taxonomia y morfologia tomate de arbol
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tomate de arbolTRANSCRIPT
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADORPONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADORPONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADORPONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR
SEDE IBARRASEDE IBARRASEDE IBARRASEDE IBARRA
PUCEPUCEPUCEPUCE ---- SISISISI
ESCUELA DE CIENCIAS AGRCOLAS Y AMBIENTALESESCUELA DE CIENCIAS AGRCOLAS Y AMBIENTALESESCUELA DE CIENCIAS AGRCOLAS Y AMBIENTALESESCUELA DE CIENCIAS AGRCOLAS Y AMBIENTALES
E.C.A.A.E.C.A.A.E.C.A.A.E.C.A.A.
INFORME FINAL DE TESISINFORME FINAL DE TESISINFORME FINAL DE TESISINFORME FINAL DE TESIS
TTULO: TTULO: TTULO: TTULO:
CARACTERIZACINCARACTERIZACINCARACTERIZACINCARACTERIZACIN MORFOAGRONMICA MORFOAGRONMICA MORFOAGRONMICA MORFOAGRONMICA Y MOLECULAR DY MOLECULAR DY MOLECULAR DY MOLECULAR DE LA E LA E LA E LA
COLECCIN DE TOMATE DE RBOL (COLECCIN DE TOMATE DE RBOL (COLECCIN DE TOMATE DE RBOL (COLECCIN DE TOMATE DE RBOL (CCCCyphomandrayphomandrayphomandrayphomandra betacea betacea betacea betacea SendtSendtSendtSendt) ) ) )
DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL INIAP, DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL INIAP, DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL INIAP, DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL INIAP, ECUADORECUADORECUADORECUADOR
PREVIA OBTENCIN DEL TITULO DE INGENIERAPREVIA OBTENCIN DEL TITULO DE INGENIERAPREVIA OBTENCIN DEL TITULO DE INGENIERAPREVIA OBTENCIN DEL TITULO DE INGENIERA AGROPECUARIAAGROPECUARIAAGROPECUARIAAGROPECUARIA
AUTORAS:AUTORAS:AUTORAS:AUTORAS: CHALAMPUENTE DORIS
PRADO PRISCILA
ASESOR:ASESOR:ASESOR:ASESOR: BIL. GALO PABN
IBARRA IBARRA IBARRA IBARRA ---- 2005200520052005
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2
AUTORIA
Declaramos que la presente investigacin es de total responsabilidad de las
autoras.
Doris Salom Chalampuente Flores Priscila Fernanda Prado Beltrn
C.I. 100261053-1 C.I. 171274322-6
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3
PRESENTACIN
La presente investigacin titulada Caracterizacin morfoagronmica y molecular
de la coleccin de tomate de rbol (Cyphomandra betacea Sendt) del banco de
germoplasma del INIAP est conformada por cinco captulos que se detallan en
los acpites siguientes.
El Captulo I, est conformado por: planteamiento del problema que detalla los
problemas relacionados con el cultivo de tomate de rbol, como la prdida de
variedades puras y la proliferacin de plagas y enfermedades; justificacin se
hace hincapi en la importancia de la caracterizacin morfolgica y molecular
para la identificacin de material promisorio, y la conservacin del germoplasma;
objetivos se plantea estudiar la variabilidad gentica de la coleccin de tomate de
rbol mediante la identificacin de caracteres morfolgicos discriminantes y la
caracterizacin molecular mediante la tcnica RAPDs.
El Captulo II, se detalla toda la revisin bibliogrfica del cultivo de tomate de
rbol, la caracterizacin y evaluacin del germoplasma y la tcnica molecular
RAPDs, obtenida en libros y pginas web.
El Captulo III, est dividido en dos etapas: caracterizacin morfoagronmica
en la que se detalla la ubicacin en campo de la granja de la Unin de
Organizaciones Campesinas e Indgenas de Cotacachi (UNORCAC), materiales y
la metodologa de anlisis multivariado empleado en la evaluacin de los
descriptores en estudio; en la caracterizacin molecular se detalla la ubicacin
del laboratorio de Biotecnologa del Departamento Nacional de Recursos
Fitogenticos y Biotecnologa (DENAREF) del INIAP, as como los protocolos
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4
empleados en la caracterizacin molecular y el anlisis estadstico de los
resultados obtenidos.
En el Captulo IV, se presentan los resultados obtenidos en la caracterizacin
morfoagronmica, y molecular de tomate de rbol, as como la discusin de
estos resultados y la correlacin de las dos fases en estudio.
En el Captulo V, se establecen las conclusiones y recomendaciones a las que se
lleg con el anlisis de los resultados obtenidos, as como la estrecha relacin
gentica entre las accesiones que fueron evaluadas en la presente investigacin.
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DEDICATORIA
A mi Dios por el diario vivir
A mi Papi Hctor y a mi mami Josefina por el apoyo incondicional que me han
brindado durante este tiempo, permitiendo culminar con una etapa ms de mi vida
profesional. Gracias padres por todo su amor.
A mis hermanos Christian, Hctor, Sandra, Daniel, Andrs por su cario y
comprensin.
A mi hermana Lix, Juan y mis sobrinos, gracias por todo.
A mis abuelitos y tos por su apoyo moral y todo su cario.
A todos los quiero mucho.
DORIS
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6
A mi papi, por ser el mentor de lo que ahora soy, por ensearme a soar y a
entender que por el camino ms difcil, siempre se llega a la cumbre.
A mi mamita, por su ternura y entrega, y por darme cada da fuerzas y valor para
salir adelante.
A mis hermanas, por ser mis cmplices, y por todo el apoyo recibido .
A mis sobrinos, por ser la alegara que llena mi corazn
A mis abuelitos por que su apoyo y cario
Al ti Wilito, por estar siempre a mi lado, y por todos los momentos compartidos
Priscila
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AGRADECIMIENTO
A la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador Sede Ibarra, y en especial a la
Escuela de Ciencias Agrcolas y Ambientales por abrirnos sus puertas durante los
aos de carrera estudiantil, y a los docentes por habernos impartido los
conocimientos que nos formaron como profesionales.
Al Instituto Nacional Autnomo de Investigaciones Agropecuarias en las personas
Ing. Victor Hugo Cardoso Director General, Dr. Julio Delgado Director de
Investigaciones. A la Estacin Experimental Santa Catalina en la persona del
Ing. Luis Fernando Rodrguez Director de la Estacin.
Al Departamento Nacional de Recursos Fitogenticos y Biotecnologa del INIAP, y
en especial a su Lder M.Sc. Csar Tapia por habernos dado la apertura para
realizar la presente investigacin, por la confianza depositada en nuestro trabajo y
la amistad brindada; a la Bil. Gabriela Piedra por brindarnos sus conocimientos
desinteresadamente, por su apoyo y amistad incondicional, gracias madre; y a
todo el personal que forma parte del DENAREF que de una u otra manera
contribuyeron con la culminacin de esta investigacin.
Al Bil. Galo Pabn por la amistad, el apoyo y por aportar con sus conocimientos
en el desarrollo de esta tesis.
Al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos USDA y en especial a Dr.
David Willams y la Dra. Karen Willams; a la Secretara del Programa de Apoyo
Alimentario PL-480 por el financiamiento recibido para el desarrollo de la presente
investigacin.
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8
Al IPGRI por la asistencia tcnica.
A nuestros queridos compaeros y amigos de la promocin 2000 B con quienes
compartimos muchos momentos agradables, y que los llevaremos siempre en
nuestros corazones.
A todas las personas que de una u otra manera colaboraron con la culminacin de
esta investigacin.
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9
RESUMEN
Los recursos fitogenticos se conservan para ser utilizados y ello solo es posible
si se conocen sus caractersticas y posibles usos. La informacin que permiti
conocer el germoplasma de tomate de rbol (Cyphomandra betacea Sendt) se
obtuvo a partir de la caracterizacin y evaluacin de 37 accesiones colectadas en
provincias del norte, centro y sur del Ecuador, para lo que se utiliz 48
descriptores morfoagronmicos (21 cuantitativo y 27 cualitativos). Con el paquete
estadstico SAS (Sistema de Anlisis Estadstico) se determin la similitud
gentica en base a descriptores morfolgicos, y con el algoritmo de Gower se
calcul una matriz de distancias genticas, que analizadas con el agrupamiento
jerrquico de Ward gener un fenograma que revel tres grupos principales de
accesiones, con una estrecha relacin gentica. Los descriptores cualitativos que
aportaron a la discriminacin entre grupos fueron: color de la lmina foliar, color
de las nervaduras, color de los brotes apicales, color primario de la epidermis del
fruto, color del muclago adherido a la semilla y color de la semilla; los
descriptores cuantitativos de alto poder discriminante estn relacionados con el
tamao del fruto; estos descriptores permitieron identificar siete morfotipos dentro
de la coleccin de tomate de rbol. Por otro lado, para la caracterizacin
molecular se empleo la tcnica RAPDs (Polimorfismos de ADN Amplificados al
Azar), mediante la cual se evalu 37 polimorfismos que utilizando el coeficiente de
Jaccard se calcul la matriz de similitud para las accesiones; las relaciones
genticas de las 37 accesiones estudiadas fueron evaluadas en un dendrograma,
en el que no se observ un agrupamiento definido de las accesiones debido a que
el nmero de polimorfismos evaluados no fue el adecuado para esta especie. El
resultado de la correlacin entre datos morfoagronmicos y moleculares no fue
significativo en el presente estudio, lo que quiere decir que la relacin gentica
entre entradas de la coleccin es estrecha, siendo necesario el uso de otras
tcnicas moleculares que permitan detectar esta baja variabilidad; por lo que el
estudio de la variabilidad de C. betacea se gener nicamente de los datos
obtenidos en la caracterizacin morfoagronmica. Se identific posibles
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10
materiales promisorios con caractersticas deseables de produccin y tolerancia a
plagas y enfermedades, con los que se podr iniciar programas de
fitomejoramiento.
