19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© Número de publicación: 2 272 31151© Int. Cl.:

C12N 15/16 (2006.01)

C12N 15/74 (2006.01)

C12N 1/21 (2006.01)

C07K 14/575 (2006.01)

A61K 38/22 (2006.01)

C12N 1/21 (2006.01)

C12R 1/225 (2006.01)

12© TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3

86© Número de solicitud europea: 00954434 .786© Fecha de presentación : 05.07.200087© Número de publicación de la solicitud: 119455487© Fecha de publicación de la solicitud: 10.04.2002

54© Título: Suministro de péptidos trébol.

30© Prioridad: 05.07.1999 EP 99870143

45© Fecha de publicación de la mención BOPI:01.05.2007

45© Fecha de la publicación del folleto de la patente:01.05.2007

73© Titular/es: Vlaams Interuniversitair Instituut voorBiotechnologieRijvisschestraat 1209052 Zwijnaarde, BE

72© Inventor/es: Hans, Wolfgang, Christian;Steidler, Lothar yRemaut, Erik, René

74© Agente: Arias Sanz, Juan

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, dela mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europeade Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo seconsiderará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 delConvenio sobre concesión de Patentes Europeas).E

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Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

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DESCRIPCIÓN

Suministro de péptidos trébol.

La presente invención se refiere al campo de sistemas de suministro de proteínas in vivo. Más particularmente, lapresente invención se refiere a la secreción in vivo de péptidos trébol por parte de microorganismos, preferiblementecepas bacterianas, preferiblemente cepas no patógenas, preferiblemente cepas no invasivas, preferiblemente cepas decalidad alimentaria, a procedimientos para el suministro de péptidos trébol usando dichos sistemas y al uso de dichossistemas de expresión de péptidos trébol para el tratamiento de trastornos inflamatorios del tracto gastrointestinal.

Lactococcus lactis es una bacteria del ácido láctico Gram positiva no patógena que puede sobrevivir en el intestino(Klijn y col., 1995). No se sabe con certeza si L. lactis puede ser también metabólicamente activo en todos estosentornos.

La expresión del fragmento C de la toxina tetánica por parte de Lactococcus lactis con vistas a la vacunación fuedescrita por Wells y col. (1993b) y Robinson y col. (1997). Además se demostró que cuando se administraban por víaintranasal a ratones preparaciones bacterianas de L. lactis modificadas para expresar interleucina-2 o interleucina-6junto con el fragmento C de la toxina tetánica (TTFC), se producía más de 10 veces más anticuerpos anti TTFC quetras la administración similar de cepas que expresaban TTFC únicamente (solicitud de patente internacional publicadaen el documento WO 97/14806). Estos resultados prueban el uso de un vector de vacuna bacteriano experimental quesecreta citocinas no invasivo para potenciar las respuestas inmunes a un antígeno conjuntamente expresado. Tambiénse ha descrito un enfoque para adjuntar fragmentos proteicos heterólogos en la pared celular y de esta forma mostrarlosen la superficie de L. lactis, conduciendo posiblemente a propiedades de vacunación más potenciadas (documento WO9709437 Steidler, Remaut, Wells).

Los péptidos trébol son secretados por las células epiteliales mucosas y son estables en un entorno ácido. Estospéptidos contribuyen a la protección de la mucosa (formación de un gel sobre el epitelio) y están implicados probable-mente en la reparación de la mucosa dañada mediante la estimulación de la migración epitelial (Playford y col., 1996).La producción de péptidos trébol aumenta localmente en aquellas regiones en las que se ha producido un daño talescomo úlceras gástricas y colitis (Wright y col., 1990). Babyatsky y col (1996) han demostrado que la administraciónde péptidos trébol recombinantes reduce el daño en esos lugares. Al contrario que la mayoría de las demás proteínasque son importantes para la protección de la mucosa (tales como el factor de crecimiento epidérmico), la mayoría delos estudios han demostrado que los péptidos trébol provocan poca o ninguna proliferación (Playford y col., 1996).Se han identificado en humanos tres miembros de esta familia de péptidos trébol y se designaron originalmente: pS2(gen inducible por estrógenos de cáncer de mama, O. Lefebvre, 1993), SP (péptido espasmolítico) e ITF (factor trébolintestinal). En la nomenclatura actual, se ha renombrado pS2 como TFF1, SP como TFF2 e ITF como TFF3 (véasepor ejemplo Wong y col., 1999). Esta nueva nomenclatura se usará a lo largo del presente texto.

En seres humanos, ratones y ratas, TFF1 y TFF2 se encuentran predominantemente en el estómago, mientras queTFF3 se encuentra predominantemente en el duodeno y el colon. Wong y col. (1999) dan una visión general recientede péptidos trébol.

Se piensa que TFF1 actúa por medio de un receptor de la superficie celular (Tan y col., 1997).

El uso de péptidos o proteínas trébol para el tratamiento de trastornos y daños del tracto digestivo, incluyendo laboca, el esófago, el estómago y los intestinos grueso y delgado, así como para la protección y el tratamiento de tejidosque se encuentran fuera del tracto digestivo se describe en los documentos WO 97/38712 y WO 92/14837. Estasproteínas se pueden usar o bien para tratar lesiones en estas áreas o bien para inhibir la formación de lesiones. Estaslesiones pueden ser provocadas por: radioterapia o quimioterapia para el tratamiento del cáncer, cualquier otro fármacoincluyendo alcohol que dañe el tracto digestivo, exposición accidental a radiación o a una sustancia cáustica, infección,un trastorno digestivo incluyendo, pero sin limitación dispepsia no ulcerosa, gastritis, úlcera péptica o duodenal, cáncergástrico, linfoma MALT, síndrome de Menetier, enfermedad de reflujo gastoresofágico, enfermedad de Crohn, colitisulcerosa y colitis aguda de origen químico, bacteriano o desconocido.

Los péptidos trébol son particularmente útiles para el tratamiento de la colitis aguda.

También se ha usado el ITF en combinación con EGF (factor de crecimiento epidérmico) para tratar úlceras deltracto gastrointestinal. Experimentos in vitro e in vivo han demostrado que las actividades de curación de heridasdel EGF se incrementan notablemente por el tratamiento de EGF en combinación con ITF, sin incrementar la acciónproliferativa del EGF (Chinery y Playford, 1995).

