ĐỘt biẾn gen beta-globin€¦ · sơđồquy trình phát hiệnđộtbiếngen β-globin...
TRANSCRIPT
ĐỘT BIẾN GEN BETA-GLOBIN
Ở BỆNH NHI BETA-THALASSEMIA
MIỀN BẮC VIỆT NAM
Nguyễn Hoàng Nam, Dương Bá Trực
Bệnh viện Nhi trung ương
HNNKTQ TpHCM 30/11-1/12-18
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
2
• Beta-thalassemia là bệnh di truyền phổ biến ở Việt Nam,
do giảm hay không tổng hợp được mạch beta globin của
Hb, do đột biến gen beta-globin.
• Nghiên cứu về đột biến gen beta-globin gây beta-
thalassemia giúp ích cho việc tư vấn di truyền, chẩn đoán
trước sinh.
• Mục tiêu nghiên cứu:
“ Nghiên cứu một số đặc điểm đột biến gen beta-globin ở
bệnh nhân beta-thalassemia phía bắc Việt Nam ”
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đối tượng nghiên cứu
• 104 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán : 55 là beta-
thalassemia,
49 là beta-thalassemia / HbE vào Bệnh viện Nhi trung ương.
• Tuổi - Dưới 5 tuổi : 89 (85,6%), trong đó < 1 tuổi 50 (44,4%)
- Từ 5-10 tuổi : 12 (11,5%)
- Từ 10-15 tuổi : 3 ( 2,9%)
• Giới : Nam / Nữ : 59/45 (1,3/1)
• Dân tộc - Kinh : 71 (68,3%), - Ít người gồm Thái, Tày,
Mường, Nùng, Sán Dìu, Dao, Bố Y : 33 (31,7%).
• Địa phương : Hà Nội và 28 tỉnh thành miền bắc. 3
Phương pháp nghiên cứu
4
• Nghiên cứu tiến cứu, mô tả, phân tích, cắt ngang. bằng các kỹ thuật
lâm sàng và xét nghiệm, tại BVNTƯ
• Phát hiện đột biến gen tại Khoa Sinh học phân tử, BVNTƯ :
- Tách DNA từ máu ngoại biên với bộ kít QIA gen DNA của Đức.
- Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR phát hiện 9 đột biến điểm
thường gặp ở Châu Á là CD41/42, CD17, IVS1-1, -28,
IVS2-654, CD71/72, IVS1-5, CD95, CD26 (HbE).
- Giải trình tự gen khi không thấy đột biến với Multiplex ARMS-PCR
- Sử dụng kỹ thuật GAP-PCR để phát hiện đột biến xóa đoạn nếu cần.
Sơ đồ quy trình phát hiện đột biến gen β-globin
Bệnh nhân β-thalassemia
Thu thập mẫu máu và tách DNA
Phát hiện đột biến gen bằng Multiplex PCRvà ARMS-PCR
Có đột biến gen Không thấy đột biến gen
Xác định kiểu gen đột biến: Dị hợp tử, đồng hợp tử
Giải trình tự gen
Có đột biến gen Phát hiện đột biến
xóa đoạn bằng
GAP- PCR
Một số đột biến gen -globin phát hiện bằng kỹ thuật ARMS
1 2 3 4 5 6 7 8
Panel 1: 1-6
1: Dị hợp tử -28
2: Dị hợp tử kép -28/71-72
3: Dị hợp tử Codon 17
4: Dị hợp tử Codon 43
5: Thang DNA 100 bp
6: Mẫu nội kiểm không DNA
Panel 2: 7-8
7: Di hợp tử IVS 2-654
8: Mẫu nội kiểm không DNA
Nội kiểm
-28
17
43
71-72
654
Nội kiểm
Phân tích đột biến gen theo chức năng và vị trí
ĐỘT BIẾN SAO MÃ (Kiểu hình β+- thalassemia)
- Vùng khởi động (promotor)
- Vị trị 5’UTR (5’ - Vùng không phiên mã)
ĐỘT BIẾN HOÀN THIỆN RNA (Kiểu hình β+ hay β0-thalassemia)
- Vị trí nối (splice junction)
- Vị trí nối đòng thuận (consensus splice site)
- Exon
- Intron
- Vị trí 3’UTR.
ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β0-thalassemia)
- Codon khởi đầu (Initiation Codon)
- Codon vô nghĩa (Nonsense Codon)
- Dịch khung (Frameshift) 7
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
ĐỘT BIẾN GEN β-GLOBIN GÂY BETA-THALASSEMIA Đã phát hiện 208 alen đột biến gen ở 104 bệnh nhân β-thalasemia
Đột biến gen β – globin ởβ – thalassemia Kiểu hình
Số alen đột
biếnTỷ lệ %
CD 41/42 (-TCTT) β0 63 30,3
CD 17 (AA – TAG) β0 62 30,0
CD 26 (GAG – AAG) HbE 49 23,5
CD 71/72 (+ A) β0 10 4,8
IVS 2 -654 (C – T) β+ 6 2,9
- 28 (A – G) β+ 6 2,9
- 88 (C – T) β++ 3 1,4
CD95 (TAC – TAA) β0 2 1,0
IVS 1 – 1 (G – T) β0 2 1,0
IVS 1- 5 (G – C) β0 2 1,0
Các đột biến hiếm gặp β+ 3 1,4
c-140 (C – T) 1 0,5
c-441-c442 ins AC 1 0,5
2.3kb – deletion 1 0,5
Tổng 208 100
Các đột biến gen β -globin phát hiện ở 104 bệnh nhân
0
5
10
15
20
25
30
35
Đột biến gen
β – globinKinh Tày Thái
Khác(Mường,
Nùng, Sán
Dìu, Dao, Bổ
Y)n % n % n % n %
CD41/42 43 30,3 10 50 6 25 4 18,2
CD17 41 29,9 6 30 6 25 9 40,9
CD26 33 23,2 1 5 12 50 3 13,7
CD71/72 8 5,6 1 5 0 1 4,5
IVS 2-654 5 3,5 0 0 1 4,5
- 28 3 2,1 1 5 0 2 9,1
- 88 3 5,6 0 0 0
CD95 2 1,4 0 0 0
IVS 1-1 2 1,4 0 0 0
I VS 1-5 1 0,7 0 0 1 4,5
Đột biến hiếm gặp 1 0,7 1 5 0 1 4,5
Cộng 142 100 20 100 24 100 22 100
Phân bố đột biến gen beta-globin theo dân tộc
Tần số các đột biến gen beta-globin ở β-thalassemia tại Việt Nam
Đột biến
Miền Bắc
(Nghiên
cứu này)
Miền Bắc 2.000
[Filon,Trực, cs.]
Miền Trung 2013
[Triết LPM.]
Miền Nam 2002
[Saovaros,và cs.]
Miền Nam 1988
[Hảo LT. vàcs.]
CD41/42CD17CD26 CD71/72 IVS 2-654 -28-88CD95IVS 1-1IVS 1-5c-140c441-c442 ins AC2.3 kb deletion Khác
30,3%30,0%23,5%4,8%2,9%2,9%1,4%1,0%1,0%1,0%0,5%0,5%0,5%
-
34,5%48,3%
-3,5%
13,8%
--------
+++-----+-----
35,7%25%
-7,3%7,3%7,3--
6,0%----
11,8%
43.5%13.0%
-8.7%
13.0%---
4.4%----
17.4%
Phân bố đột biến gen β– thalassemia phổ biến ở Châu Á
*Việt Nam [Nghiên cứu này] *Các nước khác [Southat F.2011]
Nhận xét: Các đột biến phổ biến ở Việt Nam khá giống với Trung
Quốc,Thái Lan: giống một phần với Myanma, Indonesia,
Malaysia.
Tần xuất đột biến Beta Thalassemia phổ biến ở các nước châu âu và địa trung hải
Quốc gia Đột biến Quốc gia Đột biến
Pháp
CD39 C – T 41,90%
Italia
CD39 C – T 41,00%
IVS 1-110 G – A 25,70% IVS 1-110 G – A 23,50%
IVS 1-1 G – A 10,50% IVS 1-6 T – C 10,10%
IVS 1-6 T – C 8,60% IVS 1-1 G – A 10,10%
Tây Ban Nha
CD39 C – T 50,00%
Hy Lạp
IVS 1-110 G – A 43,10%
IVS 1-110 G – A 16,50% CD39 C – T 20,90%
IVS 1-6 T – G 12,60% IVS 1-1 G – A 13,50%
IVS 1-1 G – A 11,50% IVS 1-6 T – C 8,60%
Bồ Đào Nha
CD39 C – T 37,30%
Cyprus
IVS 1-110 G – A 78,40%
IVS 1-1 G – A 21,00% IVS 1-6 T – C 6,40%
IVS 1-1 T – C 19,00% IVS 2-745 C – G 5,70%
IVS 1-110 G – A 11,50% CD39 C – T
Vương Quốc
Anh
CD39 C – T 34,80%
Sardinia
CD39 C – T 95,70%
CD 121 G – A 13,00% CD6 – A
