Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Mateja Jagić

Raznolikost mitohondrijske DNA divlje mačke (Felis silvestris) u Hrvatskoj

Diplomski rad

Zagreb, 2014

Ovaj rad je izrađen na Zavodu za animalnu fiziologiju Prirodoslovno-matematičkog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom mentorice doc. dr. sc. Ane Galov. Rad je predan na ocjenu

Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja

zvanja magistra molekularne biologije.

ZAHVALE

Posebno zahvaljujem mentorici doc. dr. sc. Ani Galov i dr. sc. Magdi Sindičić s Veterinarskog fakulteta na strpljenju, podršci i nesebičnoj pomoći, kako prilikom mog rada u laboratoriju, tako

i prilikom izrade i pisanja ovog rada.

Velika zahvala i Gordani Žakman na susretljivosti i pomoći pri radu te korisnim savjetima.

Zahvaljujem doc. dr. sc. Deanu Konjeviću, doc.dr. sc. Nikici Špremu, Vedranu Slijepčeviću dr. vet. med. i Ratku Popoviću na velikoj pomoći pri prikupljanju uzoraka divljih mačaka, te Jeleni

Selanec dr. med. vet. na pomoći pri prikupljanju uzoraka krvi domaćih mačaka.

I na kraju, puno hvala mojim roditeljima i cijeloj obitelji koji su bili puni razumijevanja i omogućili mi studij, te svim mojim prijateljima koji su bili uz mene tijekom studiranja.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u ZagrebuPrirodoslovno – matematički fakultetBiološki odsjek Diplomski rad

RAZNOLIKOST MITOHONDRIJSKE DNA DIVLJE MAČKE (Felis silvestris)

U HRVATSKOJ

Mateja Jagić

Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb, Hrvatska

Divlja mačka (Felis silvestris) autohtona je i strogo zaštićena vrsta u Hrvatskoj, međutim

objavljeno je vrlo malo znanstvenih podataka o hrvatskoj populaciji divlje mačke. Cilj ovog

istraživanja bio je analizirati raznolikost kontrolne regije mitohondrijske DNA divlje mačke na

području Hrvatske te usporediti dobivene haplotipove s haplotipovima domaće mačke (Felis

catus). Istraživanje je provedeno na 41 uzorku divljih, te 38 uzoraka domaćih mačaka. Analiziran

je slijed kontrolne regije mitohondrijske DNA duljine 814 parova baza, te je kod divlje mačke

utvrđena prisutnost 22 polimorfna mjesta koji čine 11 različitih haplotipova. Haplotipska

raznolikost analiziranih sljedova iznosila je 0,857 +/- 0,036, dok je nukleotidna raznolikost 0,017

+/- 0,009. Kod 38 uzoraka domaće mačke utvrđeno je 21 polimorfno mjesto koji čine 11

haplotipova. Haplotipska raznolikost analiziranih sljedova domaće mačke iznosila je 0,758 +/-

0,067, a nukleotidna 0,011 +/- 0,006. Među haplotipovima divlje i domaće mačke nema

podudaranja. Na temelju dobivenih rezultata zaključujem da je genetička raznolikost kontrolne

regije mitohondrijske DNA divlje mačke iz Hrvatske relativno visoka.

(34 stranice, 11 slika, 10 tablica, 35 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u središnjoj biološkoj knjižnici

Ključne riječi: divlja mačka, domaća mačka, genetička raznolikost, haplotip, polimorfno mjesto

Voditelj: doc. dr. sc. Ana Galov

Ocjenitelji: doc. dr. sc. Ana Galov, izv. prof. dr. sc. Dunja Leljak-Levanić, izv. prof. dr.

sc. Zlatko Liber

Rad prihvaćen: 1. prosinca 2014.

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of ZagrebFaculty of ScienceDivison of Biology Graduation Thesis

DIVERSITY OF MITOCHONDRIAL DNA IN WILDCAT (Felis silvestris)

IN CROATIA

Mateja Jagić

Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb, Croatia

Wildcat (Felis silvestris) is autochthonous and strictly protected species in Croatia; however

there is almost none scientific data on Croatian wildcat population. The goal of this research was

to investigate diversity of mitochondrial DNA control region of wildcat from Croatia and to

compare identified haplotypes with haplotypes of domestic cat (Felis catus). A total of 41

samples of wildcats and 38 domestic cat samples were included in the research. I analysed 814

base pairs long control region sequences and in wildcat samples 22 polymorphic sites were

identified yielding 11 different haplotypes. Haplotype diversity of analysed sequences was 0,857

+/- 0,036, while nucleotide diversity was 0,017 +/- 0,009. Among 38 domestic cats samples 21

polymorphic sites were identified yielding 11 haplotypes. Haplotype diversity of analysed

sequences of domestic cats was 0,758 +/- 0,067, while nucleotide diversity was 0,011 +/- 0,006.

There were no matches between wildcat and domestic cat haplotypes. Based on these results I

conclude that mitochondrial DNA control region diversity of wildcat from Croatia is fairly high.

(34 pages, 11 figures, 10 tables, 35 refrences, original in: Croatian)

Thesis deposited in Central Biological Library

Key words: wildcat, domestic cat, genetic diversity, haplotype, polimorfic site

Supervisor: Dr. Ana Galov, Asst. Prof.

Reviewers: Dr. Ana Galov, Asst. Prof., Dr. Dunja Leljak-Levanić, Assoc. Prof., Dr.

Zlatko Liber, Assoc. Prof.

Thesis accepted: 1st December 2014.

SADRŽAJ

1. UVOD ....................................................................................................................................................1

1.1. DIVLJA MAČKA ..............................................................................................................................1

1.1.1. BIOLOGIJA MAČAKA..............................................................................................................1

1.1.2. EVOLUCIJA I FILOGENIJA MAČAKA........................................................................................3

1.1.3. DOMESTIKACIJA DOMAĆE MAČKE........................................................................................5

1.1.4. RASPROSTRANJENOST ..........................................................................................................7

1.2. MITOHONDRIJSKA DNA ................................................................................................................ 9

1.3. ISTRAŽIVANJA MITOHONDRIJSKE DNA DIVLJE MAČKE U EUROPI ..............................................11

1.4. CILJ ISTRAŽIVANJA.......................................................................................................................12

2. MATERIJAL I METODE .........................................................................................................................13

2.1. UZORCI DIVLJIH I DOMAĆIH MAČAKA ........................................................................................13

2.2. IZOLACIJA DNA............................................................................................................................16

2.2.1. IZOLACIJA DNA IZ MIŠIĆNOG TKIVA DIVLJE MAČKE............................................................16

2.2.2. IZOLACIJA DNA IZ KRVI DOMAĆE MAČKE ...........................................................................16

2.3. LANČANA REAKCIJA POLIMERAZOM (PCR).................................................................................17

2.4. ELEKTROFOREZA I SEKVENCIRANJE.............................................................................................18

2.5. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA ..............................................................................................19

3. REZULTAT............................................................................................................................................20

4. RASPRAVA...........................................................................................................................................31

5. ZAKLJUČAK ..........................................................................................................................................33

6. LITERATURA ........................................................................................................................................34

ŽIVOTOPIS ...................................................................................................................................................38

1

1. UVOD

1.1. DIVLJA MAČKA

Divlja mačka (Felis silvestris) ubraja se u red zvijeri (Carnivora), porodicu mačaka

(Felidae) i rod mačke (Felis). Politipska je vrsta zastupljena s tri divlje podvrste, afričkom (F.

s. libyca), europskom (F. s. silvestris) i azijskom (F. s. ornata) (Pierpaoli i sur. 2003.).

Taksonomija i sistematika podvrsta divlje mačke još uvijek je predmet istraživanja, a

zahvaljujući spoznajama iz područja populacijske genetike pojedine podjele uključuju i pet

podvrsta (osim nabrojanih, podvrstama se smatraju i južna afrička divlja mačka (F. s. cafra) i

kineska alpska stepska mačka (F. s. bieti), no najčešće je prihvaćena tradicionalna podjela na

navedene tri podvrste (Driscoll i Nowell 2010.). Domaća mačka, koja je nastala

udomaćivanjem divlje afričke mačke (F. s. libyca) prije otprilike 10 000 godina na Bliskom

istoku, klasificira se kao zasebna vrsta (Felis catus) ili podvrsta (Felis silvestris catus)

(Driscoll i sur. 2007.).

1.1.1. BIOLOGIJA MAČAKA

Možda zato što se suočavaju s jednakim izazovima lova, podčinjavanja i konzumacije

plijena, ili zbog relativno nedavne evolucije, porodicu mačaka odlikuje velika morfološka

sličnost. Izvrsni su lovci s posebno oblikovanim pandžama za držanje i svladavanje plijena

prije zadavanja smrtonosnog ugriza. Pandže uglavnom drže uvučene u kožne nabore čime ih

štite prilikom hodanja te one zadržavaju svoju oštrinu, a izvlače ih samo kada je potrebno.

Udovi mačaka relativno su dugački s po pet prstiju na prednjim i četiri na stražnjim nogama.

