R. Jordano SalinasR. Jordano SalinasFacultad de VeterinariaFacultad de VeterinariaUniversidad de CUniversidad de Cóórdobardoba

VI CICLO DE CONFERENCIAS SOBRE VI CICLO DE CONFERENCIAS SOBRE ALIMENTACIALIMENTACIÓÓN FUERA DEL HOGARN FUERA DEL HOGAR

Técnicas Alternativas para el Análisis Microbiológico

de los Alimentos

Sumario

-- MicrobiologMicrobiologíía convencional o tradicionala convencional o tradicional..-- MMéétodos alternativos: clasificacitodos alternativos: clasificacióón, ventajas e n, ventajas e inconvenientes.inconvenientes.-- AutomatizaciAutomatizacióón de mn de méétodos convencionales: todos convencionales:

-- MMéétodo todo PetrifilmPetrifilm y sistema y sistema TEMPO.TEMPO.-- PetrifilmPetrifilm Series 2000 como posible mSeries 2000 como posible méétodo todo

rráápido de recuento de pido de recuento de coliformescoliformes en alimentosen alimentos-- MMéétodos rtodos ráápidos (pidos (BactometerBactometer))-- MMéétodos muy rtodos muy ráápidos (sistema pidos (sistema VIDASVIDAS))-- Conclusiones.Conclusiones.

A)A) MMÉÉTODOS BASADOS EN EL DESARROLLO DE UFC EN TODOS BASADOS EN EL DESARROLLO DE UFC EN MEDIOS SMEDIOS SÓÓLIDOS:LIDOS:

-- Se fundamentan en el desarrollo de una colonia visible a Se fundamentan en el desarrollo de una colonia visible a partir de una unidad viable (UFC).partir de una unidad viable (UFC).

B) MB) MÉÉTODOS DE DILUCITODOS DE DILUCIÓÓN EN TUBO (NMP):N EN TUBO (NMP):

-- DetecciDeteccióón de crecimiento mediante turbidez, produccin de crecimiento mediante turbidez, produccióón n de de áácido y / o gas. cido y / o gas.

Microbiología Tradicional

Ventajas:Ventajas:Sensibilidad.Sensibilidad.Simplicidad (fSimplicidad (fáácil interpretacicil interpretacióón).n).Bajo coste del equipo que se precisa.Bajo coste del equipo que se precisa.

Inconvenientes:Inconvenientes:Demora en la obtenciDemora en la obtencióón de datos.n de datos.Laboriosidad.Laboriosidad.Requiere evaluar el tamaRequiere evaluar el tamañño de la muestra.o de la muestra.Bajo valor de pruebas aisladas (se requiere: Bajo valor de pruebas aisladas (se requiere:

determinacideterminacióón n regular y conocimiento de la regular y conocimiento de la variacivariacióón normal de la poblacin normal de la poblacióón microbiana).n microbiana).

Métodos convencionales o tradicionales

IImplantacimplantacióón del n del Sistema APPCC Sistema APPCC en las industrias en las industrias alimentarias.alimentarias.

UtilizaciUtilizacióón de planes de muestreo basados en la n de planes de muestreo basados en la estadestadíística que requieren analizar un stica que requieren analizar un GRAN NGRAN NÚÚMERO MERO DE MUESTRAS.DE MUESTRAS.

Necesidad de obtener Necesidad de obtener RESULTADOS CON LA RESULTADOS CON LA MAYOR INMEDIATEZMAYOR INMEDIATEZ posible.posible.

AplicaciAplicacióón de las n de las MEDIDAS CORRECTORASMEDIDAS CORRECTORASnecesarias con necesarias con PRONTITUDPRONTITUD y ahorro de recursos. y ahorro de recursos.

Métodos alternativos: necesidad

1. 1. PrecisiPrecisióónn2. 2. ResoluciResolucióónn3. 3. Facilidad Facilidad de usode uso4. 4. RRáápida generacipida generacióón de datosn de datos5. 5. AceptabilidadAceptabilidad yy validacivalidacióónn internacionalinternacional6.6. Coste Coste analanalíítico y tico y amortizaciamortizacióónn de la instrumentacide la instrumentacióónn

7. Disponibilidad de 7. Disponibilidad de espacioespacio8. Soporte del proveedor y 8. Soporte del proveedor y mantenimiento mantenimiento ttéécnicocnico9.9. VersatilidadVersatilidad y posibilidad de evoluciy posibilidad de evolucióónnEn conclusiEn conclusióón el mn el méétodo elegido debe sertodo elegido debe ser::

1. 1. FiableFiable2. 2. EficazEficaz3. De 3. De Costes EquilibradosCostes Equilibrados

Métodos alternativos: necesidad

Métodos alternativos: clasificación

Los mLos méétodos alternativos a la todos alternativos a la MicrobiologMicrobiologíía tradicional pueden a tradicional pueden agruparse en 3 grupos o categoragruparse en 3 grupos o categoríías*:as*:

1.Automatizaci1.Automatizacióón de Mn de Méétodostodos Convencionales. Convencionales.

