouche interdigitée
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 44
C. Structures cristallines
Résumé
Empilement cristallin = bicouches parfois interdigitées
Épaisseur Bicouche = 40 à 60 Å; 25 Å si interdigitation Épaisseur zone polaire = 10 Å
Aire moléculaire = 40-50 Å2 (Glycerophospho); 50-60 Å2 (Spingoglyco)
Tilt des chaînes = 0 à 60°
Section 1 chaîne = 19 Å2
Réseau de liaisons hydrogène
Système cristallin : monoclinique, orthorhombique
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 45
D. Hydratation des lipides
D1. Diagrammes de phase
D2. Lipides en excès d’eau
D3. Mélange de lipides en excès d’eau
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 46
D. Hydratation des lipides
D1. Diagrammes de phase (binaires : lipides + eau)
a) Phases
Lipides + eau Lyotropes (polymorphisme = f(conc))
Thermotropes (polymorphisme = f(T))
Règle de Gibbs : nombre de degrés de liberté F = C – P + 2
C = nombre de composants P = nombre de phases
F = C – P + 1 Ou à pression constante :
Régime d’hydratation limité, C=2 ü 1 phase, F=2 (concentration, température) ü 2 phases, F=1 (concentration ou température
ü 3 phases, F =0 (concentration et température fixées)
Excès d’eau, C=1 (concentration fixée : limite d’hydratation)
ü 1 phase, F=1 (température) ü 2 phases, F=0 (température fixée)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 47
D. Hydratation des lipides
b) Techniques de détermination de la nature des Phases
Ø Diffraction des rayons X ou des neutrons Bragg θλ sin d 2 lk,h,=
Grands angles : ordre à courte distance (3-5 Å), e.g., empilement de chaînes
Petits angles : ordre à longue distance (période > 10 Å), e.g., symétrie du réseau
Type de réseau : • micellaire (solution)
• Périodique 1D (lamellaire),
• Périodique 2D (hexagonal)
• Périodique 3D
dhsk /=
)( hkkhashk −+= 2222
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 48
D. Hydratation des lipides
b) Techniques de détermination de la nature des Phases
Ø Diffraction des rayons X sur un empilement lamellaire
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 49
D. Hydratation des lipides
b) Techniques de détermination de la nature des Phases
Ø RMN des solides du phosphore-31 (dispersion de phospholipides)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 50
D. Hydratation des lipides
b) Techniques de détermination de la nature des Phases
Ø cryofracture et microscopie électronique
Création d’une réplique d’un échantillon clivé à basse température
Phase lamellaire
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 51
D. Hydratation des lipides
c) Nomenclature des phases (lLuzzati, 1968)
L Réseau mono dimensionnel, lamellaire
P Réseau bi dimensionnel, oblique ou centré (ondulé)
H Réseau bi dimensionnel, hexagonal
HI Réseau bi dimensionnel, hexagonal normal, huile dans eau
HII Réseau bi dimensionnel, hexagonal inverse, eau dans huile
R Rhomboédrique
Q cubique
C Tridimensionnel, cristallin
LC Lamellaire cristallin
Ordre à longue distance
α Chaînes désordonnées, fluide
β Chaînes partiellement ordonnées, gel
β’ Chaînes partiellement ordonnées, tiltées, gel
δ Partiellement ordonné (hélicoïdal), gel
Ordre à courte distance
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 52
D. Hydratation des lipides d) Glycérophospholipides + eau
Ø DMPC, 1,2–dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
OP
O-O
baseO
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
OP
O-O
baseO
252 =lipide
OH
nn
172 =lipide
OH
nn
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 53
D. Hydratation des lipides
d) Glycérophospholipides + eau
Ø DPPC 1,2–dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine
92 =lipide
OH
nn
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 54
D. Hydratation des lipides
d) Glycérophospholipides + eau
Ø DLPE 1,2–didodécyl-rac-glycerol-3-phosphoéthanolamine
152 =lipide
OH
nn
TH ~ 120°C
80°C
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 55
D. Hydratation des lipides
d) Glycérophospholipides + eau
Ø DHPE 1,2–dihexadécyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine
52 =lipide
OH
nn
TH ~ 90°C
15°C
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 56
D. Hydratation des lipides
d) Glycérophospholipides + eau
Ø DAPE 1,2–diarachinoyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine
TH ~ 90°C
10°C
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010
57
D. Hydratation des lipides
d) Glycérophospholipides + eau
Ø Lyso PC O
O
CH2
CH1
(R)
H2C O
HO
PO-
O
O base
micelles
72 =lipide
OH
nn272 =
lipide
OH
nn
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 58
D. Hydratation des lipides
e) Glycéroglycolipides + eau
Ø MGDG O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
O O
HOOH
OH
CH2OH
1,2-dioleoyl-3-α-D-glucosyl-sn-glycerol
(Cubique inversé)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 59
D. Hydratation des lipides
d) Glycéroglycolipides + eau
Ø DGDG
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
O O
HOOH
OH
O
HOOH
OH
CH2OH
O
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 60
D. Hydratation des lipides
f) Sphingolipides + eau
Ø Spingophospholipides (R)
(S)
OH
NH
O
baseO
PO
O
O-
502 =lipide
OH
nn
Transition gel-fluide à
Tphisio
352 =lipide
OH
nnLα
Lβ’
Sphingomyéline, cerveau
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 61
D. Hydratation des lipides
f) Sphingolipides + eau
Ø Spingoglycolipides (Galcer)
(R)
(S)
OH
NH
O
sucre
252 =lipide
OH
nnLα
Lβ’
