suurenenud fc retseptori sidumisvõime ja efektori ...sidumisvõime ja suurenenud efektori...
TRANSCRIPT
EE - EP1692182 B1
Suurenenud Fc retseptori sidumisvõime ja efektori funktsiooniga CD20 antikehad
LEIUTISE TAUST
TEHNIKAVALDKOND
Käesolev leiutis seondub antigeeni siduvate molekulidega (ABM). Täpsemates 5
teostustes seondub käesolev leiutis rekombinantsete monoklonaalsete
antikehadega, täpsemalt inimese CD20 spetsiifiliste inimese jaoks kohandatud
antikehadega. Lisaks seondub käesolev leiutis selliseid ABM kodeerivate
nukleiinhappe molekulide ja selliseid nukleiinhappe molekule sisaldavate vektorite
ja peremeesrakkudega. Leiutis seondub täiendavalt leiutise ABM 10
valmistamismeetoditega ja meetoditega nimetatud ABM kasutamiseks haiguste
ravimisel. Lisaks seondub käesolev leiutis modifitseeritud glükosüülimisprofiiliga
ABM, millel on paranenud terapeutilised omadused, k.a suurenenud Fc retseptori
sidumisvõime ja suurenenud efektori funktsiooniga antikehad.
TEHNIKA TASE 15
Immuunsüsteem ja anti-CD20 antikehad
Selgroogsete (k.a inimesed) immuunsüsteem koosneb arvukatest organitest ja
rakutüüpidest, mis on arenenud sissetungivaid kehaväliseid mikroorganisme
(„antigeenid“) täpselt ja spetsiifiliselt tuvastama, siduma ja hävitama.
Immuunsüsteemi korrektsel funktsioneerimisel omavad kriitilist tähtsust 20
lümfotsüüdid. Neid rakke toodetakse harknäärmes, põrnas ja luuüdis
(täiskasvanud) ning need moodustavad umbes 30% täiskasvanud inimeste
vereringes eksisteerivatest valgetest verelibledest. Eksisteerib kaks peamist
lümfotsüütide alampopulatsiooni: T rakud ja B rakud. T rakud põhjustavad raku
poolt vahendatud immuunsust, samas kui B rakud vastutavad antikehade tootmise 25
eest (humoraalne immuunsus). Kuid tüüpilise immuunvastuse korral toimivad T
rakud ja B rakud üksteisest sõltuvalt: T rakud aktiveeritakse, kui T raku retseptor
seondub antigeeni fragmentidega, mis omakorda on seotud antigeeni kujutava
raku pinnal olevate histokompatibiilse peakompleksi („MHC“) glükovalkudega;
EE - EP1692182 B1 2
selline aktiveerumine põhjustab bioloogiliste mediaatorite („interleukiinid“)
vabanemise, mis omakorda stimuleerivad B rakkude diferentseerumist ja antigeeni
vastaste antikehade („immunoglobuliinid“) tootmist.
Iga peremehes olev B rakk avaldab mingi kindla tüübi ja spetsiifilisusega antikeha
ja erinevad B rakud avaldavad erinevate antigeenide spetsiifilisi antikehasid. B 5
rakkude proliferatsioon ja antikehade tootmine suurenevad hüppeliselt
reaktsioonina kehavälisele antigeenile ning mõlemad reaktsioonid vaibuvad (või
vähenevad oluliselt), kui kehaväline antigeen on neutraliseeritud. Kuid tavaliselt
jätkub konkreetse B raku proliferatsioon ilma vähenemiseta; selline proliferatsioon
võib põhjustada kasvaja tekke, mida teatakse kui "B raku lümfoomi". 10
Nii T kui ka B rakud sisaldavad rakupinna valke, mida saab kasutada
diferentseerumise ja tuvastamise „markeritena“. Üheks selliseks inimese B raku
markeriks on inimese B lümfotsüüdi diferentseerumist keelav antigeen Bp35 ehk
„CD20“. „CD20“ avaldatakse varajase eel-B raku arengu käigus ja avaldumine
toimub plasmarakkude diferentseerumiseni. Täpsemalt, CD20 molekul võib 15
reguleerida aktiveerimisprotsessi etappi, mis on vajalik rakutsükli käivitamiseks ja
diferentseerimiseks ja see avaldub tavaliselt väga kõrgetel tasemetel
neoplastilistes („tuumori“) B rakkudes. Kuna CD20 esineb kõrgetel tasemetel
„pahaloomulistes“ B rakkudes (s.t need B rakud, mille lakkamatu proliferatsioon
võib viia B raku lümfoomini), on CD20 pinna antigeen potentsiaalseks B raku 20
lümfoomide „suunatud ravi“ kandidaadiks.
Põhimõtteliselt kujutab selline suunatud ravi endast järgnevat: B rakkude CD20
pinna antigeenide spetsiifilised antikehad sisestatakse (näiteks süstimise abil)
patsienti. Need anti-CD20 antikehad seonduvad spetsiifiliselt (näiliselt) nii tervete
kui ka pahaloomuliste B rakkude CD20 rakupinna antigeeniga; CD20 pinna 25
antigeeniga seotud anti-CD20 antikeha võib seejärel põhjustada neoplastiliste B
rakkude hävitamise ja hulga vähenemiseni. Lisaks võib anti-CD20 antikehaga
konjugeerida keemilised ained või radioaktiivsed märgised, mis on potentsiaalselt
võimelised tuumori hävitama nii, et aine "transporditakse" spetsiifiliselt näiteks
neoplastilistesse B rakkudesse. Hoolimata rakendamisviisist on peamiseks 30
eesmärgiks tuumori hävitamine: konkreetse kasutusviisi võib määrata vastavalt
EE - EP1692182 B1 3
kasutatavale konkreetsele anti-CD20 antikehale ja seega võivad võimalikud CD20
antigeenile suunatud kasutusviisid märgatavalt erineda.
Kasvaja ravimisel võivad kasulikeks ravimiteks osutuda konjugeerimata
monoklonaalsed antikehad (mAb), mida on demonstreerinud asutuse U.S Food
and Drug Administration heakskiit ravimi Rituximab (Rituxan™; IDEC 5
Pharmaceuticals, San Diego, CA ja Genentech Inc., San Francisco, CA)
kasutamisele CD20 positiivsete B rakkude, väikse riskiga või follikulaarse mitte-
Hodgkini lümfoomi ravimisel; ravimi Trastuzumab (Herceptin™; Genentech Inc,)
kasutamisele arenenud rinnavähi ravimisel (Grillo-Lopez, A.-J., et al., Semin.
Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999)), ravimi 10
Gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst) kasutamisele korduva akuutse
müeloidi leukeemia ravimisel ja ravimi Alemtuzumab (CAMPATH™, Millenium
Pharmaceuticals/Schering AG) kasutamisele B rakkude kroonilise lümfotsüütilise
leukeemia ravimisel. Nimetatud toodete edu ei põhine ainult nende efektiivsusel,
vaid samuti nende sobivatel ohutusprofiilidel (Grillo-Lopez, A.-J., et al., Semin. 15
Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999)).
Hoolimata nende ravimite abil saavutatust, pakub hetkel laialdast huvi
konjugeerimata mAb ravist suurema spetsiifilisusega antikeha aktiivsuse
väljatöötamine. Hiire monoklonaalne antikeha B-Ly1 on veel üheks antikehaks,
mis teatakse olevat inimese CD20 spetsiifiline. (Poppema, S. ja Visser, L., Biotest 20
Bulletin 3: 131-139 (1987)).
Patendis WO 03/11878 kirjeldatakse antikehade glükomuutmist, kasutades
näitena C2B8 (rituxan). Nimetatud dokumendis ei mainita B-Ly1.
Polyak et al., Blood (2002), lk 3256-3262 uurivad epitoope, millega mitmed anti-
CD20 antikehad seonduvad. Nad kasutavad katsetes ühe 16 antikehast koosneva 25
paneelina täielikku hiire B-Ly1 antikeha, testides selle reaktiivsust CD20
ekstratsellulaarse aasa konkreetse piirkonnaga, selle võimet rakkude
homotüüpilist agregatsiooni esile kutsuda ja CD20 rakumembraanis ümber
paigutada. Kuid nad ei pakkunud välja järjestust B-Ly1 jaoks ega valmistanud
fusioonvalke, mis sisaldaksid B-Ly1 järjestuse osasid (näiteks kimäärsed, inimese 30
jaoks kohandatud või glükomuundatud antikehad) ja säilitaksid samas võime
CD20 siduda.
EE - EP1692182 B1 4
Cragg et al., Blood (2003), lk 1045 - 1052 korreleerivad läbi CD20 eritumise
lipiidsetesse parvedesse erinevate anti-CD20 antikehadega (k.a rituximab)
tekitatud komplemendi vahendatud lahustust. Cragg et al. isegi ei testinud oma
uuringutes täielikku hiire B-Ly1 antikeha; selle asemel tehti ainult viide Polyak ja
Deans dokumendile, milles demonstreeriti, et B-Ly1 ei transpordi CD20 5
lipiidsetesse parvedesse.
Davies et al., Biotechnology and Bioengineering - Combinatorial Chemistry (2001),
lk 288-294 avaldasid roti GnTIII rituximab avaldavates CHO rakkudes. Kuid nad
isegi ei maininud hiire B-Ly1, rääkimata B-Ly1 järjestusi või glükomuundatud II
tüübi antikehasid sisaldavate fusioonpolüpeptiidide valmistamisest. 10
Patent US 2003/0 007 097 on suunatud GnTIII kaasavaldatavatele
rekombinantsetele antikehadele, kuid ainukene toimiv näide on suunatud GnTIII
ekspressioonile rituximab´ avaldavates rakkudes. B-Ly1 antikeha ei ole avaldatud.
Patent WO 00/67796 on suunatud meetoditele autoimmuunsete haiguste
ravimiseks, kasutades selleks B raku pinna markeritega (näiteks anti-CD20 15
antikehad) seonduvaid antagoniste. Näited on suunatud rituximab´le. B-Ly1
antikeha ei ole avaldatud.
Mitmete uuringute tulemused võimaldavad soovitada, et Fc retseptorist sõltuvad
mehhanismid soodustavad üldiselt tsütotoksiliste antikehade toimet tuumorite
vastu ja demonstreerivad, et optimaalne tuumorite vastane antikeha seonduks 20
eelistatult aktiveerimise Fc retseptoritega ja minimaalselt inhibeerimispartneriga
FcγRIIB. (Clynes, R. A., et al., Nature Medicine 6(4):443-446 (2000); Kalergis,
A.M. ja Ravetch, J. V., J. Exp. Med 19S (12):1653-1659 (juuni, 2002). Näiteks
vähemalt ühe uuringu tulemused võimaldavad soovitada, et FcγRIIIa retseptor on
tugevalt seotud antikeha ravi efektiivsusega. (Cartron, G., et al., Blood 99(3):754-25
757 (veebruar, 2002)). Nimetatud uuringu käigus demonstreeriti, et FcγRIIIa
suhtes homotsügootsete patsientide reageering rituximab´le oli parem kui
heterotsügootsetel patsientidel. Autorid järeldasid, et parem reageering oli tingitud
antikeha paremast in vivo FcγRIIIa seondumisest, mis omakorda põhjustas
parema ADCC aktiivsuse lümfoomi rakkude vastu. (Cartron, G., et al., Blood 30
99(3):754-757 (veebruar, 2002)).
EE - EP1692182 B1 5
Avaldatud on mitmed CD20 pinna antigeenile suunatud katsed. Hiire
monoklonaalne antikeha 1F5 (anti-CD20 antikeha) manustati B raku lümfoomi
põdevatele patsientidele pideva intravenoosse infusiooniga. Vereringes olevate
tuumorirakkude kõrvaldamiseks vajati ülimalt kõrgeid (>2 grammi) 1FS tasemeid ja
tulemusi kirjeldati kui „põgusaid“. Press et al., "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-5
CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas." Blood 69/2:584-591 (1987).
Nimetatud kasutusviisi potentsiaalseks probleemiks on, et inimestelt
mittepärinevatel monoklonaalsetel antikehadel (näiteks hiire monoklonaalsed
antikehad) puudub tavaliselt inimese efektori funktsionaalsus, s.t, et need ei ole
inter alia võimelised komplemendist sõltuvat lahustust vahendama või inimese 10
märklaud-rakke läbi antikehast sõltuva rakulise toksilisuse või Fc retseptori poolt
vahendatud fagotsütoosi lahustama. Lisaks võidakse inimestelt mittepärinevad
antikehad inimorganismis võõrvalkudena identifitseerida; seega võivad selliste
võõrantikehade korduvad sisestused viia immuunreageeringute esile kutsumiseni,
mis omakorda võivad viia ohtlike ülitundlikkuse reaktsioonideni. Hiire 15
monoklonaalsete antikehade korral viidatakse eelnevalt kirjeldatule sageli kui
inimese reageeringule hiire antikeha vastu või „HAMA“ reageeringule. Lisaks
võidakse neid „võõraid“ antikehasid rünnata peremehe immuunsüsteemi poolt nii,
et need neutraliseeritakse enne sihtkohta jõudmist.
Veel üheks kirjeldatud viisiks hiire monoklonaalsete antikehade B raku häirete 20
ravimiseks sobivamaks muutmiseks on radioaktiivse märgise või toksiini
konjugeerimine antikehaga viisil, et nimetatud märgis või toksiin lokaliseeritakse
tuumori asukohas. Näiteks „märgistati“ eelnevalt mainitud 1F5 antikeha jood-131
("131I“) ja seejärel testiti selle biojaotuvust kahel patsiendil. Vaadake Eary, J. F. et
al., "Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. 31/8:1257-1268 25
(1990); vaadake samuti Press, O. W. et al., "Treatment of Refractory Non-
Hodgkin’s Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody" J. Clin. Onc.
7/8:1027-1038 (1989) (ühel 131I-märgistatud IF-5 ravitud patsiendil saavutati
„osaline reageering"); Goldenberg, D. M. et al., "Targeting, Dosimetry and
Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 30
Monoclonal Antibody" J. Clin. Onc. 9/4:548-564 (1991) (kaheksast mitu doosi
saanud patsiendist kolmel arenes välja HAMA reageering); Appelbaum, F. R.
"Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin’s
EE - EP1692182 B1 6
Lymphoma" Hem. lOnc. Clinics of N. A. 5/5:1013-1025 (1991) (ülevaade); Press,
O. W. et al "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous
Bone Marrow Support." New England J. Med 329/17: 1219-12223 (1993) (jood-
131 märgistatud anti-CD20 antikehad IF5 ja Bl); ning Kaminski, M. G. et al
"Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131I Anti-B1 (Anti-CD20) 5
Antibody". New England J. Med 329/7(1993) (jood-131 märgistatud anti-CD20
antikeha B1; järgnevalt "Kaminski"). Antikehadega on samuti konjugeeritud
toksiine (s.t kemoterapeutilised ained nagu doksorubitsiin või mitomütsiin C).
Vaadake näiteks PCT publitseeritud patendiavaldust WO 92/07466 (publitseeritud
14. mail, 1992). 10
Alternatiivina „konjugeeritud“ antikehadele on samuti välja töötatud kimäärsed
antikehad, mis koosnevad kahe või rohkema erineva liigi (näiteks hiir ja inimene)
antikehade osadest. Vaadake näiteks Liu, A. Y. et al, "Production of a Mouse-
Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic
Activity" J. Immun. 139/10: 3521-3526 (1987), kus kirjeldatakse CD20 antigeeni 15
vastu suunatud hiire/inimese kimäärset antikeha. Vaadake samuti PCT
publikatsiooni nr. WO 88/04936. Näiteks kimäärne anti-CD20 antikeha rituximab
(RITUXAN®) on kiidetud heaks mitte-Hodgkinsi lümfoomi ravimisel.
Arvestades CD20 ekspressiooni B raku lümfoomide poolt, võib see antigeen
toimida kui selliste lümfoomide "ravimise" kandidaat. Põhimõtteliselt kujutab selline 20
suunatud ravi endast järgnevat: patsiendile manustatakse antikehad, mis on
spetsiifilised B rakkude CD20 pinna antigeeni suhtes. Need anti-CD20 antikehad
seonduvad spetsiifiliselt (näiliselt) nii tervete kui ka pahaloomuliste B rakkude
CD20 rakupinna antigeeniga ja raku pinnal seotud CD20 põhjustab tuumorit
sisaldavate B rakkude hävitamise ja hulga vähenemise. Lisaks võib anti-CD20 25
antikeha külge kinnitada otse või kaudselt keemilised ained, tsütotoksiinid või
radioaktiivsed ained nii, et aine „transporditakse“ selektiivselt CD20 avaldavatesse
B rakkudesse. Mõlema kasutusviisi korral on peamiseks eesmärgiks tuumori
hävitamine. Kasutatav rakendusviis sõltub konkreetsest kasutatavast anti-CD20
antikehast. Seega on selge, et erinevad CD20 antigeeni ravivõimalused võivad 30
üksteisest märgatavalt erineda.
EE - EP1692182 B1 7
Rituximab (RITUXAN®) antikeha on geenitehnoloogia abil valmistatud kimäärne
inimese gamma 1 hiire konstantne domeen, mis sisaldab inimese CD20 antigeeni
vastu suunatud monoklonaalset antikeha. See kimäärne antikeha sisaldab inimese
gamma 1 konstantseid domeene ja seda on kirjeldatud USA patendis nr.
5 736 137 (Andersen et al., väljastatud 17. aprillil, 1998 ja omistatud ettevõttele 5
IDEC Pharmaceuticals Corporation) nime all „C2B8“. RITUXAN® on kiidetud
heaks patsientide ravimiseks, kellel esineb korduv või refraktoriga väikse riskiga
või follikulaarne CD20 positiivne B raku mitte-Hodgkinsi lümfoom. Toimeuuringute
in vitro mehhanism on näidanud, et RITUXAN® ilmutab inimese komplemendist
sõltuvat tsütotoksilisust (CDC) (Reff et. al, Blood 83(2): 435-445 (1994)). Lisaks 10
avaldas see märgatavat aktiivsust analüüsides, kus mõõdeti antikehast sõltuvat
rakulist tsütotoksilisust (ADCC). On demonstreeritud, et RITUXAN® omab
antiproliferatiivset aktiivsust tümidiini liitumisanalüüsides ja piiratud võimet
otseseks apoptoosi indutseerimiseks - CD20 antikehadel see puudub (Maloney et.
al, Blood 88 (10): 637a (1996)). 15
Antikeha glükosüülimine
Oligosahhariidkomponent võib mõjutada märgatavalt terapeutilise glükovalgu
efektiivsuse olulisi omadusi, k.a füüsikaline stabiilsus, resistentsus
proteaasrünnakule, vastastiktoime immuunsüsteemiga, farmakokineetika ja
spetsiifiline bioloogiline aktiivsus. Sellised omadused ei pruugi sõltuda ainult 20
oligosahhariidide olemasolust või puudumisest, vaid samuti nende spetsiifilistest
struktuuridest. Oligosahhariidi struktuuri ja glükovalgu funktsiooni vahel võib teha
mõningaid üldistusi. Näiteks teatud oligosahhariidi struktuurid vahendavad läbi
toimete spetsiifiliste süsivesikuid siduvate valkudega glükovalgu kiiret kõrvaldamist
vereringest, samas kui teised võivad seonduda antikehadega ja käivitada 25
soovimatuid immuunreaktsioone. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81
(1996)).
Terapeutiliste glükovalkude tootmise eelistatud peremeesteks on imetajate rakud,
kuna need on võimelised glükosüülima valke inimestel kasutamiseks kõige
sobivamas vormis. (Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., 30
Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Bakterid glükosüülivad valke väga harva ja
sarnaselt muude tavapäraste peremeeste tüüpidega nagu pärmid, kiulised seened
EE - EP1692182 B1 8
ning putukate ja taimede rakud, seonduvad ka pärmi glükosüülimismustrid kiire
eemaldamisega vereringest, soovimatute immuunreaktsioonide ja mõningatel
juhtudel ka vähenenud bioloogilise aktiivsusega. Imetajarakkudest on viimase
kahe aastakümne jooksul olnud enim kasutatuiks hiina hamstri munarakud (CHO).
Lisaks sobivate glükosüülimismustrite tekitamisele võimaldavad need rakud 5
pidevat geneetiliselt stabiilsete suure tootlikkusega klonaalsete rakuliinide loomist.
Neid rakke saab kultuuristada suure tihedusega ka lihtsates bioreaktorites,
kasutades seerumivaba söödet ja saades seeläbi turvalised ja taastatavad
bioprotsessid. Muud tavaliselt kasutatavad loomarakud hõlmavad hamstripoegade
neeru (BHK) rakke, NS0- ja SP2/0 hiire müeloomi rakke. Viimasel ajal on testitud 10
ka transgeensete loomade produktsiooni (Jenkins et al., Nature Biotechnol.
14:975-81 (1996)).
Kõik antikehad sisaldavad raske ahela konstantsete piirkondade konserveerunud
positsioonidel süsivesikute struktuure, kus iga isotüüp omab erinevat N-aheldatud
süsivesiku struktuuride järjestust, mis mõjutab erineval moel valgu pakkimist, 15
eritumist või funktsionaalset aktiivsust (Wright, A. ja Morrison, S. L., Trends
Biotech. 15:26-32 (1997)). Kinnitatud N-aheldatud süsivesiku struktuur erineb
märgatavalt, sõltudes protsessimisastmest ja võib sisaldada nii suure
mannoosisisaldusega hargnenud ahelaga kui ka biantennaarseid kompleksi
vormis oligosahhariide (Wright, A. ja Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 20
(1997)). Tavaliselt toimub konkreetse glükosüülimispiirkonna külge kinnitatud
tuuma oligosahhariidi struktuuride heterogeenne protsessimine viisil, et isegi
monoklonaalsed antikehad esinevad mitmetes glükovormides. Sarnaselt on
demonstreeritud, et peamised erinevused antikeha glükosüülimisel toimuvad
rakuliinide vahel ja erinevatel kultuuritingimustel kasvatatud rakuliinide jaoks on 25
näha isegi väikesed erinevused (Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5(8):813-22
(1995)).
Üheks viisiks potentsiaalsuse oluliseks suurendamiseks, säilitades samaaegselt
lihtsad tootmisprotsessid ja vältides potentsiaalseid märgatavaid soovimatuid
kõrvaltoimeid, on monoklonaalsete antikehade looduslike raku poolt vahendatud 30
efektori funktsioonide võimendamine, muundades selleks nende oligosahhariidi
komponenti viisil, mida on kirjeldanud Umańa, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-
EE - EP1692182 B1 9
180 (1999) ja USA. patendis nr. 6 602 684. IgG1 tüübi antikehad (kasvajate
immunoteraapias enim kasutatud antikehad) on glükovalgud, mille iga CH2
domeeni Asn297 positsioonil asub konserveerunud N-aheldatud glükosüülimissait.
Asn297 külge kinnitatud kaks komplekset biantennaarset oligosahhariidi maetakse
CH2 domeenide vahele, kus need saavutavad ulatusliku kontakti polüpeptiidi 5
alustalaga ja nende olemasolu on antikeha jaoks olulise tähtsusega efektori
funktsioonide nagu antikehast sõltuv rakulise tsütotoksilisuse (ADCC),
vahendamisel (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et
al., Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., Trends
Biotechnol. 15:26-32 (1997)). 10
Käesoleva leiutise autorid demonstreerisid eelnevalt, et Hiina hamstri
munarakkudes toimuva β(1,4)-N-atsetüülgükoosaminüültransferaas III („GnTIII“)
liigse ekspressiooni käigus tekib glükosüültransferaas, mis katalüseerib poolitatud
oligosahhariidide moodustumist, suurendades seeläbi märgatavalt muundatud
CHO rakkude poolt toodetud neuroblastoomi vastase monoklonaalse antikeha 15
(chCE7) in vitro ADCC aktiivsust. (Vaadake Umańa, P. et al., Nature Biotechnol.
17:176-180 (1999) ja rahvusvaheline patenditaotlus nr. WO 99/54342). Antikeha
chCE7 kuulub suurde konjugeerimata mAb klassi, millel on tugev tuumori afiinsus
ja spetsiifilisus, kuid madal potentsiaal kliiniliseks kasutamiseks juhul, kui need
antikehad toodetakse standardsetes tööstuslikes rakuliinides, millel puudub GnTIII 20
ensüüm (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). See uuring oli
esimeseks, kus näidati, et suur ADCC aktiivsuse suurenemine võidakse
saavutada, muundades antikeha tootvaid rakke GnTIII avaldamiseks, mis
suurendab samuti konstantse piirkonnaga (Fc) seotud poolitatud oligosahhariidide
(k.a poolitatud fukosüülimata oligosahhariidid) proportsiooni võrreldes looduslikult 25
esinevates antikehades leiduvaga.
Kuid endiselt eksisteerib vajadus täiustatud ravimeetodite järele, mis on suunatud
CD20 antigeeni kasutamisele B raku lümfoomide ravimiseks primaatidel, k.a
(olemata samas nendega piiratud), inimesed.
30
EE - EP1692182 B1 10
LEIUTISE LÜHIKOKKUVÕTE
Arvestades antigeeni siduvate molekulide (ABM), millel on hiire B-Ly1 antikeha
sidumisspetsiifilisus ja mida on glükomuundatud Fc retseptori sidumisafiinsuse ja
efektori funktsiooni täiustamiseks, tohutut terapeutilist potentsiaali, töötasid
käesoleva leiutise autorid välja meetodi selliste ABM valmistamiseks. Inter alia, 5
nimetatud meetod hõlmab rekombinantsete kimäärsete antikehade või nende
kimäärsete fragmentide valmistamist. Nende ABM efektiivsust täiustatakse lisaks,
muundades antikeha Fc piirkonna glükosüülimisprofiili.
Leiutises avaldatakse eraldatud polünukleotiid, mis koosneb: (a) järjestusest, mis
on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ja SEQ ID NO.: 10
7 (CDR VH-1); (b) järjestusest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO:
21, SEQ ID NO: 22 ja SEQ ID NO: 23. (CDR VH-2); ning SEQ ID NO: 24. Lisaks on
avaldatud eraldatud polünukleotiid, mis koosneb SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ja
SEQ ID NO: 10. (CDR VL). Ühes teostuses kodeerib vähemalt üks nendest
polünukleotiididest fusioonpolüpeptiidi. 15
Lisaks avaldatakse SEQ ID NO: 3 sisaldav eraldatud polünukleotiid, SEQ ID NO: 4
sisaldav eraldatud polünukleotiid ja eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on
valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33;
SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO:
43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID 20
NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO :59; SEQ ID NO: 61; SEQ
ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69 ja SEQ ID NO: 71.
Lisaks avaldatakse SEQ ID NO: 75 sisaldav eraldatud polünukleotiid. Ühes
teostuses kodeerivad sellised polünukleotiidid fusioonpolüpeptiide.
Lisaks kirjeldatakse eraldatud polünukleotiidi, milles leiduv järjestus on vähemalt 25
80% ulatuses identne SEQ ID NO: 3; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib
fusioonpolüpeptiidi. Täiendava teostusena kirjeldatakse eraldatud polünukleotiidi,
milles leiduv järjestus on vähemalt 80% ulatuses identne SEQ ID NO: 4; nimetatud
eraldatud polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi. Samuti kirjeldatakse
eraldatud polünukleotiidi, milles leiduv järjestus on vähemalt 80% ulatuses identne 30
EE - EP1692182 B1 11
järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO:
31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID
NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ
ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59;
SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69 5
ja SEQ ID NO: 71; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib
fusioonpolüpeptiidi. Täiendava teostusena mainitakse eraldatud polünukleotiidi,
milles leiduv järjestus on vähemalt 80% ulatuses identne SEQ ID NO: 75;
nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi.
Lisaks avaldatakse polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 11 (kogu raske ahel) 10
või polünukleotiide, mis on 80%, 85%, 90%, 95% või 99% ulatuses identsed SEQ
ID NO: 11; samuti kirjeldatakse polünukleotiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 12 (kogu
kerge ahel) või polünukleotiide, mis on 80%, 85%, 90%, 95% või 99% ulatuses
identsed SEQ ID NO: 12.
Ka avaldatakse eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID NO: 1 järjestust 15
omavat kimäärset polüpeptiidi. Ühes teostuses sisaldab polünukleotiid SEQ ID
NO: 1 järjestust omavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust; samuti avaldatakse
järjestus, mis kodeerib polüpeptiidi, mis omakorda sisaldab antikeha Fc piirkonna
või selle fragmendi järjestust, mis ei pärine hiirtelt. Samuti kirjeldatakse eraldatud
polünukleotiidi, mis kodeerib kimäärset polüpeptiidi, mille järjestus on valitud 20
rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID
NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ
ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54;
SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO:
64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72. Üheks 25
teostuseks on polünukleotiid, mis sisaldab polüpeptiidi kodeerivat järjestust ja
nimetatud polüpeptiidi järjestus on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30;
SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO:
40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID
NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ 30
ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68;
SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72 ning polüpeptiidi kodeeriv järjestus, kus
EE - EP1692182 B1 12
nimetatud polüpeptiid sisaldab antikeha Fc piirkonna või selle fragmendi järjestust,
mis ei pärine hiirtelt.
Veel üheks leiutise teostuseks on eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID
NO: 2 järjestust omavat kimäärset polüpeptiidi. Ühes teostuses koosneb
polünukleotiid järjestusest, mis kodeerib SEQ ID NO: 2 järjestusega polüpeptiidi; ja 5
polüpeptiidi kodeerivast järjestusest, kus nimetatud polüpeptiidil on antikeha Fc
piirkonna või selle fragmendi järjestus, mis ei pärine hiirtelt. Veel ühes teostuses
kirjeldatakse eraldatud polünukleotiidi, mis kodeerib SEQ ID NO: 76 järjestust
omavat kimäärset polüpeptiidi. Ühes teostuses sisaldab polünukleotiid SEQ ID
NO: 76 järjestust omavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust; samuti avaldatakse 10
järjestus, mis kodeerib polüpeptiidi, mis omakorda sisaldab antikeha Fc piirkonna
või selle fragmendi järjestust, mis ei pärine hiirtelt.
Lisaks mainitakse eraldatud polünukleotiidi, mis sisaldab järjestust, mis omakorda
kodeerib hiire B-Ly1 antikeha või selle funktsionaalsete variantide VH piirkonda
omavat polüpeptiidi; samuti kirjeldatakse polüpeptiidi kodeerivat järjestust, kus 15
nimetatud polüpeptiidil on antikeha Fc piirkonna või selle fragmendi järjestus, mis
eri pärine hiirtelt. Veel ühes teostuses mainitakse eraldatud polünukleotiidi, mis
sisaldab järjestust, mis omakorda kodeerib hiire B-Ly1 antikeha või selle
funktsionaalsete variantide VL piirkonda omavat polüpeptiidi; samuti kirjeldatakse
polüpeptiidi kodeerivat järjestust, kus nimetatud polüpeptiidil on antikeha Fc 20
piirkonna või selle fragmendi järjestus, mis eri pärine hiirtelt.
Leiutises kirjeldatakse samuti ekspressioonivektorit, mis sisaldab mistahes
eelnevalt kirjeldatud eraldatud polünukleotiidi; samuti kirjeldatakse sellist
ekspressioonivektorit sisaldavat punktidele 12 kuni 17 vastavat peremeerakku.
Täiendava teostusena seondub leiutis mistahes nõudluspunktile 12 kuni 17 25
vastava peremeesrakuga.
Avaldatakse eraldatud polüpeptiid, mis koosneb: (a) järjestusest, mis on valitud
rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 ja SEQ ID NO: 17 (CDR
VH-1); (b) järjestusest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 25,
SEQ ID NO: 26 ja SEQ ID NO: 27 (CDR VH-2); ning SEQ ID NO: 28; nimetatud 30
polüpeptiidiks on fusioonpolüpeptiid. Veel ühes teostuses avaldatakse eraldatud
EE - EP1692182 B1 13
polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ja SEQ ID NO: 20 (CDR
VL), kus nimetatud polüpeptiidiks on fusioonpolüpeptiid.
Samuti avaldatakse kimäärne polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 1 järjestust
või selle varianti ja kimäärne polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 2 järjestust või
selle varianti. Ühes teostuses sisaldab mistahes selline polüpeptiid inimese Fc 5
piirkonda. Lisaks kirjeldatakse kimäärset polüpeptiidi, mis sisaldab järjestust, mis
omakorda on valitud SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID
NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ
ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54;
SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 10
64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72 või nende
variantide hulgast; ja kimäärset polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 76
järjestust. Ühes teostuses sisaldab mistahes selline polüpeptiid inimese Fc
piirkonda.
Lisaks avaldatakse polüpeptiid, mis sisaldab hiire B-Ly1 antikehast deriveeritud 15
järjestust ja heteroloogsest polüpeptiidist deriveeritud järjestust ja sellist
polüpeptiidi sisaldav antigeeni siduv molekul. Antigeeni siduvaks molekuliks on
antikeha. Ja nimetatud antikeha on inimese jaoks kohandatud.
Kirjeldatakse ka eraldatud polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 13 või selle
varianti ja eraldatud polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 14. 20
Lisaks avaldatakse kimäärne ABM, mis on võimeline CD20 sidumisel hiire B-Ly1
antikehaga konkureerima. Ühes teostuses on ABM antikeha või selle fragment.
Täiendavas teostuses on ABM rekombinantne antikeha, mis sisaldab VH piirkonna,
mille aminohappejärjestus on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 1; SEQ
ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; 25
SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO:
48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID
NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ
ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72. Ühes muus teostuses on ABM
rekombinantne antikeha, mis sisaldab VL piirkonda, mille aminohappejärjestus on 30
valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 2 ja SEQ ID NO: 76. ABM on inimese
EE - EP1692182 B1 14
jaoks kohandatud rekombinantne antikeha. Ühes muus teostuses on ABM inimese
Fc piirkonda sisaldav rekombinantne antikeha. Ühes täiendavas teostuses võib
mistahes eelnevalt avaldatud ABM konjugeerida fragmendi nagu toksiini või
radiomärgisega.
