synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide...

13
H. Ouyang D.G. Vander Velde R.T. Borchardt T.J. Siahaan Authors' af®liations: H. Ouyang*, R.T. Borchardt and T.J. Siahaan, Department of Pharmaceutical Chemistry, The University of Kansas, Lawrence, USA; and *Division of Drug Delivery and Disposition, The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, USA. D.G. Vander Velde, Department of Medicinal Chemistry, The University of Kansas, Lawrence, USA. Correspondence to: Dr Teruna J. Siahaan Department of Pharmaceutical Chemistry The University of Kansas Lawrence KS 66047 USA Tel.: 1-785-864-7327 Fax: 1-785-864-5736 E-mail: [email protected] Dates: Received 29 October 2001 Revised 5 December 2001 Accepted 13 January 2002 To cite this article: Ouyang, H., Vander Velde, D.G., Borchardt, R.T. & Siahaan, T.J. Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modi®ed sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion. J. Peptide Res., 2002, 59, 183±195. Copyright Blackwell Munksgaard, 2002 ISSN 1397±002X Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modi®ed sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion Key words: esterase-sensitive prodrug; molecular dynamics simulation; opioid peptide; peptide delivery Abstract: The coumarinic acid-based cyclic DADLE H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-OH) prodrug 1a exhibited more favorable physicochemical properties than did DADLE for permeation across the intestinal mucosa. However, prodrug 1a, whose bioconversion to DADLE was slow, was subject to extensive biliary clearance when administered to rats in vivo. To increase the rate of esterase-catalyzed bioconversion of prodrug 1a, thus decreasing its biliary clearance, the oxymethyl-modi®ed prodrug 1, in which an aldehyde equivalent is inserted between the phenolic group of the promoiety and the carboxylic acid group of the peptide, was synthesized from benzofuran-2-carboxylic acid 16 via a nine-step procedure. Brie¯y, phenacyl-protected 3-2-hydroxyphenyl)-propynoic acid 17 was coupled with Boc-D-Leu-OCH 2 I 5 to give the intermediate 18, which was further elaborated and conjugated with tetrapeptide 4 to give linear precursor 2. Precursor 2 was then deprotected and cyclized to obtain compound 1 using a high dilution technique. In an attempt to investigate the effect of the physicochemical properties and the conformation of prodrug 1 on its permeation characteristics, we calculated its physicochemical parameters and determined its solution conformation using spectroscopic techniques CD and NMR) and molecular dynamics simulations. Prodrug 1 showed a cLogP value and a molecular size similar to that of prodrug 1a. The deconvoluted CD spectra indicated that prodrug 1 has more random component 71%) than prodrug 1a 42%). 2D-NMR studies of prodrug 1 showed no signals for amide±amide hydrogen interactions and few ROE cross-peaks in ROESY spectra. Using distance restraints constructed from ROESY spectra, molecular dynamics simulations of prodrug 1 generated ®ve conformation families. One family satis®ed most of the 183

Upload: h-ouyang

Post on 06-Jul-2016

213 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

�� �������� ���� � � �� ���� ������������� �������

�������� �� � ����

�� �������� ���� ��������� ��� ���� ��������

��������� � � ������������ � ��������

� � ��������� � ������ �������� ���� ��

������� � ��� �������� �� ���������

� � ��������� � !�� ������ �� � ���� "����

� ���� "���� ���#

�� ���� � � �� � ��������� � $�������

� �������� � � ��������� � ������

�������� ���#

�������������� ���

�� � ���� �� �������

��������� � � ������������ � �������

� � ��������� � �����

�������

�� %%&'(

���

���#) *+(,-+,%'+(./(

0�1) *+(,-+,%'+-(.%

2+����) ��� ��34�#���

�����

5������� /6 7��8�� /&&*

5������ - �����8�� /&&*

�������� *. 9����� /&&/

�� � �� �� � �� ����

������� ��� ���� � � �� � ��� ���������� ���� �

�������� ���� ��� ���� �� ��������� ������� �

� �������� ����+8���� ������ ����� � � ����

������� ��� ���:�� ���������� � ��������+������;��

8�������#

�� � ���� � ��� /&&/� ��� *,.<*6-#

����� � =���4���� $�4� ����� /&&/

>��! *.6(<&&/?

��� ���� �� ���������������� � � ��������

����+8���� ������ ����� � � ���� ���������� ���:�� ����������� ��������+������;��8�������

��� ������ ����������������� ���� �� ����� ��� ��������

��� ������� ����� ������ ����� �������

�������� ��� �� ������� ���������� ������ �����

������������������������� ��� ���� � � �!������� ����

"������� �������������� �������� ���� ��� ����� "��

��������� ������ ��� ���������� � ����# ��$���% ���� � �%

$���� ������������ �� ����� $�� ���$% $�� � �&��� ��

�!������ ������� ��������� $��� ������������ �� ���� �� ����# ��

�������� ��� ���� �" ���������������'�� ������������ �" ���� �

�% �� � ���������� ��� ������� ���������% ��� �!������������(��

���� � �% �� $���� �� �������� �) ������ �� �������� ���$���

��� ������� ��� �" ��� �������� ��� ��� �����!���� ����

��� �" ��� �����% $�� ��������'�� "���

���'�" ����*������!���� ���� �� �� � �������� ����� ��#

+���,�% ���������������� -��*������!������ �������� ����

�� $�� �� ��� $��� +������� ��.�*/ � �� ��� ��� ������������

��% $���� $�� " ����� ���������� ��� ���& ����� $���

���������� �� ��� ������ ��� ���� !# ���� ���� ! $�� ����

���������� ��� �����'�� �� ������ ���� �� � ���� � ����

��� ���� ������) �# /� �� ������ �� ���������� ��� �""��� �"

��� �������������� �������� ��� ��� ���"�������� �" ���� �

� �� ��� ��������� ���������������% $� ���� ����� ���

�������������� ��������� ��� ���������� ��� ��� ����

���"�������� ���� ����������� ������) �� �.� ��� 012 ���

����� ��� �������� ��� �������# ����� � � ���$�� � �����

�� � ��� � ����� ��� ��'� ������� �� ���� �" ���� � �# ���

������� ��� .� ������ ��������� ���� ���� � � ��� ����

������ �������� �345 ���� ���� � � �6*5 # *��012

�� ���� �" ���� � � ���$�� �� ������� "�� �����7�����

�������� ������������ ��� "�$ 2�� ��������8� �� 2��9:

������# ;���� �������� ���������� ������ ���� "��� 2��9:

������% ����� ��� �������� ��� ������� �" ���� � � ���������

(� ���"�������� "�������# ��� "����� �����(�� ���� �" ���

*,.

