tecnicas de siembra de microorganismos
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Universidad Autó nóma de Quere taró Licenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto
Reporte de Practica #2:
Técnicas de siembra de microorganismos
Laboratorio de Biodiversidad de los
Microorganismos
Profesora:
Erika Beatriz Álvarez Hidalgo
Equipo #9:
Alma Marina Peralta Ruiz Rebeca Alejandra Oloarte Pulido
Juana María López Martínez
11 de septiembre del 2013
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son seres vivos que solo pueden visualizarse con el
microscopio; se encuentran en todos lados: en el suelo, agua, superficies corporales, alimentos e incluso en el aire. La mayoría son unicelulares sin embargo también
existen microorganismos multicelulares como algunas algas u hongos, cabe mencionar que también los virus forman parte de los microorganismos en el campo de estudio de la microbiología aunque no son considerados seres vivos.
Muchos microorganismos no son perjudiciales y juegan un papel muy
importante en la biosfera, dicho papel va desde fijar el nitrógeno para poder ser absorbido por las plantas hasta descomponer materia orgánica y transformarla para su reabsorción en la naturaleza; algunos microorganismos son patógenos, por esta y
muchas razones más, su estudio es de gran importancia.
La supervivencia y crecimiento continuo de microorganismos depende de un suministro adecuado de nutrientes y un ambiente favorable para su crecimiento. Un medio de cultivo es una solución que contiene los nutrientes necesarios para permitir
el crecimiento de microorganismos, en condiciones favorables de pH y temperatura. Existen 3 tipos de medios de cultivo según sus cualidades físicas: líquidos,
semisólidos y sólidos. Un medio liquido carece de un agente solidificante y se denomina caldo de cultivo; si a un caldo se le adiciona un agente solidificante como agar, se forma un medio semisólido o sólido. Para esta práctica sólo se utilizaron
medios sólidos de agar, por lo que no nos adentraremos en los medios de cultivo líquidos o semilíquidos.
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de promover intencionalmente el
desarrollo de éste, en medios de cultivo y condiciones favorables de laboratorio controladas.
La población de microorganismos desarrollada en un medio de cultivo se denomina cultivo, cuando el cultivo contiene una sola especie de microorganismo se
denomina cultivo puro o axénico; cuando contiene más de una especie se denomina cultivo mixto: en un cultivo mixto viven muchas y diferentes especies de microorganismos en forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en
el laboratorio, y para su obtención se deben tomar precauciones especiales como asegurarse de trabajar en un ambiente de asepsia ya sea en una campana de flujo
laminar o cerca de la flama de un mechero (los microorganismos se encuentran en todas partes y pueden contaminar nuestra muestra si no se trabaja con precisión).
Existen varios métodos de siembra de microorganismos, para nuestra practica utilizamos el método de siembra por estría en placa y el método de extensión en
placa. El método por estría es el más fácil y el más utilizado para obtener cultivos axénicos, para ello con un asa se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido, conforme se
van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos los cuales quedan separados e
inmovilizados; después se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica en la
superficie sin sembrar; repitiendo este proceso se logra aislar células individuales, a continuación las placas se incuban permitiendo que las células aisladas
experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. A continuación se muestra una imagen de la forma en la que hicimos nuestro estriado
para esta práctica:
En el método por extensión en placa, las células microbianas se diluyen en forma seriada antes de su siembra, las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar y se extienden con ayuda de un asa de Drigalsky
de cristal estéril, para esterilizarlas se sumergen en alcohol y se flamean antes de tener contacto con la muestra diluida.
A partir de colonias separadas suficientemente, es posible obtener un cultivo
puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El éxito
del aislamiento, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Cabe mencionar que una vez realizado el cultivo se puede analizar la morfología de
las colonias obtenidas:
OBJETIVO
Identificar y aprender los métodos para cultivar microorganismos y la importancia de éstos para su aislamiento e identificación.