Leiutis seondub täiendavalt käesoleva leiutise ABM, kus nimetatud ABM sisaldab 5
modifitseeritud oligosahhariide. Ühes teostuses on modifitseeritud
oligosahhariididel võrreldes modifitseerimata oligosahhariididega väiksem
fukosüülimisaste. Muudes teostustes on modifitseeritud oligosahhariidideks
hübriidid või kompleksid. Täiendavas teostuses on ABM nimetatud molekuli Fc
piirkonnas suurenenud fukosüülimata oligosahhariidide või poolitatud 10
fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon. Ühes teostuses on poolitatud
fukosüülimata oligosahhariidid hübriidid. Ühes täiendavas teostuses on poolitatud
fukosüülimata oligosahhariidid kompleksid. Ühes teostuses on vähemalt 20%
nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevatest oligosahhariididest fukosüülimata
või poolitatud ja fukosüülimata. Eelistatumates teostustes on vähemalt 30%, 35%, 15
40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% või 75% või rohkem oligosahhariididest
fukosüülimata või poolitatud ja fukosüülimata.
Leiutises avaldatakse samuti polünukleotiid, mis kodeerib mistahes eelnevalt
mainitud ABM ja sellist polünukleotiidi sisaldavad ekspressioonivektorid ja rakud.
Avaldatakse meetod ABM, mis on võimeline CD20 sidumisel hiire B-Ly1 20
antikehaga konkureerima, valmistamiseks ning nimetatud ABM on kimäärne;
nimetatud meetod sisaldab: (a) peremeesraku, mis sisaldab käesoleva leiutise
ABM kodeerivat polünukleotiidi, kultuuristamist söötmes tingimustel, mis
võimaldavad nimetatud ABM kodeeriva nimetatud polünukleotiidi ekspressiooni; ja
(b) nimetatud ABM eraldamist saadud kultuurist. 25
Ühes muus teostuses seondub leiutis nõudluspunktile 18 vastava
ravimkoostisega, mis sisaldab leiutise ABM. Mõistetakse, et ravimkoostis võib
lisaks sisaldada ka farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit, abiainet või nende
kombinatsiooni.
EE - EP1692182 B1 15
Täiendavas teostuses võib leiutist kasutada B rakkude hulga vähendamisega
ravitava haiguse ravimiseks. Meetod hõlmab seda vajavale inimpatsiendile
terapeutiliselt efektiivse koguse käesoleva leiutise ABM manustamist. Ühes
eelistatud teostuses ravitakse haigust ABM manustamisega ja nimetatud ABM on
kimäärne antikeha või antikeha kimäärne fragment. 5
Lisaks avaldatakse peremeesrakk, mida on muundatud viisil, et võimaldada
vähemalt ühe GnTIII aktiivsust omava polüpeptiidi kodeeriva nukleiinhappe
avaldamist mahus, mis on piisav sellisel viisil valmistatud peremeesraku Fc
piirkonna oligosahhariidide modifitseerimiseks; ABM on võimeline CD20 sidumisel
hiire B-Ly1 antikehaga konkureerima ja on kimäärne. Ühes teostuses on GnTIII 10
aktiivsust omavaks polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid. Ühes muus teostuses on
peremeesraku poolt toodetud ABM antikeha või antikeha fragment. Täiendavas
teostuses sisaldab ABM piirkonda, mis on samaväärne inimese IgG Fc
piirkonnaga.
Kirjeldatakse ka eraldatud polünukleotiidi, mis sisaldab vähemalt ühte hiire B-Ly1 15
antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat
piirkonda, mis sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust määrava
piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke; nimetatud eraldatud polünukleotiid
kodeerib fusioonpolüpeptiidi. Eelistatult kodeerivad sellised eraldatud
polünukleotiidid fusioonpolüpeptiidi, milleks on antigeeni siduv molekul. Ühes 20
teostuses koosneb polünukleotiid kolmest hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide
või lühendatud vormide komplementaarsust määravast piirkonnast, mis sisaldavad
vähemalt iga nimetatud kolme komplementaarsust määrava piirkonna
spetsiifilisust määravaid jääke. Ühes muus teostuses kodeerib polünukleotiid kogu
kimäärse (näiteks inimese jaoks kohandatud) antikeha kerge või raske ahela 25
varieeruvat piirkonda.
Kirjeldatakse ka antigeeni kombineerivat molekuli, mis sisaldab vähemalt ühte
hiire B-Ly1 antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust
määravat piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud
komplementaarsust määrava piirkonna spetsiifilisust määravat jääki ja järjestust, 30
mis on deriveeritud heteroloogsest polüpeptiidist. Ühes teostuses koosneb
antigeeni siduv molekul kolmest hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide või
EE - EP1692182 B1 16
lühendatud vormide komplementaarsust määravast piirkonnast, mis sisaldavad
vähemalt iga nimetatud kolme komplementaarsust määrava piirkonna
spetsiifilisust määravaid jääke. Ühes muus teostuses koosneb antigeeni siduv
molekul antikeha kerge või raske ahela varieeruvast piirkonnast. Ühes eriti
kasulikus teostuses on antigeeni siduvaks molekuliks kimäärne (näiteks inimese 5
jaoks kohandatud) antikeha. Sellised antigeeni siduvaid molekule saab kasutada
haiguste, k.a B raku lümfoomid, ravimiseks.
Käesolev leiutis on esimeseks teada olevaks juhuks, kus II tüübi anti-CD20
antikeha muundatakse suurenenud efektori funktsioonide nagu ADCC omamiseks,
säilitades samal ajal potentsiaalse apoptoosi võime. Seega on käesolev leiutis 10
suunatud muundatud II tüübi anti-CD20 antikehale, millel on nimetatud
muundamise tulemusel suurenenud ADCC ilma, et kaoks potentsiaalne apoptoosi
indutseerimise võime. Ühes teostuses on II tüübi anti-CD20 antikehasid
muundatud viisil, et neil oleks Fc piirkonnas muudetud glükosüülimismuster. Ühes
konkreetses teostuses koosneb muudetud glükosüülimine suurenenud poolitatud 15
kompleksi jääkide tasemest Fc piirkonnas. Ühes muus konkreetses teostuses
koosneb muudetud glükosüülimine vähenenud fukoosi jääkide tasemest Fc
piirkonnas. Ühes muus teostuses on II tüübi anti-CD20 antikehad läbinud
polüpeptiidi muundamise. Leiutis seondub lisaks meetoditega selliste muundatud
II tüübi antikehade valmistamiseks ja meetoditega selliste antikehade 20
kasutamiseks erinevate B raku häirete, k.a B raku lümfoomid, ravimiseks.
Käesoleva leiutise peremeesraku võib valida rühmast, kuhu kuuluvad, olemata
samas nendega piiratud, CHO rakk, BHK rakk, NSO rakk, SP2/0 rakk, YO
müeloomi rakk, P3X63 hiire müeloomi rakk, PER rakk, PER.C6 rakk või
hübridoomrakk. Ühes teostuses sisaldab leiutise peremeesrakk lisaks 25
transfekteeritud polünukleotiidi, mis sisaldab hiire B-Ly1 antikeha või selle
variantide VL piirkonda kodeerivat polünukleotiidi ja järjestust, mis kodeerib
inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda. Ühes muus
teostuses sisaldab leiutise peremeesrakk lisaks transfekteeritud polünukleotiidi,
mis sisaldab hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide VH piirkonda kodeerivat 30
polünukleotiidi ja järjestust, mis kodeerib inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga
samaväärset piirkonda.
EE - EP1692182 B1 17
Ühe täiendava teostusena seondub leiutis peremeesrakuga, mis toodab ABM, mis
omakorda avaldab selle oligosahhariidide modifitseerimise tõttu suurenenud Fc
retseptori sidumisafiinsust ja/või suurenenud efektori funktsiooni. Ühes muus
teostuses avaldub suurenenud sidumisafiinsus Fc retseptori ja täpsemalt FcγRIIIA
retseptori suhtes. Siin vaadeldud efektori funktsiooni võib valida rühmast, kuhu 5
kuuluvad, olemata samas nendega piiratud, suurenenud Fc vahendatud rakuline
tsütotoksilisus; suurenenud seondumine NK rakkudega; suurenenud seondumine
makrofaagidega; suurenenud seondumine polümorftuumaste rakkudega;
suurenenud seondumine monotsüütidega; suurenenud apoptoosi indutseeriv
otsene signalisatsioon; suurenenud dendriitrakkude valmimine; ja suurenenud T 10
rakkude praimimine.
Täiendavas teostuses sisaldab käesoleva leiutise peremeerakk vähemalt ühte
nukleiinhapet, mis kodeerib konstitutiivse promootorelemendiga operatiivselt
aheldatud GnTIII aktiivsust omavat polüpeptiidi.
Ühes muus teostuses avaldatakse meetod ABM tootmiseks peremeesrakus, mis 15
hõlmab: (a) peremeesraku, mida on muundatud vähemalt ühe GnTIII aktiivsust
omava fusioonpolüpeptiidi kodeeriva polünukleotiidi avaldamiseks, kultuuristamist
tingimustel, mis võimaldavad nimetatud ABM tootmist ja nimetatud ABM Fc
piirkonnas olevate oligosahhariidide modifikatsiooni; ja (b) nimetatud ABM
eraldamist; nimetatud ABM on võimeline CD20 sidumisel hiire B-Ly1 antikehaga 20
konkureerima ja on kimäärne. Ühes teostuses on GnTIII aktiivsusega
polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid, mis koosneb eelistatult GnTIII katalüütilisest
domeenist ja heteroloogse Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni
domeenist, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad mannosidaas II lokalisatsiooni
domeen, β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas I ("GnTI") lokalisatsiooni 25
domeen, mannosidaas I lokalisatsiooni domeen, β(1,2)-N-
atsetüülglükoosaminüültransferaas II ("GnTII") lokalisatsiooni domeen ja α1-6
tuuma fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen. Eelistatult on Golgi
lokalisatsiooni domeeniks mannosidaas II või GnTI.
Ühes täiendavas teostuses seondub leiutis meetodiga peremeesraku poolt 30
toodetud anti-CD20 ABM glükosüülimisprofiili modifitseerimiseks; meetod hõlmab
vähemalt ühe leiutise nukleiinhappe või ekspressioonivektori sisestamist
EE - EP1692182 B1 18
peremeesrakku. Ühes teostuses on ABM antikeha või selle fragment, mis sisaldab
eelistatult IgG Fc piirkonda. Alternatiivina on polüpeptiidiks fusioonvalk, mis
sisaldab inimese IgG Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda.
Ühes teostuses seondub leiutis rekombinantse kimäärse antikeha või selle
fragmendiga, mis on võimeline konkureerima CD20 sidumisel hiire B-Ly1 5
antikehaga ja millel on vähenenud fukosüülimistase.
Ühes muus teostuses seondub käesolev leiutis meetodiga leiutise rekombinantse
antikeha või selle fragmendi glükosüülimise modifitseerimiseks, kasutades selleks
fusioonpolüpeptiidi, millel on GnTIII aktiivsus ja mis sisaldab heteroloogse Golgi-
resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni. Ühes teostuses sisaldavad 10
leiutise fusioonpolüpeptiidid GnTIII katalüütilist domeeni. Ühes muus teostuses on
Golgi lokalisatsiooni domeen valitud rühmast, kuhu kuuluvad: mannosidaas II
lokalisatsiooni domeen, GnTI lokalisatsiooni domeen, mannosidaas I
lokalisatsiooni domeen, GnTII lokalisatsiooni domeen ja α1-6 tuuma
fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen. Eelistatult on Golgi lokalisatsiooni 15
domeeniks mannosidaas II või GnTI.
Ühes teostuses on leiutise meetod suunatud modifitseeritud oligosahhariide
sisaldava rekombinantse kimäärse antikeha või selle fragmendi tootmisele, kus
nimetatud modifitseeritud oligosahhariididel on võrreldes modifitseerimata
oligosahhariididega vähenenud fukosüülimistase. Vastavalt käesolevale leiutisele 20
võivad need modifitseeritud oligosahhariidid olla hübriidid või kompleksid. Ühes
muus teostuses seondub leiutise meetod rekombinantse kimäärse antikeha või
selle fragmendi tootmisega, millel on nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas
suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon. Ühes
teostuses on poolitatud fukosüülimata oligosahhariidideks hübriidid. Ühes muus 25
teostuses on poolitatud fukosüülimata oligosahhariidideks kompleksid. Ühes
täiendavas teostuses seondub leiutise meetod rekombinantse kimäärse antikeha
või selle fragmendi tootmisega, kus vähemalt 20% nimetatud polüpeptiidi Fc
piirkonna oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata. Ühes eelistatud
teostuses on vähemalt 30% nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevatest 30
oligosahhariididest poolitatud ja fukosüülimata. Ühes muus eelistatud teostuses on
EE - EP1692182 B1 19
vähemalt 35% nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevatest oligosahhariididest
poolitatud ja fukosüülimata.
Ühe täiendava teostusena seondub leiutis rekombinantse kimäärse antikeha või
selle fragmendiga, mis omakorda avaldab selle oligosahhariidide modifitseerimise
tõttu suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsust ja/või suurenenud efektori 5
funktsiooni. Ühes muus teostuses avaldub suurenenud sidumisafiinsus Fc
aktiveeriva retseptori suhtes. Ühes täiendavas teostuses on Fc retseptoriks Fcγ
aktiveeriv retseptor ja täpsemalt FcγRIIIA retseptor. Siin vaadeldud efektori
funktsiooni võib valida rühmast, kuhu kuuluvad, olemata samas nendega piiratud,
suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus; suurenenud seondumine NK 10
rakkudega; suurenenud seondumine makrofaagidega; suurenenud seondumine
polümorftuumaste rakkudega; suurenenud seondumine monotsüütidega;
suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene signalisatsioon; suurenenud
dendriitrakkude valmimine; ja suurenenud T rakkude praimimine.
Ühes muus teostuses seondub leiutis mistahes käesoleva leiutise meetoditega 15
valmistatud rekombinantse kimäärse antikeha fragmendiga, millel on hiire B-Ly1
antikeha sidumisspetsiifilisus ja mis sisaldab Fc piirkonda, mida on muundatud
suurenenud efektori funktsiooni saavutamiseks.
Ühes muus teostuses avaldatakse mistahes käesoleva leiutise meetoditega
valmistatud fusioonvalk, mis sisaldab SEQ ID NO: 1 järjestust ja immunoglobuliini 20
Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda; nimetatud fusioonvalku on muundatud
suurenenud efektori funktsiooni saavutamiseks.
Ühes muus teostuses avaldatakse mistahes käesoleva leiutise meetoditega
valmistatud fusioonvalk, mis sisaldab SEQ ID NO: 2 järjestust ja immunoglobuliini
Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda; nimetatud fusioonvalku on muundatud 25
suurenenud efektori funktsiooni saavutamiseks.
Ühes teostuses seondub käesolev leiutis ravimkoostisega, mis sisaldab mistahes
käesoleva leiutise meetoditega valmistatud rekombinantset kimäärset antikeha ja
farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit. Ühes muus teostuses seondub
käesolev leiutis ravimkoostisega, mis sisaldab mistahes käesoleva leiutise 30
EE - EP1692182 B1 20
meetoditega valmistatud rekombinantse kimäärse antikeha fragmenti ja
farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit. Ühes muus teostuses seondub
käesolev leiutis ravimkoostisega, mis sisaldab mistahes käesoleva leiutise
meetoditega valmistatud fusioonvalku ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.
Käesoleva leiutise ühendeid võib kasutada B rakkude hulga vähendamisega 5
ravitavate haiguste ravimismeetodis ja nimetatud meetod hõlmab seda vajavale
inimpatsiendile terapeutiliselt efektiivse koguse mistahes käesoleva leiutise
meetodiga valmistatud rekombinantse kimäärse antikeha või selle fragmendi
manustamist.
JOONISTE LOETELU 10
Joonis FIG 1. Hiire B-Ly1 VH piirkonna nukleotiid (SEQ ID NO: 2) ja
aminohappejärjestus (SEQ ID NO: 1).
Joonis FIG 2. Hiire B-Ly1 VL piirkonna nukleotiid (SEQ ID NO: 4) ja
aminohappejärjestus (SEQ ID NO: 3).
Joonis FIG 3. Rituximab® (O) ja ch-B-Ly1 (∆) seondumine CD20 Raji B lümfoomi 15
rakkudel.
Joonis FIG 4. Rituximab® (O) ja ch-B-Ly1 (∆) poolt esile kutsutud B rakkude hulga
vähenemine kolme erineva FcγRIIIa-158V/F genotüübi klassi täisveres: (A) F/F
doonori veri, mis on homotsügootne madalama afiinsuse retseptori suhtes; (B) F/V
doonori veri, mis on heterotsügootne afiinsuse retseptori suhtes; ja (C) V/V 20
doonori veri, mis on homotsügootne kõrgema afiinsuse retseptori suhtes.
Joonis FIG 5. Kimäärse anti-CD20 antikeha raske ahela nukleotiid (SEQ ID NO:
11) ja aminohappejärjestus (SEQ ID NO: 13).
Joonis FIG 6. Kimäärse anti-CD20 antikeha kerge ahela nukleotiid (SEQ ID NO:
12) ja aminohappejärjestus (SEQ ID NO: 14). 25
Joonis FIG 7. Hiire B-Ly1 antikeha CDR nukleotiid ja aminohappejärjestus. (A)
Eeldatud CDR VH piirkonna jaoks; (B) eeldatud CDR VL piirkonna jaoks.
EE - EP1692182 B1 21
Joonis FIG 8. Glükomuundatud kimäärse B-Ly1 antikeha MALDI-TOF profiil. (A)
Konkreetse tipu protsente näitav tabel; (B) glükomuundatud kimäärse B-Ly1
spekter; (C) EndoH töödeldud glükomuundatud kimäärse B-Ly1 spekter.
Joonis FIG 9. Erinevate inimese jaoks kohandatud anti-CD20 antikehade
seondumine Raji B rakkudega. Erinevused BHH2 konstruktsiooni ning B-HL8 ja B-5
HL11 konstruktsioonide vahel asuvad raami 1 ja 2 piirkondades ning kõik kolm
CDR on identsed. B-HL8 ja B-HL11 FR1 ja FR2 järjestused on deriveeritud
inimese VH3 klassist, samas kui kogu B-HH2 raam on deriveeritud inimese VH1
klassist. B-HL11 on B-HL8 derivaat, omades ühte mutatsiooni Glu1GIn, kus GIn
on B-HH2 konstruktsioonis olev aminohappejääk. See tähendab, et Glu1GIn 10
vahetus ei muuda sidumisafiinsust või -intensiivsust. Muudeks B-HH2 ja B-HL8
vahelisteks erinevusteks on 14 FR jääki, millest üks või rohkem mõjutavad
nimetatud antikeha antigeeni sidumise olemust.
Joonis FIG 10. Inimese jaoks kohandatud anti-CD20 antikeha BHL4-KV
seondumine Raji märklaudrakkudega. B-HL4 konstruktsioon on deriveeritud B-15
HH2 antikehast, asendades B-HH2 FR1 fragmendiga, mis omakorda on
deriveeritud inimese iduliini järjestusest VH1_45. Hoolimata sellest, et FR1 on
erinevad aminohapped ainult kolmel positsioonil, on konstruktsioonil on oluliselt
vähenenud antigeeni sidumisvõime. Jäägid asuvad vastavalt Kabat´
nummerdusele positsioonidel 2, 14 ja 30. Nimetatud positsioonidest tundub olema 20
kõige olulisem positsioon 30, kuna see moodustab osa Chothia CDR1
definitsioonist.
FIG 11. B-HH1, B-HH2, B-HH3 ja lähte-antikeha B-Ly1 sidumisomaduste võrdlus.
Andmed demonstreerivad, et kõikidel antikehadel on sarnane EC50 väärtus, kuid
B-HH1 konstruktsioon seondub madalama intensiivsuse/stöhhiomeetriaga kui 25
variandid B-HH2 ja B-HH3. B-HH1 võib eristada B-HH2 ja B-HH3 nii selle osaliselt
inimese CDR1 ja CDR2 piirkondadega (Kabat´ definitsioon) kui ka positsioonil 28
esineva Ala/Thr polümorfismiga (Kabat´ nummerdus). See näitab, et
antikeha/antigeeni vastastiktoime jaoks on oluline kas positsioon 28, täielik CDR1
ja/või täielik CDR2. 30
EE - EP1692182 B1 22
Joonis FIG 12. B-HL1, B-HH1 ja B-Ly1 lähte-antikeha võrdlus. Andmed
demonstreerivad sidumisaktiivsuse puudumist B-HL1 konstruktsioonis ja umbes
poolt B-HH1 sidumisintensiivsusest/stöhhiomeetriast võrreldes B-Ly1. Nii B-HL1
kui ka B-HH1 on välja töötatud, tuginedes inimese VH1 klassist deriveeritud
aktseptori raamidele. Muude erinevuste hulgas on silmatorkavaks erinevuseks B-5
HL1 konstruktsiooni positsioon 71 (Kabat´ nummerdus), näidates selle eeldatavat
tähtsust antigeeni sidumise jaoks.
Joonis FIG 13. Anti-CD20 antikeha võimekuse fluorotsütomeetriline analüüs selle
antigeeni suhtes. Andmed demonstreerisid, et B-HL2 ja B-HL3 konstruktsioonid ei
ilmuta CD20 siduvat aktiivsust. 10
Joonis FIG 14. Anti-CD20 antikehade apoptoos Z-138 MCL rakkudel.
Joonis FIG 15. Anti-CD20 antikehade poolt esile kutsutud apoptoos. Analüüsi
detailid: 5 x 105 rakku/reservuaari kohta idustati 24-reservuaariga plaatidel
kultuursöötmes (5 x 105 rakku/ml kohta). Reservuaaridele lisati 10 mg vastavat
antikeha, PBS (negatiivne kontroll) või 5 mM kamptotetsiini ((CPT) positiivne 15
kontroll). Proove inkubeeriti üleöö (16 tundi), värviti AnnV-FITC abil ja analüüsiti
FACS. Analüüs sooritati kolmes korduses (*): lahutati ainult signaal PBS jaoks
(ainult PBS andis 8% ja 2% AnnV+ vastavalt PR1 ja Z-138 rakkude jaoks).
Kasutatud antikehadeks olid: C2B8 (kimäärne, glükomuundamata); BHH2-KV1
(inimese jaoks kohandatud, glükomuundamata). Märkus: see analüüs ei hõlma 20
võimalikke täiendavaid efektori rakke, vaid ainult märklaudrakke pluss antikeha või
kontrollvariandid.
Joonis FIG 16. Märklaud-rakkude hävitamine anti-CD20 antikehadega
immuunseid efektorrakke kasutades. Analüüsi detailid: B rakkude hulga
vähendamine terves täisveres koos üleöö kestva inkubatsiooniga ja CD 19+/CD3+ 25
analüüs FACS abil. ADCC koos PBMC kasutamine efektoritena, 4 tunni pikkune
inkubatsioon, efektori:märklaua suhe 25:1, märklaua hävitamist mõõdetakse
kaltseiini peetumisega, mis on relatiivne pesuvahendiga lahustusega (100%) ja
ilma antikeha lahustuseta (0%). Kasutatud antikehad: C2B8 (kimäärne
glükomuundamata vorm); BHH2-KV1-wt (BHH2-KV1 inimese jaoks kohandatud 30
EE - EP1692182 B1 23
glükomuundatud vorm); BHH2-KV1-GE (BHH2-KV1 inimese jaoks kohandatud
glükomuundatud vorm).
Joonis FIG 17. Modifitseerimata glükomuundamata BHH2-KV1 inimese jaoks
kohandatud IgG1 B-Ly1 inimese vastase CD20 antikeha PNGaasF-vabastatud Fc
oligosahhariidide MALDI/TOF-MS profiil. 5
Joonis FIG 18. Glükomuundatud BHH2-KV1g1 inimese jaoks kohandatud IgG1 B-
Ly1 inimese vastase CD20 antikeha PNGaasF-vabastatud Fc oligosahhariidide
MALDI/TOF-MS profiil. Glükomuundamine sooritati antikeha geenide
peremeesrakkude kaasavaldamise ja geeni kodeeriva ensüümiga, millel oli β-1,4-
N-atsetüülgükoosaminüültransferaas III (GnTIII) katalüütiline aktiivsus. 10
Joonis FIG 19. Glükomuundatud BHH2-KV1g2 inimese jaoks kohandatud IgG1 B-
Ly1 inimese vastase CD20 antikeha PNGaasF-vabastatud Fc oligosahhariidide
MALDI/TOF-MS profiil. Glükomuundamine sooritati antikeha geenide
peremeesrakkude kaasavaldamise ja geene kodeeriva ensüümiga, millel oli β-1,4-
N-atsetüülgükoosaminüültransferaas III (GnTIII) katalüütiline aktiivsus ja kodeeriva 15
ensüümiga, millel oli Golgi α-mannosidaas II katalüütiline aktiivsus.
Joonis FIG 20. Glükomuundamata ja glükomuundatud antikehade seondumine
inimese FcgammaRIIIa retseptoriga, näidatuna rekombinantsete CHO-CD 16
rakkude pinnal.
Joonis FIG 21. Fc muundamata ja Fc muundatud anti-CD20 antikehade apoptoos 20
Z-138 MCL rakkudel. Analüüsi detailid: 5 x 105 rakku/reservuaari kohta idustati
24-reservuaariga plaatidel kultuursöötmes (5 x 105 rakku/ml kohta).
Reservuaaridele lisati 10 mg vastavat antikeha või PBS (negatiivne kontroll).
Proove inkubeeriti üleöö (16 tundi), värviti AnnV-FITC abil ja analüüsiti FACS.
Analüüs sooritati kolmes korduses. Kasutatud antikehadeks olid: C2B8 = rituximab 25
(kimäärne glükomuundamata vorm, sarnane kaubanduslikult saadaval olevale
vormile); BHH2-KV1 (inimese jaoks kohandatud, glükomuundamata -
glükosüülimisprofiil on toodud joonisel Fig 6); BHH2-KV1g1 (inimese jaoks
kohandatud, glükomuundatud – glükosüülimisprofiil on toodud joonisel Fig. 7);
BHH2-KV1g2 (inimese jaoks kohandatud, glükomuundatud – glükosüülimisprofiil 30
EE - EP1692182 B1 24
on toodud joonisel Fig 8). Märkus: see analüüs ei hõlma võimalikke täiendavaid
efektorrakke, vaid ainult märklaudrakke pluss antikeha või kontrollvariandid. (*):
Ainult PBS jaoks mõõdetud signaal lahutatud.
LEIUTISE DETAILNE KIRJELDUS
Siin kasutatud mõisted omavad nende üldiselt kasutatavaid tähendusi v.a juhud, 5
kui allpool on defineeritud teisiti.
Siin kasutatuna hõlmab mõiste „antikeha“ täielikke antikeha molekule, k.a
monoklonaalsed, polüklonaalsed ja multispetsiifilised (näiteks bispetsiifilised)
antikehad, nagu ka Fc piirkonda omavad ja sidumisspetsiifilisust säilitavad
antikeha fragmendid ja fusioonvalgud, mis sisaldavad immunoglobuliini Fc 10
piirkonnaga samaväärset piirkonda ja säilitavad sidumisspetsiifilisuse. Samuti on
hõlmatud inimese jaoks kohandatud, primaatide jaoks kohandatud ja kimäärsed
antikehad.
Siin kasutatuna hõlmab mõiste „Fc piirkond“ IgG raske ahela C-otsa piirkonda.
Kuigi IgG raske ahela Fc piirkonna piirid võivad kergelt erineda, on inimese IgG 15
raske ahela Fc piirkond tavaliselt määratletud ulatuma positsioonil Cys226 olevast
aminohappejäägist karboksüül-otsani.
Siin kasutatuna on fraas „piirkond, mis on samaväärne immunoglobuliini Fc
piirkonnaga“ mõeldud hõlmama nii immunoglobuliini Fc piirkonna looduslikult
esinevaid alleelseid variante kui ka variante, millel esinevad asendusi, liitmisi või 20
deletsioone tootvad muudatused, mis ei vähenda samas põhimõtteliselt
immunoglobuliini võimet efektori funktsioone vahendada (näiteks antikehast sõltuv
rakuline tsütotoksilisus). Näiteks võib immunoglobuliini Fc piirkonna N-otsast või
C-otsast kustutada ühe või rohkema aminohappe ilma, et bioloogiline funktsioon
põhimõtteliselt kaoks. Sellised variandid võib valida vastavalt üldistele praktikas 25
teada olevatele reeglitele nii, et neil oleks minimaalne mõju aktiivsusele. (Vaadake
näiteks Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990).
Siin kasutatuna viitab fraas „antigeeni siduv molekul“ oma laiemais ulatuses
molekulile, mis seob spetsiifiliselt antigeenset determinanti. Täpsemalt, „antigeeni
siduv molekul, mis seob CD20" on molekul, mis seondub spetsiifiliselt rakupinna 30
EE - EP1692182 B1 25
glükosüülimata fosfovalguga (35 000 daltonit), mis on tavaliselt tähistatud kui
inimese B lümfotsüüdi diferentseerumist keelav antigeen Bp35 ehk CD20.
„Spetsiifilise sidumise“ all mõeldakse, et sidumine on antigeeni jaoks selektiivne ja
selle saab soovimatutest või mittespetsiifilistest vastastiktoimetest eristada.
Siin kasutatuna tähistavad mõisted „fusioon“ ja „kimäärne“, kasutatuna viitena 5
polüpeptiididele nagu ABM, polüpeptiide, mis sisaldavad kahest või rohkemast
heteroloogsest polüpeptiidist (näiteks erinevate liikide antikehade osad)
deriveeritud aminohappejärjestusi. Kimäärsete ABM jaoks võivad antigeeni
mittesiduvad komponendid olla deriveeritud suurest hulgast erinevatest liikidest,
k.a primaadid nagu šimpansid ja inimesed. Kimäärse ABM konstantne piirkond on 10
kõige eelistatumalt üldiselt identne looduslikult esineva inimese antikeha
konstantse piirkonnaga; kimäärse antikeha varieeruv piirkond on kõige
eelistatumalt üldiselt identne rekombinantse anti-CD20 antikeha, millel on hiire B-
Ly1 varieeruva piirkonna aminohappejärjestus, vastava piirkonnaga. Fusioon- või
kimäärse antikeha eriti eelistatud vormiks on inimese jaoks kohandatud antikehad. 15
Siin kasutatuna viitab fraas "GnTIII aktiivsust omav polüpeptiid“ polüpeptiididele,
mis on võimelised katalüseerima N-atsetüülglükoosamiini (GlcNAc) jäägi β-1-4
ahelduses lisamist N-aheldatud oligosahhariidide trimannosüültuuma β-aheldatud
mannosiidile. See hõlmab fusioonpolüpeptiide, mille poolt avaldatud ensümaatiline
aktiivsus on sarnane, kuid mitte ilmtingimata identne, β(1,4)-N-20
atsetüülglükoosaminüültransferaasile III, mis on samuti teada kui β-1,4-
mannosüülglükovalgu 4-beeta-N-atsetüülglükoosaminüül-transferaas ((EC
2.4.1.144) vastavalt asutuse Nomenclature Committee of the International Union
of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) nomenklatuurile), mõõdetuna
konkreetses bioloogilises analüüsis koos või ilma doosist sõltuvuseta. Juhul kui 25
eksisteerib doosist sõltuvus, ei pea see olema identne GnTIII, vaid pigem üldiselt
sarnane esitatud aktiivsuse doosist sõltuvusele võrreldes GnTIII (s.t, et
potentsiaalne polüpeptiidi kandidaat avaldab suuremat aktiivsust või mitte rohkem
kui umbes 25 korda väiksemat ja eelistatult mitte rohkem kui umbes 10 korda
väiksemat ja kõige eelistatumalt mitte rohkem kui umbes kolm korda väiksemat 30
aktiivsust kui GnTIII).
EE - EP1692182 B1 26
Siin kasutatuna viitab mõiste „variant (või analoog)“ polüpeptiidile, mis erineb
leiutise konkreetselt sõnastatud polüpeptiidist aminohappe insertsioonide,
deletsioonide ja asenduste tõttu ja nimetatud muutused on loodud, kasutades
näiteks rekombinantse DNA tehnikaid. Käesoleva leiutise ABM variandid
hõlmavad kimäärseid, primaatide jaoks kohandatud või inimese jaoks kohandatud 5
antigeeni siduvaid molekule, kus üks või rohkema aminohappejääkidest on
modifitseeritud läbi asenduse, lisamise ja/või deletsiooni viisil, et see ei mõjuta
oluliselt antigeeni (nagu CD20) sidumisafiinsust. Määramisel, millised
aminohappejäägid võib asendada, lisada või kustutada ilma huvi pakkuvaid
aktiivsusi kõrvaldamata, võib juhinduda andmetest, mis saadakse konkreetse 10
polüpeptiidi järjestuse võrdlemisel homoloogsete peptiidide järjestustega ja
minimeerides suure homoloogiaga piirkondades (konserveeritud piirkonnad)
sooritatud aminohappejärjestuste muutuste arvu või asendades aminohapped
konsensusjärjestusega.
Alternatiivina võib neid samu või sarnaseid polüpeptiide kodeerivad 15
rekombinantsed variandid sünteesida või valida, kasutades ära geneetilise koodi
„liigsust“. Et optimeerida kloonimist plasmiidi või viiruse vektorisse või
ekspressiooni konkreetses prokarüootses või eukarüootses süsteemis, võib
sisestada erinevaid koodoni asendusi, näiteks erinevaid restriktsioonisaite
tekitavad vaiksed muutused. Polünukleotiidi järjestuses toimuvad mutatsioonid 20
võivad peegelduda polüpeptiidis või polüpeptiidile lisatud muude peptiidide
domeenides, mis lisatakse polüpeptiidi mistahes osa omaduste
modifitseerimiseks, muutes seeläbi omadusi nagu ligandiga seondumise afiinsus,
ahelasisesed afiinsused või degradatsiooni/pöördumise tase.