2. M2. Méétodos Rtodos Ráápidos.pidos.

3. M3. Méétodos Muy Rtodos Muy Ráápidos.pidos.

* Barcina, Mora y Herrera (1989)* Barcina, Mora y Herrera (1989)

Métodos alternativos : clasificación

1. Automatizaci1. Automatizacióón de Mn de Méétodos Convencionales.todos Convencionales.Ventajas:Ventajas:

ReducciReduccióón del uso de material y del n del uso de material y del tiempo necesario para prepararlo.tiempo necesario para prepararlo.

Incremento del nIncremento del nºº de muestras que de muestras que pueden analizarse (en comparacipueden analizarse (en comparacióón n con el mcon el méétodo esttodo estáándar en placas).ndar en placas).

Métodos alternativos: clasificación

1. 1. AutomatizaciAutomatizacióónn de de MMéétodostodos ConvencionalesConvencionales..Inconvenientes:Inconvenientes:

En general, no se reduce En general, no se reduce significativamente el tiempo preciso significativamente el tiempo preciso para para completar cada ensayo.completar cada ensayo.

No obstante, No obstante, PetrifilmPetrifilm Series 2000 Series 2000 (coliformes) y sistema (coliformes) y sistema TEMPOTEMPO (levaduras (levaduras y mohos) proporcionan y mohos) proporcionan resultados resultados en en menos tiempo.menos tiempo.

Los productos Los productos PetrifilmPetrifilm constan de 2 pelconstan de 2 pelíículas o culas o llááminas plminas pláásticas recubiertas: la inferior con todos sticas recubiertas: la inferior con todos los elementos nutritivos necesarios para el los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de los microorganismos; la superior con crecimiento de los microorganismos; la superior con agentes agentes gelificantesgelificantes..

Una rejilla directamente impresa en la pelUna rejilla directamente impresa en la pelíícula cula inferior facilita la lectura.inferior facilita la lectura.

La metodologLa metodologíía de siembra de las placas a de siembra de las placas PetrifilmPetrifilmes simple (3 pasos ).es simple (3 pasos ).

Petrifilm: principio y protocolo estándard

PRESENTACIONES COMERCIALES :PRESENTACIONES COMERCIALES :

-- PetrifilmPetrifilm Aerobios.Aerobios.

-- PetrifilmPetrifilm ColiformesColiformes..

-- PetrifilmPetrifilm Series 2000.Series 2000.

-- PetrifilmPetrifilm Levaduras y mohos.Levaduras y mohos.

-- PetrifilmPetrifilm EnterobacteriaceaeEnterobacteriaceae. .

-- PetrifilmPetrifilm E. E. colicoli / / coliformescoliformes..

-- PetrifilmPetrifilm Alta Sensibilidad para Alta Sensibilidad para ColiformesColiformes..

-- PetrifilmPetrifilm StaphStaph Express (sistema de recuento). Express (sistema de recuento).

Petrifilm

- PETRIFILM:(Aerobios)

- PETRIFILM:(Coliformes)

- PETRIFILM Series 2000

(Recuento Rápido de Coliformes)

- PETRIFILM :

(Levaduras y Mohos)

ProtocoloProtocolo . 1:. 1: inoculaciinoculacióónn y y difusidifusióónn (muestra/1ml)(muestra/1ml)Petrifilm

ProtocoloProtocolo. 2:. 2: incubaciincubacióónn a la Ta la Tªª apropiadaapropiada

Petrifilm

____________________________________________________________

Petrifilm Horas Temperatura(ºC) ____________________________________________________________

Bacterias Aerobias 48±2 30±1

Enterobacteriaceae 24±2 35±1 or 37±1

Coliformes 24±2 35±1 or 37±1

E. coli / coliformes según lo indicado en cada método

Levaduras & Mohos 72-120 25

Alta sensibilidad (coliformes) 24±2 32-35

Series 2000 (coliformes) 24±2 35±1

S. aureus (S. express) 24±2 37±1

____________________________________________________________Fuente: 3MTM Petrifilm TM Plates

Rango de tiempo y temperatura de incubación para los microorganismos

ProtocoloProtocolo. 3:. 3: recuentorecuento de de laslas coloniascolonias

PetrifilmPetrifilm

Para su utilización en el análisis de alimentos, los métodos alternativos deben reunir los requisitos siguientes:

RRáápida generacipida generacióón de datos.n de datos.

Solidez para el anSolidez para el anáálisis de rutina.lisis de rutina.

PrecisiPrecisióón y exactitud.n y exactitud.

Viabilidad tViabilidad téécnica.cnica.

AceptaciAceptacióón in internacional.nternacional.