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11
ABSTRACT
The plant genetic resources are preserved to be used afterwards. It is possible
only if their characteristics and potential applications are known. The information
that allowed us to know the germplasm of tree tomato (Cyphomandra betacea
Sendt) was obtained from the characterization and evaluation of 37 accessions
collected in central, north and south provinces of the country. To carry out this
investigation, it was used 48 morphoagronomical descriptors (21 quantitative and
27 qualitative). The genetic similarity was determined using the statistical package
SAS (System of Statistical Analysis) based on morphologic descriptors, besides, a
genetic distances matrix was calculated using the algorithm of Gower. They were
analyzed using the Ward method of clustering and generated a phenogram that
revealed three main groups of accessions that have a close genetic relation. The
qualitative descriptors that contributed to the discrimination among groups were:
foliar sheet colour, veins colour, apical buds colour, primary colour of the
epidermis of the fruit, mucilage adhered to the seed colour and seed colour; the
quantitative descriptors of high discriminant reference are related to the size of the
fruit. These descriptors permitted to identify seven morphotypes inside the
collection tree tomato. On the other hand, to carry out the molecular
characterization it was used the RAPDs (Random Amplified Polymorphisms of
DNA) technique, by means of which was evaluated 37 polymorphisms that using
the coefficient of Jaccard, the matrix of similarity for the accessions was
calculated. The genetic relations of the 37 accessions involved in the investigation
were evaluated in a phenogram, where it was not observed a defined grouping of
the accessions due to the number of Polymorphisms evaluated was not the
adequate for this species. The result of the correlation between
morphoagronomical and molecular data was not significant in the current
investigation. It means that the genetic relation among entrances of the collection
is close, being necessary the use of molecular techniques that detect this low
variability. Therefore, the variability of C. betacea investigation was generated
only based on the data obtained since the morphoagronomic characterization. It
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was identified possible promising germplasm with desirable characteristics of
production and resistance to plagues and illnesses, which will be helpful to initiate
programs of plant improvement.
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PORTADA 1
PRESENTACIN 3
DEDICATORIA 5
AGRADECIMIENTO 7
RESUMEN 9
ABSTRACT 11
INDICE 13
CAPITULO I INTRODUCCIN 19
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 19
1.2 JUSTIFICACION 21
1.3 OBJETIVOS 23
1.3.1 OBJETIVO GENERAL 23
1.3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 23
1.4 HIPTESIS 24
CAPITULO II MARCO TEORICO 25
2.1 TOMATE DE RBOL 25
2.1.1 ORIGEN, TAXONOMIA E IMPORTACIA DEL CULTIVO 25
2.1.2 DESCRIPCIN BOTANICA Y FENOLGICA 27
2.1.2.1 Tallo 27
2.1.2.2 Hojas 28
2.1.2.3 Flores 28
2.1.2.4 Fruto 28
2.1.2.5 Semillas 29
2.1.2.6 Descripcin fenolgica 29
2.1.3 AGRONOMA 30
2.1.3.1 Condiciones Agro Ecolgicas 30
2.1.3.2 Requerimientos edficos 30
2.1.3.3 Tcnicas del cultivo 31
2.1.3.4 Cosecha 33
2.1.3.5 Plagas y Enfermedades 34
2.1.4 USOS Y COMPOSICIN NUTRICIONAL 34
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14
2.1.4.1 Usos 34
2.1.4.2 Composicin Nutricional 34
2.1.5 RECURSOS GENTICOS 36
2.2 CARACTERIZACIN Y EVALUACIN DEL GERMOPLASMA 37
2.2.1 MTODOS DE CARACTERIZACIN MORFOLGICA Y EVALUACIN
AGRONMICA 38
2.2.2 MTODOS MOLECULARES 39
2.2.2.1 Reaccin en cadena de la polimerasa 40
2.2.2.2 Polimorfismos del ADN Amplificados al Azar RAPDs 42
2.3 RELACIN ENTRE LA CARACTERIZACIN MORFOLGICA
Y MOLECULAR 46
CAPITULO III MATERIALES Y METODOS 48
3.1 MATERIALES 48
3.1.1 DE CAMPO 48
3.1.1.1 Insumos 48
3.1.1.2 Herramientas 48
3.1.1.3 Recursos Humanos 49
3.1.1.4 Material de Oficina 49
3.1.2 DE LABORATORIO 49
3.1.2.1 Materiales de laboratorio 49
3.1.2.2 Reactivos 50
3.2 METODOS 50
3.2.1 UBICACIN 51
3.2.2 CARACTERSTICAS AGROCLIMTICAS 52
3.2.3 DESCRIPCIN DE LA INVESTIGACIN 52
3.2.3.1 Caracterizacin Morfolgica y Evaluacin Agronmica 52
3.2.3.2 Anlisis Estadstico para la Evaluacin en Campo 54
3.2.3.3 Caracterizacin Molecular 56
3.2.3.4 Anlisis Estadstico para datos Moleculares 59
3.2.3.5 Relacin de datos Morfolgicos y Moleculares 61
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15
CAPTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIN 63
4.1 RESULTADOS 63
4.1.1 DATOS PASAPORTE 63
4.1.1.1 Provincia de Coleccin 63
4.1.1.2 Altitud 63
4.1.2 CARACTERIZACIN MORFOAGRONMICA 63
4.1.2.1 Variabilidad Morfolgica 64
4.1.2.2 Agrupamiento de las Entradas 65
4.1.2.3 Valor discriminante de los Caracteres 65
4.1.2.4 Anlisis de los caracteres Cualitativos discriminantes
para los Grupos 67
4.1.2.5 Estructura de los Agrupamientos 70
4.1.2.6 Anlisis de la ubicacin Espacial 72
4.1.2.7 Anlisis de los Agrupamientos 72
4.1.2.8 Descriptores Morfolgicos y Agronmicos 77
4.1.3 CARACTERIZACIN MOLECULAR 94
4.1.3.1 Extraccin de ADN 94
4.1.3.2 Productos de Amplificacin 94
4.1.3.3 Anlisis de Agrupamiento 95
4.1.4 CORRELACION ENTRE MARCADORES MORFOLOGICOS Y MOLECULARES 95
4.1.5 IDENTIFICACION DE MATERIAL PROMISORIO 96
4.2 CONSIDERACIONES FINALES 97
5. CAPITULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 101
5.1 CONCLUSIONES 101
5.2 RECOMENDACIONES 103
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16
Lista de Tablas
Tabla 1 Parmetros usados para la estimacin de la variabilidad gentica de la coleccin de tomate de rbol (C. betacea) del DENAREF INIAP
110
Tabla 2
Distribucin de las 37 entradas de Cyphomandra betaacea porr grupos, segn el anlisis de agrupamiento jerrquico de Ward, evaluados en la granja de la UNORCAC, Cotacachi Ecuador, 2004
111
Tabla 3 Parmetros usados para la estimacin del valor discriminante en caracteres cualitativos para la coleccin ecuatoriana del tomate de rbol (Cyphomandra betacea) del DENAREF-INIAP
112
Tabla 4 Valores promedio para caracteres cuantitativos de los grupos definidos del anlisis del agrupamiento de Ward en la coleccin de tomate de rbol del DENAREF INIAP
113
Tabla 5 Valor promedio y desviacin estndar para caracteres cuantitativos de mayor valor discriminante para la coleccin de tomate de rbol (Cyphomandra betacea)
114
Tabla 6 Frecuencias de los grupos de accesiones de la coleccin de tomate de rbol (Cyphomandra betacea Sent), segn el estado de los caracteres cualitativos.
115
Tabla 7 Morfotipos identificados en la coleccin (Cyphomandra betacea Sendt) 118
Tabla 8 Rendimiento del ADN genmico de tomate de rbol 110
Tabla 9 Primers y fragmentos RAPDs evaluados en la coleccin de C.
betacea 120
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17
Lista de Figuras
Figura 1 Croquis del ensayo 111
Figura 2 Flujograma del anlisis estadstico para los datos morfoagronmicos la coleccin de C. betacea 112
Figura 3 Distribucin geogrfica de las accesiones de la coleccin de tomate de rbol 123
Figura 4 Agrupamiento jerrquico de WArd de la coleccin de tomate de rbol, segn datos morfoagronmicos 124
Figura 5 Dendrograma de 16 entradas de C. betacea en el agrupamiento 1
125
Figura 6 Dendrograma de 13 entradas de C. betacea en el agrupamiento 2 126
Figura 7 Dendrograma de 8 entradas de C. betacea en el agrupamiento 3
127
Figura 8 Distribucin de las accesiones de C. betacea de Ubicacin espacial y las distancias de Mahalanovis entre grupos.
128
Figura 9 Cuantificacin de ADN genmico 129
Figura 10 Patrones RAPDs observados para la coleccin de C. betacea del INIAP.
130
Figura 11 Dendrograma de la coleccin de tomate de rbol basado en polimorfismos RAPDs 131
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18
Lista de Anexos
Anexo 1 Datos pasaporte de la coleccin de tomate de rbol 131
Anexo 2 Lista descriptores utilizados para la caracterizacin morfoagronmica para tomate de rbol 134
Anexo 3 Matriz de similitud generada de los datos morfolgicos 144
Anexo 4 Matriz de similitud generada a partir de datos moleculares 145
Anexo 5 Base de datos de los descriptores morfolgicos y agronmicos
146
Anexo 6 Caracteres cualitativos discrimininantes para los subgrupo del Grupo 1 148
Anexo 7 Caracteres cualitativos discriminantes para los subgrupo del Grupo 149
Anexo 8 Caracteres cualitativos discriminante para los subgrupos del Grupo 150
Anexo 9 Caracteres cuantitativos discriminantes para los subgrupos del Grupo 1 151
Anexo 10
Caracteres cuantitativos discriminantes para los subgrupos del Grupo 2
152
Anexo 11 Caracteres cuantitativos discriminantes para los subgrupos del Grupo 3. 153
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19
CAPITULO I
INTRODUCCIN
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En el Ecuador se estima una produccin de 4 062 has del cultivo de tomate de
rbol, de las cuales 3 920 has se encuentran en la sierra, distribuidas entre las
provincias de Azuay, Bolvar, Carchi, Cotopaxi, Imbabura, Loja, Pichincha y
Tungurahua (INEC, 2003). Estas reas de produccin se han establecido debido
a la gran demanda del frutal a nivel nacional, sin embargo los niveles de
produccin se han visto afectados por la proliferacin de plagas y enfermedades
incrementando los costos de produccin y disminuyendo la calidad del fruto,
reduciendo de dos a tres aos la vida til del cultivo.
Albornoz (1992), en observaciones de frutos recolectados en el callejn
interandino determin que en el Ecuador no existen variedades puras,
clasificndolas en cinco grupos bsicos de acuerdo a sus caractersticas, estas
son: amarillo, criollo redondo, criollo puntn, negro o prpura y rojo o mora. En la
actualidad el cultivo se caracteriza por la gran heterogeneidad en colores, formas
y tamaos de frutos en todos los huertos y dentro de una misma plantacin,
fenmeno derivado de constantes hibridaciones y mezclas de material gentico
producidas a lo largo del tiempo, generado la prdida de variedades puras.
La investigacin cientfica en muchos frutales andinos, entre ellos el tomate de
rbol, esta iniciando y pese al trabajo constante de instituciones y centros de
investigacin nacionales, es muy poco el conocimiento que se posee sobre estos
frutales, por lo que es necesario disear una estrategia de uso y conservacin de
estos recursos fitogenticos. En el caso del tomate de rbol, se han logrado
avances en cuanto a mejora gentica, enfocada mayormente hacia la produccin
-
20
o la calidad del fruto, sin embargo no hay estudios de los caracteres vegetativos,
lo mismo que en aspectos relacionados con respuesta a plagas y enfermedades,
estrs ambiental abitico y vida post-cosecha.