Page 2: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

�������� ���������� ��� ��� �" ��� �������� ������ ���� ��� ��

012 �� ���� ���������# /� � �����% ���� � � ���$��

"������� �������������� �������� "�� ��������� �" ���

���������� � ����# ����� � � ������ � ���� ������

���"�������� �� ��� ���� ���� ���� � �# ����� ��""�������

�� ��� ���� ���"�������� �� �� �""��� ��� ��������� �" ���

���� �� ������ ��� ���������� � ���� �� ����� ��"" ���� ���<��

����� ������� �� �������� $��� �", ! ������������ ���� $� ��

����� ����� ��������� ��� ���������#

�����" � ���� +��% ��� ��!� ��������� +��.�%

����*��!��-��!�'�������� �������� ��������� .�% ���� ���

���������� .�9:% ���������� ����������� �1��%

6�������������� �������� �19�% ��������� �"�!���� ��.%

4��-������������������ �-������������������� ��+�%

4������!����'�����'���� ���% ����� � ��������������� 12�*%

� ����� � ������������������ ������� ���% �������� ���%

�������������� 2��9:% �������� "���� ����� ��� �""���

����������� �=�% ���, ��������� ����� ��.9:% ����� ����������

����������#

> ����� ������ ��� �������� �� �������������� ���

8�� �����:�� �� ���� �� ��������� �� ��� �� 8���

� � ���� �� � � 8�� ���� ��� ��� @*<.A# � ��� �������+

8���� ������ ��� ��B�� � ������ ���� ���������

� �� ������ � ��� ��������� �� � ��������� � ���#

"������ � ��� ������� ��������� �� 8�� ��������

������� 8� � ��� ������8�� 8�� ������������ ���������

@'A# �������+8���� ������ ��� ��������� � �� �� @����

�+ �� !+������A� ���� ���� @���� ��� ���� ����+

� ���A� �� ��� � ��� � 8�� ��������� � ��

������� � ��� ���8��� �������� �� ����8���� �

� ��� �� ��� 8�������8����� @-A# � �� ��� ��� ��������8��

� �;������ �� ������ � � � �������� ���� ��

����� @%A#

7� ������ � ������ � � ��� 8�������8����� �

�������� �� �������������� �� � ����� � ��� � ����+

� ������ ��������� 8� ��4� ������ ����� �# 7��

��8����� �� �������� ������ ������� ����� ��� ��

��� � ������ ��4��� ��� �� ����1���41�� � ���+

������ ����� �� �������� ���� @(<6A# � � ��� ����

��� �� � ���4� �������� ���� ��4�� ��� ���������

�������� 8� C� � ��# @*&�**A# � ��� ������ �������

����� � �� 8� ������� � � � ����� �������� 8� ���������

� � � 8�� ���� ������# � �� ����� +�+��� 8�������

������ �� ������� @0� # *A) � �������� ������ � � � �

��4�� �� � ���� � ������ ������ � ������� � � �����

��� # C� ��� ��� � �� � � �������� ����+8���� ������

����� � � ���� ������� @�#�# ����2A �� 8�����

� ����� ������ ��������� �� ���� ���8��� ��������

� � ��� � � ����� ������� @�#�# ����2A @*/�*.A#

"������ � � � � ����1���41� �� ��������

����+8���� ����� � � ����2 ���� ����������� � ����

���������� @��A� � � �������� ����� � � � ����� � 8�

� � ����� ���� ��� ������ � � � ��� 8������� ����� �

����2� � �� � � 8�� ������ � ����2 ���� ���� � �

�1������ @9#D# E� � ��#� ���8��� �� ����A# =������

��������� ��� �������� � ������ ������ � � ��� ��8�������

@*'A� � � 8F������ � �� ����� ��� � ��� ���;� � ���:��

�������� ����+8���� ������ ������� @����2A ����� �

��� � ���� ��� �B������� 8����� � � ���81���� ����

������� � � � ������� �� � � � �� ��� � � �

�������� ���� ��4�� @0� # *A# � � ���:�� ��������

����+8���� ������ ����� � ���� 8� �� ����� � � � ����

���� �� ��� ����:�� ��� �1���� �� � � ������� �

������� ���# C�� � 1���� �� ����� ������� 8�����

� � �+������� ���81���� ���� � � � ������� �� � � � ��

��� � � � �������� ���� ��4�� � ����� �� � � ������

������ � � � ����� 8� � ��� 8� ������� ��� � ��� � �

���� � � � ��������+������;�� ������ � �������� �� ��� ����

� 8������ �������� �� ���� ���������#

=������ � � � ����� ������ ��������� �� �����

������� � ��� �������� ���� ������ � ��� �������

������� ����� 8�� ���� ���8���� �� ��8�8�� � ���

�8����� � 8�� � � �����:� �������G�;��� @*-<*,A�

�� �� 8F������ � �� ����� ��� � � ��������;� � �

� ����� ������ ��������� �� ����� ������� �

CONH

CO

PeptideX

Peptide

Esterase

Lactonization

CONH PeptideXH

COOH

COOHNH2

OO HCHO

(in case of 1)

1a, X=-O-Peptide= DADLE

1, X=-OCH O-2

���� !� ���� � �������� ����+8���� ������ ������� ����� ��

�� ��� 1���� �� ��� �� � ��� ���:�� ���������� � ��������#

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

*,' H �� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6-

Page 3: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

����� �# ���������� �� ��8����� � ��� � �� ����� ��

�� �����8�� ���8��� �������� � ������������� ��

��� � ��8������ �� ���8��� ��I�1 ������� ��� ��

�+ �������� @�+ �A �� �������� ���������+�������

����� @$5�/� 0# �� �� 5#�# =�� ����� ���������

��8������A# =� ������ � � 8�� ������������ ���������

�� ����� ������� � ����� �� @*%�*6A ��� � ��

� ����� �� �� � ��� 8� ����8�� � ��������� � � ������� �

� � 1���� �� ����� � � � ����� ������ ����������

����� ������� �� ���� �������� � �������������

� � � ����� �#

21��������� ���������

#������ � � ������$ �

%����� ����������& *" !$5 ������� ���� �������

��� �� � '&&+ � %&&+$"; ��������# "� +�������

���� ������� @"5$�A ���� 8����� ��� JK ���������

D�= ��8��+����� �����������# ���� � ����+

��� � ��� �������� ��� ������ �� %& @/.&<'&& ��� A

�� �1���G�� �� ������� �� � � ����� ����� ������

����� � ������ ���# "� +��������� ��B��� � ����+

��� � @"���A ��� ������� ��� � ���� ���� ������

��� � �J �������# �"0 ��� ��������� ��� ����� �����

� � � ������� � 8�;� ��# ����� ��� ���������

��� � �� ��� ���1���# ��� ������ ��������� ����

���� ���� ��� ������ @$�����4��� C>� ���A� �� ��

@�� ����� $7� ���A� 0��4� � ������� @$�����4��� C>�

���A � =�� �� =������� @�� �������� ��� ���A� ��

���� ���� �� ��������#

'()!(*����+�������,(������� � � � )',& ����� ���� ��+

� ���;�� ��� � ��� � ������8�� ��������� @/&A# *" !$5

@'&& $";� ����.A � %#,%<(#&& @�� /"A� (#./<(#'. @�� /"A#

������ ����� �� "�� ��� ���� ���� ����� ���������

�+�� ���������

����� �$& 2���"�� @'#, � /- ���A �� "7=� @.#., �

/- ���A ���� ����� �� � ����� � � � =�+��������

��� ���� @/.#, ���A � �"0 @.&& ��A �� &��# � �

����� ��� ������� �� *& ��� �� � � ����� ��+

���� @/#-. � -& ���A� �$�� @.&- � � /#- ���A ��

� � �+�������+�������� ������� @/- ���A ���� �����#

����� ������ �� �� ����������� �� - � �"0 ���

������ �� �����# � � ������� ��� �������� � �� ��

������� @.&& ��A �� �1������� ��� *&L ������ ����

@.�.&& ��A� -L !�"�7. @.�.&& ��A �� ��������� 8���

@/�.&& ��A# � � � ��� ����� ��� ����� ��� $ �7' ��

:������# � � ����� ��� ������ � ��� � � �������

�������# � �� ������ ��� ���� � � � �1� ���� ��� ��

����:����#

��������� ��& � ����� � � !+������� =� ���� � �

������� @/.#, ���A ��� �������� � �0� @/- ��A ��

��� ����� �� @-& ��A# � � ����� ��� ������� ��

�� ����������� �� / �� � � ����� ��� ������

�� �����# � � ������ ��� ���� � � � �1� ������

�����:��#

-��(%��(.��(/(���� )�,& E����) *&&L# 5��&#%- @� �����G

����������� . ) *A# *" !$5 @'&& $";� ����.A � *#'- @�� 6"A�

.#*' @�� /"A� .#(- @��� *"� 9*�-#, ";� 9/�*%#, ";A�

.#,' @��� *"� 9*�-#. ";� 9/�*%#6 ";A� '#%& @�� /"�

9�-#6 ";A� '#6* @��� *"� 9*�-#/ ";� 9/�*.#& ";A� -#*6

@8���� *"A� -#/( @��� *"� 9*�*#* ";� 9/�*&#' ";A� -#.* @���

*"� 9*�*#' ";� 9/�*(#/ ";A� -#,% @�� *"A� %#%& @8���� *"A�

(#*. @�� /"A� (#/( @�� ."A# *.� !$5 @'&& $";� ����.A �

/,#%6� .,#./� ''#-6� -.#-*� %%#-.� ,&#%'� **6#--� */(#-,�

*/6#&*� */6#(.� *.*#(.� *.%#&&� *-%#..� *%6#-.� *(*#.,#

0�=$�) .%.#* @$�*A#

*(%��(.��(/(���� )�,& E����) *&&L# 5��&#*& @� �����G

����������� . ) *A# *" !$5 @'&& $";� ��� ��+�'A

� .#&* @��� *"� 9*�,#, ";� 9/�*.#6 ";A� .#/* @��� *"�

9*�-#% ";� 9/�*.#6 ";A� .#%/ @�� *"� 9�*(#* ";A� .#(&

@�� *"� 9�*(#* ";A� '#%/ @�� /"A� '#(6 @��� *"� 9*�-#, ";�

9/�,#- ";A� -#/' @�� *"� 9�*&#- ";A� -#./ @�� *"�

9�*(#/ ";A� -#6& @�� *"A� (#/. @�� /"A� (#.& @�� ."A#*.� !$5 @'&& $";� ��� ��+�'A � .(#'(� '&#/6� -'#'.�

%%#&/� **(#6.� */(#&-� */,#%&� */6#/.� *./#&,� *.%#,&�

*%%#*,� *(*#.*# 0�=$�) /%.#* @$�*A#

-��(�(��(%��(.��(/(���� )�,& E����) *&&L# 5��&#/&

@� �����G����������� . ) *A# *" !$5 @'&& $";� ����.A

� *#.- @�� /"� 9�(#* ";A� *#'% @�� 6"A� .#&6 @��� *"�

9*�(#& ";� 9/�*.#6 ";A� .#*, @��� *"� 9*�-#( ";�

9/�*.#, ";A� .#6/ @�� /"A� '#*6 @�� *"A� '#-6

@�� /"� 9�-#, ";A� '#,- @��� *"� 9*�'#( ";� 9/�*.#% ";A�

-#*( @8���� *"A� -#.& @���� *"� 9*�*,#( ";� 9/�*#.% ";�

9.�*#.% ";A� -#/- @��� *"� 9*�*#/ ";� 9/�*&#' ";A� -#,%

@�� *"A� %#%& @8���� *"A� %#66 @8���� *"A� (#*- @�� /"A�

(#/, @�� ."A# *.� !$5 @'&& $";� ����.A � *,#,&� /,#(-�

.,#*.� '.#..� -&#(6� -.#6.� %%#',� **6#'.� */(#-.� */,#66�

*/6#(&� *.*#((� *.%#/-� *-%#&-� *%,#6%� *(*#'/� *(.#-6#

0�=$�) '.'#/ @$�*A#

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

�� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6- H *,-

Page 4: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

-��(���(�(��(%��(.��(/(���� )�0,& E����) *&&L# 5��&#-&

@�� �� �������A# *" !$5 @'&& $";� ����.A � *#*, @�� ."�

9�-#6 ";A� *#'. @�� 6"A� /#6- @�� /"A� .#*. @�� /"A� .#,-

@�� /"A� '#./ @��� *"� 9*�%#, ";� 9/�*.#- ";A� '#.6 @8����

*"A� '#-6 @�� /"� 9�-#( ";A� '#,- @��� *"� 9*�%#% ";�

9/�*.#, ";A� -#/' @��� *"� 9*�&#6 ";� 9/�*&#' ";A� -#.&

@��� *"� 9*�*#* ";� 9/�*(#/ ";A� -#-( @8���� *"A� -#,.