Za razliku od ostalih zvijeri, mačke imaju kraća lica i okruglije glave. Širi zigomatični lukovi

omogućuju prihvaćanje velikih žvačnih mišića, a u čeljusti se nalazi 28 do 30 zuba

prilagođenih ubijanju plijena i trganju mesa (Macdonald i Loveridge 2010.).

Divlja i domaća mačka naizgled su vrlo slične kako po građi tijela, tako i po obojenosti

krzna. Međutim, divlja je mačka krupnije i snažnije građe pri čemu se posebno ističe krupnoća

glave. Usne i mekuši divlje mačke tamno su pigmentirani, gotovo crni, za razliku od domaće

mačke u koje su svjetliji. Također, unutarnja strana ušne školjke kod divlje je mačke jako

obrasla dlakom, dok je kod domaće mačke gornji unutarnji rub uške gol. Krzno divlje mačke je

2

neujednačene, tamno sive boje prošarano s tamnom linijom duž hrpta i poprečnim prugama po

leđima i trbuhu. Dlaka na podbratku i vratu je svjetlija, dok je trbuh zagasito žut. Tijelo je

zbijeno, dugačko 80 do 90 cm, a visoko 35 do 45 cm. Tjelesne je mase do 10 kg, a samo rijetki

primjerci teže više. Stražnje noge dulje su od prednjih i omogućuju joj dugi skok. Rep divlje

mačke je kitnjast, cijelom duljinom kružno obrastao dlakom što ga čini puno krupnijim od repa

domaće mačke. Na repu se nalazi šest do osam međusobno odijeljenih prstenova koji su sve

tamniji prema kraju repa, a sam kraj je uvijek prekriven dlakom crne boje i tup (Janicki i sur.

2007.) (Slika 1).

Slika 1. Razlike domaće i divlje mačke. Preuzeto i prilagođeno iz Kilshaw 2011.

Sva osjetila mačaka jako su dobro razvijena, posebice vid i sluh. Dikromatski vid mačaka

dobro je prilagođen kako dnevnom svjetlu tako i noćnim uvjetima. Reflektirajući sloj stanica

koji se nalazi iza retine oka, tapetum lucidum, reflektira svjetlost koja ulazi u oko pojačavajući

stimulaciju osjetilnih stanica i omogućujući mačkama snalaženje u gotovo potpunom mraku.

Sluh mačaka proteže se u rasponu od 200 Hz do 100 kHz (gornja granica ljudskog sluha je 20

kHz), a efikasno čuju do 78 kHz. To im omogućuje da otkriju ultra-zvučnu komunikaciju

glodavaca koja se odvija na frekvencijama od 20 do 50 kHz. Nadalje, oblik vanjskog uha i

ušnog kanala bitni su za lociranje zvukova u prostoru što mačke čini sposobnima za otkrivanje

plijena na većoj udaljenosti, ali i za komunikaciju s drugim mačkama. Za međusobnu

komunikaciju mačkama služi i njuh, no u lovu na plijen on je puno manje bitan od sluha i

smatra se da je ovo osjetilo najslabije razvijeno. S druge strane, osjetilo opipa je izvrsno

3

razvijeno. Brkovi (vibrissae), specijalizirane su duge taktilne dlake deblje od tjelesnih dlaka i

usađene dublje u kožu. Nalaze se u tekućinom ispunjenim vrećicama s bogatom zalihom

živaca, tako da je sve što dotakne brkove trenutno otkriveno. Brkovi mačke dijele se u tri

glavne skupine: na obrazima, iznad očiju i na njušci. Oni na obrazima i iznad očiju bitni su za

zaštitu očiju, dok su oni na njušci vjerojatno najvažniji za hvatanje plijena jer osiguravaju da je

ubojit ugriz točno usmjeren (Macdonald i Loveridge 2010.).

Divlja mačka je noćno aktivna životinja. U lov kreće u sumrak, a završava ga u zoru.

Osnova prehrane su joj sitni glodavci, uglavnom miševi i voluharice, no lovi sve što može

savladati (od zečeva i šumskih koka pa sve do lanadi). Lovi prikradanjem ili dočekom i

zaskokom plijena, a izlovljena staništa napušta. Danju se povlači u sklonište koje nalazi u

napuštenim jazbinama, šupljim deblima, raspuklinama u stijeni, ili se odmara u krošnjama

drveća. Živi asocijalno i samotnjački osim za vrijeme parenja. Ženka u proljeće na svijet

donosi četiri do pet mačića kojima, nakon prestanka sisanja, donosi živi plijen kako bi učili

vještinu lova, a pred zimu se leglo razilazi i mlade se mačke osamostaljuju. Životni vijek divlje

mačke iznosi 12 do 15 godina (Janicki i sur. 2007.).

1.1.2. EVOLUCIJA I FILOGENIJA MAČAKA

Prve zvijeri nalik mačkama javljaju se u oligocenu prije 35 milijuna godina, a prvim

pravim pripadnikom porodice mačaka (Felidae) smatra se rod Proailurus (Slika 2). To su

mačke veličine crvenog risa (Linx rufus), no kraćih udova i s nekoliko manjih razlika od

modernih mačaka u građi zubala i lubanje, koje su se pojavile u Europi prije više od 20

milijuna godina. Zatim se javljaju mačke iz Pseudaelurus kompleksa čiji su fosili nađeni širom

Europe, Azije i Sjeverne Amerike, a od kojih se odvajaju dvije potporodice: Felinae ili

stožastozube mačke i Machairodontinae ili sabljozube mačke (Macdonald i Loveridge 2010.).

U potporodicu Felinae spadaju svi danas živući rodovi mačaka koji su, po istraživanju koje su

proveli Johnson i sur. (2006.), podijeljeni u osam filogenetskih skupina. Prva se odvojila linija

Panthera, s rodovima Neophelis i Panthera, prije 10,8 milijuna godina. Zatim slijedi linija

bornejske mačke (rod Pardofelis) prije 9,4 milijuna godina i linija pustinjskog risa (rodovi

Caracal i Leptailurus) prije 8,5 milijuna godina. Četvrta se odvojila linija ocelota (rod

4

Leopardus) prije 8 milijuna godina, a nakon nje linija risa (rod Lynx) prije 7,2 milijuna i linija

puma (rodovi Puma i Acinonyx) prije 6,7 milijuna godina. Zadnje grananje odvilo se prije 6,2

milijuna godina kad su se odvojile dvije linije malih mačaka Starog svijeta: linija leopardske

mačke s rodovima Otocolobus i Prionailurus te linija domaće mačke s rodom Felis.

Molekularni podaci uglavnom se vrlo dobro poklapaju s fosilnim nalazima, a u ovakvoj

filogeniji mačaka uočljivo je da se razdvajanje u osam skupina zbivalo u kratkim razmacim

tijekom kasnog miocena što upućuje na neku, za sad još nepoznatu, funkcionalnu ili ekološku

pojavu.

Slika 2. Proailurus na grani. Preuzeto iz Anton i sur. (2000.)

Rodu Felis pripadaju četiri vrste: tropska mačka (F. chaus), crnonoga mačka (F. nigripes),

pustinjska mačka (F. margarita) i divlja mačka (F. silvestris). Međutim, unutar ovog roda i

vrste Felis silvestris postoje dvojbe kao što je ranije opisano u uvodu. Tako južnu afričku

divlju mačku (F. s. cafra) i kinesku alpsku stepsku mačku (F. s. bieti) neki autori smatraju

zasebnim vrstama roda Felis, dok su po drugima podvrsta divlje mačke (F. silvestris). Također,

jednake su dvojbe i oko klasifikacije domaće mačke koja se svrstava ili kao zasebna vrsta (F.

catus) ili podvrsta (F. s. catus) (Driscoll i sur. 2007.).

5

1.1.3. DOMESTIKACIJA DOMAĆE MAČKE

Preci većine domesticiranih životinja živjeli su u krdima ili čoporima s jasno izraženom

hijerarhijom. Ljudi su iskoristili tu činjenicu te se nametnuli kao alfa jedinke i preuzeli

kontrolu nad cijelom grupom (Driscoll i sur. 2009a.). Tako je umjetnom selekcijom, koja se

provodi još od kamenog doba, nastala većina danas domaćih životinja. Ljudi su počeli

pripitomljivati životinje kako bi od njih imali neku korist, uglavnom prehrambenu, osim u

slučaju vuka čijim su pripitomljivanjem dobili prvo zaštitara, a zatim i lovca (Driscoll i sur.

2009b).

Mačke, koje su obligatni mesojedi, žive samotnjački, vrlo su teritorijalne i uz sve to ne

obavljaju zadane zadatke, loši su kandidati za domestikaciju te je malo vjerojatno da su ih ljudi

pripitomili kako bi od njih imali koristi. Veća je mogućnost da su se mačke približile ljudskim

naseljima privučene hrpama smeća na periferiji, a potom i ušle u naselja otkrivši novi izvor

hrane, kućne miševe (Mus musculus domesticus), koji su u ljudskim naseljima pronašli svoju

novu nišu i prilagodili se. Ljudi su ove mačke počeli tolerirati budući da nisu pravile nikakvu

štetu, a rješavale su ih miševa i zmija, te su one s vremenom postale pitome. Ukratko, glavnu

ulogu u domestikaciji mačaka odigrale su one same, odnosno prirodna selekcija kojom su

jedinke, koje su se uspjele prilagoditi suživotu s ljudima, dobile pristup smeću i miševima

(Driscoll i sur. 2009a.). Ove primitivne domaće mačke bile su prepuštene same sebi te su

njihove vještine lova i preživljavanja ostale netaknute. Još je i danas većina domaćih mačaka

sposobna preživjeti bez ljudske pomoći, dokaz čemu su brojne ulične mačke u gradovima

širom svijeta (Driscoll i sur. 2009a.).