Lα+ H2O
Transition gel-fluide à
haute température
Cérébroside de cerveau de boeuf
Longueur et insaturations variables
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 62
D. Hydratation des lipides
D2. Lipides en excès d’eau
a) CMC (concentration micellaire critique)
Définition : nM Mn
micelles
Séparation de phase : monomères + micelles
La concentration en monomères est indépendante de la concentration totale : CMC
Énergie libre de formation des micelles : ΔG = RT Ln (CMC) CMC exprimée en mol.L-1 ou en fraction
molaire Ø Diacylglycerophosphocholines
- Ln
(CM
C)
10
5
nb de carbones (chaînes acyles) 6 10 16
DPPC (4,6 10-10 mol.L-1)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 63
D. Hydratation des lipides
D2. Lipides en excès d’eau
Ø Lyso PC, PE -
Ln(C
MC)
10
5
nb de carbones (chaînes acyles) 6 10 16 22
10-5 mol.L-1)
Ø Glycosphingolipides
(R)
(S)
OH
NH
O
sucre
Chaînes en C18-C22
CMC ~ 10-7 à 10-8 mol.L-1)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 64
D. Hydratation des lipides
D2. Lipides en excès d’eau
b) Phases en excès d’eau (C > CMC)
Ø Glycérophospholipides
Ø Glycéroglycolipides
Ø Sphingophospholipides
PC, PS séquence Lβ’ -- Pβ’ -- Lα PE séquence Lβ’ -- Lα -- HΙΙ Lysos micelles ∀ T
MGDG HII ∀ T (-10°C et 50°C)
DGDG Lα ∀ T (-10°C et 80°C)
séquence Lβ’ -- Lα
Ø Sphingoglycolipides séquence Lβ’ -- Lα
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 65
D. Hydratation des lipides
D2. Lipides en excès d’eau
c) Concept de forme (excès d’eau)
Explication de l’origine des différentes organisations lipidiques (Israelashvilli)
Ø Volume de la zone hydrophobe vs. Volume de la zone hydrophile
L
(PC,PS)
HI, II
(Lysos,DGDG)
HII, III
(PE,PG)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 66
D. Hydratation des lipides
c) Concept de forme (excès d’eau)
Ø paramètres influençant la nature des phases
L
(insaturations)
HI, II HII, III
(cholestérol)
(température)
(hydratation)
Ø compensation de formes
HI HII +
L
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 67
D. Hydratation des lipides
c) Concept de forme (excès d’eau)
Ø organisations lipidiques au sein d’une membrane biologique
HI, II
HII, III ?
L
Fusion de cellules
poumons
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 68
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases (excès d’eau)
Ø Définition
t
tt S
HTΔ
Δ=
Lβ (gel) Lα (fluide)
ordre désordreordre désordre
Tm
Th
hexagonal
En général : ΔHH << ΔHL
ΔSH << ΔSL
Th > Tm
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 69
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases, (excès d’eau)
v Températures de transition gel-fluide, Tm
Tm
40
10
nb de carbones (chaînes acyles) 12 16 22
70
Gel
Fluide
PC, PE, MGDG
Ø influence de la longueur des chaînes
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 70
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
Ø influence du nombre de doubles liaisons Tm
20
00
nb de doubles liaisons en cis et en trans 0 2 4
40
Gel
Fluide PC
(18:0) (18:n) sn-1 sn-2
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 71
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
Ø influence de la position de la double liaison Tm
20
00
Position de la double liaison 2 10 18
40
Gel
Fluide
PC
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 72
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
Ø influence de la position de la chaîne
1-(10:0)-2- (18:0) PC 10 PC
(n:0) (m:0) sn-1 sn-2
1-(18:0)-2- (10:0) PC 18.6
1-(14:0)-2- (18:0) PC 39.5 1-(18:0)-2- (14:0) PC 30.5
1-(16:0)-2- (18:0) PC 49 1-(18:0)-2- (16:0) PC 44
1-(12:0)-2- (22:0) PC 37.5 1-(22:0)-2- (12:0) PC 43
Tm °C
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 73
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
Ø influence de la longueur de l’une des chaînes Tm
20
00
n, chaîne sn-2 10 16 22
40
Gel
Fluide
PC
(16:0) (n:0) sn-1 sn-2
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 74
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
Ø influence du pH, ex DMPA Tm
20
pH 2 5 8
40
Gel
Fluide
pKa1 pKa2
PO4H2 PO4- H, liens H PO4
2-, répulsions
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 75
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
Ø influence de la nature de la tête polaire Tm
40
Nature de la tête polaire PA PE PG
50
Fluide
30
20 Gel
PS PC
tête
(14:0) (14:0) sn-1 sn-2
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 76
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
O O
HOOH
OH
CH2OH
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
Ø influence du nombre de sucres sur la tête polaire
Tm
Nombre de sucres sur la tête polaire 1
70
Fluide
50
Gel
2
n
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 77
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
v Températures de transition Lα-HII, Th Th
100
80
nb de carbones (chaînes acyles) 12 16 22
120
Lα
HII
PE
Ø influence de la longueur des chaînes
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 78
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
Ø influence du nombre de doubles liaisons Th
50
0
nb de doubles liaisons en cis et en trans 0 2 4
100
PE
(18) (18)
Lα
HII
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 79
D. Hydratation des lipides
d) Températures de transition de phases
Ø influence de la force ionique Th
90
80
[NaCl, M] 0 2 4
100
Lα
HII
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 80
D. Hydratation des lipides
e) Hydratation des interfaces