@�� *"A� %#(* @�� /"� 9�,#* ";A� %#,- @8����� *"A� %#6( @��

/"� 9�,#' ";A� (#/& @�� ("A# 0�=$�) -6(#. @$�*A#

*(���(�(��(%��(.��(/(���� ) ,& E����) *&&L# 5��&#*& @�� ��

�������A# *" !$5 @'&& $";� ��� ��+�'A � *#/' @�� ."�

9�(#/ ";A� /#6% @��� *"� 9*�(#' ";� 9/�*.#( ";A� .#&' @���

*"� 9*�(#, ";� 9/�*.#, ";A� .#&% @��� *"� 9*�,#, ";�

9/�*.#6 ";A� .#*, @��� *"� 9*�-#, ";� 9/�*.#, ";A� .#,-

@�� /"� 9�%#% ";A� .#6* @�� *"A� '#/' @B� *"� 9�(#/ ";A�

'#-6 @�� /"� 9�-#( ";A� '#(* @��� *"� 9*�-#6 ";� 9/�,#% ";A�

-#// @��� *"� 9*�*#& ";� 9/�*&#- ";A� -#/6 @��� *"� 9*�

*#' ";� 9/�*(#/ ";A� -#,- @�� *"A� %#(6 @�� /"� 9�,#' ";A�

(#&6 @�� /"� 9�,#' ";A� (#/- @�� -"A# *.� !$5 @'&& $";�

��� ��+�'A � *%#'/� .(#',� .(#-.� '/#&(� '6#(,� -'#'*�

--#'%� %-#6%� **-#%(� **(#(%� */-#('� */-#6%� */,#-%�

*/6#..� *.&#-*� *./#*&� *.%#6%� *-(#*/� *(&#/.� *(*#('�

*('#&%# 0�=$�) '6(#/ @$�*A#

������1����� ����������� )�',& � ��1���� � 8��� ��+

��� �� @*&& ��� *#- ��A �� � �������� ����

@/&& ��� . ��A ��� ��I�1�� �� . # � � ��1���� ���

����� ��� �� � � �1������� ��� ��� ���� � �����

@/�/&& ��A# � � � ��� � ��� ��� ��� �� ��� ������

����� ��� $ �7' �� :������# � � ����� ��� ������

�� �����# ���������� ������� � ������� ��B��� @,&#. �

.*#-LA# 8#�# /,<.&��G'<- ��" # *" !$5 @'&& $";�

����.A � -#6% @�� /"A#

-��(�(2��(/�*!�� )��,& � ��1���� � =�+�+���+7" @*-#& �

%& ���A� ����� 8����8��� @*6#*' � /', ���A� �����+

8���������� ��� �������� @/#&' � % ���A ��

� ����� �� � ��������� @**#' � %% ��A � (& �� �

����� �� (& �� � ��� ���� � ����� ��� ������� ��

�� ����������� �� * # � � � ��� � ��� ��� �����+

����� ����� ��� $ �7' �� :������# ����� ��� ������

�� ����� � ��� � ��B��� �������� � � ������� ��� ����:��

8� ������ �� � ���� ��� � ��� �1��G�� �� �������

@' ) *A � ��� � ������� ��B��� @*%#, � B���������� �����A#

5��&#%& @ �1��G�� �� �������� ' ) *A# *" !$5 @'&& $";�

����.A � &#6( @�� %"� 9�%#% ";A� *#'% @�� 6"A� *#%& @�� /"A�

*#(& @�� *"A� '#.- @��� *"� 9*�-#* ";� 9/�*'#* ";A� '#,(

@�� *"� 9�,#& ";A� -#%. @�� *"� 9�%#& ";A� -#,, @�� *"�

9�%#& ";A# 0�=$�) /,&#* @$�*A#

-��(�(2��(/�*!3 )�,& � ��1���� � =�+�+���+7�"/��

@*#( � %#&, ���A �� !�> @*#,. � */#*% ���A � *&& ��

� ����� ��� ������� ���� � �� �� �����������#

����� ��� ������ �� ����� �� � � ������� ��� ��4�

�� � ��� ���� � ����� @/&& ��A# � � ��1���� ��� � �

:������ �� � � :������ ������# � � ������� ��� ����+

:�� 8� ������ �� � ���� ��� � ��� �1��G�� ��

������� @' ) *A � ��� ������� ��B��� @*#,, � ,.#.LA#

5��&#%& @ �1��G�� �� �������� ' ) *A# *" !$5 @'&& $";�

����.A � &#6% @��� %"� 9*�/#, ";� 9/�%#- ";A� *#'% @�� 6"A�

*#%& @�� ."A� '#.& @��� *"� 9*�-#/ ";� 9/�*.#6 ";A� '#,%

@�� *"� 9�(#( ";A� -#,% @�� *"� 9�'#, ";A� %#&- @�� *"�

9�'#( ";A# 0�=$�) .(/#* @$�*A#

.������ '()!(�����+�������,(��������� )��,& � � ��1����

� .+@/+ ���1�� ���A+������ ���� � @-#(. �

.-#' ���A �� � ����� 8����� @(#&- � .-#' ���A �

'&& �� � �� �� ������� ��� ����� ����� ������ @.#6. �

.,#6 ���A# ����� ������ �� -&�� �� . � � � ��1����

��� ��� �� ��� / � "�� @/�.&& ��A �� 8���

@/�.&& ��A# � � � ��� ����� ��� ����� ��� $ �7' ��

:������# � � :������ ��� ���������# � � �������

��� ����:�� 8� ������ �� ���� � ���� ��� � ���

� �����G�� �� ������� @/& ) *A# 5����������;��� ���

�1��G�� �� ������� ��� � �� � ����� ���� @.#-( �

.%#*LA# 5��&#.- @� �����G�� �� �������� /& ) *A#*" !$5 @'&& $";� ����.A � -#'- @�� /"A� %#6- @�� /"A�

(#/* @�� *"A� (#.- @�� *"A� (#'- @�� ."A� (#%& @�� *"A� (#6&

@�� /"A# *.� !$5 @'&& $";� ����.A � .(#-6,� %(#&,�

**,#'/� */*#''� */*#%(� */,#/%� */6#.(� */6#%%� *.*#-(�

*.'#//� *.'#%.� *--#/6� *(/#(-� *6/#.%# 0�=$�) /,* @$�*A#

.������ '()!�(-��(�������+�� 1������+�������,(���������

)��,& � ��1���� � � ����� .+@/+ ���1�� ���A+

������� �� @*/& � � &#'. ���A �� ��/�7. @*'& � �

&#'. ���A � *& �� � � ����� ����� ��� ������� ��

&�� �� .& ��� =�+�+���+7�"/> � @/&& � � &#-' ���A

��� � � ����� �� � � ��1���� ��� �������� ��

�� ����������� �� �� �� / # ����� ��� ������

�� ����� �� � � ������� ��� ��4� �� ��� ��� ��+

��� �� @-& ��A �� :������# � � :������ ��� ������

�� � � ������� ��� ����:�� 8� ������ �� � ���� ��� �

��� � �����G�� �� ������� @/& ) *A � ��� � �������

�� @,& � � .-#(LA# 5��&#-& @� �����G�� �� ��������

/& ) *A# *" !$5 @'&& $";� ����.A � &#6% @�� %"A� *#''

@�� 6"A� *#(& @�� ."A� '#.- @��� *"� 9*�,#. ";� 9/�*.#6 ";A�

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

*,% H �� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6-

Page 5: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

'#66 @�� *"� 9�,#' ";A� -#-* @�� /"A� -#,& @�� *"� 9�%#' ";A�

%#&/ @�� *"� 9�%#' ";A� (#*. @�� /"A� (#'*<(#%( @�� -"A�

(#6- @�� /"A# 0�=$�) '/'#. @$�+=�A#

.������ '()!�(-��(�������+�� 1������+�������,(���������

)�4,& � ��1���� � � ����� .+@/�+=�+������1��

��� ��1�� ���A+������� �� @,(& � A� ������ ��������

@- ��L � ��������� ������� ���8���� ����� ���

����A @*&L �G�� ,( � A �� B����� @/L �G�� *, � A

� �8����� �� �� @.- ��A ��� ������� ���� ��� �

����� ��� @8���A# � � ������ ��� ������ 8� ���

@������� ������) �1��G�� �� �������� ' ) *A ���� � �

������ �������� ��� �# � � ������ �������� �� ���+

��� ���� �����:�� ��� 8� �J �� � @��) 8���+�����

���� �J �� �� 5��&#'-� ��� ���+����� ���� �J �� ��

5��&#',A# � � �������� ��� ������ 8� :������ �� � �

:������ ��� � � ��������� �� ����� � ��� � �������

�� � B���������� �����# *" !$5 @'&& $";� ����.A �

&#6. @�� %"A� *#'( @�� 6"A� *#%- @�� ."A� '#.- @�� *"A� '#6-

@8���� *"A� -#.- @�� /"A� -#(- @�� *"� 9�%#' ";A� -#6- @��

*"� 9�%#' ";A� %#/& @�� *"� 9�*/#' ";A� (#*& @�� *"A�

(#/*<(#%( @�� ("A� (#6- @�� /"A# 0�=$�) '/%#' @$�+=�A#

'()!�(-��(�������+�� 1������+�������,(������� � � � )!0,& D��

����� @',% � � .#, ���A ��� ����� � ����� � � ��1+

���� � � ����� .+@/�+=�+������1�� ��� ��1�� ���A+

������� �� @*&& � � &#*6 ���A � /& �� � ������

���� �� *&��# ����� ������ �� /& ��� � � ��1���� ��� :�+

����� � �� :���� ����� �� � � :������ ��� ���������

�� �����# � � ������� ��� ����:�� 8� ������ �� ����

� ���� ��� � ��� �1��G�� �� �������G��� ��

@' ) / ) &#(-A � ��� � ������ �� @-' � � %6#(LA# 5��&#-&

@ �1��G�� �� �������� ' ) *A# *" !$5 @'&& $";� ����.A �

&#,6 @�� %"� 9�%#' ";A� *#'' @�� 6"A� *#%- @�� ."A� '#.. @���

*"� 9*�,#% ";� 9/�*.#- ";A� '#6. @�� *"� 9�,#/ ";A� -#,*

@�� *"� 9�%#/ ";A� -#,% @�� *"� 9�%#/ ";A� %#&. @�� *"�

9�*/#' ";A� (#&- @�� /"A� (#*( @�� *"� 9�*/#' ";A� (#.. @���

*"� 9*�9/�(#( ";A� (#-/ @�� *"� 9�(#- ";A# *.� !$5

@'&& $";� ����.A � /*#',� //#*.� /.#*%� /-#*,� /,#%6�

'*#'%� -/#-'� ,&#(/� ,%#*-� *''#&*� */&#,6� *//#(/� */-#-(�

*.&#(6� *.*#.&� *'&#.,� *-'#-*� *-(#&� *(/#,%# 0�=$�)