Eelistatult luuakse aminohappe „asendused“, asendades ühe aminohappe teise 25
aminohappega, millel on sarnased struktuursed ja/või keemilised omadused (s.t
konservatiivsed aminohappe asendused). „Konservatiivsed“ aminohappe
asendused võib sooritada, tuginedes sarnasusele polaarsuses, laengus,
lahustuvuses, hüdrofoobsuses, hüdrofiilsuses ja/või kaasatud jääkide amfipaatsel
loomusel. Näiteks mittepolaarseteks (hüdrofoobseteks) aminohapeteks on alaniin, 30
leutsiin, isoleutsiin, valiin, proliin, fenüülalaniin, trüptofaan ja metioniin;
polaarseteks neutraalseteks aminohapeteks on glütsiin, seriin, treoniin, tsüsteiin,
EE - EP1692182 B1 27
türosiin, asparagiin ja glutamiin; positiivse laenguga (aluselisteks) aminohapeteks
on arginiin, lüsiin ja histidiin; ja negatiivse laenguga (happelisteks) aminohapeteks
on asparagiinhape ja glutaamhape. „Insertsioonid“ või „deletsioonid“ jäävad
eelistatult vahemikku umbes 1 kuni 20 aminohapet ja eelistatumalt 1 kuni 10
aminohapet. Lubatud variatsiooni võib määrata katsete abil, sooritades 5
rekombinantse DNA tehnikate abil süstemaatiliselt polüpeptiidi molekulis
aminohapete insertsioone, deletsioone või asendusi ning analüüsides
moodustunud rekombinantsete variantide aktiivsust.
Siin kasutatuna viitab mõiste „inimese jaoks kohandatud“ antigeeni siduvale
molekulile, mis on deriveeritud inimeselt mittepärinevast antigeeni siduvast 10
molekulist nagu hiire antikeha ja mis säilitab või säilitab üldiselt lähtemolekuli
antigeeni siduvad omadused, kuid ei ole inimestele nii immunogeenne. Selle
kohandamise võib sooritada erinevate meetoditega, k.a (a) kogu inimeselt
mittepärineva domeeni siirdamine inimese konstantsetele piirkondadele, luues
seeläbi kimäärsed antikehad; (b) ainult inimeselt mittepärinevate CDR siirdamine 15
inimese raamile ja konstantsetele piirkondadele koos või ilma kriitiliste raami
jääkide säilitamiseta (näiteks jäägid, mis on olulised hea antigeeni sidumise
afiinsuse või antikeha funktsioonide säilitamiseks); või (c) kogu inimeselt
mittepärineva domeeni siirdamine, kuid „varjates“ selle läbi pinnajääkide
asendamise inimesesarnase sektsiooniga. Sellised meetodid on avaldatud 20
järgnevates allikates - Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-
6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al.,
Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991);
Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994). Antikeha igas raske ja kerge ahela
varieeruvas domeenis on üldiselt 3 komplementaarsust määravat piirkonda ehk 25
CDR (CDR1, CDR2 ja CDR3), mis külgnevad igas antikeha raske ja kerge ahela
varieeruvas domeenis nelja raami alampiirkonnaga (s.t FR1, FR2, FR3 ja FR4).
Näiteks FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Arutelu inimese jaoks
kohandatud antikehade üle on toodud inter alia USA patendis nr. 6 632 927 ja
publitseeritud USA patenditaotluses nr. 2003/0175269. 30
Siin kasutatuna viitab mõiste „primaatide jaoks kohandatud“ antigeeni siduvale
molekulile, mis on deriveeritud primaadilt mittepärinevast antigeeni siduvast
EE - EP1692182 B1 28
molekulist nagu hiire antikeha ja mis säilitab või säilitab üldiselt lähtemolekuli
antigeeni siduvad omadused, kuid ei ole primaatidele nii immunogeenne.
Juhul, kui mõiste jaoks eksisteerib kaks või rohkem praktikas kasutatavat ja/või
aktsepteeritavat definitsiooni, on siin kasutatud mõiste definitsioon mõeldud
hõlmama juhul, kui ei ole väidetud vastupidist, kõiki selliseid tähendusi. 5
Konkreetseks näiteks on mõiste „komplementaarsust määrav piirkond“ („CDR“)
kasutamine nii raske kui ka kerge ahela polüpeptiidi varieeruvas piirkonnas
leiduvate piirnematute antigeeni kombineerivate saitide kirjeldamiseks. Seda
konkreetset piirkonda on kirjeldanud Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human
Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) ja Chothia et 10
al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), kus definitsioonid hõlmavad võrdlemisel
kattumist või aminohappejääkide alamkomplekte. Kuid hoolimata sellest jäävad
mõlemad definitsioonid antikeha või selle variantide CDR defineerimisel siin
defineeritud ja kasutatud mõiste piiridesse. Järgnevas tabelis I on võrdluseks
toodud sobivad aminohappejäägid, mis hõlmavad eelnevalt tsiteeritud viidetes 15
defineeritud CDR. Konkreetset CDR hõlmavate täpsete jääkide numbrid erinevad
sõltuvalt CDR järjestusest ja suurusest. Valdkonnas kogenud isikud on võimelised
antikeha varieeruva piirkonna aminohappejärjestuse abil hõlpsasti määrama,
millised jäägid konkreetset CDR sisaldavad.
TABEL 1. CDR definitsioonid1 20
Kabat Chothia AbM
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96 1Kõikide CDR definitsioonide nummerdus tabelis 1 vastab Kabat et al. poolt
kehtestatud nummerdusreeglitele. (vaadake allpool).
EE - EP1692182 B1 29
Kabat et al. defineerisid samuti nummerdussüsteemi varieeruva domeeni
järjestustele, mis on rakendatav mistahes antikeha jaoks. Valdkonnas kogenud
isik suudab seda „Kabat nummerduse“ süsteemi üheselt mistahes varieeruva
domeeni järjestusega rakendada, tuginemata selleks muudele katseandmetele kui
järjestusele endale. Siin kasutatuna viitab „Kabat nummerdus“ 5
nummerdussüsteemile, mida on kirjeldatud Kabat et al., poolt teoses U.S. Dept. of
Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"
(1983). Juhul kui ei ole teisiti välja toodud, on konkreetsete aminohappejärjestuste
positsioonide nummerdus ABM toodud vastavalt Kabat nummerdussüsteemile.
Järjestused järjestuste loendis (s.t SEQ ID NO: 1 kuni SEQ ID NO: 78) ei ole 10
nummerdatud vastavalt Kabat nummerdussüsteemile.
Nukleiinhappe või polünukleotiidi, mille nukleotiidjärjestus on vähemalt näiteks
95% ulatuses "identne" käesoleva leiutise viitenukleotiidjärjestusega, all on
mõeldud, et polünukleotiidi nukleotiidjärjestus on identne viitejärjestusega v.a see,
et polünukleotiidi järjestus võib sisaldada iga 100 viitenukleotiidjärjestuse 15
nukleotiidi kohta kuni viis punktmutatsiooni. Teiste sõnadega, polünukleotiidi
valmistamiseks, mille nukleotiidjärjestus on vähemalt 95% ulatuses identne
viitenukleotiidjärjestusega, võib kuni 5% viitejärjestuse nukleotiididest kustutada
või muu nukleotiidiga asendada või võib viitejärjestusse sisestada teatud hulga
nukleotiide, mis moodustab kuni 5% viitejärjestuse kogunukleotiididest. 20
Kõnealuseks järjestuseks võib olla kogu joonisel FIG. 24 või FIG. 25 näidatud
järjestus.
Selle, kas mingi konkreetne nukleiinhappe molekul või polüpeptiid on vähemalt
80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% või 99% ulatuses identne käesoleva
leiutise nukleotiidjärjestuse või polüpeptiidjärjestusega, saab määrata teada 25
olevaid arvutiprogramme kasutades. Eelistatud meetodiks parima üldise sobivuse
määramiseks päringjärjestuse (käesoleva leiutise järjestus) ja märklaudjärjestuse
vahel (nimetatud ka globaalseks järjestuste reastamiseks) on arvutiprogrammi
FASTDB kasutamine, mis põhineb Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245
(1990) algoritmil. Järjestuse reastamisel on päring- ja märklaudjärjestus mõlemad 30
DNA järjestused. RNA järjestust saab võrrelda, muundades U-d T-deks.
Nimetatud globaalse järjestuse reastamise tulemuseks on identsusprotsent.
EE - EP1692182 B1 30
Eelistatud parameetriteks identsusprotsendi arvutamiseks DNA järjestuste
FASTDB reastustes on: maatriks = ühtne, k-tuple = 4, puuduva kokkulangevuse
miinus = 1, ühinemismiinus = 30, randomiseerimisrühma pikkus = 0,
tükeldamisskoor = 1, vahe miinus = 5, vahe suuruse miinus = 0,05, akna suurus =
500 või märklaud-nukleotiidjärjestuse pikkus (kasutatakse lühemat). 5
Kui märklaudjärjestus on päringjärjestusest lühem 5´ või 3´ deletsioonide, mitte
sisemiste deletsioonide tõttu, tuleb tulemusi käsitsi korrigeerida. See on tingitud
asjaolust, et FASTDB programm ei arvesta identsusprotsendi arvutamisel
märklaudjärjestuse 5´ ja 3´ lühendusi. 5´ või 3´ otsas lühendatud (päringjärjestuse
suhtes) märklaudjärjestuste korral parandatakse identsusprotsenti, arvutades 10
päringjärjestuse aluste arvu, mis on märklaudjärjestuse 5´ ja 3´ ning mis ei ole
ühildunud/reastatud, kui kogu aluste protsendi päringjärjestuses. Selle, kas
nukleotiid on ühilduv/reastatud, saab määrata FASTDB järjestuse reastamise
tulemuste alusel. See protsent lahutatakse seejärel eelnevalt mainitud FASTDB
programmiga täpsustatud parameetreid kasutades arvutatud identsusprotsendist, 15
saades seeläbi lõpliku identsusprotsendi. Seda korrigeeritud tulemust kasutatakse
käesoleva leiutise eesmärkidel. Identsusprotsendi käsitsi korrigeerimisel
arvutatakse ainult alused, mis on väljapool märklaudjärjestuse 5´ ja 3´ aluseid,
kuvatuna FASTDB järjestuses kui päringjärjestusega mitte ühilduvad/reastatud.
Näiteks reastatakse identsusprotsendi määramiseks 90 alusega märklaudjärjestus 20
100 alusega päringjärjestuse suhtes. Deletsioon toimub märklaudjärjestuse 5´
otsas ja seega ei näita FASTDB reastus 5´ otsa esimese 10 aluse
sobivust/reastust. 10 paaritut alust kujutavad 10% järjestusest (aluste arv 5´ ja 3´
otstes, mis ei ühildu/päringjärjestuse aluste koguarv), seega lahutatakse 10%
FASTDB programmi poolt arvutatud identsusprotsendist. Kui ülejäänud 90 alust 25
ühtiks ideaalselt, oleks lõplikuks identsusprotsendiks 90%. Ühes muus näites
võrreldakse samuti 90 alusega märklaudjärjestust 100 alusega päringjärjestusega.
Sellel korral on deletsioonideks sisemised deletsioonid, seega alused, mis ei ole
päringjärjestusega ühtivad/reastatud, ei asu 5´ ja 3´ otstes. Käesoleval juhul
FASTDB abil arvutatud identsusprotsendi käsitsi ei korrigeerita. Ka sellel korral 30
korrigeeritakse käsitsi ainult märklaudjärjestuse 5´ ja 3´ aluseid, mis ei ole
EE - EP1692182 B1 31
päringjärjestusega sobivad/reastatud. Käesoleva leiutise eesmärkidel täiendavaid
käsitsi parandamisi ei sooritata.
Polüpeptiidi, mille aminohappejärjestus on vähemalt näiteks 95% ulatuses
„identne“ käesoleva leiutise päring-aminohappejärjestusega, all mõeldakse, et
märklaud-polüpeptiidi aminohappejärjestus on identne päringjärjestusega, v.a see, 5
et märklaud-polüpeptiidjärjestus võib sisaldada kuni viit aminohappe muutust
päring-aminohappejärjestuse iga 100 aminohappe kohta. Teiste sõnadega,
polüpeptiidi, mille aminohappejärjestus on vähemalt 95% ulatuses identne päring-
aminohappejärjestusega, valmistamiseks võib kuni 5% märklaudjärjestuse
aminohappejääkidest sisestada, kustutada või muu aminohappega asendada. 10
Need viitejärjestuse muutused võivad toimuda viiteaminohappejärjestuse amino-
või karboksüotsade positsioonidel või mistahes punktis nende kahe otsa vahel,
vaheldudes kas individuaalselt viitejärjestuse jääkide hulgas või ühes või
rohkemas viitejärjestusega külgnevas rühmas.
Selle, kas mingi konkreetne polüpeptiid on vähemalt 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 15
97%, 98% või 99% ulatuses viitepolüpeptiidiga identne, saab määrata teada
olevaid arvutiprogramme kasutades. Eelistatud meetodiks parima üldise sobivuse
määramiseks päringjärjestuse (käesoleva leiutise järjestus) ja märklaudjärjestuse
vahel (nimetatud ka globaalseks järjestuste reastamiseks), on arvutiprogrammi
FASTDB kasutamine, mis põhineb Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 20
(1990) algoritmil. Järjestuse reastamisel on päring- ja märklaudjärjestus mõlemad
nukleotiidjärjestused või aminohappejärjestused. Nimetatud globaalse järjestuste
reastamise tulemuseks on identsusprotsent. FASTDB aminohappe reastamise
eelistatud parameetriteks on: maatriks = PAM 0, k-tuple = 2, puuduva
kokkulangevuse miinus = 1, ühinemismiinus = 20, randomiseerimisrühma pikkus = 25
0, tükeldamisskoor = 1, akna suurus = järjestuse pikkus, vahe miinus = 5, vahe
suuruse miinus = 0,05, akna suurus = 500 või märklaud-nukleotiidjärjestuse pikkus
(kasutatakse lühemat).
Kui märklaudjärjestus on päringjärjestusest lühem N- või C-otsa deletsioonide,
mitte sisemiste deletsioonide tõttu, tuleb tulemusi käsitsi parandada. See on 30
tingitud asjaolust, et FASTDB programm ei arvesta üldise identsusprotsendi
arvutamisel märklaudjärjestuse N- ja C-otsa lühendusi. N- ja C-otsas lühendatud
EE - EP1692182 B1 32
(päringjärjestuse suhtes) märklaudjärjestuste korral parandatakse
identsusprotsenti, arvutades päringjärjestuse aluste arvu, mis on
märklaudjärjestuse N- ja C-otsas ning mis ei ole vastava märklaudjäägiga
ühildunud/reastatud, kui kogu aluste protsendi kõnealuses järjestuses. Selle, kas
jääk on ühilduv/reastatud, saab määrata FASTDB järjestuste reastamise 5
tulemuste alusel. See protsent lahutatakse seejärel eelnevalt mainitud FASTDB
programmiga täpsustatud parameetreid kasutades arvutatud identsusprotsendist,
saades seeläbi lõpliku identsusprotsendi. Seda lõplikku identsusprotsenti
kasutatakse käesoleva leiutise eesmärkidel. Identsusprotsendi käsitsi
parandamisel arvestatakse ainult jääkidega, mis seonduvad märklaudjärjestuse N- 10
ja C-otsaga ja ei sobi/reastu päringjärjestusega. See tähendab, et kasutatakse
ainult päringjäägi positsioone, mis jäävad väljapoole märklaudjärjestuse
kaugeimaid N- ja C-otsa jääke.
Näiteks reastatakse identsusprotsendi määramiseks 90 aminohappejäägiga
märklaudjärjestus 100 jäägiga päringjärjestusega. Deletsioon toimub 15
märklaudjärjestuse N-otsas ja seega ei näita FASTDB reastamine N-otsa esimese
10 jäägi sobivust/reastust. 10 paaritut jääki kujutavad 10% järjestusest (jääkide arv
N- ja C-otstes, mis ei ühildu/päringjärjestuse jääkide koguarv) nii, et 10%
lahutatakse FASTDB programmi poolt arvutatud identsusprotsendist. Kui
ülejäänud 90 jääki ühtiks ideaalselt, oleks lõplikuks identsusprotsendiks 90%. 20
Ühes muus näites võrreldakse 90 jäägiga märklaudjärjestust 100 jäägiga
päringjärjestusega. Sellel korral on deletsioonideks sisemised deletsioonid nii, et
jäägid, mis ei ole päringjärjestusega ühtiv/reastatud, ei asu N- ja C-otstes.
Käesoleval juhul FASTDB abil arvutatud identsusprotsendi käsitsi ei korrigeerita.
Ka sellel korral parandatakse käsitsi ainult FASTDB reastamise poolt kuvatud 25
märklaudjärjestuse N- ja C-otstest väljapool olevaid jäägipositsioone, mis ei
sobi/reastu päringjärjestusega. Käesoleva leiutise eesmärkidel täiendavat käsitsi
parandamist ei sooritata.
Siin kasutatuna viitab nukleiinhape, mis „hübidiseerub rangetel tingimustel“ leiutise
nukleiinhappejärjestuseks, polünukleotiidile, mis hübridiseerub öö läbi kestval 30
inkubeerimisel temperatuuril 42 oC lahuses, mis sisaldab 50% formamiidi, 5 x SSC
(750 mM NaCl, 75 mM naatriumtsitraati), 50 mM naatriumfosfaati (pH 7,6), 5 x
EE - EP1692182 B1 33
Denhardti lahust, 10% dekstraansulfaati ja 20 mg/ml kohta denatureeritud nihkega
lõhe sperma DNA, ja sellele järgneva filtrite pesemisega 0,1 x SSC temperatuuril
umbes 65 oC.
Siin kasutatuna viitab mõiste „Golgi lokalisatsiooni domeen“ Golgi resistentse
polüpeptiidi aminohappejärjestusele, mis põhjustab polüpeptiidi ankurdamise Golgi 5
kompleksis. Tavaliselt sisaldavad lokalisatsiooni domeenid ensüümi aminootsa
„sabasid“.
Siin kasutatuna viitab mõiste „efektori funktsioon“ neile bioloogilistele aktiivsustele,
mis on omistatavad antikeha Fc piirkonnale (loodusliku järjestuse Fc piirkond või
aminohappejärjestuse variandi Fc piirkond). Antikeha efektori funktsioonide näited 10
hõlmavad, olemata samas nendega piiratud, Fc retseptori sidumisafiinsust,
antikehast sõltuvat rakulist tsütotoksilisust (ADCC), antikehast sõltuvat rakulist
fagotsütoosi (ADCP), tsütokiini eritumist, immuunkompleksi vahendatud
antigeenide omastamist antigeene kujutavate rakkude poolt, rakupinna retseptorite
mahareguleerimist jne. 15
Siin kasutatuna viitavad mõisted „muundama“, “muundatud“, „muundamine“ ja
glükomuundatud“ looduslikult esineva või rekombinantse polüpeptiidi või selle
fragmendi glükosüülimismustri mistahes manipuleerimisele. Glükomuundamine
hõlmab raku glükosüülimissüsteemi metaboolset muundamist, k.a oligosahhariidi
sünteesiradade geneetilised manipulatsioonid, et võimaldada rakkudes avaldatud 20
glükovalkude muudetud glükosüülimisprofiili. Lisaks hõlmab glükomuundamine
mutatsioonide ja rakukeskkonna toimeid glükosüülimisel.
Siin kasutatuna hõlmab mõiste "peremeerakk" mistahes rakusüsteemi, mida saab
käesoleva leiutise polüpeptiidide ja antigeeni siduvate molekulide valmistamiseks
muundada. Ühes teostuses muundatakse peremeesrakku modifitseeritud 25
glükovormidega antigeeni siduva molekuli tootmise võimaldamiseks. Ühes
eelistatud teostuses on antigeeni siduvaks molekuliks antikeha, antikeha fragment
või fusioonvalk. Teatud teostustes on peremeerakke manipuleeritud täiendavalt
ühe või rohkema GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi kõrgematel tasemetel
avaldamiseks. Peremeesrakkudeks võivad olla kultuuristatud rakud, näiteks 30
imetaja kultuuristatud rakud, P3X63 hiire müeloomi rakud, PER rakud, PER.C6
EE - EP1692182 B1 34
rakud või hübridoomrakud, pärmirakud, putukarakud ja taimerakud ning samuti
transgeensete loomade, transgeensete taimede või kultuurtaimede või loomade
kudede rakud.
Siin kasutatuna tähistab mõiste „Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus“ antikehast
sõltuvat rakulist tsütotoksilisust ja inimese Fc piirkonda sisaldava lahustuva Fc 5
fusioonvalgu poolt vahendatud rakulist tsütotoksilisust. See on
immuunsusmehhanism, mis viib „antikehade märklaud-rakkude“ lahustumiseni
„inimese immuunefektorrrakkude“ poolt, kus:
„inimese immuunefektorrakkudeks“ on leukotsüütide populatsioon, mis avaldab
oma pinna Fc retseptoreid, läbi mille need antikehade või Fc fusioonvalkude Fc 10
piirkonnaga seonduvad ja efektori funktsioone sooritavad. Selline populatsioon
võib hõlmata, olemata samas nendega piiratud, perifeerse vere mononukleaarseid
rakke (PBMC) ja/või looduslikke tappurrakke (NK).
„Antikehade märklaud-rakkudeks" on rakud, mida seotakse antikehade või Fc
fusioonvalkude poolt. Antikehad või Fc fusioonvalgud seonduvad märklaud-15
rakkude Fc piirkonnaga läbi valgu N-otsa.
Siin kasutatuna viitab mõiste „suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus“
kas "antikeha märklaud-rakkude", mis teatud aja jooksul teatud antikeha või Fc
fusioonvalgu kontsentratsioonil märklaud-rakke ümbritsevas keskkonnas eelnevalt
kirjeldatud Fc vahendatud rakulise tsütotoksilisuse mehhanismiga lahustatakse, 20
arvu suurenemisele ja/või antikeha või Fc fusioonvalgu kontsentratsiooni
vähenemisele märklaudrakke ümbritsevas keskkonnas, mis on vajalik teatud arvu
"antikeha märklaud-rakkude" lahustamiseks teatud aja jooksul Fc vahendatud
rakulise tsütotoksilisuse mehhanismi abil. Fc vahendatud rakulise tsütotoksilisuse
suurenemine sõltub sama antikeha või Fc fusioonvalgu poolt vahendatud 25
rakulisest tsütotoksilisusest, mis toodetakse sama tüüpi peremeerakkude poolt
samade standardsete valdkonnas kogenud isikutele teada olevate tootmis-,
puhastamis-, moodustamis- ja hoiustamismeetoditega, kuid mis ei ole tekitatud
peremeesrakkude poolt, mida on muundatud siin kirjeldatud meetoditega
glükosüültransferaas GnTIII avaldamiseks. 30
EE - EP1692182 B1 35
„Antikeha, millel on suurenenud antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus (ADCC)“
all mõeldakse siin defineeritud antikeha, mille ADCC on suurenenud; ADCC
suurenemine määratakse mistahes sobiva valdkonnas tavapäraseid oskusi
omavale isikule teada oleva meetodiga. Üks aktsepteeritud in vitro ADCC analüüs
toimub järgneval viisil: 5
1) analüüsis kasutatakse märklaud-rakke, mis teatakse avaldavat märklaud-
antigeeni, mis omakorda on tuvastatav antikeha antigeeni siduva piirkonna poolt;
2) analüüsis kasutatakse efektorrakkudena inimese perifeerse vere
mononukleaarseid rakke (PBMC), mis on eraldatud suvaliselt valitud terve doonori
verest; 10
3) analüüs sooritatakse vastavalt järgnevale protokollile:
i) PBMC eraldatakse standardtihedusega tsentrifuugimisprotseduuridega ja
suspendeeritakse tasemel 5 x 106 rakku/ml kohta RPMI rakukultuuri söötmes;
ii) märklaud-rakke kasvatatakse standardsete koekultuuri meetoditega, kogutakse
eksponentsiaalses kasvufaasis kus elujõud on suurem kui 90%, pestakse RPMI 15
rakukultuuri söötmega, märgistatakse 100 mikrokürii 51Cr, pestakse kaks korda
rakukultuuri söötmega ja suspendeeritakse uuesti rakukultuuri söötmes
tihedusega 105 rakku/ml kohta;
iii) 96-reservuaariga mikrotiitrimisplaadi igasse reservuaari viiakse 100 mikroliitrit
eelnevalt kirjeldatud lõplikku märklaud-raku suspensiooni; 20
iv) antikeha lahjendatakse rakukultuuri söötmes seeriaviisiliselt 4000 ng/ml juurest
0,04 ng/ml juurde ja saadud antikehalahused lisatakse 96-reservuaariga
mikrotiitrimisplaadis olevatele märklaud-rakkudele, testides erinevaid antikeha
kontsentratsioone, mis katavad kogu eelnevalt toodud kontsentratsiooni-
vahemikku, kolmes korduses; 25
v) maksimaalse vabanemise (MR) kontrollvariantideks lisatakse plaadi, mis
sisaldab märgistatud märklaud-rakke, 3 täiendavasse reservuaari antikeha lahuse
asemel (eelnev punkt iv) 50 mikroliitrit 2% (V/V) mitteioonse pesuaine (Nonidet,
Sigma, St. Louis) vesilahust;
vi) spontaanse vabanemise (SR) kontrollvariantideks lisatakse plaadi, mis sisaldab 30
märgistatud märklaud-rakke, 3 täiendavasse reservuaari antikeha lahuse asemel
(eelnev punkt iv) 50 mikroliitrit RPMI rakukultuuri söödet;
EE - EP1692182 B1 36
vii) 96-reservuaariga mikrotiitrimisplaati tsentrifuugitakse seejärel 1 minut kiirusel
50 x g ja inkubeeritakse 1 tund temperatuuril 4 oC;
viii) igale reservuaarile lisatakse 50 mikroliitrit PBMC suspensiooni (eelnev punkt
i), saades seeläbi efektori:märklaud-raku suhteks 25:1; plaadid viiakse 4 tunniks
temperatuuril 37 oC inkubaatorisse, kus valitseb 5% CO2 atmosfäär; 5
ix) iga reservuaari rakuvaba ülemine vedelikukiht kogutakse ja eksperimentaalne
vabanenud radioaktiivsus (ER) määratakse gammaloenduriga;
x) iga antikeha kontsentratsiooni spetsiifilise lahustuse protsent arvutatakse
valemiga (ERMR)/(MR-SR) x 100, kus ER on keskmine mõõdetud radioaktiivsus
(punkt ix), MR on keskmine mõõdetud radioaktiivsus (punkt ix) MR 10
kontrollvariantidele (punkt v) ja SR on keskmine mõõdetud radioaktiivsus (punkt ix)
SR kontrollvariantidele (punkt vi);
4) „suurenenud ADCC“ on defineeritud kui eelnevalt testitud antikeha
kontsentratsioonivahemikus vaadeldud spetsiifilise lahustuse maksimaalne
protsent ja/või antikeha kontsentratsiooni vähenemine, mis on vajalik poole 15
eelnevalt testitud antikeha kontsentratsioonivahemikus vaadeldud spetsiifilise
lahustuse maksimaalse protsendi saavutamiseks. ADCC suurenemine on seotud
eelnevalt kirjeldatud analüüsiga mõõdetud ADCC, vahendatuna sama antikehaga,
toodetuna sama tüüpi peremeesrakkudega ning kasutades samasid valdkonnas
kogenud isikutele teada olevaid standardseid tootmis-, puhastamis-, 20
moodustamis- ja hoiustamismeetodeid; samas ei ole nimetatud ADCC tekitatud
peremeesrakkude poolt, mida on muundatud GnTIII üleavaldamiseks.
Ühes teostuses seondub käesolev leiutis antigeeni siduvate molekulidega, millel
on hiire B-Ly1 antikeha sidumisspetsiifilisus ja avastusega, et nende efektori
funktsioone saab parandada läbi muudetud glükosüülimise. Ühes teostuses on 25
antigeeni siduvaks molekuliks kimäärne antikeha. Üks eelistatud teostus seondub
kimäärse antikeha või selle fragmendiga, mis sisaldab joonisel Fig 7 näidatud
CDR. Täpsemalt, ühes eelistatud teostuses seondub leiutis eraldatud
polünukleotiidiga, mis sisaldab: (a) järjestust, mis on valitud rühmast, kuhu
kuuluvad: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ja SEQ ID NO. 7 (CDR VH-1); ja (b) 30
järjestust, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22
ja SEQ ID NO: 23 (CDR VH-2); ning SEQ ID NO: 24. Veel üks eelistatud teostus
EE - EP1692182 B1 37
seondub eraldatud polünukleotiidiga, mis sisaldab SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ja
SEQ ID NO: 10 (CDR VL). Ühes teostuses kodeerib vähemalt üks nendest
polünukleotiididest fusioonpolüpeptiidi.
Ühes muus teostuses sisaldab antigeeni siduv molekul joonisel Fig 1 näidatud
hiire B-Ly1 antikeha või selle variandi VH domeeni; ja hiirelt mittepärinevat 5
polüpeptiidi. Ühes muus eelistatud teostuses sisaldab antigeeni siduv molekul
joonisel Fig 2 näidatud hiire B-Ly1 antikeha või selle variandi VL domeeni; ja hiirelt
mittepärinevat polüpeptiidi.
Ühes muus teostuses koosnevad antigeeni siduvad molekulid ühest või rohkemast
B-Ly1 lühendatud CDR. Sellised lühendatud CDR sisaldavad minimaalselt antud 10
CDR spetsiifilisust määravaid aminohappejääke. "Spetsiifilisust määrav jääk“
tähistab neid jääke, mis on otseselt antigeeni vastastikmõjuga seotud. Üldiselt
osalevad ainult umbes 1/5 kuni 1/3 antud CDR olevatest jääkidest antigeeniga
seondumisel. Konkreetse CDR spetsiifilisust määravad jäägid saab näiteks
tuvastada, arvutades kolmemõõtmelise mudeli abil aatomitevahelised kontaktid ja 15
määrates antud jäägi positsioonil järjestuste varieeruvuse, kasutades selleks
meetodeid, mida on kirjeldanud Padlan et al., FASEB J 9(1):133-139 (1995).
Seega avaldatakse eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab vähemalt ühte hiire B-
Ly1 antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat
piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust 20
määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke; nimetatud eraldatud
polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi. Eelistatult kodeerivad sellised
eraldatud polünukleotiidid fusioonpolüpeptiidi, milleks on antigeeni siduv molekul.
Ühes teostuses koosneb polünukleotiid kolmest hiire B-Ly1 antikeha või selle
variantide või lühendatud vormide komplementaarsust määravast piirkonnast, mis 25
sisaldavad vähemalt iga nimetatud kolme komplementaarsust määrava piirkonna
spetsiifilisust määravaid jääke. Ühes muus teostuses kodeerib polünukleotiid kogu
kimäärse (näiteks inimese jaoks kohandatud) antikeha kerge või raske ahela
varieeruvat piirkonda. Leiutis seondub täiendavalt selliseid polünukleotiide
kodeerivate polüpeptiididega. 30
EE - EP1692182 B1 38
Ühes muus teostuses sisaldab antigeeni siduv molekul vähemalt ühte hiire B-Ly1
antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat
piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust
määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke ja järjestust, mis on deriveeritud
heteroloogsest polüpeptiidist. Ühes teostuses koosneb antigeeni siduv molekul 5
kolmest hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide või lühendatud vormide
komplementaarsust määravast piirkonnast, mis sisaldavad vähemalt iga nimetatud
kolme komplementaarsust määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke. Ühes
muus teostuses koosneb antigeeni siduv molekul antikeha kerge või raske ahela
varieeruvast piirkonnast. Ühes eriti kasulikus teostuses on antigeeni siduvaks 10
molekuliks kimäärne (näiteks inimese jaoks kohandatud) antikeha. Samuti
avaldatakse meetodid selliste antigeeni siduvate molekulide valmistamiseks ja
nende kasutamiseks haiguste, k.a B raku lümfoomid, ravimisel.
On teada, et anti-CD20 terapeutilist toimet mõjutavad mitmed mehhanismid, k.a
antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus (ADCC), komplemendist sõltuv 15
tsütotoksilisus (CDC) ja kasvu peatumise või apoptoosi indutseerimine. Näiteks
enamus katseandmetest näitavad, et rituximab avaldab oma toimet läbi
tavapäraste efektormehhanismide (mõõdetuna CDC ja ADCC analüüsidega).
Samuti on demonstreeritud, et erinevate lümfoomirakkude resistentsus
rituximab´le in vivo on nende CDC tundlikkuse funktsioon in vitro. Samas ühe muu 20
terapeutiliseks kasutamiseks heaks kiidetud antikeha in vivo toimerežiim B1 ei
vaja ei komplementi ega loodusliku tappurraku (NK) aktiivsust. B1 efektiivsus in
vivo on pigem tingitud selle võimest potentsiaalset apoptoosi indutseerida.
Üldiselt jagunevad anti-CD20 monoklonaalsed antikehad nende lümfoomirakkude
eemaldamise toimemehhanismi alusel kahte erinevasse kategooriasse. I tüübi 25
anti-CD20 antikehad kasutavad märklaud-rakkude hävitamiseks peamiselt
komplemente, samas kui II tüübi antikehad toimivad erinevate mehhanismidega,
milleks on peamiselt apoptoos. Rituximab ja 1F5 on I tüübi anti-CD20 antikehade
näideteks, samas kui B1 on II tüübi antikeha. Vaadake näiteks Cragg, M.S. ja
Glennie, M.J., Blood 103(7): 2738-2743 (aprill, 2004); Teeling, J.L. et al., Blood 30
104(6):1793-1800 (september, 2004).