Prvi arheološki dokazi suživota mačaka i ljudi potječu s otoka Cipra gdje je uz grob

odraslog čovjeka pronađen manji grob u koji je bila položena osam mjeseci stara mačka čije je

tijelo bilo okrenuto u istom smjeru kao i ljudsko, prema zapadu. Ovaj nalaz procijenjen je na

starost od 9 500 godina, a s obzirom da je poznato da mačke nisu nikad prirodno nastanjivale

većinu mediteranskih otoka, ovamo su ih na brodovima morali dovesti ljudi (Vigne i sur.

2004.). To pokreće pitanje izvorišta domestikacije mačaka. Driscoll i sur. (2007.) proveli su

istraživanje na 979 domaćih mačaka i njihovih divljih predaka (Felis silvestris silvestris –

europska divlja mačka; F. s. lybica – afrička divlja mačka; F. s. ornata – azijska divlja mačka;

F. s. cafra – južna afrička divlja mačka; i F. s. bieti – kineska alpska stepska mačka) te otkrili

6

kako afrička divlja mačka i domaća mačka nose zajedničke genotipove koji ih razlikuju od

ostalih podvrsta divlje mačke. To dovodi do nedvojbenog zaključka da su upravo afričke divlje

mačke (F. s. lybica) (Slika 3) bile te koje su se prilagodile suživotu s ljudima i postale pitome,

a početke domestikacije smješta na Bliski istok u područje plodnog polumjeseca (Driscoll i sur.

2007.). Afričke divlje mačke prve su se prilagodile i zauzele svoju nišu u ljudskim naseljima

onemogućivši ostalim podvrstama da učine isto.

Slika 3. Afrička divlja mačka (Felis silvestris lybica). Preuzeto iz Driscoll i sur. (2009a.)

Nepoznato je koliko je trajala preobrazba od divlje mačke do pitome i umiljate, no proces

je bio dugotrajan, preko tisuću godina, s obzirom da neolitski ljudi nisu mogli kontrolirati

njihovo miješanje s divljim jedinkama. Nepogrešivi dokazi potpune domestikacije dolaze iz

doline Nila. Stari su Egipćani za perioda Novog kraljevstva, koje je započelo prije 3 600

godina, na slikama prikazivali mačke ispod stolica, ponekad s ogrlicom ili zavezane, a često

kako jedu iz zdjelica ili s otpada. Količina ovakvih ilustracija upućuje na često držanje mačaka

kao kućnih životinja. Oko 700 godina kasnije, mačke su u Egiptu štovane kao božanstvo u

obliku božice Bastet kojoj su prinosili mačje žrtve u svetom gradu Bubastisu. Sudeći prema

7

količini mumificiranih mačaka ondje pronađenih, Egipćani su bili prvi koji su mačke počeli

aktivno uzgajati, a također su zaslužni i za njihovo širenje diljem svijeta. Brodovima su

dospjele u Grčku i Rimsko Carstvo odakle se šire u Europu, a trgovačkim su putovima dospjele

i na Daleki istok, sve do Kine i Indije. U 15. se stoljeću, na istraživačkim brodovima, šire u

Ameriku, a u 17. stoljeću u Australiju (Driscoll i sur. 2009a.). Selektivni uzgoj i prvi koraci u

stvaranju mačaka s rodovnikom poduzeti su tek tijekom 19. stoljeća gotovo slučajnim

križanjem mačaka i dobivanjem legla različitih boja i obilježja, a prva izložba mačaka održana

je 1871. godine u Londonu (Sommerville 2009.).

1.1.4. RASPROSTRANJENOST

Za razliku od domaće mačke koja je kozmopolitski rasprostranjena po čitavom svijetu (gdje

ima ljudi ima i mačaka), divlju mačku nalazimo na području Afrike, Europe, te jugozapadne i

centralne Azije (Driscoll i Nowell 2010.) (Slika 4). Europska divlja mačka (F. s. silvestris)

rasprostranjena je u gotovo cijeloj Europi, izuzev Skandinavije i Rusije, no s većom brojnošću

u središnjem i južnom dijelu kontinenta. Učestala fragmentacija staništa i pojačani lov tijekom

18. i 19. stoljeća rezultirali su značajnim padom brojnosti i fragmentacijom rasprostranjenosti,

pa su mnoge današnje europske populacije divlje mačke male i potpuno izolirane (Driscoll i

Nowell 2010.). Vrsta se danas smatra izumrlom u Nizozemskoj, a moguće je da je izumrla i u

Češkoj (Driscoll i Nowell 2010.). Uz sve to, ugrožen je i genetički integritet europske divlje

mačke uslijed križanja s domaćom mačkom (F. catus) (Eckert i sur. 2010., Oliveira i sur.

2008.). Učestalost hibridizacije varira ovisno o geografskom području, pa je tako npr. visoka

razina hibridizacije utvrđena u Škotskoj i Mađarskoj, dok je učestalost hibridizacije u Italiji,

Belgiji, Portugalu i Njemačkoj znatno niža (Beaumont i sur. 2001., Pierpaoli i sur. 2003., Lecis

i sur. 2006., Olivera i sur. 2008., O`Brien i sur. 2009.).

8

Slika 4. Rasprostranjenost pet podvrsta divlje mačke (Felis silvestris). EX (izumrle, engl.

extinct) i DD (nedovoljno poznate, engl. data deficient) predstavljaju kategorije ugroženosti po

IUCN-u (engl. International Union for Conservation of Nature). Preuzeto i modificirano prema

Driscoll i sur. 2007.

Divlju mačku u Hrvatskoj nalazimo na gotovo svim staništima, s izuzetkom jadranskih

otoka, a najpogodnija staništa su joj starije visoke šume (Janicki i sur. 2007.). Do srpnja 2013.

godine divlja mačka se nalazila na popisu divljači, no ulaskom u Europsku uniju temeljem

Pravilnika o proglašavanju divljih svojti zaštićenim i strogo zaštićenim (NN 144/2013) postala

je strogo zaštićena vrsta. Ne postoje znanstveni podatci o brojnosti divlje mačke u Hrvatskoj, te

općenito postoji jako malo znanstvenih podataka o ovoj vrsti u Hrvatskoj, a što se tiče njene

genetičke raznolikosti, upravo ovaj diplomski rad predstavlja prvo takvo istraživanje na divljoj

mački u Hrvatskoj.

9

1.2. MITOHONDRIJSKA DNA

Mitohondriji, kao organeli ključni za proizvodnju metaboličke energije u eukariotskoj

stanici, imaju vlastiti genetički sustav odijeljen i različit od jezgrinog genoma (Cooper i

Hausman 2010.). Mitohondrijska DNA je kružna dvolančana molekula DNA prisutna u

genomu stanice u vrlo velikom broju kopija (do nekoliko tisuća). Sastoji se od 15 000 do 20

000 parova baza (pb), nema introna te, za razliku od genomske DNA, nije zaštićena histonima

što je čini podložnijom mutacijama, a time i brzoj evoluciji. Nasljeđuje se preko majke te nema

dokaza postojanja rekombinacije. Sve to čini je pogodnom za populacijska istraživanja i

rekonstrukciju genealogije jedinke kroz majčinsku liniju.

Sastoji se od dva osnovna dijela: kodirajuće i nekodirajuće regije. Kodirajuća regija u

većine životinja, pa tako i mačaka, sadrži 37 gena: 13 gena koji kodiraju za sintezu proteina, 22

tRNA gena te gene za veliku i malu podjedinicu rRNA (Ambriović Ristov i sur. 2007.) (Slika

5). Nekodirajuća regija naziva se i kontrolna regija ili D – petlja, a predstavlja mjesto s kojeg

započinje replikacija i transkripcija mitohondrijskog genoma te je karakterizira najveća

raznolikost nukleotida i varijabilnost duljine sekvence u usporedbi s ostatkom mitohondrijskog

genoma (Lopez i sur. 1996.). Činjenica da najbrže evoluira čini je dobrim biljegom za

utvrđivanje promjena na nižim taksonomskim razinama, između vrsta i populacija (Zhang i

Hewitt 1996.), a zbog visoke mutacijske stope korisna je u istraživanjima nedavnih

evolucijskih događaja unutar populacija (Galtier i sur. 2009.). Čini je konzervirana središnja

regija (engl. central conserved region, CCR) omeđena s dvije hipervarijabilne regije HVS I i

HVS II (engl. hypervariable segment) (Slika 6).

10

Slika 5. Organizacija mitohondrijskog genoma domaće mačke, Felis catus. Preuzeto iz

Kolesnikov i Gerasimov 2012.

Slika 6. Kontrolna regija mitohondrijske DNA. Preuzeto iz Avise 2000.

