td n° 1 electrophorèse. lélectrophorèse est – avec la chromatographie – la principale des...
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TD n° 1TD n° 1ElectrophorèseElectrophorèse
L’électrophorèse est – avec la chromatographie – la principale
des techniques utilisées en biologie pour la séparation et la
caractérisation des molécules.
Elle a quelques applications en chimie, mais est principalement
utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation
des protéines ou celle des acides nucléiques.
Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en
fonction de leur charge et pour des charges identiques, en
fonction de leur taille.
Principe d’Electrophorèse: Principe d’Electrophorèse:
Méthode la plus fréquemment utilisée pour Méthode la plus fréquemment utilisée pour séparerséparer des des
moléculesmolécules ionisées ionisées: : Acide aminé, Acide nucléique, protéinesAcide aminé, Acide nucléique, protéines. Les . Les
molécules se déplacent a une molécules se déplacent a une vitessevitesse déterminée par rapport a déterminée par rapport a
leur leur chargecharge sur leur sur leur massemasse. .
Les molécules Les molécules anioniquesanioniques (-) migrent vers l' (-) migrent vers l'anodeanode (+) et les (+) et les
molécules molécules cationiquescationiques (+) se déplacent vers la (+) se déplacent vers la cathodecathode (−). (−).
Application d’Electrophorèse :
déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de
déterminer leur masse molaire respective ;
d'évaluer le degré de purification d'une protéine ;
de séparer des protéines pour les révéler par la technique du
Western blot (réaction avec un ou des anticorps) ;
de séquencer l'ADN et de déterminer la taille de fragments
d'ADN ;
de séparer des acides nucléiques pour les analyser par la
technique du Northen blot (ARN) ou du Southern blot (ADN).
Différentes types d’ElectophorèseDifférentes types d’Electophorèse : :
nommées en fonction du type de support :nommées en fonction du type de support :
a. Electrophorèse sur papier ou acétate de cellulose:a. Electrophorèse sur papier ou acétate de cellulose:
Pour les Pour les petites moléculespetites molécules qui migrent a une qui migrent a une vitessevitesse
proportionnelleproportionnelle à leur à leur chargecharge sur le sur le supportsupport ( (hémoglobinehémoglobine). ).
b. Electrophorèse sur gel:b. Electrophorèse sur gel:
Permet de conjuguer la Permet de conjuguer la mobilité électrophorétiquemobilité électrophorétique à un effet à un effet
de de filtration sur gelfiltration sur gel, la , la taille des porestaille des pores limitant la limitant la vitessevitesse de de
migrationmigration. On utilise généralement des . On utilise généralement des gels d'agarosegels d'agarose ou de ou de
polyacrilamidepolyacrilamide qui se solidifient. qui se solidifient.
cc. Electrophorèse unidimensionnelle ou SDS-PAGE. Electrophorèse unidimensionnelle ou SDS-PAGE::
C’est la séparation des protéines en fonction de leurs C’est la séparation des protéines en fonction de leurs
poids moléculaire. les poids moléculaire. les protéinesprotéines déposées dans un puit déposées dans un puit
du gel au du gel au pôle négatifpôle négatif migrent vers le migrent vers le pôle positifpôle positif
d'autant plus d'autant plus rapidement qu'elles sont petites. rapidement qu'elles sont petites.
d. Electrophorèse unidimensionnelle: Iso-d. Electrophorèse unidimensionnelle: Iso-
Electro-Focalisation:Electro-Focalisation:
C’est la séparation des protéines en fonction de leurs C’est la séparation des protéines en fonction de leurs
charge Une charge Une protéinesprotéines non dénaturéenon dénaturée par le par le SDS SDS
possède une possède une chargecharge globaleglobale qui qui varie varie suivant le suivant le pHpH. .
e. Electrophorèse bi-dimentionnelle (2D-PAGE):e. Electrophorèse bi-dimentionnelle (2D-PAGE):
C’est la séparation des protéines en fonction de C’est la séparation des protéines en fonction de
leurs poids moléculaires et leurs charge .leurs poids moléculaires et leurs charge .