-
21
1.2 JUSTIFICACIN
El fenmeno de erosin gentica, es la constante de un sin nmero de cultivos
que constituyen la base alimentaria en muchas comunidades. Es as que la
prdida de estos recursos fitogenticos o germoplasma vegetal representa una
seria amenaza a la seguridad alimentaria, por lo que es deber de la comunidad
cientfica generar investigaciones que propongan su uso en la agricultura e
industria.
La caracterizacin morfolgica tiene como finalidad proteger los recursos
genticos que generalmente se pierden por mal manejo en el cultivo ya sea por el
reemplazo de variedades originarias de una regin por variedades mejoradas, o
por destruccin de la vegetacin montaosa (Albornoz, 19992).
Mediante la caracterizacin y evaluacin del germoplasma de tomate de rbol se
pretende establecer analogas y diferencias entre accesiones, e identificar el
material promisorio que ser de gran utilidad al momento de definir estrategias de
manejo del cultivo, como base para la solucin de un elevado nmero de
problemas agronmicos, relacionados con produccin, adaptabilidad, patologa y
entomologa de este cultivos. Adems se generar informacin cientfica desde el
punto de vista botnico y molecular aportando con conocimientos tiles para
fitomejoradores, promotores campesinos y agricultores conservacionistas que
permitan el ptimo aprovechamiento de estos recursos.
Por otro lado, la identificacin de los centros de variabilidad de Cyphomandra
betacea Sendt en el Ecuador, permitir establecer estrategias para la
conservacin y uso racional del germoplasma de esta especie, reduciendo de
esta manera la erosin gentica.
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22
El Departamento Nacional de Recursos Fitogenticos y Biotecnologa
(DENAREF) del Instituto Nacional Autnomo de Investigaciones Agropecuarias
(INIAP), dispone de una coleccin de 37 entradas de tomate de rbol
(Cyphomandra betacea Sendt) colectadas en la Sierra ecuatoriana, la que fue
caracterizada morfolgica y molecularmente. Los resultados obtenidos en la
presente investigacin permitirn ampliar los conocimientos de la variacin
gentica que se ha venido dando en los ltimos aos.
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23
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 OBJETIVO GENERAL
Estudiar la variabilidad gentica de la coleccin de tomate de rbol
(Cyphomandra betacea Sendt) del banco de germoplasma de DENAREF -
INIAP, mediante la caracterizacin morfolgica y molecular, y evaluacin
agronmica preliminar.
1.3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Caracterizar morfoagronmicamente 37 entradas de tomate de rbol
(Cyphomandra betacea Sendt), mediante el empleo de descriptores
morfolgicos y agronmicos.
Determinar los caracteres cuantitativos y cualitativos de alto poder
discriminante, que permitan identificar relaciones genticas entre grupos y
entradas de la coleccin.
Caracterizar molecularmente 37 accesiones de la coleccin de tomate de
rbol del INIAP, mediante la tcnica RAPDs (Random Amplified
Polymorphic DNA).
Determinar correlaciones entre caracteres morfolgicos y moleculares
utilizando tcnicas de anlisis multivariado.
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24
Identificar y seleccionar materiales promisorios en base a criterios de
tolerancia a plagas y enfermedades y produccin.
1.4 HIPTESIS
Las entradas de la coleccin nacional de tomate de rbol de la Estacin
Experimental Santa Catalina-INIAP presentan variabilidad gentica.
Los descriptores agromorfolgicos empleados permiten identificar diferenciar
genticas entre los materiales en estudio.
Entre los materiales de la coleccin nacional de tomate de rbol existen
materiales promisorios relacionados en aspectos de calidad, produccin y
resistencia a plagas y enfermedades que puedan ser utilizados en planes de
fitomejoramiento.
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25
CAPITULO II
MARCO TERICO
2.1 TOMATE DE RBOL
A continuacin se detalla la revisin bibliogrfica del tomate de rbol, describiendo
su origen, taxonoma y los aspectos agronmicos de importancia para el
desarrollo de este cultivo.
2.1.1 ORIGEN, TAXONOMA E IMPORTANCIA DEL CULTIVO
El gnero Cyphomandra, al cual pertenece el tomate de rbol, abarca entre 25 y
50 especies originarias de Amrica tropical, en latitudes que van desde los 20 N
hasta los 30 S, encontrndose dispersas en Amrica del Sur (Garca et al, 2002
citado por Len et al, 2004).
Hasta hace pocos aos, muchos autores mantenan que el tomate de rbol era
nativo de la regin andina, principalmente de la vertiente oriental de Ecuador y
Per, sin embargo de acuerdo a evidencias moleculares, estudios morfolgicos y
datos de campo, el tomate de rbol est estrechamente relacionado con un
complejo de materiales silvestres bolivianos, por lo que se cree que las
variedades cultivadas se originaron en esa regin (Bohs y Nelson, 1999, citado
por Len et al, 2004).
El tomate de rbol es un cultivar autctono ecuatoriano, puesto que existen
variedades propias, seleccionadas y domesticadas por los pobladores
aborgenes, colonos y agricultores, a partir de las especies silvestres que an se
conservan entre la vegetacin montaosa subtropical y de altura (Albornoz, 1992).
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26
El tomate de rbol (Cyphomandra betacea Sendt), posee la siguiente estructura
taxonmica (Feicn et al, 1999; Len et al, 2004).
REINO: Plantae (Vegetal)
DIVISIN: Magnoliphyta (Angiospermas)
CLASE: Magnoliopsida (Dicotiledneas)
ORDEN: Solanales
FAMILIA: Solanaceae
GENERO: Cyphomandra
ESPECIE: Cyphomandra betacea Sendt
Se le conoce popularmente con el nombre de "tomate de rbol" aunque recibe
otros nombres comunes tales como: "tomate cimarrn, tomate extranjero,
granadilla y contragallinazo" en Centroamrica; " berenjena y tomate de palo" en
Mxico; "tomate de monte, tomate silvestre, pepino de monte, gallinazo panga y
tamarillo" en Colombia y Per; "chilto, sima, tomate de lima" en Bolivia; "tomate
chimango, tomateiro da serra" en Brasil; y en Nueva Zelanda pas donde ha sido
introducido alrededor del ao 1970, se la design como "Tamarillo" (www.sica.
gov.ec/agronegocios/Biblioteca/Convenio%20MAG%20IICA/productos/tomatearbo
l_mag.pdf).
El cultivo del tomate de rbol es antiguo en el Ecuador principalmente en zonas
como Patate y Baos, a pesar de que se cultiva en toda la serrana ecuatoriana.
Desde hace 15 aos se ha incrementado la demanda interna, extendindose
comercialmente a otras zonas de produccin principalmente en los valles
interandinos temperados, en donde se cultivan alrededor de 5 000 has, con
rendimientos que oscilan entre 60 80 t/ha/ao. La variedad ms difundida es la
tradicional anaranjada, habindose introducido ltimamente el tomate mora, de
color morado y pulpa ms rojiza, pero de palatabilidad inferior (www.ibiologia.
unam.mx/jardin/gela/page2.html).
-
27
Este cultivo es altamente productivo, ya que ha dado sustento y desarrollo
econmico a agricultores, que en pequeas extensiones de terreno (0.5-1 ha) han
logrado incrementar sus ingresos y mejorar sus condiciones de vida (www.sica.
gov.ec/agronegocios/productos%20para%20invertir/frutas/tomate%20arbol/princip
al.htm).
El tomate de rbol tiene excelentes cualidades nutritivas y medicinales que han
sido poco difundidas. Es considerado dentro de la medicina natural como una de
las frutas que fortalecen el cerebro, y contribuye a curar migraas y cefaleas
severas (www.ibiologia.unam.mx/jardin/gela/page2.html).
2.1.2 DESCRIPCIN BOTNICA Y FENOLGICA
Las caractersticas botnicas de C. betacea y su fenologa se detalla a
continuacin.
2.1.2.1 Tallo
El tallo inicialmente es suculento para luego tornarse leoso a medida que se
desarrolla y ramifica (tres ramas principales), lo que ocurre cuando alcanza una
altura entre 1 y 2 metros dependiendo del genotipo de la planta, el clima y
fertilidad del suelo (http://www.sica.gov.ec/agronegocios/productos%20para %20
invertir/frutas/tomate%20arbol/epftomarbol.pdf), sin embargo esta forma de
desarrollo puede variar con podas de formacin (Snchez et al, 1996).
-
28
2.1.2.2 Hojas
La hoja es de insercin alterna y caducifolia, tiene cierto aroma a almizcle y forma
ms o menos acorazonada, en la base, y ovalada con punta en el pice. Su rango
de tamao est entre 10 a 30 cm de largo, y de 4 a 12 cm de ancho (http://
www.sica.gov.ec/agronegocios/productos%20para%20invertir/frutas/tomate%20ar
bol/epftomarbol.pdf). Son de color verde oscuro o brillante, la nervadura central y
laterales son prominentes (Feicn et al, 1999).
2.1.2.3 Flores
Son fragantes y estn distribuidas en pequeos racimos axilares, supra axilares o
en cimas escorpioides. Tienen color blanco o rosado con cinco ptalos largos
unidos por la base. El cliz se forma de una base semejante a una campana de
cinco dientes agudos (Feicn et al, 1999). Son por lo regular autgamas, es decir
de auto polinizacin, existiendo tambin la posibilidad de polinizacin cruzada por
factores como el viento y la presencia de insectos. Las flores no polinizadas
tienden a caer prematuramente (http://www.sica.gov.ec/agronegocios/productos
%20para%20invertir/frutas/tomate%20arbol/epftomarbol.pdf).
2.1.2.4 Fruto
Son largos y colgantes nacen solos o en racimos en nmero de tres a 12 frutos. El
rango de tamao oscila entre 5 a 10 cm de largo y de 3.8 a 5 cm de ancho.
Tienen forma elipsoidal u ovoide ms o menos alargada. El color de la pulpa o
carne del fruto vara en un rango que va desde anaranjado claro a oscuro, tiene
contextura firme, suculenta y muy agradable al paladar, se presenta rodeando las
dos bandas de semillas insertas longitudinalmente (http://www.sica.gov.ec/
agronegocios/productos%20para%20invertir/frutas/tomate%20arbol/epftomarbol.p
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29
df). La cscara o piel del fruto es dura y desagradable al gusto, de colores
anaranjado y morado (Snchez et al, 1996).
2.1.2.5 Semillas
Las semillas de naturaleza comestible son delgadas, casi planas y circulares, ms
largas y duras que las del tomate rin y se encuentran rodeadas de la pulpa
(Feicn et al, 1999).