11

Unutar kontrolne regije mitohondrijske DNA više vrsta kralježnjaka opisano je pet

različitih ponavljajućih sljedova (engl. repetitive sequence - RS). Utvrđeni su na više lokacija

unutar mitohondrijskog genoma, sastoje se od ponavljajućih motiva različitih duljina, te ih

karakterizira izrazita heteroplazmija (Hoelzel i sur., 1994.). Kontrolna regija domaćih mačaka

(Felis catus) duga je oko 1560 pb, a karakteriziraju je dva odvojena ponavljajuća slijeda (RS2 i

RS3) na suprotnim stranama konzervirane središnje domene (Lopez i sur., 1996.). Među

pripadnicima porodice mačaka prisutnost ponavljajućih sljedova utvrđena je i u divlje mačke

(Felis silvestris) (Hertwig i sur., 2009.), euroazijskog risa (Lynx lynx) (Sindičić i sur., 2012.),

kao i u velikih mačaka (lav, tigar, leopard, snježni leopard, jaguar) (Jae-Heup i sur., 2001.).

1.3. ISTRAŽIVANJA MITOHONDRIJSKE DNA DIVLJE MAČKE U EUROPI

Dosadašnja istraživanja mitohondrijske DNA divlje mačke provedena su u Njemačkoj,

Bugarskoj (na malom broju uzoraka) i Italiji (Randi i sur. 2001., Hertwig i sur. 2009., Eckert i

sur. 2010.). U Njemačkoj je utvrđena visoka genetička raznolikost divlje mačke koja je viša

unutar istočne populacije nego zapadne, dok su u Italiji slični rezultati dobiveni među

populacijama s područja cijele države, uključujući i izolirane populacije sa Sardinije (Randi i

sur. 2001., Hertwig i sur. 2009., Eckert i sur. 2010.).

12

1.4. CILJ ISTRAŽIVANJA

Ovo istraživanje provedeno je s ciljem procjene genetičke raznolikosti divlje mačke na

području Hrvatske. Specifični ciljevi bili su utvrditi raznolikost kontrolne regije mitohondrijske

DNA, analizirati haplotipsku i nukleotidnu raznolikost, te usporediti dobivene haplotipove s

haplotipovima domaće mačke kao i s objavljenim sljedovima kontrolne regije mtDNA divlje

mačke s ostalih područja. Dodatan značaj ovom istraživanju daje činjenica da je ulaskom u

Europsku uniju divlja mačka u Hrvatskoj svrstana na popis strogo zaštićenih divljih svojti te je

Hrvatska obvezna izraditi Plan upravljanja divljom mačkom. Temelj za izradu Planova

upravljanja su znanstveni podatci o populaciji, te će ovim istraživanjem biti dobiveni podatci

koji su ključni za učinkovito upravljanje populacijom.

13

2. MATERIJAL I METODE

2.1. UZORCI DIVLJIH I DOMAĆIH MAČAKA

Istraživanje sam provela na ukupno 79 uzoraka: 41 uzorak mišića divljih mačaka (Felis

silvestris) (Tablica 1) i 38 uzoraka krvi domaćih mačaka (Felis catus) (Tablica 2). Uzorci

divljih mačaka potjecali su od životinja stradalih u prometu te od životinja odstrijeljenih

tijekom redovite provedbe lovnogospodarskih osnova prije proglašenja zakonske zaštite, dok

su uzorci krvi domaćih mačaka prikupljeni na Klinici za unutarnje bolesti Veterinarskog

fakulteta u Zagrebu te u veterinarskim ambulantama u Varaždinu i Čakovcu, a u sklopu

provođenja redovitih dijagnostičkih pretraga. U prikupljanu uzoraka su sudjelovali članovi

lovačkih društava, te veterinari i biolozi. Uzorci mišića pohranjeni su u 96% etanolu na - 20°C

do izolacije, a uzorci krvi u epruvetama s antikoagulansom (EDTA) na Veterinarskom

fakultetu Sveučilišta u Zagrebu.

14

Tablica 1. Popis uzoraka mišića divljih mačaka s mjestom uzorkovanja.

Redni broj

Mjesto uzorkovanja Oznaka uzorka

1. Banova Jaruga WC062. Žutica WC073. Ozalj WC104. Glina WC115. Glina WC126. Glina WC137. Črnovšćak, Dugo Selo WC148. Glina WC159. Glina WC1610. Glina WC1711. Črnovšćak, Dugo Selo WC1812. Bjelovar WC1913. Delnice WC2014. Gornja Ploča WC2215. Žutica WC2316. Opeka, Lipovljani WC2417. Opeka, Lipovljani WC2518. Pakrac WC2619. Stara Rača WC2720. Gradec WC2821. Stara Rača WC2922. Bjelovar WC3023. Daruvar WC3124. Bjelovar WC3225. Plitvička jezera WC3326. Samobor WC3427. Gospić WC3528. Gospić WC3629. Opeka, Lipovljani WC3730. Opeka, Lipovljani WC3831. Opeka, Lipovljani WC3932. Kosinj WC4033. Šumbar, Crna Mlaka WC4134. Šumbar, Crna Mlaka WC4235. Glina WC4436. Perjasica WC4537. Glina WC4638. Glina WC4739. Glina WC4840. Glina WC4941. Benkovac WC50

15

Tablica 2. Popis uzoraka krvi domaćih mačaka s podrijetlom.

Redni broj Oznaka uzorka1. DC072. DC083. DC214. DC235. DC276. DC297. DC308. DC329. DC3310. DC3411. DC3512. DC4013. DC4214. DC4415. DC4616. DC4717. DC4818. DC4919. DC5020. DC5121. DC5222. DC5423. DC5524. DC5625. DC5726. DC5927. DC6028. DC6129. DC6230. DC6331. DC6532. DC6733. DC6934. DC7035. DC7136. DC7237. DC7338. DC74

16

2.2. IZOLACIJA DNA

Za izolaciju DNA korišten je komercijalni kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit,

Promega, a sama izolacija provedena je prema prilagođenom protokolu proizvođača, kako za

tkivo tako i za krv.

2.2.1. IZOLACIJA DNA IZ MIŠIĆNOG TKIVA DIVLJE MAČKE

Sterilnim skalpelom usitnila sam 5 do 10 mg tkiva i prebacila u 2 mL tubice u koje sam

prethodno dodala 300 µL Nuclei Lysis Solution. Nakon kratkog vorteksiranja, uzorcima sam

dodala 1,5 µL proteinaze K te ostavila da se preko noći inkubiraju na 55 °C.

Slijedeći dan sam uzorke ostavila da se ohlade na sobnoj temperaturi, a potom dodala 100

µL Protein Precipitation Solution te ih, nakon 20 sekundi snažnog vorteksiranja, stavila 5 minuta

na led. Zatim sam ih centrifugirala 3 minute na 13 000 g. Tijekom ovog procesa talože se

proteini, a DNA ostaje u supernatantu.

U nove tubice otpipetirala sam 300 µL izopropanola te dodala supernatant iz prethodnog

koraka. Pažljivim okretanjem tubica promiješala sam uzorke sve dok nisu postale vidljive niti

DNA. Potom sam centrifugiranjem 1 minutu na 13 000 g istaložila DNA, a supernatant

dekantirala. Dodala sam 300 µL 70% etanola te ponovo pažljivo promiješala okretanjem tubica.

Nakon novog centrifugiranja 1 minutu na 13 000 g supernatant sam pažljivo odstranila, a tubice

preokrenula na čisti filter-papir kako bi se osušile na zraku.

U zadnjem koraku dodala sam 100 µL DNA Rehydration Solution i inkubirala preko noći

na 4 °C. Izoliranu DNA pohranila sam u hladnjaku na 4 °C do daljnje obrade.

2.2.2. IZOLACIJA DNA IZ KRVI DOMAĆE MAČKE

Za izolaciju DNA iz krvi krv ne smije biti koagulirana te je iz tog razloga prikupljena u

epruvete s EDTA kao antikoagulansom, a prije samog početka izolacije krv je odmrznuta.

Okretanjem epruvete dobro sam promiješala krv te sam 300 µL krvi prebacila u 1,5 mL

tubice s prethodno otpipetiranih 900 µL Cell Lysis Solution. Uzorke sam promiješala okretanjem

17

tubica pet do šest puta, a potom su inkubirani 10 minuta na sobnoj temperaturi, uz povremeno

okretanje (dva do tri puta) tijekom inkubacije, da se liziraju eritrociti. Zatim sam ih centrifugirala

20 sekundi na 13 000 g i odstranila što više supernatanta, a da ne dotaknem talog (ostalo je nekih

10 do 20 µL supernatanta). Budući da je krv bila smrznuta cijeli sam postupak ponovila još dva

puta sve dok talog nije postao bijel. U sljedećem koraku sam snažno vorteksirala uzorke desetak

sekundi kako bi se leukociti u potpunosti resuspendirali te dodala 300 µL Nuclei Lysis Solution i

promiješala pipetiranjem pet do šest puta da se leukociti liziraju. Ovim postupkom otopina

postaje vrlo viskozna. U uzorke sam dodala po 1,5 mL RNAze I i promiješala ih okretanjem

tubica pet puta te ih stavila na inkubaciju 15 minuta na 37°C.

