STUDIO FUNZIONALE DI UNA PROTEINA ATTRAVERSOLA SUA INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE

- Cromatografia per affinità (saggio in vitro) (es: saggi pull-down)

- Phage display (saggio in vivo)

- Sistema del doppio ibrido di lievito (saggio in vivo)

Un dominio può quindi essere definito come un’unità strutturale, con ripiegamenti tridimensionali, che costituisce una unità funzionale autonoma rispetto al resto della proteina, che di solito è evolutivamente conservata

I domini proteici vengono di solito identificati e classificati rispetto alle loro caratteristiche strutturali, funzionali ed evolutive.

Concetto di dominio proteico

Cromatografia per affinità (saggio in vitro)

Una certa proteina (“esca”) viene immobilizzata su una matrice di supporto inerte di una colonna cromatografica nella quale viene fatto passare un lisato cellulare. In genere la proteina “esca” è fusa con un’altra proteina (attaccata alla matrice solida).

Le proteine (prede) che interagiscono con l’esca sono trattenute nella colonna, le altre trascinate via. Successiva eluizione aumentando la concentrazione salina del tampone

ESCAProteina di fusione

(es: una certa proteina fusa con GST)

PREDAProteina da individuare

CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’ (saggio di pull-down)

CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’ (pull down)

Tag = GST

Colonna conGlutatione

Analisi della/e proteina:digestione proteolitica e spettrometria di massa

Una “esca” cattura un complessoproteico

Phage-display

“Esibizione” di proteine sulla superficie di un batteriofago filamentoso, es: M13- Fusione di un gene di una proteina di rivestimento del fago con l’intero gene (oppure con dominio proteico) di interesse- Trasfezione in E. coli- Espressione della proteina ibrida nel rivestimento del fago

COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI PHAGE DISPLAY

- Produzione di fagi ricombinanti ottenuti clonando miscele di cDNA ottenuti da tessuti (librerie di espressione specifiche)

- Ogni fago esprime ed “esibisce” una proteina di interesse fusa con quella fagica

COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI PHAGE DISPLAY

- Per vagliare una proteina di interesse: - immobilizzazione della proteina su particelle in una colonna - immobilizzazione della proteina in pozzetti di piastre da microtitolazione

- Ogni fago esprime ed “esibisce” una proteina di interesse fusa con quella fagica- Mettere a contatto una soluzione con l’intera libreria fagica - Lavare- Eluire il fago trattenuto con tampone a determinati pH o forza ionica - Caratterizzare il fago trattenuto in seguito ad infezione batterica

Applicazioni del Phage display

- studio delle interazioni proteina-proteina

- studio dell’effetto funzionale di varianti amminoacidiche

SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO IN LIEVITO

L’espressione genica in S. cerevisiae dipende da fattori di trascrizione con 2 domini.

Dominio di legame al DNA (Binding Domain) o BDDominio di attivazione della trascrizione (Activation Domain (AD)

Sostituzione dei fattori di trascrizione con proteine di fusione (ognuna costituitain parte da un dominio del fattore di trascrizione e in parte dalla proteina campione)

Se si verifica interazione tra questa coppia di ibridi si ottiene l’espressione del gene bersaglio di lievito

Ovvero:proteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono individuate grazie alla loro capacità di attivare la trascrizione di un gene indicatore

I due vettori ibridi derivanti dal 2 µ selezionati in E. coli,poi introdotti stessa cellula di lievito,oppure fusione di 2 ceppi aploidi lievito

Il dominio BD si può legare al DNA ma la trascrizione inizia solo se viene portato AD nella giusta posizione

Preda o

Utilizzo del fattore di trascrizione di lievito GAL4, che legando il promotore di LacZ permette la trascrizione della β-galattosidasi.

Se c’è interazione tra le due proteine GAL4 attiva entrambi i 2

domini e trascrive il gene LacZ. Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in

grado di scinderla e le colonie diventano blu.

Lacz

Interazione tra i 2 domini = GAL4 attivo

β-galattosidasi + X-Gal

Prom

SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO IN LIEVITO

Si cresce la colonia di lievito blu e si caratterizza il plasmide con inserito il DNA della proteina preda (o bersaglio)

Clone 1 e clone 2 ibridi inseriti in cellule di lievito

Clone 1 ibrido inserito in cellule di lievito

Screening di libreria di ricombinanti

Applicazioni: può rivelare un gran numero di interazioni che possonofacilitare la decifrazione della funzione genica

Possibilità di falsi positivi e negativi da verificare con altri metodi

CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’ (pull-down)