2.1.2.6 Descripcin Fenolgica
No se encuentran reportadas investigaciones que permitan conocer las fases de
crecimiento de esta planta, por esta razn se dispone de descripciones
fenolgicas muy ambiguas y son el resultado de observaciones de campo e
informacin proporcionada por campesinos (Albornoz, 1992).
La propagacin ms frecuente es por semilla, sin embargo tambin puede
hacerse por esquejes. La planta tiene un tiempo de vida aproximado de tres a
cuatro aos y la floracin inicia de ocho a diez meses despus de la siembra
(Feicn et al, 1999).
El perodo de floracin comienza simultneamente con la ramificacin del tallo
principal donde aparece la primera inflorescencia y las siguientes en el extremo
de las ramas, la floracin es continua y el nmero de inflorescencias est en
relacin directa con la ramificacin de la planta (Albornoz, 1992).
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30
La planta es perennifolia y la emisin de hojas es continua, sin embargo estas
caen sucesivamente quedando el tallo principal y la parte inferior de las ramas
desprovistas de follaje (Feicn et al, 1999).
2.1.3 AGRONOMA
Las condiciones agro ecolgicas y edficas ptimas para el desarrollo del cultivo,
de tomate de rbol se detallan a continuacin (www.ibiologia.unam.mx/jardin/
gelapage2.html).
2.1.3.1 Condiciones Agro Ecolgicas
Clima: Templado seco y sub-clido hmedo
Temperatura: 13 C 24 C
Humedad: 70% - 80%
Pluviosidad: 600 1500 mm
Altitud: 1800 2800 m.s.n.m.
Formacin ecolgica: Bosque hmedo montano bajo (bh-MB)
Bosque seco montano bajo (bs-MB)
2.1.3.2 Requerimientos Edficos
Textura: Francos, franco arenosos, sueltos, con buen drenaje y
aireacin
Acidez: pH 6.5 7.0
Tipo de suelo: Ricos en materia orgnica
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2.1.3.3 Tcnicas del Cultivo
Los aspectos tcnicos que deben tomarse en consideracin para el cultivo del
tomate de rbol son:
A) Almcigo
Las semillas extradas de frutos maduros se dejan secar de 10 a 15 das al
ambiente y luego se colocan en un almcigo, con un sustrato compuesto por una
parte de tierra cultivable, una de arena y una parte de materia orgnica (Feicn et
al, 1999)
B) Repique y Transplante
La germinacin tarda alrededor de 30 das y cuando las plantas tienen de 15 a 20
cm de alto (3 4 hojas) se realiza el repique, es decir el transplante de plntulas
del almcigo a fundas. Despus de 60 das se transplanta al terreno definitivo
(Feicn et al, 1999).
C) Preparacin del Terreno
Se realiza una arada y cruzada para hacer un volteado del suelo, debe hacerse
con pasadas de 30 a 40 cm de profundidad, e incorporar materia orgnica para
incrementar la microflora y micro fauna del suelo (Albornoz, 1992).
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D) Trazado y Plantacin
Segn Feicn et al (1999), las distancias de siembra ms usadas son: 2,50 m x
1,50 m (2600 plantas por ha), 2 m x 2 m (2500 plantas por ha) 1,8 m x 1,8 m
(3600 plantas por ha).
Los hoyos deben tener un tamao de 0,40 x 0,40 x 0,40 m de ancho, largo y
profundidad respectivamente. Si la siembra se realiza por surcos, la planta debe
ser colocada en la parte alta para evitar el encharcamiento de sta cuando se
efecten los riegos o se presenten precipitaciones fuertes que provoquen
inundacin en el terreno (www.sica.gov.ec/agronegocios/Biblioteca/Convenio%
20MAG%20IICA/productos/tomate_arbol_mag.pdf).
E) Fertilizacin
Segn Feicn et al (1999), la fertilizacin se realiza de acuerdo al nivel de
nutrientes disponibles en el suelo y debe ser permanente durante el ciclo de
cultivo, se recomienda los valores en kg/ha/ao que se detallan en el Cuadro 2.1.
Cuadro 2.1 Requerimientos nutricionales del tomate de rbol de
acuerdo al contenido de nutrientes del suelo .
NIVEL N P2O5 K2O MgO
BAJO 710 780 280 330 1180 1280 130 150
MEDIO 630 710 230 280 1110 1180 110 130
ALTO 590 630 170 230 1170 1110 90 110
Fuente: INIAP BULLCAY, 1998
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F) Riegos
El cultivo de tomate de rbol requiere una precipitacin anual entre 600 y 1 500
mm distribuidos durante todo el ao. En pocas secas es necesario regar la
plantacin para mantener un nivel adecuado de humedad en el suelo y de
contenido de agua en las plantas, que permitir tener un desarrollo vegetativo
normal, buena produccin y cosechas de calidad (Feicn et al, 1999).
G) Podas
Para las podas de formacin se recomienda conservar de tres a cuatro ramas
principales, en el transcurso del crecimiento se deben eliminar brotes o chupones
que aparecen sobre el tallo principal (www.ibiologia.unam.mx/jardin/gela/page2
.html). Se realizan tambin podas fitosanitarias para eliminar peridicamente las
ramas daadas, enfermas o afectadas mecnicamente, especialmente por la
influencia del viento (Feicn et al, 1999).
2.1.3.4 Cosecha
Segn la variedad, el tomate de rbol se cosecha cuando est amarillo con visos
rojos y textura firme (www.ibiologia.unam.mx/jardin/gela/page2.html). La cosecha
es manual y se debe dejar el pednculo inserto en el fruto para evitar excesiva
deshidratacin, el ingreso de hongos en la base y para dar una agradable
presentacin al exhibirlo. Generalmente, dependiendo de la cantidad de frutos
maduros y de la extensin a cosechar, se realizan cosechas cada 10 a 15 das
(http://www.sica.gov.ec/agronegocios/productos%20para%20invertir/frutas/tomate
%20arbol/epftomarbol.pdf).
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2.1.3.5 Plagas y Enfermedades
Segn Len et al (2004) las enfermedades ms comunes que afectan a este
cultivo son: antracnosis de la fruta (Colletotrichum gloesporoides), oidio (Oidium
spp.), virus (Virus Y de la papa, virus de la mancha anular del tomate y virus del
mosaico de la alfalfa), que atacan ramas, hojas y frutos. Las plagas ms
importantes son fidos (Myzus sp.), chinches (Leptoglosus zanatus) y nemtodos
de la raz (Meloidogyne incognita).
2.1.4 USOS Y COMPOSICIN NUTRICIONAL
Las caractersticas nutricionales y los usos que se dan al tomate de rbol se
detallan a continuacin.
2.1.4.1 Usos
Se sirve fresco sin emplear la corteza, y se utiliza para la preparacin de jaleas,
jugos, helados, dulces, mermeladas y ensaladas. Industrialmente se han
fabricado mermeladas, nctares, jugos turbios, y conservas con resultados muy
satisfactorios. Se observa un rendimiento de 83 a 86% en pulpa, en comparacin
a otras frutas como la tuna, el mango y el meln que ofrecen rendimientos de
45%, 64% y 59% respectivamente (http://www.sica.gov.ec/agronegocios
/productos%20para%20invertir/frutas/tomate%20arbol/epftomarbol.pdf).
2.1.4.2 Composicin Nutricional
El tomate de rbol tiene gran contenido de agua, siendo un fruto de moderado
valor calrico a expensas de su aporte de hidratos de carbono. Destaca su
contenido de provitamina A o beta caroteno. La vitamina A es esencial para la
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visin, el buen estado de la piel, el cabello, las mucosas, los huesos y para el
buen funcionamiento del sistema inmunolgico. Contiene adems vitamina C que
interviene en la formacin de colgeno, huesos y dientes, glbulos rojos y
favorece la absorcin del hierro de los alimentos y la resistencia a las infecciones;
ambas vitaminas (A y C), cumplen una funcin antioxidante. En menor proporcin
contiene otras vitaminas del grupo B, como la B6 o piridoxina, necesarias para el
buen funcionamiento del sistema nervioso. Su contenido de fibra (soluble, pectina)
es alto mejorando el trnsito intestinal (www.frutas.consumer.es/documentos/
tropicales/tamarillo/intro.php).
El tomate de rbol tiene buenas cualidades fsicas, nutritivas y organolpticas,
pese a sus caractersticas alimenticias sobresalientes no se da la importancia que
merece dentro de la alimentacin humana (Feicn et al, 1999). La composicin
nutricional de 100 g de pulpa de tomate de se detalla en el Cuadro 2.2.
Cuadro 2.2 Composicin nutricional del tomate de rbol en 100 g de pulpa
COMPONENTES CONTENIDO
Acidez Brix Caloras pH Humedad (%) Carbohidratos (g) Ceniza (g) Fibra (g) Protena (g) Caroteno (IU) Calcio (mg) Fsforo (mg) Hierro (mg) Niacina (mg) Riboflavina (mg) Tiamina (mg) Vitamina C (mg) Vitamina E (mg)
1,93 - 1,60 11,60 - 10,50 30 3,17 - 3,80 86,03 - 87,07 7 0,6 1,1 2 1000 9 41 0,9 1,07 0,03 0,1 25 2010
Fuente: Caribbean Fruit, CORPEI
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2.1.5 RECURSOS GENTICOS
Las variedades nativas de tomate de rbol en el pas debieron haber sido
sometidas a seleccin y domesticacin por los primeros pobladores del Ecuador a
partir de las especies silvestres, que an se conservan entre la vegetacin
montaosa subtropical y de altura desde la provincia del Carchi hasta Loja en la
Sierra y en provincias del Oriente como Napo y Pastaza (Albornoz, 1992).
Segn Albornoz (1992), el cultivo de tomate de rbol en el Ecuador muestra gran
heterogeneidad ya sea en formas y tamaos de los frutos, este fenmeno es
generado por hibridacin y mezcla de material gentico que se da por la
polinizacin mixta del cultivo (autgama y entomfila).
Las poblaciones muestran variabilidad en el color y espesor de la pulpa del fruto,
as como en el color del follaje tierno, y el color de los brotes apicales. Segn los
agricultores, el color del follaje verde amarillento est relacionado con la
produccin de frutos morados, y el follaje prpura con la produccin de frutos
rojos o anaranjados. La forma de los frutos vara de esfricos a ovoides con pice
puntn o redondo (Albornoz, 1992).
Segn Albornoz (1992), en el Ecuador existen posiblemente cinco variedades o
cultivares: Amarilla, conocida con el nombre de Oro de Inca, se caracteriza por
tener rboles de tamao medio, el follaje y los brotes apicales son de color verde
claro, frutos de forma ovoide con pice puntn y de color amarillo, el muclago
adherido a la semilla es anaranjado claro, y presenta precocidad a la cosecha.
