tài liệu bÀi giẢng chỦ nghĨa tƯ bẢn ĐỘc quyỀn

8/16/2019 Tài liệu BÀI GIẢNG CHỦ NGHĨA TƯ BẢN ĐỘC QUYỀN

1/7

258

Chươ ng 10

Đại cương về Công nghệ DNA Tái tổ hợp

Việc tinh chế enzyme cắt giớ i hạn đầu tiên (1970) và sử dụng nó để tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợ p đầu tiên trong ống nghiệm (1972-1973)là nền tảng cho sự ra đờ i của k ỹ thuật di truyề n (genetic engineering) vàcông nghệ DNA tái t ổ hợ p (recombinant DNA technology). Chính sự pháttriển nhanh chóng của l ĩ nh vực này không những đã đưa lại khối lượ ng trithức khổng lồ về cấu trúc và cơ chế hoạt động của các gene, các bộ gene prokaryote và eukaryote mà còn tr ở thành lực lượ ng sản xuất tr ực tiế p của

xã hội: tạo ra hàng loạt các chế phẩm y-sinh học hữu ích từ các tế bào vikhuẩn, nấm men; tạo các giống sinh vật mớ i... góp phần giải quyết nhữngvấn đề thực tiễn đặt ra trong y học và trong công tác chọn tạo giống.

Trong chươ ng này chúng ta sẽ tìm hiểu các đặc tính của enzyme cắtgiớ i hạn, các nguyên lý cơ bản của k ỹ thuật DNA tái tổ hợ p và một số ứngdụng của l ĩ nh vực công nghệ này.

I. Các công cụ chính của k ỹ thuật tạo dòng DNA tái tổ hợ p1. Các enzyme cắ t giớ i hạn

1.1. Enzyme cắt giớ i hạn là gì?

Enzyme cắ t giớ i hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme giớ i hạn (restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợ i DNA bổ sungtại các vị trí đặc thù.

1.2. Vai trò của các enzyme cắt giớ i hạn

Từ 1953 ngườ i ta đã phát hiện thấy r ằng, khi đưa DNA của một nòi vikhuẩn E. coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thườ ng thì DNA đượ cđưa vào, gọi là DNA ngoại lai hay DNA lạ, mất hẳn hoạt tính di truyền và

hầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn. Chỉ trong một số íttr ườ ng hợ p DNA lạ đó mớ i không bị phân cắt và do đó nó có thể tái bảntrong tế bào chủ. Điều đó chứng tỏ DNA lạ đượ c sửa đổi bằng cách nào đódướ i sự kiếm soát của tế bào chủ. Các hiện tượ ng nói trên xảy ra chủ yếukhi các thể thực khuẩn ( phage) xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn.

Cho đến đầu thậ p niên 1970 ngườ i ta mớ i biết rõ r ằng các tế bào vikhuẩn là những hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi vàcác enzyme cắt giớ i hạn. Chúng đều có đối tượ ng nhận biết là các đoạntrình tự của DNA vật chủ và DNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau.Cụ thể, các enzyme sử a đổ i (methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ


2/7

259

bằng cách gắn thêm nhóm methyl (-CH3) ở một số base nhất định trongđ oạn nhận biế t (recognition sequence) hay đ oạn đ ích (target sequence).Hiện tượ ng methyl hoá (methylation) này thườ ng xảy ra đối vớ i adeninevà biến đổi nó thành N-6 methyladenine. Trong khi đó, các enzyme giớ ihạn lại đóng vai trò vô hiệu hoá hoạt tính di truyền của các DNA lạ bằngcách phân cắt ở các vị trí đặc thù chừng nào nó chưa đượ c sửa đổi chogiống vớ i DNA vật chủ. Như vậy, các enzyme giớ i hạn đ óng vai trò làhàng rào bảo vệ t ự nhiên của các vi khuẩ n nhằ m chố ng l ại sự xâm nhậ pcủa các phage l ạ.

1.3. Tính chất chung của các enzyme giớ i hạn

Tr ướ c tiên, cần lưu ý r ằng các enzyme giớ i hạn chỉ phát hiện thấy ở cácvi khuẩn mà không có ở các eukaryote. Vì vậy, tên gọi của các enzymegiớ i hạn thông dụng là tên hệ thống, đượ c biểu thị bằng ba hoặc bốn chữ cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme đượ c chiết xuất. Chữ cái đầutiên đượ c viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cái tiế p theo viết thườ ngđể chỉ loài (species), và khi cần thiết thêm chữ cái thứ tư để chỉ nòi hoặcchủng (strain, type). Ngoài ra, để phân biệt các enzyme cùng một nòingườ i ta dùng số La Mã kèm theo sau tên hệ thống (xem bảng 10.1).

các đoạn DNA nốiở các đầu dính

đầu dính

đầu dính

DNA tái tổ hợp

+ DNA ligase

Hình 10.1 Enzyme giớ i hạn (EcoRI) cắt các DNA khác nhau, nhờ đó có thể kiến tạo phân tử DNA tái tổ hợ p in vitro (bắng enzyme DNA ligase).

