Las técnicas de Biología Molecular (BM) permiten ladetección de material genético (Ácidos Nucleicos), tanto DNAcomo RNA, que constituyen la característica inequívoca deespecie y sus modificaciones como mutaciones, deleciones ytranslocaciones, las cuales tienen diferentes implicanciassegún la situación estudiada.

En microbiología permiten la detección de porciones deácidos nucleicos (AN) (DNA o RNA) que son específicos decada microorganismo, en diferentes materiales clínicos. Suaplicación, surge como una necesidad para poder detectarmicroorganismos de difícil crecimiento en cultivos o desarrollostardíos y donde las técnicas serológicas de detección deantígenos (Ag) y anticuerpos (Ac) carecen de suficientesensibilidad y especificidad diagnóstica. Esta circunstancia seajusta principalmente a la detección de virus, es por ello, que eldesarrollo de técnicas moleculares comenzó en esta área.

Las primeras técnicas de BM, utilizadas desde los años70 se basan en el mismo principio que las actuales, que es lahibridación (unión de pares de bases complementarias) entrecadenas deAN. Esta unión es de alta especificidad, superior a launión Ag-Ac, pero carecen de sensibilidad, lo que las convirtióen poco útiles para la detección y se utilizan principalmente parala identificación de microorganismos.

En la década de los 80, la incorporación de laamplificación de AN a través de enzimas termoestables(polimerasas) y la evolución de los sistemas de detección,permitió mejorar notablemente la sensibilidad. Todo esteproceso que comenzó en los laboratorios de investigación se ha

trasladado a nuestro laboratorio, formando parte de una de lasherramientas más importantes para colaborar en el diagnósticode alta complejidad en la práctica diaria. Ejemplo: informes decarga viral de Citomegalovirus, en 24 hs, en urgencias clínicasde pacientes transplantados.

En la evolución de las técnicas moleculares, se fueronincorporando mejoras en función de minimizar las principalesdesventajas.

El primer punto es haber trasladado muchas de lasmetodologías caseras a formatos comerciales, permitiendouna mejor estandarización, evaluación de controles internos yexternos internacionales, e interpretación adecuada de losresultados para evaluar el diagnóstico, pronóstico yseguimiento de los pacientes.

En forma conjunta, se dio la incorporación de loscontroles internos que pueden ser de concentración conocida,que consisten en transcriptos similares al target a medir perocon una diferencia de 25 a 30 pb, que se amplifiquen con losmismos cebadores (primers) y acompañan todos los pasos dela muestra, pero pueda detectarse en forma separada. Estogeneró la capacidad de controlar el aislamiento, laamplificación, la detección, la presencia de inhibidores yrealizar la cuantificación en cada muestra en particular, ya quela utilización de una curva externa con calibradores, no era deutilidad por la gran variabilidad que producen los diferentespasos de las técnicas moleculares.

¿Cómo evolucionaron las técnicas moleculares?

Técnicas molecularesde Microbiología en la práctica diaria

16 Bioanálisis

Sin ninguna duda, este fue un paso sustancial quepermitió cuantificar el AN detectado (carga viral), metodologíaque fue incorporada rápidamente al seguimiento de pacientescon infecciones virales crónicas, así como también a una mejorevaluación de los resultados obtenidos con las técnicascualitativas que definen patologías de extrema importancia,como por ejemplo: Sistema Nervioso Central (SNC).

El segundo punto importante, era el efecto negativo y ded i f í c i l con t ro l como son las con taminac iones ,fundamentalmente aquellas producidas por reamplificación delproducto de amplificación previo o “Amplicones”. Para ello, seutilizan métodos químicos y físicos que intentan eliminar en sutotalidad la presencia de amplicones, sin embargo, ninguno estotalmente efectivo y es fundamental un correcto esquema detrabajo y estructura adecuada.

