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TECHNIQUESTECHNIQUES
Principes et applications
Culture de TetrahymenaDonnées de base
Culture de TetrahymenaDonnées de base
• Température optimale: 28 °C
• Température minimale: environ 12-14 °C
• Température maximale: environ 31-32 °C (choc thermique réversible)
• Temps de génération: 2h30-4h15 (normalement 4h)
Culture de TetrahymenaMilieux de culture
Culture de TetrahymenaMilieux de culture
• Culture axénique: sans autres micro-organismes
• Milieu semi-défini• Source acides aminés: hydrolysat de protéine• Protéose, peptone, tryptone, lait• Source de vitamines: extrait de levure• Glucose• Sels: peu concentrés, maintien du pH• Na ou K, H2PO3
2-
Culture de TetrahymenaCulture stock
Culture de TetrahymenaCulture stock
• Température basse: 14°C• Milieu pauvre
• Pas de source de vitamines ou glucose• Peptone peu concentrée=> Doit utiliser beaucoup d’énergie/temps pour
synthétiser vitamines et autres
• Croissance lente• Repiquage moins fréquent
Culture de TetrahymenaCulture de conditionnement
Culture de TetrahymenaCulture de conditionnement
• Température presque optimale: 25°C
• Milieu riche• source de vitamines ou glucose• hydrolysats plus concentrées et variés
• Réadaptation progressive à des conditions de croissance rapide
Culture de TetrahymenaCulture de croissance
Culture de TetrahymenaCulture de croissance
• Température optimale: 28°C• Milieu riche
• source de vitamines ou glucose• hydrolysats plus concentrées et variés
• Agitation: meilleure oxygénation• Conditions de croissance rapide• Obtention de grandes quantités de cellules
Culture de TetrahymenaCulture massive
Culture de TetrahymenaCulture massive
• Température optimale: 28°C
• Milieu très riche• source de vitamines et glucose• lait comme source d'acides aminés
• Agitation: meilleure oxygénation
• Conditions de croissance rapide
• Obtention de très grandes quantités de cellules
Culture de TetrahymenaCulture en milieu défini
Culture de TetrahymenaCulture en milieu défini
• Milieu défini: [ ] exactes de toutes les composantes individuelles sont connues
• Température optimale: 28°C• Milieu
• Acides aminés• Vitamines• Glucose• Autres éléments (ac. gras, minéraux….)
• => Connaissance et contrôle des conditions
Culture de TetrahymenaMilieu minimal
Culture de TetrahymenaMilieu minimal
• Tris 10 mM + pH 7.6 + Glucose
• Milieu simple pour incorporation acides aminés marqués
• Pas de croissance
• Court terme
• "choc" => induisant une réponse ????
TetrahymenaConcentration des cellules
TetrahymenaConcentration des cellules
• Dispositif de concentration• Certaines manipulations requièrent des
concentrations de cellules non obtenues par des cultures de croissance
Si on a besoin de concentrer les cellules
TetrahymenaConcentration des cellules
TetrahymenaConcentration des cellules
Lang et Gauthier (1993)
TetrahymenaEnumération à l'hémacymètre
TetrahymenaEnumération à l'hémacymètre
• Détermination du nombre de cellules• Hémacymètre
• Normalement destiné à l'énumération des cellules du sang
2 cotés et 5 zones par coté
10 zones = 1 µL
Lamelle spéciale (coûteuse)
Cellules immobilisées (formaldéhyde)
Cellules cotés: supérieurs et gauches
http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/technical_resources/labtools/hemarefpf.html
TetrahymenaTraitements
TetrahymenaTraitements
• Exposition à choc thermique ou toxique• Cellules concentrées/diluées pour obtenir
conc. finale voulue• Tubes contenant le milieu de culture (selon
volume final voulu)+ toxique concentré --> conc. finale voulue
au temps = 0
+ cellules concentrées --> conc. finale voulue
+ N.p.o.: contrôle: volume identique dans chaque tube+ 1 tube sans produit toxique: solvant du toxique
TraitementsTraitements
• Incuber à T° voulue• Prélever aliquotes aux temps voulus -->
µtubes (1.5 ou 2 mL)• Centrifuger > 10 kRPM x 10 min -->
sédiment = cell.• Extraire les cell. en resuspendant dans soln
voulue§ SDS --> électro.