MATERIALES
Cepas activadas de E. coli,
Salmonella, S. aureus,
Pseudomonas aeruginosa
Tubos c/diluyente de peptona (DP) c/5 mL c/u
Asa calibrada
Placas de Agar soya
Tripticaseína (AST)
Varillas de vidrio estériles Incubadora de 35°
Placas de Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
Asas calibradas y rectas Alcohol 70%
Placas de Agar Sangre (AS) Micropipeta de 1 y 0.1 mL 3 asas de Drigalsky Placas de Agar Verde
Brillante (AVB)
Hisopos estériles con
aplicador de madera
3 tubos de ensayo
con tapón de rosca. Placas de Agar Baird Parker
(ABP) Puntas p/micropipeta de 1
mL y de 0.1 mL estériles 1 mechero bunsen
Placas de Agar Pseudomonas F (AP)
Baño maría
METODOLOGÍA
Pasos para sembrar microorganismos por el método de siembra por estría en caja de Petri.
1. Prender el mechero bunsen 2. Destapar la caja de Petri cerca del mechero Fisher 3. Flamear el asa hasta que se ponga al rojo vivo, dejar enfriar, tomar muestra
con la punta del asa 4. Ya con la muestra, estriar aproximadamente ¼ de la superficie total del agar;
las estrías deben ser varias y muy juntas. 5. Flamear el asa nuevamente 6. Jalar 2 estrías de la primera parte y proceder con el estriado a un lado esta
vez ya sin tocar las primeras estrías, las estrías deben ser menos y estar más separadas que la primera vez.
7. Proceder con el estriado de la siguiente parte sin flamear el asa. Las estrías deben ser menos y estar más separadas que la segunda vez.
8. Estriar la última parte del agar tener en cuenta que deben estar más
separadas y ser menos en cantidad a la tercera vez. El agar debe verse de la siguiente manera:
9. Tapar la caja de Petri, escribir los datos necesarios (nombre del microorganismo, nombre del medio, dilución de la muestra (si la hay),
nombre del grupo y fecha), voltear y proceder a incubar por 48 horas. 10. Hacer este procedimiento para el agar soya tripticasa y agar pseudomonas
con agua de tortuga, para el agar verde brillante utilizar la muestra de tierra, y para el agar eosina azul de metileno utilizar muestra de heces fecales.
Pasos para sembrar microorganismos usando el método por extensión en caja de Petri.
1. Tomar la muestra nasal o bucofaríngea con ayuda de un hisopo estéril y diluir en un tubo de ensayo con tapón de rosca. Agitar.
2. Prender el mechero bunsen 3. Poner las asas de Drigalsky en un vaso de precipitado con alcohol
4. Calibrar una micropipeta para tomar 100µL de muestra 5. Abrir la caja de puntas para micropipetas cerca del mechero, tomar una
punta y proceder a tomar 100µL de la muestra ya diluida
6. Abrir la caja de Petri cerca del mechero 7. Poner los 100 µL encima del agar y volver a tapar la caja de Petri.
8. Flamear el asa de Drigalsky 9. Abrir la caja de Petri nuevamente y extender la muestra en toda la superficie
del agar con el asa de Drigalsky hasta que seque.
10. Tapar la caja de Petri, escribir los datos necesarios, voltear y proceder a incubar por 48hr.
11. Hacer este procedimiento con el Agar Sangre y con el Agar Baird – Parker utilizar la misma muestra nasal o bucofaríngea para los dos.
Cabe mencionar que existen otros métodos para la siembra por estrías, aquí hay otro ejemplo de estrías:
Diagrama de flujo para la siembra de microorganismos por
método de estrías y por el método por extensión en caja de Petri.