Validación oficial de los métodos alternativos:

SISTEMA APISISTEMA API

Organización Oficial Alimento / Producto Petrifilm_________________________________________________________

AOAC Leche (cruda y pasterizada)A, C(Association of Official Analytical Chemists) Productos lácteos A, C, HSC

Alimentos (todos) A, C, EC&C, Y&M

AFNOR (France) Alimentos (todos)* A, EC, EC&C, C, EN ,HSCNMKL (Nordic Committee of Food Analysis) Alimentos (todos) A, C, EC&CVDIA (Victorian Dairy industry Authority) Leche y derivados A, CHPB (Health Protection Branch, Canada) Alimentos & ingredientes A, C, EC&C,Y&M,

Productos lácteos C, HSCAves, carnes, mariscos EC, C

•No validado para crustáceos crudos en C (como comparación con VRBLy MPN ) y productos del cerdo procesados en C (comparación con NMP) Fuente: 3MTM PetrifilmTM Plates.A: aerobios, C: coliformes, HSC: alta sensibilidad coliformes, EC&C: E. coli y coliformes, Y&M:

ValidaciValidacióón oficial de productosn oficial de productos PetrifilmPetrifilm

TEST PRESUMPTIVO :TEST PRESUMPTIVO : TEST CONFIRMATIVO :TEST CONFIRMATIVO :(10, 12, 14 h)(10, 12, 14 h) (24 h)(24 h)

Discretas zonas amarillasDiscretas zonas amarillas Colonias asociadas con burbujas Colonias asociadas con burbujas ((áácido)cido) (gas)(gas)

Petrifilm Series 2000 como posible métodorápido de recuento de coliformes en alimentos

•• Priego R., Medina L.M., R. Jordano. 2000. Priego R., Medina L.M., R. Jordano. 2000. Evaluation of Evaluation of PetrifilmPetrifilm Series 2000 as a possible Series 2000 as a possible rapid method to count coliforms in foods. rapid method to count coliforms in foods. JJ. Food . Food ProtProt., 63(8): 1137., 63(8): 1137--1140.*1140.*

________________________________________________________________________________√√ ÍÍndicendice de de ImpactoImpacto:: 1,8201,820√√ PosiciPosicióónn en el en el listadolistado:: 7/947/94√√ SituaciSituacióónn porpor cuartilescuartiles:: 11ºº

________________________________________________________________________________________________________________________

LotesLotes de de alimentosalimentos::LecheLeche crudacruda (n = 5)(n = 5)EmbutidoEmbutido fresco (n = 5)fresco (n = 5)JudJudííasas verdesverdes congeladascongeladas (n = 5)(n = 5)Carne Carne picadapicada (n = 5)(n = 5)HuevosHuevos (n = 5)(n = 5)ProductoProducto de de pastelerpastelerííaa (n = 5)(n = 5)

TTéécnicascnicas de de cultivocultivo:: TiempoTiempo (h):(h): TTªª ((ººC):C):PetrifilmPetrifilm Series 2000 (3M)Series 2000 (3M) 10, 12, 14h (10, 12, 14h (presuntivopresuntivo) 35) 35±±11ººCC

24h (24h (confirmativoconfirmativo) ) 3131±±11ººCCRecuentoRecuento en VRBA (en VRBA (OxoidOxoid)) 24 h24 h 3131±±11ººCC

________________________________________________________________________________________________________________________

Material y Material y MMéétodostodos::

________________________________________________________________________________________________________________________

LotesLotes PetrifilmPetrifilm VRBAVRBA(log UFC/g)(log UFC/g) (log UFC/g(log UFC/g

________________________________________________________________________________________________________________________________________________

LecheLeche crudacruda 5,73 (0,19)5,73 (0,19)ªª 5,71 (0,19)5,71 (0,19)

EmbutidoEmbutido fresco fresco 4,27 (0,06)4,27 (0,06) 3,63 (0,07)3,63 (0,07)

JudJudííasas verdesverdes congeladascongeladas 3,70 (0,11)3,70 (0,11) 3,38 (0,18)3,38 (0,18)

Carne Carne picadapicada 5,92 (0,13)5,92 (0,13) 4,30 (0,48)4,30 (0,48)

HuevosHuevos 3,09 (0,15)3,09 (0,15) 2,81 (0,28)2,81 (0,28)

ProductoProducto pastelerpastelerííaa 3,29 (0,08)3,29 (0,08) 2,67 (0,34)2,67 (0,34)

________________________________________________________________________________________________________________________

ªª MMedia (SD)edia (SD)

ResultadosResultados::

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

log u fc/ g

muest r a 1 muest r a 2 muest r a 3 muest r a 4 muest r a 50

0,51

1,52

2,53

3,54

log ufc/ g

muest ra 1 muest r a 2 muest r a 3 muest r a 4 muest r a 5

0

1

2

3

4

5

log ufc/ g

muest r a 1 muest r a 2 muest r a 3 muest r a 4 muest r a 5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

log ufc/ g

muest r a 1 muest r a 2 muest r a 3 muest r a 4 muest r a 5

0

12

3

4

5

67

log ufc/ g

muest r a 1 muest r a 2 muest ra 3 muest r a 4 muest r a 50

1

2

3

4

5

6

7

log ufc/ g

muest r a 1 muest r a 2 muest r a 3 muest r a 4 muest r a 5

VRBA

Petrifilm

COMPARACICOMPARACIÓÓN ENTRE LOS RECUENTOS OBTENIDOS EN N ENTRE LOS RECUENTOS OBTENIDOS EN PETRIFILMPETRIFILM Y CON EL MY CON EL MÉÉTODO TRADICIONAL (VRBA)TODO TRADICIONAL (VRBA)