IVS 1-1 G – A 8,70% IVS 2-745 C – G
CD5 – CT 8,70%
Exon 1 (30%)
Exon 2(59,6%)
Intron 1 (1,9%)
Intron 2 (2,9%)
Vùng khởi động (4,3%)
Đột biến khác (1,4%)
Phân bố đột biến gen β -globin theo vị trí
Chức năng gen Số lượng Tỷ lệ %
ĐỘT BIẾN SAO MÃ (Kiểu hình β+ thalassemia) 9 4,3
- Yếu tố điều hòa khởi động
- 28 (A – G)
- 88 (C – T)
ĐỘT BIẾN HOÀN THIỆN RNA(Kiểuhình β0hay β+thal) 10 4,8
- Vị trí đầu kết nối IVS 1-1 (G – T)
IVS 1-5 (G – C)
IVS 2-654 (C – T)
ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β0 thalassemia) 186 89,4-Codon vô nghĩa CD17 (AAG – TAG)
CD26 (GAG – AAG)
CD95 (TAC – TAA)
-Dịch khung CD 41/42 (- TTCT)
CD71/72 (+A)
Đột biến ít gặp khác 3 1,4
Cộng 208 100
Phân bố các đột biến gen β-globin ở theo chức năng gen
Phân bố đột biến theo kiểu genKiểugen
Kiểu phối hợp
đột biến
Sốbệnh nhân
Tỷ lệ%
β0β0
Đồng hợp tửCD41/42 - CD41/42
CD17 - CD17
4017
9
8
38,46
8,7
7,7
Dị hợp tử kép
CD41/42 - CD17
CD17 - CD71/72
CD41/42 - CD71/72
CD41/42 - CD95
CD41/42 - IVS1.5
23
15
3
3
1
1
14,4
2,9
2,9
0,96
0,96
β+β+ Dị hợp tử kép
IVS2.654 - 2,3kb del1
1
0,96
0,96
Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp)
Kiểugen
Kiểu phối hợp
đột biến
Sốbệnh nhân
Tỷ lệ%
β0β+ Đị hợp tử kép-28 - CD17
-28 - CD41/42
-88-CD41/42
CD17 - IVS2.654
CD41/42 - IVS2.654
CD71/72 - IVS2.654
IVS1.1 - IVS2.654
-140 - CD17
CD17- c441.c442 ins A
143
2
2
2
1
1
1
1
1
13,462,9
1,9
1,9
1,9
0,96
0,96
0,96
0,96
0,96
‘
Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp)
Kiểugen
Kiểu phối hợp
đột biến
Sốbệnh nhân
Tỷ lệ%
β0βE Dị hợp tử phối hợp HbECD17 -CD26
CD41/42 - CD26CD71/72 - CD26
IVS1.1 - CD26IVS1.5 - CD26CD95 - CD26
47
21
20
3
1
1
1
45,20
21,2
19,2
2,9
0,96
0,96
0,96
β+βE Dị hợp tử phốihợp HbE-28 - CD26
-88 - CD26
2
1
1
1,920,96
0,96
KẾT LUẬN
• Đã phát hiện 208 alen đột biến ở 104 bệnh nhân, với 13 dạng :
- 4 đột biến phổ biến là CD41/42, CD17, CD26, và
CD71/72 với tỷ lệ 30,3%, 30%, 23,5% và 4,8%;
- 6 đột biến ít phổ biến là :
-28, IVS2-654, -88, CD95, IVS1-1, IVS1-5;
- 3 đột biến hiếm là:
-140, c441-c442 ins AC , và 2,3kb deletion.
• Không khác biệt nhiều về đột biến giữa các dân tộc, chỉ thấy CD26 gặp
nhiều ở người Thái hơn Kinh và Tày. CD41/42 gặp nhiều ở Tày hơn
Kinh
19
Các đột biến gen beta-globin đã phát hiện :
Đặc điểm đột biến gen beta-globin ở Việt Nam :
• Đột biến ở quá trình dịch mã RNA (80,4%) nhiều hơn hoàn thiện RNA
và sao mã; nhiều ở exon (89,6%), ít hơn ở intron và vùng khởi động.
• Đa số đột biến có kiểu hình β0 (68%), βE (23,5%), đột biến β+ ít
• Đã phát hiện 25 kiểu phối hợp đột biến, 5 kiểu phối hợp phổ biến :
CD17-CD26, CD41/42-CD26, CD41/42-CD17, CD41/42-CD41/42,
CD17-CD17. Kiểu gen β0 βE phổ biến nhất (45,3%), tiếp theo β0 β0
(38,4%), β0 β+ (13,4%), β+ βE (1,92%), cuối cùng là β+ β+ (0,96%).
Từ đó có thể kết luận :
Phần lớn β-thalassemia ở Việt Nam là β0-thalassemia
20
Trân trọng cảm ơn