Ø Aire par tête polaire en phase Lα (excès d’eau) H2C
CH2
N+
CH3
CH3
CH3choline
H2C
CH2
N+
CH3
CH3
CH3choline
H2C
CH2
N+
H
H
Hethanolamine
H2C
CH2
N+
H
H
HethanolaminePC = 70 Å2 PE = 57 Å2
DGDG = 80 Å2
PC + Chol (1:1) = 100 Å2
PE + Chol (1:1) = 70 Å2
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
OP
O-O
baseO
HO
A B
C D
HO
A B
C DO
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
O O
HOOH
OH
O
HOOH
OH
CH2OH
O
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 81
D. Hydratation des lipides
e) Hydratation des interfaces
Ø Variation de l’aire de la tête avec la température (excès d’eau)
S (Å
2 )
Température °C Tp
70
50
Tm
PC
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 82
D. Hydratation des lipides
e) Hydratation des interfaces
Ø Variation de l’aire de la tête avec la température (excès d’eau)
S (Å
2 )
Température °C Tm
70
40
Th
PE
50
60
ordre désordreordre désordre
déshydratation
83
D. Hydratation des lipides
f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS
Ø Glycérophosphocholines (DPPC)
(Å)
Température °C 30
20
10
Tm
30
50
40
60
10 20 60
dl
dl
d
d
dw
dw
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 84
D. Hydratation des lipides
f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS
Ø Effet de la longueur de chaîne en phase fluide T=Tm + 5°C (PC)
(Å)
Nombre de carbones 14
20
10
16
30
50
40
60
12 18
dl
d
dw
PC
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 85
D. Hydratation des lipides
f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS
Ø Glycérophosphatidyléthanolamines (DLPE)
(Å)
20
10
30
50
40
dl
d
dw
Température °C 60 80 20 40 100 120
dl
d
dw
dl
dw d32a =
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 86
D. Hydratation des lipides
(Å)
Nombre de carbones 14
20
10
16
30
50
40
60
12 18
dl
d
dw
PE
dl
d
dw
f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS
Ø Effet de la longueur de chaîne en phase fluide T=Tm + 5°C (PE)
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 87
D. Hydratation des lipides
f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS
Ø Effet de la longueur de chaîne en phase HII T=Th + 5°C (PE)
(Å)
Nombre de carbones 14 16
20
60
40
80
12 18
dl
a
dw
PE
dl
dw d32a =
20
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 88
D. Hydratation des lipides
f) Paramètres dimensionnels
Ø Glycérophospholipides (PS, PA, PG)
H2C
CHN+
H
H
HC
O O-
H2C
CHC
H
H
OHHO
(Å)
Teneur en eau en % (H20/Lip) 40 50
40
80
60
100
30
dl
d
dw
20
Comportement gonflant
DMPS.NH4+
Phase Lβ’
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 89
dl
d
dw
dl
dw d32a =
D. Hydratation des lipides
f) Paramètres dimensionnels
Ø Glycéroglycolipides en excès d’eau
(Å)
Température °C 20
20
60
40 dl
a
dw
0
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
O O
HOOH
OH
CH2OH
(Å)
20
20
60
40 dl
d
dw
0
Phase HΙΙ Phase Lα
Température °C
O
O
CH2
CH (R)
H2C O
O
O O
HOOH
OH
O
HOOH
OH
CH2OH
O
MGDG DGDG
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 90
D. Hydratation des lipides
f) Paramètres dimensionnels
Ø Glycosphingolipides (GalCer) en excès d’eau
(Å)
Température °C 50 70
50
60
30 90
d
d
Cn C24:0
C16:0
LC Lα
(R)
(S)
OH
NH
O
sucre
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 91
D. Hydratation des lipides
D3. Mélanges de lipides en excès d’eau
a) Systèmes binaires en excès d’eau
F = C – P + 1 A pression atmosphérique
ü Existence d’1 phase, P=1, sur une gamme de composition et/ou température variables F=2
Excès d’eau, C=2
ü Existence de 2 phases, P=2, sur une gamme de composition ou de température définies par les limites du diagramme, F=1
ü Existence de 3 phases, P=3, pour une composition et une température fixées (point singulier) F=0
Eutectique Péritectique Monotectique Formation de composés « complexes »
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 92
D. Hydratation des lipides a) Systèmes binaires en excès d’eau
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 93
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau
Ø DMPC/DPPC C14/C16
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
isomorphe
F+G
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 94
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau
Ø DMPC/DSPC C14/C18
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
isomorphe
F+G
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 95
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau
Ø DMPC/DAPC C14/C20
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
isomorphe
F+G
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 96
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau
Ø DMPC/DBPC C14/C22
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
isomorphe
F+G
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 97
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau
Ø DMPC/DSPC C14/C18
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
F+G
Ø DSPC/DBPC C18/C22
Ø différence des longueurs de chaîne
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
F+G
20°C
25°C
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 98
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau
Ø DPPC/DPPE C16/C16
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
F+G isomorphe
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 99
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau
Ø D0PC/DPPE C16/C16
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
F+G Monotectique, péritectique ?