La incorporación de la automatización en los diferentespasos, como el aislamiento, amplificación y la detección,permitieron generar esquemas de trabajo cerrados donde, al noabrirse tubos con productos de amplificación, la diseminaciónde “amplicones” es insignificante y por consiguiente el fantasmade la contaminación que venía acompañando a las técnicasmoleculares, en particular a las Nested PCR (Doble round dePCR) como lo son la mayoría de las técnicas caseras paraaumentar la sensibilidad, se convierte en anecdótico.

El tercer inconveniente que comenzó a surgir a travésdel tiempo, es poder realizar cuantificaciones demicroorganismos, donde la cantidad de muestras en loslaboratorios nunca serán suficientes como para que lasempresas de diagnóstico generen equipos comercialescontrolados y estandarizados, así como la necesidad deresultados en tiempos más cortos y siempre generandoresultados cada vez más exactos, fue dando origen a lastécnicas moleculares en tiempo real.

Estas técnicas permiten ir detectando el producto deamplificación a medida que se va formando, o sea, en vez derealizar una hibridación del producto final de la reacción, se varealizando a medida que se obtiene el producto amplificado.Esta metodología incorpora una serie de ventajas con respectoa las anteriores mencionadas, mayor exactitud, por evitar lamedición de productos espurios, mayor rapidez, permite lacuantificación con curvas externas debido a su altareproducibilidad y algo de suma importancia que es un sistemaabierto, o sea, que permite la incorporación de diferentes tiposde protocolos sin necesidad de tener equipos comercialescerrados.

Las técnicas moleculares en tiempo real hoy refieren alúltimo escalón de desarrollo de estas técnicas, aportando lasventajas antes mencionadas y generando esquemas de trabajodiferentes. En este sentido, nos permiten además de ladetección, cuantificación de AN, también detectar mutaciones,genotipos, translocaciones, determinaciones que aportan adiferentes especialidades dentro de la Medicina.

De esta forma, hoy conviven en nuestro Laboratorio deBiología Molecular, técnicas caseras, la mayoría Nested PCR,comerciales manuales o automatizadas, sistemas deaislamiento automatizados, metodologías en tiempo real. Por locual, es fundamental que los laboratorios incorporen en suinforme qué tipo de metodología o técnica utilizan, cuándo ycómo utilizan controles internos, para poder realizar unacorrecta interpretación de los resultados.

Ventajas:- Su capacidad de multiplicación de la porción de AN buscadaen el orden de 106-9 copias y la detección a través de técnicasde ELISA, Hibridación, etc., le confieren su altísimasensibilidad.- La utilización de iniciadores que reconocen una secuenciaúnica elegida propia de cada microorganismo, le confiere sualtísima especificidad.- Su rapidez comparada con algunas técnicas tradicionales.- La característica de detectar “presencia de AN” en vez de“viabilidad de microorganismos” permite su realización en unagran variedad de muestras.- La capacidad de determinar la cantidad de AN específico(Cuantificación o Carga Viral), a través de la incorporación decontroles internos de concentración conocida.Desventajas:- La falta de estandarización de las técnicas “HOME MADE”.- La probabilidad de resultados falsos positivos porcontaminación con productos de amplificados anteriores“Amplicones”, hace necesario una cuidadosa evaluación de susresultados.- La probabilidad de falsos negativos por la presencia deinhibidores o inconvenientes en los diferentes pasos de lastécnicas, esto se controla y detecta con la incorporación decontroles internos.- No permite el aislamiento del microorganismo para la posteriordetección de resistencia.- Los costos. Si sólo se las compara con las técnicastradicionales y no se las evalúa en el contexto total del cuidadodel paciente y gastos indirectos de las entidades de salud.

Se deben cumplir 3 condiciones fundamentales:1) Muestra clínica adecuada: Consultar en todos los casos allaboratorio, tipo de muestra, conservación y transportenecesario para cada determinación en particular por ser cadauna de éstas dependientes de la patología, estructura ydistancias en cada situación. El concepto universal es que elrecipiente debe ser “nuevo y estéril”.2) Laboratorio con estructura apropiada: Tiene que constar de 2ó 3 áreas separadas y aisladas, cada una con sus propiosmateriales para trabajar y estar instaladas en un sector conescasa circulación de personal. Equipamiento adecuado,materiales calibrados, estandarizados y sistemas debioseguridad adecuados.3) Personal altamente entrenado: El flujo de circulación delpersonal y la muestra, el uso adecuado de materiales yprocedimientos, conjuntamente con la interpretación correctade resultados permiten evitar el principal inconveniente deestas técnicas, que son los resultados falsos positivos porcontaminación.