La enfermedad inflamatoria intestinal es el nombre conjunto de una serie de inflamaciones gastrointestinales. Aeste grupo pertenecen la enteritis, la colitis, inflamaciones de la mucosa del duodeno o del colon respectivamen-te. La enfermedad de Crohn (enteritis regionalis) y la colitis ulcerosa (colitis ulcerosa) son enfermedades del tractogastrointestinal íntimamente relacionadas espontáneamente recurrentes. Estas enfermedades están mediadas inmuno-lógicamente y tienen causas ambientales y genéticas. Sartor (1995) describe los diferentes aspectos de la enfermedadinflamatoria intestinal. La enfermedad de Crohn ha sido particularmente estudiada por ejemplo por Herfath y Sartor,(1994), Cominelli y col., (1994) y MacDermott (1989).

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La intención de la presente invención es proporcionar un procedimiento para el suministro de péptidos trébol parael tratamiento de trastornos gastrointestinales.

Otra intención de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para el tratamiento detrastornos gastrointestinales.

La presente invención se refiere más particularmente a un microorganismo que suministra un péptido trébol invivo. Dicho microorganismo es una cepa bacteriana no patógena no invasiva, preferiblemente una cepa de calidadalimentaria, más preferiblemente una cepa bacteriana Gram positiva, de la forma más preferida una cepa bacterianafermentadora de ácido láctico, preferiblemente una especie de Lactococcus o de Lactobacillus que expresa un péptidotrébol in vivo. La presente invención se puede aplicar por lo tanto a cualquiera de las especies de Lactococcus o deLactobacillus seleccionadas de la lista que comprende Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactissubespecie cremoris, Lactococcus lactis subespecie hordniae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subespecie Lac-tis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobaci-llus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus,Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillusaviarius subespecie araffinosus, Lactobacillus aviarius subespecie aviarius, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillusbifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchnneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus. carnis, Lacto-bacillus casei, Lactobacillus casei subespecie alactosus, Lactobacillus casei subespecie casei, Lactobacillus caseisubespecie pseudoplantarum, Lactobacillus casei subespecie rhamnosus, Lactobacillus casei subespecie tolerans,Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobaci-llus coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus coryniformis subespecie torquens,Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus subespecie curvatus, Lactobacillus curvatussubespecie melibiosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus, Lactobacillus del-brueckii subespecie delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subespecie lactis, Lactobacillus divergens, Lactobacillusfarciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus,Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillushamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii,Lactobacillus iners, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kandle-ri, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kunkeei, Lactobacilluslactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactoba-cillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus muco-sae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabuchne-ri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, Lactobacillus paracasei subespecie tole-rans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus,Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reute-ri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei,Lactobacillus sakei subespecie camosus, Lactobacillus sakei subespecie sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobaci-llus salivarius subespecie salicinius, Lactobacillus salivarius subespecie salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis,Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus uli, Lactobacillus vaccinoster-cus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xylosus, Lactobacillusyamanashiensis, Lactobacillus yamanashiensis subespecie mali, Lactobacillus yamanashiensis subespecie Yamanas-hiensis y Lactobacillus zeae.

No resultaba obvio a partir de la capacidad de Lactococcus lactis de suministrar un antígeno heterólogo o de sucapacidad para producir moléculas tales como IL-2 e IL-6 in vivo e in vitro que las bacterias fuesen un vehículoapropiado para el suministro de otros tipos de péptidos o polipéptidos in vivo. Además no se sabe si dichos péptidostrébol expresados por dichas cepas bacterianas proporcionarían un efecto beneficioso en enfermedades inflamatoriasde tracto gastrointestinal, tales como enfermedad inflamatoria intestinal o colitis aguda.

Resulta por lo tanto sorprendente que se pudiera demostrar en la presente sección de ejemplos que cepas bacte-rianas son capaces de expresar péptidos trébol in vivo cuando están presentes en el tracto gastrointestinal y ejercenun efecto curativo en situaciones de colitis aguda. A modo de ejemplo, se clonaron fragmentos de PCR que con-tenían las regiones codificantes del TFF1 de ratón. Se construyeron vectores recombinantes que comprendían estosclones de PCR bajo el control de un promotor y la secuencia de la señal de secreción de Lactococcus lactis usp45. seconstruyeron cepas de Lactococcus lactis transformadas que expresaban péptidos trébol TFF1 de ratón. Se demostróadicionalmente en un sistema modelo de ratón in vivo que el mTFF1 recombinante producido por estas bacterias puedeejercer sorprendentemente efectos curativos sobre la parte distal del colon inflamado.

Según una forma de realización preferida, la presente invención se refiere particularmente a una cepa bacterianaque suministra péptido trébol in vivo.

Según otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a una bacteria que suministra TFF1 invivo.

Se debe entender que la presente invención también se refiere a partes o variantes de cualquier péptido trébol. Talespartes se refieren a partes biológicamente activas que se pueden generar mediante procedimientos bien conocidos poraquellos expertos en la materia. Estas partes contendrán generalmente al menos 10 aminoácidos contiguos, típicamente

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al menos 20 aminoácidos contiguos, más típicamente al menos 30 aminoácidos contiguos, normalmente al menos 40aminoácidos contiguos y preferiblemente al menos 50 aminoácidos contiguos. Dichas variantes se refieren a variantesque tienen la misma actividad biológica que los péptidos trébol anteriormente mencionados.

Debe quedar claro también que las cepas bacterianas según la presente invención como se han definido anterior-mente también pueden expresar proteínas recombinantes adicionales que sean beneficiosas para el tratamiento decualquier trastorno previsto.

Según otra forma de realización más, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que com-prende un microorganismo que expresa un péptido trébol como se ha definido anteriormente.

De forma ventajosa, la composición farmacéutica según la presente invención es preferiblemente adecuada para suaplicación sobre superficies de mucosas.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención y para su uso de acuerdo con la presente invenciónpueden comprender, además del microorganismo, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizante farmacéuticamenteaceptable u otros materiales bien conocidos para aquellos expertos en la materia. Tales materiales no deben ser tóxicosy no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza concreta del vehículo u otros materiales puededepender de la vía de administración. Aquellos con relevante experiencia en la materia son perfectamente capaces depreparar soluciones adecuadas.

Según otra forma de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para el suministro de péptidotrébol al tracto gastrointestinal que comprende la administración de un microorganismo como se ha definido anterior-mente.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un microorganismo como se ha definidoanteriormente para la fabricación de un agente para el suministro de péptido trébol al tracto gastrointestinal.