Negra o tomate de altura, se caracteriza por tener rboles de tamao medio, el
follaje es verde medio y los brotes apicales son de color prpura claro, frutos de
forma ovoide con pice puntn y de color prpura, el muclago adherido a la
semilla es prpura, y es un cultivar tardo. Criollo puntn , se caracteriza por
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37
presentar rboles de tamao medio, el follaje verde oscuro y brotes apicales
prpura oscuro, frutos de forma ovoide con pice puntn y de color anaranjado
oscuro, y el muclago adherido a la semilla es anaranjado claro. Criollo redondo
presenta rboles de tamao bajo, el follaje verde oscuro y los brotes apicales son
de color prpura oscuro, frutos de forma esfricos con pice redondo y de color
anaranjado oscuro, el muclago adherido a la semilla es anaranjado claro, y
presenta precocidad a la cosecha. Tomate mora , rojo o mora posible variedad
hbrida de negra por una de las ancestrales, quizs con criollo redondo; se
caracteriza por tener rboles de tamao medio, el follaje verde medio y los brotes
apicales son de color prpura claro, frutos de forma ovoide con pice redondo y
de color prpura, y el muclago adherido a la semilla es prpura.
Len et al ( 2004) menciona otros genotipos o cultivares que son los siguientes:
Anaranjado gigante
Mora gigante
Morado Neocelands
2.2 CARACTERIZACIN Y EVALUACIN DEL GERMOPLASMA
El proceso de caracterizacin de germoplasma es un factor estratgico en el
proceso investigativo debido a que es un componente de peso decisivo en la
solucin de los problemas actuales y futuros, relacionados con el desarrollo de
nuevas alternativas dirigidas a la obtencin de variedades vegetales mediante la
utilizacin de mtodos tradicionales o biotecnolgicos (IPGRI, 1995; Karp et al,
1997).
Para la caracterizacin y evaluacin del germoplasma se pueden usar los
siguientes mtodos:
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2.2.1 MTODOS DE CARACTERIZACIN MORFOLGICA Y EVALUACIN
AGRONMICA
Este mtodo se desarrolla en el campo e incluye dos fases de toma de datos:
caracterizacin y evaluacin, que sirven para diferenciar accesiones de una
coleccin dada, determinar materiales promisorios y su utilidad, as como para
identificar su estructura y variabilidad gentica (Jaramillo y Baena, 2000).
La caracterizacin de germoplasma se realiza en una poblacin representativa de
la accesin mediante el empleo de descriptores que son caracteres o atributos
referentes a la forma, estructura o comportamiento de un individuo dentro de un
banco de germoplasma (Taba, 1991).
La evaluacin, por su parte, consiste en describir las caractersticas agronmicas
de las accesiones que generalmente corresponden a variables cuantitativas
influenciadas por el ambiente y de baja heredabilidad. El objetivo ltimo del
proceso de evaluacin es ampliar la informacin necesaria para determinar el
potencial de uso de la especie evaluada; dicho proceso se realiza mediante
descriptores (Jaramillo y Baena, 2000).
Los caracteres morfolgicos han sido muy usados para la identificacin de
especies, familias y gneros de plantas. As mismo, las caractersticas
morfolgicas y etnobotnicas han sido el tema de numerosos estudios en
gentica de poblaciones y agricultura, donde la resistencia a plagas,
enfermedades y rendimiento han sido factores determinantes para el
fitomejoramiento (Falconer, 1981; citado por Tapia, 1998).
-
39
El mtodo de caracterizacin involucra el uso de caracteres que son usualmente
dominantes o recesivos, siendo los ms tiles para la descripcin morfolgica
aquellos menos influenciados por el ambiente, como son la flor y el fruto; le siguen
en importancia las hojas, ramas, races y tejidos celulares (Enrquez, 1991;
Lefebvre y Chevre, 1995).
Los mtodos morfolgicos son tiles para estimar niveles de variabilidad de los
caracteres dentro y entre plantas de un cultivar de tal manera que se puedan
definir caracteres discriminantes de la especie en estudio, los mismos que pueden
ser utilizados para posteriores procesos de caracterizacin y evaluacin (Wolf,
1998).
2.2.2 MTODOS MOLECULARES
Las tcnicas moleculares, han permitido conocer y caracterizar el contenido
gentico de los organismos, as como estudiar su diversidad, las relaciones
genticas y el grado de similitud entre individuos de poblaciones naturales o
mejoradas. Han encontrado utilidad en estudios de mapeo gentico, filogenia,
sistemtica molecular, estrategias de mejoramiento asistido por marcadores
moleculares e identificacin varietal (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
Un marcador molecular es cualquier caracterstica qumica o molecular medible
que es heredada segn el Modelo Mendeliano Simple (Walton, 1993 citado por
Tapia, 1998), incluyendo tanto a los que analizan directamente los cidos
nucleicos (ADN y RNA) como tambin a los que analizan los productos del ADN
como son las protenas (principalmente las isoenzimas). Ferreira y Grattapagllia
(1998) definen como marcador molecular a cualquier fenotipo molecular oriundo
de la expresin de un gen o de un segmento especfico de ADN correspondiente
a regiones codificantes o no codificantes del genoma y cuya secuencia puede o
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40
no ser conocida, que presenta diferencias entre individuos y un patrn de
heredabilidad medible.
Los marcadores moleculares exploraran la variacin de las secuencias del ADN
de los individuos en estudio y, por lo mismo, han generado una herramienta
eficiente para distinguir entre genotipos estrechamente relacionados (Weising et
al, 1994)
Los marcadores bioqumicos o moleculares como isoenzimas o fragmentos de
ADN, pueden ser utilizados para caracterizar el genotipo de un individuo a partir
de muestras de clulas o de tejidos por lo que pueden ser utilizados en cualquier
fase del desarrollo de la planta, siempre que sea posible obtener suficiente ADN
(Ferreira y Grattapaglia, 1998).
2.2.2.1 Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La "Reaccin en Cadena de la Polimerasa" (Abrev. PCR; del ingls, "Polymerase
Chain Reaction") es una tcnica poderosa, que comprende la sntesis in vitro de
millones de copias de un segmento especfico de ADN en presencia de ADN
polimerasa. Un ciclo de PCR consta de tres etapas: denaturacin, anillamiento o
pareamiento y elongacin o polimerizacin (Ferreira y Grattapaglia, 1998):
A) Denaturacin
El ADN de doble cadena es desnaturalizado mediante el aumento de la
temperatura que puede variar de 92 a 950C. En esta fase los enlaces de
hidrgeno que unen la cadena se rompen por aumento de la temperatura y
-
41
permanecen as hasta que la temperatura baje y pueda favorecer el anillamiento
de los primers.
B) Anillamiento o Pareamiento
La temperatura es rpidamente reducida entre 37 y 600C, dependiendo
especialmente del tamao y la secuencia del primer utilizado. Esta disminucin de
temperatura permite la hibridacin de cada primer con las secuencias
complementarias que flanquean la regin blanco.
C) Elongacin o Polimerizacin
La temperatura es elevada a 720 C para que la enzima ADN polimerasa realice la
extensin de la cadena a partir de cada terminal 3 de los primers, mediante la
incorporacin de nucletidos a la secuencia de ADN molde, de manera que se
produce una cadena complementaria en el proceso.
La cantidad de ADN de la secuencia-blanco se duplica en cada ciclo y la
amplificacin sigue una progresin geomtrica de manera que despus de 30
ciclos, se produce ms de un milln de veces la cantidad inicial de la secuencia
de inters. Esta escala de amplificacin permite, por lo tanto iniciar con
cantidades mnimas de ADN (nanogramos) y terminar la reaccin con cantidades
grandes de ADN de una secuencia especfica (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
Los fragmentos amplificados pueden ser visualizados realizando una
electroforesis en gel de agarosa y tiendo los fragmentos con bromuro de etidio
que es un colorante que se intercala en la cadena de ADN y produce una
-
42
fluorescencia anaranjada cuando es expuesto a la luz ultravioleta (Ferreira y
Grattapaglia, 1998).
2.2.2.2 Polimorfismos del ADN Amplificado al Azar (RAPDs)
La tcnica RAPDs (Abrev. RAPD; del ingls Random Amplified Polymorphic DNA)
es una modificacin de la PCR con un primer de secuencia arbitraria. Desde su
descripcin, el uso de marcadores RAPDs en el anlisis gentico y en el
mejoramiento de plantas ha tenido una difusin extremadamente rpida. Las
aplicaciones incluyen la obtencin de fingerprints genmicos de individuos,
variedades y poblaciones, as como el anlisis de la estructura y diversidad
gentica en poblaciones naturales, de mejoramiento y bancos de germoplasma.
La utilizacin de marcadores RAPDs tambin es utilizada para la construccin de
mapas genticos de alta cobertura genmica y localizacin de genes de inters
econmico (Rafalski et al, 1991; Caetano-Anolls et al, 1991; Williams et al, 1993;
Tingey y Delfuto, 1993; citado por Ferreira y Grattapaglia, 1998).
Pillips et al (1998) informa que la eficiencia de la tcnica RAPDs depende de
cuatro factores: nmero de ciclos de amplificacin , al respecto se debe tener
en cuenta que en los primeros ciclos el producto se incrementa ms rpidamente
que en los ciclos finales; cantidad de ADN inicial, las muestras con
concentraciones relativamente altas de ADN producen rendimientos ms bajos de
amplificacin que las reacciones en que se usan bajas concentraciones; longitud
del ADN , la eficiencia es inversamente proporcional a la longitud del ADN; y
temperatura factor que regula el proceso de amplificacin.
-
43
A) Base Gentica
La tcnica de RAPDs tiene dos caractersticas distintivas de la PCR: utiliza un
primer nico en vez de un par de primers que tienen secuencia arbitraria formada
por 10 nucletidos, por tanto su secuencia es desconocida (Ferreira y
Grattapaglia, 1998).
Para que ocurra la amplificacin de un fragmento RAPD en el genoma analizado
las secuencias de ADN complementarias al primer arbitrario deben estar
suficientemente adyacentes (
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44
nucletidos que pueden afectar la complementacin del primer con el ADN molde
(Williams et al, 1993; Weising et al, 1994)
C) Competencia por Sitios de Amplificacin RAPDs
La competitividad de un sitio de amplificacin arbitraria es determinada
esencialmente por su complementariedad con el primer utilizado. Sin embargo, en
algunos casos los segmentos son amplificados aunque la complementacin entre
los sitios de iniciacin y el primer no sea perfecta (Williams et al, 1990).