VRBA (log ufc/g)

Pet

rifilm

Ser

ies

2000

(log

ufc

/g)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0

r=0'860

ElEl ananáálisis estadlisis estadíístico de los recuentos obtenidos en stico de los recuentos obtenidos en PetrifilmPetrifilm Series 2000 y en VRBA, en el grupo de seis lotes de Series 2000 y en VRBA, en el grupo de seis lotes de alimentos mostralimentos mostróó un coeficiente de correlaciun coeficiente de correlacióón (n (rr) = 0,860 .) = 0,860 .

________________________________________________________________________________________________________________________

Criterio Criterio PetrifilmPetrifilm vsvsmicrobiolmicrobiolóógicogico convencional convencional ªª

________________________________________________________________________________________________________________________

Coeficiente correlaciCoeficiente correlacióón:n: Bacterias AerobiasBacterias Aerobias 0.8970.897

ColiformesColiformes 0.8610.861

Levaduras & MohosLevaduras & Mohos 0.9810.981

________________________________________________________________________________________________________________________ªª ComparaciComparacióón de valores medios obtenidos en 6 alimentos: leche pasterizada,n de valores medios obtenidos en 6 alimentos: leche pasterizada,helado de yogur, huevos, carne picada, fresas frescas y judhelado de yogur, huevos, carne picada, fresas frescas y judíías verdes congeladas.as verdes congeladas.

Fuente:Fuente: Jordano et al. (1995).Jordano et al. (1995).

Comparación estadística en 6 alimentos usando Petrifilm y mediosconvencionalesª

________________________________________________________________________________________________________________________LoteLote TiempoTiempo de de incubaciincubacióónn (h)(h) PetrifilmPetrifilm (log UFC/g) (log UFC/g) (%)(%)________________________________________________________________________________________________________________________________________________LecheLeche CrudaCruda 1212 5,66 (0,15)5,66 (0,15) 9999

2424 5,73 (0,19)5,73 (0,19) 100100

EmbutidoEmbutido Fresco Fresco 1212 4,04 (0,05)4,04 (0,05) 9595

2424 4,27 (0,06)4,27 (0,06) 100100

JudJudííasas VerdesVerdes C.C. 1212 3,47 (0,12)3,47 (0,12) 9494

2424 3,70 (0,11)3,70 (0,11) 100100

Carne Carne PicadaPicada 1212 5,85 (0,14)5,85 (0,14) 9999

2424 5,92 (0,13)5,92 (0,13) 100100

HuevosHuevos 1212 3,02 (0,14)3,02 (0,14) 9797

2424 3,09 (0,15)3,09 (0,15) 100100

ProductoProducto PastelerPastelerííaa 1212 3,24 (0,08)3,24 (0,08) 9999

2424 3,29 (0,08)3,29 (0,08) 100100--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

ResultadosResultados::

Huevos Judías Verdes Embutido P. Pastelería Carne P. Leche Cruda

--Los recuentos tomados a las 12 y 14 h tienen una Los recuentos tomados a las 12 y 14 h tienen una gran similitud con los registrados a las 24 h.gran similitud con los registrados a las 24 h.

--En los diferentes lotes analizados los porcentajes En los diferentes lotes analizados los porcentajes registrados a las 10 h representan aproximadamente registrados a las 10 h representan aproximadamente el 90% del total confirmado a las 24 h.el 90% del total confirmado a las 24 h.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

24 h

14 h

12 h

10 h

HORAS DE INCUBACIÓN

LOG

UFC

/g

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

10h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h

y=0.884+0.032*x+eps

Carne PicadaLeche CrudaEmbutido FrescoJudías Verdes Congel. Producto de PasteleríaHuevos

EEl anl anáálisis de regresilisis de regresióón muestra una recta cuya pendiente n muestra una recta cuya pendiente es pres práácticamente nula (b = 0,032) lo que pone de manifiesto cticamente nula (b = 0,032) lo que pone de manifiesto la proximidad de los recuentos presuntivos con los la proximidad de los recuentos presuntivos con los confirmativos.confirmativos.

•• Sistema Sistema TEMPOTEMPO: t: téécnica cnica miniaturizada y automatizada miniaturizada y automatizada basada en NMPbasada en NMP

Marcadores:Marcadores:Aerobios mesAerobios mesóófilos filos EnterobacteriasEnterobacteriasColiformes totales Coliformes totales Coliformes fecalesColiformes fecalesE. coliE. coliOtros: L&M Otros: L&M ……

•• Sistema Sistema TEMPO TEMPO : principio: principio

MMéétodo basado en NMP: 3 series de todo basado en NMP: 3 series de 16 tubos miniaturizados16 tubos miniaturizados

Lectura por fluorescencia. Lectura por fluorescencia.

