Suppression of gastric cancer growth by baculovirus vector-mediated transfer of

normal epithelial cell specific-1 geneWei Huang, Xiang-Long Tian, Yun-Lin Wu, Jie Zhong, Li-Fen Yu,

Sheng-Ping Hu, Biao LiWorld J Gastroenterol. 2008 Oct 14;14(38):5810-5.Universidade de Brasília

Estudantes: Carolina Fumico 09/0004434

Inaê Aquino 09/0018516

Luana Lima 09/0028210

Paula Margotto 09/0011872

www.paulomargotto.com.br

Brasília, 17 de janeiro de 2011

Suppression of gastric cancer growth by baculovirus vector-mediated transfer of normal epithelial cell specific-1 gene.

Huang W, Tian XL, Wu YL, Zhong J, Yu LF, Hu SP, Li B.

World J Gastroenterol. 2008 Oct 14;14(38):5810-5.PMID: 18855978 [PubMed - indexed for MEDLINE]Free PMC ArticleFree text

ARTIGO INTEGRAL

Câncer Gástrico Câncer gástrico é a maior causa de morte por doenças malignas (Nakamura, 1992cancer). Diagnostico tardio – biopsia. Desenvolvimento do câncer: - mucosa; camadas seguintes ; ultrapassa as paredes do estômago (atinge pâncreas e baço); metástases Tratamento : ressecção (gastrectomia); quimioterapia e radioterapia tem pouca eficiência ; terapia gênica.

Terapia gênica Consiste em adicionar

fatores genéticos que possam suprir deficiências ou até mesmo inibir a expressão de certos genes nas células-alvo, servindo de tratamento para diversas doenças.

O vetor, no caso, baculovírus, é administrado diretamente ao paciente, permitindo, dessa forma, uma interação in vivo entre o fator genético e as células-alvo.

Introdução Baculovírus - promissores na terapia

gênica, pois: entra mas não se reproduzir em mamíferos, transgenes grandes podem ser acomodados, altos níveis de expressão de gene recombinante.

NES1 – gene supressor de tumor, é provável que funcione como um regulador extracelularmente do crescimento celular.

GFP – proteína fluorescente verde, permitindo a detecção da sua expressão com microscopia de fluorescência.

Objetivo do artigo

Estudar o efeito inibitório do baculovírus mediado pelo gene de

células epiteliais normais específicas (NES1) em câncer gástrico in vitro e

in vivo - terapia gênica.

EsquemaConstrução do vetor recombinante

Verificar a expressão de GFP

Infecção das células CG com Bac-GFP Infecção das células CG com Bac-NES1

Western blot Ensaio de proliferação(in vitro)

Nude mice com tumor de células CG

Estudos in vivo e imunohistoquímica

Bac-GFP e Bac-NES1

Construção de vetores recombinantes de baculovírus

Método Plasmídeo de baculovírus pFBGFPR –

Instituto de Biologia Molecular da Universidade de Hong Kong

pCMV-NES1 – Divisão da Biologia do Câncer do Departamento de Radioterapia, New England Medical Center

Bac-to-Bac (Invitrogen)

Sistema Bac-to-Bac de acordo com o manual padrão (Invitrogen).

Construção de vetores recombinantes de baculovírus

Resultados Derivado do vetor baculovírus contendo o gene

de interesse NES1 com o promotor CMV. Propagação de Bac-NES1 e Bac-GFP em células

de inseto Spodoptera frugiperda (Sf-9).

Cultura de linhagens de células e incubação com o vetor

Método SGC-7901 foram preservadas e mantidas

em RPMI 1640 com 10% de FBS. Sf-9 foram cultivadas a 27ºC em um

frasco de cultura contendo Sf900 II(Gibco), suplementado com 10% de FBS.

SGC-7901 foram semeadas e depois de 1 dia a cultura foi infectada com diferentes MOI de Bac-GFP.

Cultura foi examinada para expressão de GFP por microscopia de fluorescência

Cultura de linhagens de células e incubação com o vetor

Resultados As células transfectadas com Bac-GFP

(MOI=200) 24h após foram examinadas por microscopia de fluorescência, mostrando que as células SGC-7901 podem ser infectadas com baculovírus.