Parece ser que el pareamiento perfecto en la extremidad 3 del primer, a partir del
cual se inicia la polimerizacin es ms crtico que en el pareamiento 5, esto se
debe a que est permitido un cierto nivel de no complementariedad que vara con
la composicin de las bases (Williams et al, 1990; citado por Ferreira y
Grattapaglia, 1998). Los pareamientos GC son evidentemente ms estables que
los AT debido al tipo de enlace trivalente (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
D) Dominancia de los Marcadores RAPDs
Una caracterstica fundamental de los marcadores RAPDs es su comportamiento
como marcadores genticos dominantes. En esta tcnica se distinguen dos
estados: presencia o ausencia de la banda, asumiendo que cada banda
corresponde a un locus con dos alelos (Williams et al, 1990). La dominancia en
este caso no se refiere al concepto clsico de interaccin gentica entre alelos de
un mismo locus, sino puramente al punto de vista de la interpretacin relativa
entre genotipo y fenotipo de un individuo (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
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45
El genotipo homocigtico recesivo (aa), que corresponde al fenotipo nulo, es
identificado por la ausencia de banda en el gel, mientras que los genotipos
homocigticos dominante (AA) y heterocigticos (Aa) don identificados por la
presencia de la banda en el gel y considerados como una misma clase fenotpica.
Es precisamente en esta instancia en la cual estriba la dominancia de la tcnica
RAPDs, al detectar solamente un alelo por locus (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
E) Ventajas de los RAPDs
Esta tcnica tiene una serie de ventajas prcticas que se resumen en simplicidad,
rapidez y bajo costo. No requiere el desarrollo previo de una biblioteca de sondas
especficas para el organismo de inters, pudiendo utilizar un conjunto nico de
primers arbitrarios (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
Es una tcnica rpida y no radioactiva. El tiempo de amplificacin dura alrededor
de tres horas y es completamente automatizado. Utiliza una mnima cantidad de
ADN (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
Por basarse en PCR, la tcnica RAPDs es mucho ms sensible en la deteccin
de polimorfismo a nivel de ADN distribuido por todo el genoma del organismo
(Ferreira y Grattapaglia, 1998).
El costo de esta tcnica es bajo, tanto de implementacin como de operacin ya
que no requiere de instalaciones de laboratorio sofisticado, con relacin a otros
marcadores moleculares (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
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F) Limitaciones de los Marcadores RAPDs
La principal limitacin de los marcadores RAPDs es el bajo contenido de
informacin gentica por locus, debido a que los genotipos heterocigticos no
pueden ser discriminados directamente de los homocigticos. La sensibilidad de
la tcnica hace que cualquier modificacin en el proceso de amplificacin se
detecte nuevos loci y que otros anteriormente visualizados pasen desapercibidos
(Ferreira y Grattapaglia, 1998).
Los RAPDs pueden presentar el inconveniente de una baja consistencia
(repetitividad), sin embargo empleando una metodologa controlada y constante
(termociclador, tipo y concentracin de reactivos, etc.), pueden conseguirse
resultados satisfactorios (www.webcd.usal.es/web/transgen00/Unidadesdocumen
01/ caballero/cap7htm).
2.3 RELACIN ENTRE LA CARACTERIZACIN MORFOLGICA Y
MOLECULAR
Es importante establecer el grado de concordancia entre los rasgos
morfoagronmicos y los marcadores moleculares, ya que los estudios que
combinan estas dos tcnicas maximizan la informacin y la utilidad de las
colecciones de germoplasma. Los caracteres morfoagronmicos son
influenciados por el ambiente y algunos de ellos son poco convenientes para el
estudio de la biodiversidad; por otro lado los marcadores moleculares, no
consideran las interacciones del genotipo con el medio ambiente, sin embargo la
combinacin de estos dos mtodos de caracterizacin pueden proveer un amplio
y real conocimiento de la diversidad de las especies (Hillis, 1987).
No siempre existe una adecuada correlacin entre los marcadores morfolgicos y
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moleculares por lo que se han desarrollado dos mtodos de consenso: tcnicas
de consenso que enfatizan la estabilidad e informacin en comn; y la
combinacin de tcnicas, que enfatiza el poder descriptivo y parsimonia global
(Miyamoto, 1985).
La manera de comparar matrices de datos es calculando para los caracteres
moleculares, los coeficientes de similitud en base a Jaccard o Nei principalmente,
mientras que los datos morfolgicos se realiza una transformacin (z) en cada
caracterstica y luego se ejecuta una transformacin de rangos o anlisis de
componentes principales. Este tipo de comparacin da como resultado la
identificacin de correlaciones entre los caracteres morfolgicos y moleculares
(Mantel, 1967)
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48
CAPTULO III
MATERIALES Y MTODOS
3.1 MATERIALES
Los materiales utilizados en la presente investigacin tanto de campo y laboratorio
como de oficina se detallan a continuacin.
3.1.1 DE CAMPO
Los materiales de campo que se utilizaron en la presente investigacin son los
siguientes:
3.1.1.1 Insumos
Semilla de las 37 accesiones (Coleccin DENAREF).
Fungicidas ( Ridomil, Mancozeb, Cursate, Antracol, Fitoraz).
Insecticidas (Curacron, Kan plus, Cipermetrina, Basudn, Malathion
57%).
Fertilizantes (Hidrocomplex, 10 30 10, sulpomag, 0 0 - 60).
Foliares
Humus
3.1.1.2 Herramientas
Azadones
Palas
Barras
-
49
Balanza
Bomba de fumigar
3.1.1.3 Recurso Humano
Tcnicos INIAP
Tesistas
3.1.1.4 Material de Oficina
Libro de campo
Computadora
Hojas
Cmara fotogrfica
Otros
3.1.2 DE LABORATORIO
Los materiales de laboratorio utilizados en la presente investigacin se detallan a
continuacin:
3.1.2.1 Materiales de laboratorio
Morteros y pistilos
Tubos eppendorf de 2 y 0.6 ml
Puntas amarillas
Puntas azules
Erlenmeyer de vidrio de 250 y 1000 ml
Micro pipetas
-
50
Micro centrifuga
Micro estufa
Bao Mara
Termocicladores MJPTC100
Cmara de electroforesis
3.1.2.2 Reactivos
Buffer de extraccin de ADN ( CTAB, Tris, EDTA y NaCl)
Cloroformo/ Alcohol isoamlico
Etanol, Isopropanol
Tris EDTA (TE)
Tris cido Actico EDTA (TAE)
Agarosa
Bromuro de etidio
Buffer 5X (MgCl2, KCl, BSA)
Agua grado de biologa molecular
Primer RAPDs Operon
dNTPs
Taq polimerasa
3.2 MTODOS
La metodologa empleada en la presente investigacin se detalla en los siguientes
prrafos.
-
51
3.2.1 UBICACIN
La presente investigacin se desarroll en dos etapas, la primera etapa
denominada Caracterizacin morfolgica y evaluacin agronmica y la
segunda etapa Caracterizacin molecular.
ETAPA 1. Caracterizacin morfolgica y evaluacin a gronmica
La etapa 1 de la presente investigacin se realiz en:
Provincia : Imbabura
Cantn: Cotacachi
Parroquia: San Francisco
Comunidad: Eloy Alfaro
Sitio: Granja de la Unin de Organizaciones
Campesinas e Indgenas de Cotacachi (UNORCAC)
ETAPA 2. Caracterizacin molecular
La etapa 2 se realiz en:
Provincia: Pichincha
Cantn: Meja
Parroquia: Cutuglahua
Sitio: Instituto Nacional Autnomo de Investigaciones
Agropecuarias (INIAP). Departamento Nacional de
Recursos Fitogenticos y Biotecnologa (DENAREF).
Estacin Experimental Santa Catalina (EESC), Quito.
-
52
3.2.2 CARACTERSTICAS AGROCLIMTICAS
ETAPA 1
Altitud: 1 500 m.s.n.m.
X coord: 693067.2 UTM
Y coord: 9533871.0 UTM
Temperatura media anual: 20.5 C
Precipitacin media anual: 642,2 mm
Dficit hdrico : 388 mm
Meses secos : 8 meses
Uso anterior : Barbecho
Tipo de suelo: Franco Arenosos
Fuente: UNORCAC, 2003
3.2.3 DESCRIPCIN DE LA INVESTIGACIN
El procedimiento general para el desarrollo de las dos etapas de la presente
investigacin se detalla a continuacin.
3.2.3.1 Caracterizacin Morfolgica y Evaluacin Ag ronmica
El ensayo estuvo constituido por 37 entradas de la coleccin nacional de tomate
de rbol del Banco de Germoplasma del DENAREF INIAP, el detalle de los
datos pasaporte de las accesiones caracterizadas se encuentran en el Anexo 1.
Se inici con la geminacin de las semillas en los bancos de propagacin, a los
15 das se realiz el repique de las plantas con sus respectivos cdigos a fundas,
en un sustrato que estuvo compuesto de una parte de cascarilla de arroz, una
-
53
parte de pomina y una parte de tierra. Estas plntulas permanecieron en los
invernaderos durante tres semanas y luego fueron trasladadas a la granja de la
UNORCAC Cotacachi, para la aclimatacin de las mismas. El transplante se
realiz a los dos meses del repique.
La preparacin del terreno fue mecanizada, dando un pase de arado y uno de
rastra, los hoyos realizados tuvieron una dimensin de 0,40 x 0,40 x 0,40 cm, se
traz a una distancia de 1,50 m entre plantas y 2 m entre hileras, se
transplantaron 12 plantas por hilera. Para la fertilizacin de fondo se utilizaron 100
g de hidrocomplex y 4,5 kg de humus por hoyo. Cada tres meses las plantas
fueron fertilizadas utilizando sulpomag, rea, muriato de potasio, 10-30-10 y
humus de lombriz.
Se sembraron 12 plantas por hilera a una distancia de 1,5 m entre plantas y 2 m
entre hileras, dando un rea de 3 m2 por planta. Cada hilera tuvo 18 m de largo y
2 m de ancho, resultando un rea total de 36 m2 por entrada. Para eliminar los
efectos de borde, se evaluaron solamente diez plantas, dando un rea neta de 30
m2 por entrada. El rea total del ensayo fue 1 332 m2, y un rea neta de 1 110 m2,
el croquis de la distribucin en campo se encuentra en la Figura 1.
Constantemente se realizaron deshierbas y podas de formacin y sanitarias. Los
controles fitosanitarios se dieron de acuerdo a la incidencia de plagas y
enfermedades, se realizaron aplicaciones principalmente para pulgn (Aphis sp.),
chinche (Leptoglossus zonatus), lancha (Phytophthora infestans) y antracnosis
(Colletotrichum sp.).
