tecnicas microscópicas teoria
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TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Técnicas microscópicas
Es la asignatura que da a conocer aspectos referentes al conocimiento de
microscopio instrumento óptico fundamental del biólogo, más los implementos
necesarios, para efectuar preparados para microscopía,
Entre los implementos nescesarios están los equipos y aparatos, la cristalería de
laboratorio
Siendo menester conocer cada una de sus nominaciones técnicas, su funcionamiento
y utilidad, las normas de bioseguridad y control de calidad, más los procedimientos
para preparados invivo y post morten, la microscopía es una disciplina que se
encarga del estudio de los métodos y tecnicas que permitan la optencion de una
pequeñísima porción de muestra, suficientemente delgada y contrastada para ser
vista bajo el lente de un microscópio fotónico o electrónico, siguiendo un protocolo..
Historia
se inicia paralelamemte al desarrollo de la óptica, remontándose a las civilizaciones
Mesopotámica y Egipcia (app 3000 AC), con el comienzo de la fabricación del vidrio
(a partir de arena), hecho demostrable por el hallazgo de una lente de cristal de roca
en 1847 en Nínive.
El hallazgo de las propiedades de aumento de las imágenes fue descubierto por
Séneca en el siglo I DC, al observar un objeto a través de una bola de cristal llena de
agua, que conformaba una lente convexa que hacía converger los rayos de luz hacia
un punto central se comporta como una lente convergente. Constituyendo una lupa.l
primer microscopio fue creado por los hermanos Hans y Zacarías Jensen en los
Países Bajos en 1590 y consistía de 2 tubos de latón deslizables que sostenían 1 lente
cada uno. Así surge el microscopio compuesto, base de los microscopios ópticos
actuales. 1608 Z. Jansen construye un microscopio con dos lentes convergentes.
En 1611 Johannes Kepler sugirió una forma de construir un microscopio compuesto.
Posteriormente en 1612, Galileo Galilei crea un microscopio compuesto en Italia, que
consistía de 2 tubos de madera deslizables sobre uno exterior de cartón, forrado de
cuero verde, permitiendo el enfoque. Presentaba un tamaño de 12 cm.
En 1632 el microscopio simple realizado por Antoni van Leeuwenhoek, en Leyden,
Holanda de 10 cm de tamaño. Le permite imágenes de mayor calidad, informando
sus descubrimientos 1674 de protozoarios. Observando bacterias por vez primera
en 1683
En 1665 Hooke construye y utiliza un microscopio compuesto, al estudiar cortes de
corcho describe los pequeños poros en forma de caja a los que él llamó "células".
Publica su libro Micrographia, cuyo original se conserva en "La Court Collection in the
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Science Museum at South Kensington, England, también por esas fechas Giuseppe
Campana, construye un microscopio compuesto de 9 cm en Italia.. Construido en
madera y soportado por un anillo de metal, permite el enfoque mediante el
desplazamiento de la porción interior por un mecanismo de tornillo. En la base
presenta un disco de madera con un agujero central lo que le hace apto para
observar especímenes por transparencia. Por sus reducidas dimensiones se le
considera el primer microscopio de bolsillo.
Christopher Cock 1670. en Inglaterra. (50 cm). según diseño de Robert Hooke de
1665 construye un microscopio compuesto
Los diseños de microscopio, que en un inicio eran relativamente sencillos pero
mostraban la tendencia artística de las épocas en que fueron construidos, pronto
fueron cambiando conforme se buscaban otros parámetros más prácticos como la
estabilidad del mecanismo, la necesidad de aprovechar la visión Estereoscópica del
ser humano, el desarrollo de la ergonomía, que exige a la mayor comodidad y a la
anatomía del individuo,
Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por
asociación de Chris Neros y Flint Crown obtenidos en 1740 por H. M. Hall y
mejorados por John Dollond. De esta época son los estudios efectuados por Isaac
Newton y Leonhard Euler el rápido avance de la electricidad, electrónica,
computación y cibernética, que se han aprovechado en microscopía para crear
nuevas aplicaciones de ésta. 1820 se emplean por vez primera lentes acromáticas
.
1828 W. Nicol desarrolla la microscopía con luz polarizada, en 1833 Brown publica
sus observaciones microscópicas de orquídeas y describe claramente el núcleo de la
célula, 1838 Schleiden y Schwann proponen la teoría de la célula y declaran que la
célula nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales, en 1849 J.
Quekett publica un tratado práctico sobre el uso del microscopio. Durante el siglo
XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que aumentaron su
estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por el momento mejoras
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ópticas. 1876 Abbé analiza los efectos de la difracción en la formación de la imagen
en el microscopio y muestra cómo perfeccionar el diseño del microscopio, surgiendo
las mejoras más importantes de la óptica en 1877, cuando Ernest Abbe publicó su
teoría del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de
inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener
aumentos de 2000.
En 1881 Retzius describe gran número de tejidos animales con un detalle que no ha
sido superado por ningún otro microscopista de luz. En las siguientes dos décadas él,
Cajal y otros histólogos desarrollan nuevos métodos de tinción y ponen los
fundamentos de la anatomía microscópica, 1882 Koch usa tinte de anilina para teñir
microorganismos e identifica las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera. En
las siguientes dos décadas, otros bacteriólogos, como Klebs y Pasteur identificarán a
los agentes causativos de muchas otras enfermedades examinando preparaciones
teñidas bajo el microscopio.
1886 Zeiss fabrica una serie de lentes, con el diseño de Abbé que permiten al
microscopista resolver estructuras en los límites teóricos de la luz visible.
1898 Golgi ve y describe por primera vez el aparato de Golgi tiñendo células con
nitrato de plata
1908 Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.
1924 Lacassagne y colaboradores desarrollan el primer método autoradiográfico para
localizar polonium radiactivo en especímenes biológicos.
En el siglo XIX, al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar
con combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al mercado
objetivos acromáticos excelentes. .A principios de los años 1930 se había alcanzado el
límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos
superiores a 500X o 1000X. Sin embargo, existía un deseo científico de observar los
detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.). 1930 Lebedeff diseña y
construye el primer microscopio de interferencia, Max Knoll y Ernst Ruska en
Alemania en 1931 desarrollan el microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo
aumentos de 100.000X. En 1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases
Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM),
1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial
para el microscopio de luz, 1981: Gerd Binnig y Heinrich Rohrer desarrollan el
microscopio de efecto túnel, en 1985 Binnig y Rohrer desarrollan el microscopio de
fuerza atómica
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Entre los pioneros más importantes en la microscopía electrónica en biología están:
Albert Claude, Don Fawcett, Earnest Fullam, Charles Leblond, John Luft, George
Palade, Daniel Pease y Keith Porter. Claude y Palade, recibieron el Premio Nobel de
Medicina en 1974 por sus logros en biología celular utilizando el microscopio
electrónico.
CONCEPTOS BÁSICOS DE FÍSICA ÓPTICA
LA LUZ es la radiación electromagnética que puede ser percibida por el ojo humano
y es estudiada por la óptica, rama de la física que estudia el comportamiento de la
luz, sus características y sus manifestaciones, Actualmente el valor exacto aceptado
para la velocidad de la luz en el vacío es de 299.792.458 m/s.= 300.000m/s.
Considera que la luz es una onda electromagnética, consistente en un campo
eléctrico que varía en el tiempo generando a su vez un campo magnético y viceversa,
ya que los campos eléctricos variables generan campos magnéticos (ley de Ampère) y
los campos magnéticos variables generan campos eléctricos (ley de Faraday). De esta
Confocal Leica 1994
Microscopio Mc. Artur
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forma, la onda se autopropaga indefinidamente a través del espacio, con campos
magnéticos y eléctricos generándose continuamente. Estas ondas electromagnéticas
son sinusoidales, con los campos eléctrico y magnético perpendiculares entre sí y
respecto a la dirección de propagación
ONDA ELECTROMAGNÉTICA
Campo óptico Es el espacio limitado donde ocurren los fenómenos ópticos, sus
elementos son:
Lente trozo de cristal carente de boro, u otro material transparente refringente,
limitado
por 2 superficies con simetría axial
MICROSCOPIO
Es el aparato óptico que permite ver imágenes ampliadas de objetos no visibles a
simple vista, concebido a partir de óptica geométrica, mejorado desde la concepción
de la teoría general de formación de imágenes, gracias a la naturaleza ondulatoria de
la luz, manifestada particularmente por la difracción, Son aparatos ópticos
indispensables para el biólogo, presentan sobre una parte mecánica un sistema
óptico (lupas) o más sistemas ópticos (M. compuestos), tienen la capacidad de
generar aumento de los objetos observados, debido a que los rayos luminosos son
LENTES CONVERGENTES son
aquellos que amplían las imágenes,
presentan mayor espesor hacia el
centro, y tienen dioptrías positivas
LENTES DIVERGENTES son aquellos
que presentan menor espesor
hacia el centro, disminuyen las
imágenes, y presentan dioptrías
negativas
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refractados al pasar a través del cristal del sistema óptico que lo conforma, y la
interacción con el aire. Etimológicamente derivan de 2 voces: Mikros= pequeño y
Scopeo= examen, la nominación es dada por Jean Faber , son fabricados trecientos
años después de que se crearon los anteojos.
Microscópios ordinarios simples incrementan las imágenes 3 a 8 veces, y los
compuestos entre 30 a 1200 veces o diámetros (X), el ojo humano aprecia objetos
pequeños de aproximadamente 30 µm (micrónetros) , en un microscopio compuesto
se aprecian detalles del orden de una désina de micrómetro,
La microscopia antigua data de 1674 a. del trabajo pionero de A. Leeuwenhoek, la
microscopía moderna data de los estudios teóricos sobre óptica del físico judío
residente alemán ABBE, que condujeron a la fabricación de sistemas ópticos
mejorados que brindan clara imagen, precisa de muy buen aumento, en la actualidad
todos los microscopios son parafocales, y los progresos en la composición química
de cristales ópticos han hecho posible producir campos aplanáticos , haciendo que el
foco sea igualmente agudo, sobre todo el campo visual
Con un instrumento bien calibrado podemos decir que la óptica geométrica fija la
posición y el aumento de la imagen obtenida mientras que la difracción impone
límites en la percepción de los detalles del objeto. El objeto biológico no es
precisamente luminoso de por si sólo, entonces es preciso iluminarlo, por lo que un
microscopio cuenta con condensador, y una fuente de luz, el condensador concentra
lo haces de luz provenientes de la fuente de luz ubicada en la base del microscopio,
que puede regularse la intensidad, con su respectivo botón de control o con el
diafragma del condensador, tiene oculares y objetivos para visualizar el objeto, para
analizarlo, dependiendo de la calidad de estas 3 unidades la calidad de la imagen
observada.
Partes conformantes.
1 Parte Mecánica integrada por elementos que sirven de sostén a la parte óptica, allí
están: el pié o estativo, columna, platina pinzas, carro tornillos de deslizamiento del
carro, Cremallera, tornillos macrométrico y micrométrico de enfoque
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PARTE ÓPTICA conformada por:
Tubo óptico sostiene al ocular u oculares,
es generalmente de 160 mm de longitud
mecánica
eses de 160mm
Cremallera de desplazamiento del tubo
Tornillo macrométrico solo o incluido con el
micrométrico, permiten el enfoque de la
imagen
Mango o empuñadura por donde se
sujeta el microscopio, cogiendo con
la otra mano por su base, estativo o
pié son compactos
Platina, con sus tornillos para el
desplazamiento del portaobjetos,
sobre el charriot
Fuente de luz o bombilla eléctrica
actualmente. 60 w
Tornillo micrométrico para un enfoque más preciso, y tambor
micrométrico para medición de grosor de objetos observados
Sistema revólver, con su respectiva calota rotatoria,
para ubicar en el eje óptico cada objetivo
Tubo óptico monocular o
puede ser binocular,
trinocular
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ÓPTICA DE ILUMINACIÓN Integrada por:
Bombilla eléctrica, pavonada o no, con o sin diafragma y filtro para evitar la
formación del haz incandescente en el preparado
Sistema condensador cuya mejor calidad es un ABBE compuesto, conformado
por dobletes o tripletes acromáticos con alta apertura numérica (1 . 25) Permite
reunir los haces de luz en el eje óptico.
ÓPTICA DE LA FORMACIÓN DE IMÁGENES
Sistema de los oculares están frente al observador, crean la imagen virtual, se
caracteriza por su distancia focal (entre 5 a 80 mm), aumento visual angular
entre 15 a110 °en el espacio imagen.