'&,#/ @$�*A� '.&#/ @$�!��A#

��1����� )!,& ����� ��� �������� ��� �0�����+

�+���+K��+� �+7+����� �� ����� � ����� � �

������� �������� �� ����� � ��� ������� �����

@�����) %(#,LA# 5��&#.- @� �����G��� ��� /& ) *A#*" !$5 @'&& $";� ��� ��+�'A � &#6& @��� %"�

9*�%#% ";� 9/�6#( ";A� *#*( @�� ."� 9�(#. ";A� *#'' @�� 6"A�

*#-* @�� /"A� *#%- @�� *"A� /#,6 @�� /"A� .#*& @�� /"A� .#--

@�� *"� 9�*%#, ";A� .#%, @�� *"� 9�*%#, ";A� '#*( @�� /"A�

'#.% @��� *"� 9*�(#% ";� 9/�(#, ";A� '#-( @�� /"� 9�-#% ";A�

'#%% @��� *"� 9*�%#- ";� 9/�(#, ";A� -#/& @��� *"�

9*�*#* ";� 9/�*&#- ";A� -#/( @��� *"� 9*�*#' ";�

9/�*(#/ ";A� -#(% @�� *"� 9�%#- ";A� -#,' @�� /"� 9�%#- ";A�

-#,' @�� *"A� %#*/ @�� *"� 9�*/#- ";A� %#(/ @�� /"�

9�,#' ";A� %#6/ @�� *"A� %#6- @�� *"� 9�*/#- ";A� (#&/ @��

*"� 9�,#' ";A� (#&, @�� /"A� (#/&<(#.& @�� %"A� (#.( @��

*"� 9�(#- ";A# 0�=$�) ,,-#, @$�*A� 6&,#, @$�!��A#

��1����� )!�,

5�1�"� � ���� $����& �� @�� .A' @// � � &#&*, ���A

��� ����� �� � ��1���� � ����� @*%/ � �

&#*,. ���A �� ��� ��� @*-6 � � *#,. ���A �

/& �� � �"0 �� �� �����������# � � ��1���� ���

������� ���� �� �� .& �� �� �� ������������ ��

� � �"0 ��� ������ 8� ����� �������� ����

������# � � ������� ��� �������� � .& �� � �� ��

������� �� ��� �� ��� / � "�� @/�/& ��A# � � � ���

����� ��� ����� ��� $ �7' �� :������� � � :������ ���

���������# � � ������� ��� ����:�� 8� ������ ��

���� � ���� ��� � ��� � �����G��� �� @. ) *A

@5��&#'- � �����G��� ��� . ) *A � ��� � � ��� ����#

5�1�"� � -��($����& � � ����� �������� �8�� ���

�������� � .& �� � �� �� ������� �� ���� � &��#

"�� @ ��A ��� � � 8�88��� �� � � ����� �� *- ��

�� � � ����� ������� �� �� �� /& �� �� &��# � �

�� �� ������� ��� � � ������ � ��� � � ��� ������ �

B���������� �����# � � ������ ��� ���� � � � �1� ����

��� �� ����:����# ���� ����� �� � ��� �� �����)

(,#&L# 5��&#'& @� �����G��� ��� . ) *A# *" !$5

@'&& $";� ��� ��+�'A � &#6. @�� %"A� *#*% @�� ."�

9�(#. ";A� *#%. @�� *"A� *#(( @�� /"A� /#6* @�� /"A� .#&(

@�� *"A� .#*, @�� *"A� .#'/ @�� *"� 9�*%#, ";A� .#%- @�� *"�

9�*%#, ";A� '#*. @�� /"A� '#.6 @��� *"� 9*�(#( ";�

9/�(#6 ";A� '#%/ @��� *"� 9*�-#/ ";� 9/�,#' ";A� -#6/

@�� /"A� %#*- @�� *"� 9�*/#' ";A� %#(' @�� /"� 9�,#- ";A�

(#&& @�� /"A� (#&( @�� /"� 9�,#- ";A� (#*% @�� *"A�

(#/&<(#./ @�� ("A# 0�=$�) ('%#' @$�*A#

���� � ���� �� ������$ )�,& ����� � @6.& � �

*#/- ���A ��� �������� � .& �� � �$0 �� � �

������� ��� *-&& �� � ��� ����� ��# ����� ������

@*#/% � */#- ���A �� =�+�� @/#/. � ,#(- ���A ����

����� �� � � �����# � � ��1���� ��� ������� �� /&

�� �� �����������# � � ����� ��� ��������� ��

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

�� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6- H *,(

Page 6: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

� � ������� ��� �������� � /&& �� � �� �� �������# � �

� ��� ����� ��� �1������� ��� / � "�� @/�*&& ��A

�� 8��� @/�*&& ��A� ����� ��� $ �7'� �� :������# � �

����� ��� ������ �� � � ������� ������� ����:�� 8�

��������������� "���# � � ������� ���� ��������� 8�

��������� "���# � � ����� ������� ���� ��8���

�� ��� ���;�� � ��� � � ��� ���� @*&& � � **#'LA#

"��� ������) @����� �) 6&L ������ *&L �����������

&#*L �0�� ����� =) 6&L ����������� *&L ������ &#*L

�0�A# � � ������� � ����� = ��� �������� ���

*& � .&L ��� *% ��� � � � '-L ��� �� ��

,- ��# � � ������ ���� � � � ������ ��� � %- ��#

5��&#%& @� �����G��� ��� *& ) *A# *" !$5 @'&& $";�

��� ��+�'A � &#,' @�� ."� 9�%#' ";A� &#,6 @�� ."�

9�%#' ";A� *#*6 @�� ."� 9�,#, ";A� *#.& @�� /"A� *#%&

@�� *"A� /#%, @�� *"A� /#,6 @�� *"A� .#&6 @�� /"A� .#*-

@�� *"� 9�*(#/ ";A� .#(* @�� *"� 9�*(#/ ";A� '#*& @�� *"A�

'#'& @�� /"A� '#-' @�� *"A� -#%, @�� *"� 9�%#' ";A�

-#,, @�� *"� 9�%#' ";A� %#&6 @�� *"� 9�*/#/ ";A� %#%,

@�� /"� 9�%#( ";A� %#6.<(#*- @�� -"A� (#/&<(#.- @�� ("A#*.� !$5 @'&& $";� ��� ��+�"A � *-#(.� /&#-'� //#.-�

/'#%'� .-#.,� .(#'*� .6#%*� '/#/(� '6#-%� -*#/*� --#/,�

--#6'� (,#',� ,,#',� 6&#'*� **-#/'� **%#-(� */.#&.� */'#.'�

*/%#(-� */(#/,� */(#'6� */,#'-� */6#.*� *.&#.%� *.-#*,�

*.(#'%� *--#6&� *-%#.(� *%(#6(� *(&#.%� *(/#.-� *(/#6(�

*('#-/# 0�=$�) (/,#. @$�*A� (-&#. @$�!��A# "5$�) �����

�� �.6"'%!-76� (/,#./6%� ���� (/,#..*(#

.��� �����1 �� ������� �� ������� 6� �� ��

�����1� �� ���� ��

2 ���� � � �� �� 1������� � 6� ������ ���& � � ��������

���������� � ����2 �� ��� ����� � � �� ���� 8����

��� ����� J���� %#- @����� >�#� �� ����� $7� ���A#

�� � �� ���� �������� ������ ���� ������� ���

� � $������� ������� ��� @$��A#

� ����� � ���� �1& �������� ��� ���� @��A �1��������

���� �������� ��� � �J>J ��+%&�� ��������#

������� ���� �������� � ��� �� �� � �������� �

/&& ��# ���� ���� �������� � � � �� � /'&<*6& �

� ����� � * � �� ��� ��# �� ���� ���� ����;��

��� � � ���1 ������� ������� @���A ��� � �

�������� � � ������� � � � � ������� ���������

������ @*%�/*A#

785 ������������& 0� !$5 �1��������� .#- � � � �

������ ����� � ��� �������� � &#% �� � �$�7+�%#

7�+ �� ��+�������� !$5 �1�������� ���� �������

�� ��� %&& $"; =��4�� ����� ����������� �B������

��� � �����8�� ����������� ��8�# � � �����������

�������� � � � ����� ��� ��� �������� ��� /6.