2° phase Lα
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 100
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau
Ø DEPC/DPPE C20:1/C16
Lα, Fluide
Lc, Lβ‘, Gel
F+G Monotectique
2° phase Lα
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 101
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau
Ø DEPC/DPPE C16/C16
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
péritectique
2° phase Gel
F+G
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 102
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides/Sphigophospholipides en excès d’eau
Ø DMPC/SPM C14/C16
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
F+G
Analogue à PC/PC
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 103
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides/Sphigoglycolipides en excès d’eau
Ø GalCer/DPPC C14/C16
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
Phase cristalline
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 104
D. Hydratation des lipides
a) Mélanges de glycérophospholipides/cholestérol en excès d’eau
Ø DPPC/Chol
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
Phase β : intermédiaire entre
fluide et gel :
liquide ordonné
HO
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 105
E.1. Les mouvements a) Isotropes
b) Anisotropes
c) Hydrodynamique
E.2 Mesure de la dynamique
a) Mouvements intramoléculaires
b) Mouvements moléculaires
c) Mouvements collectifs
E.3 Quelques Exemples
E.4. Notions de fluidité membranaire
E. Dynamique des lipides
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 106
0 20 40 60 80 100-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
τ
G(τ)
0 20 40 60 80 100-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
τ
G(τ)
E.1. Les mouvements
Les mouvements isotropes Ø Molécules en solution Ø Colloïdes de faible taille (< 1000Å)
Equation de Stokes (diffusion isotrope) :
383
61
RTkD B
c πητ==
Viscosité η
2R
Fonction d’auto-corrélation
τc = temps de corrélation du mouvement considéré
ceG ττ
τ−
=)(
E. Dynamique des lipides
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 107
E. Dynamique
E1. Les mouvements
Les mouvements anisotropes (direction privilégiée de mouvement)
Intramoléculaire τc ∼ 10-12-10-9 s
Rotations,
isomérisations gauche-trans,
fluctuations locales
Moléculaire τc ∼ 10-9-10-6 s
Rotations, balancement,
diffusion anisotrope
Collectifs τc ∼ 10-6-10-1 s
Modes hydrodynamiques de déformation, twist,
splay, etc.