Los oculares pueden ser del: tipo Huygens cuando presentan diafragma anular en la
porción media del cilindro ocular, con lentes planoconvexas (objetivos acromáticos),
para efectuar mediciones a microscopía, en el diafragma anular se incerta el
micrómetro ocular, que es una placa de cristal circular con escala gravada.
Los oculares Kelmer de 40 a 50°de campo visual son de buena calidad ,
Oculares de gran angular con 90°, con aumentos que van desde 10X, 12X, 16X. los
más utilizados.
Diafragma anular
Lente de campo
diafragma del condensador
Manilla para abrir o serrar el diafragma , debajo de está
el porta filtros, y filtros de diferente color que se les
denomina con siglas de acuerdo a sus propiedades
espectrales: VUV para ultravioleta, etc.
microfotografíamicroproyección
condensador
Lente frontal y montura con
especificaciones de marca y
ampliación
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SISTEMA DE LOS OBJETIVOS generan la primera escala de aumento, y una imagen
real invertida, caracterizados por su aumento de 1a 100X (aumento parcial objetivo)
y abertura numérica de de 0.01 hasta1.40, que van a la par con el condensador,
Objetivos de menor aumento trabajan en seco son de 1.2 a 25.
Objetivos medianos trabajan en seco o a inmersión en agua.
Objetivos de mayor aumento o de inmersión homogénea, trabajan con aceite de
IR similar al del lente frontal del objetivo.
Sistema revólver presenta placa convexa hacia afuera, cóncava hacia adentro,
presenta orificios con rosca para entornillar objetivos de diferente aumento y
diferente corrección de acuerdo a su calidad y van adosados al Cabezal, que porta
además al monocular, al binocular o trinocular y cámara fotográfica
incorporada.
La imagen real se forma por rayos convergentes que pueden ser recogidos sobre
una pantalla o una placa fotográfica
Los microscopios compuestos se utilizan para estudiar especímenes delgados,
puesto que su profundidad de campo es muy limitada. Por lo general, se utilizan para
examinar una lámina muy fina de cualesquier material. Normalmente depende de la
luz transmitida que atraviese la muestra desde abajo, siendo necesario usualmente
técnicas especiales para aumentar el contraste de la imagen in vivo o post morten
La resolución de los microscopios ópticos está restringida por un fenómeno llamado
difracción que, dependiendo de la apertura numérica AN del sistema óptico y la
Cápsula con los datos de
ampliación, AN, Longitud focal
Lente frontal
En el interior se halla un
diafragma anular ennegrecido
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longitud de onda de la luz utilizada (λ), establece un límite definido (d) a la resolución
óptica. Suponiendo que las aberraciones ópticas fueran despreciables. Normalmente,
se supone una λ de 550 nm., correspondiente a la luz verde. Si el medio es el aire, la
AN práctica máxima es de 0,95, y en el caso de aceite de hasta 1,5., Ello implica que
incluso el mejor microscopio óptico está limitado a una resolución de unos 0,2
micrómetros
Capacidad de resolución está dada por la longitud de onda empleada y la AN de los
objetivos que determinan La distancia mínima entre dos puntos visibles para ser
diferenciados como tales
Donde λ es la longitud de onda de la luz monocromática en la que se observa el
objeto y A N es la abertura del microscopio.
Líquidos de inmersión son medios ópticos líquidos, que rellenan el espacio entre el
preparado para microscopía y el lente frontal del objetivo. Para lentes de 90 a
100X (con índice de refracción IR es de 1.51 o más), como: aceites de cedro o de
enebro, glicerina, monobromo naftalina, entre otros, pero debe ser de preferencia del
IR del lente frontal objetivo o más alto 1.53, 1.6, como indica el fabricante de cada
microscopio, concluido el trabajo debe limpiarse el lente.
En el objetivo de mediano aumento (40x), puede utilizarse agua como líquido de
inmersión.
Tipos de objetivos de calidad y sus características.
Para evitar aberraciones cromáticas se tienen objetivos acromáticos corregidos para
el rojo y el azul, son los de menor calidad, apocromáticos están corregidos para el
rojo y el azul y tienen una mayor apertura numérica (AN) y corrigen Aberraciones. de
esfericidad, los Semi / plan apocromáticos son de mejor calidad que los anteriores y
están corregidos para el rojo, el azul y el verde curvatura de campo y esfericidad y
aún mucho mejores son los Plan apocromático para investigación biológica,
cualquiera de estas nominaciones van indicadas en la cápsula del objetivo o cubierta.
UTILIDAD de los microscopios son útiles en diferentes campos de las ciencias, en
química en el estudio de cristales, en la física en la investigación de las propiedades
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físicas de los materiales, en geología en el análisis de la composición mineralógica de
algunas rocas y cristales y mucho más, en el campo de la biología en el estudio de
estructuras microscópicas de la materia viva, en el laboratorio de citología, histología
animal y vegetal en anatomía patológica, donde la microscopía permite determinadas
aplicaciones diagnósticas, entre ellas el diagnóstico de certeza del cáncer, numerosas
estructuras cristalinas, pigmentos, lípidos, proteínas, depósitos óseos, depósitos de
amiloide, etc.
Unidades de medida empleadas en microscopía:
Una unidad de medida es una cantidad estandarizada de una determinada magnitud
física. Para determinarla se emplea el Sistema Internacional de Unidades (SI) también
conocido como sistema métrico, que es el más ampliamente usado. Este sistema se
originó a partir del antiguo sistema métrico decimal mks (metro-kilogramo-segundo),
el cual fue mejorado. Fue creado en 1960 por la Conferencia General de Pesas y
Medidas, celebrada en Paris.
La longitud es una magnitud creada para medir la distancia entre dos puntos y su
unidad es el metro. La palabra metro proviene de la palabra griega metron Se
representa con la letra m.
MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO se denomina así al microscopio que oferta visión
tridimensional del objeto observado, sin seccionar o seccionado, permite hacer
disecciones, utilizando elementos de cirugía menor
Presenta sistema zoom de avance, carece generalmente de sistema condensador y
tornillo micrométrico, presenta prisma de inversión de imagen, en el cabezal para
ponerla derecha, ya que en los sistemas compuestos se presenta imagen final virtual
invertida. Iluminación episcópica y diascópica. Siempre es binocular y con 2 objetivos
gemelos su aumento total no excede de 60X, puede ser trinocular con cámara
fotográfica incorporada, muestran objetos entre aproximadamente 0.05 a 20
milímetros. .Existen los oculares foto, especiales para fotomicrografía, y cuando se
utilizan con los objetivos plan apocromáticos dan la mejor calidad de fotografías.
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Entre los microscopio simples están aquellos denominados lupas con un solo
sistema de lentes simples biconvexa o con una pila de dobletes o tripletes
acromático, que brindan imágenes ampliadas derechas, las de uso en biología
son: Los cuentacolonias, los de diagramas florales y entomológicos simples o de
plano inclinado. Todos ellos deben ser anastigmáticos
Limpieza de microscopios : las lentes deben limpiarse con papel toalla para
quitar el aceite de inmersión o el agua, luego con una mezcla alcohol xilol 1/1
limpiar manchas y nuevamente pasar papel toalla o papel para lentes. O un paño
de polar.
Cuando se ha contaminado con patógenos dejar el microscopio por 18 Hrs en el
interior de un desecador, colocando al otro extremo un algodón ligeramente
humedecido en formol, transcurrido el tiempo, sacarlo para airearlo .
Platina de discos
opacos y transparentes
y
tttransparentestranspa
rentes Tornillos de control de intensidad
lumínica episcópica o diascópica
Tornillo zoom de
avance
Cabezal binocular con prima de inversión
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TRAYECTORIA DE LOS HACES DE LUZ EN LOS MICROSCOPIOS : FOTÓNICO,
ELECTRÓNICO
En un microscopio compuesto la imagen resultante es virtual invertida y amplificada
Refracción es el cambio de dirección que experimenta una onda que incide
oblicuamente sobre la superficie de separación de los dos medios y si estos tienen
índices de refracción distintos al pasar de un medio material a otro.
Índice de refracción Es la relación entre la velocidad de propagación de la onda en
un medio de referencia (por ejemplo el vacío para las ondas electromagnéticas) y su
velocidad en el medio del que se trate, constituye una constante óptica entre
cualesquier dos medios.
Difracción es un fenómeno característico de las ondas que se basa en la desviación
de estas al encontrar un obstáculo o al atravesar una rendija. La difracción de rayos X
como un método para explorar la naturaleza de los cristales y otros materiales con
estructura periódica. Es una técnica que se utilizó para intentar descubrir la
estructura del ADN, y fue una de las pruebas experimentales de su estructura de
doble hélice propuesta por James Watson y Francis Crick en 1953,
Poder de resolución es la capacidad de un lente para precisar detalles muy
adhiacentes individualizados claros, no borrosos, está limitado por la longitud de
onda de la luz visible y la AN, el poder de resolución puede mejorar, mediante el uso
de longitud de onda, menor de 0,2 µm, para permitir resolución de partículas de 0,1
µm, empleando lentes de cuarzo, o sistemas fotográficos muy complejos
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Poder de ampliación es la capacidad de la lente de aumentar las imágenes depende
de su configuración
Poder definidor depende de la configuración, calidad de las lentes que integran el
sistema ,
Poder de penetración capacidad de la lente para atravesar los diferentes estratos
del espesor del objeto observado, mostrando los planos de observación
Tipos de exámenes a microscopía
Preparados in vivo son todos aquellos tomados directamente de la naturaleza o a
partir de medios de cultivo en laboratorio, se adecúan más para observaciones a
nicroscopía de campo oscuro, contraste de fases, confocal. Son más para unicelulares
procariontes o eucariontes.
Utilizan como medios de montaje sustancias naturales o artificiales o colorantes
vitales, que no alteren su vitalidad, debiendo mantener la humedad, el pH,
temperatura, aireación, concentración de sales.
Medios naturales son aquellos tomados de la naturaleza como el agua marina, agua
continental, saliva, secreciones, transudados, clara de huevo, humor acuoso, suero
sanguíneo.
Medios artificiales son imitaciones de las naturales, entre ellas tenemos a solución
salina fisiológica SSF de Nace Cl Na al 0.85%, sol de Ringer, Loche, Loock, Pages,
Tyrode . fitohemaglutinina Ellas contienen cloruros, fosfatos y carbonatos. Por Ejm:
Tyrode contiene Na Cl 8g, KCl 0.20g, CaCl2 0.20g , MgCl2 0.20g, NaH4 PO2 0.05g,
NaHCO3 1.00g, glucosa 1.00 pH 6.5 hasta pH 7, para un litro de agua detilada,
Tampón fosfato salino (PBS ) comúnmente usada en la investigación biológica. Se
trata de una solución de salina en agua que contiene cloruro de sodio, fosfato de
sodio, y, en algunas formulaciones, cloruro de potasio y fosfato de potasio. Grupos
fosfato del tampón ayudan a mantener un pH constante. Las concentraciones de iones
y osmolaridad de la solución generalmente coinciden con los del cuerpo humano NaCl
8.01g, KCl 0.20g, Na2HPO4 2HO 1.78g, KH2PO4 pH7.4
RPMI 1640 es un medio bufferizado a base de bicarbonato, enriquecido con
proteínas, carbohidratos, aminoácidos, vitaminas, minerales y otros suplementos en
proporciones adecuadas para mantener el crecimiento celular.
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Suero Fetal Bovino (SFB) es un suplemento del medio que entre muchos otros
componentes posee factores de crecimiento que estimulan el cultivo y es
determinante para la adaptación de las células al nuevo ambiente artificial.
Fitohemaglutinina (PHA) fitohemaglutinina fracción proteica de las semillas del
frijol colorado común Phaseolus vulgaris, aglutina tanto hematíes como leucocitos, se
une a determinados oligosacáridos y estimula la mitosis en diferentes estirpes
celulares, es una glucoproteína vegetal (lectina) la cual se acopla a las proteínas de la
membrana de los linfocitos en las primeras 24 horas de crecimiento del cultivo para
actuar como un agente mitógeno que induce la transformación blástica de los
linfocitos. Posteriormente los propios linfocitos segregan interleuquina 2 para
continuar el estímulo.