� .*, � � -+� �����# ����� ������ @.�"!�A ����

�������� ��� �M0+�7�E ������� �� /6. �# 572�E

������� ���� �������� �� .&& �� ���+��4 ����# � �

� �� +����� ������� ��������� ���� ����������

��� � � ����� ��� ��� �� �� � � � 572 ����+���4�#

>�������� ���� ���� �� �� ��� � ������ � ���4

��� ����� �� ���� 8������� � �������� �� �!��@���A�

���!@����*A �� �!�!@����*A � *#6<.#&� /#&<.#% �� /#-<'#- �N �

������������# ����+� �� ���� ���� � ���� �� �����+

�����:������ ���� 572 ��������� �� ����+� ��� ����

���������� 8� ������� ����� ���� @//�/.A#

��1���� ��� 1������ )! ,& � � ����� �� ��� �

7���� ����� K��� ��� ������� @����� /#6,� ���������

�� ��� � ��� ���A ��� ���� � ��������� �����

�������� � �� ��� ������� ��� � � !$5 ����#

�������� ������ ���� :��� @����A ��� ���� �� � ���

����������� �� � � ���F������� ���� ������� �����

*&& ��# � 572 �������� $� �������� �� ����� ���

�������� �� *& �� �� 6&& � ��� � ���������� ����� �

���� � 8���� � � ������ ���� � � � ������ ����� ���

� ����� ��������# � ������ ���� � *&& 4���G�� �N / ���

���� � 8�� � � ��� � 8�����8�� 572 ��������#

0�� � � *& �� $� ���������� ������� ��������

��� �����8�� ������� 8� ������ ���� ��������#

� ��� ���������� ���� � � ��8F����� � 6&& � $� ��

*&& �� � �1���� ��� ����8�� ������ ��������#

���� � �� � +����������� ��������� ��� � � �������

8�� ���� ��� ������ �� � � ������� ��� � ����

����� �������� � #+��� ������ �������� @/-A# � � ���F���+

���� ��� � +����������� ������� ���� ����;�� ��

���������� ������������ 8� ������ � � ���� 8�����

8��48�� � � � ���F�������# 0��� �������� �������� �

������� ���� �������� ��� ���� ������ ��� �

&#' �N �� ��� ������# ����� � ���������� � ��� ������

���� ��8F����� � *&& ����� � ��� � �����;���� ���

� � �������� ������ ��� � � ����1 � � �������# 2��

��������� ��� � � ��4�� ��� �$�7 @, �N �����A ���+

����� ������ 8� .& �� $� ��������� �� .&& � ���

572 ��������# ������� �������� ���� �������� ��

� � :�� ������� ��� �� ��������) @�A � � �������

�� � ������� ������� ���� � �&#- �N �������

��� � � ����� �� ���� 8��� � �������� ��� 572

����� �� @��A � � ������� �� � ��� ��� � .&� �

���������� ������ ��� .�"�!# � ��� �������� ����

�����;�� ��� ����� �������� ��� � � �F� ���

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

*,, H �� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6-

Page 7: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

������ ��� � ��� �� ���� ����� ���� � � ���� ���

&#' 4���G�� �N # � � ��� �+�����;�� ���������� ����

����;�� � ����� � �� ����� � ���� ��� � �� 8������

572 ��������� �� � � ��� :� ������ ��� � � ��������#

5������ �� ��������

#������ �

� � ������ ����� � ��� 8����� ��� ����� ��������

8� ���� � ������� 8� 8����� �+������ �� � ���+

����� @0� # /A# ����� �������� ��� �����8��� 8�

�F� ��� ������������ �� ���� �� � �� ����� � �

�������� ���� ��4�� �� � � 1���� �� ������ ���# � �

��� ���� � � �� ���� ��� �������� �� ��� ����� �

������������ � �� �# >���������� � O.+@/+ ���1�� ���A+

������ ����P �� � �B������� � �������� ���� � � ��

� � ������ 8� �� � ���4 �� � � ���$��8�� 8�# ������

��� ���� � � � ������ 8� � � � ������� � ������

�������� ��� � � ��� ��8�� 8�# ����������� � � �

���� ��� � ����������� � 8� � � � ����+7" � � ���

� � 4�� ����������� �� �������� � � � ���81���� ����

��� � ����������� � ������ 8� ������ ��� � �

��� ��� � ������������ ������� ����� �������� #

#������ � � '()!(�����+�������,(������� � � � )',

0���� ���������� ��������� @/&A� .+@/+ ���1�� ���A+

������ ���� � ��� ��� ���;�� � B���������� ����� 8�

������ ����������� ������8�� 8�;����+/+���81����

���� �� ��� ��� �� <(,�� @0� # -A#

#������ � � ���� �� �$1��� ) ,

������������ ��� ��� ���;�� ��� =� � ������� ���

� � ����� � ������ � @0� # .A# � � ��� ���� ��� �������

8� ������ =�+K��+7" ��� "+� �+7��� � ��� � �

��������� =�+K��+� �+7��� � � B���������� �����# � ��

��������� ��� ��8F����� � �0�G�"/��/ � ����� � � =�

������� ���# ���� � ��� ���� ��� �� ����:���� �

� � �1� ����� � �� ���� ��� ������� ��� =�+�+���+7"

� ��� � � ���������� �# ��������� � � � =� ���

� � ��� ���� �� � �� �� ����� ��� =�+���+7"

������� � � ������������ ��# �������� � ����� ��

��� �0�G�"/��/ ��� � � ������� ���� #

OH

COOH

CONNH

O

XNHO

O

HN

NH

O

OHO

O

CNH

O

ONHO

HO

R1

HN

NH

OR2

O

O

OO

HN

NH

O

HO

HN

NH

OR2

O

O

O

H2N

( 2 )

( 3 )

( 4 )

( 5 )

R1

HN

O I

O

(1) X=-OCH2O-(1a) X=-O-

COOH

OCH2O-D-Leu-R1

( 20 )