Según otra forma de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de enferme-dades y/o trastornos gástricos y/o intestinales que comprende la administración de un microorganismo como se hadefinido anteriormente.

La presente invención también se refiere a un procedimiento de tratamiento de enfermedades y/o trastornos gástri-cos y/o intestinales que comprende la administración de un microorganismo que suministra un péptido trébol TFF1 invivo.

Las proteínas trébol que expresan las cepas bacterianas según la presente invención pueden usarse o bien paratratar lesiones en estas áreas o bien para inhibir la formación de lesiones provocadas por enfermedades y trastornosgastrointestinales.

La expresión “enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales” se refiere a todos los tipos de enfermedadesy/o trastornos gástricos, intestinales y gastrointestinales. En formas de realización preferidas de la invención, estaexpresión se refiere a enfermedades y trastornos gastrointestinales agudos. Estas enfermedades son preferiblementeenfermedades gastrointestinales agudas de origen químico, bacteriano o desconocido. A este grupo pertenecen laenteritis, la colitis, incluyendo pero sin limitación reagudizaciones de la enfermedad de Crohn e inflamaciones decolitis ulcerosa de la mucosa del duodeno o del colon, respectivamente. También se incluye aquí la diarrea del viajero.En otras formas de realización preferidas de la invención, la expresión “enfermedades y/o trastornos gástricos y/ointestinales” se refiere a enfermedades crónicas y espontáneamente recurrentes del tracto gastrointestinal tales comola enfermedad de Crohn (enteritis regionales) y la colitis ulcerosa (colitis ulcerosa).

La expresión “enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales” se refiere también a enfermedades en lasque están implicadas lesiones en superficies de mucosas. Como tales, los estados de enfermedad que se van a tratarmediante los procedimientos y composiciones farmacéuticas de la invención también pueden incluir trastornos y dañodel tracto digestivo, incluyendo la boca, el esófago, el estómago y los intestinos grueso y delgado, así como parala protección y el tratamiento de tejidos que se encuentran fuera del tracto digestivo. Estas lesiones pueden estarprovocadas por: radioterapia o quimioterapia para el tratamiento del cáncer, cualquier otro fármaco incluyendo alcoholque dañe el tracto digestivo, exposición accidental a radiación o a una sustancia cáustica, infección, un trastornodigestivo incluyendo, pero sin limitación dispepsia no ulcerosa, gastritis, úlcera péptica o duodenal, cáncer gástrico,linfoma MALT, síndrome de Menetier, enfermedad de reflujo gastoresofágico y enfermedad de Crohn.

La presente invención se refiere por lo tanto al uso de un microorganismo como se ha descrito anteriormente parala preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales.

La presente invención se refiere por lo tanto al uso de un microorganismo como se ha descrito anteriormente parala preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias gastrointestinales agudas, colitisaguda, reagudizaciones de la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, y para el tratamiento de enfermedades crónicasy espontáneamente recurrentes del tracto gastrointestinal que comprenden enfermedad de Crohn (enteritis regionales)y colitis ulcerosa (colitis ulcerosa).

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Según otra forma de realización, la invención se refiere al uso de un microorganismo como se ha descrito anterior-mente para la preparación de un medicamento para inhibir la formación de lesiones provocadas por enfermedades ytrastornos gástricos y/o intestinales.

La administración del microorganismo puede ser por vía oral o por medio de cualquier otro procedimiento conocidoen la materia que permita que el microorganismo entre en los lugares que se desean tratar, tales como por ejemplo porvía anal, vaginal. El microorganismo puede aplicarse en un medio nutritivo, es decir, en un medio que contiene unasustancia o sustancias que mantienen (al menos in vitro) la actividad metabólica del microorganismo. Tales sustanciaspueden mantener la viabilidad si no el crecimiento del microorganismo. Tales sustancias pueden incluir una fuente deenergía tal como glucosa, aminoácidos y así sucesivamente.

El individuo al que se le administra el microorganismo puede ser un ser humano o un animal.

En un contexto terapéutico, es decir, cuando el efecto biológico del suministro del polipéptido a un individuoes beneficioso para ese individuo, la administración es preferiblemente en una cantidad “terapéuticamente eficaz”,siendo esta suficiente para mostrar un beneficio al paciente. Tal beneficio puede ser al menos la mejora de un síntoma.La cantidad real administrada y la tasa y desarrollo temporal de la administración dependerán de la intención de laadministración, por ejemplo, del efecto biológico buscado en vistas de la naturaleza y de la gravedad del problema yestá sujeta a una optimización de rutina. Las prescripciones de tratamiento, por ejemplo, decisiones de dosificación,etc., son responsabilidad de facultativos generales y otros médicos.

De acuerdo con la presente invención, se puede administrar una composición que comprende microorganismossegún la presente invención sola o combinada con otros tratamientos, bien de forma simultánea o secuencial.

Según otra forma de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de unmicroorganismo que suministra un péptido trébol in vivo como se ha definido anteriormente que comprende transfor-mar un microorganismo con un vector recombinante que lleva una secuencia codificante de un péptido trébol bajo elcontrol de un promotor adecuado y una secuencia señal de secreción bacteriana.

Tal secuencia señal de secreción bacteriana puede ser cualquier secuencia que se conozca en la técnica que realicedicha función. Preferiblemente, para L. lactis, dicha secuencia señal de secreción es la secuencia señal de secreciónusp45 de L. lactis. Tal secuencia promotora puede ser cualquier promotor que permita la expresión de dicha secuen-cia codificante en dicho microorganismo. Los ejemplos que se dan en la sección de ejemplos incluyen el promotorconocido T7 inducible por fago de E. coli y el promotor constitutivo conocido P1 de L. lactis.

La presente invención también se refiere a un vector recombinante que comprende al menos una parte de unasecuencia codificante de un péptido trébol bajo el control de un promotor adecuado y una secuencia señal de secreciónadecuada. Dicho vector recombinante puede usarse para suministrar in vivo al menos una parte de una secuencia depéptido trébol que puede ejercer un efecto curativo sobre áreas dañadas de las superficies de las mucosas.

La presente invención se refiere adicionalmente a un vector recombinante como se ha definido anteriormente quetiene una secuencia de nucleótidos como se representa por cualquiera de las ID SEC Nos 1, 2 ó 4.