COLORANTES VITALES se utilizan a menor concentración. 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001
son tinciones directas porque el colorante interacciona directamente con el sustrato,
sin otro tratamiento previo, en realidad no colorean solo se depositan en las
concavidades de estructuras
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia
son:
Moléculas cargadas Positivamente (cationes) Básicos se combinan con intensidad
con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos
nucleídos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de
metileno, el cristal violeta y la safranina.
Moléculas cargadas negativamente (aniones) Ácidos se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de
colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con
los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización
de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el
negro Sudán. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas
las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que
oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de
bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no
se tiñe.
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Para prolongar la observación se han ideado los cultivos en portaobjetos, como la
cámara húmeda, con agar nutritivo o e portaobjetos excavado con algún medio
líquido nutritivo como la fitohemaglutinina.
Un medio de cultivo es un sustrato creada para proliferación de organismos
unicelulares procariontes o eucariontes, o para células de organismos pluricelulares,
con el fin de contar en laboratorio con la suficiente cantidad de estos para
experimentación, permitiendo estudiar su morfología, su fisiología, su genética, las
interrelaciones, sus reacciones frente a diferentes tratamientos, identificación ,etc. Los
cultivo deben contener nutrientes entre ellos donadores y aceptores de carbono,
nitrógeno, oligoelementos, aminoácidos, purinas y pirimidinas, vitaminas y
condiciones como: humedad, aireación, concentración de hidrogeniones,
temperatura, tonicidad. De acuerdo a sus propios requerimientos
Los organismos pueden ser aeróbicos o anaeróbicos, facultativos aeróbicos, o
facultativos anaeróbicos, ser termófilos, sicrófilos, mesófilos.de ambiente neutro,
básico, o ácido. etc. Los medios de cultivo por su consistencia pueden ser:
Sólidos permiten el aislamiento y los líquidos permiten la competencia,
bifásicoscontienen parte sólida en el fondo y una parte líquida encima. Por su
contenido de nutrientes pueden ser medios básicos, especiales, específicos
Portaobjeto con el medio de
cultivo inoculado, más el
cubre objeto Puente de
vidrio
Papel secante humedecido con
agua estéril
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TIPOS DE PREPRADOS pueden Ser:
Frotis común se realiza con asa microbiológica, pipeta Paster, varilla o vageta
tomando una suspensión de microorganismos, células, que se extienden sobre el
portaobjetos.
Preparado en gota pendiente se realiza en porta objetos excavado sobre el que se
coloca un cubre objetos barnizado con vaselina o parafina líquida en el contorno
formando un círculo, en cuyo interior se coloca la suspensión de microorganismo, se
adhiere al portaobjetos, para observar motilidad
Preparado en gota se toma una gota de secreción con una pipeta, se coloca sobre el
portaobjetos, y se protege con el cubreobjetos para observar, o se toma una muestra
con palillo aplicador y coloca sobre gota de solución salina fisiológica haciendo girar
(homogenizar), se protege luego con el cubreobjetos.
Squach se realiza presionando estructuras externas frágiles para revelar contenido
interno, sirve para incriminar vectores o intermediarios. o bien con el extremo plano
de un lápiz se completa la disgregación de células meristemáticas.
Frotis tipo sanguíneo se realiza con el bisel de un
portaobjetos puesto sobre la gota de sangre colocada en
un extremo de un segundo portaobjetos, para observar
morfología de los elementos conformantes
Esterilización a calor directo cultivo en agar
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Scotch tape para tomar muestra directa de hongos ectoparásitos, de insectos
ectoparásitos y Scotch Tape de Graham para tomar muestra directa de huevos de
Oxiurus, Enterobius, Taenias ubicados en periferie de la ampolla anal.
Método de "pin tape" (PT). Consiste en una lámina de polivinílico de 8 x 3,5 cm,
que posee en su extremo superior una parte engomada y cubierta con plástico; en el
momento de usarlo se desprende el plástico protector y se coloca en la región anal.
Se coloca una lámina a cada persona a muestrear apenas concibe el sueño y no se
quita hasta la mañana siguiente (5.00 a 6.00 horas) en que se recupera la pequeña
cinta para colocarla en un sobre y se trasladarla al laboratorio para el análisis
microscópico de huevos de: Oxiurus, Enterobius, Taenias ubicados en periferie de la
ampolla anal.
Cultivos de tejidos vegetales Los medios de cultivo, líquidos o semisólidos, difieren
básicamente por la presencia de un gelificante, contienen carbohidratos como fuente
de carbono y energía (generalmente sacarosa), sumado a minerales, vitaminas,
aminoácidos, suplementos orgánicos y en muchos casos fitohormonas o compuestos
sintéticos conocidos como reguladores de crecimiento, son mensajeros químicos
vegetales secretados en un determinado tejido y que actúan en el mismo tejido, o en
otro distinto de la planta y por ello, se les considera biocatalizadores junto con los
enzimas y las vitaminas. Las hormonas vegetales pertenecen a cinco grupos cada uno
de los cuales exhibe propiedades fuertes de regulación del crecimiento en plantas y
pueden ser activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta, estos grupos
son: Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido Abscísico y Etileno.
CONDICIONES DE UN PREPARADO PARA EXAMEN INVIVO
Debe realizarse en una sola capa de células, debe ser homogéneo transparente,
mantener la humedad , la concentración de hidrogeniones pH del espécimen a
estudiar, mantener la isotonicidad, etc. Debe ser observado inmediatamente, ya que
son efímeros, por que NO pasan por proceso de fijación.
Las células no son solamente tan pequeñas invisibles a simple vista, también son
incoloras y translúcidas en su mayoría. Dilucidar este hecho permitió el desarrollo de
un surtido de técnicas colorantes que asegurarían un contraste suficiente para poder
visualizar las células en toda su estructura y complejidad, estas exigencias de
visualización, hacen que en el siglo XX, la observación de detalles de la ultraestructura
de los componentes más finos del citoplasma, se diera gracias al empleo de la
microscopía electrónica.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
19
La observación de las células permite estudiar principalmente la estructura; aunque
también a partir de hallazgos en las micrografías, que son imágenes estáticas, se
puede inferir sobre alguna actividad celular o proceso fisiológico. Las células no
pueden sobrevivir si son separadas del organismo al cual pertenecen, por lo que
requieren condiciones especiales para poder subsistir o perpetuarse y de la simple
observación se puede pasar al aislamiento y cultivos celulares, técnicas estas que
permiten obtener datos relacionados directamente con las actividades fisiológicas de
las células y sus relaciones con el entorno.
PREPARADOS POST MORTEN Es el conjunto de operaciones a las que se somete un
material organizado, biológico, para hacer posible su estudio a microscopía,
posibilitando la observación de las estructuras no visibles al ojo humano. Son
preparados que han pasado por la narcosis proceso que aplica sustancias anestésicas
entre ellas morfina, codeína, cloroformo, nicotina, cocaína, cloretano. para tomar la
muestra, para luego de este anestesiado o relajación someterlo a la muerte celular
tanatosis con fijadores.
La Fijación es un proceso mediante el cual se trasforma el coloide protoplasmático
en geles insolubles e irreversibles por coagulación o por precipitación. Cuanto más
denso sea el coloide protoplasmático mejor es su conservación.
La fijación es paso imprescindible para un preparado post morten, que permite el
estudio morfocitológico, histológico, citoquímico, histoquímico, ultraestructural.
Obtención del material se obtiene por: Biopsias, material obtenido de necropsias,
de animales de laboratorio, de estudios experimentales en animales, o de vegetales;
de material de cultivos de tejidos, de frotis o extendidos, etc.
Instrumental de cirugía menor para obtención de tejidos, punch para biopsia.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
20
Necropsia para obtener muestras para estudio
Fijación
Detiene estructuras celulares y tisulares, manteniéndolas lo más parecido posible a lo
que fueron en vida, generando coagulación o precipitación del coloide
protoplasmático para convertirlo en geles insolubles e irreversibles, mejorando los
índices de refracción, endureciendo la muestra, lo que facilita la microtomía, la
fijación debe ser lo más precoz posible, con capacidad de difusión, y de penetración
aceleradas. La fijación prepara a la muestra para los posteriores procesos: coloración,
inclusión microtomía, Los fijadores ingresan por difusión desde células periféricas
hasta el interior. Dependiendo de Su gradiente de penetración, su poder, difusión y la
barrera proteica. El tiempo de aplicación debe ser el establecido en la metodología,
debe conocerse su composición , utilidad y calidad, para una aplicación pertinente.
Cualidades de un buen fijador:
Rapidez de penetración y de acción
Gradiente de oxido reducción, Ph ácido es mejor que neutro y este mejor que los
básicos, Los ácidos actúan coagulando No beben obstaculizar posteriores procesos,
Tonicidad adecuada de preferencia isotónicos, Actuar matando lo más rápidamente a
la célula, llevándola a su estabilización
Actuar con rapidez y detener los procesos autolíticos. Buen poder de penetración.
Conservar lo más fielmente la estructura del tejido. No interferir y facilitar los
procesos posteriores. Endurecer el tejido y darle mayor consistencia. Insolubilizar los
componentes de los tejidos. No producir estructuras artificiales.(artefactos).
La fijación debe favorecer a la sucesión de procesos Sig: Proceso de inclusión,
obtención de cortes o microtomía, Proceso de coloración, Montaje final.
Clasificación:
Fijadores físicos
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Calor seco directo por pasajes del frotis a la acción de la llama del mechero, se
emplea más para procariontes
Calor húmedo (vapores) se utiliza para algunos estudios de samgre,
Frío solo por congelación o por congelación y desecado , (Actua con rapidez y
detiene los procesos autolíticos) para estudios fisiológicos, hitopatológicos,
citológicos, histoquímicos
Fijadores Químicos
Por la intervención de componentes
a) Simples: constituido por una sola sustancia: Formol al 10%: Es muy usado,
Aldehído, glutárico o glutaraldehido, Acetona en frío.
b) Compuestos o mezclas fijadoras, constituidas por varias sustancias: Liquido de
Flemming: (mezcla cromo-osmio-acética) para estudios citológicos, Liquido de Bouin:
(mezcla picro-formol-acética) Muy penetrante.
Coaguladores: Formol, alcohol, sales de mercurio, cromo, uranio, ácidos pícrico y
acético
Por su poder óxido reductor
Reductores, al contacto con las sustancias orgánicas formando un precipitado fino:
ácido ósmico, bicloruro de mercurio.
Oxidantes Ácidos minerales entre ellos ácido crómico y ósmico, sales minerales:
bicromatos, bicloruros. Ácidos orgánicos: Acético, tricloroacético, pícrico ,
trinitroformol
Por su base química pueden ser:
A base de formol CH2=O o formaldehido no deshidratan tejidos, es un buen fijador
histológico, mediocre para células bueno para investigaciones estructurales y
topográficas, para el estudio de mielina. Actúa mediante la formación de puentes
entre las moléculas tisulares. Se utiliza a concentraciones entre el 5 a 10 %.
ampliamente usado por la buena preservación del tejido, produce poca retracción
tisular, es un buen fijador para lípidos, es compatible con la mayoría de las tinciones
histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica e hibridación de ácidos
ribonucleicos. Normalmente se usa en solución tamponada e isotónica. Puede
generar pigmentos negros=pigmento formólico, para evitarlo se sumerge en alcohol
amoniacal
A base de Alcohol: metílico, etílico, Alcohol amoniacal, Carnoy, Shaudin Estos fijan
glucógeno, para el fijador de Carnoy, las muestras deben ser de pequeño volumen 3
a 4 mm de grosor, solución de Carnoy preparada con Metanol absoluto (Deshidrata
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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y fija los cromosomas) y Ácido acético glacial (degrada la membrana citoplasmática)
en una proporción 3:1 antes de extender en una placa 2 o 3 gotas de la preparación
cromosómica procesada. Etanol: CH3-CH2-OH Alcohol etílico. es buen fijador
nuclear Fija por deshidratación se usa al 70 y 90 %. Preserva moléculas: ciertas
enzimas, propiedades antigénicas, glucógeno, pigmentos y extensiones citológicas.
Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se puede usar también como un
conservante de las muestras. Tiene inconvenientes como el endurecimiento y la
retracción de los tejidos. Carece de efecto mordiente.
Ácido acético. CH3COOH fija cambiando el estado coloidal de las proteínas. Se
utiliza a una concentración entre el 1 y el 5% es ideal para ácidos nucleicos y
nucleoproteínas. Pero genera destrucción de las mitocondrias y mala fijación de
membranas y citoplasma. Se suele usar en combinación con otros fijadores.