Para el registro de caracteres morfolgicos y evaluacin agronmica se utiliz
preliminarmente la lista de descriptores establecida por Albornoz (1992), a la que
-
54
se le hicieron modificaciones en ciertos estados de los caracteres, ya que en el
presente estudio se observ algunos caracteres y estados diferentes. Se
evaluaron 48 descriptores morfolgicos y agronmicos (21 cuantitativos y 27
cualitativos). El detalle de los descriptores utilizados en esta investigacin se
encuentra en el Anexo 2.
3.2.3.2 Anlisis Estadstico para la Evaluacin en Campo
En el flujograma de la Figura 2, se observan los anlisis estadsticos realizados
para la caracterizacin morfolgica. En los siguientes acpites se detalla cada uno
de los anlisis .
A) Matriz de similitud y distancia
La similitud general entre dos entradas es funcin de sus similitudes individuales
en cada uno de los caracteres para los cuales son comparados. Utilizando el
paquete estadstico SAS versin 6.12 (SAS Institute Inc., 1990) y la distancia de
Gower (1967), se estim la similitud taxonmica entre cada par de entradas para
caracteres continuos, mientras que para los cualitativos se utiliz el coeficiente de
asociacin que se detalla a continuacin:
Sij = Sij / n
Donde:
n = nmero de caracteres cualitativos
Sij = coeficiente de asociacin entre las entradas i y j
Luego se transform en una matriz de distancia (D1), mediante el complejo Sij:
D1(i,j)= ( 1 - Sij)
-
55
Adems se calcul una Matriz de Distancia Euclideana:
D2(i,j)= (X ki X kj) 2 / n
Donde:
X ki = registro estandarizado del carcter k en la entrada i
X kj = registro estandarizado del carcter k en la entrada j
Dando la matriz final:
D = ( n1D1 + n2D2) / (n1+n2 )
La estructura taxonmica de las entradas fue analizada por medio del
agrupamiento jerrquico de Ward (1963) que hace posible encontrar en cada
estado aquellos dos grupos cuya unin produzca el mnimo incremento en la
suma total de cuadrados del error, dentro de grupos.
La eleccin del nmero de grupos de entradas se hizo con los criterios de Pseudo
F y Pseudo t2 utilizando el procedimiento CLUSTER del paquete estadstico SAS.
B) Determinacin del valor discriminante entre gru pos
Mediante este anlisis se reconocieron dentro del grupo de caracteres utilizados
aquellos que tuvieron el mayor valor discriminante y que por lo tanto permitieron
una eficiente identificacin de la relacin entre los clones o entradas de la
poblacin en estudio para un determinado carcter y para el grupo de caracteres.
-
56
Caracteres Cuantitativos
El valor discriminante o ndice D de un descriptor cuantitativo es el nmero de
diferencias significativas detectadas por la prueba Duncan, expresadas como una
fraccin del nmero total de posibles comparaciones dentro de un grupo de
clones. Con el anlisis de esta comparacin se identific los descriptores de
mayor valor discriminantes (Engels, 1983), que permiti la formacin de grupos
dentro de la coleccin.
Caracteres Cualitativos
El valor ndice D para caracteres cualitativos se basa en el nmero de pares de
taxa que un cierto descriptor puede separar y en la cantidad de informacin que
este descriptor comparte con otros descriptores del mismo estudio (Engels, 1983).
La comparacin de valores D entre el grupo de descriptores permiti seleccionar
aquellos con mayor valor discriminante. En general, la magnitud de D expresa
la mayor o menor relacin entre clones de un grupo con relacin a un
determinado carcter; entre mayor sea la relacin de los clones de un grupo,
menor ser el valor D (Engels, 1983).
El valor discriminante para separar grupos se estim sobre la base del anlisis de
frecuencias y las estadsticas de Cramer (Kendall & Stuart, 1979), coeficiente de
asociacin (Fienberg, 1977) y Chi cuadrado X2 (Cochran, 1954).
3.2.3.3 Caracterizacin Molecular
Los procedimientos que se llevaron a cabo para la caracterizacin molecular se
detallan en los prrafos siguientes.
-
57
A) Extraccin de ADN genmico
Para la extraccin de ADN de C. betacea, se colectaron de dos a tres hojas de
plantas jvenes (15 a 30 das) de cada accesin, que fueron envueltas con papel
aluminio y colocadas sobre hielo hasta su extraccin. Se sigui el protocolo
establecido por Colombo (1998) modificado por Piedra (2004, comunicacin
personal).
Para el proceso de extraccin de ADN, las muestras colectadas fueron
maceradas en morteros con 300 l de buffer de extraccin, se coloc el macerado
en un tubo Eppendorf de 2 ml con 30 l de antioxidante (-mercapto etanol), a
continuacin se afor la muestra a 2 ml y se homogeniz mediante agitacin, se
incub a 65 C por una hora y media, agitando cada 30 minutos. Posteriormente
se dej enfriar y se centrifugaron por diez minutos a 14000 r.p.m. El sobrenadante
fue transferido a un nuevo tubo, y se aadi 1 ml de Cloroformo/Alcohol
Isoamlico (CIA 24:1). Nuevamente la muestra fue homogenizada y se centrifug
por cinco minutos a 14000 r.p.m. El sobrenadante fue transferido a otro tubo y se
repiti la limpieza con CIA. Una vez finalizada la limpieza, el ADN fue precipitado
con Isopropanol, obteniendo un pellet o pastilla al que se le realiz una nueva
limpieza con Etanol/Acetato de Sodio y finalmente con Etanol/Acetato de Amonio.
Se coloc la muestra en la microestufa por una hora a 37 C con la finalidad de
secar el pellet. Una vez eliminado los residuos de alcohol, se procedi a diluir el
pellet de ADN en TE (Tris-HCl EDTA) a 65C por 30 min; para eliminar el ARN se
coloc ARNasa (10 g/ml; R-4642, SIGMA) por 30 min a 37C. Finalmente las
muestras fueron almacenadas a -20C hasta su utilizacin.
Piedra, G. 2004. Protocolo de Extraccin de ADN (Comunicacin personal). DENAREF - INIAP. Quito, Ecuador.
-
58
B) Cuantificacin del ADN
La integridad y concentracin de ADN fueron analizadas por electroforesis en
geles de agarosa 0,8% en tampn TAE 1X y cuantificado comparativamente
utilizando el estndar ADN Low Mass Ladder (10068-013, INVITROGEN),. La
electroforesis se realiz a 70 V por 15 minutos. Sobre la base de estas
determinaciones, la concentracin de ADN de cada una de las accesiones se
estandariz en tampn TE 0,1M tartrazine hasta lograr una concentracin final de
1,25 ng /l.
C) Reaccin RAPDs
En cada tubo de reaccin se coloc una alcuota de los siguientes componentes:
Componentes 1 Rx
ADN (1.25 ng /l) 1,5 l
5X buffer 2,2 l
Primer (1,0 M) 0,4 l
dNTPs (2,5 mM cada uno) 0.8 l
Taq polimerasa (5U/l) 0,13 l
H2O ultra pura 2,3 l
Volumen final 7,33 l
La reaccin fue cubierta con una gota de aceite mineral (para evitar la
evaporacin de los componentes) y esta fue amplificada en un termociclador MJ
Research, de acuerdo al siguiente programa:
-
59
Los productos de amplificacin fueron visualizados en geles de agarosa al 2% en
tampn TAE 1X con bromuro de etidio. La electroforesis fue realizada a 110 V.
Se us el estndar 1Kb DNA Ladder Marker (10381-010 INVITROGEN) como
marcador de referencia. Para la visualizacin de las bandas se coloc el gel bajo
un transiluminador UV y posteriormente las bandas fueron documentadas.
Primer evaluados
Se probaron 145 primers pertenecientes a los Kits OPA, OPAC, OPAN, OPAM,
OPR, OPS, OPW, OPAA, de Operon Technologies en un sondeo preliminar
(screening) para el que se escogieron cinco accesiones morfolgicamente
diferentes. Como resultado del proceso de screening se seleccionaron ocho
primers que presentaron polimorfismos reproducibles y confiables, los mismos
que se emplearon para amplificar el ADN de las 37 accesiones estudiadas.
3.2.3.4 Anlisis Estadstico para Datos Moleculare s
Las bandas polimrficas fueron evaluadas a travs de las variables presencia (1)
o ausencia (0) y se registraron por inspeccin en una matriz de datos binarios en
el programa NTEDIT del paquete estadstico NTSYS pc ver.2,0 (Applied Biostatistic
Paso Temperatura C Tiempo
1 Denaturacin inicial 94 5 min.
2 Denaturacin cclica 94 30 seg.
3 Anillamiento 42 1 min.
4 Elongacin 72 2 min.
40 veces el paso 2 hasta el paso 4
6 Elongacin final 72 7 min.
7 Conservacin de la muestra 4 5 min.
-
60
Inc, 1998). No se tomaron en cuenta polimorfismos que involucren datos dudosos.
Los tamaos de las bandas polimrficas se calcularon mediante la aplicacin
LENGTH (Templeton & Lawrence, 1988) y se expresaron en pb.
La principal ventaja de esta codificacin es la de dar el mismo peso a todos los
individuos independientemente del nmero de bandas. El nmero de locus es el
nmero de bandas diferentes observadas en el germoplasma en estudio. Al
comparar dos accesiones, los estados posibles a un mismo locus son:
ACCESIN Y
+ -
ACCESIN X + a b
- c d
Hay que recalcar que el nmero de dobles ausencias (carcter )
corresponde al nmero de loci homocigotos para el alelo nulo en dos individuos
ya que solo informa sobre la ausencia del alelo amplificado lo que no constituye
una evidencia de similitud entre dos accesiones. Por lo tanto, la seleccin del
ndice de similaridad sobre este tipo de marcadores moleculares tiene que
basarse en las caractersticas de la tcnica usada.
A) Matriz de similitud y distancias
Utilizando el coeficiente de Jaccard se calcul la similitud gentica entre pares de
accesiones mediante la opcin SIMQUAL del paquete estadstico NTSYS. La base
molecular para la presencia de una banda RAPDs no est claramente entendida,
pero se considera que la ausencia de una banda compartida no necesariamente
implica un ancestro comn o similitud gentica entre las muestras, clones o
accesiones. Por lo tanto el coeficiente de Jaccard fue considerado como el mejor
algoritmo para obtener la matriz de similitud y distancia en este estudio, puesto
-
61
que este coeficiente no considera a la ausencia de banda entre dos muestras
como elemento a favor de la similitud entre ellas, y se expresa de la siguiente
manera:
Mxy F= ______________
(Mt Mxyo)
Donde:
F = Coeficiente de Jaccard
Mxy = nmero de fragmentos compartidos entre dos accesiones
Mt = nmero total de bandas en la matriz de datos
Mxyo = nmero de bandas en la matriz
Sobre la matriz obtenida se aplic la tcnica de Cluster anlisis empleando el
mtodo de agrupamiento UPGMA (Media Aritmtica No Ponderada; Sneath &
Sokal, 1973) mediante la opcin de SAHN CLUSTERING del paquete estadstico
NTSYS.