EE - EP1692182 B1 39
Käesolev leiutis on esimeseks teada olevaks juhuks, kus II tüübi anti-CD20
antikeha muundatakse suurenenud efektori funktsioonide nagu ADCC omamiseks,
säilitades samal ajal potentsiaalse apoptoosi võime. Seega on käesolev leiutis
suunatud muundatud II tüübi anti-CD20 antikehale, millel on nimetatud
muundamise tulemusel suurenenud ADCC ilma, et kaoks potentsiaalne apoptoosi 5
indutseerimise võime. Ühes teostuses on II tüübi anti-CD20 antikehasid
muundatud viisil, et neil oleks Fc piirkonnas muudetud glükosüülimismuster. Ühes
konkreetses teostuses koosneb muudetud glükosüülimine suurenenud poolitatud
kompleksi jääkide tasemest Fc piirkonnas. Ühes muus konkreetses teostuses
koosneb muudetud glükosüülimine vähenenud fukoosi jääkide tasemest Fc 10
piirkonnas. Vaadake USA patenditaotluse publikatsiooni nr. 2004/0093621,
(Shitara et al.). Ühes muus teostuses on II tüübi anti-CD20 antikehad läbinud
polüpeptiidi muundamise, mida on kirjeldatud USA patendis nr. 6 737 056 (Presta)
või USA patenditaotluse publikatsioonis nr. 2004 0185045 (Macrogenics) või USA
patenditaotluse publikatsioonis nr. 2004 0132101 (Xencor). Avaldatakse ka 15
meetodid selliste muundatud II tüübi antikehade valmistamiseks ja meetodid
selliste antikehade kasutamiseks erinevate B raku häirete, k.a B raku lümfoomid,
ravimiseks.
Kirjeldatud on ka kimäärseid hiire/inimese antikehasid. Vaadake näiteks Morrison,
S. L. et al., PNAS I1: 6851-6854 (november, 1984); Euroopa patendipublikatsioon 20
nr. 173494; Boulianna, G. L, at al., Nature 312:642 (detsember, 1984); Neubeiger,
M. S. et al., Nature 314:268 (märts, 1985); Euroopa patendipublikatsioon nr.
125023; Tan et al., J. Immunol. 135:8564 (november, 1985); Sun, L. K et al.,
Hybridoma 5(1):517 (1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986).
Vaadake Muron, Nature 312:597 (detsember, 1984); Dickson, Genetic 25
Engineering News 5(3) (märts, 1985); Marx, Science 229:455 (august, 1985); ja
Morrison, Science 229:1202-1207 (september, 1985). Robinson et al., kirjeldavad
PCT publikatsioonis nr. WO 88104936 kimäärset antikeha, mis koosneb inimese
konstantsest piirkonnast ja hiire varieeruvast piirkonnast ja millel on spetsiifilisus
CD20 epitoobi suhtes; Robinsoni kimäärse antikeha hiire osa on deriveeritud 2H7 30
hiire monoklonaalsest antikehast (gamma 2b, kappa). Kuigi antud patendis
mainitakse, et kirjeldatud kimäärne antikeha on "esmane kandidaat" B raku häirete
ravimiseks, võib seda väidet vaadelda kui pelgalt soovitust valdkonnas kogenud
EE - EP1692182 B1 40
isikutele määramiseks, kas nimetatud soovitus vastab antud konkreetse antikeha
puhul tõele ja seda eriti selle tõttu, et viiteallikas puuduvad andmed terapeutilise
efektiivsuse kinnitamiseks ja samuti kõrgema arengutasemega imetajate nagu
primaatide või inimeste kohta käivad andmed.
Valdkonnas on teada metoodikad kimäärsete antikehade valmistamiseks. Näiteks 5
võib kerged ja rasked ahelad avaldada eraldi, kasutades näiteks immunoglobuliini
kerget ahelat ja immunoglobuliini raskeid ahelaid eraldi plasmiidides või ühel
(näiteks paljutsistronilisel) vektoril. Need saab seejärel puhastada ja in vitro
terviklikeks antikehadeks kokku panna; metoodikaid sellise kokkupaneku
sooritamiseks on kirjeldatud. Vaadake näiteks Scharff, M., Harvey Lectures 69:125 10
(1974). Samuti on kirjeldatud in vitro reaktsiooniparameetreid IgG antikehade
valmistamiseks taandatud eraldatud kergetest ja rasketest ahelatest. Vaadake
näiteks Sears et al., Biochem. 16(9):2016-25 (1977).
Ühes eriti eelistatud teostuses on käesoleva leiutise kimäärseks ABM inimese
jaoks kohandatud antikeha. Meetodid inimeselt mittepärinevate antikehade 15
inimese jaoks kohandamiseks on valdkonnas teada. Näiteks võib käesoleva
leiutise inimese jaoks kohandatud ABM valmistada vastavalt meetoditele, mida on
kirjeldatud USA patendis nr. 5 225 539 (Winter), USA patendis nr. 6 180 370
(Queen et al.) või USA patendis nr. 6 632 927 (Adair et al.). Eelistatult on inimese
jaoks kohandatud antikehal üks või rohkem aminohappejääki, mis on pärinevad 20
allikast, kelleks ei ole inimene. Neid inimeselt mittepärinevaid aminohappejääke
nimetatakse sageli "olulisteks" jääkideks, mis võetakse tavaliselt "olulisest"
varieeruvast domeenist. Inimese jaoks kohandamise võib üldiselt läbi viia,
kasutades meetodeid, mida on kirjeldanud Winter ja tema kaastöötajad (Jones et
al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); 25
Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), asendades hüpervarieeruva
piirkonna järjestused inimese antikeha vastavate järjestustega. Seega on sellised
„inimese jaoks kohandatud antikehad“ kimäärsed antikehad (USA patent nr.
4 816 567), kus väike osa inimese varieeruvast domeenist on asendatud vastava
inimesest erineva liigi järjestusega. Praktikas on inimese jaoks kohandatud 30
antikehadeks tavaliselt inimese antikehad, kus mõned hüpervarieeruva piirkonna
jäägid ja võimalik, et ka mõned FR jäägid on asendatud näriliste antikehade
EE - EP1692182 B1 41
analoogsete saitidega. Kõnealused inimese jaoks kohandatud anti-CD20
antikehad koosnevad inimese immunoglobuliini konstantsetest piirkondadest.
Inimese jaoks kohandatud antikehade valmistamisel on antigeensuse
vähendamisel väga oluline inimese varieeruvate domeenide (nii kerged kui
rasked) valik. Vastavalt nn. „parima sobivuse“ meetodile võrreldakse närilise 5
antikeha varieeruva domeeni järjestust kogu teada olevate inimese varieeruva
domeeni järjestuste teegiga. Närilise järjestusele kõige sarnasemat inimese
järjestust kasutatakse seejärel inimese jaoks kohandatud antikeha inimese raami
piirkonnana (FR) (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol.
Biol., 196:901 (1987)). Veel üheks meetodiks inimese raami järjestuse valimiseks 10
on täieliku närilise raami iga individuaalse alampiirkonna järjestuse (s.t FR1, FR2,
FR3 ja FR4) või mõne individuaalse alamregiooni kombinatsiooni (näiteks FR1 ja
FR2) võrdlemine teada olevate inimese varieeruva piirkonna järjestuste, mis
sellele raami alampiirkonnale vastavad (määratuna näiteks Kabat´
nummerdusega), teegiga ja iga alampiirkonna või kombinatsiooni jaoks inimese 15
järjestuse, mis on närilise järjestusega kõige sarnasem, valimine (Leung, USA
patenditaotluse publikatsioon nr. 2003/0040606A1, publitseeritud 27. veebruaril,
2003). Veel ühes meetodis kasutatakse konkreetset raami piirkonda, mis on
deriveeritud kergete ja raskete ahelate mingi kindla alamrühma kõikide inimese
antikehade konsensusjärjestusest. Sama raami võib kasutada mitme erineva 20
inimese jaoks kohandatud antikeha jaoks (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA,
89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Lisaks on oluline, et antikehad kohandataks inimese jaoks, säilitades antigeeni
suure afiinsuse ja muud soovitavad bioloogilised omadused. Selle eesmärgi
saavutamiseks valmistatakse inimese jaoks kohandatud antikehad vastavalt 25
eelistatud meetodile protsessiga, mille käigus analüüsitakse eellas-järjestusi ja
erinevaid kontseptuaalseid inimese jaoks kohandatud produkte, kasutades eellas-
ja inimese jaoks kohandatud järjestuste kolmemõõtmelisi mudeleid.
Kolmemõõtmelised immunoglobuliini mudelid on laialdaselt saadaval ja on
valdkonnas kogenud isikutele tuttavad. Saadaval on arvutiprogrammid, mis 30
illustreerivad ja kuvavad valitud võimalike kandidaat-immunoglobuliinjärjestuste
kolmemõõtmelisi kohandatud struktuure. Nende kuvade uurimine võimaldab
EE - EP1692182 B1 42
analüüsida jääkide võimalikku osatähtsust kandidaat-immunoglobuliinjärjestuste
funktsioneerimisel, s.t jääkide analüüsimist, mis mõjutavad kandidaat-
immunoglobuliini võimet selle antigeeni siduda. Sellisel viisil võib FR jäägid
vastuvõtjalt valida, kombineerida ning importida nii, et saavutatakse soovitud
antikeha omadus nagu suurenenud afiinsus märklaud-antigeeni suhtes. Üldiselt on 5
antigeeni sidumise mõjutamisel otse ja kõige olulisemalt kaasatud
hüpervarieeruva piirkonna jäägid.
Ühes muus teostuses muundatakse käesoleva leiutise antigeeni siduvaid
molekule viisil, et neil oleks täiustatud sidumisafiinsus; nimetatud meetod on
avaldatud näiteks USA patendiavalduse publikatsioonis nr. 2004/0132066 (Balint 10
et al.).
Ühes teostuses konjugeeritakse käesoleva leiutise antigeeni siduv molekul
täiendava fragmendiga, näiteks radiomärgis või toksiin. Sellised konjugeeritud
ABM võib toota mitme meetodiga, mis on praktikas hästi teada.
Käesolevas leiutises on rakendatav teatud hulk radionukliide ja valdkonnas 15
kogenud isikud peaksid olema võimelised määrama, milline radionukliid on
erinevatel asjaoludel kõige sobivam. Näiteks 131jood on laialdaselt tuntud
radionukliid, mida mingi kindla märklaua vastu suunatud immunoteraapias
kasutatakse. Kuid 131joodi kliiniline kasutus võib olla piiratud mitme faktoriga, k.a: 8
päeva pikkune füüsikaline poolestusaeg; jooditud antikeha dehalogeenimine nii 20
veres kui ka tuumorite asukohtades; ja kiirgusomadused (näiteks suur
gammakompoment), mis võib osutuda suboptimaalseks lokaliseeritud doosi
kuhjumiseks tuumoris. Kõrgekvaliteediliste kelaativate ainete saabumisel
suurendas võimalus metalli kelaativate rühmade kinnitamiseks valkude külge
võimalusi muude radionukliidide kasutamiseks, näiteks 111indium ja 90ütrium. 25 90ütrium võimaldab mitmeid eeliseid radioimmunoteraapiliste rakenduste
kasutamisel: 90ütriumi 64 tunni pikkune poolestusaeg on piisavalt pikk, et
võimaldada antikeha kuhjumist tuumoris ja samuti on 90ütrium erinevalt näiteks 131joodist puhas suure energia beetakiirgaja ilma kaasneva gammakiirguseta
lagunemisel; kiirgus jääb koes vahemikku 100 kuni 1000 raku diameetrit. Lisaks 30
võimaldab läbistava kiirguse minimaalne kogus 90ütriumiga märgistatud
antikehade manustamist ambulatoorsetele patsientidele. Lisaks ei ole märgistatud
EE - EP1692182 B1 43
antikeha omandamine raku hävitamiseks vajalik ja ioniseeriva kiirguse lokaalne
kiirgamine peaks olema piisav kõrval asetsevate tuumorirakkude, kus märklaud-
antigeen puudub, hävitamiseks.
90ütriumiga märgistatud anti-CD20 antikehade efektiivsed ühe ravikorra doosid (s.t
terapeutiliselt efektiivsed kogused) jäävad vahemikku umbes 5 kuni umbes 75 mCi 5
ja eelistatumalt vahemikku umbes 10 kuni umbes 40 mCi. 131joodiga märgistatud
anti-CD20 antikehade efektiivsed ühe ravikorra luuüdile mitteablatiivsed doosid
jäävad vahemikku umbes 5 kuni umbes 70 mCi ja eelistatumalt vahemikku umbes
5 kuni umbes 40 mCi. 131joodiga märgistatud anti-CD20 antikehade efektiivsed
ühe ravikorra ablatiivsed doosid (s.t, et vajalik võib olla autoloogse luuüdi 10
siirdamine) jäävad vahemikku umbes 30 kuni umbes 600 mCi ja eelistatumalt
vahemikku umbes 50 kuni vähem kui umbes 500 mCi. Seotult kimäärse anti-CD20
antikehaga jäävad 131joodiga, mille pikem poolestusaeg vereringes on tingitud vis-
a-vis hiire antikehadest, märgistatud kimäärsete anti-CD20 antikehade luuüdile
mitteablatiivsed doosid vahemikku umbes 5 kuni umbes 40 mCi ja eelistatumalt 15
vähem kui umbes 30 mCi. Kujutuskriteeriumid näiteks 111indiumi märgise jaoks on
tavaliselt väiksemad kui umbes 5 mCi.
Radiomärgistatud anti-CD20 antikehadega sooritatav ravi võib toimuda ühte või
mitut ravikorda kasutades. Radionukliidist komponendi tõttu on eelistatud, et enne
ravi „kogutakse“ patsientidelt, kellel esineb radiatsiooni tõttu potentsiaalselt 20
surmav luuüdi toksilisus, perifeersed tüvirakud („PSC“) või luuüdi („BM“). BM ja/või
PSC kogutakse standardtehnikatega ning puhastatakse ja külmutatakse seejärel
võimalikuks reinfusiooniks. Lisaks on kõige eelistatumaks lähenemisviisiks, et
enne ravi viiakse patsiendil läbi diagnostiline dosimeetria uuring diagnostilist
märgistatud antikeha (näiteks 111indium) kasutades; nimetatud uuringu eesmärgiks 25
on kindlustada, et terapeutiliselt märgistatud antikeha (näiteks 90ütrium) ei
„kontsentreeruks“ üheski terves organis või koes liigselt.
Eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab allpool tabelis 3 näidatud
aminohappejärjestust omavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust. Leiutises
avaldatakse samuti eraldatud nukleiinhape, mille järjestus kodeerib tabelis 3 30
näidatud konstruktsioonide aminohappejärjestust (konservatiivsete
aminohappeasendustega) omavat polüpeptiidi.
EE - EP1692182 B1 44
Tabel 2
EE - EP1692182 B1 45
(järgneb)
EE - EP1692182 B1 46
(järgneb)
EE - EP1692182 B1 47
(järgneb)
EE - EP1692182 B1 48
(järgneb)
EE - EP1692182 B1 49
(järgneb)
EE - EP1692182 B1 50
(järgneb)
Tabel 3
5
EE - EP1692182 B1 51
(järgneb)
EE - EP1692182 B1 52
(järgneb)
Leiutises kirjeldatakse eraldatud polünukleotiidi, mis sisaldab joonisel FIG. 1 või
FIG. 2 näidatud aminohappejärjestust sisaldavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust.
EE - EP1692182 B1 53
Leiutisega avaldatakse eraldatud nukleiinhape, mis sisaldab mistahes joonisel
FIG. 1, FIG. 2, FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5 või FIG. 6 näidatud konservatiivsete
aminohappeasendustega konstruktsiooni aminohappejärjestust omavat
polüpeptiidi kodeerivat järjestust.
Ühes muus teostuses seondub käesolev leiutis nõudluspunktidele vastava 5
ekspressioonivektori ja/või peremeerakuga, mis sisaldab ühte või rohkemat
eraldatud polünukleotiidi.
Üldiselt võib käesoleva leiutise ABM avaldamiseks kasutada iga kultuuristatud
rakuliini tüüpi. Ühes eelistatud teostuses kasutatakse leiutise muundatud
peremeesrakkude valmistamisel aluseks oleva rakuliinina CHO rakke, BHK rakke, 10
NS0 rakke, SP2/0 rakke, YO müeloomi rakke, P3X63 hiire müeloomi rakke, PER
rakke, PER.C6 rakke või hübridoomrakke, muid imetajate rakke, pärmirakke,
putukarakke või taimerakke.
Käesoleva leiutise ABM terapeutilist efektiivsust saab parandada, tootes need
peremeesrakkudes, mis avaldavad täiendavalt GnTIII aktiivsust omavat 15
polüpeptiidi kodeerivat polünukleotiidi. Ühes eelistatud teostuses on GnTIII
aktiivsusega polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid, mis sisaldab Golgi-resistentse
polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni. Ühes muus eelistatud teostuses annab
käesoleva leiutise ABM ekspressioon peremeesrakus, mis avaldab GnTIII
aktiivsust omavat polüpeptiidi kodeerivat polünukleotiidi, saagiseks ABM, millel on 20
suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsus ja suurenenud efektori funktsioon.
Seega ühes teostuses seondub käesolev leiutis peremeesrakuga, mis omakorda
koosneb (a) eraldatud nukleiinhappest, mis omakorda sisaldab GnTIII aktiivsust
omavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust; ja (b) eraldatud polünukleotiidist, mis
kodeerib käesoleva leiutise ABM, näiteks inimese CD20 siduv kimäärne või 25
inimese jaoks kohandatud antikeha. Ühes eelistatud teostuses on GnTIII
aktiivsusega polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid, mis sisaldab GnTIII katalüseerivat
domeeni ja Golgi lokalisatsiooni domeeniks on mannosidaas II lokalisatsiooni
domeen. Meetodid selliste fusioonpolüpeptiidide valmistamiseks ja nende
kasutamiseks suurenenud efektori funktsioonidega antikehade valmistamiseks on 30
avaldatud USA patenditaotluses nr. 60/495 142. Veel ühes eelistatud teostuses on
kimäärseks ABM kimäärne antikeha või selle fragment, millel on hiire B-Ly1
EE - EP1692182 B1 54
antikeha sidumisspetsiifilisus. Ühes eriti eelistatud teostuses sisaldab kimäärne
antikeha inimese Fc. Ühes muus eelistatud teostuses on antikeha primaatide või
inimese jaoks kohandatud.
Ühes teostuses võib ühe või mitu käesoleva leiutise ABM kodeerivat
polünukleotiidi avaldada konstitutiivse promootori või alternatiivina reguleeritud 5
ekspressioonisüsteemi kontrolli all. Sobivad reguleeritud ekspressioonisüsteemid
hõlmavad, kuid ei ole nendega piiratud, tsetratsükliin-reguleeritud
ekspressioonisüsteemi, ekdüsooniga indutseeritavat ekspressioonisüsteemi, lac-
lülitiga ekspressioonisüsteemi, glükokortikoidiga indutseeritavat ekspressiooni-
süsteemi, temperatuuriga indutseeritavat promootorsüsteemi ja metallotioneiini 10
metall-indutseeritavat ekspressioonisüsteemi. Kui peremeesraku süsteemis leidub
mitmeid erinevaid käesoleva leiutise ABM kodeerivaid nukleiinhappeid, võib
mõned nendest avaldada konstitutiivse promootori kontrolli all ja ülejäänud
avaldatakse reguleeritud promootori kontrolli all. Maksimaalseks
ekspressioonitasemeks loetakse stabiilse polüpeptiidi ekspressiooni suurimat 15
võimalikku taset, mis ei avalda märgatavat negatiivset mõju rakkude
kasvukiirusele; maksimaalne ekspressioonitase määratakse rutiinse
katsetamisega. Ekspressioonitasemed määratakse valdkonnas teada olevate
meetodiga, k.a Western blot analüüs ABM spetsiifilist antikeha või ABM külge
sulatatud peptiidmärgise spetsiifilist antikeha kasutades; ja Northern blot analüüs. 20
Täiendava alternatiivina võib polünukleotiidi aheldada operatiivselt
reportergeeniga; kimäärse ABM, mille sidumisspetsiifilisus on üldiselt sama hiire
B-Ly1 antikehaga, ekspressioonitasemed määratakse, mõõtes signaali, mis on
korrelatsioonis reportergeeni ekspressioonitasemega. Reportergeeni võib
transkribeerida koos nimetatud fusioonpolüpeptiidi kodeerivate nukleiinhapetega 25
ühe mRNA molekulina; nende vastavad kodeerimisjärjestused võib aheldada kas
sisemise ribosomaalse sisestuspiirkonna (IRES) või cap-iseseisva translatsiooni
võimendajaga (CITE). Reportergeeni võib transleerida koos vähemalt ühe
kimäärset ABM kodeeriva nukleiinhappega, millel on hiire B-Ly1 antikehaga
üldiselt sama spetsiifilisus nii, et moodustub üks polüpeptiidahel. Käesoleva 30
leiutise AMB kodeerivad nukleiinhapped võib aheldada operatiivselt
reportergeeniga, mis on ühe promootori kontrolli all, näiteks fusioonpolüpeptiidi
kodeeriv nukleiinhape; reportergeen transkribeeritakse RNA molekuli, mis on
EE - EP1692182 B1 55
alternatiivselt kahte eraldi mRNA molekuli splaissitud; üks saadud mRNA
transleeritakse nimetatud reportervalku ja teine transleeritakse nimetatud
fusioonpolüpeptiidi.
Ekspressioonivektorite, mis sisaldavad ABM kodeerimisjärjestust ja millel on
üldiselt sama sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal koos sobivate 5
transkriptsiooni/translatsiooni kontrollsignaalidega, konstrueerimiseks võib
kasutada meetodeid, mis on valdkonnas kogenud isikutele hästi teada. Need
meetodid hõlmavad in vitro rekombinantse DNA tehnikaid, sünteetilisi tehnikaid ja
in vivo rekombinatsiooni/geneetilist rekombinantsiooni. Vaadake näiteks tehnikaid,
mida on kirjeldanud Maniatis et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY 10
MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) ja Ausubel et al.,
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing
Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989).
Käesoleva leiutise ABM kodeerimisjärjestuse avaldamiseks võib kasutada
erinevaid peremees-ekspressioonivektori süsteeme. Eelistatult kasutatakse 15
peremeesrakusüsteemidena imetajarakke, mis on transfekteeritud rekombinantse
plasmiidi DNA või kosmiidi DNA ekspressioonivektoritega, mis omakorda
sisaldavad huvi pakkuva valgu kodeerimisjärjestust ja fusioonpolüpeptiidi
kodeerimisjärjestust. Peremeesraku süsteemina kasutatakse kõige eelistatumalt
CHO rakke, BHK rakke, NS0 rakke, SP2/0 rakke, YO müeloomi rakke, P3X63 hiire 20
müeloomi rakke, PER rakke, PER.C6 rakke või hübridoomrakke, muid imetajate
rakke, pärmirakke, putukarakke või taimerakke. Mõningaid
ekspressioonisüsteemide ja selektsioonimeetodite näiteid on kirjeldatud
järgnevates viiteallikates ning nendes mainitud viiteallikates: Borth et al.,
Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001), Werner et al., 25
Arineimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), Andersen ja Krummen, Curr.
Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), Chadd ja Chamow, Curr. Op. Biotechnol.
12:188-194 (2001) ning Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001).
Alternatiivsetes teostuses vaadeldakse ka muude eukarüootsete
peremeesrakkude süsteemide kasutamist, k.a käesoleva leiutise ABM 30
kodeerimisjärjestust sisaldavate rekombinantse pärmi ekspressioonivektoritega
transformeeritud pärmirakud; putukaraku süsteemid, mis on nakatatud
EE - EP1692182 B1 56
rekombinantse viiruse ekspressioonivektoritega (näiteks bakuloviirus), mis
omakorda sisaldab kimäärset ABM kodeerivat järjestust, millel on üldiselt sama
sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal; taimeraku süsteeme, mis on
nakatatud rekombinantse viiruse ekspressioonivektoritega (näiteks lillkapsa
mosaiikviirus CaMV; tubaka mosaiikviirus TMV) või transformeeritud 5
rekombinantsete plasmiidi ekspressioonivektoritega (näiteks Ti plasmiid), mis
sisaldavad leiutise ABM kodeerimisjärjestust; või loomaraku süsteemid, mis on
nakatatud rekombinantse viiruse ekspressioonivektoritega (näiteks adenoviirus,
vaktsiinia viirus), k.a rakuliinid, mida on muundatud viisil, et need sisaldavad
mitmeid DNA koopiaid, mis kodeerivad kimäärset ABM, mille sidumisspetsiifilisus 10
on üldiselt sama hiire B-Ly1 antikehaga ja mis on kas stabiilselt võimendatud
(CHO/dhfr) või ebastabiilselt topelt-minuti kromosoomides võimendatud (näiteks
hiire rakuliinid). Ühes teostuses on leiutise ABM kodeerivaid polünukleotiide
sisaldav vektor paljutsistroniline. Ühes teostuses on eelnevalt avaldatud ABM
antikeha või selle fragment. Ühes eelistatud teostuses on ABM inimese jaoks 15
kohandatud antikeha.
Leiutise meetodite juures eelistatakse üldiselt põgusale ekspressioonile stabiilset
ekspressiooni, kuna selle abil saavutatakse tavaliselt kergemini taastatavamad
tulemused ja see on samuti paremini suures mahus tootmiseks kohandatav. Selle
asemel, et kasutada replikatsiooni viiruslikke algeid sisaldavaid 20
ekspressioonivektoreid, võib rakud transformeerida vastavate kodeerivate
nukleiinhapetega, mida kontrollitakse sobivate ekspressioonikontrolli elementide
(näiteks promooter, võimendaja, järjestused, transkriptsiooni terminaatorid,
polüadenülatsioonisaidid jne) ja valitava markeriga. Pärast võõrkehalt pärineva
DNA sisestust võib muundatud rakkudel samuti lasta 1 kuni 2 päeva rikastatud 25
söötmel kasvada ja seejärel selektiivsele söötmele üle viia. Rekombinantses
plasmiidis olev valitav marker avaldab selektsioonile resistentsust ja võimaldab
valida rakke, mis on integreerinud plasmiidi stabiilselt oma kromosoomidesse ja
kasvavad foci moodustumiseks, mille omakorda saab kloonida ja rakuliinidesse
laiendada. 30
Kasutada võib mitmeid selektsioonisüsteeme, k.a (olemata samas nendega
piiratud), herpes simplex viiruse tümidiini kinaasi (Wigler et al., Cell 11:223
EE - EP1692182 B1 57
(1977)), hüpoksantiin-guaniini fosforibosüültransferaasi (Szybalska & Szybalski,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)) ja adeniin-fosforibosüültransferaasi
(Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) geene, mida saab kasutada vastavalt tk-, hgprt-
või aprt- rakkudes. Samuti saab antimetaboliidi resistentsust kasutada selektsiooni
alusena dhfr geene, mis avaldavad resistentsust metotreksaadile (Wigler et al., 5
Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O’Hare et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA
78:1527 (1981)); gpt geene, mis avaldavad resistentsust mükofenoolhappele
(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo geene, mis
avaldavad resistentsust aminogükosiid G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol.
Biol. 150:1 (1981)); ja hügro geene, mis avaldavad resistentsust hügromütsiinile 10
(Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Hiljuti kirjeldati täiendavaid valitavaid geene,
nimelt trpB, mis võimaldab kasutada rakkudel trüptofaani asemel indooli; hisD, mis
võimaldab kasutada rakkudel histidiini asemel histinooli (Hartman & Mulligan,
Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:8047 (1988)); glutamiini süntaasisüsteemi; ja ODC
(ornitiini dekarboksülaas), mis avaldab resistentsust ornitiini dekarboksülaasi 15
inhibiitori, 2-(difluorometüül)-DL-ornitiin, DFMO suhtes (McConlogue teoses:
Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.
(1987)).
Käesolev leiutis seondub täiendavalt meetodiga peremeesraku poolt toodetud
käesoleva leiutise ABM glükosüülimisprofiili muutmiseks, mis hõlmab leiutise ABM 20
kodeeriva nukleiinhappe ja GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi kodeeriva
nukleiinhappe või selliseid nukleiinhappeid sisaldava vektori avaldamist nimetatud
peremeesrakus. Eelistatult on modifitseeritud polüpeptiidiks IgG või selle fragment,
mis sisaldab Fc piirkonda. Ühes eriti eelistatud teostuses on ABM inimese jaoks
kohandatud antikeha või selle fragment. 25
Leiutise peremeerakkude poolt loodud modifitseeritud ABM ilmutavad
modifikatsiooni tulemusel suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsust ja/või
suurenenud efektori funktsiooni. Ühes eriti eelistatud teostuses on ABM inimese
jaoks kohandatud antikeha või selle Fc piirkonda sisaldav fragment. Eelistatult on
suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsuseks suurenenud seondumine Fcγ 30
aktiveeriva retseptoriga, näiteks FcγRIIIa retseptoriga. Suurenenud efektori
funktsiooniks on eelistatult ühe või rohkema järgneva suurenemine: suurenenud
EE - EP1692182 B1 58
antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus, suurenenud antikehast sõltuv rakuline
fagotsütoos (ADCP), suurenenud tsütokiini eritus, suurenenud immuunkompleksi
vahendatud antigeeni omastamine antigeeni kujutavate rakkude poolt, suurenenud
Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus, suurenenud seondumine NK rakkudega,
suurenenud seondumine makrofaagidega, suurenenud seondumine 5
polümorftuumaste rakkudega (PMN), suurenenud seondumine monotsüütidega,
suurenenud märklauaga seotud antikehade ristsidumine, suurenenud apoptoosi
indutseeriv otsene signalisatsioon, suurenenud dendriitrakkude valmimine ja
suurenenud T rakkude primeerimine.
Käesolev leiutis seondub samuti meetodiga käesoleva leiutise ABM 10
valmistamiseks, millel on peremeesrakus modifitseeritud oligosahhariidid;
nimetatud meetod hõlmab (a) peremeesraku, mida on muundatud avaldama
vähemalt ühte nukleiinhapet, mis omakorda kodeerib GnTIII aktiivsusega
polüpeptiidi, kultuuristamist tingimustel, mis võimaldavad käesolevale leiutisele
vastava ABM valmistamist ja nimetatud GnTIII aktiivsust omav polüpeptiid 15
avaldatakse koguses, mis on piisav nimetatud ABM Fc piirkonnas olevate
oligosahhariidide modifitseerimiseks nimetatud peremeesraku poolt; ja (b)
nimetatud ABM eraldamist. Ühes eelistatud teostuses on GnTIII aktiivsusega
polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid, mis sisaldab GnTIII katalüütilist domeeni. Ühes
eriti eelistatud teostuses sisaldab fusioonpolüpeptiid täiendavalt Golgi-resistentse 20
polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni.
Eelistatult on Golgi lokalisatsiooni domeeniks mannosidaas II või GnTI
lokalisatsiooni domeen. Alternatiivina on Golgi lokalisatsiooni domeen valitud
rühmast, kuhu kuuluvad: mannosidaas I lokalisatsiooni domeen, GnTII
lokalisatsiooni domeen ja α1-6 tuuma fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen. 25
Käesoleva leiutise meetoditega valmistatud ABM on suurenenud Fc retseptori
sidumisafiinsus ja/või suurenenud efektori funktsioon. Eelistatult kujutab
suurenenud efektori funktsioon endast ühte või rohkemat järgnevatest:
suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus (k.a suurenenud antikehast
sõltuv rakuline tsütotoksilisus), suurenenud antikehast sõltuv rakuline fagotsütoos 30
(ADCP), suurenenud tsütokiini eritus, suurenenud immuunkompleksi vahendatud
antigeeni omastamine antigeeni kujutavate rakkude poolt, suurenenud
EE - EP1692182 B1 59
seondumine NK rakkudega, suurenenud seondumine makrofaagidega,
suurenenud seondumine monotsüütidega, suurenenud seondumine
polümorftuumaste rakkudega, suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene
signalisatsioon, suurenenud märklauaga seotud antikehade ristsidumine,
suurenenud dendriitrakkude valmimine ja suurenenud T rakkude primeerimine. 5
Suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsuseks on eelistatult suurenenud
seondumine Fc aktiveerivate retseptoritega nagu FcγRIIIa. Ühes eriti eelistatud
teostuses on ABM inimese jaoks kohandatud antikeha või selle fragment.
Ühes muus teostuses seondub käesolev leiutis kimäärse ABM, millel on üldiselt
sama sidumisafiinsus kui hiire B-Ly1 antikehal ja mis on toodetud leiutise 10
meetoditega ja millel esineb nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas suurenenud
poolitatud oligosahhariidide proportsioon. Vaadeldakse, et selline ABM hõlmab
antikehasid ning nende fragmente, mis sisaldavad Fc piirkonda. Ühes eelistatud
teostuses on ABM inimese jaoks kohandatud antikeha. Ühes teostuses on
poolitatud oligosahhariidide protsent ABM Fc piirkonnas vähemalt 50%, 15
eelistatumalt vähemalt 60%, vähemalt 70%, vähemalt 80%, vähemalt 90% ja
kõige eelistatumalt vähemalt 90-95% oligosahhariidide koguhulgast. Veel ühes
teostuses on leiutise meetoditega valmistatud ABM Fc piirkonnas suurenenud
fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon – see saavutatakse läbi selle
oligosahhariidide modifikatsiooni käesoleva leiutise meetodeid kasutades. Ühes 20
teostuses on fukosüülimata oligosahhariidide protsent vähemalt 50%, eelistatult
vähemalt 60% kuni 70% ja kõige eelistatumalt vähemalt 75%. Fukosüülimata
oligosahhariidid võivad olla hübriidid või kompleksid. Ühes eriti eelistatud
teostuses on peremeesrakkude poolt leiutise meetodeid kasutades valmistatud
ABM suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon Fc 25
piirkonnas. Poolitatud fukosüülimata oligosahhariidid võivad olla hübriidid või
kompleksid. Täpsemalt, käesoleva leiutise meetodeid võib kasutada ABM
valmistamiseks, kus vähemalt 15%, eelistatumalt vähemalt 20%, eelistatumalt
vähemalt 25%, eelistatumalt vähemalt 30% ja veelgi eelistatumalt vähemalt 35%
ABM Fc piirkonnas olevatest oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata. 30
Käesoleva leiutise meetodeid võib samuti kasutada polüpeptiidide valmistamiseks,
kus vähemalt 15%, eelistatumalt vähemalt 20%, eelistatumalt vähemalt 25%,
EE - EP1692182 B1 60
eelistatumalt vähemalt 30% ja veelgi eelistatumalt vähemalt 35% polüpeptiidi Fc
piirkonnas olevatest oligosahhariiddest on poolitatud fukosüülimata hübriidid.