1. El lector cuenta pocillos + en rangos 1. El lector cuenta pocillos + en rangos de diluciones.de diluciones.2. El algoritmo interpreta el recuento 2. El algoritmo interpreta el recuento con tabla NMPcon tabla NMP3. Se realiza el informe en NMP/g 3. Se realiza el informe en NMP/g óó mlml..

DeterminaciDeterminacióón de Marcadoresn de Marcadores: t: téécnica cnica tradicional frente a sistema tradicional frente a sistema TEMPOTEMPO________________________________________________________________________________Marcador Marcador Tradicional Tradicional vs.TEMPOvs.TEMPO AhorroAhorro

(h)(h) (h)(h) (h) (h) __________________________________________________________________________________________

Aerobios Aerobios mesmesóófilosfilos 7272 4040 3232

EnterobacteriasEnterobacterias 2424 2424 --

ColiformesColiformes totalestotales 2424 2424 --

E. E. colicoli 2424 2424 --______________________________________________ ______________________________________________ FuenteFuente: XII : XII SimposiumSimposium biobio MMéérieuxrieux (Madrid, 2006)(Madrid, 2006)

Métodos alternativos: clasificación

-- MMéétodos Rtodos Ráápidos: pidos: ImpedanciaImpedanciaFacilitan resultados en 6Facilitan resultados en 6--12 horas.12 horas.

-- Basado en la detecciBasado en la deteccióón de la actividad metabn de la actividad metabóólica en un lica en un medio de cultivo.medio de cultivo.

-- Las molLas molééculas del medio elculas del medio elééctricamente neutras o ctricamente neutras o ddéébilmente ionizadas bilmente ionizadas numerosas molnumerosas molééculas mculas máás peques pequeññas as (carga y movilidad el(carga y movilidad elééctrica mctrica máás elevada).s elevada).

--Los cambios de impedancia se detectan cuando la Los cambios de impedancia se detectan cuando la concentraciconcentracióón microbiana excede de un umbral determinado.n microbiana excede de un umbral determinado.

-- El tiempo que se precisa El tiempo que se precisa Tiempo de DetecciTiempo de Deteccióónn(inversamente proporcional al recuento total). (inversamente proporcional al recuento total).

-- Determinaciones: marcadores (aerobios, Determinaciones: marcadores (aerobios, coliformescoliformes, , enterobacteriasenterobacterias, L&M), BAL, predicci, L&M), BAL, prediccióón de vida n de vida úútil.til.

Métodos rápidosIMPEDANCIMETRIMPEDANCIMETRÍÍAA

(Medida de la Impedancia): (Medida de la Impedancia):

Sistemas de Sistemas de impedimetrimpedimetrííaa disponibles:disponibles:________________________________________________________________________________________________________

RabitRabit BactometerBactometer MalthusMalthus 20002000 BactracBactrac________________________________________________________________________________________________________CCéélulas de Medida:lulas de Medida:materialmaterial propileno polipropileno Cristal propileno polipropileno Cristal óóptimo propilenoptimo propilenovolumenvolumen 10ml10ml 2x8ml (mod.) 8/100ml 10/100ml2x8ml (mod.) 8/100ml 10/100mlusouso reutilizable reutilizable úúnico uso reutilizable reutilizablenico uso reutilizable reutilizableElectrodosElectrodos acero acero inoxinox.. acero acero inoxinox.. platino acero platino acero inoxinox..

ConfiguraciConfiguracióónn 16x3216x32 4x1284x128 5x2405x240 4x404x40

MedidasMedidas CoCo ImIm, , CoCo, , CaCa CoCo CoCo

FrecuenciaFrecuencia (corriente)(corriente) 21 21 kHzkHz 1,2 1,2 kHzkHz 10 10 kHzkHz 1,0 1,0 kHzkHz

Temperatura Temperatura (precisi(precisióón) n) ±± 0,0050,005 ±± 0,1 0,1 ±± 0,006 0,006 ±± 0,1 0,1

TemperaturaTemperatura (rango)(rango) Amb.Amb.--55 855 8--5555 44--56 Amb.56 Amb.--6565________________________________________________________________________________________________________CoCo: conductancia : conductancia -- ImIm: impedancia : impedancia -- CaCa: : capacitanciacapacitanciaFuenteFuente: : BlivetBlivet (2000)(2000)

RESULTADOS EN HORAS RESULTADOS EN HORAS IMPEDANCIAIMPEDANCIA

MUESTRAS ANALIZADAS EN MUESTRAS ANALIZADAS EN MMÓÓDULOS CON MEDIOS DE CULTIVO AL EFECTODULOS CON MEDIOS DE CULTIVO AL EFECTO