Les Les protéines protéines sont sont séparées par une séparées par une
électrophorèse IEFélectrophorèse IEF puis en puis en SDS-PAGESDS-PAGE. .
b. Gel d'électrophorèse:b. Gel d'électrophorèse:
Les gels de polyacrylamide peuvent être de deux types : Les gels de polyacrylamide peuvent être de deux types :
SDS-PAGE (Sodium dodécyl sulfate poly acrylamide gel SDS-PAGE (Sodium dodécyl sulfate poly acrylamide gel
elecrophoresis) ou Tris-Tricine. Les gels SDS PAGE sont utilisés elecrophoresis) ou Tris-Tricine. Les gels SDS PAGE sont utilisés
pour faire migrer des protéines, les gels Tris Tricine permettent de pour faire migrer des protéines, les gels Tris Tricine permettent de
visualiser des protéines de petite taille dont le nombre d'acide visualiser des protéines de petite taille dont le nombre d'acide
aminé est inférieur à 150 : les peptides. aminé est inférieur à 150 : les peptides.
Les gels d'agarose sont quant à eux utilisés pour faire Les gels d'agarose sont quant à eux utilisés pour faire
migrer des acides nucléiques.migrer des acides nucléiques.
A. Gel d'électrophorèse des protéines en conditions A. Gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantesdénaturantes
La technique du gel La technique du gel
d'électrophorèse en d'électrophorèse en
conditions dénaturantes : conditions dénaturantes :
(SDS-PAGE(SDS-PAGE) a été décrite ) a été décrite
par par Ulrich Laemmli en Ulrich Laemmli en
19701970
Le gel est coulé entre des plaques de verre fixées sur un Le gel est coulé entre des plaques de verre fixées sur un
support et un peigne est enchâssé entre ces plaques. support et un peigne est enchâssé entre ces plaques.
Après polymérisation du gel, le peigne est retiré formant Après polymérisation du gel, le peigne est retiré formant
ainsi des puits.ainsi des puits.
La taille et le nombre des dents des peignes sont variables La taille et le nombre des dents des peignes sont variables
ce qui permet de déposer des volumes allant de ce qui permet de déposer des volumes allant de 20 µL à 200µL 20 µL à 200µL
d'échantillon de protéines à séparer.d'échantillon de protéines à séparer.
Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont
placées dans une cuve d'électrophorèse.placées dans une cuve d'électrophorèse.
Le tampon d'électrophorèse conducteur (électrolytes) est mis Le tampon d'électrophorèse conducteur (électrolytes) est mis
dans la cuve et la migration s'effectue sous l'action d'un champ dans la cuve et la migration s'effectue sous l'action d'un champ
électrique : électrique :
Tampon d'électrophorèse : Tris 50 mM - Glycine 0,2 M - SDS Tampon d'électrophorèse : Tris 50 mM - Glycine 0,2 M - SDS
0,1% - pH 8,3 - 8,8 ;0,1% - pH 8,3 - 8,8 ;
Tris : nom commun du 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-Tris : nom commun du 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-
propanediol ;propanediol ;
Glycine : acide faible (forme zwitterion non chargé ou anion) ;Glycine : acide faible (forme zwitterion non chargé ou anion) ;
voltage : 100 V - 150 V. voltage : 100 V - 150 V.
Les échantillons de protéines dénaturées sont déposés dans Les échantillons de protéines dénaturées sont déposés dans
les puits. les puits.
Après migration, le gel est démoulé. Après migration, le gel est démoulé.
Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui
contient du méthanol et de l'acide acétique qui dénaturent de contient du méthanol et de l'acide acétique qui dénaturent de
manière irréversible les protéines dans les mailles du gel.manière irréversible les protéines dans les mailles du gel.