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 108
E. Dynamique
a) Mouvements intramoléculaires
R
R’
RR’
RR’
trans gauche + gauche -
E
Angle de rotation
Rotations autour de liaisons, vibrations
Temps caractéristique, ps
JJ D6
1=τ
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 109
E. Dynamique
Mouvements locaux dans une phase cristal liquide
C DC DC DC D
ZD
énergie d’une configuration i
i
iidisp
ii AEEE γ++= int
ZTk
Eep B
i
i
−=
Probabilité d’existence d’une configuration donnée
Énergie potentielle (isomérisation)
Attraction entre chaînes (champ moyen)
Répulsions stériques
γ = pression latérale A = surface de la configuration i
Z = fonction de partition
JJ D6
1=τ
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 110
E. Dynamique
Le concept de paramètre d’ordre (Saupe, 1964), phases de cristaux liquides
CH
H
βi
ZD Zk
k
ZD ZD : Axe moléculaire
Zk : Axe local, ⊥ plan H-C-H
Conformère i
Cas à symétrie axiale : orientation d’un axe Z par rapport à un autre axe Z
21β3cosS i
2
izz,−
=k
ii
k p izz,zz S S ∑=Paramètre d’ordre (local) de la position k
Chaîne rigide, ordonnée
1Szz =k
Ptrans = 1 Pj = 0
Chaîne « liquide », désordonnée
0Szz =k
équiprobabilité Pj = Pi
Intérêt :
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010
111
E. Dynamique
Diffusion latérale dans le plan de la bicouche
Equation de diffusion à deux dimensions
τc P 1DP D
tP
2
22
⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
∂
∂+
∂
∂=∇=
∂
∂
rrrLL
P(r,t) = probabilité, au temps t qu’une molécule soit à une distance r de l’origine
DL = coefficient de diffusion Latérale (m2s-1)
b) Mouvements moléculaires
Analogie avec le libre parcours moyen <r> d’une particule :
cL
rD
τ4
2
=t = 0
t = τc
r
RTkD B
πη8=(cas isotrope, particule sphérique : )
Lipides : Fréquence νj, distance λ
2
41
λν jLD =
Valeurs types : DL = 10-11 à 10-12 m2s-1
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 112
E. Dynamique
Diffusion transverse
Flip-flop
t½
b) Mouvements moléculaires
Bicouches étendues : γin = ½ , kin = kout = k/2
out
in
[Lout] [Lin] kin
kout
kin = γin k kout = (1-γin) k γin = nin/ (nin+ nout)
γin
t t½
0,5 t½ = 1/ (Ln2 k)
Valeurs typiques : t½ = heures, jours
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 113
E. Dynamique
Diffusion rotationnelle anisotrope
ZN ZN : Axe directeur, ⊥ couche
2
2
//2
22 PDPθcot
θPsinθ
θsinθ1D
tP
ϕϕ ∂
∂+⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
∂
∂+⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛∂
∂
∂
∂=
∂
∂⊥
Équation de rotation diffusion anisotrope :
ZD : Axe de diffusion moléculaire rotation
oscillation Z N
X N
Y N
θ
ϕ
P(θ,ϕ,t) = probabilité, au temps t d’avoir une orientation de la molécule définie par θ et ϕ
D// = coefficient de diffusion // à l’axe de diffusion moléculaire
D⊥ = coefficient de diffusion ⊥ à l’axe de diffusion moléculaire
Temps de corrélation de rotation anisotrope
//// D6
1=τ
⊥⊥ = D6
1τ
b) Mouvements moléculaires
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 114
E. Dynamique
Paramètre d’ordre moléculaire
ZN
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ −=
213
2θλθ
cos)(U
θ
λ = amplitude du potentiel
ZD Rotation restreinte de ZD dans un potentiel d’orientation de la forme :
13cosS 221
zz −= θ
Paramètre d’ordre moléculaire :
( )( )
( )
∫
∫ −
=π
0
TkθU-
π
0
TkθU-
2
21
dθ sinθe
dθ sinθe 1θ3cos
B
B
Intérêt : Pas d’oscillation
1Szz =
Oscillations sur (0-π) équiprobables
0Szz =
b) Mouvements moléculaires
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 115
E. Dynamique
Mouvements collectifs dans une phase cristal liquide Z0
ξ
Fluctuations ξ(q)
ZN Déformation d’une couche (film)
Hydrodynamique : analyse des déformations en une large distribution de modes q activés thermiquement (de Gennes, 1974) dl
22ll
B2
Kqλ dTk(q)ξ =
K = constante d’élasticité de la couche Q = vecteur d’onde du mode q
λl = longueur de cohérence (µm)
η = viscosité
λl
Temps de corrélation : 2Kqητ(q) =
c) Mouvements collectifs
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 116
E. Dynamique
Quelsques modes de déformation c) Mouvements collectifs
Module d’élasticité de courbure, kc (Κ)
ΚModule d’élasticité de courbure gaussienne,
Courbure sphérique Courbure gaussienne
Etirement
Module élastique d’étirement, kS
Module élastique de compression,
Compression
Β
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 117
E. Dynamique
Caractérisation de la dynamique des lipides à différentes échelles