Inicio
Tomar las muestras a sembrar en
los medios de cultivo de la práctica
anterior; diluir según sea el caso
Prender el mechero
bunsen
Destapar caja de Petri cerca
del mechero
Método
por
estrías
Tomar 100µL de
muestra previamente
diluida y agitada
Flamear el asa
Tomar muestra
Método por
extensión
en placa
Abrir la caja de puntas para
micropipetas cerca del
mechero y tomar una
Calibrar micropipeta
a 100µL
Vaciar la muestra
en la caja de Petri
Poner las asas de
Drigalsky en un vaso de
precipitado con alcohol
Estriar la cuarta parte
de la superficie
aproximadamente
Si
Si
No
No
Estriar el resto de la
superficie teniendo en
cuenta que cada vez las
estrías deben ser menos
y más separadas
Jalar 2 estrías de
la primera parte
Flamear el asa de
Drigalsky y extender la
muestra en la superficie del
agar hasta que seque
Tapar la caja de Petri, escribir los datos,
voltear y proceder a incubar por 48 hr. Fin
RESULTADOS
Referencia
MEDIO DE CULTIVO
CEPA DE REFERENCIA
# DE COLONIAS
COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO
AST – Agar soya tripticasa
Salmonella 1 Crema traslucido Regular Plana >1mm – 3mm
VB – Agar verde
brillante Salmonella 2
1. Rosa cremoso traslucido
2. Amarillo cremoso opaco
1. Regular
2. Irregular
1. Plana
2. Elevada
1. >1mm – 3mm
2. 1mm – 2mm
EMB – Agar eosina azul de
metileno Escherichia Coli 1
Morado cremoso opaco
Regular Plano convexa 1mm – 2mm
AS – Agar sangre Staphylococcus
Aureus 1 Blanco opaco Puntiforme Convexa >1mm – 2mm
AP – Agar
pseudomonas Pseudomonas 1 Crema traslucido Circular Plano convexa >1mm a 5mm
ABP – Agar Baird Parker
Staphylococcus Aureus
1 Negro opaco Puntiforme Convexa >1mm – 1mm
Muestra 1 – Rebeca
MEDIO DE
CULTIVO
ORIGEN DE LA
MUESTRA
# DE
COLONIAS COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO
AST – Agar soya tripticasa
Agua de tortuga 2 1. Blanco opaco
2. Crema traslucido 1. Irregular 2. Regular
1. Plana 2. Elevada
1. >1mm – 16mm 2. 1mm – 5mm
VB – Agar verde brillante
Agua de tortuga 2
1. Amarillo verdoso
traslucido 2. rojo traslucido
1. Regular 2. Regular
1. Plana 2. Plano convexa
1. >1mm – 2mm 2. >1mm
EMB – Agar eosina azul de
metileno
Heces fecales de animal
1 Rosa opaco Circular Convexa >1mm – 2mm
AS – Agar sangre Nariz 1 Blanco opaco Circular Plana >1mm – 4mm
AP – Agar
pseudomonas Tierra 1 Crema traslucido Circular Plano convexa >1mm a 3mm
ABP – Agar Baird Parker
Nariz 1 Negro opaco Puntiforme Convexa >1mm
Muestra 2 – Marina
MEDIO DE CULTIVO
ORIGEN DE LA MUESTRA
# DE COLONIAS
COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO
AST – Agar soya tripticasa
Agua de tortuga 4
1. Crema opaca
2. Crema opaca 3. Crema opaca
4. Crema traslucida
1. Irregular
2. Irregular 3. Regular 4. Regular
1. Plana 2. Plano convexa
3. Convexa 4. Convexa, rugosa en el
centro
1. 5mm
2. 7mm 3. 4mm 4. 1mm
VB – Agar verde
brillante Agua de tortuga 3
1. Amarillo opaco 2. Naranja traslucido
3. Amarillo
traslucido
1. Regular 2. Regular 3. Regular
1. Convexa 2. Plana 3. Plana
1. 2mm 2. 1mm
3. 1.5mm
EMB – Agar eosina azul de
metileno
Heces fecales de
animal 1 Rosa opaco Regular Convexa >1mm
AS – Agar sangre Garganta 2
1. Cremosa
traslucida 2. Crema opaca
1. Irregular 2. Regular
1. Convexa 2. Convexa
1. >1mm 2. 1mm
AP – Agar
pseudomonas Tierra 3
1. Opaca verdosa 2. Crema traslucida
3. Verde opaca
1. Regular 2. Irregular 3. Regular
1. Convexa 2. Plana
3. Convexa
1. 3mm 2. 3mm 3. 4mm
ABP – Agar Baird Parker
Garganta 1 Gris oscuro Regular Convexa >1mm
Muestra 3 – Juana
MEDIO DE CULTIVO
ORIGEN DE LA MUESTRA
# DE COLONIAS
COLOR BORDE ELEVACIÓN TAMAÑO
AST – Agar soya tripticasa
Agua de tortuga 2 1. Crema