Mediante la opcin TREE DISPLAY fueron visualizados los agrupamientos o
relaciones entre entradas de la coleccin generndose diagramas arborescentes
o dendrogramas que mostraron las relaciones genticas entre accesiones.
3.2.3.5 Relacin de Datos Morfolgicos y Molecular es
Se utiliz la opcin MXCOMP del paquete estadstico NTSYS, la cual procede de la
siguiente manera: Utiliza las matrices de distancia moleculares X obtenidas con
el coeficiente de Jaccard y las morfolgicas Y obtenidas con el coeficiente de
Gower; y se las correlaciona entre ellas con el valor estadstico Mantel (1967),
que se define como:
-
62
Z = j k X jk Y jk
Donde
X jk y Y jk = son elementos de js lneas y ks columnas de Xnxn y Ynxn,
respectivamente, y k es < j.
-
63
CAPTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIN
4.1 RESULTADOS
Los resultados obtenidos de la caracterizacin morfoagronmica y molecular, as
como la comparacin estadstica de estas dos fases se detalla a continuacin:
4.1.1 DATOS PASAPORTE
4.1.1.1 Provincias de Coleccin
Las 37 accesiones evaluadas en el presente estudio, fueron colectadas en ocho
provincias de la Sierra ecuatoriana tanto del norte (Carchi, Imbabura y Pichincha),
centro (Tungurahua y Chimborazo) y sur del pas (Caar, Azuay y Loja). La
distribucin geogrfica de las colectas se observa en la Figura 3.
4.1.1.2 Altitud
Las colectas fueron realizadas en altitudes comprendidas entre los 1 360 y 2 670
m.s.n.m. y seis de las accesiones evaluadas (ECUs-12883, 12884, 12885, 5546,
5579, 6690) fueron colectadas bajo los 2 000 m.s.n.m. (Anexo 1).
4.1.2 CARACTERIZACIN MORFOAGRONMICA
Los resultados obtenidos del anlisis estadstico de los descriptores morfolgicos
y agronmicos evaluados en la coleccin de tomate de rbol del INIAP, se
detallan en los siguientes acpites.
-
64
4.1.2.1 Variabilidad morfolgica
Para determinar la variabilidad de los datos morfolgicos de la coleccin de C.
betacea se usaron como parmetros estadsticos, la media aritmtica y el
coeficiente de variacin para los 21 descriptores cuantitativos (Tabla 1).
Mientras ms bajo sea el valor de coeficiente de variacin ms homogneo sern
los datos y por lo tanto la variacin ser menor por lo que, con los valores
observados, el descriptor das a la madurez fisiolgica present un valor de 6%,
siendo el carcter de menor variabilidad, por otro lado el descriptor nmero de
frutos cosechados por inflorescencia present un valor de 27,83% siendo el de
mayor variacin.
Los descriptores que mayor variacin presentaron en la evaluacin fueron:
nmero de frutos cosechados por inflorescencia (27,83%), tamao del eje
transversal de la semilla (24,37%), nmero de frutos cados por inflorescencia
(22,51%), y nmero de flores y botones por inflorescencia (19,43%). Esta alta
variacin observada es producto, posiblemente, de la influencia del ambiente
sobre estos caracteres, por lo que deberan ser evaluados en otros ciclos de
cultivo o realizar repeticiones en otras localidades que permitan verificar los
valores obtenidos en la presente investigacin.
Los descriptores que presentaron menor coeficiente de variacin fueron das a la
madurez fisiolgica (6,01%), tamao del eje transversal mayor del fruto (6,09%),
tamao del eje longitudinal de la semilla (6,58%), y das de duracin de floracin
(6,83%). Como se haba mencionado anteriormente, los valores bajos de
coeficiente de variacin indican que hay homogeneidad en los resultados y por lo
tanto un buen manejo del experimento, por lo que se puede considerar estos
descriptores para evaluaciones preliminares de germoplasma de tomate de rbol.
-
65
4.1.2.2 Agrupamiento de las Entradas.
El agrupamiento jerrquico de Ward (1963) obtenido a partir de la matriz de
distancia generada por el algoritmo de Gower, identific tres grupos de entradas
(Tabla 2), representadas grficamente en el dendrograma que puede observarse
en la Figura 4. Este dendrograma muestra la variabilidad y parentesco gentico
entre entradas y grupos de accesiones.
4.1.2.3 Valor Discriminante de los Caracteres
Los parmetros estadsticos para la seleccin de descriptores discriminantes
cualitativos y cuantitativos se detallan en los prrafos siguientes.
A) Caracteres cualitativos
Para determinar los descriptores discriminantes de los 27 caracteres cualitativos
evaluados, se aplic la prueba X2, determinando a seis caracteres como
altamente significativos al 1%, cuatro como significativos al 5% y siete caracteres
como no significativos (Tabla 3).
En la Tabla 3 se detallan los resultados de la prueba X2, coeficiente de asociacin
(P) y Cramer de los caracteres cualitativos analizados. Los descriptores con
valores totalmente homogneos (diez descriptores) no fueron considerados dentro
del anlisis (Anexo 5).
Se determinaron seis caracteres discriminantes por ser los que presentaron un
mayor valor de X2 y son altamente significativos: color del muclago adherido a
la semilla (39,37), color de la semilla (37,75), color de la lmina foliar (37,00),
-
66
color de las nervaduras (37,00), color primario de la epidermis del fruto
(33,15), y color de los brotes apicales (31,98); como se puede observar hay
caracteres que describen tanto la parte vegetativa como el fruto. Estos caracteres
identificados por su mayor valor discriminante, pueden utilizarse para establecer
diferencias entre grupos genticos.
Los descriptores de mayor valor segn la prueba de Cramer fueron: color de la
lmina foliar y color de las nervaduras con un valor de 1,00, y color de los
brotes apicales con 0,93, por lo que son los de mayor contribucin en la
discriminacin entre grupos genticos.
B) Caracteres cuantitativos
Segn Engels (1983), un carcter para el cual los grupos genticos tengan
valores marcadamente distintos, tendr un valor D mximo de 1. El presente
estudio tuvo un valor de 1 entre las comparaciones posibles entre grupos y por lo
tanto fue posible seleccionar los descriptores cuantitativos de mayor poder
discriminante.
Los valores de la prueba de Duncan y promedios calculados para los descriptores
cuantitativos evaluados se detallan en la Tabla 4. De los 21 caracteres
cuantitativos evaluados solo tres resultaron discriminantes: tamao del eje
longitudinal del fruto, tamao del eje transversal mayor y transversal menor
del fruto (Tabla 5).
Los valores de desviacin estndar de los descriptores cuantitativos
discriminantes son bajos (Tabla 5), esto quiere decir que los datos de las
accesiones de cada grupo no presentan alta variacin.
-
67
4.1.2.4 Anlisis de los Caracteres Cualitativos Di scriminantes para los
Grupos
Los descriptores o caracteres cualitativos estn constituidos por varios estados
que expresan la variabilidad de la coleccin. La relacin de los agrupamientos con
los estados de los caracteres de mayor poder discriminante permite comprender
con facilidad la naturaleza del agrupamiento (Tabla 6).
A) Color de la lamina foliar
0
10
2030
40
50
6070
80
90
100
G1 G2 G3
Verde claro
Verde medio
Verde oscuro
El Grupo 1 y 2 presentaron el 100% de las entradas laminas foliares de color
verde oscuro, mientras que el grupo 3 en su totalidad present laminas foliares de
color verde normal.
-
68
B) Color de las nervaduras
0
20
40
60
80
100
G1 G2 G3
Amarillo
Marron claro
Marron oscuro
Tanto el grupo 1 como el grupo 2 presentaron en el 100% de las entradas
nervaduras de color marrn oscuro y el grupo 3 se diferencia por presentar
nervaduras de color marrn claro.
C) Color de los brotes apicales
0
20
40
60
80
100
G1 G2 G3
Verde claro
Purpura claro
Purpura oscuro
El Grupo 1 y 2 presentaron el 100% brotes apicales de color prpura oscuro,
mientras que el Grupo 3 present en su totalidad brotes apicales de color prpura
claro.
-
69
D) Color primario de la epidermis del fruto
0
20
40
60
80
100
G1 G2 G3
Amarillo
Anaranjado claro
Anaranjado oscuro
Morado
Rosado oscuro
Respecto al color primario de la epidermis del fruto solo el grupo 1 tiene frutos de
color anaranjado claro con el 68,75% y el 31,25% presentaron frutos de color
anaranjado oscuro. El grupo 2 present el 92,31% de las entradas frutos de color
anaranjado oscuro y una entrada (7,69%) fue de color rosado oscuro. El grupo 3
present el 50% de las entradas de color morado, el 37,5% fueron de color
anaranjado oscuro y una accesin (12,5%) fue de color rosado oscuro.
E) Color del muclago adherido a la semilla
0
20
40
60
80
100
G1 G2 G3
Incoloro
Anaranjado claro
Anaranjado medio
Anaranjado oscuro
Purpura claro
Purpura oscuro
El grupo 1 present el 93,75% de las entradas con muclagos adheridos a la
semilla de color anaranjado medio y el 6,25% fueron anaranjado oscuro. El grupo
2 tiene 30,77% de entradas muclago adherido a la semilla de color anaranjado
oscuros, y el 61,54% de las entradas fueron de color anaranjado medio y una
accesin (7,69%) present color prpura oscuro. El grupo 3 se destaca por
-
70
presentar muclagos adheridos a la semilla de color prpura claro en todas sus
accesiones.
F) Color de la semilla
0
20
40
60
80
100
G1 G2 G3
Crema claro
Crema oscuro
Pardo
Purpura claro
Purpura oscuro
El grupo 3 es homogneo porque el 100% de las entradas presenta semillas de
color prpura claro. El grupo 2 present el 92,31% semillas de color crema
oscuro, el 7,69% fueron de color prpura oscuro. El grupo 1 presenta 75% de las
entradas semillas de color crema oscuro y 25% fueron pardas.
4.1.2.5 Estructura de los Agrupamientos
El Grupo 1 consta de 16 entradas agrupando el mayor nmero de accesiones,
que han sido colectadas en el norte y sur del pas, este grupo se encuentra a una
distancia gentica de 0,047 en relacin a los otros dos grupos (G2, G3). Las
accesiones de este grupo muestran una estrecha relacin y parentesco,
dividindose en cuatro subgrupos A, B, C, y D (Figura 5) de acuerdo a los estados
de los caracteres cualitativos y cuantitativos discriminantes, el subgrupo A tiene
una distancia gentica de 0,0076; el subgrupo B se encuentra a una distancia de