Los siguientes ejemplos sirven únicamente para ilustrar la presente invención, y no se deben considerar comolimitantes de la invención en ningún sentido.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Vista general de los plásmidos usados

Figura 1a: mapas esquemáticos de los plásmidos pL2mTFF1 v1 y pT1mTFF1. T7 es el principal promotor tardíodel colifago T7 (Studier y Moffatt, 1986). P1 es el promotor de lactococos como en Waterfield y col., (1995), usp45S esun fragmento de ADN que codifica el péptido señal de secreción de la proteína de lactococos Usp45 (van Asseldonck ycol., 1990), mtff1 es un fragmento de ADN que codifica la parte madura del TFF1 murino, mtffv1 es un fragmento deADN que codifica un TFF1 murino maduro truncado (sin dos restos aminoácido aminoterminales), Cm es el marcadorde selección de cloranfenicol, Em es el marcador de selección de eritromicina. Para pPICmTFF1: PPMF es el factorde acoplamiento α prepro de Saccharomyces cerevisiae; AOX1 es el promotor de la alcohol oxidasa, AOX1 term esel terminador de la alcohol oxidasa, HIS4 es el gen de la histidol deshidrogenada, Ori es un origen de replicaciónde Escherichia coli, AOXfr es un fragmento 3’ del gen de la alcohol oxidasa, AmpR es el gen de la resistencia a laampicilina. Todos los componentes son del plásmido pPIC9 (Invitrogen).

Figura 1b: secuencia de ADN del plásmido pL2mTFF1v1 (ID SEC nº 1)

Figura 1c: secuencia de ADN del plásmido pT1mTFF1 (ID SEC nº 2)

Figura 1d: secuencia de ADN del plásmido pPICmTFF1 (ID SEC nº 3)

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Figura 2: SDS PAGE. Las diferentes proteínas se derivan del medio de células de L. lactis MG1820 [pILPOL]control), MG1820 [pILPOL; pL2mTFF1v1], MG1363 [pTREX1] o MG1363 [pT1mTFF1]. Los dos carriles izquier-dos contienen proteínas marcadoras en las que el peso molecular se da en kDa Las proteínas se visualizaron usandotinción con azul de Coomasie.

Figura 3: Representación de los valores histológicos de la parte distal del colon. Gráfico superior izquierdo: dañoen el epitelio (parte distal del colon). Gráfico superior derecho: infiltración inflamatoria (parte distal del colon). Gráficoinferior: suma de los valores de los gráficos superiores (parte distal del colon).

Figura 4: Representación de los valores histológicos de la parte distal del colon de ratones sanos (control) o ratonescon colitis DSS aguda sin tratamiento (DSS) o después del tratamiento con células MG1363, MG1363 [pTREX1] oMG1363 [pT1mTFF1].

Figura 5: valoraciones de citocina proinflamatoria en tejido de colon con inflamación aguda. Interlecucina-1β enel colon distal (izquierda) e interferón-γ en el colon medio y distal (derecha) de ratones sanos (control) o ratonescon colitis DSS aguda sin tratamiento (DSS), o después del tratamiento con células MG1363, MG1363 [pTREX1] oMG1363 [pT1mTFF1].

Figura 6: SDS PAGE de fracciones proteicas del medio de Pichia pastoris seleccionada (GST115::pPICmTFF1) ycontrol negativo. El clon productor de mTFF1 que se usó adicionalmente para la producción de mTFF1 se indica conuna punta de flecha. Las proteínas se visualizaron usando tinción con azul de Coomasie.

Figura 7: A: patrón de filtración en gel de mTFF1 purificada (Superdex 75; Pharmacia). La proteína mTFF1 eluyóen dos picos, estando presente la mayoría en las fracciones 14, 15, 16 (dímero) y 20 (monómero). Se demostró que laidentidad de la proteína en estas fracciones era mTFF1 por SDS-PAGE (inserto). Las proteínas se visualizaron usandotinción con azul de Coomasie. B: SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras de mTFF1 purificada. Loscarriles de la izquierda son marcadores de tamaño de tamaños indicados, tinción con azul brillante de Coomasie.

Figura 8: Representación de los valores histológicos de la parte distal del colon de ratones tratados por inoculaciónpor inyección intraperitoneal (i.p.), oral (oral) y rectal (rectal), antes (pre), durante (du) o después (po) de la instalaciónde colitis aguda inducida por DSS. DSSdu representa los valores de ratones tratados con PBS a los que se les indujocolitis DSS aguda.

Ejemplos

Ejemplo 1

Clonación y expresión de TTF1 de ratón (mTTF1)

Medios de cultivo

GM17 es M17 (Difco, Detroit) suplementado con un 0,5% p/v de glucosa. El medio M9 contiene por litro: 6g deNa2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 g de NH4Cl, 0,5 g of NaCl, 2 mmol de MgSO4, 0,1 mmol de CaCl2 y 5 g de Casitone(Difco). M9B es M9 suplementado con 2,1 g de NaHCO3 y 2,65 g de Na2CO3 por litro. GM9B es M9B suplementadocon glucosa al 0,5% p/v. LM9B es M9B suplementado con lactosa al 0,5% p/v.

Cuando resultaba apropiado, se añadieron los antibióticos eritromicina (Er) o cloranfenicol (Cm) a los mediosrespectivos a concentraciones finales de 5 µg/ml cada uno. La designación usada par indicar la presencia del anticuerpoes, por ejemplo GM17Er, LM9BC y así sucesivamente. Los medios sólidos contenían agar al 1,2%.

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron enzimas modificadoras del ADN y endonucleasas de restricción en condiciones normales y en los tam-pones recomendados por los fabricantes. Las técnicas moleculares generales de clonación y las electroforesis de ADNy proteínas se llevaron a cabo según procedimientos convencionales. L. lactis se transformó por electroporación decélulas cultivadas en presencia de glicina (Wells y col., 1993a). El ADN plasmídico se purificó de forma rutinariausando el kit Plasmad de Quiagen.

Amplificación por PCR de mTFF1

Se llevó a cabo la reacción de la PCR sobre un plásmido que contenía ADNc de mTFF1 (Lefebvre, 1993), usandolos cebadores oligonucleotídicos mTFF1S y mTFF1A. El cebador mTFF1S corresponde a los primeros 18 nucleótidosde la hebra sentido de mTFF1 desde el primer nucleótido después de la secuencia señal. El cebador mTFF1A escomplementario a los últimos 26 nucleótidos de la hebra sentido del mTFF1 incluyendo el codón de terminación, eintroduce un sitio de restricción Spel adicional.