2. Amarillo opaco 1. Circular 2. Circular
1. Plana 2. Plana
1. 9mm 2. 4mm
VB – Agar verde brillante
Agua de tortuga 3 1. Amarillo
2. Rojo
3. Anaranjado
1. Regular 2. Regular
3. Circular
1. Plana 2. Plana
3. Plana
1mm
EMB – Agar eosina azul de
metileno
Heces fecales de
animal 1 Negro Circular Plana 2mm
AS – Agar sangre Garganta 1 Amarillo cremoso Circular Plana 1mm
AP – Agar pseudomonas
Tierra 1 Crema Circular Plana > 1mm
ABP – Agar Baird Parker
Garganta 2 1. Negro 2. Gris
1. Circular 2. Fusiforme
1. Plano convexa 2. Plano convexa
1mm
1. Separar los medios de
cultivo a utilizar
2. Con un hisopo estéril tomar
una muestra nasal y sumergir en un tubo de
ensayo con disolución
3. Agitar el tubo de ensayo
para desprender los microorganismos del hisopo
4. Poner las asas de
Drigalsky en un vaso de precipitado con alcohol
5. Calibrar la micropipeta a
100µL; abrir la caja de puntas para micropipeta
cerca del mechero y tomar una
6. Tomar 100µL de la muestra
diluida
7. Vaciar la muestra a la caja de Petri
8. Flamear el asa de Drigalsky
9. Extender la muestra en la caja Petri con ayuda del asa
de Drigalsky hasta que seque. Tapar y voltear
10. Flamear el asa calibrada para siembra en estrías
11. Tomar muestra
12. Abrir caja de Petri y estriar de la forma como fue
explicado
13. Tapar, voltear e incubar por 48 hr.
14. Observar la morfología de las colonias obtenidas
15. Describir las morfologías diferentes y reportar
resultados
DISCUSION DE RESULTADOS
La siembra en cajas Petri nos permite cultivar microorganismos gracias a que contiene los
nutrientes necesarios para su desarrollo. El crecimiento de los microorganismos se manifiesta de
formas diferentes dependiendo de la técnica utilizada para su siembra y del tipo de medio en el que
se realizó dicha siembra, de esta forma es posible obtener características morfológicas distintas
cuando se realizan siembras de una misma muestra en diferentes medios de cultivo o viceversa,
esto queda mejor explicado en los resultados que obtuvimos en la morfología colonial de nuestro
agar verde brillante en el cual se observó que algunas colonias tenían un color amarillo verdoso y
otras eran rojas, esto se debe a que dicho agar tiene colorantes que nos permiten diferenciar las
bacterias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras de lactosa; las formas observadas
fueron variadas (regular, puntiforme, circular e irregular) y en cuanto a elevaciones tuvimos planas,
elevadas, planoconvexas y convexas.
CONCLUSIÓN
El desarrollo de colonias formadas a partir de los métodos realizados por estrías y por extensión en placa difieren en forma, borde, elevación, superficie y estructura interna, lo cual es
notablemente influenciado por las concentraciones de carga microbiana del medio en el cual dichas colonias se desarrollaron así como por el mismo medio de cultivo, por eso inclusive en nuestras cepas de referencia la salmonella se visualizó con algunas diferencias morfológicas cuando se
cultivó en agar soya tripticasa y en agar verde brillante. En general aprendimos a sembrar microorganismos por dos métodos diferentes obteniendo resultados satisfactorios.
También aprendimos a describir la morfología de las colonias que obtuvimos así como
compararlas con las cepas de referencia que se nos proporcionó; tuvimos un poco de dificultad para
la siembra por estrías en el agar eosina azul de metileno debido a que el agar estaba muy suave sin embargo aun así pudimos realizar 2 de 3 siembras satisfactoriamente.
BIBLIOGRAFÍA Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial Pearson
Intro. a la Microbiología – Gerard J. Tortora – Editorial Medica Panamericana