A base de ácido pícrico y picroformol fijan bien muestras voluminosas, deben ser
lavadas en alcohol, es favorable a coloraciones topográficas,es malo para
impregnaciones argéntcas, no permite el uso de azul de toluidina y tionina
A base de bicromato de potasio: Líquido de Orth
A base de ácido pícrico- Líquido de Bouin: contiene 75 ml de solución acuosa
saturada de ácido pícrico, 25 ml de formol y 5 ml de ácido acético glacial muy
utilizado para el tratamiento de tejidos que se incluirán en parafina, muy útil para
tejidos blandos y embriones, y preserva bien el núcleo y el glucógeno. Tras la fijación
las muestras de tejido se pueden conservar en alcohol de 70°. Es malo para el riñón y
el estudio de mitocondrias. lavar en alcohol de 70°
A base de glutaraldehido Forma puentes entre las moléculas de los tejidos. Se usa a
una proporción de entre el 0,5 al 3 %. preserva la estructura celular, por lo que es el
fijador para observación de ultraestructuras celulares con el microscopio electrónico.
Pero tiene baja penetración tisular y puede producir retracciones. Se usa en
soluciones tamponadas isotónicas. La mezcla glutaraldehído al 2.5% en un tampón a
pH 7.4y paraformaldehído (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados en tetróxido
de osmio al 1 % en solución tamponada. Es un buen preservador de la
ultraestructura celular, sobre todo membranas, en cooperación con los aldheídos.
para microscopía electrónica y polimerización de resinas a 60 °C, Actúan como
colorantes electrodensos
A base de tetroxido de osmio Forma puentes entre moléculas. Se emplea al 1 % en
soluciones tamponadas. fijador de la ultraestructura de células para observaciones
con microscopio electrónico. Fija para grasas y membranas celulares. Por su fuerte
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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carácter oxidante no se usa para tinciones convencionales, excepto para las
impregnaciones argénticas como el método de Golgi.
Deshidratación de efectúa en batería de alcoholes de diferente gradación
Tiene por finalidad la extracción del agua del tejido para que la parafina ocupe su
lugar, para ello se emplea una serie de alcoholes en concentración creciente: 70º, 80º,
96º, 100º. Las piezas se dejan en la serie creciente de alcoholes adaptando el tiempo
de permanencia al contenido de agua de la pieza, a su tamaño. El tiempo varía según
el tamaño de la pieza de 1 a 12 horas en cada alcohol
Inclusión procedimiento que se realiza para generar consistencia, dureza a la
muestra para obtener cortes delgados, en un solo plano y uniformes, es necesario
que las piezas adquieran una dureza determinada. En el método de inclusión
tenemos: celoidina gelatina, mixta, parafina
Congelación del material de estudio: Este procedimiento confiere a los tejidos un
endurecimiento uniforme y permite realizar diagnósticos inmediatos y estudios
histoquímicos, ya que la congelación no altera la composición química de los
componentes histológicos del material a examinar.
Inclusión en parafina una mezcla de cadenas de 22 carbonos hasta 29 carbonos,
hidrocarburos saturados utilizada en la Técnica Histológica. Es variando su punto de
fusión entre 45º a 60º C,. que Se licuefacta con facilidad.
Las muestras , después de haber sido aclaradas, se pasan a una mezcla de parafina
líquida con líquido aclarante (xilol), en partes iguales en estufa durante una hora. Al
cabo de los cuales se introducen en parafina líquida sola, para que la parafina
impregne totalmente por 4 horas, para posteriormente formar el molde o taco
usando un molde o las barras de Leuckart, colocando dentro la muestra, sobre la que
se vierte la parafina líquida a 60º C cuidando de orientarla convenientemente para
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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saber después la dirección en que debe ser cortada. Se deja a enfriar a temperatura
ambiente durante 30 minutos o más, y una vez solidificada se retira del molde
obteniéndose de éste modo el taco que queda listo para ser cortado en micrótomo
Micrótomos: criostático de mano de mesa
Aclaración o diafanisado. Una vez obtenida la deshidratación, se coloca a la muestra
en el cloroformo, toluol, xilol o benzol, siendo pasado cada 1 a 3 horas en cada baño.
una o dos veces, produce una transparencia característica, al emplear el Benzol o
xilol se le puede agregar ácido carbónico o fénico para aumentar su eficacia.
COLORACIONES Desde 1770 se vienen utilizando coloraciones simples, a partir de
1807 coloraciones compuestas en investigaciones biológicas, los colorantes penetran
por ósmosis dando contraste a estructuras biológicas, que de por si solas no las
tienen. En 1665, Robert Hooke vio composición del tejido, tras observar muestras
vegetales diafanizadas con suero glicerinada, Leeuwenhoek (1714) aplicó por primera
vez un agente colorante natural para mejorar la observación microscópica de fibras
musculares de mamífero al emplear una solución alcohólica de “saffron”.Hill (1770)
aplicó carmín para la demostración del sistema vascular en plantas, Link (1807) utilizó
sales férricas para visualizar el tanino celular en tejido vegetal, Raspail (1825) empleó
yoduro para colorear los gránulos de almidón presentes en semillas germinadas,
Hartig (1854) coloreó núcleos y Böhmer hizo lo mismo pero con hematoxilina en
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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1865. Prout (1855) tuvo la brillante idea de hacer reaccionar los ácidos nítrico y úrico
para obtener murexide, primer colorante sintético y Perkin, en 1856, produce un
colorante anilínico, año en que comienza la producción industrial de distintas anilinas
sintéticas, Ehrlich (1879) fue el primero en teorizar sobre los mecanismos de la tinción
histológica al informar que tanto los colorantes como los componentes del tejido
debían presentar sitios cargados eléctricamente y que sería natural que interactúen
por unión iónica, Mann (1902) puntualizó que hay mecanismo físico-químico
producido durante la unión colorante-tejido, Baker en 1958 publicó su libro titulado
“Principios biológicos de la microscopia”, para explicar con gran precisión, los
mecanismos de la coloración y su relación con los diferentes métodos de fijación
biológica
Clasificación
I por su naturaleza:
Colorantes naturales, se extraen de vegetales ( Palo azul o del Campeche) o de
animales (Cochinilla) , poseen radical cetónico, entre ellos orceína, hematoxilina
Colorantes artificiales se extraen del carbón mineral o hulla, tienen radical
bencénico
II por la base química de cromóferos :
Básicos catiónico (+), presentan los grupos azo -N = N, Azin =N-N=,
Indoamino –N=
se utilizan para la tinción de núcleos, nódulos, gránulos de secreción, paredes
vegetales en proceso de lignificación: Naranja de metilo, naranja G, Pardo de
Bismark, rojo de Burdeos, rojo de Congo, verde de Jano, azul de Tripán, Negro Sudan
B, azocarmin, nigrosina, azul de metileno.
Acidos aniónicos (-), presentan los radicales nitro -N o Quinona
O = = O
son colorantes esencialmente citoplasmáticos, colorean el protoplasma y paredes
lignificadas, los principales: eosina, eritrosina, verde brillante, naranja , fucsina ácida.
Verde de metilo, violeta cristal, pararrosanilina.
Neutros tienen componentes equilibrados ácidos y básicos como los eosinatos azul
de metileno: Giemsa, May Grunwald giemsa, Romnowski, Leishmam.
Tecnicas de coloración
Coloraciones citológicas:
Nucleares como el rojo neutro, lacas de hematoxilina, como la de Hansen, Mason
este es mejor que el hemalun de Mayer y al hemalum glicerinado. Hematoxilinas
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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férricas, como la de Regaud, se usa para cortes delgados, Hematoxilina de Hansen, de
Croat.
Reacción nuclear de Feulgen Rosenbeck coloración citoquímica, caracteriza al ácido
ribonucleico, presente en cromatina y cromosomas, fundamentada por la hidrólisis
de bases púricas y pirimidinicas, libera los enlaces glucocídicos y revela las funciones
aldehídicas que colorean el reactivo de shiff.
Citoplasmáticas O de fondo, eosina eritrosina, naranja G, azul de metileno.
Para estructuras ergastoplásmicas que son un conjunto de estructuras
citoplasmáticas filamentosas, granulosas al microscopio electrónico, ricas en
ribonúcleo proteínas, son teñidas con verde de metil pironina o de Pappenhein
Unma, en lugar de esta se puede también utilizar May-grunwald Giemsa, galocianina,
azul de toluidina, y la de Man-Dominici.
Colorantes mitocondriales : Hematoxilina de Regaud, de Cowdri, Bensley, Fucsina
de Altmann.
Para gránulos secretorios: Fucsina paraldehído de Gab, Eritrocina-Naranja azul de
toluidina de Mann-Dominici, hematoxilina crómica de Gomori (para estudio de islotes
de Langerans)
Coloraciones topográficas para anatomía microscópica: Hemalum eosina,
Hemalum-floxina –azafran de Masson, verde solido de Masson.Para fibras colágenas
también las anteriores coloraciones.
Para fibras basales y reticulares : impregnaciones argénticas (Plata amoniacal) de
Wilder, Del Río Hortega.
Para fibras elásticas: Orceina ácido Nítrico,Col. De Gallego(Fucsina de Ziehl-Picro-
índigo-carmin),Fucsina paraldehído de Gabe
Para neurofibrillas : Del Río Hortega, de Bodian (proteinato de plata-hidroquinona),
de Holmes.
Coloraciones metacromáticas: bajo la acción de un solo colorante, ofertan colores
distintos, entre ellos está el azul de toluidina (con 5 componentes en su espectro de
acción), detecta en principio sustancias de peso molecular elevado,portadoras de
grupos aniónicos, Azur A.
Coloraciones especiales : uso de fluorócromos, rhodamina, fluoresceína, auramina 0,
biotina.
Montaje final
Se coloca el cubreobjeto laminilla de vidrio de 0,2 mm de espesor, que va adherirla
con una sustancia de montaje, con la finalidad de recubrir y proteger al preparado
elaborado.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Sustancias de montaje se emplea resinas como: Bálsamo de Canadá. resina natural,
menos utilizado ahora, es de menor costo, Euparal, Clarite, DPX. Technicon son de
mayor costo mejores que la anterior porque presentan altos IR y secan rápido.
un buen medio de montaje une, cubre muestra y portaobjetos, rápidamente, debe
ser químicamente neutro, transparente, incolora, no alterarse con el tiempo, sobre
todo tener un índice de refracción alto, así tenemos: Glicerina IR= 1.47, parafina
líquida IR= 1.47, aceite de cedro IR= 1.51, Bálsamo de Canadá IR= 1.53, Euparal IR=
1.6 Clarite IR= 1.61 DPX IR= 1.6. Technicon IR= 1.63.
Célula de Pisum,
coloración: safranina-fast-green
Traqueidas del leño de Pinus
Coloración: safranina
Microscopios
Clasificación por sus componentes:
• Microscopio simple: o lupa, consta de una sola lente biconvexa o una pila de lentes
acrommáticos, las mejores son anastigmáticas.
• Microscopio compuesto: Llamado así por estar formado por tres sistemas de
lentes: Oculares, Objetivos y el Condensador, pudiendo ser monoculares, binoculares
o trinoculares.
Microscopios del siglo XVII y actuales
Invertoscopios Son binoculares o trinoculares de campo claro, cuyos oculares están
por debajo de la muestra a observar. Muy utilizados para lectura de cultivos.
Comparativamente los estereoscopios son instrumentos ópticos que ofertan visión
tridimensional del objeto analizad, para lectura de cultivos.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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E. de campo elevado SYCOP presenta estabilidad impresionante e imágenes
bastante grandes
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES Fue desarrollada por Zernike en 1932. Se
basa en el retraso que se produce en las ondas de luz al atravesar objetos de
distintos índices de refracción, aprovechando y amplificando dichos retrasos, permite
observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.
Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas
partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. Fue desarrollada
por Zernike en 1932. Se basa en el retraso que se produce en las ondas de luz al
atravesar objetos de distintos índices de refracción, aprovechando y amplificando
dichos retrasos, permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para
células vivas.
Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen;
las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto
estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes
semifinos no coloreados
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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formas de discos de fase, positivos y negativos, los que tienen distintos efectos
sobre la luz difractada, haciendo que las imágenes se vean de diferente manera
dependiendo cual
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Microscopia de contraste de interferencia diferencial de Nomarski
Usa la combinación de un sistema de luz polarizado y dos rayos divididos para crear
fases de diferencias en la muestra. Esto provee una imagen tridimensional de la
muestra sin los halos que rodean a la célula en las imágenes generadas en los
microscopios de fase de contraste
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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El principio del sistema es el siguiente: Utiliza luz blanca polarizada por el filtro
plano, este rayo de luz monocromático incide en el condensador completamente
abierto y el prisma de Nomarski birrefringente que se encuentra dentro de él,
genera dos rayos de luz paralelos, uno incide sobre la muestra a analizar y el
segundo pasa en forma paralela sobre la muestra
M. de contraste interferencial de Nomarski
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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El objeto de análisis o el espécimen que se encuentra en fase toma direcciones
diferentes de acuerdo con los valores de grosor e índices de refracción que
presente. El prisma (birrefringente) situado sobre la parte posterior del plano focal
del objetivo es usado para re combinar las dos ondas en un solo rayo.
El objeto atravesado por los dos rayos vuelve a otro prisma (Wollaston) que es el
que en realidad crea la interferencia (destructiva o constructiva)
Así el plano polarizado es recapturado por un analizador, que transforma esto en
ondas de vibración de la misma longitud y habilita la interferencia; como respuesta a
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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estas dos últimas acciones tenemos que diferentes regiones del objeto estudiado
aparecerán con más brillo o menos brillo sobre un fondo oscuro.
Es útil para determinar el índice de refracción, la concentración de sólidos, la masa
seca y el espesor de las estructuras celulares, procesos como la mitosis o la
migración celular; unido a un método de refractometría por inmersión, Produce una
imagen brillante contra un fondo oscuro sin halos de difracción de una célula viva.
Desventajas Su alto costo, por los diferentes aditamentos utilizados para
microcinematografía requerida para el seguimiento de los procesos que realiza la
célula in vivo y mantenimiento cuidadoso de la muestra de células vivas, láseres,etc
Microscopio de campo oscuro
Está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte
indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrás de la muestra como un
fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra
que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las partículas de
polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una
habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de polvo llegan hasta la retina
del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite incluso distinguir partículas
más pequeñas que el poder separador del sistema óptico usado por transparencia.
La iluminación de campo oscuro se puede realizar tanto mediante luz transmitida
(trans-iluminación) como con luz incidente (epi-iluminación). En el primer caso, para
lograr el efecto se requiere bloquear la parte central del rayo de luz que
normalmente pasa a través y alrededor del espécimen, de tal manera que sólo sea
iluminado por rayos oblicuos. La manera más fácil y económica de lograrlo consiste
en colocar un filtro circular opaco (por ejemplo círculos de cartulina negra o una
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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moneda adherida a un círculo de vidrio o plástico transparente) bajo el
condensador de un microscopio compuesto ordinario. Esta maniobra funciona bien
con objetivos de 10x-40x; el diámetro del circulo opaco debe ser de
aproximadamente 16-18mm para un objetivo de 10x cuya apertura numérica sea de
0.25. Para un objetivo de 20x o 40x con una apertura numérica de 0.65, el diámetro
del círculo opaco debe oscilar entre 20-24mm. Para la iluminación con luz incidente
o iluminación oblicua se emplea un filtro en forma de luna en cuarto decreciente (en
forma de C), obteniéndose una interesante imagen con relieve
Micrografías de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste entre
los diversos tipos de iluminación. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro
empleado, en campo claro (derecha) el haz de luz pasa sin interrupción. En campo
oscuro, aún muchos detalles más pequeños son visibles. En iluminación oblicua se
obtiene contraste con relieve. En campo claro el contraste es limitado. Wim van
Egmond (2002). Modelos de filtros de fácil realización para lograr la técnica de campo
oscuro (izquierda y centro) e iluminación oblicua (derecha, en cuarto decreciente).
Para campo oscuro el diámetro de la máscara negra central dependerá del objetivo
que se emplee. Con objetivos de mayor aumento y apertura numérica, se requiere un
disco negro de mayor diámetro. Wim van Egmond (2002).
La iluminación Rheinberg combina la iluminación convencional de campo claro en un
color con la iluminación de campo oscuro en otro color
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Algunos ejemplos de modelos de filtros empleados para la iluminación Rheinberg
que pueden ser fabricados con plástico de colores o pintados con marcadores
permanentes para transparencias. Un filtro de color verde en la periferia incrementa
los detalles porque el ojo humano visualiza muy bien ese color. Es importante que el
filtro central sea más oscuro que el filtro periférico. Se pueden emplear los colores
que se deseen
.
Microfotografía de un nematodo iluminado con la técnica de Rheinberg. El parásito
aparece de color azul claro sobre un fondo violáceo. Tomado de Santamaría Nino
(2007)
El método más apropiado consiste en el empleo de un condensador característico
que además mejora la resolución.. Con este dispositivo se forma un cono hueco de
luz (cuyo centro es oscuro) que incide lateralmente sobre la muestra y sólo los rayos
que son difractados o reflejados por las estructuras penetran en la lente objetivo y la
célula aparece como un objeto luminoso sobre un fondo oscuro
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
36
.
Requiere condensadores :Paraboloide y cardioide ambos son utilizados con el
mismo fin, pero el cardiode tiene mayor aplicabilidad en la investigación con
Treponemas y estructuras semejantes, Para que el efecto de campo oscuro se logre ,
la apertura numérica del condensador debe ser mayor que la de el objetivo, lo cual
ocurre con los objetivos de pequeño y mediano aumento no así con los de
inmersión, a los cuales deberán adicionarse un diagrama de suspensión para la
reducir la apertura numérica. Permite analizar partículas dispersas en un medio
homogéneo. Hace posible la observación del movimiento Browniano de las
partículas. Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear.
Visualiza los bordes destacados de las muestras.
Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum,
espiroquetas con diámetros superior a 0.2 um. Para células epiteliales observadas
(Wegerhoff, R., Weildich O, Kassens M. (2005). Basis of light microscopy image)
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Permite el estudio de especímenes de tamaño pequeño no coloreados, tales como
microorganismos acuáticos, ovocitos, células en cultivo (cuyos índices de refracción
oscilan en un rango de 1.2 a 1.4 y no hay una diferencia notable con el índice de
refracción de 1.3 de la solución acuosa en la cual se encuentran). Observación de
células móviles, como el Treponema pallidum, una espiroqueta causante de la sífilis,
la cual con la microscopía óptica ordinaria es muy difícil de visualizar. Estudio de
procesos fisiológicos como mitosis y migración celular.
Microscopio de fluorescencia es una variación del M. de luz ultravioleta en el que
los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda La
imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las
moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor
longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben
colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa
para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas
con fluorócromos.
La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente
por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año
1935 por Alexander Jablonski. Es la propiedad que tienen ciertos elementos
químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando
sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una
longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática
azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda (de un determinado
color, verde, rojo, amarillo). Es un fenómeno de luminiscencia de vida corta, emitida
simultáneamente con la excitación.
E l fenómeno de fluorescencia se produce cuando un electrón de un átomo absorbe
toda la energía de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros
orbitales. Es una situación inestable durante la cual se emite la mayor parte de la
energía que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a
su orbital
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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El fenómeno de fluorescencia se produce cuando un electrón de un átomo absorbe
toda la energía de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros
orbitales. Es una situación inestable durante la cual se emite la mayor parte de la
energía que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a
su orbital.
Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear
contraste en zonas determinadas de los especímenes.
Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la
propiedad de fluorescencia.
Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de
absorción y de emisión específico que depende de la composición y estructura de la
molécula fluorescente
Algunos de los principales fluorócromos (Costa J. 2004)
Fluorocromo Longitud de onda de
absorción (nm)
Longitud de onda
de emisión (nm)
Cascade blue 374-403 422-430
Fluoresceína (FITC) 494 520
Rodamina (TRITC) 540 570
Naranja de acridina 460-502 526-650
Yoduro de propidio 536 617
Existen fluorocromos intracelulares naturales, tales como nucleótidos de nicotina
reducidos (NADH, NADPH), nucleótidos de flavina oxidados, clorofilas, proteínas
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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fluorescentes (Green Fluorescent Protein GFP) y esto debe ser tomado en cuanta al
realizar esta técnica con marcadores fluorescentes.
La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente, aún
cuando sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite. Los
fluorócromos actúan como fuentes de luz de un color determinado que pueden ser
localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia. El marcaje selectivo de
moléculas y otros compuestos celulares se realiza mediante la técnica de
inmunofluorescencia
Implementos necesarios:
• Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en
el espectro específico de cada fluorócromo. Hay que tomar en cuenta que la
fluorescencia es pasajera y la iluminación produce un efecto de fotoblanqueo en el
fluoróromo; además, las células vivas pueden ser dañadas por la intensa radiación. La
luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lámparas de mercurio a alta
presión que funcionan de un modo diferente a las lámparas de filamentos
incandescentes. También se utiliza luz ultravioleta y rayos laser.
• Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda,
la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes
no deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espécimen por reflexión de un
espejo dicroico y es nuevamente filtrada para poder ser observada
• Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen
de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica.
. Los filtros empleados son útiles porque por ejemplo, cuando se emplea la
fluoresceína, el espécimen se ilumina con una luz azul monocromática pura y filtrada.
Para visualizarlo se emplea otro filtro el cual es completamente opaco a la luz azul
pero deja pasar la luz verde (o amarilla y roja emitidas por otros fluorocromos). Las
estructuras celulares marcadas mediante inmunofluorescencia aparecen iluminadas
de verde contrastando con un fondo negro.
Micrografias de células en división, tomadas con un microscopio de fluorescencia. Se
emplearon tres fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas, GFP
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
40
(proteína verde fluorescente intracelular que emite luz verde) y rodamina (luz roja)
para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo amerita el uso de filtros específicos,
dependiendo de la longitud de onda necesaria para su excitación, señalada arriba y a
la izquierda en cada imagen y expresada en nm.
Aplicaciones del microscopio de fluorescencia :
• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.
• Estudio de células normales y patológicas.
• Estudios inmunológicos.
• Mineralogía.
Esquema básico de la iluminación en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca
emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El
espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja
pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluoresceína) pero por el
contrario, deja pasar la luz verde emitida.
Microscopio de polarización o Microscopio de luz polarizada
También se denomina microscopio petrográfico o metalúrgico por su uso inicial en el
estudio de minerales, sin embargo su aplicación se ha extendido al campo de la
biología, medicina, química y muchas otras disciplinas.
Esta microscopía puede emplear tanto la luz transmitida como la luz incidente (trans-
iluminación y epi-iluminación respectivamente).
La luz polarizada es la más efectiva en el estudio de muestras ricas en materiales
birrefringentes, la luz proveniente de una fuente estándar de iluminación vibra y se
propaga en todas las direcciones.
Requiere un filtro polarizante el polarizador dispositivo que solo deja pasar la luz que
vibra en un plano determinado denominado eje de polarización estando ubicado
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
41
entre la fuente de luz y la muestra, al pasar por este filtro las ondas de luz y su campo
eléctrico oscilan todos en un mismo plano.
Esquema que muestra el efecto de filtros polarizadores en un rayo de luz. A la
izquierda la luz no polarizada se distribuye en todos los planos, pero al pasar por el
primer filtro (horizontal) éste sólo deja pasar las ondas que se propagan en un plano
horizontal. Si se interpone un filtro polarizador orientado de manera vertical (rotado
90º en relación al horizontal) la luz polarizada no pasa y se detiene.
El analizador va entre el objetivo y el observador. Se puede rotar el polarizador y el
analizador; la diferencia entre sus ángulos de rotación se usa para determinar el
grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. De estructuras
birrefringentes.
Exhiben birrefringencia en el músculo estriado o esquelético y las inclusiones
cristaloides de las células intersticiales .