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mTFF1S: 5’-CAGGCCCAGCCCAGGCC -3’ (ID SEC Nº 4)

mTFF1A: 5’-GCACTAGTTAGAAGGGACATTCTTCTTCTTG AG-3’ (ID SEC Nº 5)

en el que ACTAGT en mTFF1A representa un sitio SpeI.

Se llevó a cabo la amplificación por PCR usando la ADN polimerasa VentTM (New England Biolabs, Beverly,EE.UU.), que da un producto de PCR que lleva extremos romos. La mezcla de PCR consistía en 2 unidades de ADNpolimerasa Vent, 10 µl de de tampón Vent (thermopol), 4 µl de dXTP (0,5 mM máximo), 4 µl (0.5 µM) d cada cebador,1 µl (50 ng) de ADN molde y 74 µl de H2O. Se dispusieron seis reacciones, que diferían en su concentración final deMgSO4, ajustadas a 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mM respectivamente. Los ciclos de amplificación de PCR fueron: T0 durante 300”a 94◦C, T1 durante 45” a 94◦C, T2 durante 30” a 60◦C, T3 durante 20” a 72◦C, T4 durante 10” a 20◦C. Estos ciclos T1hasta T3 se llevaron a cabo 30 veces.

La amplificación por PCR con estos cebadores dio los genes para mTFF1 maduro sin la secuencia señal e inclu-yendo un sitio de restricción Spel adicional. Después de comprobar por electroforesis en gel, el fragmento amplificadoaparecía como una banda en el intervalo de longitud esperado. El extremo 5’ de la secuencia de mTFF1 contiene dossecuencias diana posibles complementarias al cebador anterior. Como una consecuencia de dos fragmentos de 202pares de bases y 208 pares de bases respectivamente, se puede amplificar a partir del ADNc de mTFF1 usando loscebadores mencionados. No se espera resolver estos fragmentos por electroforesis en gel de agarosa.

Construcción de plásmidos

Se usaron dos tipos de vectores diferentes como aceptores para el fragmento de PCR que codifica el péptidotrébol mTFF1. La estructura primaria de los dos vectores originales pT1NX, derivado de pTREX1 (Wells y Schofield,1996), y pLET2NX, derivado de pLET2N (Steidler y col., 1995) - contienen los siguientes elementos comunes: unpromotor (T7 o P1), la secuencia señal de secreción de L. lactis usp45 (van Asseldonk y col., 1990 y la solicitud depatente europea publicada con el Nº 0 455 280), modificados para contener un sitio de restricción Nael solapándosecon la secuencia que codifica el último resto aa (Steidler y col., 1995), y un sitio de restricción Spel en dirección 3’.Los plásmidos derivados de pT1NX especifican resistencia a la eritromicina, los plásmidos derivados de pLET2NXespecifican resistencia al cloranfenicol. Los fragmentos de PCR se trataron durante 1 hora a 37ºC usando 50 µl desolución de ADN, 10 µl de tampón Spel, 50 unidades de Spel, 10 unidades de polinucleótido cinasa T4 (Gibco BRL,Bethesda, EE.UU.), ATP 0,5 mM ajustado a pH 7,5 y 36 µl de H2O. El vector pT1NX se digirió durante 1 hora a37ºC usando 10 ADN purificado a 20 µl, 10 µl de tampón Nael, 10 unidades de Nael, 50 unidades de Spel, 1 unidadde fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim, Alemania) y 73 a 63 µl de H2O. Después de 30minutos de incubación, se añadieron de nuevo a la mezcla 50 unidades de Spel y 10 unidades de Nael. Las enzimasde restricción se inactivaron y se extrajeron de la mezcla mediante extracción con fenol/cloroformo. Después de ladigestión de restricción, la banda derivada de mTFF1 (que comprendía un fragmento de 195 pb y uno de 201 pb comose ha descrito anteriormente bajo “amplificación por PCR de TFF1 de ratón (mTFF1)” y las partes de vector fueronescindidas del gel de agarosa. Después del ligamiento de los respectivos fragmentos de PCR y del vector durante45 minutos a 16ºC usando una ligasa de ADN “lista para usar” (Pharmacia Biotech, R.U.), se obtuvieron plásmidosrecombinantes que contenían el cistrón mTFF1 como una fusión en marco a la secuencia señal de secreción usp45bajo el control del promotor.

El plásmido pT1 mTFF1 (Figura 1a), que contiene el promotor constitutivo de L. lactis P1 surgió como resultadodel ligamiento de la parte del vector purificado Nael - Spel de pT1NX y el fragmento de PCR cortado y fosforilado en5’ de Spel.

El plásmido pL2mTFF1v1 (Figura 1a), que contiene el promotor de E. coli inducible por fago T7 surgió comoresultado del ligamiento de la parte del vector purificado Nael - Spel de pLET2N y el fragmento de PCR cortado yfosforilado en 5’ de Spel. El promotor T7 sólo puede ser activado por la ARN polimerasa análoga de T7 codificadapor ejemplo por el plásmido pILPOL. Este plásmido está presente en la cepa de L. lactis MG1820 [pILPOL] (Wells ycol., 1993c).

Para el análisis estructural, el plásmido pT1mTFF1 se transformó en la cepa de L. lactis MG1363. Las células secultivaron en placas GM17Er. Las colonias se cultivaron en 2,5 ml de GM17Er y se aisló el plásmido. Por medio deuna digestión analítica, se compararon el patrón de restricción del vector pT1NX (2 µl de ADN (pT1NX), 20 unidadesde EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 µl de tampón Spel y 15 µl de H2O) y el plásmido recombinante aislado (5 µl deADN, 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 µl de tampón Spel, 0,25 µl de una solución madre de 10 µg/mlde ARNasa A, 12 µl de H2O). Los plásmidos se cortaron con EcoRI y Spel durante 1 hora a 37ºC. En los plásmidosde referencia, se prevén dos fragmentos lineales de 907 pb y 4999 pb. En pT1mTFF1, se prevén dos bandas de 499 pby 4999 pb. Los tamaños de los fragmentos obtenidos experimentalmente, como se visualizan mediante electroforesisen gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio resultaron coherentes con las longitudes previstas. A partir de cadaplásmido recombinante se extendió un cultivo en placas de GM17Er para obtener colonias aisladas. Una colonia seinoculó a continuación en 100 ml de medio MM17Er y se dejó crecer hasta la saturación. Se recogieron las células y sepurificaron los plásmidos. Su estructura física se verificó mediante análisis con enzimas de restricción y electroforesisen gel de agarosa. Además, los análisis de las secuencias revelaron que el cistrón mTFF1 se había ligado perfectamenteen marco con la secuencia líder de secreción usp45. El pT1mTFF1 contiene un inserto de 208 pb que representa la

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secuencia codificante completa del mTFF1 maduro (como se ha descrito anteriormente bajo “amplificación por PCRdel TFF1 de ratón (mTFF1)”).