Intramoléculaires (rotations, vibrations)
qques Å, akj
kzz
kc E,p,S(ps),τ
Moléculaires (rotations, oscillations, translation flip-flop)
qques 10 Å, aLzz E ,D , t,S (ns), τ(ns),τ21//⊥
Film lipidique (modes hydrodynamiques de déformation)
qques µm, ηµ k(k s),-s(τ SC ),,,, ΒΚKq
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 118
E. Dynamique
E2. Mesure de la dynamique
a) Mouvements Intramoléculaires
Ø Spectroscopies infrarouge et Raman
Modes d’élongation (stretching) C-H ou C-D
2800 2900 3000
2930
2880
2800 2900 3000
2930 2880
Gel Fluide
cm-1 cm-1
2880
2930
hh
Le déplacement des bandes est proportionnel au nb d’isomères gauche (g±) par chaîne lipidique
Raman
2800 2900 3000
2850
2920 Gel
cm-1
Fluide
∝ nb d’isomères gauche (g±) par chaîne lipidique
IR
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 119
E. Dynamique
Ø Résonance paramagnétique électronique
O
O
H2C
CH
CH2
O
O
O
P
O
O-O
N+
N
O
O°
Radical nitroxide
Interaction entre le spin électronique (s = ½) de l’électron célibataire et le spin nucléaire de l’azote -14 (I = 1)
Domaine des micro-ondes, ν = 1010 Hz, éclatement hyperfin, ΔH
Pour des raisons historiques, le spectre est représenté en mode dérivée
B0
B0
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 120
E. Dynamique
ü Exemple: spectre RPE d’un lipide marqué (N-0°) dans une phase lamellaire
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
Isotrope
molzz
intrazz S SΔH∝
L’éclatement hyperfin permet d’accéder aux paramètres d’ordre des chaînes
O
O
H2C
CH
CH2
O
O
O
P
O
O-O
N+
N
O
O°
O
O
H2C
CH
CH2
O
O
O
P
O
O-O
N+
O
O
H2C
CH
CH2
O
O
O
P
O
O-O
N+
Inconvénient = sondes encombrantes, peu précises en phase gel
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 121
E. Dynamique
Ø RMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …
Lα, Fluide
Lβ‘, Gel
molzz
intrazz S SΔ ∝σ
-10 0 10 Frequency (kHz)
Lc
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
O
O
H2C
CH
CH2
O
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
C
H2C
CH2
CH2
O
O
PO
O-O
H2C
H2C N+
H3CCH3
CH3
H
H
Anisotropie de blindage électronique Spectres
Dispersions de lipides dans l’eau
Δσ
Accès au paramètre d’ordre de la tête
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 122
E. Dynamique
Ø RMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …
3
molzz
intrazz S SΔr
D∝
Couplage spin-spin direct (dipolaire), 13C-13C, 13C-1H, (1H-1H) Spectres
Dispersions de lipides dans l’eau
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
O
O
H2C
CH
CH2
O
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
CC
H2C
CH2
CH2
O
O
P
O
O-O
H2C
H2C N+
H3CCH3
CH3
H
HH
H
-15 -10 -5 0 5 10 15 Frequency (kHz)
Echantillon orienté dans B0 ΔD
Accès aux paramètres d’ordres des segments C-C, C-H, aux distances
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 123
E. Dynamique
Ø RMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …
molzz
intrazz S SΔ ∝Q
Interaction magnétique la plus facile à utiliser, C-D
Couplage électrique quadrupolaire, 2H, 14N, … Spectres
Dispersions de lipides dans l’eau
-90 -60 -30 0 30 60 90 Frequency (kHz)
Echantillon orienté dans B0 ΔQ
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
O
O
H2C
CH
CH2
O
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
C
C
H2C
CH2
CH2
O
O
P
O
O-O
H2C
H2C N+H3C
CH3
CH3
DDH
H
Accès aux paramètres d’ordres des segments C-D
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 124
E. Dynamique
Ø RMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …
Temps de relaxation magnétique nucléaire
xL yL
zL M0
xL yL
zL M0 Mz(t)
t
)e - (1 M (t)M 1ZTt -0z =
équilibre perturbation
Retour à l’équilibre
0 20 40 60 80 100-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
τ
G(τ) G(τ)= exp(-τ/τc)
τc = temps de corrélation du mouvement considéré
∫+∞
∞−
τω− ττ=ω d e GJ 0i0 )()(
220
01
1 12
c
cZ JT
τωτ
ω+
=∝− )(
Temps de relaxation longitudianal « spin-réseau », T1Z
G(τ), fonction d’autocorrélation liquide
solide
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 125
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010
10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-410-2
10-1
100
101
102
103
104
105
106
E. Dynamique
Ø RMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …
Temps de relaxation magnétique nucléaire
Mesure de T1Z pour plusieurs températures ou ω0
τc (s)
T1Z (s) ω0/2π = 500 MHz ω0/2π = 100 MHz
ω0/2π = 1000 MHz