Les Les protéinesprotéines sont sont révélées révélées par une par une coloration coloration : par exemple : par exemple
avec le avec le bleu de Coomassie ou le nitrate d'argentbleu de Coomassie ou le nitrate d'argent (plus sensible). (plus sensible).
On obtient différentes bandes pour chaque
piste de la figure (la flèche indique le sens de
migration).
La masse molaire des protéines est
déterminée à l'aide de marqueurs qui sont des
protéines standards de masses molaires connues
(piste de droite).
Exemple de marqueurs :
myosine (205 kDa)
b galactosidase (116 kDa)
phosphorylase b (97,4 kDa)
albumine (66 kDa)
ovalbumine (45 kDa)
anhydrase carbonic(29 kDa)
Source: E. Jaspard (2004)
Tampon d'électrophorèse :Tampon d'électrophorèse :
TAE : Tris/Acétate 40mM - TAE : Tris/Acétate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8 EDTA 1 mM - pH 8
TBE : Tris/Borate 40mM - TBE : Tris/Borate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8EDTA 1 mM - pH 8
Tampon de charge : bleu Tampon de charge : bleu de bromophénol 0,02% - de bromophénol 0,02% - xylène cyanol 0,02% - glycérol xylène cyanol 0,02% - glycérol 3% - tampon TBE.3% - tampon TBE.
B. Gel d'électrophorèse d'ADNB. Gel d'électrophorèse d'ADN
Préparation du gelPréparation du gel
Réalisation du gel Réalisation du gel
d’agarose par dissolution à d’agarose par dissolution à
chaud de poudre d’agarose chaud de poudre d’agarose
dans un tampon TBE à pH dans un tampon TBE à pH
8.2 et refroidissement 8.2 et refroidissement
jusqu’à une température jusqu’à une température
voisine de 50°C.voisine de 50°C.
Préparation du moule Préparation du moule
pour couler le gel :pour couler le gel :
après avoir obturé les après avoir obturé les
deux extrémités du moule deux extrémités du moule
avec un scotch fort, placer le avec un scotch fort, placer le
moule sur une surface bien moule sur une surface bien
horizontale et disposer dans horizontale et disposer dans
les encoches prévues à cet les encoches prévues à cet
effet le peigne nécessaire à la effet le peigne nécessaire à la
réalisation des puits dans le réalisation des puits dans le
gel. gel.
Coulage du gel :Coulage du gel :
verser lentement le gel verser lentement le gel
dans la cuve sans dépasser le dans la cuve sans dépasser le
niveau supérieur des dents du niveau supérieur des dents du
peigne.peigne.
Laisser refroidir 30 mn Laisser refroidir 30 mn
environ avant d’enlever environ avant d’enlever
délicatement le peigne. Les délicatement le peigne. Les
puits sont alors prêts pour puits sont alors prêts pour
recevoir les dépôts d’ADN et le recevoir les dépôts d’ADN et le
scotch fermant la cuve peut-scotch fermant la cuve peut-
être enlevé.être enlevé.
Mise en place du gel dans la Mise en place du gel dans la
cuve : cuve :
les puits sont placés du côté les puits sont placés du côté
de la cathode et la cuve est de la cathode et la cuve est
remplie de tampon TBE remplie de tampon TBE
jusqu’au niveau supérieur du jusqu’au niveau supérieur du
gel.gel.
..
Préparation de l’ADNPréparation de l’ADN
Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendre Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendre
certaines précautions pour que les fragments ne se réassocient certaines précautions pour que les fragments ne se réassocient
pas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un choc pas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un choc
thermique à 65°c avant de le refroidir brutalement.thermique à 65°c avant de le refroidir brutalement.