Para el análisis estructural, el plásmido pL2mTFF1v1 se transformó en la cepa MG1820[pILPOL]. Las células secultivaron en placas GM17Cm. Las colonias se cultivaron en 2,5 ml de GM17Cm y se aislaron los plásmidos. Por me-dio de una digestión analítica, se compararon el patrón de restricción del vector pLET2NX (2 µl de ADN (pLET2NX),20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 µl de tampón Spel y 15 µl de H2O) y el plásmido recombinante aislado(5 µl de ADN, 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 µl de tampón Spel, 0,25 µl de una solución madre de10 µg/ml de ARNasa A, 12 µl de H2O). El plásmido recombinante se cortó con EcoRI y Spel durante 1 hora a 37ºC.En los plásmidos de referencia, se prevén dos fragmentos lineales de 907 pb y 4650 pb. En pL2mTFF1, se prevéndos bandas de 499 pb y 4650 pb. Los tamaños de los fragmentos obtenidos experimentalmente, como se visualizanmediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio resultaron coherentes con las longitudesprevistas. A partir de cada plásmido recombinante se extendió un cultivo en placas de GM17Cm para obtener coloniasaisladas. Una colonia se inoculó a continuación en 100 ml de medio GM17Cm y se dejó crecer hasta la saturación. Serecogieron las células y se purificaron los plásmidos. Su estructura física se verificó mediante análisis con enzimas derestricción y electroforesis en gel de agarosa. Además, los análisis de las secuencias revelaron que el cistrón mTFF1 sehabía ligado perfectamente en marco con la secuencia líder de secreción usp45. El pL2mTFF1v1 contiene un insertode 202 pb (que carece coherentemente de los dos primeros restos aa aminoterminales del mTFF1 maduro, como se hadescrito anteriormente bajo “amplificación por PCR del TFF1 de ratón (mTFF1)”). Estas secuencias de los plásmidosrecombinantes se dan en las figuras 1b y 1c. Sus secuencias completas se recopilaron a partir de las secuencias pu-blicadas de las partes constitutivas. Además, las secciones relevantes de las secuencias, tales como los fragmentos dePCR y los puntos de unión de ligamiento se verificaron experimentalmente.

Expresión de proteínas en L. lactis transformados

Se transformaron cepas de L. lactis con los plásmidos construidos anteriormente. Para la transformación delplásmido pT1mTFF1, se usó la cepa de L. lactis MG 1363 (Gasson, 1983). Para la transformación del plásmidopL2mTFF1v1, se usó la cepa de L. lactis MG 1820 (pILPOL) (Meda y Gasson, 1986).

La expresión de las proteínas por parte de estas cepas de L. lactis transformadas se detecto mediante SDS-PAGE.

Para preparar las fracciones del sobrenadante del cultivo, las células se cultivaron durante 20 horas a 28ºC en cincoml de medio GM17Er para el plásmido pT1mTFF1 o medio GM17Cm para el plásmido pL2mTFF1v1. Los cultivos sediluyeron en cinco ml de medio GM17Er o GM17Cm y se cultivaron durante 3 horas a 28ºC. Las células se recogieronpor centrifugación a 2800 rpm durante 20 minutos y se resuspendieron en 5 ml del medio apropiado, es decir, GM9Erpara células MG1363 o LM9BCm para células MG 1820 [pILPOL]. Después de cinco horas adicionales de cultivo,las células se aglomeraron. Las proteínas presentes en las fracciones de medio se recuperaron mediante extracción confenol y precipitación con etanol.

Las proteínas expresadas en la fracción sobrenadante del cultivo de una cepa MG 1820 de L. lactis de controlcomparadas con las cepas MG 1820 de L. lactis transformadas con [pILPOL; pL2mTFF1v1] y la cepa MG 1363transformada con [pTREX1; pT1mTFF1] se muestran en la figura 2. Esta figura muestra una banda de proteína adi-cional del tamaño apropiado (indicada por la cabeza de flecha) en MG 1820 [pL2mTFF1v1] y MG 1363 [pT1mTFF1]cuando se compara con los controles. Como se puede observar a partir de esta figura, la expresión del gen recombi-nante es bastante baja. Esto hace que el resultado observado in vivo sea sorprendente ya que otros usan péptidos trébolpurificados en terapias para la reparación de lesiones gástricas e intestinales a niveles enormemente más elevados, porejemplo Tran y col (1999) usaban una aplicación intrarrectal diaria de TFF2 recombinante humano a niveles de 2,5mg/kg de peso corporal durante cinco días para obtener una reducción en el índice de inflamación de colitis instaladade forma experimental en ratas (administración intracolónica de ácido dinitrobencenosulfónico en alcohol).

Ejemplo 2

Comprobación in vivo de MG1363 [pT1mTFF1]

Preparación de células para la administración intragástrica

Se extendieron sobre placas GM17Er transformantes de las cepas de L. lactis MG1363 [pTREX1], MG1363[pT1mTFF1] y se cultivaron durante toda la noche a 28ºC. En cada caso se cultivó a continuación una única colo-nia a 28ºC durante toda la noche en 15 ml de medio GM17Er. A este cultivo se le añadieron 15 ml de glicerol al 100%para conservar dichas células a -20ºC. Cada día se pudo inocular la cantidad necesaria de células para el trata mientode los ratones. Para ello, el cultivo se diluía a 1/200 en 10 ml de medio GM17Er. Después de cómo mínimo 20 horasde crecimiento a 30ºC, las células se recogieron mediante centrifugación durante 15 minutos a 2800 rpm. Las célulasse resuspendieron entonces en 1 ml de M9B sin antibiótico.