ω0/2π = 10 MHz
107 Hz < ω0/2π < 109 Hz
Avec T1 (min) : τc = 1/ω0
10-8 s < τc < 10-10 s
v ω0 τc << 1, mouvements rapides, 10-10s < τc < 10-12 s
v ω0 τc >> 1, mouvements lents, 10-6 s < τc < 10-8 s [10-6 s , 10-12 s] 126
E. Dynamique
b) Mouvements Moléculaires
Ø Diffusion latérale
DL
FRAP (Réapparition de la fluorescence après photoblanchiement)
N+
N+
Sondes de fluorescence, DPH, TMA-DPH, NBD-PC,
NBD-PE
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
O
O
H2C
CH
CH2
O
NHO
O
P
O
O-O
H2C
H2C N+
H3CCH3
CH3
N
O NNO2
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
O
O
H2C
CH
CH2
O
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
C
C
H2C
CH2
CH2
O
O
P
O
O-O
H2CCH2
NH
H
HH
H
N
O
N
NO2
équilibre Photoblanchiement (laser)
Bicouches ou monocouches sur balance de Langmuir (observation au microscope)
LDt e BA −−
F
t
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 127
E. Dynamique
b) Mouvements Moléculaires
Ø Diffusion latérale
LDt e−
F
t
Marqueurs de fluorescence chargés
cathode anode cathode anode E = 0 E ≠ 0
E = 0
E ≠ 0 E = 0
Fonctions en
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 128
E. Dynamique
b) Mouvements Moléculaires
Ø Diffusion transverse
t
RPE
Utilisation de marqueurs de spin H3C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C O
O
CH2
CH
H2CO
H3CCH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C CH2
OO
P O
O
O-CH2
CH2
N+
CH3
H3C N O°
CH3H3C
CH3H3C
Incorporation du marqueur de spin
Signal de RPE
Addition d’un agent réducteur (ascorbate)
Flip-flop Réduction ultérieure Si
gnal
RPE
t½
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 129
E. Dynamique
b) Mouvements Moléculaires
Ø Diffusion rotationnelle isotrope
RMN ou RPE (voir mouvements intramoléculaires)
rotation
oscillation Z N
X N
Y N
θ
ϕ
Accès à τ//, τ⊥, Ea, molzz
intrazz S S
Dans le cas de molécules rigides, on peut séparer et intrazzS
molzzS
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 130
E. Dynamique
b) Mouvements Moléculaires
Ø Diffusion rotationnelle isotrope Fluorescence fluorophores rigides
N+
Lumière naturelle
Avant excitation
excitation
Photo sélection (ps)
Lumière polarisée
Milieu anisotrope
liquide
I// > I⊥
I// = I⊥
Anisotropie ou polarisation de fluorescence
⊥
⊥
+
−=
IIIIr2//
//
⊥
⊥
+
−=
IIIIP
//
//
t (ns)
r
r∞
r0 0,4
0,0
//)()( τt
errrtr−
∞∞ −+= 0
2)( molzzSr ∝∞
τ// = temps de corrélation de rotation du fluorophore,
doit être plus petit que le temps de vie de l’état
excité
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 131
E. Dynamique
c) Mouvements collectifs
50 µm
Ø Fluctuations thermiques de vésicules (liposomes) géantes
Observation au microscope optique
Fluctuations du rayon moyen dans le plan équatorial
2)(tumn
),()(
pkTktu m
nC
Bmn σλ
12=
Tensions de membrane Pression hydrostatique
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 132
E. Dynamique
c) Mouvements collectifs
Ø RMN et DRX (expérience de dilution/gonflement)
Z0
ξ
ZN
dl
λl
d CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
O
O
H2C
CH
CH2
O
CH3
H2C
CH2
H2C
CH2
C
C
H2C
CH2
CH2
O
O
P
O
O-O
H2C
H2C N+H3C
CH3
CH3
DDH
H
Lipide marqué au deutérium
-90 -60 -30 0 30 60 90 Frequency (kHz)
ΔQ RMN
DRX
molzz
intrazz
collzz S S SΔ ∝Q
( )22
2collzz 1
1cos 2
13SuΔ+
=−
= ξξ ;cos
Constants lors de la dilution
d
ΔQ
( ) ⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛=Δ
dkLn
kdfu C
C
2
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 133
Labeled carbon position
0
20
40
60
80
100
120
140
2 9 14γ β α g3 g2 g1
1 / T
1z (H
z)
Labeled carbon position
0
20
40
60
80
100
120
140
2 9 14γ β α g3 g2 g1
1 / T
1z (H
z)
Ø (Lα)
E. Dynamique
c) Mouvements intramoléculaires
E2. Quelques exemples
intrazzS Fluide
0.3
0.6
//
1.0
0.9
0.8
0.0
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 134
E. Dynamique
c) Mouvements intramoléculaires
intrazzSØ (Lα)
0.5
0.0
Température Tm
1.0
Gel
Fluide intrazzS
4
13
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 135
E. Dynamique
c) Mouvements intramoléculaires
Ø Ordre dans la bicouche en phase Lα, Lβ’, HII, HI
0.5
0.0
# Carbone des chaînes 2
1.0
intrazzS
4
13
4 6 8 10 12 14 16
Lβ’
Lα
HI
HII
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 136
E. Dynamique
c) Mouvements intramoléculaires
Ø Probabilités de conformères trans-gauche en phase Lα
0.5
0.0
# Carbone des chaînes 2
1.0
kip
4 6 8 10 12 14 16
trans
gauche
2.0
0.0
Température
4.0
Tm