Tính chất quan tr ọng nhất của các enzyme giớ i hạn là tính đặc hiệu vị trí , ngh ĩ a là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vị trí xác định. Tuỳ theo vị trí cắt so vớ i đoạn nhận biết mà chia ra hai loại:


3/7

260

loại I bao gồm các enzyme giớ i hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận biếtvà loại II bao gồm các enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết. Ở đây chúng ta chỉ xét các enzyme giớ i hạn loại II vốn đượ c xem là công cụ hiệu năng (giống như con dao mổ tinh vi) cho phép thao tác trên các genetrong k ỹ thuật DNA tái tổ hợ p (hình 10.1).

Đặc tr ưng nổi bật của các đoạn đích là có kích thướ c ngắn, 4-8 cặ p base, và có tính đố i xứ ng xuôi ng ượ c (palindrome).

Nhìn chung, các enzyme giớ i hạn khác nhau có hai kiểu cắt sau đây:cắt lệch và cắt thẳng. Vớ i kiểu cắt lệch tức là các vị trí cắt trên hai sợ i củaDNA sợ i kép là so le, tạo ra các đoạn DNA có các đầu sợ i đơ n gồm một số base bổ sung gọi là các đầu dính (cohesive/sticky ends). Các enzyme giớ ihạn như thế có vai trò to lớ n trong việc kiến tạo DNA tái tổ hợ p in vitro (hình 10.1). Điển hình ở đây là EcoRI và BamHI (bảng 10.1). Vớ i kiểu cắtthẳng, tức cắt cùng vị trí trên cả hai sợ i của DNA sợ i kép, do đó tạo ra cácđoạn DNA có các đầu bằ ng (blunt ends); ví dụ, SmaI...(bảng 10.1).

Các enzyme giớ i hạn khác nhau có đoạn đích giống nhau, mặc dù vị trívà kiểu cắt có thể giống hoặc khác nhau, gọi là các enzyme giớ i hạn t ươ ngứ ng (isoschizomers); ví dụ, SmaI và XmaI (bảng 10.1).

Bảng 10.1 Các trình tự nhận biết và vị trí cắt của các enzyme giớ i hạn đượ cchọn lọc (mũi tên chỉ vị trí cắt; các trình tự ở đây đượ c chỉ ra trên sợ i 5'→3')

Nguồn vi sinh vật Tên enzyme Trình tự nhận biết Arthrobacter luteus AluI AG↓CT Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G↓GATCC Escherichia coli RY13 EcoRI G↓AATTC Haemophilus influenzae Rd HindII GTPy↓PuAC Haemophilus influenzae Rd HindIII A↓AGCTT Nocardia otitidis-caviarum NotI GC↓GGCCGC Providencia stuartii PstI CTGCA↓GSerratia marcescens Sb SmaI CCC↓GGG Xanthomonas malvaccarum XmaI C↓CCGGG

2. Các vector thông d ụng trong k ỹ thuật di truyề n

2.1. DNA tái tổ hợ p là gì?

DNA tái t ổ hợ p (recombinant DNA) là phân tử DNA đượ c tạo ra trongống nghiệm bằng cách k ết hợ p các DNA từ các nguồn (loài) khác nhau,theo một quy trình k ỹ thuật nhất định, gọi là k ỹ thuật tái tổ hợ p DNA.

Thông thườ ng một phân tử DNA tái tổ hợ p bao gồm một phân tử DNAcó bản chất là plasmid hoặc phage nguyên vẹn gọi là vector (thể tải) vàmột đoạn DNA từ nguồn khác mang một gene hoặc yếu tố điều hòa mong


4/7

261

muốn đượ c cho xen vào; nó đượ c gọi là DNA ngoại lai (foreign DNA).2.2. Hai loại vector thông dụng

Vector là phân tử DNA có kích thướ c bé hoặc vừa phải, đóng vai trò làvật trung gian mang truyền đoạn DNA ngoại lai nghiên cứu vào trong tế bào thể nhận (tế bào khả biến) bằng con đườ ng biế n nạ p (transformation)hoặc t ải nạ p (transduction).