Pruebas in vivo en ratones con colitis aguda

Se probó el efecto de los péptidos trébol expresados por estas bacterias L. lactis en ratones que sufrían colitisaguda. veintiún ratones Balb/c hembra recibieron DSS (sulfato sódico de dextrano) al 5% disuelto en su agua de bebida

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durante 7 días. De esta forma se indujo la colitis aguda (Kojouharoff y col., 1997). Para los propósitos terapéuticos, aestos ratones se les inoculó diariamente por vía oral por medio de un catéter gástrico usando una 100 µl de suspensiónbacteriana (mínimo 1.108 células) desde el día 1 hasta el día 7 del tratamiento con DSS. Como se ha indicado, a seisratones se les inocularon células MG1363 [pTRX1], a seis ratones se les inocularon células MG1363 [pT1mTFF1] ya tres ratones no se les inoculó nada (control DSS). El día 8 después de la inducción de la colitis, los ratones fueronsacrificados y examinados inmunológica e histológicamente.

Las pruebas inmunológicas de los sueros mostraron que los ratones tratados no mostraban respuesta inmune frentea las proteínas expresadas. Se tomó suero de los ratones que fueron desangrados en día 8. Este suero se analizó pormedio de inmunotransferencia para comprobar si contenía anticuerpos frente a las proteínas presentes en las fraccionesdel medio de las células de L. lactis. Las fracciones del medio usadas se derivaron de las cepas de L. lactis MG1363[pTREX1] y MG1363 [pT1mTFF1]. Se analizó el equivalente a 1 ml de fracciones del medio concentradas (extraccióncon fenol y precipitación con etanol) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS al 20%.Después de pasarlas a filtros de nitrocelulosa, los filtros se incubaron durante 1 hora con las soluciones de suero delos 4 grupos de ratones. El suero se diluyó 500 veces en 20 ml de tampón de bloqueo de nitrocelulosa (Blotto: 100 ml10xPBS, 150 m de NaCl 1 M, 2 ml de Triton X-100, 25 g de leche en polvo desnatada, agua hasta un volumen total de1 litro). Como anticuerpo secundario, se usó IgG de oveja anti-ratón acoplado a peroxidasa de rábano (HRP). Usandoel suero diluido 500 veces no se detectó señal.

Se realizaron análisis histológicos a los colones de los ratones tratados. Los colones se cortaron en direcciónlongitudinal y se dividieron en tres porciones iguales: las partes distal (la más cercana al ano), media y proximal.Estas partes del colon se analizaron histológicamente después de una fijación durante toda la noche en formaldehídoal 3,7% (en PBS), seguida de inclusión en parafina, asegurando la posición vertical de las muestras de tejido en losbloques de parafina. De cada muestra de tejido se hicieron secciones longitudinales de 3 µm de grosor espaciadasuniformemente a lo largo de la muestra. Estas secciones transversales se tiñeron con hematoxilina/eosina. Se realzóel análisis histológico de forma enmascarada, lo que significa que las marcas de las preparaciones fueron cubiertasantes de valorar los cortes. Las preparaciones que llevaban secciones obtenidas de los varios grupos de ratones sealeatorizaron antes del examen microscópico. Entonces se asignó un valor histológico a cada preparación (oscilandode 0 a 5) según la descripción sintomática definida en la tabla 1.

Para cada ratón y para cada parte del colon se calculó el valor medio de las tres secciones. En las partes distalesy medias del colon, la inflamación que consistía en daño epitelial e infiltración era la más pronunciada. En la parteproximal, no se pudo observar apenas inflamación. Se calculó el valor histológico medio tanto para la parte distalcomo para la parte media del colon por grupo de animales. La suma final de los valores histológicos es la suma delos dos valores separados (valor suma= valor de daño epitelia + valor de infiltración) y es la medida del grado de lainflamación. La suma de los valores histológicos de la parte distal del colon para cada uno de los grupos de ratones semuestra en la figura 3.

A partir de los valores histológicos para la parte distal del colon como se expone en la figura 3 se podría concluir queexiste una clara disminución de la inflamación tras la inoculación de células de L. lactis que producen péptidos trébolen ratones. Los ratones que recibieron células de L. lactis transformadas con [pT1mTFF1] muestran una reducciónsignificativa de la inflamación de más del 65%.

Como se puede ver a partir de la figura 3, la infiltración inflamatoria u el daño epitelial en la parte distal delcolon han disminuido significativamente después de la inoculación con cepas recombinantes de L. lactis que segreganpolipéptidos TFF1.

Estos resultados fueron confirmados en un experimento independiente que se llevó a cabo de la misma forma,incluyendo grupos mayores (tamaño del grupo= 10) y más grupos control. La figura 4 muestra los valores histoló-gicos (obtenidos como se ha descrito anteriormente) de ratones sanos de control (control) y de ratones que habíanrecibido DSS como se ha descrito, bien sin tratar (DSS), o tratados (como se ha descrito anteriormente) con MG1363,MG1363 [pT1TREX1] o MG1363 [pT1mTFF1] como se ha indicado. El experimento muestra una clara y significativadisminución de la inflamación intestinal en el grupo de los ratones tratados con MG1363 [pT1mTFF1].

El último experimento también se evaluó determinando los niveles de interleucina-1β (IL-1β) e interferón-γ (IFN-γ), ambos citocinas proinflamatorias bien conocidas para los expertos. A los ratones (n=10) se les inocularon lascepas indicadas como se ha descrito. Control= ratones sanos, DSS= ratones que recibieron DSS al 5% en el agua debebida sin tratamiento alguno. El colon se extrajo y se preparó y se aislaron áreas de la misma superficie por mediode un troquel (∅= 4 mm). Las muestras de tejido de cada grupo se recubrieron con 500 µl de RPMI + suero fetalbovino al 10% y se incubaron durante toda la noche a 37ºC. Se recogió el sobrenadante y se valoró el contenidoen citocina mediante ELISA. La cantidad de IL-1β e IFN-γ en los respectivos tejidos se muestra en la figura 5. losresultados muestran una clara reducción en estas citocinas proinflamatorias en los grupos de ratones tratados conMG1363 [pT1mTFF1].

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Ejemplo 3

Comparación del tratamiento con MG1363 [pT1mTFF1]y TFF1 purificado

Construcción de plásmidos

Para la expresión de mTFF1 a partir de Pichia pastoris se construyó el plásmido pPICmTFF1, el gen del mTFF1se amplificó mediante PCR como se ha descrito (amplificación por PCR del TFF1 de ratón). Este fragmento se ligóen el sitio de restricción abierto Nael de un derivado de pPIC9 (Invitrogen). La mezcla de ligamiento se transformaa MC1061 de E. coli y los clones correctamente ensamblados se identificaron mediante análisis de restricción ysecuenciación del ADN (secuencia como en la figura 1d). En el plásmido resultante pPICmTFF1, la secuencia demTFF1 se fusiona en fase con la secuencia de secreción prepro del factor de acoplamiento α de Saccharomycescerevisiae.