Ühes muus teostuses seondub käesolev leiutis leiutise meetoditega valmistatud
kimäärse ABM, millel on hiire B-Ly1 antikehaga sarnane sidumisspetsiifilisus ja
mida on muundatud suurenenud efektori funktsiooni ja/või suurenenud Fc 5
retseptori sidumisafiinsuse saavutamiseks. Eelistatult kujutab suurenenud efektori
funktsioon endast ühte või rohkemat järgnevatest: suurenenud Fc vahendatud
rakuline tsütotoksilisus (k.a suurenenud antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus),
suurenenud antikehast sõltuv rakuline fagotsütoos (ADCP), suurenenud tsütokiini
eritus, suurenenud immuunkompleksi vahendatud antigeeni omastamine antigeeni 10
kujutavate rakkude poolt, suurenenud seondumine NK rakkudega, suurenenud
seondumine makrofaagidega, suurenenud seondumine monotsüütidega,
suurenenud seondumine polümorftuumaste rakkudega, suurenenud apoptoosi
indutseeriv otsene signalisatsioon, suurenenud märklauaga seotud antikehade
ristsidumine, suurenenud dendriitrakkude valmimine ja suurenenud T rakkude 15
primeerimine. Eelistatud teostuses on suurenenud Fc retseptori
sidumisafiinsuseks suurenenud seondumine Fc aktiveeriva retseptoriga ja kõige
eelistatumalt FcγRIIIa retseptoriga. Ühes teostuses on ABM antikeha või Fc
piirkonda sisaldav antikeha fragment või fusioonvalk, mis sisaldab
immunoglobuliini Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda. Ühes eriti eelistatud 20
teostuses on ABM inimese jaoks kohandatud antikeha.
Käesolev leiutis seondub täiendavalt ravimkoostistega, mis sisaldavad käesoleva
leiutise ABM ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.
Käesolev leiutis seondub lisaks selliste ravimkoostiste kasutamisega kasvajate
ravimiseks. Täpsemalt, käesolev leiutis seondub meetodiga kasvaja ravimiseks 25
ning nimetatud meetod hõlmab terapeutiliselt efektiivse koguse leiutise
ravimkoostise manustamist.
Käesoleva leiutisega pakutakse lisaks välja meetodid peremeesrakkude
süsteemide loomiseks ja kasutamiseks käesoleva leiutise ABM glükovormide
valmistamiseks, millel on suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsus, eelistatult 30
suurenenud seondumine Fc aktiveeritavate retseptoritega ja/või suurenenud
EE - EP1692182 B1 61
efektori funktsioonid, k.a antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus.
Glükomuundatud antikeha, mida käesoleva leiutise ABM kasutada saab, on
kirjeldatud detailsemalt USA patendis nr. 6 602 684 ja esialgses USA
patenditaotluses nr. 60/441 307 ja WO 2004/065540. Käesoleva leiutise ABM võib
alternatiivina glükomuundada patendis EP 1 176 195 A1 kirjeldatud viisil, et need 5
sisaldaksid Fc piirkonnas vähenenud fukoosi jääke.
Rakuliinide valmistamine muudetud glükosüülimismustriga valkude tootmiseks
Käesolevas leiutises pakutakse välja peremeesraku ekspressioonisüsteemid
käesoleva leiutise ABM valmistamiseks, millel on muudetud glükosüülimismustrid.
Täpsemalt, käesolevas leiutises pakutakse välja peremeesraku süsteemid 10
käesoleva leiutise ABM paranenud terapeutilise väärtusega glükovormide
valmistamiseks. Seega pakutakse leiutises välja peremeesraku
ekspressioonisüsteemid, mis on valitud või muundatud GnTIII aktiivsusega
polüpeptiidi avaldamiseks. Ühes teostuses on GnTIII aktiivsusega polüpeptiidiks
fusioonpolüpeptiid, mis sisaldab heteroloogse Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi 15
lokalisatsiooni domeeni. Täpsemalt, need peremeesraku ekspressioonisüsteemid
võib valmistada selliselt, et need sisaldaksid GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi
kodeerivat rekombinantset nukleiinhappe molekuli, mis on aheldatud operatiivselt
konstitutiivse või reguleeritud promootorsüsteemiga.
Ühes konkreetses teostuses pakutakse käesoleva leiutisega välja peremeerakk, 20
mida on muundatud vähemalt ühe GnTIII aktiivsust omavat fusioonpolüpeptiidi
kodeeriva nukleiinhappe avaldamiseks, mis omakorda sisaldab heteroloogse
Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni. Ühes teostuses on
peremeesrakku muundatud nukleiinhappe molekuliga, mis sisaldab vähemalt ühte
GnTIII aktiivsust omavat fusioonpolüpeptiidi kodeerivat geeni ja heteroloogse 25
Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni.
Üldiselt võib käesoleva leiutise peremeesrakkude liinide valmistamise alusena
kasutada mistahes kultuuristatud rakuliini tüüpi, k.a eelnevalt avaldatud rakuliinid.
Ühes eelistatud teostuses kasutatakse leiutise muundatud peremeesrakkude
valmistamisel aluseks oleva rakuliinina CHO rakke, BHK rakke, NS0 rakke, SP2/0 30
rakke, YO müeloomi rakke, P3X63 hiire müeloomi rakke, PER rakke, PER.C6
EE - EP1692182 B1 62
rakke või hübridoomrakke, muid imetajate rakke, pärmirakke, putukarakke või
taimerakke.
Leiutis on mõeldud hõlmama kõiki GnTIII aktiivsust omavaid polüpeptiide
avaldavaid muundatud peremeesrakke, k.a fusioonpolüpeptiidid, mis sisaldavad
siin defineeritud heteroloogse Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni 5
domeeni.
Konstitutiivse promootori või reguleeritud ekspressioonisüsteemi kontrolli all võib
avaldada ühte või mitut GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi kodeerivat nukleiinhapet.
Sellised süsteemid on praktikas hästi teada ja hõlmavad eelnevalt mainitud
süsteeme. Kui peremeesraku süsteemis leidub mitu erinevat fusioonpolüpeptiide, 10
millel on GnTIII aktiivsus ja mis sisaldavad heteroloogse Golgi-resistentse
polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni, kodeerivat nukleiinhapet, võib mõned
nendest avaldata konstitutiivse promootori kontrolli all, samas kui teised
avaldatakse reguleeritud promootori kontrolli all. GnTIII aktiivsusega
fusioonpolüpeptiidide ekspressioonitasemed määratakse üldiselt valdkonnas 15
teada olevate meetoditega, k.a Western blot analüüs, Northern blot analüüs,
reportergeeni ekspressioonianalüüs või GnTIII aktiivsuse mõõtmine. Alternatiivina
võib kasutada GnTIII biosünteetiliste saadustega seonduvat lektiini, näiteks E4-
PHA lektiin. Alternatiivina võib kasutada ka funktsionaalset analüüsi, millega
mõõdetakse suurenenud Fc retseptori seondumist või suurenenud efektori 20
funktsiooni, mida vahendatakse GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi kodeeriva
nukleiinhappega muundatud rakkude poolt toodetud antikehade poolt.
Transfektantide või transformantide tuvastamine, mis avaldavad modifitseeritud
glükosüülimismustriga valku
Peremeesrakud, mis sisaldavad kimäärse ABM, millel on üldiselt hiire B-Ly1 25
antikehaga sama sidumisspetsiifilisus, kodeerimisjärjestust ja mis avaldavad
bioloogiliselt aktiivseid geenisaaduseid, võib tuvastada vähemalt nelja üldise
lähenemisviisiga; (a) DNA-DNA või DNA-RNA hübridisatsioon; (b) „marker“ geeni
funktsioonide olemasolu või puudumine; (c) transkriptsioonitaseme hindamine,
mõõdetuna vastavate mRNA transkriptide ekspressiooniga peremeesrakus; ja (d) 30
EE - EP1692182 B1 63
geenisaaduse tuvastamine immuunsusanalüüsi või selle bioloogilise aktiivsuse
mõõtmisega.
Esimese võimaluse korral võib kimäärse ABM, millel on üldiselt sama
seondumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal, kodeerimisjärjestuse ja GnTIII
aktiivsusega polüpeptiidi kodeerimisjärjestuse tuvastada DNA-DNA või DNA-RNA 5
hübridisatsiooniga, kasutades selleks proove, mis koosnevad
nukleotiidjärjestustest mis omakorda on homoloogsed vastavate kodeerimis-
järjestuste või nende osade või derivaatidega.
Teise meetodi korral saab rekombinantse ekspressioonivektori/peremeessüsteemi
tuvastada ja valida, tuginedes teatud „marker“ geeni funktsioonide olemasolule või 10
puudumisele (näiteks tümidiinkinaasi aktiivsus, resistentsus antibiootikumide
suhtes, resistentsus metotreksaadi suhtes, transformatsiooni fenotüüp,
oklusioonkeha moodustumine bakuloviiruses jne). Näiteks juhul, kui leiutise ABM
või selle fragmendi kodeerimisjärjestus ja GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi
kodeerimisjärjestus sisestatakse vektori markergeeni järjestusse, saab vastavaid 15
kodeerimisjärjestusi sisaldavad rekombinantsed saadused tuvastada markergeeni
funktsiooni puudumise alusel. Alternatiivina võib markergeeni sisestada tandemina
kodeerimisjärjestustega samade või erinevate promootorite, mida
kodeerimisjärjestuste ekspressioonil kasutati, kontrolli all. Markeri ekspressioon
reageeringuna induktsioonile või selektsioonile näitab leiutise ABM 20
kodeerimisjärjestuse ekspressiooni ja GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi
kodeerimisjärjestust.
Kolmandas meetodis võib leiutise ABM või selle fragmendi kodeeriva piirkonna
transkriptsionaalset aktiivsust ja GnTIII aktiivsust omava polüpeptiidi
kodeerimisjärjestuse aktiivsust hinnata hübridisatsiooni analüüsidega. Näiteks 25
RNA võib eraldada ja analüüsida Northern blot meetodiga, kasutades leiutise ABM
või selle fragmendi kodeerimisjärjestustega homoloogset proovi ja GnTIII
aktiivsust omava polüpeptiidi või selle konkreetsete osade kodeerimisjärjestust.
Alternatiivina võib ekstraheerida kõik peremeesraku nukleiinhapped ja analüüsida
nende hübridisatsiooni selliste proovide suhtes. 30
EE - EP1692182 B1 64
Neljandas meetodis võib valgusaaduste ekspressiooni hinnata immunoloogiliselt
(näiteks Western blot analüüsid), immuunsusanalüüside nagu „radioimmuno-
sadestumine“ või ensüümiga aheldatud immuunsusanalüüsidega. Kuid ülim test
ekspressioonisüsteemi edukuse määramiseks hõlmab bioloogiliselt aktiivsete
geenisaaduste tuvastust. 5
ABM, millel on suurenenud efektori funktsioon, k.a antikehast sõltuv rakuline
tsütotoksilisus, valmistamine ja kasutamine
Eelistatud teostuses pakutakse käesoleva leiutisega välja kimäärsete ABM, millel
on üldiselt sama sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal ja suurenenud
efektori funktsioon, k.a antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus, glükovormid. 10
Antikehade glükomuundamist on kirjeldatud varasemalt. Vaadake näiteks USA
patenti nr. 6 602 684.
Kliinilised katsed konjugeerimata monoklonaalsete antikehade (mAb)
kasutamiseks mõningate kasvajatüüpide ravimisel on andnud viimasel ajal
julgustavaid tulemusi. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); 15
Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Kimäärne konjugeerimata IgG1 on
kiidetud heaks väikse riskiga või follikulaarse B raku mitte-Hodgkinsi lümfoomi
ravimiseks. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997), samas kui
üks teine konjugeerimata mAb, inimese jaoks kohandatud IgG1, mis on suunatud
tahkete rinnakasvajate ravimisele, on III faasi kliinilistes katsetes samuti lubavaid 20
tulemusi demonstreeritud. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Nende
kahe mAb antigeene avaldatakse tugevalt nende vastavates tuumorirakkudes ja
antikehad vahendavad potentsiaalset tuumori hävitamist efektorrakkude poolt in
vitro ja in vivo. Samas paljud konjugeerimata mAb, millel on hea
tuumorispetsiifilisus, ei suuda käivitada piisava potentsiaaliga efektori funktsioone, 25
mis osutuksid kliiniliselt kasulikeks. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus
et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). Mõningate selliste nõrgemata mAb jaoks
katsetatakse hetkel täiendavat tsütokiini ravi. Tsütokiinide lisamine võib
stimuleerida antikehast sõltuvat rakulist tsütotoksilisust (ADCC), suurendades
vereringes leiduvate lümfotsüütide aktiivsust ja arvu. Frost et al., Cancer 80:317-30
33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). ADCC ehk lüütiline
rünnak antikeha märklaud-rakkude vastu käivitatakse pärast leukotsüüdi
EE - EP1692182 B1 65
retseptorite seondumist antikehade konstantse piirkonnaga (Fc). Deo et al.,
Immunology Today 18:127 (1997).
Erinevaks, kuid samas komplementaarseks meetodiks konjugeerimata IgG1
ADCC aktiivsuse suurendamiseks on antikeha Fc piirkonna muundamine. Valgu
muundamisuuringud on näidanud, et FcγR omab vastastikmõju IgG CH2 domeeni 5
madalama liigendpiirkonnaga. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996). Kuid
FcγR seondumine nõuab samuti CH oleva konserveeritud Asn 297 külge
kovalentselt kinnitatud oligosahhariidide olemasolu. Lund et al., J. Immunol.
157:4963-69 (1996); Wright ja Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), mis
võimaldab eeldada, et nii oligosahhariid kui ka polüpeptiid on mõlemad 10
vastastiktoime piirkonnaga seotud või on oligosahhariidi vaja aktiivse CH2
polüpeptiidi konformatsiooni säilitamiseks. Oligosahhariidi struktuuri
modifikatsiooni saab seega uurida kui vahendit vastastiktoime afiinsuse
suurendamiseks.
IgG molekul kannab oma Fc piirkonnas kahte N-aheldatud oligosahhariidi – üks 15
mõlemal raskel ahelal. Nagu iga glükovalk, toodetakse ka antikehad glükovormide
populatsioonina, mis omavad sama polüpeptiidist alustala, kuid
glükosüülimissaitide külge on kinnitatud erinevad oligosahhariidid. Seerumi IgG Fc
piirkonnas tavaliselt leiduvad oligosahhariidid on biantennaarsed kompleksid
(Wormald et al., Biochemistry 36:130-38 (1997)), millel on otsmise siaalhappe ja 20
poolitava N-atsetüülglükoosamiini (GlcNac) madalad tasemed ning erinevad
otsmise galaktosüülimise ja tuuma fukosüülimise tasemed. Mõningad uuringud
võimaldavad soovitada, et FcγR seondumiseks vajalik minimaalne süsivesiku
struktuur peitub oligosahhariidi tuumas. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69
(1996). 25
Tööstuses ja konjugeerimata terapeutiliste mAb tootmisuuringutes kasutatud
hiirtelt ja hamstritelt deriveeritud rakuliinid kinnitavad tavaliselt vajalikud
oligosahhariidi määrajad Fc saitidele. Kuid nendes rakkudes avaldatud IgG
puudub poolitav GlcNac, mida leidub väikeses koguses seerumi IgG. Lifely et al.,
Glycobiology 318:813-22 (1995). Samas hiljuti täheldati, et roti müeloomiga 30
toodetud inimese jaoks kohandatud IgG1 (CAMPATH-1H) omas mõningates oma
glükovormides poolitavat GlcNAc. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995).
EE - EP1692182 B1 66
Roti rakust deriveeritud antikeha saavutas sarnase maksimaalse in vitro ADCC
aktiivsuse kui standardsete rakuliinide poolt toodetud CAMPATH-1H antikehad,
kuid märgatavalt madalamatel antikeha kontsentratsioonidel.
CAMPATH antigeeni leidub tavaliselt kõrgetel tasemetel lümfoomi rakkudes ja
kimäärsel mAb on poolitava GlcNAc puudumisel suur ADCC aktiivsus. Lifely et al., 5
Glycobiology 318:813-22 (1995). N-aheldatud glükosüülimisrada (poolitav GlcNAc)
lisatakse GnTIII poolt. Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986).
Varasemates uuringutes kasutati ühte antikeha tootvat CHO rakuliini, mida oli
eelnevalt kloonitud GnTIII geeni ensüümi erinevate tasemete avaldamiseks väliselt
reguleeritud viisil muundatud (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 10
(1999)). See meetod lõi esimest korda jäiga korrelatsiooni GnTIII ekspressiooni ja
modifitseeritud antikeha ADCC aktiivsuse vahel. Seega sisaldab leiutise süsteem
rekombinantset kimäärset antikeha või selle fragmenti, millel on hiire B-Ly1
antikeha sidumisspetsiifilisus ja suurenenud GnTIII aktiivsusest tingitud muudetud
glükosüülimisomadused. Suurenenud GnTIII aktiivsus põhjustab ABM Fc 15
piirkonnas nii poolitatud oligosahhariidide protsendi suurenemise kui ka fukoosi
jääkide protsendi vähenemise. Sellel antikehal või selle fragmendil on suurenenud
Fc retseptori sidumisafiinsus ja suurenenud efektori funktsioon. Lisaks seondub
leiutis antikeha fragmendi ja fusioonvalkudega, mis sisaldavad immunoglobuliinide
Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda. 20
Vastavalt käesoleva leiutise meetoditele valmistatud ABM terapeutiline
kasutamine
Käesoleva leiutise ABM võib kasutada iseseisvalt tuumorirakkude leidmiseks ja
hävitamiseks in vivo. ABM võib samuti kasutada koos sobiva terapeutilise ainega
inimese kartsinoomi ravimiseks. Näiteks võib ABM kasutada kombineeritult 25
standardsete või tavapäraste ravimeetoditega nagu kemoteraapia, kiiritusravi või
konjugeerida või aheldada terapeutilise aine transportimiseks kartsinoomi
asukohta nii terapeutilise ravimi või toksiini kui ka lümfokiini või tuumorit
inhibeeriva kasvufaktoriga. Esmase tähtsusega käesoleva leiutise ABM
konjugaatideks on (1) immunotoksiinid (ABM ja tsütotoksilise fragmendi 30
konjugaadid) ja (2) märgistatud (näiteks radiomärgistatud, ensüüm-märgistatud või
EE - EP1692182 B1 67
fluorokroom-märgistatud) ABM, kus märgis loob vahendid märgistatud ABM
sisaldavate immuunsuskomplekside tuvastamiseks. ABM võib samuti kasutada
lahustuse indutseerimiseks läbi loodusliku kromosoomistikprotsessi ja
vastastiktoimeks tavaliselt esinevate antikehast sõltuvate tsütotoksiliste
rakkudega. 5
Immunotoksiini tsütotoksiliseks fragmendiks võib olla tsütotoksiline ravim või
bakteritelt või taimedelt pärinev ensümaatiliselt aktiivne toksiin või sellise toksiini
ensümaatiliselt aktiivne fragment („A ahel“). Kasutatavateks ensümaatiliselt
aktiivseteks toksiinideks või nende fragmentideks on difteeria A ahel,
difteeriatoksiini mittesiduvad aktiivsed fragmendid, eksotoksiini A ahel (pärineb 10
Pseudomonas aeruginosa), ritsiini A ahel, abriini A ahel, modeksiini A ahel, alfa-
sartsiin, Aleurites fordii valgud, diantiini valgud, Phytolacca americana valgud
(PAPI, PAPII ja PAP-S), momordica charantia inhibiitor, kurtsiin, krotiin,
sapaonaria officinalis inhibiitor, geloniin, mitogeliin, restriktotsiin, fenomütsiin ja
enomütsiin. Ühes muus teostuses on ABM konjugeeritud väikese molekuliga 15
kasvajavastaste ravimitega. ABM ja selliste tsütotoksiliste fragmentide
konjugaadid valmistatakse erinevaid bifunktsionaalseid valke siduvaid aineid
kasutades. Selliste reagentide näideteks on SPDP, IT, imidoestrite
bifunktsionaalsed derivaadid nagu dimetüüladipimidaat, HCl, aktiivsed estrid nagu
disukinimidüülsuberaat, aldehüüdid nagu glutaaraldehüüd, bis-asidoühendid nagu 20
bis(p-asidobensoüül)heksaandiamiin, bis-diasooniumi derivaadid nagu bis-(p-
diasooniumbensoüül)-etüleendiamiin, diisotsüanaadid nagu tolüleen 2,6-
diisotsüanaat ja bis-aktiivsed fluori ühendid nagu 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenseen.
Toksiini lahustava osa võib ühendada ABM Fab fragmendiga. Täiendavad sobivad
toksiinid on valdkonnas teada, millele aitab kinnitust leida näiteks publitseeritud 25
USA patenditaotlus nr. 2002/0128448.
Ühes teostuses konjugeeritakse kimäärne glükomuundatud ABM, millel on üldiselt
sama sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal, ritsiini A ahelaga. Kõige
eelistatumalt on ritsiini A ahel deglükosüülitud ja valmistatud rekombinantsete
vahenditega. Eelistatud meetodit ritsiini immunotoksiini valmistamiseks on 30
kirjeldanud Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987).
EE - EP1692182 B1 68
Kasutatuna inimese kasvajarakkude hävitamiseks in vitro diagnostilistel
eesmärkidel, lisatakse konjugaadid tavaliselt rakukultuuri söötmele
kontsentratsiooniga vähemalt umbes 10 nM. In vitro kasutamisel ei ole koostis ja
manustamisviis kriitilise tähtsusega. Tavaliselt kasutatakse veelisi koostisi, mis
sobivad perfusioonisöötme kultuuriga. Kasvaja olemasolu või leviku astme 5
mõõtmisel võib tsütotoksilisuse mõõta tavapäraste tehnikatega.
Nagu eelnevalt mainitud, võib kasvaja ravimiseks mõeldud tsütotoksilise
radiofarmatseutilise aine valmistada, konjugeerides radioaktiivse isotoobi (näiteks
I, Y, Pr) kimäärse glükomuundatud ABM, millel on üldiselt sama
sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal. Mõiste „tsütotoksiline fragment“ on 10
siin kasutatuna mõeldud selliseid isotoope hõlmama.
Ühes muus teostuses täidetakse liposoomid tsütotoksilise ravimiga ja kaetakse
seejärel käesoleva leiutise ABM. Kuna pahaloomulise B raku pinnal on palju CD20
molekule, võimaldab see meetod suure koguse ravimi transportimist õigesse
rakutüüpi. 15
Tehnikad selliste terapeutiliste ainete konjugeerimiseks antikehadega on hästi
teada (vaadake näiteks Amon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting
of Drugs in Cancer Therapy", teoses Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,
Reisfeld et al. (eds.), lk 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al.,
"Antibodies For Drug Delivery", teoses Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), 20
Robinson et al. (eds.), lk 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody
Carriers Of Cytotoxic Agents teoses Cancer Therapy: A Review", teoses
Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.
(eds.), lk 475-506 (1985); ja Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic
Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)). 25
Veel üks leiutise ABM terapeutiline rakendusviis hõlmab konjugatsiooni või
aheldust (näiteks rekombinantse DNA tehnikatega) ensüümiga, mis on võimeline
muundama eelravimi tsütotoksiliseks ravimiks ning nimetatud antikeha-ensüümi
konjugaadi kasutamist kombineeritult eelravimiga, et muuta eelravim tuumori
piirkonnas tsütotoksiliseks ravimiks (vaadake näiteks Senter et al., "Anti-Tumor 30
Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-46
EE - EP1692182 B1 69
(1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of
Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-
Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); ja
Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates:ANewApproach
to Cancer Therapy, "FASEBJ. 4:188-193 (1990)). 5
Veel üks leiutise ABM terapeutiline kasutus hõlmab tuumorirakkude eemaldamist
kasvajaga patsientide luuüdist kas konjugeerimata kujul (komplemendi
juuresolekul) või antikeha-ravimi või antikeha-toksiini konjugaadi osana. Vastavalt
sellele meetodile võib autoloogse luuüdi puhastada ex vivo läbi ravi antikehaga ja
seejärel infundeeritakse luuüdi patsiendile tagasi [vaadake näiteks Ramsay et al., 10
"Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-
88 (1988)].
Lisaks vaadeldakse, et leiutis sisaldab ühe ahelaga immunotoksiini, mis sisaldab
antigeeni siduvaid domeene, mis omakorda võimaldavad üldiselt sama
sidumisspetsiifilisust kui hiire B-Ly1 antikeha (näiteks polüpeptiid, mis sisaldab 15
hiire B-Ly1 antikeha CDR) ja sisaldavad täiendavalt toksiini polüpeptiidi. Leiutise
ühe ahelaga immunotoksiine võib kasutada inimeste kartsinoomide ravimiseks in
vivo.
Sarnaselt võib inimese kartsinoomi in vivo ravimiseks kasutada fusioonvalku, mis
sisaldab vähemalt leiutise ABM antigeeni siduvat piirkonda, mis on liidetud 20
vähemalt tuumorivastase aktiivsusega teise valgu funktsionaalselt aktiivse osaga
(näiteks lümfokiin või onkostatiin).
Käesolevat leiutist saab kasutada CD20 avaldavate tuumorirakkude selektiivseks
hävitamiseks. Nimetatud meetod hõlmab leiutise immunokonjugaadi (näiteks
immunotoksiin) reageerimist nimetatud tuumorirakkudega. Need tuumorirakud 25
võivad pärineda inimese kartsinoomist.
Lisaks võib leiutist kasutada kartsinoomide (näiteks inimese kartsinoomid)
ravimiseks in vivo. See meetod hõlmab patsiendile farmatseutiliselt efektiivse
koguse koostise, mis sisaldab vähemalt ühte leiutise immunokonjugaatidest
(näiteks immunotoksiin), manustamist. 30
EE - EP1692182 B1 70
Täiendava teostusena võib leiutist kasutada täiustatud meetodis B raku
proliferatiivsete häirete (näiteks B raku lümfoom) ja autoimmuunse haiguse, mis
on tekkinud täielikult või osaliselt patogeensete autoantikehade tõttu, ravimiseks
läbi B rakkude eemaldamise; nimetatud meetod hõlmab seda vajavale
inimpatsiendile terapeutiliselt efektiivse koguse käesoleva leiutise ABM 5
manustamist. ABM on glükomuundatud anti-CD20 antikeha, mille
sidumisspetsiifilisus on üldiselt sarnane hiire B-Ly1 antikeha vastavate näitajatega;
nimetatud antikeha on inimese jaoks kohandatud. Autoimmuunhaiguste või -
häirete näited hõlmavad, olemata nendega piiratud, immuun-vahendatud
trombotsütopeeniaid nagu akuutne idiopaatiline trombotsütopeeniline purpur ja 10
krooniline idiopaatiline trombotsütopeeniline purpur, dermatomüosiit, Sydenhami
korea, luupusnefriit, reumaatiline palavik, polüglandulaarsed sündroomid, Henoch-
Schonleini purpur, streptokokk-infektsiooni järgne nefriit, sõlmjas erüteem,
Takayasu arteriit, Addisoni tõbi, multiformne erüteem, nodoosne polüartriit,
anküloseeriv spondüliit, Goodpasture sündroom, oblitereeriv endarteriit, primaarne 15
biliaarne tsirroos, Hashimoto türeoidiit, türeotoksikoos, krooniline aktiivne hepatiit,
polümüosiit/dermatomüosiit, polükondriit, harilik villtõbi, Wegeneri granulomatoos,
membraani nefropaatia, amüotroofiline lateraalskleroos, seljaajukuive,
polümüalgia, kahjulik aneemia, kiiresti süvenev glomerulonefriit ja fibroseeruv
alveoliit, põletikulised reageeringud nagu põletikulised nahahaigused, k.a psoriaas 20
ja dermatiit (näiteks atoopiline dermatiit); süsteemne sklerodermia ja skleroos;
põletikulise soolehaigusega seonduvad reageeringud (nagu Crohni tõbi ja
haavandiline koliit); respiratoorse distressi sündroom (k.a täiskasvanu
respiratoorse distressi sündroom; ARDS); dermatiit; meningiit; entsefaliit;
soonkestapõletik; jämesoolepõletik; glomerulonefriit; allergilised seisundid nagu 25
ekseem ja astma ning muud seisundid, mis hõlmavad T rakkude sissetungi ja
kroonilisi põletikulisi reageeringuid; ateroskleroos; leukotsüüdi kleepumishäire;
reumaatiline artriit; süsteemne erütematoosne luupus (SLE); diabeet (näiteks
esimest tüüpi diabeet või insuliinist sõltuv diabeet); sclerosis multiplex; Reynaud
sündroom; autoimmuunne türoidiit; allergiline entsefalomüeliit; Sjörgeni sündroom; 30
raske suhkrutõbi varajase algusega; ja immuunreageeringud, mis seonduvad
tsütokiinide ning T-lümfotsüütide vahendatud akuutse ja viivitatud ülitundlikkusega
ja mis esinevad tavaliselt koos tuberkuloosi, sarkoidoosi, polümüosiidi,
EE - EP1692182 B1 71
granulomatoosi ja vaskuliidiga; pahaloomuline aneema (Addisoni tõbi); haigused,
mis hõlmavad leukotsüüdi diapedeesi; kesknärvisüsteemi (KNS) põletikuline häire;
mitme organi vigastussündroom; hemolüütiline aneemia (k.a, olemata samas
nendega piiratud krüoglobineemia või Coombsi positiivne aneemia); raskekujuline
müasteenia; antigeen-antikeha kompleksi vahendatud haigused; Goodpasture´i 5
sündroom; antifosfolipiidi sündroom; allergiline neuriit; Gravesi tõbi; Lambert-
Eatoni sündroom; bulloosne pemfigoid; pemfigus; autoimmuunne
polüendokrinopaatia; Reiteri tõbi; kangestunud mehe sündroom; Behceti tõbi;
hiidraku artriit; immuunkompleksi nefriit; IgA nefropaatia; IgM polüneuropaatiad;
immuunne trombotsütopeeniline purpur (ITP) või autoimmuunne 10
trombotsütopeenia jne. Selles leiutise teostuses kasutatakse leiutise ABM B
rakkude hulga vähendamiseks veres pikendatud perioodi jooksul.
Vastavalt käesoleva leiutise tavale võivad patsientideks olla inimesed, hobused,
sead, veised, hiired, koerad, kassid ja linnud. Käesoleva leiutisega on samuti
hõlmatud muud soojaverelised loomad. 15
Käesolevat leiutist saab kasutada meetodites inimese tuumorirakkude kasvu
inhibeerimiseks, tuumori ravimiseks patsiendil ja proliferatiivse haiguse ravimiseks
patsiendil. Need meetodid hõlmavad patsiendile efektiivse koguse leiutise ühendi
manustamist.
Seega on mõistetav, et käesolev leiutis hõlmab ravimkoostisi, kombinatsioone ja 20
meetodeid inimeste kartsinoomide (näiteks B raku lümfoom) ravimiseks. Leiutis
hõlmab näiteks inimese kartsinoomide ravimiseks kasutatavaid ravimkoostisi, mis
koosnevad farmatseutiliselt efektiivsest kogusest käesoleva leiutise antikehast ja
farmatseutiliselt aktsepteeritavast kandurist.
Käesoleva leiutise ABM koostised saab manustada tavapäraseid manustamisviise 25
kasutades, k.a (olemata samas nendega piiratud) intravenoosne,
intraperitoneaalne, suukaudne, intralümfaatiline või otse kasvajasse manustamine.
Eelistatud on intravenoosne manustamine.
Ühes leiutise teostuses valmistatakse leiutise ABM sisaldavad ravimkoostised
hoiustamiseks, segades soovitud puhtusastmega antikeha valikuliste 30
EE - EP1692182 B1 72
farmatseutiliselt aktsepteeritavate kandurite, ekstsipientide või stabilisaatoritega
(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))
lüofiliseeritud koostiste või vesilahuste vormis. Sobivad kandurid, ekstsipiendid või
stabilisaatorid on patsientidele kasutatud dooside ja kontsentratsioonide juures
mittetoksilised ning hõlmavad ühendeid, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad 5
puhvrid nagu fosfaat, tsitraat ja muud orgaaniliste hapete soolad; antioksüdandid
nagu askorbiinhape ja metioniin; säilitusained (näiteks
oktadetsüüldimetüülbensüül-ammooniumkloriid; heksametooniumkloriid;
bensalkooniumkloriid, benetooniumkloriid; fenool-, butüül- või bensüülalkohol);
alküülparabeenid nagu metüül- või propüülparabeen; katehhool; resortsinool; 10
tsükloheksanool; 3-pentanool; ja m-kresool); madala molekulmassiga (vähem kui
umbes 10 jääki) polüpeptiidid; valgud nagu seerumalbumiin, želatiin või
immunoglobuliinid; hüdrofiilsed polümeerid nagu polüvinüülpürrolidoon;
aminohapped nagu glütsiin, glutamiin, asparagiin, histidiin, arginiin või lüsiin;
monosahhariidid, disahhariidid ja muud süsivesikud, k.a glükoos, mannoos või 15
dekstriinid; kelaativad ained nagu EDTA; suhkrud nagu sahharoos, mannitool,
trehaloos või sorbitool; soolasid moodustavad vastasioonid nagu naatrium;
metallkompleksid (näiteks Zn-valgu kompleksid); ja/või mitteioonsed pindaktiivsed
ained nagu TWEEN™, PLURONICS™ või polüetüleenglükool (PEG).