Uzorcima ohlađenim na sobnu temperaturu dodala sam 100 µL Protein Precipitation Solution

i snažno vorteksirala 20 sekundi. Zatim sam ih centrifugirala 3 minute na 13 000 g kako bi se

proteini istaložili te sam preostale korake izolacije provela jednako kao i kod tkiva: supernatant

sam dodala u 300 µL izopropanola, promiješala i DNA istaložila centrifugom 1 minutu na 13

000 g. Potom sam na talog dodala 300 µL 70% etanola, ponovo promiješala i centrifugirala 1

minutu na 13 000 g, odlila supernatant i tubice preokrenula na čisti filter – papir da se suše na

zraku. Na DNA uzoraka dodala sam 120 mL DNA Rehydration Solution, inkubirala preko noći

na 4°C te do daljnje obrade čuvala u hladnjaku na 4°C.

2.3. LANČANA REAKCIJA POLIMERAZOM (PCR)

Kod provođenja lančane reakcije polimerazom (PCR) korištene su početnice Lf15926 (5'-

ATATAAAATACTTTGGTCTTGTAAACC-3') (Kocher i sur. 1989.) i DLH (5'-

CCTGAAGTAAGAACCAGATG-3') (Tiedemann i sur. 1996.). Za pripremu PCR smjese

korišten je Platinum® Taq DNA polymerase, Invitrogen te ostale potrebne otopine u omjerima

navedenim u Tablici 3. Reakcija se provodila u uređaju Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied

Biosystems) uz uvjete navedene u Tablici 4.

18

Tablica 3. Koncentracija i volumen pojedinih otopina u mješavini korištenoj kod lančane

reakcije polimerazom.

Koncentracija otopine

Koncentracija u PCR mješavini

V (µl) za 1 uzorak

PCR buffer 10X 1x 2dNTP 10 mM 0,2 mM 0,4MgCl2 50 mM 1,3 mM 0,52

Mješavina početnica 2 µM 0,2 µM 2Polimeraza 5 U/µl 0,07 U/µl 0,28

Voda 13,3DNA 1,5

Ukupno 20

Tablica 4. Reakcijski uvjeti lančane reakcije polimerazom.

Temperatura (ºC) Vrijeme Broj ciklusa

Aktivacija polimeraze 94 2 min 1

Denaturacija kalupa 94 30 sek

30Prianjanje početnica 56 40 sek

Produženje lanca 72 1 min

Završno produženje 72 5 min 1

2.4. ELEKTROFOREZA I SEKVENCIRANJE

Prisutnost PCR proizvoda provjerila sam elektroforezom na 1,5%-tnom agaroznom gelu.

Gel je pripremljen otapanjem 0,75 g agaroze (CertifiedTM PCR Agarose, Bio-Rad) u 50 ml 1 X

TBE pufera. U agarozu je dodano 5 μl SYBR Safe Gel stain (Invitrogen). Na parafilmu sam

izmiješala 5 μl PCR proizvoda i 2 μl LB pufera (engl. loading buffer), koji sadrži 0,25%

bromfenol plavila, 0,25% ksilencijanol fluorofosfata i 15% fikola, te sam ih nanijela u jažice u

19

gelu. U prvu jažicu nanesen je biljeg veličine DNA odsječaka koji se sastoji od 10 dvolančanih

DNA molekula veličina 100 pb, 200 pb, 300 pb itd., do 1000 pb (100 bp Molecular Ruler, 100

μg/ml, Bio-Rad). Elektroforeza je provedena pri naponu od 90 V u trajanju od 40 minuta. Gelovi

su promatrani u transiluminatoru te fotografirani digitalnim fotoaparatom. Uspješno umnožene

uzorke sam poslala na sekvenciranje, gdje je provedeno i pročišćavanje PCR proizvoda. PCR

produkti su sekvencirani u oba smjera u servisu Macrogen Europe u Amsterdamu, Nizozemska,

gdje koriste 3730XL Automatic DNA sequencer.

2.5. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA

Sljedove kontrolne regije analizirala sam u BioEdit programu (Hall 1999.), u kojem je

implementiran ClustalW program (Thompson i sur. 1994.) kojim sam izvršila sravnjenje

sljedova DNA i identificirala polimorfna nukleotidna mjesta. Učestalost haplotipova, te

haplotipska i nukleotidna raznolikost izračunati su pomoću programa Arlequin 3.1 (Excoffier i

sur. 2005.).

Geografsku rasprostranjenost haplotipova prikazala sam na karti pomoću programa

PhyloGeoViz.

GenBank, odnosno NCBI - National Center for Biotechnology Information

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) pretražila sam alatom BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool), u potrazi za pohranjenim sljedovima kontrolne regije divlje i domaće mačke iz ostalih

dijelova Europe.

20

3. REZULTATI

Uspješnost umnažanja željenog dijela kontrolne regije mitohondrijske DNA lančanom

reakcijom polimeraze provjerena je na 1,5%-tnom agaroznom gelu (Slika 7) kako bi se na

sekvenciranje slali samo kvalitetni uzorci. Za 79 analiziranih uzoraka divlje i domaće mačke

uspješno su sekvenciranjem dobiveni sljedovi kontrolne regije mitohondrijske DNA duljine od

654 do 814 parova baza (pb). Duljina dobivenog slijeda ovisila je o prisutnosti ponavljajućeg

slijeda RS2 dugog 80 pb (Slika 8), koji se u divlje mačke u osam uzoraka (20%) ponavlja pet

puta (duljina analiziranog slijeda 814 pb), u dvadeset i tri uzorka (56%) četiri puta (duljina

analiziranog slijeda 734 pb), dok deset (24%) uzoraka ima tri ponavljanja (duljina analiziranog

slijeda 654 pb). U domaće mačke šest uzoraka (16%) ima pet ponavljanja (analizirani slijed od

814 pb), dvadeset i četiri uzorka (63%) četiri ponavljanja (analizirani slijed od 734 pb), a u osam

uzoraka (21%) RS2 slijed se ponavlja tri puta (analizirani slijed od 654 pb). Ponavljajući slijed

RS2 koji se kod divlje i domaće mačke sastoji od dva do pet ponavljanja monomera duljine 80

pb, nije jedinstven već unutar njega postoje polimorfna mjesta, no zbog visoke stope

proklizavanja koja često uzrokuje heteroplazmije ovaj se dio ne koristi u populacijskim

analizama te je iz istog razloga isključen i iz ovog istraživanja.

Slika 7. 1,5%-tni agarozni gel nakon elektroforeze PCR proizvoda: 6 uzoraka divlje i 6

uzoraka domaće mačke

21

Slika 8. Ponavljajući slijed RS2 dugačak 80 pb

Isključivanjem ponavljajućeg slijeda RS2, za analizu raznolikosti divlje mačke preostao je

slijed od 414 pb (Slika 9) koji, kad se poravna sa slijedom cijele mitohondrijske DNA domaće

mačke preuzetim iz baze GenBank (FCU20753), odgovara pozicijama 16 244 – 16 518 i 16 759

– 16 898.

22

Slika 9. Dio slijeda kontrolne regije mtDNA uzorka domaće mačke DC47

Na 41 slijedu kontrolne regije mitohondrijske DNA divlje mačke iz Hrvatske duljine 414

pb utvrdila sam prisutnost 22 polimorfna mjesta (Tablica 7) koja proizlaze iz baznih supstitucija:

19 tranzicija i četiri transverzije. Utvrđena polimorfna mjesta čine 11 različitih haplotipova.

Haplotipovi su označeni kraticom WCRO (engl. Wildcat CROatia) i brojevima od 01 do 11, a

pripadnost pojedinih uzoraka određenom haplotipu prikazana je u Tablici 5. Kod domaće mačke,

na 38 sljedova kontrolne regije mitohondrijske DNA jednake duljine utvrdila sam prisutnost 21

polimorfnog mjesta koje proizlazi iz 19 baznih supstitucija: 16 tranzicija i tri transverzije, te dva

indela (engl. insertion or deletion). Utvrđena polimorfna mjesta čine 11 različitih haplotipova

koji su označeni kraticom DCRO (engl. Domestic cat CROatia) i brojevima od 01 do 11.

Pripadnost pojedinih uzoraka određenom haplotipu domaće mačke prikazana je u Tablici 6.

23

Tablica 5. Pripadnost analiziranih uzoraka divlje mačke pojedinom haplotipu te učestalost

haplotipova.

Oznaka haplotipa

Uzorci Broj jedinki Učestalost haplotipa %

WCRO01 WC06 WC19 WC30 WC31 4 9,8

WCRO02 WC07 WC16 WC23 WC26 WC39 5 12,2

WCRO03 WC10 WC13 WC17 WC25 WC28 WC33 WC34 WC36 WC42 WC44 WC45 WC48 WC49

13 31,7

WCRO04 WC11 WC12 WC18 WC47 4 9,8

WCRO05 WC14 WC15 WC38 WC40 WC50 5 12,2

WCRO06 WC20 1 2,4

WCRO07 WC22 WC24 2 4,9

WCRO08 WC27 1 2,4

WCRO09 WC29 WC35 WC37 WC41 4 9,8

WCRO10 WC32 1 2,4

WCRO11 WC46 1 2,4

24

Tablica 6. Pripadnost analiziranih uzoraka domaće mačke pojedinom haplotipu te učestalost

haplotipova.