Expresión y purificación de mTFF1

El plásmido pPICmTFF1 se transfirió a Pichia pastoris GST115 por un procedimiento como se describe en Logghe(1995) y se seleccionaron los clones positivos que tenían la unidad mTTF1 integrada en el locus his4 mediante identi-ficación por PCR. Estos clones positivos se indujeron con metanol y se detectó selectivamente la expresión medianteanálisis de proteínas del sobrenadante de cultivo y un clon que mostraba, en comparación con el control negativo(negativo) una expresión particularmente alta de una banda adicional a los 6,5 kda (GST115::pPICmtFF1) se retuvopara trabajos posteriores (figura 6, indicado por la punta de la flecha). La banda de proteína adicional se identificócomo mTFF1 mediante secuenciación de proteínas. Este procedimiento de expresión se optimizó a gran escala y seoptimizó hasta un cultivo de 16 l y se purificó mTFF1 a partir del sobrenadante del cultivo.

Para ello, se concentró GST115::pPICmTFF1 de sobrenadantes inducidos por metanol mediante filtración tangen-cial (Millipore proflux M12, punto de corte 3000 Da) y se dializó a pH 7,4 en un tampón fosfato 0,02 M. Se purificómTFF1 a partir de este concentrado en una columna de intercambio iónico (Q-column de Biorad). Las proteínas fueroneluidas de la columna por un gradiente salino isocrático. El mTFF1 resultante era puro en más del 99% y se concentróde forma adicional. La preparación final contiene menos de 160 ng/l de LPS/ml. Esta cantidad de LPS está dentro delos límites aceptables y la proteína pS2 puede usarse en experimentos futuros.

Tras el análisis en una columna de exclusión por tamaño de mTFF1 purificado (Superdex 75, Pharmacia) se con-cluyó que el 7,5% del mTFF1 está en forma monomérica, y el 92,5% está en forma dimérica (figura 7A). Esto seconformó mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras frente a no reductoras del mTFF1 purificado (figura 7B).

Evaluación de la actividad biológica del mTFF1 purificado

Una característica bien conocida de la proteína mTFF1 es que después de la administración de la proteína a mo-nocapas de células Caco-2 disminuye de forma significativa la expresión superficial de cadherina E (Liu y col., 1997).Se mostró una disminución del 10% de la expresión superficial de cadherina E después de administrar el mTFF1preparado como se ha descrito anteriormente a monocapas de Caco-2.

Tratamiento de la colitis murina aguda con mTFF1 purificado

Para la inducción de la colitis aguda, los ratones recibieron sulfato sódico de dextrano al 6% (DSS, PM 40000)disuelto en el agua de bebida durante 7 días (Kojouharoff y col., 1997). Los ratones que se usaron para los experimentostenían la misma edad y habían recibido el tratamiento con DSS de forma simultánea. Para propósitos terapéuticos, losratones fueron tratados diariamente con 50 µl de mTFF1 en 200 µl de PBS antes de la administración de DSS desdeel día -7 al día 0 (grupos de tratamiento previo), durante la administración de DSS desde el día 0 al día 7 (gruposdurante el tratamiento) y después de la administración de DSS desde el día 7 al 14 (grupos de tratamiento posterior).Para estudiar las diferentes vías para suministrar mTFF1, se trataron los ratones mediante inyección intraperitoneal(i.p.), inoculación intragástrica y administración rectal en cada caso. Los ratones se sacrificaron el día 8 después derecibir agua de bebida sin DSS durante un día (los grupos de tratamiento previo y durante el tratamiento) y el día 14después de recibir agua de bebida sin DSS durante siete días (los grupos de tratamiento posterior). Los grupos controlno tratados con DSS en el agua de bebida se sacrificaron el día 8 y 14. Todos los grupos estaban constituidos por 9ratones. Los resultados se representan en la figura 8 y muestran claramente que en el régimen sin tratamiento no sepuede observar ninguna mejora estadísticamente significativa. Esto hace que la invención descrita sea sorprendente yaque se observa una clara mejora (figuras 3 y 4). Esto significa que el suministro de TFF1 a través de L. lactis suponeuna contribución esencial al efecto terapéutico observado.

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TABLA 1

Descripción sintomática de los valores histológicos

Referencias

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REIVINDICACIONES

1. Una bacteria recombinante no patógena y no invasiva transformada con ADN que codifica un péptido trébolcapaz de suministrar un péptido trébol en el tracto gastrointestinal de un ser humano o un animal.

2. Una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según la reivindicación 1, en la que dicha bacteria es unacepa bacteriana de calidad alimentaria, preferiblemente una cepa bacteriana Gram positiva.

3. Una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según la reivindicación 2, en la que dicha cepa bacterianaes una especie de Lactococcus o de Lactobacillus.

4. Una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según la reivindicación 3, en la que dicha cepa bacterianaes Lactococcus lactis.

5. Una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la quedicho péptido trébol es TFF1.

6. Composición farmacéutica que comprende una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cual-quiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Procedimiento para el suministro de péptido trébol al tracto gastrointestinal que comprende la administración deuna bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Uso de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 parala fabricación de un agente para el suministro de un péptido trébol al tracto gastrointestinal.

9. Uso de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5para la preparación de un medicamento para tratar lesiones causadas por enfermedades y/o trastornos gástricos y/ointestinales.

10. Uso de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales.

11. Uso de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias gastrointestinales agudasque comprenden colitis aguda, reagudizaciones de la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

12. Uso de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 parala preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades crónicas y espontáneamente recurrentes deltracto gastrointestinal que comprenden enfermedad de Crohn (enteritis regionales) y colitis ulcerosa (colitis ulcerosa).

13. Uso de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5para la preparación de un medicamento para inhibir la formación de lesiones causadas por enfermedades y trastornosgástricos y/o intestinales.

14. Procedimiento para la producción de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva según cualquiera delas reivindicaciones 1 a 5 que comprende transformar una bacteria no patógena y no invasiva con un vector recombi-nante que lleva una secuencia que codifica un péptido trébol bajo el control de un promotor adecuado y una secuenciaseñal de secreción adecuada.

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