sv ětelná a fluorescen ční mikroskopie - fyzika.upol.cz · do optického systému kondenzoru...
TRANSCRIPT
Světelná a fluorescenční mikroskopie
Teorie: Světelný mikroskop Základem optického mikroskopu jsou dvě soustavy čoček objektiv a okulár
(mechanická část spojující objektiv s okulárem se nazývá tubus).
Z hlediska kvality zobrazení je nejvýznamnější čočkou optické soustavy mikroskopu
objektiv , vytvářející skutečný, zvětšený a převrácený obraz. Obraz vytvořený objektivem
je pak pozorován okulárem jako lupou a výsledkem je zvětšený, převrácený a neskutečný
obraz. Mikroskop tedy zobrazuje dvoustupňově. Nejprve objektiv vytvoří obraz předmětu
v horní ohniskové rovině objektivu a následně tento obraz zvětšuje okulár. Zvětšený obraz je
pak registrován oční sítnicí (nebo kamerou).
Dokonalé osvětlení zorného pole mikroskopu je umožněno další optickou soustavou,
kondenzorem, který soustřeďuje světelné paprsky do místa, kde se nachází pozorovaný
objekt.
objektivy
Mechanická konstrukce uspořádání mikroskopu je ovlivněna především typem vzorku,
pro který je mikroskop určen a způsobem jeho osvětlení. Kromě klasických typů mikroskopů,
jak je naznačeno na obrázku 1 vlevo se vyrábějí také invertované typy mikroskopů, viz
obrázek 1 vpravo, který mají revolverový stolek s objektivy pod vzorkem. Využívá se jich
hlavně k pozorování biologických vzorků, především buněčných kultur, které jsou
adherované na dně kultiva ční misky.
Kvalitu zobrazení mikroskopických objektů charakterizují tyto parametry: zvětšení,
rozlišovací schopnost mikroskopu a obrazový kontrast.
Zvětšení mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu a okuláru. Maximální
zvětšení dosažitelné nejlepšími objektivy, které by bylo užitečné při vizuálním pozorování,
je 500x až 1000x. Zvětšíme-li pomocí silnějšího okuláru obraz nad tuto mez, získáme jen
prázdné zvětšení – to jest větší obraz bez jakýchkoli nových detailů.
Důležitým pojmem je rozlišovací schopnost, která má v mikroskopii větší význam
než zvětšení. Jedná se o vzdálenost dvou ještě rozlišitelných bodů. Potřebné výpočty pro
rozlišovací mez mikroskopu provedl a prakticky uplatnil průkopník mikroskopie – německý
fyzik Ernst Karl Abbe (1840 – 1905). Dospěl k výrazu: µ
λδsin⋅
=n
, kde λ je vlnová délka
použitého světla, n je index lomu prostředí mezi objektivem a krycím sklíčkem preparátu a µ
je poloviční otvorový úhel (polovina úhlu 2µ, který svírají protilehlé krajní paprsky
vycházející z předmětového bodu na optické ose mikroskopu a vstupují ještě do objektivu),
viz obr. Otvorový úhel objektivu.
objektivy
okulár
Otvorový úhel objektivu
Charakteristická hodnota numerické apertury daná konstrukcí objektivu
Rozlišovací schopnost objektivu je vyjádřena jeho numerickou (číselnou)
aperturou (NA), jejíž výpočet byl uveden výše ve jmenovateli Abbeho vztahu
(NA = n ⋅ sinµ).
Číselná apertura objektivu má velký praktický význam. Určuje rozlišovací
schopnost a hranice užitečného zvětšení, ovlivňuje světelnost mikroskopického obrazu
a hloubku ostrosti (snížením NA se zvětšuje tloušťka zobrazené vrstvy preparátu). Hloubkou
ostrosti se rozumí tloušťka vrstvy preparátu (výška předmětového pole), ve které se nalézají
zobrazené objekty. Ty objekty, které leží nad a pod touto vrstvou, jsou zobrazeny neostře
nebo vůbec. S rostoucí aperturou objektivu se hloubka ostrosti zmenšuje. Pokud chceme
zobrazit detaily a nečistoty ležící nad a pod objektem, zvětšíme hloubku ostrosti přicloněním,
dojde ale ke snížení kvality obrazu.