LOS CAMBIOS DE CONDUCTIVIDAD QUE SE PRODUCEN EN EL MEDIO DE CRECLOS CAMBIOS DE CONDUCTIVIDAD QUE SE PRODUCEN EN EL MEDIO DE CRECIMIENTO IMIENTO SE MIDEN A SE MIDEN A INTERVALOS DE TIEMPO (a mayor carga bacteriana menor tiempo de dINTERVALOS DE TIEMPO (a mayor carga bacteriana menor tiempo de deteccieteccióón)n)

LA MEDIDA DE LA IMPEDANCIA LA MEDIDA DE LA IMPEDANCIA DETECTA PEQUEDETECTA PEQUEÑÑAS VARIACIONES ELAS VARIACIONES ELÉÉCTRICAS EN EL PASO DE CTRICAS EN EL PASO DE CORRIENTE ALTERNA DEBIDO AL CRECIMIENTO MICROBIANO (antes de la CORRIENTE ALTERNA DEBIDO AL CRECIMIENTO MICROBIANO (antes de la visualizacivisualizacióón de UFC) n de UFC)

RECUENTO RRECUENTO RÁÁPIDO POR IMPEDANCIA (BACTOMETER)PIDO POR IMPEDANCIA (BACTOMETER)

SIMULTSIMULTÁÁNEAMENTE INCUBADAS Y LENEAMENTE INCUBADAS Y LEÍÍDAS (6DAS (6’’))

MUESTRAMUESTRA(25 g)(25 g)

DILUCIDILUCIÓÓN 1/10N 1/10

INCUBACIINCUBACIÓÓB:B:TTªª y IEMPO SEGy IEMPO SEGÚÚN N MICROORGANISMOMICROORGANISMO

Recuento rRecuento ráápido de microorganismos por pido de microorganismos por impedancia (impedancia (BactometerBactometer))

SIEMBRA: MEDIO DE SIEMBRA: MEDIO DE CULTIVO ESPECCULTIVO ESPECÍÍFICOFICO

AGUA DE PEPTONA 0,1%AGUA DE PEPTONA 0,1%(225 ml)(225 ml)

0,2 ml

DeterminaciDeterminacióón de microorganismos por impedancian de microorganismos por impedancia ((BactometerBactometer))

____________________________________________________________________________________________________________

MicroorganismoMicroorganismo Tradicional Tradicional vs. vs. BactometerBactometer AhorroAhorro(h)(h) (h)(h) (h)(h)

____________________________________________________________________________________________________________

EnterobacteriasEnterobacterias 2424 33--55 2121--1919

ColiformesColiformes 2424 44--17 17 2020--77

BALBAL 48 48 22--1212 4646--3232

__________________________________________________________________________________________________________________________Fuente: Fuente: PriegoPriego FernFernáández (2006)ndez (2006)

Métodos alternativos : clasificación

-- MMéétodos Muy Rtodos Muy Ráápidos: pidos: sistema Vidassistema VidasPermiten obtener resultados en Permiten obtener resultados en

menos de una hora.menos de una hora.

Sistema Sistema VIDASVIDAS ((inmunoensayoinmunoensayo automatizado) automatizado)

-- VisualizaciVisualizacióón de la reaccin de la reaccióón entre un n entre un AgAg y su y su correspondiente correspondiente AcAc..

-- El sistema de detecciEl sistema de deteccióón final es por reaccin final es por reaccióón de n de fluorescencia medida a 450 fluorescencia medida a 450 nmnm..

-- Permite detectar: Permite detectar: E. E. colicoli O157:H7, O157:H7, ListeriaListeria sppspp.. ((L. L. monocytogenesmonocytogenes), ), CampylobacterCampylobacter sppspp., ., SalmonellaSalmonella sppspp. y . y enterotoxinaenterotoxina estafilocestafilocóócicacica..

-- Facilita resultados en 45Facilita resultados en 45--80 minutos (lectura del 80 minutos (lectura del testtest).).

Métodos muy rápidos

Sistema mini-VIDAS

Un ensayo inmunoenzimUn ensayo inmunoenzimáático detecta espectico detecta especííficamente los Ag ficamente los Ag de determinados patde determinados patóógenos mediante el mgenos mediante el méétodo ELFA*todo ELFA*

-- Cada ensayo utiliza: Cono desechable (fase sCada ensayo utiliza: Cono desechable (fase sóólida y sistema de lida y sistema de pipeteopipeteo) y Cartucho (reactivos)) y Cartucho (reactivos)

**EnzymeEnzyme LinkedLinked FluorescentFluorescent AssayAssay

ReacciReaccióón tipo n tipo sandwichsandwich ::HidrHidróólisis del substrato lisis del substrato Producto fluorescente Producto fluorescente RFVRFV