Oznaka haplotipa

Uzorci Broj jedinki Učestalost haplotipa %

DCRO01 DC07 DC08 DC29 DC30 DC42 DC46 DC48 DC50 DC52 DC54 DC55 DC56 DC63 DC67 DC71 DC72 DC73 DC74

18 47,4

DCRO02 DC21 DC61 DC69 3 7,9

DCRO03 DC23 DC40 2 5,3

DCRO04 DC27 1 2,6

DCRO05 DC32 DC59 DC65 DC70 4 10,5

DCRO06 DC33 1 2,6

DCRO07 DC34 DC35 DC47 DC49 4 10,5

DCRO08 DC44 DC57 2 5,3

DCRO09 DC51 1 2,6

DCRO10 DC60 1 2,6

DCRO11 DC62 1 2,6

Polimorfna mjesta haplotipova divlje i domaće mačke prikazana su u Tablici 7. S obzirom

da se neka polimorfna mjesta preklapaju, 22 polimorfna mjesta pronađena u divlje mačke i 21

polimorfno mjesto pronađeno u domaće mačke ukupno čine 29 polimorfnih mjesta, odnosno 14

polimorfnih mjesta zajedničko je objema vrstama, osam ih je specifično za divlju mačku, a

sedam za domaću.

25

Tablica 7. Polimorfna mjesta jedanaest haplotipova mtDNA divlje mačke i jedanaest haplotipova mtDNA domaće mačke. Polimorfna mjesta su označena brojevima koji odgovaraju redoslijedu na analiziranom slijedu od 414 pb. „∙“ označavaju identitet s haplotipom WCRO01, „–“ označava nedostatak nukleotida, odnosno deleciju.

Haplotip Polimorfno mjesto

25

73

167

168

179

180

218

233

237

244

248

257

262

264

298

299

306

313

315

316

318

319

320

322

338

342

352

377

385

WCRO01 C C A ─ A C C C T G G C A A T A A G G G C T T T T G T T CWCRO02 ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ T ∙ ∙ A A T G ∙ ∙ ∙ G ∙ A ∙ T C ∙ ∙ C A C ∙ ∙WCRO03 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ A ∙ T ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙WCRO04 ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ T ∙ ∙ A A T G ∙ ∙ ∙ G ∙ A A T C ∙ ∙ ∙ A C ∙ ∙WCRO05 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ C ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙WCRO06 T ∙ ∙ ∙ ∙ A ∙ A C A ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ C ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙WCRO07 T ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ A ∙ T ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙WCRO08 T ∙ ∙ ∙ C ∙ T ∙ ∙ A A T G ∙ ∙ ∙ G ∙ A A T C ∙ ∙ ∙ A C ∙ ∙WCRO09 ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ T ∙ ∙ A A T G ∙ C ∙ G ∙ A ∙ T C ∙ ∙ C A C ∙ ∙WCRO10 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ A A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ C A ∙ ∙ ∙WCRO11 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙DCRO01 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ G ∙ A A ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ A ∙ C ∙DCRO02 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ G ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ A ∙ C ∙DCRO03 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ G T A A ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ A ∙ C ∙DCRO04 ∙ ∙ ∙ A ∙ ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ G ∙ A A ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ A ∙ C ∙DCRO05 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ A ∙ A C A ∙ ∙ ∙ G C ∙ ∙ ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙DCRO06 ∙ T ∙ ∙ ∙ A ∙ A C A ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ C ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙DCRO07 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ A A A ∙ ∙ ∙ C C A ∙ ∙ ∙DCRO08 T ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ G ∙ A A ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ A ∙ C ∙DCRO09 ∙ ∙ ─ ∙ - ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ G ∙ A A ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ A ∙ C ∙DCRO10 ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ A ∙ A C A ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ C ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙DCRO11 ∙ ∙ ∙ ∙ T ∙ ∙ A ∙ ∙ ∙ ∙ ∙ G ∙ A A ∙ ∙ ∙ ∙ C ∙ A ∙ C T

26

Najučestaliji haplotip kod divlje mačke je WCRO03 s učestalošću od 31,7% (13 uzoraka),

zatim slijede haplotipovi WCRO02 i WCRO05 s po pet uzoraka (12,2%), WCRO01, WCRO04 i

WC09 s po četiri uzorka (9,8%), haplotip WCRO07 s dva uzorka (4,9%) te WCRO06,

WCRO08, WCRO10 i WCRO11 s jednim uzorkom (2,4%) (Tablica 5). S obzirom na broj

različitih nukleotida, haplotipovi WCRO02 i WCRO09, WCRO03 i WCRO07, WCRO03 i

WCRO11, te WCRO04 i WCRO08 međusobno su najsličniji i razlikuju se u samo jednom

polimorfnom mjestu, dok je najveća razlika između haplotipa WCRO02 i haplotipa WCRO06 i

iznosi dvadeset polimorfnih mjesta (Tablica 8).

Tablica 8. Udaljenost između parova haplotipova prikazana brojem različitih nukleotida između

parova haplotipova divlje mačke.

WCRO01

WCRO02

WCRO03

WCRO04

WCRO05

WCRO06

WCRO07

WCRO08

WCRO09

WCRO10

WCRO01WCRO02 13

WCRO03 3 12

WCRO04 13 2 12

WCRO05 4 11 3 11

WCRO06 10 20 9 18 10

WCRO07 4 13 1 13 4 8

WCRO08 14 3 13 1 12 17 12

WCRO09 14 1 13 3 12 19 14 4

WCRO10 6 9 7 11 4 14 8 12 10

WCRO11 2 13 1 13 2 8 2 14 14 6

27

Kod domaće mačke, najučestaliji haplotip je DCRO01 s učestalošću od 47,4% (18 uzoraka),

zatim slijede haplotipovi DCRO05 i DCRO07 s po četiri uzorka (10,5%), DCRO02 s tri uzorka

(7,9%), DCRO03 i DCRO08 s dva uzorka (5,3%) te DCRO04, DCRO06, DCRO09, DCRO10 i

DCRO11 s jednim uzorkom (2,6%) (Tablica 6). S obzirom na broj različitih nukleotida, haplotip

DCRO01 i haplotipovi DCRO02, DCRO03, DCRO04, DCRO08, DCRO09 i DCRO11, te

haplotip DCRO06 i haplotip DCRO10 razlikuju se u samo jednom polimorfnom mjestu i

međusobno su najsličniji, dok je najveća razlika između haplotipa DCRO06 i haplotipova

DCRO04, DCRO08, DCRO09 i DCRO11 i iznosi petnaest polimorfnih mjesta (Tablica 9).

Tablica 9. Udaljenost između parova haplotipova prikazana brojem različitih nukleotida između

parova haplotipova domaće mačke.

DCRO01

DCRO02

DCRO03

DCRO04

DCRO05

DCRO06

DCRO07

DCRO08

DCRO09

DCRO10

DCRO01DCRO02 1

DCRO03 1 2

DCRO04 1 2 2

DCRO05 12 11 13 13

DCRO06 14 13 13 15 4

DCRO07 4 5 5 5 12 14

DCRO08 1 2 2 2 13 15 5

DCRO09 1 2 2 2 13 15 5 2

DCRO10 13 12 12 14 3 1 13 14 14

DCRO11 1 2 2 2 13 15 5 2 2 14

28

Haplotipska raznolikost (H) divlje mačke s područja Hrvatske iznosi 0,8573 +/- 0,0358 , dok

je nukleotidna raznolikost (Π) 0,017273 +/- 0,009184. Haplotipska raznolikost (H) domaće

mačke iznosi 0,7582 +/- 0,0669, dok je nukleotidna raznolikost (Π) 0,010944 +/- 0,006114.

Haplotipovi divlje i domaće mačke analizirani u ovom istraživanju međusobno su uspoređeni

te među njima nisu utvrđena podudaranja. Analizirani haplotipovi divlje mačke uspoređeni su i s

43 slijeda mtDNA divlje mačke iz Njemačke (Hertwig i sur. 2009.) preuzeta iz GenBank baze

podataka u dužini od 254 pb. Haplotipovi dobiveni u ovom istraživanju ne podudaraju se niti s

jednim od preuzetih sljedova.

Analizirani haplotipovi domaće mačke uspoređeni su s 37 sljedova mtDNA domaće mačke iz

Njemačke (Hertwig i sur. 2009.) preuzeta iz GenBank baze podataka u dužini od 344 pb. Među

ovim rezultatima ima podudaranja kod pet haplotipova (Tablica 10), no ove je rezultate potrebno

uzeti s rezervom zbog gubitka polimorfnih mjesta uslijed kraćenja sekvenci.