Při vizuálním pozorování a s nejkvalitnějšími objektivy je rozlišovací schopnost optických
mikroskopů mírně lepší než polovina vlnové délky použitého světla. Samotná vynikající
rozlišovací schopnost objektivu však ještě nezaručuje, že teoreticky rozlišitelné strukturní
detaily v mikroskopickém obrazu skutečně uvidíme. Můžeme je spatřit jen tehdy, existuje-
li dostatečný rozdíl jasu mezi nimi a jejich okolím.
Proč fázový kontrast?
Běžným světelným mikroskopem se zobrazují struktury, které se liší absorbcí
viditelného světla. Jestliže světlo procházející objektem mění svou vlnovou délku
a amplitudu, rozeznáváme to jako rozdíly v barvě objektu a v intenzitě světla. Takové
vlastnosti mají zabarvené objekty (např. histologické preparáty) a označují se jako
amplitudové objekty.
Druhým typem jsou fázové objekty, které jsou bezbarvé a nemění amplitudu světla.
Absorpce světla pozorované struktury se od svého okolí (růstového média) liší jen v místech
s rozdílnou optickou hustotou - nepatrnou změnou indexu lomu. Při průchodu světla
biologickými objekty nastane pouze posunutí fáze světelné vlny a proto struktury nemají
dostatečný kontrast pro zobrazení v běžném světelném mikroskopu. Malé fázové rozdíly
však naše oko nerozezná, je citlivé jen na barvy viditelného spektra nebo na změnu
intenzity (amplitudy) světla a proto se nám tyto objekty jeví průhledné a bezstrukturní.
Aby došlo ke změně amplitudy procházejícího vlnění skrz vzorek a tím ke zvýšení
kontrastu, můžeme ho obarvit. Mnoho biologických objektů patří právě mezi fázové objekty
a bez barvení jsou v běžném optickém mikroskopu špatně pozorovatelné. Přítomnost barviva
přitom představuje mnohdy vážný zásah do činnosti buňky, která může být takto i usmrcena.
Fázově kontrastní mikroskopy umožňují pozorování bezbarvých živých objektů v nativním
stavu bez jakéhokoliv barvení .
Fázový kontrast je tedy vhodnou metodou pro pozorování živých buněčných linií.
Přeměňuje neviditelné fázové rozdíly vlnění, vzniklé po průchodu fázovým objektem,
na změnu intenzity světla, které rozeznáváme.
Obr. : A) zobrazení fibroblastu ve světlém poli (běžným optickým mikroskopem),
B) zobrazení fibroblastu optickým mikroskopem s fázovým kontrastem
Činnost fázově kontrastního mikroskopu si můžeme představit takto:
Mikroskop s fázovým kontrastem je vybaven fázovým objektivem a fázovým
kondenzorem, v nichž se vyskytují prstenčité clony, které si velikostí odpovídají. Obě clony
se seřídí, aby se jejich obrazy v zorném poli přesně překrývaly.
Objektiv modifikovaný pro fázový kontrast
Do optického systému kondenzoru (do místa jeho přední ohniskové roviny) je
umístěna kruhová clona se zatemněným středem – světlo prochází jen úzkým mezikružím.
Vzniká dutý kužel přímého světla, oddělený od světla difraktovaného – dochází k separaci
vlnění.