CICLOS DEL CICLOS DEL SISTEMASISTEMA

AcAc en el interior en el interior del cono, del cono,

especespecííficos del ficos del microorgmicroorg. diana. diana

Muestra Muestra problemaproblema

CICLOS SECUENCIALES DE LAVADOCICLOS SECUENCIALES DE LAVADO

AcAc especespecííficos del ficos del microorgmicroorg. diana, . diana, conjugados a un conjugados a un

enzimaenzima

AcAc + Enzima+ Enzima

AgAg

AcAcENZIMAENZIMA

Residuos despuResiduos despuéés s del lavadodel lavadoOtros Otros

microorganismosmicroorganismos

ValidaciValidacióón del sistema n del sistema VidasVidas::________________________________________________________________________________________________________Organismo / PaOrganismo / Paííss SLMSLM ECOECO LMOIILMOII SET2SET2________________________________________________________________________________________________________

AOACAOACªª XX XX XX XX

AFNORAFNORbb / Francia/ Francia XX XX XX

NordvalNordval / Pa/ Paííses Nses Nóórdicosrdicos XX XX

HPBCHPBCcc / Canad/ Canadáá XX XX

EMMASEMMASdd / UK/ UK XX

ComitComitéé DINDINee / Alemania/ Alemania XX________________________________________________________________________________________________________ªª AsociaciAsociacióón Oficial de Qun Oficial de Quíímicos Analmicos Analííticosticosbb AsociaciAsociacióón Francesa de Normalizacin Francesa de Normalizacióónncc SecciSeccióón de Salud Pn de Salud Púública de Canadblica de Canadáádd ComitComitéé Europeo de Validaciones de MEuropeo de Validaciones de Méétodos Microbioltodos Microbiolóógicosgicosee Instituto AlemInstituto Alemáán de Normalizacin de Normalizacióónn

DeterminaciDeterminacióón de patn de patóógenos / toxinagenos / toxina::Sistema Sistema Vidas Vidas (medios y condiciones de cultivo)(medios y condiciones de cultivo)________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PatPatóógenos / Toxina genos / Toxina TiempoTiempo TTªª Medios de Cultivo / Medios de Cultivo / TestsTestsªª(h/m) (h/m) ((ººC) C)

________________________________________________________________________________________________________________________

S.S. TyphimuriumTyphimurium 3838b b //4545cc 3737--4242 RappaportRappaport, , SelenitoSelenito--cistinacistina, M/, M/Vidas SLMVidas SLM

E. E. colicoli O157:H7O157:H7 24 / 4524 / 45 4141--3737 TSB, TSB, McConkeyMcConkey / Vidas ECO/ Vidas ECO

L. L. monocytogenesmonocytogenes 48 / 7048 / 70 3030 FraserFraser / Vidas LMO II/ Vidas LMO II

EnterotoxinaEnterotoxina 8080 Vidas SET 2Vidas SET 2de de StaphylococcusStaphylococcus________________________________________________________________________________________________________________________

ªª bioMbioMéérieuxrieuxb b PreparaciPreparacióón de la muestra (n de la muestra (preenriquecimientopreenriquecimiento, enriquecimiento y , enriquecimiento y postenriquecimientopostenriquecimiento segsegúún el caso)n el caso)cc DetecciDeteccióón (lectura del n (lectura del testtest))

25 g MUESTRA + 225 ml 25 g MUESTRA + 225 ml AGUA PEPTONADAAGUA PEPTONADA

16 h/3716 h/37ººCC

10 ml RAPPAPORT10 ml RAPPAPORT

6h/426h/42ººCC

10 ml SELENITO10 ml SELENITO--CISTINACISTINA

6h/376h/37ººCC

10 ml CALDO M10 ml CALDO M

16h/4216h/42ººCC

10 ml CALDO M10 ml CALDO M

16h/4216h/42ººCC

CALENTAR EN BACALENTAR EN BAÑÑOO100100ººC/15 C/15 minmin

RESULTADO (+ RESULTADO (+ óó --) EN ) EN 45 45 minmin

0,1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

500 µl SalmonellaSalmonella sppspp. . (Vidas SLM)(Vidas SLM)

25 g MUESTRA + 225 ml CALDO 25 g MUESTRA + 225 ml CALDO TSB/NOVOBIOCINATSB/NOVOBIOCINA

6 h/416 h/41ººCC

9 ml CALDO 9 ml CALDO McCONKEYMcCONKEY

18h/3718h/37ººCC

RESULTADO (+ RESULTADO (+ óó --) EN 45 ) EN 45 minmin

CALENTAR EN BACALENTAR EN BAÑÑOO100100ººC/15 C/15 minmin

1 ml

1 ml

500 µl E. E. colicoli O157 H:7O157 H:7(Vidas ECO)(Vidas ECO)