Patologías y situaciones donde su utilidad estáampliamente comprobada:

La relación costo-beneficio de su realización es positiva,ya sea porque evita tratamientos innecesarios o porquepermiten cambios de conducta médica que son de vitalimportancia para el paciente.

¿Cuáles son las ventajas y desventajas de las técnicas de

Biología Molecular?

¿Cuáles son las condiciones indispensables para surealización?

¿Cuándo es conveniente su solicitud?

HIV

HCV

CMV

CMV Cargaviral

EBV

EBV Cargaviral

Toxoplasmagondii

Mycobacte-riumtuberculosis

Chlamydiatrachomatis

Herpes simples-Enterovirus

-Varicela Zoster-Toxoplasma

gondii-Citomegalovirus-Mycobacterium

tubercolisis-Epstein Barr

Indicación clínica

Diagnóstico-Recién nacido de madreHIVpositiva-Primoinfección sintomática-Contacto de alto riesgo-Resultados serológicosIndeterminados

-Inicio de tratamiento-Evaluación de tratamiento-Cambios de tratamiento

-Evaluación de Resistencia

Seguimiento:

Indicación clínica

Diagnóstico-Infección aguda-Serología indeterminada-Control final de tratamiento

-Iniciación de tratamiento-Evaluación de tratamiento

Seguimiento

Indicación clínica

Pacientesinmunocomprometidos(IC)(Transplante, tumores,HIV).

Pacientesinmunocomprometidos(IC)(Transplante, tumores, HIV)

Pacientesinmunocomprometidos(síndromeslinfoproliferativos)

Pacientesinmunocomprometidos(síndromeslinfoproliferativos)

-Diagnóstico Prenatal

Diagnóstico:-Infecciones pulmonares yextrapulmonares.

-Enfermedades detransmisión sexual (ETS)

Indicación clínica

Diagnóstico- Infección del SNC- Infecciones en elhuéspedinmunocomprometido

- Infección del SNC- Infecciones en elhuéspedinmunocomprometido

Pronóstico ySeguimiento:

Inmunodeficiencia por HIV

Infecciones del SNC

Técnica

PCR Cualitativa:-De DNA proviral(Comercial o ”Homemade”Nested-PCR)

PCR Cuantitativas (*):-RT PCR (Amplicor-Roche,Cobas Amplicor, Taqman)-Nasba/Nuclisens(Biomerieux, NUCLISENSEASYQ HIV-1)-bDNA (Bayer, Versant)

-Medición fenotípica (sóloen Laboratorios dereferencia)-Medición Genotípica(secuenciación)

Técnica

PCR Cualitativa:-RT PCR Cualitativa(Amplicor-Roche, CobasAmplicor, Taqman)-NASBA (Biomerieux)-Nested RT PCRCualitativa (“Homemade”)

PCR Cuantitativas:-RT PCRCuantitativa(Amplicor-Roche, Cobas Amplicor,Taqman)-NASBA (Biomerieux)-bDNA (Bionmerieux)Genotipificación:-HCV INNO-LIPA (Bayer)-RFLP (Polimorfismo delongitud de fragmentos derestricción)

Técnica

PCR Cualitativas:-PCR (Comercial-Roche oNested-PCR“Homemade”)-Nasba pp67 (RNAm).-PCR cuantitativaAmplicor-Roche (CobasAmplicor)- PCR en tiempo real

(Roche, AppliedBiosystems)

PCR Cuantitativa:-Cobas AMPLICOR-Roche.- PCR en tiempo real(Roche, AppliedBiosystems)