Näitlikke anti-CD20 ABM koostisi on kirjeldatud patendis WO98/56418. Selles 20
publikatsioonis kirjeldatakse vedelat mitut doosi sisaldavat koostist, mis sisaldab
40 mg/ml kohta rituximab, 25 mM atsetaati, 150 mM trehaloosi, 0,9%
bensüülakoholi ja 0,02% polüsorbaat 20; koostise pH tase on 5,0 ja minimaalseks
hoiustusperioodiks temperatuuril 2 - 8 oC on kaks aastat. Veel üks huvi pakkuv
anti-CD20 koostis sisaldab 10 mg/ml rituximab lahust, mis koosneb 9,0 mg/ml 25
kohta naatriumkloriidist, 7,35 mg/ml kohta naatriumtsitraadi dihüdraadist, 0,7
mg/ml kohta polüsorbaat 80 ja süstimiseks mõeldud steriilsest veest; lahuse pH on
6,5. Käesolevas leiutises asendatakse RITUXAN® käesoleva leiutise ABM.
Subkutaanseks manustamiseks kohandatud lüofiliseeritud koostisi on kirjeldatud
patendis WO 97/04801. Sellised lüofiliseeritud koostised võib taastada sobiva 30
lahjendi abil suure valgukontsentratsioonini ja taastatud koostise võib manustada
subkutaanselt selle abil ravitavale imetajale.
EE - EP1692182 B1 73
Siin kirjeldatud koostis võib samuti sisaldada vajaduse korral konkreetse häire
ravimiseks rohkem kui ühte aktiivühendit ja eelistatud on ühendid, mille täiendavad
aktiivsused ei mõjuta üksteist ebasobival viisil. Näiteks võib olla soovitav lisada
täiendav tsütotoksiline aine, kemoterapeutiline aine, tsütokiin või immuunvastust
mahasuruv aine (näiteks aine, mis toimib T rakkudel (tsüklosporiin) või T rakke 5
siduv antikeha nagu LFA-1 siduv antikeha). Selliste muude ainete efektiivne kogus
sõltub koostises oleva antagonisti kogusest, ravitava haiguse või häire tüübist ja
muudest eelnevalt mainitud faktoritest. Täiendavaid ühendeid kasutatakse üldiselt
samade dooside ja samade manustamisviisidega kui siin eelnevalt mainitud või
vahemikus 1 kuni 99% siin eelnevalt rakendatud doosi suurustest. 10
Aktiivained võib samuti sulgeda mikrokapslitesse, mis on valmistatud näiteks
koagulatsioonitehnikate või pindaktiivse polümerisatsiooniga, näiteks
hüdroksümetüültselluloosist või želatiinist mikrokapslid ja polü-
(metüülmetatsülaadi) mikrokapslid vastavalt kolloidsetes ravimi
transportimissüsteemides (näiteks liposoomid, albumiini mikrosfäärid, 15
mikroemulsioonid, nanoosakesed ja nanokapslid) või makroemulsioonides.
Sellised tehnikad on avaldatud teoses Remington’s Pharmaceutical Sciences 16h
edition, Osol, A. Ed. (1980).
Valmistada võib ka pideva vabanemisega preparaadid. Pideva vabanemisega
koostiste sobivad näited hõlmavad antagonisti sisaldavate tahkete hüdrofoobsete 20
polümeeride poolläbitavaid maatrikseid ja nimetatud maatriksid on vormitud kujul,
näiteks kiled või mikrokapslid. Pideva vabanemisega maatriksite näideteks on
polüestrid, hüdrogeelid (näiteks polü(2-hüdroksüetüülmetakrülaat) või
polü(vinüülalkohol)), polülaktiidid (USA patent nr. 4 774 919), L-glutaamhappe ja
γ-etüül-L-glutamaadi kopolümeerid, lagunematu etüleenvinüülatsetaat, lagunevad 25
piimhappe-glükoolhappe kopolümeerid nagu LUPRON DEPOT™ (süstitavad
mikrosfäärid, mis koosnevad piimhappe-glükoolhappe kopolümeerist ja
leuproliidatsetaadist) ja polü-D-(-)-3-hüdroksübutüürhape.
In vivo manustamiseks kasutatavad ravimkoostised peavad olema steriilsed. See
on kergesti saavutatav filtreerimisega läbi steriilsete filtreerimismembraanide. 30
EE - EP1692182 B1 74
Leiutise koostised võivad esineda erinevates doseerimisvormides, mis hõlmavad,
olemata nendega piiratud, vedelaid lahuseid või suspensioone, tablette, pille,
pulbreid, ravimküünlaid, polümeerseid mikrokapsleid või mikropõiekesi, liposoome
ja süstitavaid või sulamatuid lahuseid. Eelistatud vorm sõltub manustamisviisist ja
terapeutilisest rakendamisest. 5
Leiutise koostised sisaldavad samuti eelistatult tavapäraseid praktikas teada
olevaid farmatseutiliselt aktsepteeritavaid kandureid ja abiaineid nagu inimese
seerumalbumiin, ioonivahetajad, alumiinium, letsitiin, puhverained nagu fosfaadid,
glütsiin, sorbhape, kaaliumsorbaat ja soolad või elektrolüüdid nagu
protamiinsulfaat. 10
Käesoleva leiutise ravimkoostiste kõige efektiivsem manustamis- ja
doseerimisrežiim sõltuvad haiguse tõsisusest ja käigust, patsiendi tervislikust
seisundist ja reageeringust ravile ning raviarsti otsusest. Seega tuleks koostiste
doosid iga patsiendi jaoks eraldi tiitrida. Hoolimata sellest jääb leiutise koostiste
efektiivne doos üldiselt vahemikku umbes 0,01 kuni umbes 2000 mg/kg kohta. 15
Siin kirjeldatud molekulid võivad olla erinevates doseerimisvormides, mis
hõlmavad, olemata nendega piiratud, vedelaid lahuseid või suspensioone, tablette,
pille, pulbreid, ravimküünlaid, polümeerseid mikrokapsleid või mikropõiekesi,
liposoome ja süstitavaid või sulamatuid lahuseid. Eelistatud vorm sõltub
manustamisviisist ja terapeutilisest rakendamisest. 20
Käesoleva leiutise ABM sisaldav koostis formuleeritakse, doseeritakse ja
manustatakse viisil, mis vastab heale meditsiinilisele tavale. Selles kontekstis on
kaalumist vajavateks faktoriteks konkreetne ravitav haigus või häire, konkreetne
ravitav patsient, patsiendi kliiniline seisund, haiguse või häire põhjus, aine
transportimispiirkond, manustamismeetod, manustamisgraafik ja muud 25
meditsiinitöötajatele teada olevad faktorid. Manustatava antagonisti terapeutiliselt
efektiivne kogus sõltub sellistest asjaoludest.
Üldise soovitusena jääb parenteraalselt manustatud antikeha terapeutiliselt
efektiivne kogus doseerimisel vahemikku 0,1 kuni 20 mg/kg patsiendi kehamassi
EE - EP1692182 B1 75
kohta päevas ja kasutatava antagonisti algne tase jääb tavaliselt vahemikku
umbes 2 kuni 10 mg/kg kohta.
Ühes eelistatud teostuses on ABM antikeha ja eelistatult inimese jaoks
kohandatud antikeha. Sellise konjugeerimata antikeha sobivad doosid jäävad
näiteks vahemikku umbes 20 mg/m2 kuni umbes 1000 mg/m2. Ühes teostuses 5
erineb antikeha doos doosist, mis on üldiselt soovitatud RITUXAN® jaoks. Näiteks
võib patsiendile manustada ühe või mitu antikeha doosi, mis on väiksemad kui 375
mg/m2 koha, näiteks jäävad doosid vahemikku umbes 20 mg/m2 kuni umbes 250
mg/m2 kohta, näiteks vahemikku umbes 50 mg/m2 kuni umbes 200 mg/m2.
Lisaks võib manustada ühe või mitu algset antikeha doosi ja sellele järgnevalt ühe 10
või rohkem järgnevat doosi, kus mg/m2 antikeha doos järgnevates doosides ületab
algse doosi antikeha mg/m2 näitaja. Näiteks võib algne doos jääda vahemikku
umbes 20 mg/m2 kohta kuni umbes 250 mg/m2 kohta (näiteks umbes 50 mg/m2
kohta kuni umbes 200 mg/m2 kohta) ja järgnev doos võib jääda vahemikku umbes
250 mg/m2 kohta kuni umbes 1000 mg/m2 kohta. 15
Kuid nagu eelnevalt mainitud, on need soovitatud ABM kogused suuresti
terapeutilise valikuvabaduse poolt mõjutatavad. Võtmetähtsusega faktoriks sobiva
doosi ja graafiku valimisel on saadud tulemus (vaadake eelnevalt). Näiteks
süvenevate ja akuutsete haiguste ravimisel võib algselt vaja minna suhteliselt
kõrgemaid doose. Sõltuvalt haigusest või häirest kõige efektiivsemata tulemuste 20
saamiseks manustatakse antagonist võimalikult kiiresti pärast haiguse või häire
esimest märki, diagnoosi, ilmnemist või esinemist või haiguse või häire remissiooni
käigus.
Käesoleva leiutise ABM manustatakse mistahes sobival viisil, k.a parenteraalne,
subkutaanne, intraperitoneaalne, intrapulmonaarne ja intranasaalne manustamine 25
ja kui lokaalse immuunvastust mahasuruva ravi jaoks on vajalik, siis ka
intralesionaalne manustamine. Parenteraalsed infusioonid hõlmavad
intramuskulaarset, intravenoosset, intraarteriaalset, intraperitoneaalset või
subkutaanset manustamist. Lisaks võib antagonisti manustada sobivuse korral
impulss-infusiooniga, kasutades näiteks antagonisti vähenevaid doose. Eelistatult 30
toimub doseerimine süstidega ja kõige eelistatumalt intravenoossete või
EE - EP1692182 B1 76
subkutaansete süstidega sõltuvalt sellest, kas manustamine on lühiajaline või
krooniline.
Koos siin kirjeldatud antagonistidega võib manustada ka muud ühendid nagu
tsütotoksilised ained, kemoterapeutilised ained, immuunvastust mahasuruvad
ained ja/või tsütokiinid. Kombineeritud manustamine hõlmab kaasmanustamist 5
eraldi koostisi või ühte ravimkoostist kasutades ja üksteisele järgnevat
manustamist mistahes järjekorras, kus eelistatult esineb ajavahemik, kus mõlemad
(või kõik) aktiivained avaldavad oma bioloogilisi aktiivsusi samaaegselt.
On selge, et graafiku optimeerimiseks võib leiutise koostise doosi, mis on raviks
vajalik, täiendavalt vähendada. 10
Vastavalt leiutise tavale võib farmatseutiliseks kanduriks olla lipiidist kandur.
Lipiidist kanduriks võib olla fosfolipiid. Lisaks võib lipiidist kanduriks võib olla
rasvahape. Lipiidist kanduriks võib olla ka pesuaine. Siin kasutatuna on
pesuaineks mistahes aine, mis muudab vedeliku pindpinevust, seda tavaliselt
vähendades. 15
Ühes leiutise näites võib pesuaineks olla mitteioonne pesuaine. Mitteioonsete
pesuainete näited hõlmavad, olemata samas nendega piiratud, polüsorbaat 80
(teada ka kui Tween 80 või (polüoksüetüleensorbitanmonooleaat), Brij ja Triton
(näiteks Triton WR-1339 ja Triton A-20).
Alternatiivina võib pesuaineks olla ioonne pesuaine. Ioonse pesuaine näiteks on 20
alküültrimetüülammooniumbromiid, olemata samas sellega piiratud.
Lisaks võib lipiidist kandur olla vastavalt leiutisele liposoom. Käesolevas
dokumendis kasutatuna on „liposoomiks“ mistahes membraaniga seotud põieke,
mis sisaldab leiutise mistahes molekule või nende kombinatsioone.
Järgnevatest teostustes on mainitud spetsiifilisi teostusi, mis on olulised: 25
Punkt 1: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:
a. järjestusest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:
6 ja SEQ ID NO: 7; ja
EE - EP1692182 B1 77
b. järjestusest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 21, SEQ ID
NO: 22 ja SEQ ID NO: 23; ja
c. SEQ ID NO: 24.
Punkt 2: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ja
SEQ ID NO: 10. 5
Punkt 3: punktile 1 või punktile 2 vastav eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib
fusioonpolüpeptiidi.
Punkt 4: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 3.
Punkt 5: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 4.
Punkt 6: punktile 4 või punktile 5 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud 10
polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi.
Punkt 7: eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on vähemalt 80% ulatuses
identne SEQ ID NO: 3; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib
fusioonpolüpeptiidi.
Punkt 8: eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on vähemalt 80% ulatuses 15
identne SEQ ID NO: 4; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib
fusioonpolüpeptiidi.
Punkt 9: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:
a. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi järjestusega SEQ ID NO: 1; ja
b. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc 20
piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt.
Punkt 10: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:
a. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi järjestusega SEQ ID NO: 2; ja
b. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc
piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt. 25
EE - EP1692182 B1 78
Punkt 11: eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID NO: 1 järjestust omavat
polüpeptiidi.
Punkt 12: eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID NO: 2 järjestust omavat
polüpeptiidi.
Punkt 13: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 11. 5
Punkt 14: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 12.
Punkt 15: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 80%
ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12.
Punkt 16: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 85%
ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12. 10
Punkt 17: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 90%
ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12.
Punkt 18: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 95%
ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12.
Punkt 19: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 99% 15
ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12.
Punkt 20: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 13 (raske ahel aa)
polüpeptiidi kodeerivat järjestust.
Punkt 21: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 14 (kerge ahel aa)
polüpeptiidi kodeerivat järjestust. 20
Punkt 22: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:
a. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille VH piirkond pärineb hiire B-Ly1
antikehalt või selle variantidelt; ja
b. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc
piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt. 25
Punkt 23: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:
EE - EP1692182 B1 79
a. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille VL piirkond pärineb hiire B-Ly1
antikehalt või selle variantidelt; ja
b. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc
piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt.
Punkt 24: ekspressioonivektor, mis koosneb mistahes punktile 1 kuni 23 vastavast 5
eraldatud polünukleotiidist.
Punkt 25: punkti 24 vektor, kus nimetatud vektor on paljutsistroniline.
Punkt 26: punktile 24 vastavat ekspressioonivektorit sisaldav peremeesrakk.
Punkt 27: peremeesrakk, mis koosneb mistahes punktile 1 kuni 23 vastavast
eraldatud polünukleotiidist. 10
Punkt 28: polüpeptiid, mis sisaldab hiire B-Ly1 antikehast deriveeritud järjestust ja
heteroloogsest polüpeptiidist deriveeritud järjestust.
Punkt 29: punkti 28 polüpeptiidi sisaldav antigeeni siduv molekul.
Punkt 30: punktile 29 vastav antigeeni siduv molekul, mis seob inimese CD20.
Punkt 31: punktile 29 vastav antigeeni siduv molekul, milleks on antikeha. 15
Punkt 32: punktile 31 vastav antigeeni siduv molekul, milleks on kimäärne
antikeha.
Punkt 33: punktile 31 vastav antigeeni siduv molekul, milleks on inimese jaoks
kohandatud antikeha.
Punkt 34: punktile 31 vastav antigeeni siduv molekul, milleks on primaatide jaoks 20
kohandatud antikeha.
Punkt 35: kimäärne antikeha, mis sisaldab SEQ ID NO: 1 järjestust või selle
varianti.
Punkt 36: kimäärne antikeha, mis sisaldab SEQ ID NO: 2 järjestust või selle
varianti. 25
EE - EP1692182 B1 80
Punkt 37: kimäärne polüpeptiid, mis koosneb:
d. polüpeptiidist, mille järjestus on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO:
15, SEQ ID NO: 16 ja SEQ ID NO: 17; ja
e. polüpeptiidist, mille järjestus on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO:
25, SEQ ID NO: 26 ja SEQ ID NO: 27; ja 5
f. SEQ ID NO: 28.
Punkt 38: punktile 37 vastav kimäärne polüpeptiid, mis koosneb täiendavalt raske
ahela varieeruva piirkonna raamist, kus nimetatud raam sisaldab positsioonil 71
(vastavalt Kabat´ nummerdusele) alaniini jääki.
Punkt 39: punktile 37 vastav kimäärne polüpeptiid, mis koosneb täiendavalt raske 10
ahela varieeruva piirkonna raamist, kus nimetatud raam sisaldab positsioonil 94
(vastavalt Kabat´ nummerdusele) arginiini jääki.
Punkt 40: kimäärne polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ja
SEQ ID NO: 20.
Punkt 41: eraldatud polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 13 või selle varianti. 15
Punkt 42: eraldatud polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 14 või selle varianti.
Punkt 43: mistahes punktile 35 kuni 40 vastav eraldatud polüpeptiid, kus
nimetatud polüpeptiidiks on fusioonpolüpeptiid.
Punkt 44: antigeeni siduv molekul, mis sisaldab punkti 43 eraldatud polüpeptiidi.
Punkt 45: punkti 44 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks 20
molekuliks on antikeha.
Punkt 46: punkti 45 antikeha, kus nimetatud antikeha on primaadi jaoks
kohandatud antikeha.
Punkt 47: punkti 45 antikeha, kus nimetatud antikeha on inimese jaoks
kohandatud antikeha. 25
EE - EP1692182 B1 81
Punkt 48: punkti 44 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks
molekuliks on antikeha fragment.
Punkt 49: punkti 48 antikeha fragment, kus nimetatud antikeha fragment on
primaadi jaoks kohandatud.
Punkt 50: punkti 48 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antikeha fragment on 5
inimese jaoks kohandatud.
Punkt 51: antigeeni siduv molekul, mis on võimeline CD20 sidumisel hiire B-Ly1
antikehaga konkureerima ja nimetatud antigeeni siduv molekul on kimäärne.
Punkt 52: punkti 51 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks
molekuliks on antikeha. 10
Punkt 53: punkti 52 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antikeha on primaadi
jaoks kohandatud.
Punkt 54: punkti 51 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud rekombinantne
antikeha on inimese jaoks kohandatud.
Punkt 55: punkti 51 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud rekombinantne 15
antikeha sisaldab inimese Fc piirkonda.
Punkt 56: punkti 55 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud inimese Fc piirkonnaks
on inimese IgG Fc piirkond.
Punkt 57: mistahes punkti 29 kuni 34 või 44 kuni 56 antigeeni siduv molekul, kus
nimetatud antigeeni siduval molekulil on modifitseeritud oligosahhariididega Fc 20
piirkond.
Punkt 58: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc piirkonda
on modifitseeritud väiksemaks fukoosi jääkide sisalduseks võrreldes
modifitseerimata antigeeni siduva molekuliga.
Punkt 59: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc piirkonnal 25
on suurenenud poolitatud oligosahhariidide proportsioon.
EE - EP1692182 B1 82
Punkt 60: punktile 59 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud
modifitseeritud oligosahhariidideks on poolitatud kompleksid.
Punkt 61: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud
modifitseeritud oligosahhariididel on nimetatud antigeeni siduva molekuli Fc
piirkonnas suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon. 5
Punkt 62: punktile 61 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud poolitatud
fukosüülimata oligosahhariidideks on hübriidid.
Punkt 63: punktile 61 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud poolitatud
fukosüülimata oligosahhariidideks on kompleksid.
Punkt 64: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 20% nimetatud 10
polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja
fukosüülimata.
Punkt 65: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 30% nimetatud
polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja
fukosüülimata. 15
Punkt 66: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 35% nimetatud
polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja
fukosüülimata.
Punkt 67: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% nimetatud
polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja 20
fukosüülimata.
Punkt 68: meetod antigeeni siduva molekuli valmistamiseks, mis on võimeline
inimese CD20 seondumisel hiire B-Ly1 antikehaga konkureerima ja nimetatud
antigeeni siduv molekul on kimäärne; nimetatud meetod hõlmab:
a. punkti 26 või punkti 27 peremeesraku kultuuristamist söötmes tingimustel, mis 25
võimaldavad nimetatud antigeeni siduvat molekuli kodeeriva nimetatud
polünukleotiidi ekspressiooni;
b. nimetatud antigeeni siduva molekuli eraldamist moodustunud kultuurist.
EE - EP1692182 B1 83
Punkt 69: punkti 68 meetod, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on
antikeha.
Punkt 70: ravimkoostis, mis sisaldab mistahes punktile 29 kuni 34 või 46 kuni 67
vastavat antigeeni siduvat molekuli ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.
Punkt 71: punkti 70 ravimkoostis, kus nimetatud koostis sisaldab täiendavalt 5
farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.
Punkt 72: punkti 70 ravimkoostis, kus nimetatud koostis sisaldab täiendavalt
abiainet.
Punkt 73: meetod häire ravimiseks, mis on ravitav B rakkude hulga
vähendamisega ja kus nimetatud meetod hõlmab seda vajavale inimpatsiendile 10
mistahes punkti 70 kuni 72 ravimkoostise efektiivse koguse manustamist.
Punkt 74: peremeesrakk, mida on muundatud vähemalt ühe β(1,4)-N-
atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidi kodeeriva
nukleiinhappe avaldamiseks koguses, mis on piisav nimetatud peremeesraku
poolt toodetud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevate oligosahhariidide 15
modifitseerimiseks ja nimetatud polüpeptiidiks on mistahes punktile 44 kuni 67
vastav antigeeni siduv molekul.
Punkt 75: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud β(1,4)-N-
atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidiks on
fusioonpolüpeptiid. 20
Punkt 76: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks
on antikeha.
Punkt 77: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks
on antikeha fragment.
Punkt 78: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduv molekul sisaldab 25
piirkonda, mis on samaväärne inimese IgG Fc piirkonnaga.
EE - EP1692182 B1 84
Punkt 79: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud peremeesraku poolt toodetud
nimetatud antigeeni siduv molekul avaldab nimetatud modifikatsiooni tulemusel
suurenenud Fc retseptorit siduvat afiinsust.
Punkt 80: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud peremeesraku poolt toodetud
nimetatud antigeeni siduv molekul avaldab nimetatud modifikatsiooni tulemusel 5
suurenenud efektori funktsiooni.
Punkt 81: punkti 75 peremeesrakk, kus nimetatud fusioonpolüpeptiid sisaldab
β(1,4)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas III katalüseerivat domeeni.
Punkt 82: punkti 75 peremeesrakk, kus nimetatud fusioonpolüpeptiid sisaldab
täiendavalt heteroloogse Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni 10
domeeni.
Punkt 83: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni
domeeniks on mannosidaas II lokalisatsiooni domeen.
Punkt 84: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni
domeeniks on β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas I lokalisatsiooni 15
domeen.
Punkt 85: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni
domeeniks on β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas II lokalisatsiooni
domeen.
Punkt 86: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni 20
domeeniks on mannosidaas I lokalisatsiooni domeen.
Punkt 87: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni
domeeniks on α1-6tuuma fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen.
Punkt 88: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori
funktsiooniks on suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus. 25
Punkt 89: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori
funktsiooniks on suurenenud seondumine NK rakkudega.
EE - EP1692182 B1 85
Punkt 90: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori
funktsiooniks on suurenenud seondumine makrofaagidega.
Punkt 91: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori
funktsiooniks on suurenenud seondumine polümorftuumaste rakkudega.
Punkt 92: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori 5
funktsiooniks on suurenenud seondumine monotsüütidega.
Punkt 93: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori
funktsiooniks on suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene signalisatsioon.
Punkt 94: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori
funktsiooniks on suurenenud dendriitrakkude valmimine. 10
Punkt 95: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori
funktsiooniks on suurenenud T rakkude praimimine.
Punkt 96: peremeesrakk vastavalt punktile 79, kus nimetatud Fc retseptoriks on
Fcγ aktiveeriv retseptor.
Punkt 97: peremeesrakk vastavalt punktile 79, kus nimetatud Fc retseptoriks on 15
FcγRIIIA retseptor.
Punkt 98: peremeesrakk vastavalt punktile 74, kus nimetatud peremeesrakuks on
CHO rakk, BHK rakk, NSO rakk, SP2/0 rakk, YO müeloomi rakk, P3X63 hiire
müeloomi rakk, PER rakk, PER.C6 rakk või hübridoomrakk.
Punkt 99: punkti 74 peremeesrakk, mis sisaldab täiendavalt vähemalt ühte 20
transfekteeritud polünukleotiidi, mis kodeerib mistahes punktile 28 ja 35 kuni 41
vastavat polüpeptiidi ja nimetatud nukleiinhape sisaldab järjestust, mis kodeerib
inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda.
Punkt 100: peremeesrakk vastavalt punktile 74, kus nimetatud vähemalt üks
nukleiinhape, mis β(1,4)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega 25
polüpeptiidi kodeerib, on aheldatud operatiivselt konstitutiivse
promootorelemendiga.
EE - EP1692182 B1 86
Punkt 101: punkti 100 peremeesrakk, kus nimetatud β(1,4)-N-
atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidiks on
fusioonpolüpeptiid.
Punkt 102: meetod antigeeni siduva molekuli, mille peremeesrakus on
modifitseeritud oligosahhariidid, tootmiseks ja nimetatud meetod hõlmab: 5
a. peremeesraku, mida on muundatud vähemalt ühte β(1,4)-N-
atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsust omavat polüpeptiidi kodeeriva
nukleiinhappe avaldamiseks, kultuuristamist tingimustel, mis võimaldavad
nimetatud antigeeni siduva molekuli tootmist ja võimaldavad nimetatud antigeeni
siduva molekuli Fc piirkonnas olevate oligosahhariidide modifikatsiooni; ja 10
b. nimetatud antigeeni siduva molekuli eraldamist, kus nimetatud antigeeni siduv
molekul on võimeline CD20 seondumisel hiire B-Ly1 antikehaga konkureerima ja
kus nimetatud antigeeni siduv molekul või selle fragment on kimäärne.
Punkt 103: punkti 102 meetod, kus nimetatud modifitseeritud oligosahhariididel
võrreldes modifitseerimata oligosahhariididega väiksem fukosüülimisaste. 15
Punkt 104: punkti 102 meetod, kus nimetatud modifitseeritud oligosahhariidid on
hübriidid.
Punkt 105: punkti 102 meetod, kus nimetatud modifitseeritud oligosahhariidid on
kompleksid.
Punkt 106: punkti 102 meetod, kus nimetatud peremeesraku poolt valmistatud 20
nimetatud rekombinantsel antikehal või selle fragmendil on nimetatud polüpeptiidi
Fc piirkonnas suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon.
Punkt 107: punkti 106 meetod, kus nimetatud poolitatud ja fukosüülimata
oligosahhariidid on hübriidid.
Punkt 108: punkti 106 meetod, kus nimetatud poolitatud ja fukosüülimata 25
oligosahhariidid on kompleksid.
Punkt 109: punkti 102 meetod, kus vähemalt 20% nimetatud polüpeptiidi Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata.
EE - EP1692182 B1 87
Punkt 110: punkti 102 meetod, kus vähemalt 30% nimetatud polüpeptiidi Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata.
Punkt 111: punkti 102 meetod, kus vähemalt 35% nimetatud polüpeptiidi Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata.
Punkt 112: antigeeni siduv molekul, mida on muundatud suurema efektori 5
funktsiooni saavutamiseks ja mis on valmistatud mistahes punktile 102 kuni 111
vastava meetodiga.
Punkt 113: punkti 112 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks
molekuliks on antikeha.
Punkt 114: antikeha, mida on muundatud suurema Fc retseptori sidumisafiinsuse 10
saavutamiseks ja mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni 111 meetodiga.
Punkt 115: punkti 114 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks
molekuliks on antikeha.
Punkt 116: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud
suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud Fc vahendatud rakuline 15
tsütotoksilisus.
Punkt 117: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud
suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine NK rakkudega.
Punkt 118: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud
suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine makrofaagidega. 20
Punkt 119: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud
suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine monotsüütidega.
Punkt 120: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud
suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine polümorftuumaste
rakkudega. 25
Punkt 121: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud
suurenenud efektori funktsiooniks on apoptoosi indutseeriv otsene signalisatsioon.
EE - EP1692182 B1 88
Punkt 122: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud
suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud dendriitrakkude valmimine.
Punkt 123: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud
suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud T raku praimimine.
Punkt 124: punktile 114 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc 5
retseptoriks on Fc aktiveeriv retseptor.
Punkt 125: punktile 114 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc
retseptoriks on FcγRIIIa retseptor.
Punkt 126: mistahes punkti 102 kuni 111 meetodiga valmistatud antigeeni siduv
molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on antikeha fragment, mis 10
sisaldab Fc piirkonda ja mida on muundatud suurema efektori funktsiooni
saavutamiseks.
Punkt 127: antigeeni siduv molekul, mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni
111 meetodiga, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on fusioonvalk, mis
sisaldab SEQ ID NO: 1 järjestusega polüpeptiidi ja piirkonda, mis on samaväärne 15
immunoglobuliini Fc piirkonnaga ja mida on muundatud suurenenud efektori
funktsiooni saavutamiseks.
Punkt 128: antigeeni siduv molekul, mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni
111 meetodiga, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on fusioonvalk, mis
sisaldab polüpeptiidi, mille järjestus on omakorda valitud rühmast, kuhu kuuluvad 20
SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO:
38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID
NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ
ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66;
SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70; ja SEQ ID NO: 72, ning piirkonda, mis on 25
samaväärne immunoglobuliini Fc piirkonnaga ja mida on muundatud suurenenud
efektori funktsiooni saavutamiseks.
Punkt 129: antigeeni siduv molekul, mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni
111 meetodiga, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on fusioonvalk, mis
EE - EP1692182 B1 89
sisaldab SEQ ID NO: 3 järjestusega polüpeptiidi ja piirkonda, mis on samaväärne
immunoglobuliini Fc piirkonnaga ja mida on muundatud suurenenud efektori
funktsiooni saavutamiseks.
Punkt 130: antigeeni siduv molekul, mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni
111 meetodiga, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on fusioonvalk, mis 5
sisaldab SEQ ID NO: 76 järjestusega polüpeptiidi ja piirkonda, mis on samaväärne
immunoglobuliini Fc piirkonnaga ja mida on muundatud suurenenud efektori
funktsiooni saavutamiseks.
Punkt 131: ravimkoostis, mis sisaldab mistahes punktile 112 kuni 130 vastavat
antigeeni siduvat molekuli ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit. 10
Punkt 132: ravimkoostis, mis sisaldab punkti 126 antikeha fragmenti ja
farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.
Punkt 133: ravimkoostis, mis sisaldab mistahes punktile 127 kuni 130 vastavat
fusioonvalku ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.
Punkt 134: meetod haiguse ravimiseks, mis on ravitav B rakkude hulga 15
vähendamisega ja kus nimetatud meetod hõlmab seda vajavale inimpatsiendile
mistahes punkti 112 kuni 130 antigeeni siduva molekuli efektiivse koguse
manustamist.
Punkt 135: punktile 4 või 5 vastav eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab
täiendavalt inimese antikeha kerge või raske ahela konstantset piirkonda 20
kodeerivat järjestust.
Punkt 136: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 80%
ulatuses identne SEQ ID NO: 24; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib
fusioonpolüpeptiidi.
Punkt 137: peremeesrakk, mis kaasavaldab punktile 136 vastavat eraldatud 25
polünukleotiidi ja polünukleotiidi, mis sisaldab antikeha kerge ahela varieeruvat
piirkonda kodeerivat järjestust.
EE - EP1692182 B1 90
Punkt 138: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 50% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.
Punkt 139: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 60% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.
Punkt 140: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% Fc 5
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.
Punkt 141: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 80% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.
Punkt 142: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 90% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud. 10
Punkt 143: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 50% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.
Punkt 144: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 60% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.
Punkt 145: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% Fc 15
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.
Punkt 146: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 75% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.
Punkt 147: punkti 73 meetod, kus nimetatud häireks on B raku lümfoom.
Punkt 148: eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on valitud rühmast, kuhu 20
kuuluvad SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ
ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45;
SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO:
55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID
NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69 ja SEQ ID NO: 71. 25
Punkt 149: punktile 148 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud eraldatud
polünukleotiid sisaldab SEQ ID NO: 31.
EE - EP1692182 B1 91
Punkt 150: punktile 148 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud eraldatud
polünukleotiid sisaldab SEQ ID NO: 55.
Punkt 151: punktile 148 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud eraldatud
polünukleotiid sisaldab SEQ ID NO: 59.
Punkt 152: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 75. 5
Punkt 153: punktile 148 või punktile 149 vastav eraldatud polünukleotiid, kus
nimetatud polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi.
Punkt 154: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:
a) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus omakorda on valitud
rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 56; ja SEQ ID NO: 60; ning 10
b) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi järjestusega SEQ ID NO: 76.
Punkt 155: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 80%
ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:
29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID
NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ 15
ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57;
SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:
67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71 ja nimetatud eraldatud polünukleotiid
kodeerib fusioonpolüpeptiidi.
Punkt 156: eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on vähemalt 80% ulatuses 20
identne SEQ ID NO: 75; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib
fusioonpolüpeptiidi.
Punkt 157: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 85%
ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:
29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID 25
NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ
ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57;
SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:
67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71.
EE - EP1692182 B1 92
Punkt 158: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 85%
ulatuses identne SEQ ID NO: 75.