Se ideó este microscopio para las estructuras internas denominándas anisótropos
cuya organización cristalina es diferente (hexagonal, trigonal, tetragonal, rómbico,
entre otras) por sus constituyentes dispuestos de manera asimétrica y varían según la
dirección; en consecuencia el comportamiento de las ondas luminosas también es
diferente a las isótropas; que presentan un índice de refracción constante, las
anisótropas presentan distintos índices de refracción en relación a la dirección del haz
de luz; cuando un rayo de luz incide sobre la superficie de un material anisótropo
transparente se presenta el fenómeno de la doble refracción o birrefringencia; esto
quiere decir que se producen dos rayos refractados distintos que vibran en planos
diferentes que se propagan con diferentes velocidades en el interior del material, de
allí su uso en cristalografía; sin embargo, también se emplea para estudiar el carácter
birrefringente de muchas estructuras celulares anisótropas.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
42
El contraste de la imagen se observa gracias a la interacción de la luz polarizada con
los elementos birrefringentes del espécimen que producen las dos ondas refractadas,
cada una de ellas polarizada en planos perpendiculares. Una vez que las ondas de luz
salen del espécimen lo hacen de manera desfasada, pero son recombinadas al pasar
por otro filtro o filtro analizador. De esta manera, el microscopio de luz polarizada
permite el estudio comparativo entre minerales tomando en cuenta la absorción del
color e índices de refracción.
Sin embargo, en biología su principal utilidad consiste en distinguir las sustancias
isotrópicas de las anisotrópicas, revelando información detallada sobre la estructura y
composición de los materiales con la finalidad de caracterizarlos para fines
diagnósticos. El ojo humano no capta las direcciones en las que vibra la luz y la luz
polarizada puede ser detectada como un incremento en la intensidad luminosa o
como un efecto de color.
El 90% de las sustancias sólidas son anisotrópicas y como materiales isotrópicos se
pueden enumerar una variedad de gases, líquidos y cristales.
Este microscopio está equipado con:
Un primer filtro polarizador colocado entre la fuente de luz y el condensador que
se puede rotar 360º. Los polarizadores antiguos conocido como nícoles estaban
conformados por un sistema de prismas de calcita descrito por W. Nicol, en los
microscopios actuales el polarizador está constituido por una lámina polaroid, que
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
43
consiste en una película de un polímero transparente (revestida de cristales
minúsculos de sulfato de iodoquinina orientados en la misma dirección) interpuesta
entre dos placas de vidrio
Un analizador o segundo polarizador, colocado por encima del objetivo, entre su
lente posterior y el tubo de observación o cámara fotográfica. También puede rotarse
90º o 360º.
Condensador polarizador Debe estar libre de desperfectos en sus componentes
ópticos.
Platina circular con capacidad de rotar 360º para facilitar la orientación del eje
óptico con el campo de visión. Puede contener un vernier para medir los ángulos de
rotación. El espécimen debe rotarse y colocarse en una posición diagonal en la cual
los elementos anisotrópicos se observarán más brillantes (birrefringentes).
Objetivos polarizadores son diferentes a los objetivos comunes, estos deben estar
libres de desperfectos y tener capacidad polarizadora. Son ensamblados de manera
que se evita en lo posible el daño de las lentes ya que cualesquier daño por mínimo
que sea compromete el rendimiento del objetivo. Poseen la inscripción P, PO, o Pol.
Ocular con una cruz visible en el campo visual para marcar el centro del campo
visual.
Lente de Bertrand situada inmediatamente debajo del ocular, es removible y sirve
para ver la interferencia con la finalidad de ajustar la iluminación de una manera
precisa.
Esquema simplificando la técnica de iluminación con luz polarizada. El filtro
polarizador (1) está localizado por debajo del condensador (2) y el espécimen (3) es
iluminado con luz polarizada lineal. El analizador (5) rotado en ángulo de 90º en
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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relación a (1) está localizado detrás del objetivo (4). Una lente (6) en el tubo forma la
imagen intermedia (7). Kapitza H G. (1997).
La luz polarizada y el contraste se evidencia en la imagen con algunos colores cuando
se emplea otro dispositivo denominado plato lambda.
Micrografía de cartílago hialino visto con luz polarizada en donde se aprecia la
birrefringencia del colágeno que forma parte del pericondrio, correspondiendo a las
estructuras rosadas brillantes. Laboratorio de Investigaciones Histológicas Aplicadas.
Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe, Argentina
Micrografía de luz polarizada de fibrocélulas musculares estriadas en la cual se
aprecia el patrón de bandas y estriaciones transversales. Junqueira y Carneiro (2005)
Se utiliza para Identificar sustancias cristalinas o fibrosas intracelulares (como el
citoesqueleto) y extracelulares (sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales de
uratos y otras de origen exógeno). Identificar y estimar cuantitativamente los
componentes minerales.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Microscopio de barrido confocal
Fue inventado en el año 1955 por el científico estadounidense Marvin Minsky al
estudiar neuronas. Su mecanismo, basado en el microscopio de fluorescencia hace
posible la obtención de imágenes de la arquitectura tridimensional de células y
tejidos. Los detalles de la óptica del microscopio confocal son complejos y
complementado por métodos electrónicos y de computación, este instrumento
permite enfocar únicamente un plano determinado del espécimen, eliminando la luz
(fluorescencia) procedente de las regiones que no están en el plano de enfoque
Se ideó para estudiar la estructura de los materiales biológicos. Emplea un sistema de
iluminación con rayo láser que es muy convergente y, en consecuencia produce un
punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un
tubo fotomultiplicador, donde es analizada, utiliza un sistema de espejos para mover
el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran
los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se puede llevar
la imagen a un monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se
pueden tomar imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de
foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definición máxima a
la imagen, Utiliza potentes rayos láser y ofrece mejor imagen realizada por
computadora, dá imagen Tridimencional de muestras gruesas flourescentes,
ampliamente utilizado en biología celular.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
46
La alta calidad de imágenes que proporciona este microscopio tiene mucho éxito en
el mundo científico
Comparación entre dos micrografías de una célula en mitosis, contrastada con un
doble marcaje fluorescente, tanto para los cromosomas (verde) y la actina (rojo). A la
izquierda se aprecia una imagen donde la profundidad de campo abarca
prácticamente todo el espesor de la célula y en consecuencia la imagen se ve un
tanto borrosa a pesar de estar enfocada. A la derecha se observa una imagen
obtenida con el principio confocal, que consiste en un corte óptico de la célula donde
se captura la fluorescencia que proviene exclusivamente de las estructuras que están
en el plano de enfoque, obteniéndose una imagen más nítida. The Imaging
Technology Group .
Principio de la microscopía confocal
El microscopio confocal añade el principio de iluminar el espécimen punto por punto
y elimina la luz proveniente de los planos no enfocados. Para ello se necesita una
fuente de luz muy potente, así como también un filtro con un agujero que se coloca
en el trayecto del rayo de luz, Minsky lo logró con una lámpara de arco de zirconio,
pero en los microscopios modernos se emplea un rayo laser, cuya longitud de onda
puede estar disponible en un amplio rango de frecuencias.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Esquema que muestra de manera simplificada el principio del microscopio confocal y
el trayecto de la luz. El rayo laser (luz azul) es filtrado por un agujero y un espejo
dicroico; luego es enfocado mediante un lente objetivo sobre el espécimen y
estimula la fluorescencia presente en el mismo (luz verde). La fluorescencia es
recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la refleja y dirige hacia un
detector. Un segundo filtro con agujero se coloca frente al detector y sólo deja pasar
la luz proveniente del plano de enfoque (línea continua). La fluorescencia fuera de
foco de las zonas que están por encima y por debajo del plano de enfoque (en líneas
discontinuas) no pasa por el agujero y por lo tanto no formará parte de la imagen.
Olschewski F. (2000).
Se requiere:
.La luz coherente del rayo láser dirigida por espejos hacia el espécimen (el cual ha
sido previamente tratado mediante marcadores fluorescentes) iluminándolo punto
por punto y de manera seriada; la fluorescencia resultante es medida también punto
por punto. Para obtener la información completa, el rayo laser debe ser desplazado
por todo el espécimen (en los planos x, y, z) y este proceso es lo que se conoce como
escaneo o barrido. Para reconstruir las imágenes a partir de los datos obtenidos, se
emplean programas de computación adecuados.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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.La fuente de luz: Generalmente emplea una fuente de luz muy poderosa (laser o
lámpara de arco). Se pueden utilizar sistemas de rayos láser multi-frecuencia (en el
rango ultravioleta, luz visible e infra-roja) adaptados a los tipos de marcadores
fluorescentes empleados para el contraste de los elementos celulares. Se han
desarrollado dos técnicas, la de escaneo con un solo rayo (laser) y el escaneo con
múltiples rayos. La primera es la más popular y emplea un par de espejos controlados
por computadora para escanear el espécimen. La técnica multi-rayos utiliza una
lámpara de arco y el escaneo se realiza gracias a un disco rotatorio (disco de Nipkow)
conformado por micro-lentes y micro-agujeros. Esta última técnica de iluminación
disminuye el daño a los especímenes e incrementa la detección.
• Sistema óptico: está complementado con los avances en óptica moderna y la
tecnología electrónica.
• Filtros de interferencia: Incluyen espejos dicromáticos o dicroicos, barreras con
agujero de diámetro variable y diversos filtros de excitación (para seleccionar la
longitud de onda de excitación del fluorócromo).
• Detectores: Son fotodetectores muy sensibles a la fluorescencia emitida. Para los
microscopios con múltiples rayos generalmente se usan cámaras CCD (charge-
coupled device).
• Computadora: Configurada con los requisitos suficientes de memoria y
procesador, tarjetas de video de alta resolución, complementadas con software de
captura, análisis y procesamiento de imágenes, así como también de impresoras de
muy alta calidad.
Micrografías comparativas entre las técnicas de fluorescencia con iluminación
convencional o de campo amplio (serie superior, a, c, e) y la iluminación en
microscopía confocal (serie inferior b, d, f). Nótese en la serie superior la cantidad de
señal (fluorescencia) que está fuera de foco y la contrastante nitidez de las imágenes
de la serie inferior en las cuales sólo se obtiene exclusivamente la información del
plano de enfoque. Las muestras de la izquierda (hipotálamo de ratón) y centro
(músculo liso de rata) fueron marcadas con diversos fluorocromos (dobles y triples
marcajes). Las imágenes de la derecha corresponden a un grano de polen de girasol
el cual es autofluorescente. Claxton N, Fellers T, Davidson M. (2008).
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
49
Con el microscopio confocal es posible obtener una imagen de un plano
determinado del espécimen. Esta imagen se denomina sección o corte óptico fino y
puede estar en el rango de 0.5-1.5 micrómetros. Se pueden obtener de una manera
no invasiva a partir de especímenes fluorescentes cuyo espesor puede variar entre
50-100 micrómetros (121). Las imágenes se obtienen en una secuencia o serie, de
manera manual o mediante un sistema automatizado. Las imágenes 2D (dos
dimensiones) obtenidas a intervalos regulares siguiendo el eje óptico son
combinadas y utilizadas para recrear una estructura en tres dimensiones (3D)
mediante el empleo de software especializados.
Secciones ópticas seriadas de un grano de polen de Pinus contorta. Cada imagen fue
obtenida a un intervalo de 3 micrómetros. Claxton N, Fellers T, Davidson M. (2008).
Se observa reconstrucciones tridimensionales a partir de cortes ópticos obtenidos
con el microscopio confocal. (a) grano de polen, (b) muestra de hígado de ratón, (c)
corte grueso de corteza cerebral de rata. En los que emplearon varios marcadores
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
50
fluorescentes. (d) auto fluorescencia de una porción de raíz de helecho. Las
reconstrucciones fueron realizadas a partir de series de 30-45 cortes ópticos. Claxton
N, Fellers T, Davidson M. (2008).
El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o
fluorescente procedente de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina una
pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal,
eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores (Boyde,
1988). La luz procedente de un láser es reflejada mediante un espejo dicroico, y con
la lente de un objetivo es enfocada en un punto de la muestra. La señal emitida por el
punto iluminado (fluorescencia o luz reflejada) vuelve por el mismo camino óptico,
pasando a través del espejo dicroico y enfocada en un fotomultiplicador. Por último,
un diafragma o "pinhole" es colocado delante del fotomultiplicador para eliminar las
señales procedentes de la zona fuera de foco, aumentando con ello la claridad y
resolución de la imagen,principalmente en aquellas muestras que tienen diferentes
grosores o índices de refracción; en particular los bordes de cualquier estructura.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
51
El Microscopio Confocal es utilizado en: Medición de actividades enzimáticas,
reacciones de oxidación, pH intracelular, fagocitosis, apoptosis, comunicaciones
intercelulares. Electrofisiología, Estudios de ADN y ARN, morfología de organoides
citoplasmáticos, cirugía y otros métodos clínicos, Otras aplicaciones en el campo de
la física, la química y en tecnología alimentaria
Microscopios de barrido con sondas o sonda de barrido (scanning probe
microscopes
Son empleados en la nanobiología, en nano ciencia.