25 g MUESTRA + 225 ml 25 g MUESTRA + 225 ml CALDO FRASERCALDO FRASER

24 h/3024 h/30ººCC

10 ml CALDO FRASER10 ml CALDO FRASER

24h/3024h/30ººCC

RESULTADO (+ RESULTADO (+ óó --) EN 70 ) EN 70 minmin

1 ml

500 µl

L. L. monocytogenesmonocytogenes(Vidas LMO)(Vidas LMO)

PREPRE--EXTRACCIEXTRACCIÓÓNN

20 g MUESTRA + 20 ml TAMP20 g MUESTRA + 20 ml TAMPÓÓNN

TrituraciTrituracióón 3 n 3 minmin

EXTRACCIEXTRACCIÓÓN / FILTRACIN / FILTRACIÓÓNN

15 15 minmin/3000 /3000 rpmrpm

RESULTADO (+ RESULTADO (+ óó --) EN 80 ) EN 80 minmin

CALENTAMIENTO EN BACALENTAMIENTO EN BAÑÑOO

8080ººC/2 C/2 minmin

2 ml

500 µl

1 ml

EnterotoxinaEnterotoxina de de

StaphylococcusStaphylococcus(Vidas SET)(Vidas SET)

Tiempos de detecciTiempos de deteccióón de patn de patóógenos mediante el sistema genos mediante el sistema VidasVidas

____________________________________________________________________________________________________________

PatPatóógeno / Toxinageno / Toxina Tradicional Tradicional vs. vs. Sistema Sistema VidasVidas AhorroAhorro(h)(h) (h/(h/minmin)) (h)(h)

____________________________________________________________________________________________________________

SS. . TyphimuriumTyphimurium 9696 3939ªª/ 45/ 45bb 5656

E. E. colicoli O157:H7 O157:H7 4848 24 / 45 24 / 45 2323

L. L. monocytogenesmonocytogenes 96 96 48 / 7048 / 70 4747

EnterotoxinaEnterotoxina 33--55cc 8080 1,51,5--3,53,5estafilocestafilocóócicacica__________________________________________________________________________________________________________________________ªª PreparaciPreparacióón de la muestra (n de la muestra (preenriquecimientopreenriquecimiento, enriquecimiento y , enriquecimiento y postenriquecimientopostenriquecimiento))bb DetecciDeteccióón (lectura del n (lectura del testtest))C C TermonucleasaTermonucleasa

ConclusionesConclusiones::

Petrifilm Petrifilm Series 2000 (recuento rSeries 2000 (recuento ráápido de pido de coliformes) puede considerarse una coliformes) puede considerarse una alternativa valternativa váálida a la Microbiologlida a la Microbiologíía a tradicional. tradicional.

En el contexto del anEn el contexto del anáálisis microbiollisis microbiolóógico gico de los alimentos, la utilizacide los alimentos, la utilizacióón de los n de los sistemas sistemas Petrifilm Petrifilm y y TEMPO TEMPO (determinaci(determinacióón n de marcadores), y las tde marcadores), y las téécnicas cnicas BactometerBactometer y y VIDAS VIDAS (detecci(deteccióón de patn de patóógenos) pueden genos) pueden considerarse complementarias.considerarse complementarias.

Agradecimiento

-- JordanoJordano R., R., LLóópezpez M.C., M.C., RodrRodrííguezguez M.V., CM.V., Cóórdoba M.G., Medina L.M., M.J. rdoba M.G., Medina L.M., M.J. Barrios. 1995.Barrios. 1995.-- Comparison of Comparison of PetrifilmPetrifilm method to conventional methods for enumerating aerobic method to conventional methods for enumerating aerobic bacteria, coliforms, bacteria, coliforms, EscherechiaEscherechia coli and yeasts and coli and yeasts and moldsmolds in foodsin foods. . ActaActa MicrobiologicaMicrobiologica et et ImmunologicaImmunologica HungaricaHungarica, 42(3): 255, 42(3): 255--259.259.

-- L.M Medina L.M., R. L.M Medina L.M., R. JordanoJordano. 2000.. 2000.-- PetrifilmPetrifilm: an enhanced cultural technique, : an enhanced cultural technique, p. 1662p. 1662--1671. In R.K. Robinson, C.A. 1671. In R.K. Robinson, C.A. BattBatt, P.D. Patel (ed.), , P.D. Patel (ed.), EncyclopediaEncyclopedia of Food of Food Microbiology vol. 3. Academic Press Ltd., London.Microbiology vol. 3. Academic Press Ltd., London.

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-- PriegoPriego R., Medina L.M., R. R., Medina L.M., R. JordanoJordano. 2000.. 2000.-- Evaluation of Evaluation of PetrifilmPetrifilm series 2000 as a series 2000 as a possible rapid methods to count coliforms in foodspossible rapid methods to count coliforms in foods. J. Food Prot. 63(8): 1137. J. Food Prot. 63(8): 1137--1140.1140.

Referencias

A 3M Microbiology ProductsA 3M Microbiology ProductsA A bioMbioMéérieuxrieux EspaEspaññaa, S. A., S. A.

R. Jordano SalinasR. Jordano SalinasDpto. de BromatologDpto. de Bromatologíía y Tecnologa y Tecnologíía de los a de los Alimentos (Grupo MICAL)Alimentos (Grupo MICAL)Facultad de VeterinariaFacultad de VeterinariaUniversidad de CUniversidad de Cóórdobardobarjordano@uco.esrjordano@uco.es

Muchas Gracias Muchas Gracias ……