Có hai loaị vector thông dụng là các plasmid hoặc các phage. Các plasmid vi khuẩn (hình 10.2) đượ c sử dụng r ộng rãi hơ n cả, bở i vì chúngcó các đặc điểm sau: (i) có khả năng xâm nhậ p vào tế bào vật chủ mà vẫnhoạt động (tái bản, biểu hiện gene) bình thườ ng; (ii) có tr ọng lượ ng phântử thấ p nên dễ dàng tinh chiết; (iii) số bản sao trong mỗi tế bào vi khuẩn

thườ ng khá cao; và (iv) đặc biệt là, một số plasmid có chứa các genekháng thuốc tiện lợ i cho việc theo dõi và phát hiện sự có mặt của plasmidtái tổ hợ p trong vi khuẩn chủ.

các khởi điểm tái bản

Hình 10.2 Các plasmid có chứ a khở i điểm tái bản ( ori), các điểm cắt củamột số retrictase và các gene kháng ampicillin (AmpR ), kanamycin (KanR ).

Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda (λ) có nhiềuưu thế nhất, bở i lẽ ở phần giữa của bộ gene có chứa một số gene khôngquan tr ọng và không liên quan vớ i sự tái bản của nó, nên thuận lợ i choviệc xen đoạn DNA mong muốn vào đây. Các phage không chứa các genekháng thuốc cho nên việc theo dõi phage tái tổ hợ p đượ c xác định dựa vàocác vế t tan d ươ ng tính (positive plaques) trên nền vi khuẩn.

3. Thiế t l ậ p phân t ử DNA tái t ổ hợ p in vitro


5/7

262

3.1. Phươ ng pháp sử dụng các đầu dínhBất k ỳ đoạn DNA nào nếu đượ c cắt bở i cùng một loại enzyme giớ i

hạn (ví dụ, EcoRI ) cho các đầu dính thì có thể dính líp lại vớ i nhau vàđượ c nối bở i DNA ligase (hình 10.3). Phươ ng pháp thành lậ p phân tử DNA tái tổ hợ p kiểu này lần đầu tiên đượ c đưa ra bở i J.Mert và R.Davisnăm 1972 bằng thực nghiệm trên các virus. Và sau đó, lần đầu tiên năm1973, H.Boyer và nhóm nghiên cứu của S.Cohen đã tạo ra đượ c phân tử DNA tái tổ hợ p gồm vector là plasmid nhỏ pSC101 của E. coli và DNA''ngoại lai'' là một plasmid khác. Chính sự kiện này đã đặt nền móng và mở ra triển vọng to lớ n cho k ỹ thuật DNA tái tổ hợ p sau này.

Nối sai Nối sai

DNA sẽ được

xen vào

DNA được cắtvới EcoRI

Các đầu dính

Tái tổ hợp DNA+ DNA ligase

DNAtái tổ hợp

Hình 10.3 Hai phân tử DNA khác nhau đượ c cắt bở i cùng một enzyme giớ ihạn thì có thể nối vớ i nhau nhờ xúc tác cuả DNA ligase.

3.2. Phươ ng pháp nối tr ực tiế p hoặc tổng hợ p các đầu bổ sung

Đối vớ i các đoạn DNA đượ c tạo ra bằng cách xử lý enzyme giớ i hạncắt thẳng như HindII chẳng hạn, thì việc nối các đoạn DNA có đầu bằngđượ c tạo ra có thể thực hiện theo hai cách sau: Nối tr ực tiế p bằng DNAligase của phage T4 hoặc tổng hợ p thêm các đầu dính vào các đầu 3' mộtsố nucleotide bổ sung bằng cách sử dụng các enzyme end transferase, r ồisau đó các đoạn DNA như thế sẽ đượ c nối vớ i nhau bở i DNA ligase của vikhuẩn. Cơ sở của phươ ng pháp k ết hợ p DNA này đượ c thực hiện lần đầutiên giữa DNA của virus SV40 vớ i DNA của phage λ bở i L.Lobban và


6/7

263

D.Kaiser (1972), và D.Jackson và P.Berg (1972)

II. Tạo dòng gene hay DNA tái tổ hợ p

1. Nguyên t ắ c chungVề nguyên tắc, k ỹ thuật DNA tái tổ hợ p hay t ạo dòng (cloning) gồm

các bướ c chung nhất như sau: (1) Tách chiết và tinh sạch DNA thuộc cácnguồn khác nhau (gồm vector và DNA mang gene mong muốn); (2) tạo ra phân tử DNA tái tổ hợ p in vitro; (3) đưa phân tử DNA tái tổ hợ p vào trongtế bào nhận, thườ ng là E. coli hoặc nấm men. Hình 10.4 mô tả một quytrình k ỹ thuật đơ n giản như thế. Tuy nhiên, trên thực tế, sự phức tạ p là ở bướ c (4), phát hiện và phân lậ p các dòng DNA tái tổ hợ p đặc hiệu.

