Prof. MsC. Moezio de Vasconcellos Costa Santos FilhoProf. MsC. Moezio de Vasconcellos Costa Santos FilhoMaceió - 2014Maceió - 2014

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTETÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

HISTÓRICOHISTÓRICO

Watson & CrickWatson & CrickEstrutura do Estrutura do

química do DNA química do DNA (1953)(1953)

Tecnologia DNA Tecnologia DNA recombinanterecombinanteInsulina recombinanteInsulina recombinante

(1978)(1978)

Ian WilmutIan Wilmutclonagem de mamíferoclonagem de mamífero

(1997)(1997)

HISTÓRICOHISTÓRICO

Prática clínicaPrática clínicaTestes genéticosTestes genéticos

(1995...)(1995...)

PGHPGHConhecer genoma H. sapiens Conhecer genoma H. sapiens

(1995-2003)(1995-2003)

TransgeniaTransgenia(1995...)(1995...)

→ → DNA Polimerase;DNA Polimerase;→ → RNA Polimerase;RNA Polimerase;→ → DNA Helicase;DNA Helicase;→ → Endonuclease de Restrição;Endonuclease de Restrição; (Sítio-específicas)(Sítio-específicas)

→ → DNA Ligase;DNA Ligase;→ → Taq DNA Polimerase;Taq DNA Polimerase;→ → Poli-A Polimerase;Poli-A Polimerase;→ → DNAses/Nucleases.DNAses/Nucleases. (sem sítios específicos)(sem sítios específicos)

ENZIMAS

PCR (PCR (Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction))

Fundamentos e objetivosFundamentos e objetivos

Amplificação exponencial de pequenas quantidades de DNA Amplificação exponencial de pequenas quantidades de DNA in vitroin vitro;;

Resolução dos problemas da baixa quantidade e degradação;Resolução dos problemas da baixa quantidade e degradação;

Amplificação exponencial por alteração de temperatura.Amplificação exponencial por alteração de temperatura.

PCR (PCR (Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction))

EtapasEtapas

DesnaturaçãoDesnaturação: “: “double strand” double strand” separadas (95°C);separadas (95°C);

AnelamentoAnelamento: Ligação dos : Ligação dos primersprimers na “ na “single strand” single strand” (56°C);(56°C);

ExtensãoExtensão: Produção da fita complementar pela DNA-polimerase (72°C).: Produção da fita complementar pela DNA-polimerase (72°C).

VídeoVídeo

W. AlberW. Alber H. SmithH. Smith D. NathansD. Nathans

→→ Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima.nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima.

→ → Descritas em 1970Descritas em 1970,,

Endonucleases de RestriçãoEndonucleases de Restrição

→→ Bam Bam HI - HI - Bacillus amyloliquefaciensBacillus amyloliquefaciens 5’ G/GATCC 3’5’ G/GATCC 3’

→→ Eco Eco RI - RI - Escherichia coliEscherichia coli 5’ G/AATTC 3’5’ G/AATTC 3’

→→ Hae Hae III - III - Haemophilus aegyptiusHaemophilus aegyptius5’ GG/CC 3’5’ GG/CC 3’

→→ Pst Pst I - I - Providencia stuartiiProvidencia stuartii5’ CTGCA/G 3’5’ CTGCA/G 3’

→ → NomenclaturaNomenclatura

37370 0 C, 1 hora, C, 1 hora, com tampão com tampão

adequadoadequado

Extremos rombosExtremos rombos

Extremos coesivosExtremos coesivos

Clonagem MolecularClonagem Molecular

→→ Utilização de bactérias;Utilização de bactérias;

→→ Plasmídeos como alvos;Plasmídeos como alvos;

→→ Endonucleases de restrição;Endonucleases de restrição;

→→ Clonagem de genes responsáveis por proteínas importantes ou Clonagem de genes responsáveis por proteínas importantes ou escassas em determinado organismo.escassas em determinado organismo.