R1=Boc-; R2=Allyl-

���� %� 5������ ���� ������� � � � ���:�� �������� ����+8���� ������� ����� �#

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

�� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6- H *,6

Page 8: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

� � ����� ��� ��� � �� �� � � ������� ��� ��

� � �+������� ���81���� ���� � � � ������� ��� ��� #

� ��� ��� �� F����:����� �� � �� � ���) @�A 8������

� � ������� ��� ��� ��� ��� ���;�� ��� ������� =�

������� � �������� � � �+������� ������� ��� ��

������� ��� ��� ���� 8� ���8�� ���� � � ��� ������

������ @�# # �0� � �"/��/A ���� � � � =� �������

� ������� � ����� � � ������� ��� @/A� � � �������

��� ���� 8� ������ ���� ���� ������ ����� � �

����� �������� ��� �����8���# > ����� �������� � � ���

�� � ��� ��8�� 8� � � � �������� � �� �� �������� �

��� ����G�������� �� � ����1�+��� �� �� ��

������ � �� �� �������� � 8� ��� ���� �� ���

8��� @/(�/,A# � ������� ������ � � � ������� ���

��B����� ������ � �� � � ��� ����G������� ��

��� ���� � 8���# � � ����� ��� ����� 8� ��B����+

����# >� �� ������� ���������� ��� ������ ����� ��

�� 8� ������ ��� � ��������� �����1 � � � ������� �

� ������� ���� @�# # ��� ���A �� �� �����������

@/,<.&A#

#������ � � -��(�(2��(/�*!3 )�,

� � ��� ���� � =�+�+���+7�"/> � ��� �������� 8�

��I�1� 8��� ����� �� �� ��� � ��������

���� � �� . � ��� � � � ����� �� � ��������� ��#

��� � � � ��� ������� � �� �+=�'!"�7'� � ����� ��

� ��������� �� ��� ������� ��� =�+�+���+7" � � �

��+� ��� ������ ��� � ��1���� � �"/��/ �� ����� �

������ ����� �� � B���������� �����# ��������

� ����� �� ��� ����� ����� � ����� ��������

� =�+�+���+7�"/> � @(A#

> � � ��� ���� � =�+�+���+7�"/> �� � � ���������

� �+ ����4�� ����� �� @=�+�+���+7�"/��A ��� � � 4��

����# J����� ��� �� ��� 8�� ������� �� � � �������+

�� � �+ ����4�� ������ @.*<.'A# $�� � � ��� ��� ��

������ � � ������ � � ���� ����� ��� � ���� ���

�� � ����������� ��� ��� ����� �����# =������

�������� �� ���� � ������;� ���� � ��� ��� ���+

���� � ��� ��� �� ��� � �����8�� � �� ��� ���� �

� � ������� ����� # >�������� ������ ���� ���� � ��4�����

� � ���81���� ���� ��� � � � !+�������+��������

������ @=�+�+���+7" �A ��� ����� �� �������

@.-�.%A� 8�� � � ������� ��� ������� ������# � �

��4����� � =�+�+���+7" � ��� �� ����� �� ���

��� ����������� < �� ��� � ���������� ��1����� ���

� �� �� ��� ���:���� � �������� � � ������� ������#

����� �� ��� :���� ��� ���;�� 8� ��4�����

=�+�+���+7" � ��� � ����� �� � ��������� ��

@.(<.6A � � ��+� ��� ������ � ��� ���� � ����� ��

�B���� ����� 8����8��� � � � ������� � � � ���

������� � �� @�+=�'!"�7'A @0� # 'A#

#������ � � ������$ )�, �� ���1�� �$ �$1��� )',9 ) , �� )�,

� � ���� ��� ���� � ����� � ��� �������� 8� ������

8�;����+/+���81���� ���� �� ��� ��� �� <(,�� ��

*- �� � ��� .+@/+ ���1�� ���A+������ ���� � �

B���������� ����� @0� # -A# ����� � ��� ������� ���

� ����� 8����� � 8��� ����� ��� � � ��

� � ���81���� ���� ��� ��� ����������� �������� � � �

������� � � ���� � ���� ���1�� ���# ��� � �

��� � �������� � �� ��8����� @'&A� ����� �� ���

������ ��� =�+�+���+7�"/> @-A � ��� ����������� ��#

�� ������ � � ������ 8� � � � ����������� �� 8�

��� ���� ��� ������ ��������� � � � ����� ���

� �� ��� ������ ��� ;��G������ ���� �� � � �����+

������� ��� ������ ��� ����� �� � ��� � �

����� �������� # � � =� ������� ��� � ��������

��� ������ 8� 8�88�� "�� �� �� ��� �� �� �������

����� �� � � ����� ��� ��� ������ ��� � ���������

�����1� ��@�� .A'� � � � ������� � ��� ��� � ���

����� �# 0������ � � ��� �� ����� � ��� 8�����

8� �����;� ����� � ��� =�+�� � ������ �����#

�� � � � 0� # -� � � ���81���� ���� ��� �

.+@/+ ���1�� ���A+������ ���� � �� � 8� ��������

8���� =�+�+���+7�"/> � ��� �F� ���� � ��� � ����

���1�� ���# � � ������� ��� ���� �����������

a: EDC/HOBt/TEA/DMAP/THF;b: TFA/CH2Cl2

H-Phe-O-All

+ Boc-Gly-OH

Boc-Gly-Phe-OAll

a

b

H-Gly-Phe-OAll

a+ Boc-D-Ala-OH

Boc-D-Ala-Gly-Phe-OAll

H-D-Ala-Gly-Phe-OAll

Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OAll

H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OAll

+ Boc-Tyr-OH a

b

b

(4)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

���� &� ��� ���� � ������� ��� ��� #

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

*6& H �� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6-

Page 9: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

����� ��� � � ���81���� ���� ��� � � � ������� �

���� � ��# ���� � � � �������� � � � � �����

��� � �� ��� ����� ��� ������� ����� ���

�� 8�;��� ���� ���� �� @���A� ���� @'*A� ������ @'/A�

�+8��������� ������� @�=�$�A @'.A� =� �� ���� ��+

�� 1����8�� @���A @''A� ���� ������ �� � ���

� �� ��B�������# � ����� 8����� @'-<'(A� ������

����������� ������� ��� � � ���81���� ���� ��� �

.+@/+ ���1�� ���A+������ ���� � �� ��� ������

���� ���� ������ ���������#

���� � � ��� ���� � ����� �� � � ��� ��8�� 8� �

� � �������� ���� ��� ��� � 8� � ��8��� �������

���# C � ������ �������� @-L ��G���7.A ��� �������

� ������� ��4�� �� ��� ��4��� ���+������� ��� �

������ ��8���# >� ��� ����� 8� ������ � � ������

���� �� 8� ���� B����� @/L�G�A � ��� � � ������

��������# $������ � � DG"7�� ��� ���� � � �

��������� � � ����� ���� � � ���$��8�� 8� ���

������;�� �� � ����� �: ����� ����� / # > � �

������� � DG"7��� � � ������ ��� �������� � � � ��

BrCH2Cl HO SO

OCl ClCH2O S

O

OCl+

reflux

~30%Boc-D-Leu-OH

Boc-D-Leu-OCH2Cl

+

H2O/CH2Cl2

NaHCO3/Bu4NHSO4

Boc-D-Leu-OCH2INaI/Acetone

(13)

(15)

(11) (12) (14)

(5)

���� "� ��� ���� � =�+�+���+7�"/> �#

OCOOH COOH

LDA/THF

-78 0C, 30min

OH

H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-O-AllEDC/HOBt/TEA/DMAP/THF

OH

Phenacyl bromide

Cs2CO3/Acetone

H2/Ethanol

COOPac

OCH2O-D-Leu-Boc

COOPac

OCH2O-D-Leu-Boc

Zn/HOAcCOOH

OCH2O-D-Leu-Boc

COOPacBoc-D-Leu-OCH2I

TEA/Ethyl acetate

5%Pd/CaCO3

1) HCl (gas)/Ethyl acetate

2)Pd(PPh3)4/Morpholine/THF

CO-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OH

OCH2O-D-Leu-H Bop-Cl/TEA/DMF/CH2Cl2

CO-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OAll

OCH2O-D-Leu-Boc

Target compound ( 1 )

(16) (3)

(17) (18)

(19) (20)

(2)

(21)

���� '� 0��� ���� �� � � ��� ���� � ����� ����� �#

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

�� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6- H *6*

Page 10: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

���� @*- ��A �� �� ����������� @*&��A � ������ � �

������ � � � ������;�� ������#

������� 6� �� � ���� �����1 �� ������� ��

� � ���� ����� ����� � � � �������� ����� �������� � �

��F� 8������ �� ��� ��� �������� @-A# � ��� ��� ��

������� ��� ���� �� ������� ��� �������� ����� � �

�������� ���� ����� ������������ �� ������������# =������

� � ������� ���� ������8�� �� ������������ ������� �� ���

���� � � � �� �� ������������ ������� �� � � ������������

��� ��� �� �������� ���������� 8� � � ������� � �� �

F������ ��� � �������� � � �������� ���� ���� 8�

������������ ������� ������� ��� ���� 8�������8�������

@�*</LA @',A# =������ � � ��� ������8�� � ����� ������

���������� �������+8���� � ���������� ��� ������� ��

���� ���8����� � ��� � ��� �������� ����� ��������

����� ����� �� ������� � � � ������������ ��� ���� � ��

������� � �� ��� 8�������8������� @'6A# =� ��4� ������

����� �� � � ���� ���81���� ���� �� ��� ��� �

�������+8���� ������ ���� 8� ���4��� � �� ������

� � � �� � �� ������� � � � �������# > ������� � �

��������� ��;� � � � ������ ������� ���� 8� �������� ���

� �� � � � ����� ����� �������+8���� �����# � �

�����;��� � �������� ���� ��� ������ � � � ������ �

������������ ��� � 8�@�A �� � � �������

���� � � � �������� ��� �� � � 8����� � � �������

���� � � � �������� �� ����� ��������#

=������ � � ���� ������� �� �������� ��;� ��� ��

������� � ����� ������ ��������� � �� ���� ������ � �

������� ������� � �������� @-&A� � � �� � ������ @�

������� � ���� �������A �� �������� ������� ����� �

����� � � �� ��� �� � ��� ����� ����� ������� ����2

���� ���������� ��� ������ J���� %#-# �� � � �

��8�� *� ����� � � �� �� ��� ������� �� � ������ @�#�#

'#6- �� '#6%� ������������A# =� ��� ��� ���� ���� � �

����2 @�� ��<&#./A �� ��� � ��� ������ ���

������� ������� �����# � ��� ������� �� ��� � �� � � ������

����� � � �� �� � � ��� �� ������ � ��� ����2

��� ������� � ��;�# "������ ����� � � �� �� ��� ���

� �� ���� ��������� � � ����2# � ��� � �� � ��� 8�

��� ����8�� � �������� ���� ���8���� �� � �� ��� �

��8������� �� ��I�1 ���������� @��� �������� 8���A# >� ��

�������� � �� � �� ����� � � �� �� � ��� �������

�� � �� �������� ������� ���� ������� ������� � ��

� � 1���� ��+���:���� ��� � �� �:����� ����� � �

� ����� ������ ��������� �� � �� 8� ����� � � ���

��� ������� �������� � ������������� ����� ���� ���+

8����# �������� ������8����� ������� ��� ���+/ ����

������� �:���� � ��� ��������� @0# �� ��

5#�# =�� ����� ��������� ��8������� "# 7��� � ��#�

���������� ��8������A# C�� � � ��F� �����;�� ��I�1

������� � ���+/ ����� ���������� 8� K0*/&6*,� � ���������

�+ � � �8��� @-*A� �� �������� �� � � �8��� � 8�

�+ � �� $5�/ @-/�-.A� ����� � � �� �� � ��� � ��

�������� ����� ���+/ ����� O���� �� � =��'#'�*&<( ��G�

@���8��� �� ����A �� %#%�*&<( ��G� @0# �� �� 5#�#

=�� ����� ��������� ��8������� "# 7��� � ��#� ���+

������� ��8������A� ������������P � � � ��� ����� ����2

@���� �� � =��&#(,�*&<( ��G�A @*.A#

�����1� �� ���� ��

������� ������� � �� ��8����� ���������� � ��

� � ����� ������� � � ������� � � ������ �������

����� ���� 8� � ������� ����� � ������ � �

��� �+8�� �8����� � � �������� � �� � � � ���

� ����� ������ ��������� @*%�*(A# >������ �8�� � �

����� ������� � � ������� ���� ��� ������ �

����8�� �1������ �� � � ��8������ �������� � ������

������� ����� � �� � � ��I�1 ���������� @*%<*,A# >

�� �������� � � ����� ������� � ������ ����� �

��� ��������� 8� !$5� �� �� �������� �������

��������#

=������ � � � �� �B���� ���8����� � ����� �� !$5

���� ���� �������� � �$�7$�% @��8�� /A# � � �+

�������� *" !$5 �������� � ��� � �������� �

� � � ������ � ���� �� ����� �������� ��������� � �

���8�� ������ �� � � �1��������� �����������# � �

��� � ������ � ���� ���� �����:�� ��� "+"+��������

���������� @�7�EA� ���� �������� ����������

@�7��EA� �� ����� ����� 7��� ����� ������ ����������

@572�EA# � �� ��������� 572 ����+���4 �� � � �����

!"<!" �������� ��� 8������ � � � 572�E ��������

� ����� �# 0��� ������ � � � 572�E �������� � ��� ����

��� ����� 572 ����+���4� �� ����� � � � �� ����

�� @*%A# � ��� ������� �� ����� � �� � ��� ��� �+���

����� �� .��� �����1 �� ������� �� � ���2: �� �� ���� �������$� � �� �

1���� ������� �����

1���� ��� � �"������� ��* �

����� >34 7?#-* >*@#A@

���� � � B@3 6#@B >6A#>?

���� � � 3*3 6#@> >*B#*>

�# 1��.�� �" 9:+:� B#> $�� ��� �� ���� ���� ��� .������������ ��� � �"���#

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

*6/ H �� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6-

Page 11: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

��������� � ����� � �� � �� �� ������ � ��� ����

������� � � ����� ��# � � ����������� ���:�����

� � � ����� ���� � ����� � �:���� � ��� 8�����+

��� @��8�� /A# $�� ����� ���� ��� � ��� � �����������

���:���� � � ������ � ����� ������� � � �������

� �����+�1���� ����� ���� �� � � �8���� �

���8�� ������������ �7+!" ��� � 8�# 0��� ������

� � �� ����� ��� �:���� � � ������� ��������� �8��#

�� �1�������� ���� �������� ����� � � �� ��

� ��� �� @���� � � �A# � � ������� ���� ��������

�� ��������� � ��� ������ �� ���������

��� �� ���� 8����� �� ��� � � � ������# ����� �

� ��� ��� ���� ����� @(*LA � � �� @'/LA�

������� � ��� ���� ������� �� ����� �#

��� ������� �������� ��������� ��� � � 572�E

��������� �� �������� �������� ������� ��������

����� � ��� � � ���� ��������� �� ������8�� ���������

@*%A# ����� ��� � �����;���� :�� �������� � � �

���������� ���� �������# 7� ������ � � � ����������

�����:�� ��� � � � 572 ������� �������� �� ��� � � �

�� ����� � ��� �������� 8� !$5 ����� ������

@��8�� .A# � � ����� � ��������� � � �� ������ �� � � �

0� # %# ���4� ����� ��� � �� �� �������� � ���� >

�� ���� >> �+���� @*%A� ����� � �� �+��� �������

��������� �� ��� �������� 8��48� �� ��������� �� � ����

���# � � 1� � ���� � 8� � � � �� ��� �� � �

1����� �� ��� ��� � ���� ��1����� � � � �����

��� � � K��.# � � ����8�� ������������ ��� �

8�� 8����� � � �� 1� � ���� �� � � �����

��� � ��� � ����� ���8���;�� � � ����� ���

�� �������� � � ���� �� ����������� ���:���� � � �

����� ����� ��� @�#�# ��G��&#. �#�#8#G�A#

� � ���������� � � � �������� � ����� � � �� ��

���� ��� ������� ���������� �� � � 8�� ������������

��������� � � � �� ����� � @*A# ���8����� ������� � ���

� �� ����� � �� � �� ���+����� � ��� 8�� ���� �����

� � ����� ��� �������8�� 8������ � ��� ��� ��

�������� �� ����� 8��� @"# 7��� � ��#� ���+

������� ��8������A# � � � � � � � � �������� @� �

���� ��� � ����� � ��# � � ���� > �� ���� >> �+��� �

����� ��A ��8�8�� ����8���� � � � �������� � � �

����� �� ��1������� ����� ����9 ���1 �� �� ��9 �� ����� �$�������� � ������$ �

2���� ���<��##�#<C

.� ������������-�0�� ��'