Následně světelné paprsky projdou vzorkem. Na fázových objektech nastane
odchýlení a zpomalení některých paprsků z původního směru (ohybem, rozptylem či lomem),
což je způsobeno indexem lomu a tloušťkou preparátu.
fázová destička
Schéma optické soustavy mikroskopu pro fázový kontrast
Kontrast amplitudových objektů je způsoben interferencí přímého
a difraktovaného světla posunutého o ½ vlnové délky. Při pozorování fázového objektu
dochází ke zpomalení pouze o ¼ vlnové délky a po interferenci s přímým světlem
nedochází ke snížení intenzity světla - ke vzniku dostatečného kontrastu. To znamená,
že při zobrazování fázových objektů musíme posunout přímé světlo o ¼ , abychom dosáhli
rozdílu vlnových délek ½, jako je tomu při pozorování amplitudových objektů. K tomuto
posunu slouží fázové destičky (jedna v objektivu, druhá v kondenzoru). Obraz je nakonec
vytvořen interferencí paprsků fázově posunutých (o ½ vlnové délky) a světla
průchozího.
Jsou-li fázově posunuty paprsky se změněným směrem šíření (difraktované),
dojde k destruktivní interferenci a fázové objekty se jeví jako tmavší vůči svému pozadí -
hovoříme o pozitivním fázovém kontrastu. Jsou-li posunuty paprsky nevychýlené
(průchozí) ze svého směru, vznikne konstruktivní interference, detaily vzorku jsou světlé
na tmavém pozadí a hovoříme o negativním fázovém kontrastu.
Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční mikroskopie využívají schopnosti některých látek emitovat viditelné
světlo po ozáření světlem o kratší vlnové délce. Většinou se využívá ultrafialového záření
a přilehlé oblasti viditelného spektra emitovaného halogenovými lampami, rtuťovými
výbojkami, lasery, nebo LED diodami. Ze světelného zdroje (např. rtuťové výbojky) je
tedy emitováno světlo o krátké vlnové délce (UV), excitační filtr propustí paprsky jen
s vybranou vlnovou délkou, které pokračují na dichroické zrcadlo a z něho jsou odraženy
směrem ke vzorku. Po interakci světla s barvivem se emituje záření o delší vlnové délce,
než byla vlnová délka dopadajícího záření, excitovaného ze světelného zdroje. Toto
záření zachytí objektiv a následně bariérový filtr, který zajistí výstup záření jen
o určité vlnové délce.
Schéma - dopad světla na vzorek a vznik fluorescenčního zářeni
Konstrukce fluorescenčního mikroskopu
Excitace elektronu v molekule barviva a následná fluorescence
Příklad:
Máme bezbarvý vzorek (adherované buňky) a potřebuji zjistit jejich počet a viabilitu (zda
jsou živé). Obarvím buňky barvivem (např. kalceinem, který zabarví pouze živé buňky).
Abychom viděli fluorescenční obraz (viz. snímek), musíme vědět, jakým světlem (vln.
délkou) musíme na vzorek posvítit – to je vždy uvedené na příbalovém letáku zakoupené
barvičky. Pro kalcein je to světlo o vlnové délce 494 nm (tj. excitační vlnová délka).
Ze zdroje vyjde záření o všech vln. délkách, ale excitační filtr na vzorek propustí jen
paprsky námi požadované vlnové délky (494 nm). Toto záření interaguje se vzorkem
(excitují se elektrony molekuly barviva (kalceinu) a při návratu elektronů
na základní energetickou hladinu dojde k vyzáření (k emitaci) světla o delší vlnové délce
(princip fluorescence)). Vlnová délka emitovaného záření je u kalceinu 517 nm (zelená oblast
spektra). Aby do okuláru vstupovaly pouze tyto paprsky a už žádné zbytkové UV záření,
které se vzorkem neinteragovalo, je mikroskop vybaven ještě bariérovým filtrem, který
propustí jen zelenou barvu.