Presentan:
Plataforma y una sonda o aguja fina que recorre la superficie de la muestra con
gran precisión (escaneo o barrido). Este filamento se coloca muy cerca (a 1 nm) del
objeto a estudiar, generando una corriente eléctrica y se desplaza por la superficie,
captando electrones que se desvían en lo que se llama efecto túnel. Los electrones
saltan de la punta a la muestra y viceversa. La corriente del efecto túnel varía
dependiendo de la distancia entre la sonda y la muestra. De esta manera se
reproduce la topografía o relieve de la muestra con una alta resolución y mediante
programas informáticos, la imagen es traducida por la computadora, pudiéndose
distinguir un átomo de otro y se genera una imagen en tres dimensiones.
Dependiendo del tipo de sonda se puede obtener información sobre las propiedades
químicas, eléctricas, mecánicas o físicas de la microestructuras o nanomateriales.
Como aplicaciones en biotecnología se realiza el estudio genético de moléculas de
ADN, ARN y la manipulación y desplazamiento de átomos para ser colocados donde
se requiera. Estos microscopios deben estar colocados sobre un sistema anti-
vibración y van acoplados a una computadora. Entre estos microscopios tenemos a:
Microscopio de efecto túnel Creado por Binning y Rohrer en el año 1981( Premio
Nobel en 1986). Corresponde a una nueva generación de microscopios. Los
materiales deben ser conductores o semi-conductores
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
52
Imagen que muestra la sonda (punta de la aguja) Micrografía de la superficie de
situada a una distancia muy corta de la superficie un cristal en el cual se aprecian
de la muestra (Nanoquímica.) . los átomos de cilicio.
Microscopios de fuerza atómica: Es un instrumento que se emplea en materiales no
conductores, como las muestras biológicas. La sonda es una aguja un tanto más fina,
que el anterior, de escasos micrómetros de largo y de unos 10nm de diámetro, la cual
se dobla al desplazarse sobre la muestra, detectando de esta manera las
irregularidades en la superficie y su forma (palpándola). Captura la información
proveniente de la fuerza magnética de superficie de la muestra lográndose ver
moléculas muy pequeñas y átomos. tiene muchas aplicaciones en biología celular.
Microscopio de fuerza atómica.. Análisando multicomponentes de una muestra
Estudio del efecto de antibióticos sobre la
superficie de eritrocitos humanos.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Microscopio de barrido térmico mide la conductividad térmica de la superficie del
espécimen y de esta manera se obtiene información sobre la topografía.
Microscopio de barrido óptico de campo cercano emplea una fibra óptica por la
cual se hace pasar un haz de luz, el cual a su vez pasa por una micro-abertura (en el
orden de decenas de nm). La sonda es inmóvil y el espécimen se desplaza, midiendo
las propiedades ópticas y la topografía de la muestra. La resolución puede alcanzar
alrededor de 100 nanómetros.
Microscopio de iones en campo las muestras se observan en una cámara de alto
vacío la cual es cargada con un gas como el helio o el neón. La muestra se congela y
se le aplica un voltaje positivo; los átomos del gas se ionizan y el material provoca
una magnetización que repele los iones, los cuales chocan sobre un detector que
recoge la información, obteniéndose así una imagen de alta definición por los iones
gaseosos rechazados. Se emplea para el análisis de átomos, en el estudio o
microanálisis de nanomateriales y elaboración de microsondas para microscopios de
barrido con sondas. Es uno de los microscopios que ha permitido la obtención de
imágenes muy nítidas a escala atómica.
La figura Sig. muestra una imagen tomada con análisis de punta muy fina de una
aguja o nanosonda de tungsteno, en donde cada estructura esférica corresponde a
un átomo. Las estructuras alargadas corresponden a trazas dejadas por los átomos en
movimiento durante la captura de la imagen (1 s). (Physics new graphics. The
sharpest man made thing )
Microscopio de fluorescencia de excitación con dos fotones
Es un microscopios reciente para la investigación biológica que permite un estudio
no invasivo y la formación de imágenes en 3D. Está basado en una técnica
relacionada con la microscopía confocal que permite obtener cortes ópticos de
especímenes fluorescentes pero con mayor poder de penetración (hasta un
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
54
milímetro). El principio consiste en un método especial para excitar las moléculas
fluorescentes con ventajas obvias sobre el microscopio confocal. La excitación de la
molécula fluorescente se realiza mediante la absorción simultánea de dos fotones
(con la técnica de fluorescencia convencional la molécula fluorescente absorbe un
fotón). Esto se logra al hacer incidir de manera discontinua y pulsátil (en intervalos de
picosegundos) un láser altamente enfocado.
Permite el estudio de células vivas y otros especímenes, los cuales pueden ser
observados por un tiempo más prolongado. De esta manera la emisión de la
fluorescencia se cuadriplica y se disminuye notablemente el daño ocasionado por el
láser sobre las células. Esta técnica es ideal para localizar reacciones fotoquímicas y
de moléculas efectoras. se complementa con computadoras altamente eficientes
Estudio “In vivo” realizado con microscopía de dos fotones. La mayor penetración
permite el monitoreo de la actividad neuronal y de los cambios morfológicos de las
células nerviosas en el cerebro de un ratón vivo. Este microscopio puede detectar
señales fluorescentes de las capas más profundas (hasta 0.9 mm) de la superficie de
la corteza cerebral, de manera que se pueden observar las neuronas de todas las
capas de la corteza en el animal vivo. (Nemoto T. 2012)
M.E.T Microscopio electrónico de transmisión fue desarrollado entre 1931 y 1933
por Ernest Ruska y Max knoll, quiénes se basaron en los estudios de L.V. Broglié
acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones. construido por Siemens
en 1939.
Usa electrones emitidos por un filamento de tungsteno calentado (cátodo)
Un ánodo, hacia el cual son atraídos los electrones
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Una diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo imparte un voltaje de
aceleración entre 20.000 y 200.000 voltios a los electrones que crea. El haz pasa por
una serie de electroimanes bobinas electromagnéticas (BE).
Las lentes condensadoras se encargan de la formación inicial del haz tras la emisión
de los electrones. Las lentes de objetivo focalizan el haz sobre la muestra y finalmente
las lentes de proyección se encargan de expandir el haz reflejado hacia la pantalla de
fósforo u otro dispositivo de visualización tal como película. Los aumentos del TEM
vienen dados por la razón de las distancias entre la muestra y el plano imagen del
objetivo.
.
El alto poder de resolución ha permitido mostrar detalles de eucariontes y
procariontes, usando cortes ultra delgados de inclusiones por congelación,
coloraciones negativas electrodensas como el ácido fosfotúnsgtico o las sales de
uranilo (metales pesados)para el suficiente contraste
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Sistema de vacio imprescindible para conseguir el flujo ininterrumpido de electrones,
el TEM debe operar a bajas presiones, en el orden de 10 − 4 a 10 − 8 kPa. esto se debe
a dos razones: primero, permitir una diferencia de voltaje entre el cátodo y tierra sin
que se produzca un arco voltaico. Segundo, reducir la frecuencia de las colisiones de
los electrones con los átomos del aire a niveles despreciables. Ya que el TEM,
contrariamente a un CRT, es un sistema que debe permitir la reposición de
componentes, la inserción de muestras. Por ello los TEMs están equipados con
sistemas de bombeo completos y su sellado de vacío no es permanente
El haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio de una B E
objetivo y se aumenta aun más con una o más lentes proyectoras. La imagen final se
visualiza sobre una planilla cubierta por fósforo. Las porciones de la muestra que han
sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones que
absorbieron o esparcieron los electrones por su densidad aparecen oscuras, se coloca
placa fotográfica o un detector de video por encima o por debajo de la pantalla del
visor, con la finalidad de obtener un registro permanente de imagen
La criofractura esta técnica Freeze-etching puesta a punto por MOOR y
MUHLETHALER (1963) permite la observación de las caras de fractura de las
membranas celulares. En estas caras de fractura aparecen partículas
intramembranosas es una técnica utilizada en microscopia electrónica de
transmisión, para el estudio de las membranas celulares, se ha convertido en una de
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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las técnicas preparativas más importantes, para estudios ultraestructurales, trata a la
muestra con un crioprotector como el glicerol, para evitar la formación de cristales de hielo
en el interior de la muestra, empleando nitrógeno líquido en la congelación a -195,8°C,
sumergiendo rápidamente la muestra,
Fractura de la Muestra Se lleva a cabo en condiciones de vacío, bajo una cuchilla de
diamante o romperla en una dispositivo de bisagra, o por técnica, de la facturación en
una atmósfera de nitrógeno liquido, a una presión de 3 ATM con el uso de una cuchilla
de afeitar.
Fijación de platino – carbono Se procede a evaporar una fina capa de carbono -
platino sobre la muestra. Así, las características topográficas de la superficie congelada
se convierten en variaciones en el espesor de la capa de platino depositada sobre la
muestra.
Limpieza de la réplica Posteriormente a la fijación, la muestra se lleva a presión
atmosférica y se le deja calentar a temperatura ambiente. El material biológico restante
de la replica es eliminado mediante el empleo de una solución de ácido crómico,
hipoclorito de sodio u otros agentes limpiadores.
Cuando se aplica la técnica de criofractura, a un talo liquénico la observación que se
tiene del ficobionte es la que muestra la figura 2c.
Se trata únicamente la réplica de platino y carbono obtenida una vez el alga ha quedado
fracturada en su zona media. Se distinguen claramente las lamelas tilacoidales, que aquí
quedan escalonadas por efecto de la fractura. Pueden observarse claramente en ellas las
partículas de que están formadas.
El microscopio electrónico de transmisión con 200 kV de aceleración está
especialmente indicado para la nano-caracterización estructural y analítica de
materiales pues dispone de un cañón de electrones de emisión de campo (FEG) que
permite obtener haces muy intensos y de tamaño sub-nanométrico. Este equipo
incorpora una lente objetivo de “Ultra Alta Resolución” que le confiere las siguientes
capacidades:
Resolución Punto a punto 0,19 nm.
Entre líneas 0,1 nm.
Tamaño de spot Modo TEM 2 – 5 nm.
Modo EDS, NBD, CBD 0,5 – 2,4 nm.
Modo STEM 0,2 nm.
Al portamuestras convencional con una inclinación de +/- 25º se le puede acoplar un
soporte especial de alto ángulo (+/- 70º) para uso en tomografía. Además se puede
utilizar un portamuestras de doble inclinación para estudios de difracción. El
movimiento de la muestra depende de un goniómetro que incluye un mecanismo
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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piezoeléctrico que permite el desplazamiento suave y la corrección de la deriva a
grandes aumentos.
Dispone de una cámara CCD de alta resolución (2048 x 2048 pixels) de la marca
GATAN, modelo SC200 para la obtención de imágenes y el software Digital
Micrograph para su control de adquisición y procesado.
El microscopio está equipado con la unidad STEM y los detectores de imagen de
campo claro y de campo oscuro de alto ángulo (HAADF), que facilita la observación
de contraste de fases con distinto número atómico. La capacidad de caracterización
química se completa con el detector de EDS X-Max 80 de Oxford Instruments, con
una resolución de 127 eV y dotado para la ejecución de análisis elemental de áreas,
puntuales y distribución espacial de los elementos en la muestra (mapping).