.������� ���"� �##�

7* ��* ��*

����4 3#3 B#6B A#*- 6#*> *#B*<*#36

������* >#B >#6@ A#*- 6#?* 4#?3

����- ?#- >#A? 3#A- -#??<-#6? 7

����6 -#B A#?* 3#63 6#6- *#3?<*#A>

���� �> 3#? 3#BB A#46 6#44 4#6*

����� � � ���� �$��� �� ��� ����$� 1 � 1 6�� "��$����������� � ������$ �& �������� � ����� �$��� ) � ��$����,��1 ����� �$ �������� )'7*�, �� ��� $ "�� �� ��1�� ���

2���� �.� ������������ ��' .��� ����� � ��

1��� ���� �� � ��

����4 B#6B 74B?% 73?% -?% 4?? 73> 4*>

������* >#6@ 743?% 7B?% *>% 44> 44> 74B?

����- >#A? 74B>% 73?% -?% 4?> 743> 74*A

����6 A#?* 74>?% 7A?% B? 74*6 A3

���� �> 3#BB 0� 744* @@

(A) (B)

���� (� 2�� �+�����;�� ����� � ���������� � ����� �) @�A ����

����� @=A 8��4 ����#

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

�� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6- H *6.

Page 12: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

����� 8��� ��������� @/A# � � �������� ����� ����

� �� �� � � ������ 8������ �� ��� ��� �������� 8��

��� �� � 8�� ���� 8������ @-A# � ������8� � � ��������

� ������������� � �������� ����� � � �������� ���� �����

�� ��� � ������ � �� � � � ����� ������ ���������

� � � �������� 8�� ��� � ��� ��8������ �������� �� ��I�1

��������� �������� ��� �� �+ � �� $5�/ � �

���8��� � ���� ���� ����� � � � �������� ����� @-'A#

$������ � ��� ��I�1 ���������� ��� ��� ������ � � �

����� �� ��� ���������� � 8� ������ � � � 8������

�������� � ���� 8�� �������� @--A# ����� ������� � ��

������� ���� ������� ���� � � � �� � ������� �����+

�� �� � 8� � ��B������� �� � ��8������ �� �+ � @-%�-(A#

� ������� � � ������� � � � ������� ��� ��� � ���+

���� ���� � � � ����� � ���� ��8�8�� � � � � ���

��8������ �������� �� � � ��I�1 ���������� ��� �+

��B������ � ��� �������� ����� �������� ����� ��

� ��� �� ���� � �����4����� ���������#

> ������� �� ��� ������8�� � �����8�� ��� ����

��� � � ��4� � ���:�� �������� ����+8���� ������

������� ����� � ��� � ���� ��� �B������� �������

8����� � � � ���� ��� � � � ������� �� � �

���81���� ���� ��� � � � �������# ����� � � �� ��

�1 �8�� ��� �����8�� � ����� ������ ��������� ��

���8��� ��������# !$5� �� �� �������� �������

�������� ������� � ��� � �� � � 1����� ��+���:��

����� � ������ � �������� ������� � � ���

����:�� ��� �� @���� ��� ��# ���� > �� ���� >>

�+���A# � ��� ���������� � ����� ������� ����

������ � � �������� � ����� � ����� ����� 8�������

8� ������� ������� ��G� � ��� �8����� � ������� ���

��I�1 ���������@�A � �� ���� ����� � ��� ������������

��������#

��;������$�1����� ��� � ����� $� �� ��8� �� ����8 ���"�����

2������ 9# ����� ��� �� D���� : "�� ����� ���" � � ���������

��� ���� ������# ���� �������� $�� � ����� �� � ����� "���

��� ;����� 9����� � ���� ������ 9����� ��� ?@-4> # �E9 $� ��

��8� �� ����8 ��� ;�������� �" C����� "�� ��� 9��" =�� ���

9������ �$���#

5��������

*# �� ������ �#C# @*66*A ��������� � ����

������� ��� � �� � ������ �� ��� �� ��

������� ��� �) ������ ������ �� ������

��������# #)* � �� +������ ��� *,&<*6(#

/# ����� �#�# Q "� ��� 5#�# @*666A !��

���� ��������� ��������������� ��

���������� ������ ��� ��8�������

��8������# �������, �� ��� .(6<.6&#

.# ���8�� �# Q 5 �� �# @*66,A 0�� ��������

� ��������������) ���� � �������

�� ��� �� ��F� ���������8����� ������#

����,� *��� � ��� ��� *(.<*,*#

'# ������ $#�# Q ����� K#�# @*66-A

� ���� $��� � ��� ����- .����������

��������� ��� + ��/����,� �������

� ������ ������� C�� � � ��#

-# ��������� K#$#� K� ���� �#� ��� ��� �#�

��8�� 9# Q =�� ����� 5#�# @*66(A

>�������� � ��� 8�������8�����)

�������������� �� ����� ������ ���# *���

��� ���� � �� �� /.-</-%#

%# ���� ���� �� 5# Q $����� �#�# @*66-A

������� ����8���� 8� K������� ����������

�� ������� ���������# > � ���� $���

��� ����- .���������� ��������� ���

+ ��/����, @������ $#�# Q ����� K#�#�

���A# ������� � ������ �������

C�� � � ��� ��# '(<%,#

(# K� ���� �#� ��������� K#$#� ��� ��� �#9#�

������� J#9# Q =�� ����� 5#�# @*66(A ��� ����

� � ��� ��������+�������� ������ ����� �

� �1�������� ��� � @����1�A��41�

�������# �� ���� .� ,� �� *.-%<*.%/#

,# C� � =#� K� ���� �#� ��������� K#$#�

��� ��� �#9# Q =�� ����� 5#�# @*66(A

��� ���� � � ��� ��������+�������� ������

����� ������ �� �������� � �� �����;�� �

R������ �� ��4S+����������� �����;���

������# �� ���� .� ,� �� *.%.<*.%(#

6# C� � C#� ������� � K#� ���� �#�#�

D � � "#� "� ��� 2#� C ������ K#�#�

=�� ����� 5#�# Q C� � =# @/&&&A �

������+8���� ����� ������ � � ������

� � ��� �8����� � 5K� ��������������#

�� .������� � � �� ��� /'-</-*#

*&# C� � =#� D � � "# Q C� � C# @*66%A

� ������ �����8����� ������� � �

������+8���� ����� ������# �������

+ �� .� ,� 0 ��� �� 6'-<6-&#

**# C� � =#� D � � "#� � �� �# Q C� � C#

@*66%A ������+8���� ����� � /# ��� ����

�� 8��������8����� ������� � �

��������+�������� ������ ����� ����2�

� ��� �������# ������� + �� .� ,� 0 ���

�� /,/.</,/%#

*/# C� � =#� !��4��� �#� C� � C#� D � � "#�

� �� �#� K�������� 7#� K� ���� �#�

��� ��� �#9# Q =�� ����� 5#�# @*666A

��� ���� �� �������� � � �

� ����� ������ ��������� �

��������+�������� ������ ����� � � ����

�������� ��� �������� ���� ��

� ��������� ���� ��4���# �� � ���� � ��

��� .(&<.,/#

*.# K�������� 7#�#� ��������� K#$#�

C� � C#� � �� �#� D � � "#� C� � =# Q

=�� ����� 5#�# @*666A �������� ����+8����

������ ����� � � ���� �������� � �� �1 �8��

����8��� ���8����� � ���������� ��

�1������ �������� ������8�����# ����,���

� �� ��� (<*-#

*'# =�� ����� �# Q =��� !# @*666A M����������

���������<����8���� ������� ���) ������

�� ������ ������� � � � �;������

�������� � � ��� ���81���� ������#

�� + �� .� ,� � -*%&<-*%,#

*-# =������� �#2#� � ��� �# Q � ������ $#

@*666A �����+������ ������� ��

�����+8��� ��������� � �������� ��

�������8��� ��������) ����������

�� 8�� ���� �����:����# ������,� ��������

*��� ��� ,6<*&,#

*%# K�������� 7#�#� 9��� �#�#�

J���� J����� �#K#� ��� ��� �#9#� C� � =# Q

=�� ����� 5#�# @*666A � � ������ �

������� � � ���8��� ��������

� �������� ����+ �� � ���������

����+8���� ������ ����� � � ���� ��������#

�� � ���� � �� ��� .,.<.6/#

*(# K�������� 7#�#� J���� J����� �#K#�

9��� �#�#� =�4� �#� ��� ��� �#9# Q

=�� ����� 5#�# @*666A � � ������ �

������� � � � ����1���41�+8����

������ ����� � � ���� �������� � ���

���8��� ������8�����# �� � ���� � ��

��� '&.<'*.#

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

*6' H �� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6-

Page 13: Synthesis and conformational analysis of a coumarinic acid-based cyclic prodrug of an opioid peptide with modified sensitivity to esterase-catalyzed bioconversion