Expressão de NES1 nas células tumorais pela Bac-NES1

A expressão de NES 1 foi comprovada com western blot Eletroforese em gel(separa as proteínas por tamanho) Transferência para membrana de nitrocelulose membrana colocada face-a-face

com o gelcorrente elétrica então as proteínas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantém a mesma disposição que continham no gel.

Bloqueio(ligações não específicas ) leite Anticorpo primário (membrana incubada overnight ) Anticorpo secundário (1h) Quimioluminescencia foi detectada e analisada

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Expressão de NES1 nas células tumorais pela Bac-NES1

Resultado Comprovação de que o gene estava

sendo expresso nas células tumorais.

Análise de western blot, mostrando a expressão de NES1 em celulas do tumorResultado: 1 proteína na banda 43 kDa

Ensaio de proliferação de SGC-7901(in vitro)

Placas com células tumorais (SGC-7901)

Bac-NES1 Bac GFP PBS

Quantificado o crescimento celular por absorbância

Infectado

com Infectado com

Tratado com

Estudos de enxerto de tumor in vivo

Objetivo : Estudar o efeito inibitório do gene NES1 no crescimento do tumor nos nude mice enxertados com GC

Nude mice: devido a uma modificação genética o camundongo não tem o timo, apresentando uma deficiência no sistema imunológico.

Estudos de enxerto de tumor in vivo Método: Foram usados nude mice com 5 semanas obtidos

da Shanghai Experimental Animals Centre of Chinese Academy of Sciences

As células SGC-7901 foram injetadas subcutanêamente no flanco dorsal de cada camundongo

Conforme o tumor foi crescendo, ele foi cortado em pequenos pedaços e re-implantados no flanco dorsal de cada camundongo

Isso foi feito mais de três vezes e quando o tumor estava palpável os camundongos foram divididos em três grupos e foi injetado baculovírus contendo: 1. Bac-NES1 2. PBS 3. Bac-GFP * foi aplicado diretamente no tumor durante 3 dias

Estudos de enxerto de tumor in vivo

O peso e o volume do enxerto foi medido de forma aleatória com um “ calliper” a cada três dias durante 3 semanas de tratamento

Após a terapia, o camundongo foi sacrificado e o tecido do tumor foi fixado com formol 10% para o próximo teste

Estudos de enxerto de tumor in vivo Resultados O crescimento do tumor

foi significativamente inibido por Bac-NES1(42,3%) comparando com os outros grupos.

Foi observado diferença significante no volume do tumor a partir do 9˚ dia; Os outros dois grupos não obtiveram diferença significativa entre si

Expressão do GFP Objetivo: Verificar se baculovírus podem ser

infectados in vivo

Resultado: Só teve expressão das células com GFP na letra A, então o enxerto com o tumor podem ser infectados com o baculovírus

Imunohistoquímica Objetivo: Avaliar a expressão de NES1 em SGC-7901 xenografts Método: Os tecidos fixados com formol foram desparafinizados,

rehidratados e lavados com PBS Depois de incubados com 3% H2O2 por 10 minutos a temperatura

ambiente, o antigeno foi ativado As secções foram cobertas com soro animal por 20 minutos e

incubadas com anticorpo policlonal NES1 de coelho a 4˚C durante a noite

Então foram tratadas com EnVision kit por 30 minutos a temperatura ambiente

As secções foram visualizadas por diaminobenzidina e contrastada com hematoxilina

Controle negativo: anti-corpos primários TBS foram substituidos por TBS

Os cortes foram observados no microscópio

Imunohistoquímica

Resultados: O tumor tratado com Bac-NES1 exibiu uma expressão de NES1 significativamente maior que os outros tratados com Bac-GFP e PBS. Isso sugere que redução do crescimento do tumor e tamanho deve estar associado com o aumento da expressão do gene NES1.

Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Os dados foram analisados utilizando o sofware SPSS 10.0 (Chicago, EUA).

Conclusão

O estudo da terapia gênica mediada por gene NES1 no câncer gástrico, mostrou-se eficiente para a inibição do crescimento do tumor.

Maiores estudos são necessários para avaliar reações sistêmicas, afeitos adversos e possíveis problemas de resposta imunológica.

Estratégia potente para tratamento de CG

Bibliografia

• http://www.ghente.org/ciencia/terapia/index.htm

• http://www.invitrogen.com.br/

• www.inca.gov.br