Electrophorèse (EGPA)Electrophorèse (EGPA)
• Séparation des protéines par EGPA-SDS• Protéines dénaturées: SDS et ßME + chauffage
• Charge uniforme + géométrie similaire séparation selon masse
Système triphasique• Tampon d'électrode: glycine• Gel de tassement: Cl- pH 6.8 (conc. PA faible)• Gel de séparation: Cl- pH8.8 (conc. PA forte)
==> échantillons volumineux peuvent être compactés pour donner une résolution supérieure
ElectrophoresePrincipe de la séparation
ElectrophoresePrincipe de la séparation
Gel de tassementGel de séparationIndicateur
de migration(Bleu de
briomophénol)
Directionde
migration
ElectrophorèseAnalyse des protéines synthétisées
ElectrophorèseAnalyse des protéines synthétisées
• Electrophorèse• Tassement• Séparation
• Fixation et Coloration• Ac. Acétique 10%• Bleu de Comassie (simple et sensible)• Argent (complexe mais très sensible)
• Buvardage ou Séchage + conservation
Buvardageprincipes
Buvardageprincipes
• Transférer à la surface d'une matrice solide
• Différentes matrices: nitrocellulose… PVDF, nylon.
• Capacité d'adsorption• Buvardage: transfert électrophorétique• Adsorption: forces hydrophobes, ioniques
• Méthanol. porosité de la matrice, durée et puissance du transfert
Transfert westernmécanisme
Transfert westernmécanisme
Direction demigration
Gel d'acrylamideMatrice solide(nitrocellulose)
ImmunodétectionImmunodétection
• Identification et détection d'une protéine spécifique
• Anticorps spécifique à la protéine d'intérêt
• Adsorption antigène d'intérêt sur la matrice
• Buvardage électrophorétique• Application directe ("dot blot")
Immunodétectionprécautions
Immunodétectionprécautions
• Blocage des sites inoccupés • Protéines: lait en poudre, albumine, collagene
(gélatine) => Ne contient pas antigène, anticorps, enzyme indicateur
• Prévention des liaisons non spécifiques• détergent doux: Tween (empêche adsorption Ag-Ab et
Ab-marice non spécifique)
ImmunodétectionImmunodétection
• Adsorption de l'anticorps sur l'antigène (primaire)
• Adsorption de l'anticorps secondaire conjugué avec enzyme sur l'antigène primaire (autres marqueurs fluorochromes)
• Détection de l'enzyme: Chromogénique
Chemiluminescent
Radioactif, fluorescent, etc.
Immunodétection: enzymesImmunodétection: enzymes
• Phosphatase alcaline• Sensible• Bon contraste en photo• Stable
• Peroxydase de raifort (HRP)• Assez sensible
• Durée limitée incubation (H2O2)
• Coloration +/- stable (H2O2)
• Contraste moyen
Electro ou ImmunodétectionComparer des patrons de migration
Electro ou ImmunodétectionComparer des patrons de migration
• Déposer même quantité de protéines ou protéines provenant d'une même quantité de cellules = difficile
• Base de comparaison: étalon interne• Protéine qui reste en quantité stable dans une
cellule• Étalons courants: actine, GAP
ImmunodétectionImmunodétection
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Marquage métabolique des protéinesMarquage métabolique des protéines
• Souvent on doit être capable de distinguer les protéines dont la synthèse est induite/ralentie par le traitement
• => Marquage métabolique:
• Exposition des cellules a des ac. Aminés marqués
• Extraction et séparation des protéines
• Autoradio- ou fluorographie