*,# �� ��;��� 5# @*66/A "� � �������� �������

��� ����� ���8���� �� � ��� � ��

������ � ��� 8�� ���� ��������T ���1� �� + ��

����� � �� �� *&((<*&,6#

*6# C� � =#� C� � C#� ������� � K#�#�

2��� 9#� D � � "# Q =�� ����� 5#�# @*666A

��� ���� �� �������� � ���

������+8���� ��������+�������� ������

����� � � ������������� 5K� ��� �

��� ������� ���8��� ������8�����#

.� ,� ����,� ����� @��2��A �� 6&<6-#

/&# D � � �#� C� � C#� D � � "# Q C� � =#

@*666A �� �� ������� ������ �� � � �

��� ���� � ������+8���� ����� �#

� ���� ���� ��� '/.(<'/-'#

/*# ����;��� �# Q "����� $# @*66%A > .�������

�������, ��� �� .��3��,������� *�������

�3 ���,�� ��� � @0����� K#�#� ��#A# �����

������ !�� E�4# � ����� 6� /,-<.,&#

//# C�� ��� � �# @*6,%A #+� �3 ���� ��� ���

#��� �� *����# C����� !�� E�4#

/.# 5���� $#� ������ 7#C#� =�� ����� K#�

C� ��� K#� 2���� 5#5# QC�� ��� � �# @*6,.A

>������ �������� ������� � ��� *"

!$5 ������� � ������ ��� ��8�� B�����

:����� # ����� ,� �������� � �� .�,,���

���� '(6<',-#

/'# K� ���� �#� 9��� �#�#� ��� ��� �#9#� J����

J����� �#K#� ������� J#9# Q =�� ����� 5#�#

@*66%A � � ������ � �������

���8��� ������8����� � � ����1���41�+

��4�� ������ ����� � � ���� �1��������#

����,��� � �� ��� *%-(<*%%/#

/-# 5���� ����� K#!# Q$����� �#�# @*6(%A �

�1������ �� � � ���� �������� � ���

������� ���� � ������ �� �����������#

�� +��� ����� ���� ,-<6/#

/%# �1� 5#�# Q E����� �# @*6,%A � �1����

������� ������� � ������ �� � �������

�������� � �������� ����# J������ � � ���

�������# �� ���� .� ,� ��� .%*6<.%/'#

/(# ������ �# Q =��� !# @*6,/A ��� ���� ��

�������� � ��� �������1���� �� ��

������� ����������� � � ���� ������#

*���� ����,� .� ,� ���� 4�� ��� *&'<**&#

/,# K��8�� 0#� �� ���� 7# Q =������� K# @*6,%A

���������+������;�� ������ � ���8������

������# ��������� �� ���� ���� ���������

� ����� �� �����1����8�� �����������

� ���+�����# � ���� ���� 0 ���

�� /.%-</.%,#

/6# ������� �#$# Q C����8�� 5# @*6-&A ���

���� �����������# ># ���8�����1� �����������

� ��� �+��� �����# �� *,� .� ,� ����

�� (/-<(/(#

.&# D � "#?#� K��8�� 0# Q =������� K# @*6,,A

��������� ���������+������;�� ��������� �

� � ����� �� �����1����8�� ���� �

� �� ��� � ������� �� � � � ������� �

����� �� �� ����� ��1����8�� ����#

� ���� ���� 0 ��� �� %/.<%/%#

.*# 5�� ��� 5#5# Q C���� 9#�# @*6/-A � � 8����

�� � � � ���� ���� �������� � ������

+��� ������# >>># � ��� �����������#

�� *,� .� ,� ���� �� /6,6</66-#

./# 2����� 2#�# Q ��F����� �# @*6%*A � �

��������� � ��� �+ �� �+���#+��4��

������ � ���� ���� �����# *��� .� ,� ������

��� */&6<*/*'#

..# 2����� 2#�# Q ������� 7# @*6%.A

������ � � ��������� � ��� �+

�� �+���#+��4�� ������# *��� .� ,�

������ ��� /(%-</(%%#

.'# 2����� 2#�#� !��� �# Q ��F����� �#

@*6%%A � � ��������� � ��� �+ ����4��

������# *��� .� ,� ������ �� */(.<*/,&#

.-# "� � 5#�# @*6,,A "� ���� ����� ���

�1� � �# /# ������+����� ������ ��� ���� �

������� ��4�� �������� ��� ��4�� ������#

�� ���� .� ,� ��� -(,.<-(,-#

.%# 2���� C#�# Q 0������ �#0# @*6-.A

$���� ������ ������� � ������ ����� �

�����# >># � � ��� ���� � ��4�� ��������#

�� *,� .� ,� ���� ��� //-(#

.(# =������� 2# Q "���� 2#�# @*6,'A

� ���������� �� ��� ��� � � � ��� ���� �

���81���� ���� ������ ���� � ���+�������

������# ���� .�,,��� �� ,-(<,%'#

.,# "������ !#� " �� $#� ���4�� �#�

���� �� �� �#� "�� ������ �#Q���F� ���� �#

@*66'A � ������ ��������� � � ����� ��

������ � 8��4�� ��� �����# ���� .�,,���

� (%(<((/#

.6# ��� 2#� C�� C# Q =��� !# @*6,6A � ������

�������� ������ �� ��� �����������+

�������� ������� ���� ���������# �� + ��

.� ,� �� *(,6<*(6-#

'&# 7��� � "#� ��� ��� �# Q =�� ����� 5#�#

@/&&/A ������ ������ �� � 4�� ����� �

����� �+ ����4�� ����� ��� � ��#

� ���� ���� 0 ��� �� -((<-(6#

'*# 7���� 5#�# Q �� ��� 5#�# @*6((A J���� �

� � ����1����8�� ��� � ���1��

�������) ��������� � � � ��� ���� �

���� ��# � ���� ���� 0 ��� ��� *-(*<*-('#

'/# "������ 2#� $�4��� K#�#� !����� $#7#

Q ��� ��� 9# @*6%'A ��� ���� ��

��������� � ��� ���1�������

������ � B���� ����# �� *,� .� ,� ����

��� /*.(</*'%#

'.# ����� 2#9# Q J�4���������� �# @*6(/A

������� � ���1�� ���� ��

� ��+8��������� ������� �����������# �� *,�

.� ,� ���� �� %*6&<%*6*#

''# C�� �;� �#=# Q 9 ��� =#5# @*6%(A

���� ���� 1����8��) � �����

�������8�� ������� ���# � ���� ����

0 ��� �� /---</--(#

'-# �����4���� K#�#� �� ��� �# Q D������ �#

@*6%%A !�� ��� �� � ������� ��� ����#

���� >>># ������� � ���81�� ���#

�� .� ,� ���� @.A **6*<**66#

'%# E� � �#�# Q $����:���� 5#=# @*6(%A � �

8���+� ����� ����� �� � �������� �������

��� � �����;� ������ ����� ������

���� ��8��B��� �������� � ��������

�������� ��� "0# �� ���� .� ,�

�� *&./<*&'*#

'(# "�����4�� 9#=# Q ������� �# @*6(&A � �

� ����� ������� ��� �� ����� ��

� ���# � ���� ���� 0 ��� �� .'.<.''#

',# ���� "#9# @*66-A � ���� $��� � ��� ����-

.���������� ��������� ��� + ��/����,

@������ $#�#� ����� K#�#� ���A# �������

� ������ ������� C�� � � ��#

'6# K� ���� �#� ��������� K#$#� C� � =#�

��� ��� �#9#� ������� J#9# Q =�� ����� 5#�#

@*66(A ����� ������ ��� � � ��� � �

�������� �8����� � ��������# ���

����� �� ����� � *',<*--#

-&# �����4�� �#�# @/&&&A ��� +��4� ��������� ��

� � ������ � �� ���8����� �� ��

������8�����# �� ����,����� ��5����� + �����

� /.-</'6#

-*# ������� �#�#� �����4� K#$#� =������ �#5# Q

=������ �#�# @*666A 2������ � � ���� ��

�����:� �+ �������� � �8��� � �

8��<8��� 8������ ������8��� ��

������������ ������ � ��� �� � � � ���#

��� + ��/� ������ �� ,/(<,.'#

-/# !���� �#�#� ���;� �#� =��� $#� ������ ># Q

�������� �# @*66,A 21������ � � � ������

�F� ��� �1��� ����� $��/� � � �

�����;�� ������ ���� ���� C>0+=#

� �������� �� *../<*.'&#

-.# ���� � �#9#� $����� �#� �� �4��� �#"# Q

=���� �# @*66,A ������8����� � ���,..� �

��8������ �� � �8��� � �+ ����������

� ������ ��������� � �����# �� #���

.��� � )���� ��� **%*<**%%#

-'# ��8��4��� �#J#� ���� �#� "������ �#�#�

5���� ����� $#� ������ ># Q

K������� $#$# @*666A =�� �������

��������� �� � ������ ���� ������� � � �

�������� ���������# *���� � ��

����,����� ��5����� ��� .%*<.6,#

--# ��4� �� �� "#� ���� 5#=#� ������ �#5# Q

C��4��� K#5# @*66(A � ��������;��� �

� � ������ ���������� ���8��� �������

� � ���� �� �������) ����4���#

�� ����,����� 45�� �� �� ��� /6(<.&.#

-%# ����� � �# @*66,A � ����� ������ ��

��8������ ��� ��� 8� �+ ��������#

4��� �� ����� ,� ��� /-/</%*#

-(# ����� � �# @*66,A "� ��� �+ ��������

��� �;� ��� ��8�������T )��� �� .����

����,����� �� �� ��� -&<-'#

7��� � �� # 2�������+�������� ����� � � ���� �������

�� � ���� � �� ��� /&&/ G *,.<*6- H *6-