Systémy premutagenézu

(T4 vs Pfu)Martin Janitor, PhD.

Lambda Life a.s.

Mutagenéza v praxi

Nešpecifická mutagenéza - radiácia- UV žiarenie- chemické látky

Špecifická mutagenéza- bodové mutácie- viacnásobné bodové mutácie- inzercie- delécie

Priebeh Pfu a T4 DNA mutagenézy

}

WT mut

}

}

T4 DNA Polymeráza

}

WT mut

}

}

Pfu DNA Polymeráza

}

WT mut

}

}

PROMEGA systémy pre mutagenézu

PROMEGA GeneEditor System™ - - určený na bodové mutácie- viacnásobné simultánne bodové mutácie (2-5)- inzercie- delécie (do 700 bp)

- pozitívna selekcia mutantov

PROMEGA Altered Sites™ II in vitro Mutagenesis System – - určený na bodové mutácie- viacnásobné bodové mutácie v cyklických krokoch- inzercie- delécie

- pozitívna selekcia mutantov- in vitro a in vivo expresia

PROMEGA Erase – a – Base System – - pre rýchlu konštrukciu 5´ delečných mutantov- delécie môžu dosiahnuť dĺžku niekoľkých kb

GeneEditor Mutagenesis System- bodové mutácie -

} }

}}WT

mut

mut

Ampr

Ampr+

Ampr+

GEN 1gen 1

gen 1anelácia

T4 syntéza + ligácia

replikáciamut-

Selekcia LB+AB Mix

- použiteľný akýkoľvek konštrukt s Ampr génom

- vhodný pre mutácie, delécie, inzercie

- reakcia obsahuje všetky reagencie (T4 DNA Polymeráza,

T4 DNA Ligáza, mutS a JM109 kompet. bunky)

- dodávaný s Top a Bottom oligo

- mutagenéza trvá max. 90 minút

- úspešnosť cca 98%

- zachováva sa Amp rezistencia

GeneEditor Mutagenesis System- viacnásobné bodové mutácie -

}

WT mut

Ampr

Ampr+

GEN 1gen 1

anelácia

T4 syntéza + ligácia

replikáciamut-

}}

}

}

}

}}

mut

Ampr+

gen 1}}

}

}

2 až 5

Selekcia LB+AB Mix

- použiteľný akýkoľvek konštrukt s Ampr génom

- vhodný pre viacnásobné mutácie, delécie, inzercie

- reakcia obsahuje všetky reagencie (T4 DNA Polymeráza,

T4 DNA Ligáza, mutS a JM109 kompet. bunky)

- dodávaný s Top a Bottom oligo

- mutagenéza trvá max. 90 minút

- úspešnosť cca 95% po cca 30% (pri 5 rôznych oligo)

- zachováva sa Amp rezistencia

Altered Sites™ II in vitro Mutagenesis System - bodové mutácie -

mut 1

anelácia

syntéza

replikáciamut-

LB+Amp}

Ampr

Tetr x

mut 1

Ampr

}gen 1

Tetr x

}

Ampr X

Tetr

mut 2 denaturácia

}}

mut 1

Ampr

gen 1

Tetr x

}}

Ampr x

}}

mut2

gen 1

Tetr

}}

mut 2

}

anelácia a syntéza

}

Ampr x Tetr

WTpALTER

Ampr x

GEN 1

Tetr

}

replikáciamut-

LB+Tet

PROMEGA Erase – a - base System - 5´ delečné mutácie -

inzert

priming site

štiepenie vhodnými RE

5´ prečnievajúcialebo tupý koniec

3´ prečnievajúcialebo chráneným s alpha-

phosphorothioate NTPs

Exo IIIv časových intervaloch

S 1nukleáza

KlenowdNTPs

T4 DNA Ligase

Aplikácie PROMEGA systémov pre mutagenézu

Vysoko efektívna bodové mutagenézaInzercie krátkych a dlhých DNA úsekovVýmeny bázViacnásobné simultánne mutácie

GeneEditor SystemAltered Sites II System (pALTER 1)

Vysoko efektívna bodové mutagenéza a proteínová expresia v baktériách

Altered Sites II Ex1/Ex2 Systems (pALTER Ex1, Ex2)

Vysoko efektívna bodové mutagenéza a proteínová expresia v cicavčích bunkách

Altered Sites II Mammalian in vitro Mutagenesis System

5´ delečné mutácie Erase – a – base System

Vektor pALTER 1 pALTER Ex1 pALTER Ex2

Selekčné markery amp, tet amp, tet cm, tet

Prítomné promótory SP6, T7 SP6, T7, tac SP6, T7, tac

Prot. exp. in vitro a in vivo Niev E. coli

Áno Áno

Kompatibilita s ColE1 p Nie Nie Áno

Blue/White Screening Áno Nie Nie

PROMEGA Mutagenesis Systems- T4 DNA Polymerase vs Pfu DNA Polymerase -

T4 DNA Polymerase Pfu DNA Polymerase

Proofreading activity + +

Mutation rate 1 per 107 1-2 per 106

Strand displacement activity - + +Viacnásobné mutácie v 1 reakcii + + -

GeneEditor Mutagenesis System Q9280 23 168 Sk s DPH Altered Sites II in vitro Mutagenesis System Q6210 17 152 Sk s DPHAltered Sites II Ex1 in vitro Mutagenesis System Q6090 19 755 Sk s DPHAltered Sites II Ex2 in vitro Mutagenesis System Q6080 19 755 Sk s DPHAltered Sites Mammalian Mutagenesis System Q5590 20 565 Sk s DPH