Punkt 159: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 90%
ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:
29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID 5
NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ
ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57;
SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:
67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71.
Punkt 160: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 90% 10
ulatuses identne SEQ ID NO: 75.
Punkt 161: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 95%
ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:
29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID
NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ 15
ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57;
SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:
67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71.
Punkt 162: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 95%
ulatuses identne SEQ ID NO: 75. 20
Punkt 163: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 99%
ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:
29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID
NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ
ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; 25
SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:
67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71.
Punkt 164: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 99%
ulatuses identne SEQ ID NO: 75.
EE - EP1692182 B1 93
Punkt 165: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:
a) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus omakorda on valitud
rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID
NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ
ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; 5
SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO:
64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72; ning
b) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc
piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt.
Punkt 166: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb: 10
a) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi järjestusega SEQ ID NO: 76; ja
b) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc
piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt.
Punkt 167: eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus
omakorda on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; 15
SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO:
42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID
NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ
ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja
SEQ ID NO: 72. 20
Punkt 168: eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID NO: 76 järjestust
omavat polüpeptiidi.
Punkt 169: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus kodeerib polüpeptiidi,
milles sisalduv järjestus omakorda on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:
30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID 25
NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ
ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58;
SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO:
68; SEQ ID NO: 70; ja SEQ ID NO: 72.
EE - EP1692182 B1 94
Punkt 170: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 76 omavat
polüpeptiidi kodeerivat järjestust.
Punkt 171: ekspressioonivektor, mis koosneb mistahes punktile 148 kuni 170
vastavast eraldatud polünukleotiidist.
Punkt 172: punkti 171 vektor, kus nimetatud vektor on paljutsistroniline. 5
Punkt 173: punktile 171 vastavat ekspressioonivektorit sisaldav peremeesrakk.
Punkt 174: peremeesrakk, mis koosneb mistahes punktile 148 kuni 170 vastavast
eraldatud polünukleotiidist.
Punkt 175: inimese jaoks kohandatud polüpeptiid, mille järjestus on valitud
rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID 10
NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ
ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54;
SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO:
64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72 või nende
variandid. 15
Punkt 176: inimese jaoks kohandatud polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 76
järjestust või selle varianti.
Punkt 177: eraldatud polüpeptiid, milles sisalduv järjestus on valitud rühmast, kuhu
kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ
ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; 20
SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO:
56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID
NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70; ja SEQ ID NO: 72 või nende variandid.
Punkt 178: eraldatud polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 76 või selle varianti.
Punkt 179: mistahes punktile 177 kuni 178 vastav eraldatud polüpeptiid, kus 25
nimetatud polüpeptiidiks on fusioonpolüpeptiid.
Punkt 180: antigeeni siduv molekul, mis sisaldab punkti 179 eraldatud polüpeptiidi.
EE - EP1692182 B1 95
Punkt 181: punkti 180 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks
molekuliks on antikeha.
Punkt 182: punkti 181 antikeha, kus nimetatud antikeha on inimese jaoks
kohandatud antikeha.
Punkt 183: punkti 180 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks 5
molekuliks on antikeha fragment.
Punkt 184: punkti 183 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antikeha fragment
on inimese jaoks kohandatud.
Punkt 185: punkti 180 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks
molekuliks on rekombinantne antikeha. 10
Punkt 186: punkti 185 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud rekombinantne
antikeha on inimese jaoks kohandatud.
Punkt 187: punkti 180 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud rekombinantne
antikeha sisaldab inimese Fc piirkonda.
Punkt 188: punkti 187 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud inimese Fc 15
piirkonnaks on inimese IgG Fc piirkond.
Punkt 189: mistahes punkti 180 kuni 188 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud
antigeeni siduval molekulil on modifitseeritud oligosahhariididega Fc piirkond.
Punkt 190: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc
piirkonda on modifitseeritud väiksemaks fukoosi jääkide sisalduseks võrreldes 20
modifitseerimata antigeeni siduva molekuliga.
Punkt 191: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc
piirkonnal on suurenenud poolitatud oligosahhariidide proportsioon.
Punkt 192: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud
modifitseeritud oligosahhariidideks on poolitatud kompleksid. 25
EE - EP1692182 B1 96
Punkt 193: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud
modifitseeritud oligosahhariididel on nimetatud antigeeni siduva molekuli Fc
piirkonnas suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon.
Punkt 194: punktile 193 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud poolitatud
fukosüülimata oligosahhariidideks on hübriidid. 5
Punkt 195: punktile 193 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud poolitatud
fukosüülimata oligosahhariidideks on kompleksid.
Punkt 196: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 20%
nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud
ja fukosüülimata. 10
Punkt 197: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 30%
nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud
ja fukosüülimata.
Punkt 198: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 35%
nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud 15
ja fukosüülimata.
Punkt 199: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70%
nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud
ja fukosüülimata.
Punkt 200: meetod antigeeni siduva molekuli valmistamiseks, mis on võimeline 20
inimese CD20 seondumisel hiire B-Ly1 antikehaga konkureerima ja nimetatud
antigeeni siduv molekul on kimäärne; nimetatud meetod hõlmab:
a) punkti 173 või punkti 174 peremeesraku kultuuristamist söötmes tingimustel,
mis võimaldavad nimetatud antigeeni siduvat molekuli kodeeriva nimetatud
polünukleotiidi ekspressiooni; 25
b) nimetatud antigeeni siduva molekuli eraldamist.
Punkt 201: punkti 200 meetod, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on
antikeha.
EE - EP1692182 B1 97
Punkt 202: punkti 200 meetod, kus nimetatud kimäärset antigeeni siduv molekul
on inimese jaoks kohandatud.
Punkt 203: ravimkoostis, mis sisaldab mistahes punktile 189 kuni 199 vastavat
antigeeni siduvat molekuli ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.
Punkt 204: punkti 203 ravimkoostis, kus nimetatud koostis sisaldab täiendavalt 5
farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.
Punkt 205: punkti 203 ravimkoostis, kus nimetatud koostis sisaldab täiendavalt
abiainet.
Punkt 206: meetod häire ravimiseks, mis on ravitav B rakkude hulga
vähendamisega ja kus nimetatud meetod hõlmab seda vajavale inimpatsiendile 10
mistahes punkti 203 kuni 205 ravimkoostise efektiivse koguse manustamist.
Punkt 207: peremeesrakk, mida on muundatud vähemalt ühe β(1,4)-N-
atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidi kodeeriva
nukleiinhappe avaldamiseks koguses, mis on piisav nimetatud peremeesraku
poolt toodetud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevate oligosahhariidide 15
modifitseerimiseks ja nimetatud polüpeptiidiks on mistahes punktile 180 kuni 197
vastav antigeeni siduv molekul.
Punkt 208: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud β(1,4)-N-
atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidiks on
fusioonpolüpeptiid. 20
Punkt 209: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks
on antikeha.
Punkt 210: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks
on antikeha fragment.
Punkt 211: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduv molekul 25
sisaldab piirkonda, mis on samaväärne inimese IgG Fc piirkonnaga.
EE - EP1692182 B1 98
Punkt 212: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud peremeesraku poolt toodetud
nimetatud antigeeni siduv molekul avaldab nimetatud modifikatsiooni tulemusel
suurenenud Fc retseptorit siduvat afiinsust.
Punkt 213: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud peremeesraku poolt toodetud
nimetatud antigeeni siduv molekul avaldab nimetatud modifikatsiooni tulemusel 5
suurenenud efektori funktsiooni.
Punkt 214: punkti 208 peremeesrakk, kus nimetatud fusioonpolüpeptiid sisaldab
β(1,4)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas III katalüseerivat domeeni.
Punkt 215: punkti 208 peremeesrakk, kus nimetatud fusioonpolüpeptiid sisaldab
täiendavalt heteroloogse Golgi resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni 10
domeeni.
Punkt 216: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni
domeeniks on mannosidaas II lokalisatsiooni domeen.
Punkt 217: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni
domeeniks on β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas I lokalisatsiooni 15
domeen.
Punkt 218: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni
domeeniks on β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas II lokalisatsiooni
domeen.
Punkt 219: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni 20
domeeniks on mannosidaas I lokalisatsiooni domeen.
Punkt 220: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni
domeeniks on α1-6tuuma fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen.
Punkt 221: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud
efektori funktsiooniks on suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus. 25
Punkt 222: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud
efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine NK rakkudega.
EE - EP1692182 B1 99
Punkt 223: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud
efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine makrofaagidega.
Punkt 224: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud
efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine polümorftuumaste rakkudega.
Punkt 225: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud 5
efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine monotsüütidega.
Punkt 226: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud
efektori funktsiooniks on suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene signalisatsioon.
Punkt 227: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud
efektori funktsiooniks on suurenenud dendriitrakkude valmimine. 10
Punkt 228: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud
efektori funktsiooniks on suurenenud T rakkude praimimine.
Punkt 229: peremeesrakk vastavalt punktile 212, kus nimetatud Fc retseptoriks on
Fcγ aktiveeriv retseptor.
Punkt 230: peremeesrakk vastavalt punktile 212, kus nimetatud Fc retseptoriks on 15
FcγRIIIA retseptor.
Punkt 231: peremeesrakk vastavalt punktile 207, kus nimetatud peremeesrakuks
on CHO rakk, BHK rakk, NSO rakk, SP2/0 rakk, YO müeloomi rakk, P3X63 hiire
müeloomi rakk, PER rakk, PER.C6 rakk või hübridoomrakk.
Punkt 232: punkti 207 peremeesrakk, mis sisaldab täiendavalt vähemalt ühte 20
transfekteeritud polünukleotiidi, mis kodeerib mistahes punktile 28 ja 35 kuni 41
vastavat polüpeptiidi ja nimetatud nukleiinhape sisaldab järjestust, mis kodeerib
inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda.
Punkt 233: peremeesrakk vastavalt punktile 207, kus nimetatud vähemalt üks
nukleiinhape, mis β(1,4)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega 25
polüpeptiidi kodeerib, on aheldatud operatiivselt konstitutiivse
promootorelemendiga.
EE - EP1692182 B1 100
Punkt 234: punkti 233 peremeesrakk, kus nimetatud β(1,4)-N-
atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidiks on
fusioonpolüpeptiid.
Punkt 235: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 50% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud. 5
Punkt 236: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 60% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.
Punkt 237: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.
Punkt 238: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 80% Fc 10
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.
Punkt 239: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 90% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.
Punkt 240: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 50% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata. 15
Punkt 241: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 60% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.
Punkt 242: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% Fc
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.
Punkt 243: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 75% Fc 20
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.
Punkt 244: punkti 206 meetod, kus nimetatud häireks on B raku lümfoom.
Punkt 245: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab vähemalt ühte hiire B-Ly1
antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat
piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust 25
määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke; nimetatud eraldatud
polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi.
EE - EP1692182 B1 101
Punkt 246: punktile 245 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud
komplementaarsust määrav piirkond on valitud rühmast, kuhu kuuluvad:
[NIMEKIRI KÕIKIDEST B-Ly1 CDR JÄRJESTUSTEST].
Punkt 247: punktile 245 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud
polünukleotiid kodeerib antigeeni siduvat molekuli. 5
Punkt 248: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab vähemalt kolme hiire B-Ly1
antikeha või nende variantide või lühendatud vormide komplementaarsust
määravat piirkonda, mis omakorda sisaldavad vähemalt iga kolme nimetatud
komplementaarsust määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke; nimetatud
eraldatud polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi. 10
Punkt 249: punktile 248 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud
komplementaarsust määravad piirkonnad sisaldavad vähemalt ühte järjestust, mis
on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ja SEQ ID NO:
7; ning vähemalt ühte järjestust, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID
NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 ning SEQ ID NO: 24 või nimetatud 15
järjestuste variandid või lühendatud vormid, mis sisaldavad vähemalt iga
nimetatud komplementaarsust määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke.
Punkt 250: eraldatud polüpeptiid, mida kodeeritakse mistahes punkti 245 kuni 249
eraldatud polünukleotiidi poolt.
Punkt 251: antigeeni siduv molekul, mis sisaldab vähemalt ühte hiire B-Ly1 20
antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat
piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust
määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke ja järjestust, mis on deriveeritud
heteroloogsest polüpeptiidist.
Punkt 252: punkti 251 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduv 25
molekul sisaldab vähemalt kolme hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide või
lühendatud vormide komplementaarsust määravat piirkonda ja nimetatud antikeha
või selle variandid või lühendatud vormid sisaldavad iga nimetatud
komplementaarsust määrava piirkonna jaoks vähemalt spetsiifilisust määravaid
jääke. 30
EE - EP1692182 B1 102
Punkt 253: punktile 252 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni
siduv molekul sisaldab antikeha kerge või raske ahela varieeruvat piirkonda.
Punkt 254: punkti 252 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks
molekuliks on kimäärne või inimese jaoks kohandatud antikeha.
Punkt 255: muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, mille ADCC on nimetatud 5
muundamise tagajärjel suurenenud ilma, et võime märklaud-rakkudes apoptoosi
indutseerida oluliselt väheneks.
Punkt 256: punkti 255 muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, kus nimetatud
antikeha on muundatud muudetud glükosüülimismustri tekitamiseks Fc piirkonnas.
Punkt 257: punkti 256 muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, kus nimetatud 10
antikeha muutunud glükosüülimine avaldub suurenenud poolitatud komplekside
vormis oligosahhariidide kogusena.
Punkt 258: punkti 256 muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, kus nimetatud
antikeha muutunud glükosüülimine avaldub vähenenud fukoosi jääkide kogusena.
Punkt 259: punkti 255 muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, kus nimetatud 15
antikeha on muundatud muudetud aminohappejärjestuse tekitamiseks Fc
piirkonnas.
Järgnevalt esitatud näidetes kirjeldatakse leiutist detailsemalt. Järgnevad näited ja
valmistamisviisid on toodud, et võimaldada valdkonnas kogenud isikutel
käesolevat leiutist paremini mõista ja praktiseerida. Lugedes eelnevalt toodud 20
kirjeldust ja uurides lisatud jooniseid, mõistab valdkonnas kogenud isik
tõenäoliselt, et lisaks kirjeldatutele on võimalikud ka leiutise täiendavad erinevad
variatsioonid.
NÄITED
[MÄRKUS: Juhul, kui ei ole teisiti välja toodud, on konkreetsete 25
aminohappejärjestuste positsioonide nummerdus järgnevates näidetes esitatud
vastavalt Kabat´ nummerdussüsteemile.]
EE - EP1692182 B1 103
NÄIDE 1
Materjal ja metoodika
Rekombinantse antikeha B-Ly1 kloonimine ja ekspressioon
B-Ly1 avaldavaid hübridoomrakke kasvatati RPMI, mis sisaldas 10% FBS ja 4 mM
L-glutamiini. Koguti 6 x 106 rakku, mille elujõud oli > 90% ning kogu RNA eraldati 5
Qiagen RNA easy minikomplekti kasutades. B-Ly1 erinevaid kergeid ja raskeid
ahelaid kodeerivad cDNA võimendati RT-PCR abil. RT-PCR reaktsioon sooritati
järgmistel tingimustel: 30 minutit temperatuuril 50 oC esimese tüve cDNA sünteesi
jaoks; 15 minutit kestev algne denatureerimine temperatuuril 95 oC; 30 tsüklit
temperatuuril 94 oC 1 minuti jooksul, temperatuuril 45 oC 1 minuti jooksul ja 10
temperatuuril 72 oC 1,5 minuti jooksul; ning viimase pikendusetapi jooksul 10
minutit temperatuuril 72 oC. PCR saaduste eeldatud suurus kinnitati geel-
elektroforeesiga. PCR saadused klooniti sobivatesse E. coli vektoritesse ja DNA
järjestamine kinnitas, et erinevad kerget ja rasket ahelat kodeerivad geenid olid
eraldatud. 15
Kimäärsete B-Ly1 ekspressioonivektorite valmistamiseks sulatati sünteetilised
signaaljärjestused ja sobivad restriktsioonisaidid täiendavate PCR reaktsioonide
abil varieeruvate ahelate külge. Pärast varieeruvate ahelate õige DNA järjestuse
lõplikku kinnitamist liideti need vastavate inimese IgG1 konstantsete
piirkondadega. Pärast geenide valmistamist klooniti need MPSV promootori 20
kontrolli all ja sünteetilisest polüA saidist vastassuunas, kasutades kahte eraldi
vektorit (üks mõlema ahela jaoks) ja saades seeläbi plasmiidid pETR1808 (raske
ahela ekspressioonivektor) ja pETR1813 (kerge ahela ekspressioonivektor).
Mõlemad vektorid kandsid EBV OriP järjestust.
Kimäärne B-Ly1 toodeti, kotransfekteerides HEK293-EBNA rakke vektorite 25
pETR1808 ja pETR1813, kasutades selleks kaltsiumfosfaadi-transfektsiooni
meetodit. Eksponentsiaalselt kasvatatud HEK293-EBNA rakke transfekteeriti
kaltsiumfosfaadi meetodiga. Rakke kasvatati T kolvides kui kõrvuti asetsevaid
monokihi kultuure, kasutades 10% FCS täiendatud DMEM kultuursöödet ning
transfekteeriti, kui nende kokkuvalguvus jäi vahemikku 50 kuni 80%. T75 kolvi 30
EE - EP1692182 B1 104
transfektsiooniks idustati 8 miljonit rakku 24 tundi enne transfektsiooni 14 ml
DMEM kultuursöötmes, mida oli täiendatud FCS (lõpp-kontsentratsioon 10% V/V)
ja 250 µg/ml kohta neomütsiiniga ning rakud viidi ööks temperatuuril 37 oC
inkubaatorisse, kus valitses 5% CO2 atmosfäär. Iga transfekteeritava T75 kolvi
jaoks valmistati DNA, CaCl2 ja vee lahus, segades selleks 47 µg kogu 5
plasmiidivektori DNA, mis oli jagatud võrdselt kerge ja raske ahela
ekspressioonivektorite vahel, 235 µl 1M CaCl2 lahust ja lisades vett, kuni lõplikuks
mahuks oli 469 µl. Sellele lahusele lisati 469 µl pH tasemel 7,05 lahust, mis
koosnes 50 mM HEPES, 280 mM NaCl ja 1,5 mM Na2HPO4 ning saadud segu
segati koheselt 10 sekundit ja lasti seejärel 20 sekundit toatemperatuuril seista. 10
Suspensioon lahjendati 12 ml DMEM, mis oli asendatud 2% FCS ning viidi T75
olemasoleva söötme asemele. Rakke inkubeeriti temperatuuril 37 oC 5% CO2
atmosfääris umbes 17 kuni 20 tundi ning seejärel asendati sööde 12 ml DMEM,
mida oli täiendatud 10% FCS. Modifitseerimata antikeha „chB-Ly1“ tootmiseks
transfekteeriti rakud ainult suhtes 1:1 antikeha ekspressioonivektoritega 15
pETR1808 ja pETR1813. Glükomuundatud antikeha „chBLy-1-ge" tootmiseks
kotransfekteeriti rakke nelja plasmiidiga, millest kaks olid vastavalt antikeha
ekspressiooniks (pETR1808 ja pETR1813), üks oli vastavalt fusioon GnTIII
polüpeptiidi ekspressiooniks (pETR1519) ja üks oli mannosidaas II
ekspressiooniks (pCLF9); omavaheline suhe oli 4:4:1:1. 5 päeva pärast 20
transfektsiooni koguti ülemine vedelikukiht, tsentrifuugiti 5 minutit kiirusel 1200
pööret minutis, sellele järgnevalt 10 minutit kiirusel 4000 pööret minutis ja hoiti
temperatuuril 4 oC.
chB-Ly1 ja chB-Ly1-ge puhastati kultuuri pindmisest vedelikukihist, kasutades
kolme üksteisele järgnevat kromatograafilist etappi: valk A kromatograafia, 25
katioonvahetuse kromatograafia ja suuruseralduskromatograafia Superdex 200
kolonnil (Amersham Pharmacia), vahetades puhvri fosfaat-puhverdatud
soolalahuse vastu ja kogudes monomeerse antikeha tipu sellest viimasest etapist.
Antikeha kontsentratsiooni hinnati spektrofotomeetrit kasutades neelduvusest
tasemel 280 nm. 30
EE - EP1692182 B1 105
Oligosahhariidi analüüs
Oligosahhariidid vabastati antikehadest ensümaatiliselt PNGaasF
digereerimisega, kus antikehad oli immobiliseeritud PVDF membraanil või
lahuses.
Saadud vabanenud oligosahhariide sisaldavat digereerimislahust kasutati otse 5
MALDI/TOF-MS analüüsis või digereeriti enne MALDI/TOF-MS analüüsi
täiendavalt EndoH glükosidaasiga.
Oligosahhariidide vabastusmeetod PVDF membraanile immobiliseeritud
antikehade jaoks
96-reservuaariga plaadi, mis oli valmistatud koos PVDF (Immobilon P, Millipore, 10
Bedford, Massachusetts) membraaniga, reservuaarid niisutati 100 ml metanooliga
ja vedelik imeti läbi PVDF membraani vaakumiga, mis oli tekitatud mitme avaga
vaakumitekitajaga (Millipore, Bedford, Massachusetts). PVDF membraane pesti
kolm korda 300 µl veega. Reservuaare pesti seejärel 50 µl RCM puhvriga (8M
uurea, 360 mM Tris, 3,2 mM EDTA, pH 8,6). 10 µl RCM puhvrit sisaldavasse 15
reservuaari viidi 30 - 40 mg antikeha. Reservuaaris olev vedelik imeti vaakumi abil
läbi membraani ja membraani pesti seejärel kaks korda 50 µl RCM puhvriga.
Disulfiidsildade taandamine sooritati 50 µl lahuse, mis koosnes RCM olevast 0,1M
ditiotreitoolist, ja 1 tunni pikkuse inkubeerimisega temperatuuril 37 oC.
Pärast taandamist rakendati ditiotreitoollahuse reservuaarist eemaldamiseks 20
vaakumi. Reservuaare pesti kolm korda 300 µl veega ja seejärel rakendati
tsüsteiini jääkidel karboksümetüülimist, lisades selleks RCM puhvris oleva 50 µl
0,1M jodoäädikhapet ja inkubeerides 30 minutit toatemperatuuril pimedas.
Pärast karboksümetüülimist tühjendati reservuaarid vaakumiga ja pesti järgnevalt
kolm korda 300 µl veega. PVDF membraan blokeeriti seejärel endoglükosidaasi 25
adsorptsiooni vältimiseks, inkubeerides 100 µl 1% polüvinüülpürrolidoon 360
vesilahust 1 tund toatemperatuuril. Blokeeriv reagent eemaldati seejärel nõrga
vaakumiga ja sellele järgnes 3 pesu 300 µl veega.
EE - EP1692182 B1 106
N-aheldatud oligosahhariidid vabastati 2,5 mU peptiid-N-glükosüdaas F
(rekombinantne N-glükanaas, GLYKO, Novato CA) ja 0,1 mU sialidaasi (GLYKO,
Novato, CA) lisamisega, eemaldades seeläbi võimalikud potentsiaalsed laenguga
monosahhariidi jäägid – lõppmaht oli 25 µl 20 mM NaHCO3 (pH 7,0).
Digereerimine toimus 3 tundi temperatuuril 37 oC. 5
Oligosahhariidi vabastamismeetod lahuses olevate antikehade jaoks
40 kuni 50 µg antikeha segati lahusega, mis koosnes 2 mM Tris olevast 2,5 mU
PNGaasF (Glyko, USA) (pH 7,0), lõpliku mahuni 25 mikroliitrit ning saadud segu
inkubeeriti 3 tundi temperatuuril 37 oC.
PNGaasF-vabastatud oligosahhariidide endoglükosidaas H digereerimise 10
kasutamine hübriidsete poolitatud oligosahhariidide struktuuride hindamiseks
MALDI/TOF-MS neutraalsete oligosahhariidtippude jaoks
PNGaasF vabastatud oligosahhariidid digereeriti järgnevalt endoglükosidaas H
(EC 3.2.1.96) abil. EndoH digereerimise jaoks lisati PNGaasF
digereerimissaadusele (eelnevalt kirjeldatud lahuses oleva antikeha meetod) 15 15
mU EndoH (Roche, Šveits), saades lõplikuks mahuks 30 mikroliitrit ning segu
inkubeeriti 3 tundi temperatuuril 37 oC. EndoH lõhestub N-aheldatud
oligosahhariidide tsitobioostuuma N-atsetüülglükoosamiinjääkide vahel. Ensüüm
saab digereerida ainult oligomannoosi ja enamusi hübriidseid glükaane, samas kui
kompleksi tüüpi oligosahhariide ei hüdrosüülita. 20
Proovi valmistamine MALDI/TOF-MS jaoks
Vabanenud oligosahhariide sisaldavaid ensümaatilisi digereerimissaaduseid
inkubeeriti pärast äädikhappe lisamist lõpliku kontsentratsioonini 150 mM 3 tundi
toatemperatuuril ning juhiti seejärel katioonide ja valkude eemaldamiseks läbi 0,6
ml katioonvahetuse vaigu (AG50W-X8 vaik, hüdrogeeni vormis, 100 - 200 sõela 25
suurus, BioRad, Šveits), mis oli paigutatud mikro-bio-pöörlevasse kromatograafia
kolonni (BioRad, Šveits). Üks mikroliiter saadud proovi viidi roostevabast terasest
plaadile ja segati plaadil 1 µl sDHB maatriksiga. sDHB maatriks valmistati,
lahustades 2 mg 2,5-dihüdroksübensoehapet ja 0,1 mg 5-metoksüsalitsüülhapet 1
ml etanoolis/10 mM naatriumkloriidi vesilahuse segus (suhtes 1:1). Proovid 30
EE - EP1692182 B1 107
kuivatati õhu käes, neil rakendati 0,2 µl etanooli ja proovidel lasti lõpuks õhu käes
rekristalliseeruda.
MALDI/TOF-MS
Massispektri saamiseks kasutatud MALDI-TOF massispektromeetriks oli Voyager
Elite (Perspective Biosystems). Instrumenti kasutati lineaarses konfiguratsioonis, 5
20 kV suuruse kiirenduse ja 80 ns viivitusega. Ioonide massi määramisel kasutati
oligosahhariidide standardeid kasutavat välist kalibreerimist. Lõpliku spektri
saamiseks summeeriti 200 laseri rakendamise tulemused.
Täisvere B rakkude hulga vähendamine
Tervelt patsiendilt saadud 495 µl hepariniseeritud verd alikvooditi 5 ml 10
polüstüreentuubidesse, seejärel lisati 5 µl 100-kordseid kontsentreeritud antikeha
proove (1-1000 ng/ml kohta lõppkontsentratsioon) või ainult PBS ja tuube
inkubeeriti temperatuuril 37 oC. 24 tunni pärast viidi uude tuubi 50 µl verd ja värviti
anti-CD3-FITC, anti-CD19-PE ja anti-CD45-CyChrome (Becton-Dickinson) abil 15
minutit toatemperatuuril pimedas. Enne analüüsi lisati tuubidesse 500 µl FACS 15
puhvrit (PBS, mis sisaldas 2% FCS ja 5 mM EDTA). Vereproovide CD3-FITC ja
CD 19-PE fluorestsentsi analüüsiti voolutsütomeetriliselt, seades lävendi CD45-
CyChrome´l. B rakkude hulga vähenemine määrati, arvutades CD19+ B rakkude
suhte CD3+ T rakkude suhtes.
Anti-CD20 antikehade seondumine Raji rakkudega 20
180 µl FACS puhvris (PBS, mis sisaldab 2% FCS ja 5 mM EDTA) olevad 500 000
rakku viidi 5 ml polüstüreentuubidesse, lisades 20 ul 10 kordse
kontsentratsiooniga anti-CD20 antikeha proove (lõppkontsentratsioon 1 – 5000
ng/ml kohta) või ainult PBS ja inkubeerides tuube 30 minutit temperatuuril 4 oC.
Järgnevalt pesti proove kaks korda FACS puhvriga ja granuleeriti 3 minuti jooksul 25
kiirusel 300 x g. Ülemine vedelikukiht aspireeriti välja ja rakud võeti 100 Φ1 FACS
puhvrisse, lisades 1 µl anti-Fc-spetsiifilise F(ab´)2-FITC fragmente (Jackson
Immuno Research Laboratories, USA) ja seejärel inkubeeriti tuube 30 minutit
temperatuuril 4 oC. Järgnevalt pesti proove kaks korda FACS puhvriga ja viidi
seejärel voolutsütomeetriaga analüüsimiseks 500 µl FACS puhvrisse, mis sisaldas 30
EE - EP1692182 B1 108
0,5 µg/ml kohta Pl. Seondumine määrati, arvutades graafikul geomeetrilise
keskmise fluorestsentsi antikeha kontsentratsioonide vastu.
NÄIDE 2
Suure homoloogiaga aktseptori meetod
Suure homoloogiaga antikeha aktseptori raami otsing viidi läbi, reastades hiire B-5
Ly1 valgu järjestuse inimese idutee rakkude järjestustega ja valides selle inimese
järjestuse, millel ilmnes suurim järjestuse identsus. Käesolevas katses valiti raske
ahela raami aktseptori järjestuseks VBase andmebaasist järjestus VH1_10 ja
kerge ahela raami aktseptori järjestuseks valiti VK_2_40 järjestus. Neile kahele
aktseptori raamile siirdati kolm hiire raskete ja kergete varieeruvate domeenide 10
komplementaarsust määravat piirkonda (CDR). Kuna raami 4 piirkonda ei olnud
idutee V geeni varieeruva piirkonna osaks, sooritati selle positsiooni reastamine
individuaalselt. Raske ahela jaoks valiti JH4 piirkond ja kerge ahela jaoks valiti JK4
piirkond. Välja töötatud immunoglobuliini domeeni molekulaarne modelleerimine
paljastas ühe punkti, mis vajas väljapool CDR potentsiaalselt inimese 15
aminohappejääkide asemel hiire aminohappejääke. Hiire aminohappejääkide
taassisestus inimese raami tekitakse nn. tagasimutatsioonid. Näiteks Kabat´
positsioonil 27 olev inimese aktseptori aminohappejääk muteerus tagasi türosiini
jäägiks. Seega töötati välja inimese jaoks kohandatud antikeha fragmendid, mis ei
sisaldanud ega jätnud vahele tagasimutatsioone. Inimese jaoks kohandatud 20
antikeha kerge ahel ei vajanud mingisuguseid tagasimutatsioone. Pärast
valgujärjestuste väljatöötamist sünteesiti need valke kodeerivad DNA järjestused
viisil, mis on välja toodud järgnevalt.
Segatud raami meetod
Et vältida tagasimutatsioonide sisestamist inimese aktseptoriraami kriitilise 25
tähtsusega aminohappejäägi positsioonidele (kriitilised hea antigeeni siduva
afiinsuse või antikeha funktsiooni säilitamiseks) uuriti, kas kogu raami piirkond 1
(FR1) või raami piirkonnad 1 (FR1) ja 2 (FR2) koos suudaksid asendada juba
doonorjääke omavad inimese antikeha järjestused või funktsionaalselt
samaväärsed järjestused nendel olulistel looduslikel inimese idutee järjestuste 30
EE - EP1692182 B1 109
positsioonidel. Sellel eesmärgil reastati hiire B-Ly1 järjestuse VH raamid 1 ja 2
individuaalselt inimese idutee järjestustega. Siin ei olnud suurim järjestuse
identsus oluline ja seda ei kasutatud aktseptori raamide valimiseks; olulisemaks
loeti mitme kriitilise tähtsusega jäägi ühtivust. Need kriitilised jäägid hõlmasid
jääke 24, 71 ja 94 (Kabat´ nummerdus) ja samuti neid jääke positsioonidel 27, 28 5
ja 30 (Kabat´ nummerdus), mis jäid väljapoole Kabat´ CDR1 definitsiooni, kuid
osalesid sageli antigeeni sidumisel. Sobivaks järjestuseks valiti IMGT järjestus
VH3_3_15. Pärast valgujärjestuste väljatöötamist sünteesiti need valke kodeerivad
DNA järjestused viisil, mis on välja toodud järgnevalt. Seda meetodit kasutades ei
vajatud heade antigeeni sidumistasemete säilitamiseks ei kergel ega raskel ahelal 10
tagasimutatsioone.
Antikeha geenide süntees
Pärast inimese jaoks kohandatud antikeha V piirkonna aminohappejärjestuse
väljatöötamist tuli luua DNA järjestus. Individuaalsete raami piirkondade DNA
järjestuste andmed olid toodud inimese idutee järjestuste andmebaasides. CDR 15
piirkondade DNA andmed võeti vastavatest hiire cDNA andmetest. Nende
järjestuste abil pandi virtuaalselt kokku kogu DNA järjestus. Omades neid DNA
järjestuse andmeid, sisestati virtuaalsesse järjestusse diagnostilised
restriktsioonisaidid, sisestades selleks vaiksed mutatsioonid ja luues seeläbi
restriktsiooni endonukleaaside tuvastussaidid. Füüsikalise DNA ahela hankimiseks 20
viidi läbi geenisüntees (näiteks Wheeler et al. 1995). Selles meetodis loodi
oligonukleotiidid huvi pakkuvatest geenidest viisil, kus üks seeria oligonukleotiide
deriveeriti kodeerivast tüvest ning muud seeriad deriveeriti mittekodeerivast tüvest.
Iga oligonukleotiidi 3´ ja 5´ otsad (v.a reas esimene ja viimane) demonstreerisid
kahe vastastüvest deriveeritud praimeri suhtes alati komplementaarseid järjestusi. 25
Viies need oligonukleotiidid mistahes stabiilse polümeraasi jaoks sobivasse
reaktsioonipuhvrisse ja lisades Mg2+, dNTPs ja DNA polümeraasi, laiendati iga
oligonukleotiidi selle 3´ otsast. Ühe praimeri värskelt moodustunud 3´ ots seondus
seejärel kaksikahelaks vastastüve järgmise praimeriga ja laiendas selle järjestust
edasi tingimustel, mis sobisid matriitsist sõltuvaks DNA ahela pikendamiseks. 30
Lõppsaadus klooniti E. coli tüves paljundamiseks tavapärasesse vektorisse.