PCR Cualitativas:-Nested-PCRCualitativa(“Home made”)PCR en tiempo real (Roche,Applied Biosystems)

PCR Cuantitativa:-PCR en tiempo real(Roche, AppliedBiosystems)

PCR Cualitativas:-PCR (“Homemade”)-PCR en tiempo real(Roche, AppliedBiosystems)

-PCR Cualitativa:(Comercial-Roche o “InHouse” Nested-PCR)-LCX (Comercial-Abbott)-PCR en tiempo real(Roche, AppliedBiosystems)

PCR Cualitativa-PCR (Comercial-Amplicor-Roche, Cobas-Amplicor)-LCX (Comercial-Abbott)

Técnica

PCR Cualitativa:Nested-PCRCualitativa (“Homemade”)-PCR en tiempo real(Roche, AppliedBiosystems)

PCR Cuantitativas:-PCR en tiempo (Roche,Applied Biosystems)

Muestra

5 a 10 ml de sangreentera con EDTA para laobtención de capa deleucocitos.

Plasma de sangre enteracon EDTA

Muestra

-Plasma de sangre conEDTA-Suero

-Plasma de sangre conEDTA-Suero

Muestra

Sangre entera con EDTA-Plasma

-Plasma

-Sangre entera conEDTA

-Plasma

-Plasma

-Líquido amniótico-Biopsias

-Tracto respiratorioinferior

-Muestrasgenitourinarias

Muestra

-Líquidocefalorraquídeo (LCR)-Biopsia

LCR

(*) Todas las técnicas de cuantificación tienen similar límite de detección, pero no puedenutilizarse alternativamente durante el seguimiento, por poseer diferentes metodologíasy no ser comparables entre sí.

Hepatitis

Otras patologías y situaciones especiales

HBV

Diagnóstico-Evaluación de situacionesespeciales en infeccionescrónicas

-Evaluación de tratamientoSeguimiento

PCR Cualitativa:-PCR (ComercialAmplicor) o (“Homemade”Nested-PCR)

PCR Cuantitativas:-PCR Cuantitativa(Cobasamplicor-Roche)

-Plasma de sangre enteracon EDTA-Suero

Plasma de sangre enteracon EDTA-Suero

17Mar - Abr 2006

¿Cuál es la perspectiva futura?Además de las mencionadas, se podrían realizar

técnicas de Biología Molecular en muchas otras situaciones dedifícil diagnóstico etiológico dentro de las enfermedadesinfecciosas. Ejemplo: Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiapneumoniae, Borrelia burgdorferi, Enterovirus, Helicobacterpylori, etc.

También tienen demostrada utilidad para resolverproblemas taxonómicos con rapidez y eficiencia. Ejemplo:Mycobacterium tuberculosis y otras Mycobacteriosis.

Significan un aporte incalculable en la detección másrápida de resistencia a antimicrobianos. Ejemplo: Resistencia ameticilina en Staphylococcus aureus, resistencia a rifampicinacomo marcador de multiresistencia en Mycobacteriumtuberculosis.

Son importantes herramientas para el correcto estudioepidemiológico de brotes nosocomiales.

La Genotipificación en algunas patologías posibilita elmejor conocimiento del pronóstico de las mismas. Ejemplo:HCV.

En conclusión, podríamos aplicar técnicas de BiologíaMolecular para la detección y cuantificación “en teoría” decualquiera de los agentes conocidos, pero la realidad es que elavance en las metodologías es mayor que el conocimiento delsignificado de los resultados obtenidos, es por ello, que esfundamental restringir su realización a las situaciones en querealmente está comprobada su utilidad clínica, epidemiológica.Debemos considerar también su realización en otrasespecialidades de la Medicina (Hematología, Oncología,estudios prenatales, Farmacogenética) y muchas otrassituaciones donde todavía nuestro conocimiento no essuficiente para reconocer las ventajas de su utilización.

Es decir, que las posibilidades presentes y futuras sontan infinitas como lo es la imaginación en busca del próximosiglo.

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