Clonagem MolecularClonagem Molecular

→→ É o isolamento e a propagação É o isolamento e a propagação em um organismo de em um organismo de moléculas idênticas de DNA.moléculas idênticas de DNA.

CLONAGEM MOLECULARCLONAGEM MOLECULAR

VídeoVídeo

→ → Nem todas as proteínas são como a insulina;Nem todas as proteínas são como a insulina;

→ → As membranas são impermeáveis a grandes moléculas.As membranas são impermeáveis a grandes moléculas.

1- 1- O gene deve ter sido bem caracterizado (clonado e amplificado). O gene deve ter sido bem caracterizado (clonado e amplificado). Deve está disponível em forma pura;Deve está disponível em forma pura;

2-2- Deve está disponível um método eficiente para introduzir o(s) Deve está disponível um método eficiente para introduzir o(s) gene(s) nos tecidos ou células desejadas;gene(s) nos tecidos ou células desejadas;

3-3- Os riscos da terapia gênica para o paciente devem ter sido Os riscos da terapia gênica para o paciente devem ter sido cuidadosamente avaliados e demonstrados como mínimos;cuidadosamente avaliados e demonstrados como mínimos;

4-4- A doença não deve ser tratável por outras estratégias;A doença não deve ser tratável por outras estratégias;

5-5- Devem estar disponíveis dados de experimentos preliminares Devem estar disponíveis dados de experimentos preliminares com modelos animais ou células humanas e deve ser indicado com modelos animais ou células humanas e deve ser indicado que a terapia gênica proposta deve ser eficaz.que a terapia gênica proposta deve ser eficaz.

Devido a morte por terapia gênicaDevido a morte por terapia gênica

Figura 17.8Figura 17.8

Obs.: Células SomáticasObs.: Células SomáticasNão cura a doença, Não cura a doença, somente a controlasomente a controla

Figura 17.13Figura 17.13

Obs.: TransgeneObs.: Transgene

→ → hGHhGH→ → Fator VIIIFator VIII→ → InsulinaInsulina

Microinjeção de DNAMicroinjeção de DNA

Figura 17.14Figura 17.14

Ocorre em células germinativasOcorre em células germinativas

GG0 0 → DNA inserido antes da fusão nuclear → DNA inserido antes da fusão nuclear (Mosaicos Genéticos)(Mosaicos Genéticos)

GG1 1 → Transgene em todas as células→ Transgene em todas as células

Antes da Terapia GênicaAntes da Terapia Gênica

→ → hGHhGH

→ → Bovinos e suínos incompatíveis;Bovinos e suínos incompatíveis;

→ → Primatas e cadáveres humanos Primatas e cadáveres humanos compatíveis.compatíveis.

PlantasPlantas

→ → Células vegetais → Totipotência;Células vegetais → Totipotência;→ → Retorno ao estado embrionário;Retorno ao estado embrionário;→ → Não existe separação em linhagem germinativa e células somáticas.Não existe separação em linhagem germinativa e células somáticas.

Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

→ → Sistema natural de Engenharia Genética;Sistema natural de Engenharia Genética;→ → Plasmídeo Plasmídeo TiTi;;→ → T-DNA.T-DNA.

17.1617.16

- Bombardeio de microprojéteis;Bombardeio de microprojéteis;- EletroporaçãoEletroporação..

- Transformação mediada porTransformação mediada por Agrobacterium tumefaciens.Agrobacterium tumefaciens.

→ → T-DNA - Atinge cromossomos vegetais causando o tumor;T-DNA - Atinge cromossomos vegetais causando o tumor;

→ → Células com T-DNA - sem controle de divisão;Células com T-DNA - sem controle de divisão;

→ → Identificação dos genes tumorais em T-DNAIdentificação dos genes tumorais em T-DNA

Figura 17.18Figura 17.18

Figura 17.17

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