Tablica 10. Podudaranja haplotipova domaće mačke s haplotipovima preuzetim iz GenBank baze

podataka

Haplotipovi domaće

mačke iz Hrvatske

Haplotipovi domaće mačke iz Njemačke preuzeti

iz GenBank baze podataka

Broj

podudaranja

Hap_1 DCRO01, DCRO08 GQ268237, GQ268259, GQ268240, GQ268258,

GQ268247, GQ268248, GQ268263, GQ268243,

GQ268261, GQ268246, GQ268266, GQ268241,

GQ268238, GQ268251

16

Hap_2 DCRO05 GQ268253, GQ268245, GQ268235, GQ268255,

GQ268265, GQ268267, GQ268239, GQ268262

9

Hap_3 DCRO07 GQ268260, GQ268250, GQ268257 4

Hap_4 DCRO10 GQ268252, GQ268254 3

29

Pomoću programa PhyloGeoViz prikazala sam geografsku rasprostranjenost haplotipova

divlje mačke (Slike 10 i 11). Može se primijetiti da su najučestaliji haplotipovi WCRO03,

WCRO05 te WCRO09 ujedno i geografski najrasprostranjeniji. Haplotipovi WCRO01,

WCRO08 i WCRO10 utvrđeni su samo na području istočne Hrvatske, dok su haplotipovi

WCRO04 i WCRO11 pronađeni samo na području središnje Hrvatske.

Slika 10. Geografska rasprostranjenost uzoraka divlje mačke s udjelom haplotipova u pojedinim populacijama

o Središnja Hrvatskao Istočna Hrvatskao Lika i Gorski kotar

30

Slika 11. Prisutnost pojedinog haplotipa divlje mačke u analiziranim regijama Hrvatske

31

4. RASPRAVA

Ovim istraživanjem dobiveni su prvi znanstveni podatci o genetičkoj raznolikosti divlje

mačke (Felis silvestris) iz Hrvatske. Jedna od najvećih prepreka provođenju istraživanja jest

prikupljanje većeg broja uzoraka. Od proglašenja divlje mačke zaštićenom životinjskom vrstom,

prikupljanje invazivnih uzoraka ograničeno je na uzorke životinja stradalih u prometu ili zbog

drugih razloga, dok je hvatanje živih životinja s ciljem prikupljanja uzoraka za DNA analize

dugotrajan i skup postupak, koji je bio izvan mogućnosti ovog istraživanja. Kao najvažniji izvor

DNA kod zaštićenih vrsta zvijeri koriste se neinvazivni uzorci izmeta i dlaka. Budući da divlja

mačka zakapa izmet do njega je gotovo nemoguće doći, dok prikupljanje dlaka pomoću zamki za

dlake zahtjeva terenski rad i znatna financijska ulaganja (Steyer i sur. 2013.). Ujedno je i

kvaliteta uzoraka znatno slabija nego kvaliteta invazivnih uzoraka.

U sklopu ovog istraživanja uspješno je sekvenciran 41 uzorak divlje i 38 uzoraka domaće

mačke, te je s ciljem utvrđivanja genske raznolikosti kontrolne regije mitohondrijske DNA

analizran slijed dužine 414 pb. Među uzorcima divlje i domaće mačke utvrđena je prisutnost po

11 haplotipova u svake vrste, koji se nisu međusobno podudarali. Obje vrste pokazuju relativno

visoke razine raznolikosti kontrolne regije mitohondrijske DNA, s time da su vrijednosti

haplotipske (0,857) i nukleotidne (0,017) raznolikosti kod uzoraka divlje mačke više nego kod

uzoraka domaće mačke (H=0,758, Π =0,011)

Hertwig i sur. (2009.) su na 434 pb ukupno 76 uzoraka divlje mačke iz Njemačke utvrdili

prisutnost 22 haplotipa s haplotipskom raznolikošću u rasponu od 0,667 do 0,956, ovisno o

području s kojeg su uzorci prikupljeni. Eckert i sur. (2010.) analizirali su 322 pb kontrolne regije

mitohondrijske DNA na 96 uzoraka divlje mačke iz Njemačke i pronašli 18 različitih

haplotipova te haplotipsku raznolikost od 0,70. U sklopu istog istraživanja analiziran je i manji

broj uzoraka iz Bugarske s dva različita lokaliteta, te je osam uzoraka s jednog područja imalo

dva haplotipa i haplotpsku raznolikost 0,49, dok je sedam uzoraka s drugog područja imalo

također dva haplotipa no značajno manju haplotipsku raznolikost (0,29). U Italiji su pak Randi i

sur. (2001.) na prosječno 692 pb mtDNA 40 uzoraka divlje mačke pronašli 17 različitih

haplotipova s haplotipskom raznolikošću od 0.91 i nukleotidnom od 0,008. Usporedbom

rezultata dobivenih u ovom istraživanju s podatcima o genetičkoj raznolikosti divlje mačke iz

32

Njemačke, Bugarske i Italije vidljivo je da dobiveni rezultati upućuju na visoku genetičku

raznolikost divlje mačke s područja Hrvatske te da opstanak divlje mačke s ovog područja nije

ugrožen gubitkom genetičke raznolikosti.

Činjenica da nije nađen niti jedan zajednički haplotip divlje mačke iz Hrvatske i onih iz

Njemačke ukazuje na vjerojatno strukturiranje populacija divlje mačke na širem geografskom

području, unutar srednje i jugoistočne Europe (Njemačka – Hrvatska). Međutim, rezultati

dobiveni u ovom istraživanju ne ukazuju na strukturiranje populacija divljih mačaka unutar užeg

geografskom područja, poput Hrvatske, jer je veći broj haplotipova nađen unutar svih triju ili bar

dvaju istraženih područja (Slika 11).

Dva haplotipa divlje mačke (WCRO06 i WCRO10) posjeduju neka polimorfna mjesta

specifična za domaću mačku, dok ne posjeduju ni jedno polimorfno mjesto svojstveno samo

divljim mačkama. Takva mjesta u haplotipu WCRO06 su 180, 233, 237, 306 i 377, a u haplotipu

WCRO10 takvo je polimorfno mjesto 313 (Tablica 7). Pošto se mitohodrijska DNA prenosi

isključivo s majke na potomstvo, postoji mogućnost da ovi haplotipovi potječu od domaće

mačke, a da su ti uzorci zapravo križanci između divlje i domaće mačke. Međutim, za dobivanje

točnijih podataka o hibridizaciji divlje i domaće mačke u Hrvatskoj potrebno je uz analizu

mitohondrijske DNA provesti i analizu mikrosatelita. Ovakve analize već su provedene u

Njemačkoj, Italiji, Španjolskoj i Portugalu gdje je zabilježeno svega nekoliko hibrida (Eckert i

sur. 2010., Hertwig i sur. 2009., Oliveira i sur. 2008., Randi i sur. 2001.), te u Mađarskoj i

Škotskoj gdje je utvrđena znatna introgresija gena domaće mačke u genotip divlje (Pierpaoli i

sur. 2003., Beaumont i sur. 2001.). Podaci o hibridizaciji između divljih i domaćih životinja vrlo

su bitni jer hibridizacija može dovesti do gubitka bioraznolikosti, a kako do toga ne bi došlo

potrebno je na vrijeme provesti konzervacijske planove i sačuvati integritet gena u populaciji

(Randi 2008.).

Kako bi se dobio točan uvid u genetičku raznolikost europske divlje mačke, te stupanj

ugroženosti hibridizacijom s domaćom mačkom potrebna su opširnija i ujednačena istraživanja

kako u Hrvatskoj, tako i diljem Europe.

33

5. ZAKLJUČAK

Analizom kontrolne regije mitohondrijske DNA 41 uzorka divlje mačke (Felis silvestris)

iz Hrvatske na slijedu dužine 414 pb utvrđena je prisutnost 22 polimorfna mjesta koja čine 11

jedinstvenih haplotipova.

U kontrolnoj regiji mitohondrijske DNA 38 uzoraka domaće mačke (Felis catus) na

slijedu iste dužine utvrđeno je 21 polimorfno mjesto koji također čini 11 haplotipova.

Utvrđena razina genska raznolikosti divlje mačke s područja Hrvatske slične je razine kao

one utvrđene u Njemačkoj i Italiji. Haplotipska raznolikost (H) divlje mačke iznosi 0,857 +/-

0,036, dok je nukleotidna raznolikost (Π) 0,017 +/- 0,009.

Haplotipska raznolikost (H) domaće mačke nešto je niža od one divlje mačke i iznosi

0,758 +/- 0,067, dok je nukleotidna raznolikost (Π) 0,011 +/- 0,006.

Dobiveni haplotipovi divlje mačke ne podudaraju se niti s jednim slijedom divlje mačke

preuzetim iz GenBank baze podataka, dok uspoređivanjem skraćenih sljedova domaće mačke sa

sljedovima domaće mačke preuzetim iz GenBank baze podataka postoji preklapanje u pet

haplotipova.

34

6. LITERATURA

Ambriović Ristov, A., Brozović, A., Bruvo Mađarić, B., Ćetković, H., Herak Bosnar, M.,

Hranilović, D., Katušić Hećimović, S., Meštrović Radan, N., Mihaljević, S., Stade, N.,

Vujaklija, D. (2007.): Metode u molekularnoj biologiji. Institut Ruđer Bošković, Zagreb.

Anton, M., Turner, A., Howell, F.C. (2000.): The big cats and their fossil relatives. Columbia

University Press, New York.