Finalmente, el microscopio incorpora la unidad DigiSTAR de Nanomegas para la
adquisición de patrones de difracción en modo precesión y software ATD-3D
(Nanomegas) para la reconstrucción automática del espacio 3D de los patrones de
difracción. Esta herramienta es extremadamente importante para la caracterización
de estructuras cristalinas en las investigaciones de ciencia de materiales
Procedimiento
• Muestra menor de un milímetro cúbico
• fijación con glutaraldehído, seguida de un lavado con un buffer y fijación con
tetróxido de osmio que se une a los componentes fosfolipídicos de las
membranas, lo que le agrega densidad
• Deshidratacion con Alcohol acetona o alcohol- nitrato de uranilo
• Ultramicrotomía seccion de entre 50 nm y 150 nm
• inmersión en soluciones de acetato y formiato de uranilo, citrato de plomo,
molibdenato amónico, el fosfotungtato sódico
Para efectuar cortes se requiere
Ultramicrotomo con un sistema completo de orientación de la muestra sobre el
borde de la cuchilla para que el plano de corte se pueda orientar perfectamente a la
superficie de nuestra muestra. Al realizar cortes muy delgados cualquier vibración o
cambio de temperatura afecta la homogeneidad del grosor del corte, por tanto
debe situarse en una habitación donde no haya vibraciones y mantenerla a
temperatura constante para evitar dilataciones del brazo que porta la muestra,
cuentan con panel de control externo donde se controla electrónicamente el proceso
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
59
de corte: inicio de corte, grosor de la sección, velocidad de corte, ventana de corte,
iluminación de la muestra, etc. Antes de realizar el primer corte ultrafino de una
muestra, es necesario tallar y desbastar el bloque para crear una pirámide
truncada. utilizar un aparato denominado piramitomo que lima y crea las caras de
la pirámide con un disposivo a modo de torno, producir el desbastado preciso
porque la superficie de corte debe ser de unos 0,5 mm2. Los lados deben ser
paralelos y uno más grande que el otro. Con esto se asegura que una nueva sección
empujará a la previa del borde de la cuchilla consiguiendo tiras rectas de secciones.
Antes de hacer las secciones ultrafinas se suele hacer una sección semifina, de 1 o 2
µm para tener una imagen de la muestra observable al microscopio óptico.
Proceso por el que se obtiene una cuchilla para hacer cortes en el ultramicrotomo.
Las cuchillas empleadas deben tener filos muy agudos. son de diamante o de
vidrio especial, se obtienen mediante aparatos que con puntas de diamante y
golpes secos sobre barras de vidrio son capaces de producir dichas cuchillas.. El
grosor de una sección ultrafina se conoce por el color que produce el reflejo de la
luz sobre su superficie. Este color puede ser gris (menos de 60 nm), plata (60 a 90
nm), oro pálido (90 a 120 nm), oro intenso (120 a 150 nm), púrpura (150 a 190 nm),
etc.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Corte y recogida de secciones en una rejilla.
Las secciones ultrafinas recién obtenidos quedan flotando sobre una balsa de agua
que posee la propia cuchilla y no se recojen sobre portaobjetos sino directamente
sobre soportes denominados rejillas
Rejillas son de níquel o cobre, discos circulares con un enrejado de hilos,
normalmente desde 100 a varios cientos de µm cuadradas, permiten una gran
nitidez de las imágenes del tejido que ofrece el microscopio electrónico puesto que
los electrones sólo atraviesan la sección antes de incidir sobre la pantalla de
visualización.
En "rejillas" de ojal, tienen una sola cavidad y suficientemente grande como para
soportar un corte entero, pero debe tener una membrana muy fina hecha de una
sustancia denominada formvar, la cual deja pasar los electrones y sostiene a las
secciones.
Microscopía electrónica de barrido (SEM)Para este fin las muestras deben estar
secas y ser conductoras. El proceso de secado debe preservar al máximo la
estructura original de la muestra. Para ello usar el método clásico de fijación y
deshidratación química y finalizar con el secado por punto crítico o utilizar el
moderno método de criofijación que ya está acoplado a uno de los microscopios.
Posteriormente la muestra necesita recubrirse con un material que la haga
conductora y permita su observación en el microscopio.
Recubrimiento de muestras en bajo vacío
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
61
Este método se realiza por dos tipos de recubrimientos: “spputtering” de oro para
obtener las mejores condiciones de imagen y, si se requiere microanálisis por rayor
X, el recubrimiento por hilo de carbono.
Recubrimiento de muestras en alto vacío
Consigue recubrimientos de grano mucho más fino y está preparado para realizar
“spputtering” con distintos metales. También trabaja por el método de
evaporación, con lo que aumenta el rango de posibles elementos de recubrimiento.
Utiliza electrodos de carbono para evaporarlo y obtener “films” que recubren las
rejillas destinadas al TEM.
Observación de muestras criofijadas
El microscopio electrónico de barrido (SEM) puede dotarse de un sistema capaz de
observar la muestra a muy baja temperatura de forma que su preservación
estructural es máxima y la capacidad de trabajo del microscopio no se afecta en
absoluto, pues ya no se trataja con una muestra hidratada sino congelada.
El proceso se inicia fuera del microscopio, enfriando la muestra a la máxima
velocidad posible mediante nitrógeno nieve. A continuación pasa al sistema de
criobservación, donde se puede fracturar, sublimar el hielo superficial y recubrir con
oro o carbono para su observación y/o análisis. La ventaja puede observar
cualquier muestra biológica o hidratada con una preparación mínima y rápida con
una buena preservación estructural.
Microscopía electrónica de barrido
Es para analizar tejidos se deja la muestra, en deshidratación por desecación de
punto crítico, se cubre con una película evaporada de oro-carbón, se monta en un
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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taco de aluminio y se coloca en la cámara de muestras del microscopio. En los
tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con lejía y
analizar las características estructurales del mineral, el mismo tipo de rastreo que
explora el haz de electrones a través de la superficie un tubo de televisor. Los
electrones reflejados desde la superficie y los electrones forzados hacia el exterior
de la superficie son captados por uno o más detectores y reprocesados para formar
una imagen tridimensional en un televisor.
El microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FESEM), es un
instrumento que al igual que el SEM es capaz de ofrecer una amplia variedad de
información procedente de la superficie de la muestra, pero con mayor resolución y
con un rango de energía mucho mayor. El funcionamiento es igual al de un SEM
convencional; se barre un haz de electrones sobre la superficie de la muestra
mientras que en un monitor se visualiza la información que nos interesa en función
de los detectores disponibles.
La mayor diferencia entre un FESEM y un SEM reside en el sistema generación de
electrones. El FESEM utiliza como fuente de electrones un cañón de emisión de
campo que proporciona haces de electrones de alta y baja energía muy focalizados,
lo que mejora notablemente la resolución espacial y permite trabajar a muy bajos
potenciales, (0.02 - 5 kV); esto ayuda a minimizar el efecto de carga en especímenes
no conductores y a evitar daños en muestras sensibles al haz electrónico.
Otra característica muy destacable de los FESEM es la utilización de detectores dentro
de la lente, (in lens). Estos detectores están optimizados para trabajar a alta
resolución y muy bajo potencial de aceleración, por lo que son fundamentales para
obtener el máximo rendimiento al equipo.
El Microscopío modelo ULTRA 55 de la marca ZEISS cuenta con los siguientes
detectores de fabricación
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63
Detector de electrones secundarios SE2: ofrece la imagen SEM típica de la
topografía de la superficie de la muestra con una gran profundidad de campo. Es el
más adecuado para obtener resoluciones medias y bajas con potenciales de
aceleración altos. Se utiliza principalmente para navegar por la muestra a bajos
aumentos buscando puntos de interés y para estudiar muestras con mucha
información topográfica.
Detector de electrones secundarios in lens: situado en el interior de la columna de
electrones, trabaja con electrones secundarios de baja energía y ofrece las imágenes
de mayor resolución. Es muy sensible a las características superficiales de la muestra,
por lo que es muy adecuado para la caracterización superficial de cualquier material.
Ofrece su mejor rendimiento a bajos potenciales de aceleración, (< 5 kV), por lo que
es muy recomendable para trabajar con muestras sensibles al haz electrónico y para
minimizar el efecto de carga en muestras no conductoras.
Detector de electrones retrodispersados AsB: es sensible a la variación de número
atómico de los elementos presentes en la muestra, por lo que se utiliza para observar
los cambios en la composición química del espécimen. El detector AsB cuenta con
cuatro cuadrantes y permite seleccionar entre imagen con contraste topográfico y
composicional. Además, gracias al modo de trabajo con alto ángulo, permite
observar contraste estructural en muestras cristalinas.
Detector de electrones retrodispersados in lens EsB: es independiente del detector
de secundarios in lens, lo que le permite ofrecer señal de retrodispersados pura, sin
ninguna contaminación de electrones secundarios y a muy bajo potencial de
aceleración. Proporciona más contraste en Z que ningún otro detector de
retrodispersados, y es el único que puede seleccionar los electrones en función de su
energía, lo que posibilita diferenciar elementos que se distinguen en solo unos pocos
átomos. Además es capaz de trabajar a muy bajo voltaje (en el mismo rango que el
detector in lens de secundarios), por lo que es ideal para muestras sensibles. El hecho
de trabajar de manera independiente facilita captar la señal de electrones
secundarios y retrodispersados de forma simultánea.
Detector de energía dispersiva de Rayos X, EDS (OXFORD INSTRUMENTS): recibe
los Rayos X procedentes de cada uno de los puntos de la superficie sobre los que
pasa el haz de electrones. Como la energía dispersada de los Rayos X es característica
de cada elemento químico, proporciona información analítica cualitativa y
cuantitativa de puntos, líneas o áreas seleccionadas en la superficie de la muestra.
Esta técnica se conoce como Microanálisis por EDS.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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En el microscopio de fuerza atómica (AFM), una punta afilada situada en el extremo
de una palanca flexible recorre la superficie de una muestra manteniendo constante
una pequeña fuerza de interacción. El movimiento de barrido lo realiza un escaner
piezo-eléctrico, y la interacción punta/muestra se monitoriza reflejando un láser en la
parte trasera de la palanca, que se recoge en un detector fotodiodo. El fotodiodo esta
dividido en 4 segmentos, y las diferencias de voltaje entre los distintos segmentos
(generalmente los 2 superiores respecto de los 2 inferiores) determinan con precisión
los cambios en la inclinación o amplitud de oscilación de la punta.
En el Servicio de Microscopía de la U.P.V. disponemos de los siguientes modos de
trabajo:
AFM de Contacto: Mide la topografía deslizando la punta sobre la superficie de la
muestra. Se puede realizar en aire y en medio líquido.
AFM de Tapping: Mide la topografía tocando intermitentemente la superficie de la
muestra con una punta oscilante. Se eliminan las fuerzas laterales y de presión que
pueden dañar las muestras blandas y reducir la resolución de la imagen. Se puede
realizar en aire y en medio líquido.
Imagen de Fase: Proporciona imágenes cuyo contraste está causado por diferencias
en las propiedades de adhesión y viscoelasticidad de la superficie de la muestra. Se
realiza en modo Tapping y se mide como el retraso en la fase de oscilación de la
punta medido en el fotodiodo, con respecto al valor de fase de oscilación
proporcionado por el piezo del soporte de la punta.
Microscopia de Efecto Túnel: Mide la topografía de superficies conductoras
utilizando una corriente de túnel que depende de la separación entre la punta y la
superficie de la muestra.
Fuerzas Magnéticas: Mide el gradiente de distribución de fuerzas magnéticas por
encima de la superficie de la muestra. Se lleva a cabo con el LiftMode para seguir la
topografía de la muestra a una distancia fijada.
LiftMode: Se trata de una técnica combinada de dos pasos. Por una parte, mide de
forma separada, y en modo Tapping, la topografía de la muestra. Por otra parte, mide
otra propiedad seleccionada (fuerzas magnéticas, eléctricas, etc.) utilizando la
información topográfica para mantener la punta por encima de la superficie de la
muestra a una altura constante.
Fuerzas Laterales: Mide fuerzas de fricción entre la punta y la superficie de la
muestra. En modo Contacto.
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS FCMP
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Medidas Fuerza-Distancia: Mide fuerzas repulsivas, de atracción y de adhesión entre
punta y muestra durante el acercamiento, el contacto y la separación de ambas
partes.
Fuerza Volumen: Realiza una serie de medidas puntuales de fueza-distancia sobre
una área determinada de la muestra. Con esas curvas de fuerza individuales en cada
punto, muestra imágenes de variaciones de fuerza y topografía de la muestra.
Electroquímica: Mide los cambios de la superficie y las propiedades de los
materiales conductores sumergidos en soluciones electrolito, al establecer gradientes
o ciclos de intensidad-voltage eléctrico
UNIDADES DE MEDIDAS
-decímetro (dm)
-centímetro (cm)
-milímetro (mm)
-micrómetro (µm)
-nanómetro (nm)
-angstrom (Å)
-picómetro (pm)
-femtómetro (fm)
-attómetro (am)
-zeptómetro (zm)
-yoctómetro (ym)
10-1 metros
10-2 metros
10-3 metros.
10-6 metros
10-9 metros.
10-10 metros
10-12 metros
10-15 metros
10-18 metros
10-21 metros
10-24 metros
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