EE - EP1692182 B1 110
Antikeha tootmine
Inimese raske ja kerge ahela liiderjärjestused (eritamiseks) lisati eelnevalt
mainitud varieeruva piirkonna järjestustest vastassuunas ning ühendati seejärel
vastavalt inimese IgG1 kappa konstantsetest raske ja kerge ahela järjestustest
vastassuunas, kasutades selleks standardseid molekulaarbioloogia tehnikaid. 5
Saadud täieliku antikeha raske ja kerge ahela DNA järjestused alamklooniti MPSV
promootori kontrolli all ja sünteetilisest polüA piirkonnast vastassuunas imetajate
ekspressioonivektoritesse (üks kerge ahela jaoks ja üks raske ahela jaoks); iga
vektor kandis EBV OriP järjestust, nagu on kirjeldatud eelnevas näites 1.
Antikehad loodi eelnevalt toodud näites 1 kirjeldatud viisil, kotransfekteerides 10
nimelt HEK293-EBNA imetaja antikeha raske ja kerge ahela
ekspressioonivektoriga, kogudes tingimustele vastava kultuursöötme 5 kuni 7
päeva pärast transfektsiooni ja puhastades eritatud antikehad valk A afiinsusega
kromatograafiaga, millele järgnes katioonvahetuse kromatograafia ja viimasena
suuruseralduskromatograafia etapp puhaste monomeersete IgG1 antikehade 15
eraldamiseks. Antikehad moodustati lahuses, mis koosnes 25 mM
kaaliumfosfaadist, 125 mM naatriumkloriidist ja 100 mM glütsiinlahusest (pH 6,7).
Inimese jaoks kohandatud antikeha variandid valmistati, kotransfekteerides
antikeha ekspressioonivektoreid koos GnTIII glükosüültransferaasi
ekspressioonivektoritega või koos GnTIII ekspressioonivektori pluss Golgi 20
mannosidaas II ekspressioonivektoriga viisil, mida on kirjeldatud eelnevas näites 1
kimäärse antikeha jaoks. Glükomuundatud antikehad puhastati ja moodustati viisil,
mida on eelnevalt glükomuundamata antikehade jaoks kirjeldatud. Antikehade Fc
piirkondade külge kinnitatud oligosahhariide analüüsiti MALDI/TOF-MS analüüsiga
eelnevalt kirjeldatud viisil. 25
Oligosahhariidi analüüs
Oligosahhariidi vabastamismeetod lahuses olevate antikehade jaoks
40 kuni 50 µg antikeha segati lahusega, mis koosnes 2 mM Tris olevast 2,5 mU
PNGaasF (Glyko, USA) (pH 7,0), lõpliku mahuni 25 mikroliitrit ning saadud segu
inkubeeriti seejärel 3 tundi temperatuuril 37 oC. 30
EE - EP1692182 B1 111
Proovi valmistamine MALDI/TOF-MS jaoks
Vabanenud oligosahhariide sisaldavaid ensümaatilisi digereerimissaaduseid
inkubeeriti pärast äädikhappe lisamist lõpliku kontsentratsioonini 150 mM
täiendavad 3 tundi toatemperatuuril ning juhiti seejärel katioonide ja valkude
eemaldamiseks läbi 0,6 ml katioonvahetuse vaigu (AG50W-X8 vaik, hüdrogeeni 5
vormis, 100 - 200 sõela suurus, BioRad, Šveits), mis oli paigutatud mikro-bio-
pöörlevasse kromatograafia kolonni (BioRad, Šveits). Üks mikroliiter saadud
proovi viidi roostevabast terasest plaadile ja segati plaadil 1 µl sDHB maatriksiga.
sDHB maatriks valmistati, lahustades 2 mg 2,5-dihüdroksübensoehapet ja 0,1 mg
5-metoksüsalitsüülhapet segus, mis koosnes 1 ml etanoolist/10 mM 10
naatriumkloriidi vesilahusest (suhtes 1:1). Proovid kuivatati õhu käes, neil
rakendati 0,2 µl etanooli ja proovidel lasti lõpuks õhu käes rekristalliseeruda.
MALDI/TOF-MS
Massispektri saamiseks kasutatud MALDI-TOF massispektromeetriks oli Voyager
Elite (Perspective Biosystems). Instrumenti kasutati lineaarses konfiguratsioonis, 15
20 kV suuruse kiirenduse ja 80 ns viivitusega. Ioonide massi määramisel kasutati
oligosahhariidide standardeid kasutavat välist kalibreerimist. Lõpliku spektri
saamiseks summeeriti 200 laseri rakendamise tulemused.
Antigeeni seondumistest
Puhastatud monomeerse inimese jaoks kohandatud antikeha variantide 20
seondumist inimese CD20 testiti Raji B raku lümfoomi märklaud-rakkudel,
kasutades voolutsütomeetrial põhinevat analüüsi, mida on kirjeldatud eelnevas
näites 1 kimäärse B-Ly1 antikeha jaoks.
Monomeersete IgG1 glükovariantide seondumine NK rakkude ja Fc□RIIIA-
avaldava CHO rakuliiniga 25
Inimese NK rakud eraldati värskelt eraldatud perifeerse vere mononukleaarsetest
rakkudest (PBMC), rakendades negatiivset selektsiooni, mis oli CD16- ja CD56-
positiivsete rakkude (MACS system, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch
Gladbach/Saksamaa) jaoks rikastav. CD56 ekspressiooniga määratud puhtus jäi
EE - EP1692182 B1 112
vahemikku 88 - 95%. Värskelt eraldatud NK rakke inkubeeriti PBS ilma kaltsiumi ja
magneesiumi ioonideta (3 x 105 rakku/ml kohta) 20 minutit temperatuuril 37 oC, et
eemaldada NK rakkudega seonduv IgG. Rakke inkubeeriti kontsentratsioonil 106
rakku/ml kohta erinevate anti-CD20 antikeha kontsentratsioonidena (0, 0,1, 0,3, 1,
3, 10 mg/ml kohta) PBS, 0,1% BSA. Pärast mitut pesu määrati antikeha sidumine, 5
inkubeerides suhtes 1:200 FITC konjugeeritud F(ab´)2 kitse inimesevastase,
F(ab´)2 spetsiifilise IgG (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA/USA) ja
inimesevastase CD56-PE (BD Biosciences, Allschwil/Šveits). Antikeha
glükovariantide (3 µg/ml kohta) seondumisega konkureerimiseks lisati
kontsentratsiooniga 10 µg/ml kohta Anti-FcgammaRIIIa 3G8 F(ab´)2 fragmendid 10
(Ancell, Bayport, MN/USA). Seotud antikeha variantidele viitav fluorestsentsi
intensiivsus määrati CD56-positiivsete rakkude jaoks seadmega FACSCalibur (BD
Biosciences, Allschwil /Šveits). CHO rakud transfekteeriti elektroporatsiooniga
(280 V, 950 mF, 0,4 cm), kasutades ekspressioonivektorit, mis kodeerib
FcgammaRIIIA-Va1158 α-ahelat ja µ-ahelat. Transfektandid valiti, lisades 6 µg/ml 15
kohta puromütsiini ja stabiilseid kloone analüüsiti FACS, kasutades 10 µl FITC-
konjugeeritud anti-FCgammaRIII 3G8 monoklonaalset antikeha (BD Biosciences,
Allschwil/Šveits) 106 raku jaoks. IgG1 seondumine FcgammaRIIIAVal158-
avaldavate CHO rakkudega sooritati analoogselt eelnevalt kirjeldatud NK rakuga
seondumisega. 20
ADCC analüüs
Efektorrakkudena kasutati inimese perifeerse vere mononukleaarseid rakke
(PBMC) ning need valmistati, kasutades Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics
Inc., St. Louis, MO63178 USA) ja järgides üldiselt tootja juhiseid. Lühidalt,
vabatahtlikelt võeti hepariniseeritud süstaldega veeniverd. Veri lahjendati suhtes 25
1:0,75-1,3 PBS (ei sisalda Ca++ või Mg++) ja kanti kihiliselt Histopaque-1077.
Gradienti tsentrifuugiti ilma pausideta 30 minutit kiirusel 400 x g toatemperatuuril
(TT). PBMC sisaldav interfaas koguti, pesti PBS (50 ml rakkude kohta kahest
gradiendist) ning koguti tsentrifuugimisega 10 minuti jooksul TT kiirusel 300 x g.
Pärast kobara resuspensiooni PBS loendati PBMC ja pesti teist korda 30
tsentriguurimisega 10 minuti jooksul TT kiirusel 200 x g. Rakud resuspendeeriti
seejärel järgnevateks protseduurideks sobivas söötmes.
EE - EP1692182 B1 113
ADCC analüüsides kasutatud efektori-märklaua suhe PBMC ja NK rakkude jaoks
oli vastavalt 25:1 ja 10:1. Efektorrakud valmistati AIM-V söötmel piisava
kontsentratsiooniga, et ümara põhjaga 96-reservuaariga plaadi igasse reservuaari
sai lisada 50 µl materjali. Märklaud-rakkudeks olid inimese B lümfoomi rakud
(näiteks Raji rakud), mis olid kasvatatud 10% FCS sisaldavas DMEM. Märklaud-5
rakud pesti PBS, loendati ja resuspendeeriti AIM-V kontsentratsioonil 0,3 miljonit
rakku/ml kohta nii, et igasse mikroreservuaari saaks lisada 30 000 rakku 100 µl
kohta. Antikehad lahjendati AIM-V, lisati 50 µl suuruse kogusena eelnevalt plaadile
kantud märklaud-rakkudele ja lasti 10 minutit TT märklaud-rakkudega seonduda.
Seejärel lisati efektorrakud ja plaati inkubeeriti 4 tundi temperatuuril 37 oC 5% CO2 10
sisaldavas niisutatud atmosfääris. Märklaud-rakkude hävitamist hinnati, mõõtes
laktaatdehüdrogenaasi (LHD) vabanemise kahjustatud rakkudest tsütotoksilisuse
tuvastuskomplekti kasutades (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Šveits). Pärast 4
tunni pikkust inkubeerimist tsentrifuugiti plaate kiirusel 800 x g. Igast reservuaarist
viidi 100 µl ülemist vedelikukihti uuele läbipaistvale lameda põhjaga 96-15
reservuaariga plaadile. Seejärel lisati igale reservuaarile 100 µl komplekti
värvisubstraadi puhvrit. Värvireaktsiooni Vmaks väärtused määrati ELISA lugejaga
tasemel 490 nm vähemalt 10 minuti jooksul SOFTmax PRO tarkvara kasutades
(Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Spontaanne LDH vabanemine
mõõdeti reservuaaridest, mis sisaldasid ainult märklauda ja efektorrakke, kuid 20
mitte antikehasid. Maksimaalne vabanemine määrati reservuaaridest, mis
sisaldasid ainult märklaud-rakke ja 1% Triton X-100. Spetsiifilise antikeha-
vahendatud hävitamise protsent arvutati järgneval viisil: ((x-SR)/(MR - SR)*100,
kus x oli Vmaks keskmine spetsiifilisel antikeha kontsentratsioonil, SR oli
spontaanse vabanemise Vmaks keskmine ja MR oli maksimaalse vabanemise 25
Vmaks keskmine.
Komplemendist sõltuv tsütotoksilisuse analüüs
Märklaud-rakud loendati, pesti PBS ning resuspendeeriti AIM-V (Invitrogen)
kontsentratsiooniga 1 miljonit rakku/ml kohta. Lameda põhjaga 96-reservuaariga
plaadi igasse reservuaari viidi 50 µl rakke. Antikeha lahjendused valmistati AIM-V 30
ja lisati rakkudele 50 µl kogusena. Antikehadel lasti rakkudega 10 minutit
toatemperatuuril seonduda. Inimese seerumi komplement (Quidel) sulatati,
EE - EP1692182 B1 114
lahjendati 3-kordselt AIM-V ja lisati reservuaaridele koguses 50 µl. Küüliku
komplement (Cedarlane Laboratories) valmistati vastavalt tootja juhistele,
lahjendati 3-kordselt AIM-V ja lisati reservuaaridele koguses 50 µl.
Kontrollvariandina kuumutati komplemendi allikaid enne analüüsile lisamist 30
minutit temperatuuril 56 oC. Analüüsiplaate inkubeeriti 2 tundi temperatuuril 37 oC. 5
Rakkude hävitamine määrati LDH vabanemise mõõtmisega. Lühidalt, plaate
tsentrifuugiti 3 minutit kiirusel 300 x g. 50 µl ülemist vedelikukihti reservuaari kohta
viidi uuele 96-reservuaariga plaadile ja seejärel lisati 50 µl tsütotoksilisuse
komplekti (Roche) analüüsireagenti. ELISA lugejaga sooritatud kineetiline
mõõtmine näitas, et Vmaks vastab ülemises vedelikukihis valitsevale LDH 10
kontsentratsioonile. Maksimaalne vabanemine määrati, inkubeerides rakke 1%
Trition X-100 juuresolekul.
Täisvere B rakkude hulga vähendamise analüüs
Tervete B rakkude hulga vähendamine anti-CD20 antikehade poolt täisveres viidi
läbi vastavalt eelnevas näites 1 kirjeldatud meetodile. 15
Apoptoosi analüüs
Antikehade apoptootilist potentsiaali analüüsiti, inkubeerides antikeha
kontsentratsioonil 10 µg/ml kohta (küllastavad tingimused antigeeni sidumise
suhtes) üleöö (16 - 24 tundi) märklaud-rakkudega (märklaudrakkude
kontsentratsioon 5 x 105 rakku/ml kohta). Proovid värviti AnnV-FITC ja analüüsiti 20
FACS abil. Analüüs sooritati kolmes korduses.
Tuvastus sooritati voolutsütomeetriaga, järgides apoptootiliste markerite nagu
anneksiin V ja fosfatidüülseriini välimust. Negatiivne kontrollvariant (ei indutseeri
apoptoosi) ei sisaldanud antikeha, vaid ainult fosfaat-puhverdatud soolalahust.
Positiivne kontrollvariant (maksimaalne apoptoos) sisaldas 5 mikromooli tugevat 25
apoptoosi indutseerijat kamptotetsiini (CPT).
Tulemused ja arutelu
Võrreldes antikeha variantide B-HH1, B-HH2 ja B-HH3, mis oli liidetud kimäärse B-
Ly1 kerge ahelaga (mVL, kirjeldatud eelnevas näiteks 1) või inimese jaoks
EE - EP1692182 B1 115
kohandatud B-Ly1 kerge ahelaga (KV1) ja eellaseks oleva kimäärse antikehaga
chB-Ly1 (kirjeldatud eelnevas näites 1), seondumist inimese CD20 antigeeniga
selgus, et kõikidel antikehadel oli sarnane EC50 väärtus, kuid B-HH1
konstruktsioon seondus madalama intentsiivsuse/stöhhiomeetriaga kui variandid
B-HH2 ja B-HH3 (joonis Fig 11). B-HH1 võis eristada B-HH2 ja B-HH3 nii selle 5
osaliselt inimese CDR1 ja CDR2 piirkondade (Kabat´ definitsioon) kui ka
positsioonil 28 esineva Ala/Thr polümorfismi poolest (Kabat´ nummerdus). See
näitas, et antikeha/antigeeni vastastikkuse toime jaoks oli oluline kas positsioon
28, täielik CDR1 ja/või täielik CDR2.
B-HL1, B-HH1 ja kimäärse chB-Ly1 lähteantikeha võrdlus näitas, et B-HL1 10
konstruktsioonis puudus mistahes sidumisaktiivsus ja B-HH1 omas võrreldes B-
Ly1 umbes poolt sidumisintentsiivsusest/stöhhiomeetriast (joonis Fig 12). Nii B-
HL1 kui ka B-HH1 olid välja töötatud, põhinedes inimese VH1 klassist deriveeritud
aktseptori raamidele. Muude erinevuste hulgas oli B-HL1 konstruktsiooni
positsioon 71 (Kabat´ nummerdus; Kabat´ positsioon 71 vastab SEQ ID NO: 48 15
positsioonile 72) silmatorkav erinevus, näidates selle eeldatavat tähtsust antigeeni
sidumise jaoks.
Võrreldes joonistel Fig 9 kuni 13 kujutatud antigeeni sidumisandmeid,
demonstreerisid BHH2-KV1, BHLB-KV1 ja BHL11-KV1 variandid kõikide erinevate
testitud inimese jaoks kohandatud antikeha variantide hulgast parimat 20
sidumisafiinsust inimese CD20 inimese rakkude pinnal. B-HH2 ja B-HL8 ning B-
HL11 vaheline erinevus peitus ainult FR1 ja FR2 piirkondades - kõik kolm CDR
olid identsed (võrreldes näiteks SEQ ID NO: 32, 56 ja 60, mis ei olnud
nummerdatud vastavalt Kabat´, kuid mille Kabat´ nummerduse on valdkonnas
kogenud isik võimeline hõlpsasti määrama). B-HL8 ja B-HL11 FR1 ja FR2 25
järjestused olid deriveeritud inimese VH3 klassist, samas kui kogu B-HH2 raam on
deriveeritud inimese VH1 klassist. B-HL11 oli ühe Glu1Gln mutatsiooniga
(positsioon 1 on sama nii Kabat´ nummerduses kui ka järjestuste loetlemisel
kasutatud tavapärases nummerdussüsteemis) B-HL8 derivaat, kus Gln oli B-HH2
konstruktsioonis olev aminohappejääk. See tähendas, et Glu1Gln vahetus ei 30
muutnud sidumisafiinsust või -intensiivsust. Muudeks B-HH2 ja B-HL8 vahelisteks
EE - EP1692182 B1 116
erinevusteks olid 14 raami jääki, millest üks või rohkem mõjutasid nimetatud
antikeha antigeeni sidumise olemust.
B-HL4 konstruktsioon oli deriveeritud B-HH2 antikehast, asendades B-HH2 FR1
fragmendiga, mis oli deriveeritud inimese iduliini järjestusest VH1_45. Hoolimata
sellest, et FR1 olid erinevad aminohapped ainult kolmel positsioonil, oli 5
konstruktsioonil on suuresti vähenenud antigeeni sidumisvõime. Jäägid asusid
positsioonidel 2, 14 ja 30 (Kabat´ nummerdus). Nimetatud positsioonidest võis
osutuda oluliseks positsioon 30, kuna see moodustas osa Chothia CDR1
definitsioonist. Joonistel Fig 9 kuni 13 näidatud sidumiskõverate üldine analüüs
demonstreeris, et CD20 seondumisel olid olulised järgnevad inimese jaoks 10
kohandatud B-Ly1 raske ahela jäägid (Kabat´ nummerdus): N35 (Kabat´ CDR1
lõpp), täielik Kabat´ CDR1, täielik Kabat´ CDR2 ja täielik Kabat´ CDR3, jäägid A71
ning R94 (käesoleval juhul ei saa R94 treoniiniga asendada) ja Y27. Madalamal
tasemel olid samuti kaasatud A28 ja S30. Lisaks olid antigeeni sidumise jaoks
olulised Kabat´ CDR3 ja kõik kanoonilised jäägid. Inimese jaoks kohandatud 15
kergesse ahelasse, kuhu olid siirdatud täielikud Kabat´ CDR1, CDR2 ja CDR3, ei
sisestatud tagasimutatsioone. Apoptoosi indutseerimisel (joonised Fig 14, 15 ja
21) osutus kõige potentsiaalsemaks variandiks inimese jaoks kohandatud B-Ly1
variant BHHK2-KV1 (isegi potentsiaalsem kui algne chB-ly1 ja palju
potentsiaalsem kui rituximab järjestusega identset järjestust omav antikeha C2B8). 20
Muud inimese jaoks kohandatud variandid (BHL8 derivaadid), mis suurenenud
apoptoosi taastada suutsid, olid: BHL12 kuni B-HL17 (vaadake tabelit), BHH8
(segatud raamid) ning BHH9 ("segatud raamid" ühe tagasimutatsiooniga, S30T).
Positsioonid 9 ja 48 (Kabat´ nummerdus) võivad olla antigeeniga kontaktis.
Variandid BHH4 kuni BHH7 olid muudeks inimese jaoks kohandatud B-Ly1 25
variantideks, mis ei sisestanud täiendavaid inimeselt mittepärinevaid järjestusi.
Inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikeha olulisteks omadusteks oli, et see oleks
II tüübi anti-CD20 antikeha, mis on defineeritud Cragg, M.S. ja Glennie, M.J.,
Blood 103(7):2738-2743 (aprill, 2004). Seega ei indutseerinud see CD20
seondumisel mistahes märkimisväärset resistentsust CD20 mitteioonse 30
pesuvahendi ekstraheerimisele CD20+ inimese rakkude pinnalt – selle
määramiseks kasutati analüüsi, mida on kirjeldanud Polyak, M.J. ja Deans, J.P.,
EE - EP1692182 B1 117
Blood 99(9):3256-3262 (2002). See avaldas kindlasti märgatavalt väiksemat
resistentsust CD20 mitteioonse pesuvahendi ekstraheerimisele kui C2B8 antikeha
(muu anti-CD20 antikeha, millel oli rituximab identne järjestus (vaadake USA
patendipublikatsiooni nr. 2003/0003097 (Reff))). Nagu oli II tüübi anti-CD20
antikehalt oodata, puudus inimese jaoks kohandatud B-Ly1 märgatav 5
komplemendi poolt vahendatud lahustusaktiivsus ja kindlasti oli komplemendi
vahendatud lahustusaktiivsus palju väiksem kui anti-CD20 antikehal C2B8
(kimäärne IgG1, mille järjestus on identne rituximab´ga). Veel üheks inimese jaoks
kohandatud B-Ly1 antikeha oluliseks omaduseks oli, et see oli väga potentsiaalne
homotüüpilise agregatsioonianalüüsi käigus. Selles analüüsis inkubeeriti CD-20 10
positiivseid inimese rakke (Daudi rakud) rakukultuuri söötmes kuni 24 tundi
temperatuuril 37 oC 5% CO2 atmosfääris imetaja rakuinkubaatoris, mida oli
kirjeldatud detailsemalt Dean´i viiteallikas; antikeha kontsentratsiooniks oli 1
mikrogramm/ml kohta ja paralleelselt 5 mikrogrammi/ml kohta. Võrdluseks või
kontrollvariandina sooritati identsetel tingimustel paralleelne rakkude 15
inkubeerimine, kuid kasutades anti-CD20 antikeha C2B8. Erinevatel ajahetkedel,
k.a 8 tundi ja 24 tundi pärast inkubeerimise algust, uuriti rakke visuaalselt
mikroskoobi abil. Leiti, et inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikeha kasutamine
viis tugeva homotüüpilise agregatsioonini, mille agregaadid olid oluliselt suuremad
kui C2B8 kontrollantikeha lisamisel indutseeritud. Lisaks indutseeris see sarnaselt 20
anti-CD20 tüüpi antikehaga juhul, kui CD20-positiivseid inimese rakke inkubeeriti
inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikehas, suuremaid apoptoosi tasemeid
võrreldes kontrollvariandiga; tingimused oli samad ja kasutati C2B8 kimäärset
IgG1 antikeha koos rituximab´ga identse järjestusega.
Inimese jaoks kohandatud antikehade glükomuundatud variandid toodeti GnTIII 25
glükosüültransferaasi koekspressioonil koos antikeha geenidega imetajate
rakkudes. See viis antikehade Fc piirkonna külge kinnitatud fukosüülimata
oligosahhariidide fraktsiooni suurenemiseni, k.a poolitatud fukosüülimata
oligosahhariidid – vaadake patenti WO 2004/065540 (joonised Fig 17-19).
Glükomuundatud antikehadel oli oluliselt suurem seondumistase inimese 30
FcgammaRIII retseptoritega (joonis Fig 20) ja ADCC aktiivsus (joonis Fig 16) kui
glükomuundamata antikehal ja C2B8 antikehal. Inimese jaoks kohandatud B-Ly1
antikeha oli võrreldes kontrollantikehaga C2B8 samuti potentsiaalsem inimese B
EE - EP1692182 B1 118
rakkude hulga vähenemise indutseerimisel täisvere analüüsis (joonis Fig 16). See
kehtis nii glükomuundamata B-Ly1 antikeha kui ka selle glükomuundatud versiooni
kohta. Glükomuundatud antikeha oli B rakkude hulga vähendamisel täisvere
analüüsis umbes 1000 korda potentsiaalsem kui C2B8 kontroll anti-CD20
antikeha. See võrdlus oli oluline nii glükomuundamata kui ka glükomuundatud 5
inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikeha vormide jaoks, kuna see demonstreeris,
et analüüsides, mis kombineerisid Fc retseptorist sõltuvas aktiivsused nagu ADCC
pluss komplemendi vahendatud lahustus pluss apoptoosi indutseerimine, olid
mõlemad B-Ly1 vormid oluliselt potentsiaalsemad kui C2B8, kuigi mõlemal B-Ly1
vormil oli oluliselt madalam komplemendi vahendatud lahustusaktiivsus. ADCC, Fc 10
retseptorist sõltuvad rakkude hävitamise aktiivsused ja apoptoosi indutseerimine
esinesid kõik inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikeha variantides üliheas
aktiivsuses. Lisaks olid apoptoosi analüüsi käigus potentsiaalsed nii selle II tüübi
anti-CD20 antikeha glükomuundatud kui ka glükomuundamata vormid; apoptoosi
indutseerimisel olid Fc muundatud variandid, millel oli suurenenud sidumisafiinsus 15
Fcgamma retseptorite suhtes, isegi potentsiaalsemad kui Fc muundamata
variandid ning kõik variandid olid oluliselt potentsiaalsemad kui kontrollantikeha.
Täiustunud homotüüpilise agregatsiooni ja II tüübi anti-CD20 antikehade
vahendatud apoptoosi indutseerimise täpne mehhanism ei ole teada ning seda
olulist omadust võivad mõjutada kaasnev CD20-positiivsete rakkude pinnal toimuv 20
muude molekulide, näiteks Fc gamma retseptorid, sidumine. Seega oli oluline
demonstreerida, et II tüübi anti-CD20 antikehad, mida oli muundatud Fc piirkonnas
suurenenud sidumisafiinsuse saavutamiseks Fc gamma retseptoritega, k.a
FcgammaRIII, ja ADCC aktiivsuse suurendamiseks, olid endiselt võimelised
tugeva apoptoosi indutseerimiseks, mis oli isegi suurem kui Fc muundamata ja 25
homotüüpilise agregatsiooni korral tekitatu. Apoptoosi indutseerimine on oluline in
vivo, kuna kehas esineb piirkondasid, kus leidub märklauaks olevaid CD20-
positiivseid rakke, kuid milles leiduvatele FcgammaRIII-positiivsetele rakkudele
juurdepääs on keerulisem kui veres; sellisteks piirkondadeks on näiteks
lümfisõlmed. Sellistes piirkondades võib apoptoosi indutseerimine anti-CD20 30
antikeha enda poolt olla kriitilise tähtsusega anti-CD20 antikeha ravi paremaks
efektiivsuseks inimestel, ravides B rakkude arvukuse vähendamise meetodiga nii
hematoloogilisi pahaloomulisi kasvajaid nagu mitte-Hodgkinsi lümfoomid ja B raku
EE - EP1692182 B1 119
krooniline lümfotsüütiline leukeemia kui ka autoimmuunhaiguseid nagu
reumaatiline artriit ja luupus. Selliste teraapiate olulisteks atribuutideks võivad
samuti olla suurenenud sidumisafiinsus FcgammaRIII suhtes ja inimese jaoks
kohandatud Fc muundatud II tüübi anti-CD20 antikeha kõrgem ADCC. Viimasena,
selliste II tüübi anti-CD20 antikehade, k.a selle inimese jaoks kohandatud ning Fc 5
muundatud variandid, vähenenud või väheoluline komplemendi vahendatud
lahustusaktiivsus võib osutuda samuti oluliseks, kuna anti-CD20 antikehade
poolset kõrgemat komplemendi aktiveerimist on seostatud suurenenud
soovimatute kõrvaltoimete esinemisega.
10
EE - EP1692182 B1 120
Patendinõudlus
1. Inimese jaoks kohandatud glükomuundatud II tüübi anti-CD20 antikeha, millel
on pärast nimetatud inimese jaoks kohandamist nimetatud glükomuundamise
tulemusel suurenenud ADCC ja suurenenud apoptoosi indutseerimise võime
märklaud-rakkudes ja kus nimetatud antikeha koosneb raske ahela varieeruvast 5
piirkonnast, mis sisaldab hiire B-Ly1 antikeha komplementaarsust määravaid
piirkondi (CDR), kus:
a. raske ahela CDR1 on SEQ ID NO: 16;
b. raske ahela CDR2 on SEQ ID NO: 26; ja
c. raske ahela CDR3 on SEQ ID NO: 28; 10
kus nimetatud antikeha raske ahela varieeruva piirkonna raami piirkonnad (FR)
FR1, FR2 ja FR3 on VH1_10 inimese idutee järjestuse poolt kodeeritavad inimese
FR järjestused ja nimetatud antikeha raske ahela varieeruv piirkond FR4 on
inimese JH4 idutee järjestuse poolt kodeeritud inimese FR järjestus; nimetatud
antikeha sisaldab täiendavalt kerge ahela varieeruvat piirkonda, mis omakorda 15
sisaldab hiire B-Ly1 antikeha CDR, kus:
d. kerge ahela CDR1 on SEQ ID NO: 18;
e. kerge ahela CDR2 on SEQ ID NO: 19; ja
f. kerge ahela CDR3 on SEQ ID NO: 20,
nimetatud antikeha kerge ahela varieeruva piirkonna FR FR1, FR2 ja FR3 on 20
VK_2_40 inimese idutee järjestuse poolt kodeeritud inimese FR järjestused ja
nimetatud antikeha kerge ahela varieeruva piirkonna FR4 on JK4 inimese idutee
järjestuse poolt kodeeritud inimese FR järjestus.
2. Antikeha vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et antikeha sisaldab
eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ ID NO: 32 või SEQ ID NO: 40 25
raske ahela varieeruva piirkonna järjestusest.
3. Antikeha vastavalt punktile 1 või 2, mis erineb selle poolest, et antikeha
sisaldab eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ ID NO: 40 raske
ahela varieeruva piirkonna järjestusest.
EE - EP1692182 B1 121
4. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 3, mis erineb selle poolest,
et antikeha sisaldab eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ ID NO:
76 kerge ahela varieeruva piirkonna järjestusest.
5. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 4, mis erineb selle poolest,
et antikeha sisaldab esimest eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ 5
ID NO: 32 või SEQ ID NO: 40 raske ahela varieeruva piirkonna järjestusest; ja
teist eraldatud polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 76 kerge ahela varieeruva
piirkonna järjestust.
6. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 5, mis erineb selle poolest,
et antikeha sisaldab esimest eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ 10
ID NO: 40 raske ahela varieeruva piirkonna järjestusest; ja teist eraldatud
polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 76 kerge ahela varieeruva piirkonna
järjestust.
7. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 6, mis erineb selle poolest,
et nimetatud antikeha on suurenenud poolitatud komplekside vormis 15
oligosahhariidide hulga saavutamiseks glükomuundatud.
8. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 7, mis erineb selle poolest,
et nimetatud antikeha on vähenenud fukoosi jääkide koguse saavutamiseks
glükomuundatud.
9. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 8, mis erineb selle poolest, 20
et nimetatud antikehal on modifitseeritud oligosahhariididega Fc piirkond.
10. Antikeha vastavalt punktile 9, mis erineb selle poolest, et vähemalt 20%
nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud
ja fukosüülimata.
11. Antikeha vastavalt punktile 9, mis erineb selle poolest, et vähemalt 50% Fc 25
piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.
12. Peremeesrakk, mis avaldab vähemalt ühte β(1,4)-N-atsetüül-
glükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidi kodeerivat nukleiinhapet
koguses, mis on piisav nimetatud peremeesraku poolt toodetud polüpeptiidi Fc
EE - EP1692182 B1 122
piirkonna modifitseerimiseks ja nimetatud polüpeptiidiks on ükskõik millisele
punktile 1 kuni 11 vastav antikeha.
13. Peremeesrakk vastavalt punktile 12, mis erineb selle poolest, et nimetatud
peremeesraku poolt toodetud nimetatud antikeha avaldab nimetatud
glükomuundamise tulemusel suurenenud Fc retseptorit siduvat afiinsust. 5
14. Peremeesrakk vastavalt punktile 13, mis erineb selle poolest, et nimetatud Fc
retseptoriks on FcγRIIIA retseptor.
15. Peremeesrakk vastavalt punktile 12, mis erineb selle poolest, et nimetatud
peremeesraku poolt toodetud nimetatud antikeha avaldab nimetatud
glükomuundamise tulemusel suurenenud efektori funktsiooni. 10
16. Peremeesrakk vastavalt punktile 15, mis erineb selle poolest, et nimetatud
suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene
signalisatsioon.
17. Peremeesrakk vastavalt punktile 12, mis erineb selle poolest, et sisaldab
täiendavalt vähemalt ühte transfekteeritud polünukleotiidi, mis kodeerib ükskõik 15
millisele punktile 2, 3, 5 või 6 vastavat polüpeptiidi ja nimetatud nukleiinhape
sisaldab järjestust, mis kodeerib inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga
samaväärset piirkonda.
18. Ravimkoostis, mis sisaldab antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni
11 ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit. 20
19. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 11 kasutamiseks ravimina
B raku lümfoomi ravimiseks.
20. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 11 kasutamine ravimi
valmistamiseks B raku lümfoomi ravimiseks.