Dilution et densification Dilution et densification
de l’ADN par une solution de l’ADN par une solution
de charge permettant que de charge permettant que
le dépôt s’enfonce bien au le dépôt s’enfonce bien au
fond de chaque puits. Cette fond de chaque puits. Cette
solution est colorée par du solution est colorée par du
bleu de bromophénol et bleu de bromophénol et
elle permettra de suivre elle permettra de suivre
l’avancement de l’avancement de
l’électrophorèse.l’électrophorèse.
Dépôt de l’ADN dans Dépôt de l’ADN dans
les puits et la migration les puits et la migration
se fait dans le gel.se fait dans le gel.
la cuve est mise la cuve est mise
sous tension pendant une sous tension pendant une
heure environ. heure environ.
Quand le front de Quand le front de
migration atteint migration atteint
l’extrémité du gel, on l’extrémité du gel, on
coupe le courant.coupe le courant.
Révélation des fragmentsRévélation des fragments : :
pendant la migration, il pendant la migration, il
faut préparer la solution pour faut préparer la solution pour
révéler les fragments d’ADN : révéler les fragments d’ADN :
il s’agit d’un colorant bleu il s’agit d’un colorant bleu
dans une solution tampon dans une solution tampon
dont on ajuste le pH à pH 5.2. dont on ajuste le pH à pH 5.2.
Les 2 colorants permettent Les 2 colorants permettent
de suivre la migration des de suivre la migration des
fragments d'ADN:fragments d'ADN:
la migration du bleu de la migration du bleu de
bromophénol est "comparable" bromophénol est "comparable"
à celle d'un fragment d'ADN de à celle d'un fragment d'ADN de
300 paires de base 300 paires de base
la migration du Xylène la migration du Xylène
cyanol est "comparable" à cyanol est "comparable" à
celle d'un fragment d'ADN de celle d'un fragment d'ADN de
4000 paires de base.4000 paires de base.
Le gel, toujours Le gel, toujours
sur son support, est sur son support, est
sorti de la cuve et sorti de la cuve et
placé dans un bac. On placé dans un bac. On
le recouvre alors de la le recouvre alors de la
solution de colorant solution de colorant
pendant 10 pendant 10
mn. mn.
La dernière opération La dernière opération
consiste à décolorer le gel consiste à décolorer le gel
par passage successif dans par passage successif dans
plusieurs bains d’eau plusieurs bains d’eau
déminéralisée. Les bandes déminéralisée. Les bandes
d’ADN conservent la d’ADN conservent la
coloration bleue et sont de coloration bleue et sont de
plus en plus visibles dans les plus en plus visibles dans les
heures qui suivent. On peut heures qui suivent. On peut
alors retirer le gel de son alors retirer le gel de son
support et le conserver support et le conserver
quelques jours à l’obscurité quelques jours à l’obscurité
dans un bac rempli d’eaudans un bac rempli d’eau
Détermination de la taille Détermination de la taille
d'un fragment d'ADN:d'un fragment d'ADN:
Gel d'électrophorèse sur Gel d'électrophorèse sur
agarose sur lequel on voit : agarose sur lequel on voit :
les marqueurs (ou échelle, les marqueurs (ou échelle,
""ladderladder") de longueur (en paires ") de longueur (en paires
de base) de fragments d'ADN de base) de fragments d'ADN
un fragment d'ADN inconnuun fragment d'ADN inconnu
La droite :La droite :
log (taille) = f(distance log (taille) = f(distance
de migration) permet de de migration) permet de
déterminer la taille en déterminer la taille en
paires de base d'un paires de base d'un
fragment d'ADN inconnu fragment d'ADN inconnu
(figure de droite).(figure de droite).
Exercice:Exercice:
Analyse du gel de la figure ci-Analyse du gel de la figure ci-contre :contre :
a/ De quels type a/ De quels type d'électrophorèse s'agit-il ?d'électrophorèse s'agit-il ?
b/ Calculer la taille du fragment b/ Calculer la taille du fragment d'ADN inconnu.d'ADN inconnu.