Zeleně svítící kalcein, který obarvil buněčnou membránu živých buněk Některé složky živé hmoty vykazují autofluorescenci, například aminokyselina
tryptofan i jiné látky s aromatickým jádrem či heterocyklem. Většinou jsou však k preparátům
přidávána speciální fluorescenční barviva schopná specifické interakce s různými buněčnými
strukturami. V některých případech je fluorescenční barvivo (fluorochrom) navázáno na
protilátku specifickou pro některou z bílkovin přítomných v cytoplasmě. V takovém případě
lze selektivně zviditelnit například složky cytoskeletu, chromatin, membránové bílkoviny
apod.
Laboratorní část: A) Pasážování buněk 1) Zahřejte zmražený trypsin na 37°C 2) Vyndejte kultivační destičku z inkubátoru a po otření desinfekcí umístněte do flow boxu 3) Z jamek určených pro pasážování buněk odeberte všechno médium (500 µl) a jamku promyjte PBS (300 µl) 4) Do všech jamek, které pasážujete, napipetujte nejprve prvních 70 µl trypsinu a následně druhých 70 µl. Zavřete kultivační destičku a nechte ve flow boxu 8 min v klidu (vhodné občasné míchání – plynulým pohybem destičky rukou) 5) Do každé jamky přidejte 350 µl média, pomalu rozsuspenzujte a napipetujte všechen objem do připravené ependorfky 6) Centrifugujte 3 min na 6000 otáček 7) Zkontrolujte množství vzniklého peletu a nařeďte na vhodný objem (po konzultaci s asistentem praktik) 8) Rozpasážujte objem do odpovídajících nových jamek a vložte do inkubátoru
Buňka, která se začíná adherovat na dno kultivační jamky
Buňka, která není přichycená ke dnu, má zakulacený tvar
Buňky 3 hod po tryspinizaci Buňky adherované, 100% konfluence
Mrtvé buňky – kulaté, protože se
deadherovaly ode dna
B) Značení buněk fluorochromem 1) Z jamky odeberte všechno médium a napipetujte tam 200 µl nového. Přidejte 2 µl zásobního roztoku kalceinu a opětovným nasátím do pipety rozmíchejte. Vložte do inkubátoru na 10 minut. 2) Odeberte všechno médium obsahující kalcein, promyjte v 500 µl nového média a přidejte opět nových 500 µl, ve kterých vzorek budete pozorovat 3) Půl hodiny po této výměně vzorek pozorujte na světelném mikroskopu ve fluorescenčním módu Do protokolu vysvětlete pojmy: kmenová buňka; k čemu jste používali trypsin a proč musel mít teplotu 37°C a čím se zastavila jeho reakce; buněčná terapie v regenerativní medicíně; proč se buňky značí nanočásticemi; co je to nanočástice Mikroskopická část: 1) Najděte ostrý obraz buněčné kultury pro každé zvětšení a nasnímejte. Vyzkoušejte si všechny možné nastavitelné kontrasty a zapište, při kterém kontrastu jste obraz viděli nejostřeji (v každém zvětšení (4x, 10x, 20x, 40x)). 2) Nasnímejte obraz ve fázovém kontrastu při zvětšení objektivu 20 a totéž místo nasnímejte ve fluorescenčním módu 3) Oba snímky složte a do výsledného obrazu vložte měřítko podle použitého zvětšení 4) Každý z vás spočítejte množství buněk z 10ti různých zorných polí z jednotlivých jamek a do protokolu vytvořte společnou tabulku. Stanovte zde průměr počtu buněk/zorné pole a jamky mezi sebou porovnejte. Do protokolu vysvětlete, co znamenají: jednotlivé značky na objektivu, princip fázového kontrastu a fluorescenčního zobrazení, fluorochrom, numerická apertura, rozlišovací schopnost a hloubka ostrosti a popište výhody/nevýhody pozorování vzorku ve fluorescenčním režimu Doporučené zdroje: http://www.olympusmicro.com/ http://www.mesenchymal-stem-cells.com/