técnicas moleculares para el diagnóstico diferencial de...
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Técnicas moleculares para el diagnóstico diferencial de patógenos en organismos
acuáticos
Laboratorio de Referencia Análisis y Diagnóstico en Sanidad Acuícola
(LARADSA)
LARADSA
3
Muestreo aleatorio: Cuando una población es muestreada para determinar su estado de salud/enfermedad y/o prevalencia de un patógeno específico, el número de organismos muestreados está determinado por la prevalencia esperada del patógeno específico tomando en consideración los grados de confianza de una confidencia estadística.
FORMULA SEGUN CANNON Y ROE (2001)
Se
SeDNn
D ))()()(( / 12
111 1 ----@
a
4
Tamaño
de la
población
2%
5%
10%
20%
30%
40%
50%
50 50 35 20 10 7 5 2
100 75 45 23 11 9 7 6
250 110 50 25 11 9 8 7
500 130 55 26 11 9 8 7
1,000 150 55 27 11 9 9 8
1,500 140 55 27 11 9 9 8
2,000 145 60 27 11 9 9 8
4,000 145 60 27 11 9 9 8
10,000 145 60 27 11 9 9 8
>100,000 150 60 30 11 9 9 8
TAMAÑO DE LA POBLACION 4,000
NIVEL DE CONFIANZA 95%
SENSIBILIDAD 95%
PREVALENCIA ESPERADA 2%
TAMAÑO DE MUESTRA (n) 153
5
Muestreo no aleatorio.
En cualesquier otro evento, seleccionar 10 organismos vivos, que exhiban las señales clínicas típicas de la enfermedad en cuestión.
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Consideraciones de Muestreo
Toma de muestra: Tomar la muestra al amanecer o atardecer Seleccionar organismos de diferentes puntos del
estanque (compuerta de entrada, salida y medio). Fijación de muestra: Agregar cantidad suficiente de
solución fijadora especialmente en el hepatopancreas para evitar el hidrolizado de los órganos y/o tejidos aledaños.
No realizar corte longitudinal ventral
Envío de muestras
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Histología Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
TECNICAS DE DIAGNOSTICO
PCR
Hibridación
Histología
Cultivos Bacterianos
Actividades Enzimáticas
Hemaglutinación Y Técnicas
Relacionadas
Técnicas con Anticuerpos
RT-PCR
Anticuerpos
Que Genero bacteriano es: Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas, etc.
Que Especie de bacteria es: Vibrio algilolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, etc.
Que variedad Vibrio es: Vibrio cholerae
tipo I, Vibrio cholerae tipo II, etc.
Técnicas con anticuerpos
Método rápido de diagnóstico WSSV
Hibridación
1
DNA
Dr. Kary Mullis
1983
Problema Polimerasa
1986
Thermophilus aquaticus
1993
Premio Nobel
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
DNA pol
Transcriptasa
reversa
1. Pool camarones normales 1-9
2. Pool camarones normales 10-19
3. Pool camarones normales 20-29
4. Pool camarones normales 30-39
5. Pool camarones normales 40-49
6. Pool 9 camarones normales + 1 positivo
7. Pool 19 camarones normales + 1 positivo
8. Pool 29 camarones normales + 1 positivo
9. Pool 39 camarones normales + 1 positivo
10. Pool 49 camarones normales + 1 positivo
11. Control positivo kit diagxotics
12. Camarón inoculado wssv
Nota. Todos los camarones se sangraron por separado con 200µl
de anticoagulante + 100 de hemolinfa. De el total solo se tomaron
20 µl de hemolinfa de cada uno de los camarones sagrados.
100 pb
200 pb
multiplex
Ag
ua
ctx
hly
A
01
Marc
ad
or
de P
M
deg.
70 75 80 85 90 95
dF
/dT
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Cycle
5 10 15 20 25
Norm
. F
luoro
.
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Vibrio cholerae 01, todos los primers
01
cxtA
hlyA
01
cxtA
hlyA
PCR en tiempo real
1
2
3
4
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
Temperatura 60°C Tiempo 1 hora Primers 3 pares
25
Toma de muestra:
Consideraciones de Muestreo
Selección del tejido
26
, ,
, , , , ,
, ,
, ,
, , , , , , ,
, , ,
, , ,
Lab 1
, ,
, , ,
Lab 2
Positivo Negativo
27
Microarreglos
Fred Sanger
Secuenciación de ADN (1975)
preventivo
correctivo
dirigido no dirigido
Tipos de diagnostico
•Calidad de agua
•Cuentas de bacterias
•Presencia de virus en agua
•Calidad de agua •Cuentas de bacterias •Bacterias en organismos •Parásitos •Virus
Jorge Hernández López
Arturo Sánchez Paz
Daniel Eduardo Coronado Molina
Fernando Mendoza Cano
Trinidad Encinas García
Nancy Janeth Sau Acosta
Rosa Isela Vázquez Sánchez
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