Các đoạn cắt bởi enzyme giới hạn

Tế bào được biến nạp

Plasmidtái tổ hợp

Tế bào chủ E. coli

DNA ngoại lai

Nối các đầu dính

Enz me iới hạn

Biến nạp

Hình 10.4 Một quy trình biến nạp DNA tái tổ hợ p vớ i vector là plasmid,enzyme giớ i hạn EcoRI, enzyme nối - DNA ligase, và tế bào nhận là E. coli.

Trong tế bào chủ, phân tử DNA tái tổ hợ p có thể biểu hiện gene mongmuốn (cho sản phẩm protein) hoặc tái bản độc lậ p nhiều lần để tạo ra hàngloạt bản sao của nó, và khi tế bào chủ phân chia sẽ kéo theo sự t ạo dòng phân t ử (molecular cloning). Mặt khác, do tốc độ phân chia r ất nhanh củacác vi khuẩn nên có thể tạo hàng triệu bản sao mong muốn trong một thờ igian ngắn. Vì thế nhà khoa học có thể tách dòng bất k ỳ một gene nào để


7/7

264

dùng cho nghiên cứu hoặc cho sản xuất trên quy mô công nghiệ p một số lượ ng lớ n các protein vốn là những chế phẩm y-sinh học nào đó.

2. Quy trình t ạo dòng gene tái t ổ hợ pBây giờ ta xét một quy trình k ỹ thuật tạo dòng mà việc phát hiện DNAtái tổ hợ p dựa trên khả năng kháng thuốc do vector plasmid mang lại.

• Bướ c 1: Tinh chiế t DNA

Giả sử đã tinh chiết đượ c plasmid có chứa hai gene kháng ampicillinvà tetracyclin, ký hiệu là AmpR và TetR ; và cũng giả thiết r ằng gene TetR có chứa điểm cắt của EcoRI, và phân tử DNA ngườ i có mang gene insulin.

• Bướ c 2: Kiế n t ạo phân t ử DNA tái t ổ hợ p in vitro

Tr ướ c tiên, dùng enzyme giớ i hạn đầu dính EcoRI (xem bảng 10.1) để cắt vòng plasmid tại giữa gene TetR và cho cắt DNA ngườ i, trong số cácđoạn bị cắt có một đoạn mang gene insulin. Sau đó đem tr ộn lẫn hai loạiDNA trên trong ống nghiệm vớ i DNA ligase. K ết quả là có thể xảy ra batr ườ ng hợ p: (1) Plasmid tự nối lại thành mạch vòng như lúc đầu; (2) ĐoạnDNA tự nối lại thành mạch vòng; và (3) Plasmid tái tổ hợ p có mang geneinsulin, và có thể mang một đoạn DNA không phải gene đó.

• Bướ c 3: Biế n nạ p và phát hiện dòng DNA tái t ổ hợ p chung

Đưa các DNA đượ c xử lý vào các tế bào E. coli. Nếu phân tử có kíchthướ c lớ n ngườ i ta phải xử lý vi khuẩn 'thể nhận' bằng chlorid calcium(CaCl2) để làm cho màng tr ở nên thấm đượ c dễ dàng. Sau đó đem cấyriêng r ẽ các vi khuẩn trên môi tr ườ ng có ampicillin và theo dõi.

+ Nếu có xuất hiện khuẩn lạc (các vi khuẩn trong cùng một khuẩn lạcthì thuộc một dòng vì chúng bắt nguồn từ một vi khuẩn ban đầu), chứng tỏ vi khuẩn có mang gene AmpR , tức là chúng có mang plasmid ban đầu(tr ườ ng hợ p 1) hoặc plasmid tái tổ hợ p (tr ườ ng hợ p 3). Ngượ c lại, nếu chỗ cấy không xuất hiện khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn mang DNA tự nối(tr ườ ng hợ p 2).

+ K ế đó, đem cấy riêng r ẽ các vi khuẩn thu đượ c sang môi tr ườ ng cótetracyclin. Nếu có xuất hiện khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn có mang geneTet

R nguyên vẹn (tr ườ ng hợ p 1). Nếu không có khuẩn lạc, chứng tỏ vi

khuẩn đem cấy có mang DNA tái tổ hợ p (tr ườ ng hợ p 3); vì gene TetR bị bất hoạt do đoạn DNA xen vào. Bằng cách theo dõi như vậy cho phép xácđịnh đượ c dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợ p, nhưng vẫn chưa biết đượ cđâu là các dòng đặc hiệu, ngh ĩ a là có mang gene insulin.

Hình 10.5 dướ i đây mô tả một quy trình đơ n giản về tạo dòng vi khuẩnmang gene insulin ngườ i.

tài liệu bÀi giẢng chỦ nghĨa tƯ bẢn ĐỘc quyỀn

Documents