técnicas de eletroforese rodrigo rocha latado. eletroforese diversos métodos para análise de:...
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Técnicas de Eletroforese
Rodrigo Rocha LatadoRodrigo Rocha LatadoRodrigo Rocha LatadoRodrigo Rocha Latado
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Eletroforese
Diversos métodos para análise de:
Ácidos nucléicos (DNA e RNA)
Proteínas
Enzimas
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ETAPAS
Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR, Proteínas, etc...)
Preparar o gel
Aplicar as amostras no gel
Eletroforese
Coloração do gel, Fixação, Documentação
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CLASSIFICAÇÃO
• Tipos: - agarose
- poliacrilamida desnaturante
não desnaturante- amido (para isoenzimas)
• Princípios:- carga elétrica e tamanho da molécula (partícula)
- pH (focalização isoelétrica)
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• Detecção:– brometo de etídeo, SYBR, nitrato de prata,
fluorescência– substratos específicos (isoenzimas)
• Visualização:
– UV, direta, câmera
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Eletroforese
Sharp, Sambrook and Sugden
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Eletroforese
Syber green
Singer VL, Lawlor TE, Yue S. 1999. Comparison of SYBR Green Inucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat. Res. 439(1):37-47.
http://www.probes.com/servlets/product?region=0&item=7563
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Àcidos Nucléicos• Ácido nucléico exposto a campo elétrico
migra para eletrodo na velocidade ou mobilidade proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula– mobilidade: inversamente proporcional ao
coeficiente friccional– coeficiente friccional: função do tamanho e
forma da molécula e viscosidade do meio
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Eletroforese• Moléculas separadas por:
– tamanho– forma ou conformação– magnitude de cargas
• Sob pH fisiológico -> fosfatos ionizados– poliânions correm em direção ao eletrodo
positivo– Eletroforese pólo negativo -> pólo positivo
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Eletroforese
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Eletroforese• Tamanho da Molécula de DNA
– DNA linear migra inversa/ proporcional ao log10 do seu peso molecular
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Eletroforese• AGAROSE: • polissacarídeo linear de galactose com
unidades de -D-galactopiranose com ligações 1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose
• PM médio: 120.000 Da
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Agarose
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Eletroforese em gel de agarose
- Tampão (TAE ou TBE) e agarose
- Concentração agarose varia entre 1 e 3%
- Fundir a agarose no tampão e aplicar na fôrma
- Esperar esfriar, retirar o pente
- Aplicar as amostras no gel
- Iniciar a eletroforese
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Eletroforese• Tampões: água eletrolisada gerando H+• no anodo e OH- no catodo
– terminal catódico (+) -> básica– terminal anódico (-) -> ácida
• requer tampão para evitar gradientes de pH
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EletroforeseTampão Aplicação e comentários
TAE Usar quando o DNA vai ser recuperadoUsar para eletroforese de DNA de grande tamanho (> 12 Kb)Baixa f orça iônicaPropriedades:Baixa capacidade tamponante - recirculação pode ser necessária paracorridas eletroforéticas longas (> 6 horas).
TBE Usar para eletroforese de DNA pequeno (< 1 Kb)Melhor resolução de DNA pequeno (< 1 Kb)Mobilidade do DNA mais restritaAlta f orça iônicaPropriedades:Diminui a mobilidade do DNA.Alta capacidade tamponante - não requer recirculação para corridaslongas.
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Eletroforese• TAE
– para recuperação de fragmentos– preferido moléculas maiores– menor campo de força– maior porosidade
• TBE– preferido para moléculas menores < 1Kb– interage com agarose - poros menores
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Eletroforese
• Voltagem– expressar sempre em V cm-1
– gradiente de voltagem - distância entre eletrodos
– voltagem excessiva - rastro de banda– voltagem baixa - difusão de bandas pequenas <1
Kb
– TBE - bandas pequenas mais finas– TAE - bandas maiores
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Eletroforese
TampãoTamanho Voltagem
Recuperação Análise
< 1 kb 5 V/ cm TAE TBE
1 to 12 kb 4-10 V/ cm TAE TAE/ TBE
> 12 kb 1-2 V/ cm TAE TAE
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Eletroforese
• Tempo de corrida
– correr gel até banda de interesse ter migrado de 40 a 60% do comprimento do gel
– parte inferior do gel - difusão e dispersão
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Eletroforese
• Tampão de Carregamento:• Concentração 6 a 10x
– aumentar densidade da amostra - depositar amostra no fundo do poço
– adicionar cor a amostra– adicionar corantes de mobilidade ou migração
• azul de bromofenol• xileno cianol• verde de bromocresol
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Eletroforese- Poliacrilamida
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GEL DE POLIACRILAMIDA
- Géis de Poliacrilamida são obtidos a partir da formação de ligações entre o polímero acrilamida e o co-monômero bis-acrilamida.
- Essa reação covalente é geralmente catalizada por persulfato de amônio e iniciada por TEMED, uma amina terciária.
- Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser obtida através de variações de: Concentração de acrilamida e bis-acrilamida Grau de polimerização
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GEL DE POLIACRILAMIDA
- A matriz de poliacrilamida por possuir poros menores do que a matriz de agarose, géis de acrilamida são usados para separar fragmentos de DNA menores que 2 kpb, enquanto que moléculas de até 200 kpb podem ser separaradas em géis de agarose.
- De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp, enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1 a 0,05 Kpb.
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Eletroforese
Acrilamida* (%)
Tamanho de Fragmentos Separados (pares de
base)
Migração de Corante
Xileno Cianol Azul de Bromofenol pb pb
3,5 100 – 1000 460 100 5,0 80 – 500 260 65 8,0 60 – 400 160 45 12,0 40 – 200 70 20 15,0 25 – 150 60 15 20,0 6 – 100 45 12
O corante Azul de Bromofenol (Bromphenol Blue) migra aaproximadamente a 300 pares de base e Xileno Cianol (XyleneCyanol) a 4 Kpb, independente da concentração de agaroseentre 0,5 e 1,4% em 0,5 x de TBE.
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ACRILAMIDA DESNTAURANTE
- Acréscimo de Uréia no gel para a manutenção do DNA naforma de fita simples
- Amostras de DNA são desnaturadas a 94 -96o C, na presença de Formamida, antes da eletroforese