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 137
E. Dynamique
c) Mouvements intramoléculaires
Ø τc, Ea (kJ mol-1)
1/Tm
10-10
3 3.5 4 x103 K-1
10-8
10-6
10-4
10-2
Lα Lβ’ Pβ’
1/Tm
10-12
3 3.5 4 x103 K-1
10-11
10-10
10-4
10-2 4
13
τc (s) τc (s) tête chaînes
12
50
45
20
8
8 15
15
Lα Lβ’ Pβ’
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 138
E. Dynamique
c) Mouvements intramoléculaires
Ø Effet du cholestérol τc, Ea (kJ mol-1),
1/Tm
10-12
3 3.5 4 x103 K-1
10-11
10-10
10-4
10-2
τc (s) chaînes
Lα Lβ’ Pβ’
0.5
0.0
Température Tm
1.0
4
13
+ Chol
- Chol
intrazzS
intrazzS
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 139
E. Dynamique
c) Mouvements moléculaires Ø Diffusion transverse
Température (°C) 30 20 50 40
t½(h)
20
1
10
Vésicules phospholipidiques, t½ = 1 - 1000 heures, Ea ~ 8-150 kJ mol-1
DMPC
Effet de la longueur de chaîne : n ↑, t½ ↑
Nature de la tête, PE/PC : t½ ~ 1900 h
t½
out
in
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 140
E. Dynamique
c) Mouvements moléculaires Ø Diffusion transverse
Temps d’incubation avant réduction du NO° (h) 2.5 0
Sign
al R
PE n
on r
édui
t
100 %
0
50 %
Membrane du Globule rouge
O
O
H2C
CH
CH2
O
O
O
P
O
O-O
N+
N
O
O°
5
PS
PE
PC SM
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 141
E. Dynamique
c) Mouvements moléculaires
Ø Diffusion Latérale
SM PC PE
30
10
20
Température (°C) Tm
DL x
10-
12 m
2 s-1
100
0.01
1
Peu d’influence de la longueur de chaîne
Nature de la tête (Lα)
DL x
10-
12 m
2 s-1
Température
Vitesse de saut d’un lipide à l’autre
10 ns
1 µs
0.1 ms
+ Cholestérol
τc
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 142
Température
0.5
0.0
Tm
1.0
molzzS
Lα Lβ’ Pβ’
+ 30% cholestérol
E. Dynamique
c) Mouvements moléculaires
Ø Diffusion rotationnelle
1/Tm
10-9
3 3.5 4 x103 K-1
τc (s)
Lα Lβ’ Pβ’
10-6
10-3
rotation
oscillation
τ//
τ⊥
+ 30% chol
60
90
35
Ea en kJ mol-1
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 143
1.5
1.0
2.0
Lα
E. Dynamique
c) Mouvements collectifs
Ø Longueur des chaînes k C
x10
-19 J
400 500 600 Å2 (d2)
kC ~ d2
DLPC DMPC DPPC Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010
144
1.5
1.0
2.0
E. Dynamique
c) Mouvements collectifs
Ø température, cholestérol
k C x
10-1
9 J
Tm Tm+5°C
3.0
1.0
5.0
k C x
10-1
9 J
0 20 40 % cholestérol température
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 145
E. Dynamique
E.4 Notions de fluidité membranaire
Fluidité : ensemble des phénomènes dynamiques se produisant aussi bien à l’échelle de l’Å que du micron (intra-, moléculaire, collectif)
Ø Rôle de la fluidité membranaire :
Assurer un fonctionnement cellulaire correct Barrière sélective
v diffusion d’ions et de molécules
o dans le plan de la membrane
o à travers la membrane
v déformation de la membrane
o passage de cellules dans les capillaires
v fusion (endocytose, exocytose)
v stabilisation de récepteurs à la surface de canaux membranaires
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 146
E. Dynamique
Fluidité membranaire adéquate
Ø Réactions membranaires
DL
La vitesse de réaction est contrôlée par la diffusion latérale des protéines
Dépend de DL des lipides
Ø Transport
1/T x 10-3
Lα
Lβ’
0.1
1
10
100
Vite
sse
de t
rans
port
Ex: transport actif de b-galactoside à travers la membrane
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 147
E. Dynamique
Régulation de la fluidité membranaire
Perturbations extérieures (température, diète, pH, …)
Compensations (molécules régulatrices, synthèse de double liaisons dans les acides gras, cholestérol, …)
Fluidité optimale CONSTANTE
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 148
E. Dynamique
Hétérogénéité de la fluidité membranaire
Les radeaux lipidiques
Image en microscopie de fluorescence d’îlots dans une membrane
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010 149
E. Dynamique
The role of phytosterols in plant adaptation to temperature
Beck, J. G., Mathieu, D., Loudet, C., Buchoux, S., and Dufourc, E. J. (2007) Plant sterols in "rafts": a better way to regulate membrane thermal shocks., FASEB J 21, 1714-1723.
Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2010
0 10 20 30 40 50 60
40
60
80
100
120
140
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
M1 [k
Hz]
[T] °C
|2*<
S CD> ch
ain|
so
ld
lo
so
ld
lo
2
34
5
101
HO 67
89
19
H
14
1312
11
15
16
17
20
2122
2324
25
27
26
H
18
H
H
HO
CH3
H
H3C
CH3
CH3
H
CH3
H
H
CH3
Cholesterol
Sitosterol
50 kHz
150