Avise, J.C. (2000.): Phylogeography: The history and formation of species. Harvard University

Press, Cambridge.

Beaumont, M., Barrat, E.M., Gottelli, D., Kitchener, A.C., Daniels, M.J., Pritchards, J.K.,

Bruford, M.W. (2001.): Genetic diversity and introgression in the Scottish wildcat. Molecular

Ecolology 10: 319–336.

Cooper, G.M. i Hausman, R.E. (2010.): Stanica: Molekularni pristup. Medicinska naklada,

Zagreb.

Driscoll, C.A., Menotti-Raymond, M., Roca, A.L., Hupe, K., Johnson, W.E., Geffen, E., Harley,

E.H., Delibes, M., Pontier, D., Kitchener, A.C., Yamaguchi, N., O’Brien, S.J., Macdonald,

D.W. (2007.): The near eastern origin of cat domestication. Science 317: 519–523.

Driscoll, C.A., Clutton-Brock, J., Kitchener, A.C., O´Brien, S.J. (2009a.): The taming of the cat.

Scientific American: 68 – 75.

Driscoll, C.A., Macdonald, D.W., O´Brien, S.J. (2009b.): From wild animals to domestic pets, an

evolutionary view of domestication. Proceedings of the National Academy of Sciences 106:

9971 – 9978.

Driscoll, C. i Nowell, K. (2010.): Felis silvestris. In: IUCN 2013. IUCN Red List of Threatened

Species. Version 2013.2. <www.iucnredlist.org>. Downloaded on 28 April 2014.

Eckert, I., Suchentrunk, F., Markov, G., Hartl, G.B. (2010): Genetic diversity and integrity of

German wildcat (Felis silvestris) populations as revealed by microsatellites, allozymes, and

mitochondrial DNA sequences. Mammalian biology 75: 160 – 174.

35

Excoffier, L., Laval, G., Schneider, S. (2005.): Arlequin ver. 3.0: An integrated software package

for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1: 47 – 50.

Galtier, N., Nabholz, B., Glemin, S., Hurst, G.D.D. (2009.): Mitochondrial DNA As A Marker

Of Molecular Diversity: A Reappraisal. Molecular Ecology 18: 4541-4550.

Hall, T.A. (1999.): BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis

program for Windows 95/97/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: 95-98.

Hertwig, S.T., Schweizer, M., Stepanow, S., Jungnickel, A., Böhle, U.–R., Fischer, M.S. (2009.):

Regionally high rates of hybridization and introgression in German wild cat populations

(Felis silvestris, Carnivora, Felidae). Journal of Zoological Systematics and Evolutionary

Research 47: 283-297.

Hoelzel, A.R., Lopez, J.V., Dover, G.A., O’Brien, S.J. (1994.): Rapid evolution of a

heteroplasmic repetitive sequence in the mitochondrial DNA control region of carnivores.

Journal of Molecular Evolution 39: 191–199.

Jae-Heup, K., Eizirik, E., O’Brien, S.J., Johnson, W.E. (2001.): Structure and patterns of

sequence variation in the mitochondrial DNA control region of the great cats. Mitochondrion

14: 279–292.

Janicki, Z., Slavica, A., Konjević, D.,Severin, K. (2007.): Zoologija divljači. Zavod za biologiju,

patologiju i uzgoj divljači, Veterinarski fakultet, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb.

Johnson, W.E., Eizirik, E., Pecon-Slattery, J., Murphy, W.J., Antunes, A., Teeling, E., O´Brien,

S.J. (2006.): The late Miocene radiation of modern Felidae: A genetic assessment. Science

311: 73 – 77.

Kilshaw, K. (2011): Scottish wildcats: Naturally Scottish. Scottish Natural Heritage.

Kocher, T.D., Thomas, W.K., Meyer, A., Edwards, S.V., Pääbo, S., Villablanca, F.X., Wilson,

A.C. (1989.): Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and

sequencing with conserved primers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America 86: 6196 – 6200.

36

Kolesnikov, A.A. i Gerasimov, E.S. (2012.): Diversity of mitochondrial genome organization.

Biochemistry (Moscow) 77: 1424 – 1435.

Lecis, R., Pierpaoli, M., Biró, Z.S., Szemethy, L., Ragni, B., Vercillo, F., Randi, E. (2006.):

Bayesian analyses of admixture in wild and domestic cats (Felis silvestris) using linked

microsatellite loci. Molecular Ecology 15: 119 – 131.

Lopez, J.V., Cevario, S., O´Brien, S.J. (1996.): Complete nucleotide sequences of the domestic

cat (Felis catus) mitochondrial genome and a transposed mtDNA tandem repeat (Numt) in the

nuclear genome. Genomics 33: 229 – 246.

Macdonald, D.W., i Loveridge, A.J. (2010.): Biology and conservation of wild felids. Oxford

University Press, Oxford.

O’Brien, J., Devillard, S., Say, L., Vanthomme, H., Léger, F., Ruette, S., Pontier, D. (2009.):

Preserving genetic integrity in a hybridising world: are European Wild cats (Felis silvestris

silvestris) in Eastern France distinct from sympatric feral domestic cats? Biodiversity and

Conservation 18: 2351 – 2360.

Oliveira, R., Godinho, R., Randi, E., Alves, P.C. (2008.): Hybridization versus conservation: are

domestic cats threatening the genetic integrity of wildcats (Felis silvestris silvestris) in Iberian

Peninsula? Philosophical Transactions of the Royal Society B 363: 2953 – 2961.

Pierpaoli, M., Biró, Z.S., Herrmann, M., Hupe, K., Fernandes, M., Ragni, B., Szemethy, L.,

Randi, E. (2003.): Genetic distinction of wild cat (Felis silvestris) populations in Europe, and

hybridization with domestic cats in Hungary. Molecular Ecolology 12: 2585 – 2598.

Randi, E., Pierpaoli, M., Beaumont, M., Ragni, B. (2001.): Genetic identification of wild and

domestic cats (Felis silvestris) and their hybrids using bayesian clustering methods.

Molecular Biology and Evolution 18: 1679 – 1693.

Randi, E. (2008.): Detecting hybridization between wild species and their domesticated relatives.

Molecular Ecology 17: 285 – 293.

37

Sindičić, M., Gomerčić, T., Galov, A., Polanc, P., Huber, Đ., Slavica, A. (2012.): Repetitive

sequences in Eurasian lynx (Lynx lynx L.) mitochondrial DNA control region. Mitochondrial

DNA 23: 201 – 207.

Sommerville, L. (2009.): Cats. Ermine street books, Buntingford.

Steyer, K., Simon, O., Kraus, R. H. S., Haase, P., Nowak, C. (2013.): Hair trapping with

valerian-treated lure sticks as a tool for genetic wildcat monitoring in low-density habitats.

European Journal of Wildlife Research 59: 39 – 46.

Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson, T.J. (1994.): CLUSTAL W: improving the sensitivity of

progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap

penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673 – 4680.

Tiedemann, R., Harder, J., Gmeiner, C., Haase, E. (1996.): Mitochondrial DNA sequence

patterns of Harbor porpoises (Phocoena phocoena) from the North and Baltic Sea. Zeitschrift

für Säugetierkunde 61: 104 – 111.

Vigne, J.D., Guilaine, J., Debue, K., Haye, L., Gérard, P. (2004.): Early taming of the cat in

Cyprus. Science 304: 259.

Zhang, D.X., Hewitt, G.M. (1996.): Nuclear integrations: challenges for mitochondrial DNA

markers. Trends in Ecology and Evolution 11: 247-251.

38

ŽIVOTOPIS

Rođena sam 17. svibnja 1990. godine u Varaždinu gdje sam s odličnim uspjehom 2009.

godine završila Prvu Gimnaziju Varaždin. Iste godine upisujem studij Molekularne biologije na

Prirodoslovno – matematičkom fakultetu u Zagrebu gdje sam stekla zvanje prvostupnika

molekularne biologije, ali i nastavila školovanje upisavši diplomski studij molekularne biologije

2012. godine.

Već pri prvom susretu s biologijom u osnovnoj školi, kada sam radila na projektu uzgoja

praživotinja u školskom kabinetu, znala sam da je biologija nešto čime se želim baviti u

budućnosti, a interes za biologiju kroz srednju je školu rastao.

Tijekom studiranja bila sam demonstrator na Zoologijskom zavodu kod izv. prof. dr. sc.

Mladena Kučinića, a stručnu laboratorijsku praksu obavila sam na Zavodu za molekularnu

biologiju pod vodstvom izv. prof. dr. sc. Dunje Leljak – Levanić. Aktivno sam sudjelovala u

radu studentske udruge BIUS te u sklopu iste bila na mnogo terenskih istraživanja. Također sam

i aktivni član Hrvatskog biospeleološkog društva s kojim sam bila na nekoliko terena te

sudjelovala u provođenju edukativnih radionica i na Znanstvenom pikniku 2014.

Preko Studentskog servisa radim kao vodič u Botaničkom vrtu PMF-a te kao edukator za

osnovnoškolce u Parku Maksimir, a nedavno sam počela raditi i na digitalizaciji i inventarizaciji

zbirke u Hrvatskom prirodoslovnom muzeju.