PRÁCTICO N° 3

Técnicas para la observación,

aislamiento y conservación de

microorganismos

Objetivos

Conocer el manejo del microscopio óptico, sus partes y utilidad en el

laboratorio de microbiología.

Conocer las técnicas básicas para la realización de coloraciones simples y

dobles.

Ser capaz de explicar el fundamento de la coloración de Gram y mencionar sus

utilidades diagnósticas.

Conocer las técnicas de aislamiento de microorganismos para obtener cultivos

puros.

Adquirir habilidad para la observación de microorganismos.

Adquirir habilidad en el aislamiento de microorganismos en medio sólido.

Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar

una eficiente labor grupal.

Métodos de coloración y observación de microorganismos

Características del microscopio óptico

Aumento: objetivo x ocular

Resolución: objetivo de inmersión (aceite de inmersión)

Tipos de microscopios ópticos

Campo claro Contraste de fases Campo oscuro Fluorescencia

Preparaciones húmedas

Tipos de preparaciones para observación en microscopio ópticos

Preparaciones fijadas

Métodos de coloración

Objetivo: Aumentar el contraste de los microorganismos con el fondo.

Tipos de colorantes

Catiónicos:

- azul de metileno

- cristal violeta

- safranina

Aniónicos:

- fucsina ácida

- rojo congo

Preparación y fijación de

un extendido por calor

Coloración

Observación

Tipos de coloración

Coloraciones simples

Secuencia de una coloración simple

Equipo de coloración Flamear un portaobjeto Esterilizar el ansa

Extender Fijar al calorExtraer una alícuota

Secuencia de una coloración simple (cont.)

Agregar el colorante Esperar un minuto Lavar

Secar

Observar

Secuencia de una coloración simple (fijación con ácido)

Portaobjeto enterrado

Colorear con fucsina Fijación con ácido acéticoEsperar 5 minutos

Actividad: colorear con fucsina los cultivos de suelo (fijado por calor) y el

portaobjeto enterrado (fijado con ácido acético).

Coloración simple (Rossy-Cholodny)

Hongo

tabicado

Hongos

Bacterias

Actinomycetes

Partícula de

arena

Coloraciones Diferenciales (Gram)

1) Teñir el extendido con Cristal Violeta (1 minuto)

Todas las bacterias se tiñen de violeta

2) Añadir Lugol para fijar el colorante (1minuto)

3) Decolorar el extendido con alcohol acetona.

Se enjuaga con agua.

Las bacterias G + quedan violetas y las G – se decoloran

4) Teñir el extendido con fucsina (30 segundos).

Enjuagar con agua.

Las bacterias G + quedan violetas y las G – rosadas

Gram + Gram -

Coloración diferencial (Gram)

Bacterias G-

Bacterias G+

Actividad: realizar una coloración diferencial

Métodos de aislamiento

Aislamiento en medio sólido:

Consiste en separar e inmovilizar

individuos en un medio solidificado.

Aislamiento biológico:

Consiste en inocular animales o

vegetales y aislarlas de la sangre,

tejidos, etc.

Cultivo puro: conjunto de microorganismos genéticamente iguales.

Aislamiento: procedimiento que permite separar un microorganismo

de una población mixta.

Obtención de cultivos puros

Aislamiento en medio sólido por estriado

Fundir el agar

Esterilizar el ansa

Colocar en caja de Petri

Trazar estrías sobre el agar

Dejar solidificar

Incubar

Cultivos puros en caja de PetriCrecimiento confluente

Colonias aisladas

Actividad: realizar aislamiento por agotamiento (estrías)

Conservación de cultivos puros

Formas de conservación de cultivos puros

Liofilización: desecación mas congelación

Congelación: -90° C recubierto con glicerol

Subcultivos seriados: repiques periódicos ( 4-5°C)

Síntesis del práctico N° 3

Técnicas

microbiológicasNormas de manejo

en microbiología

Asepsia

• Atmósfera

• Sup. de trabajo

• Manejo de material

y recipiente

Observación

Microscopio Óptico

Tipos de Coloración

• Simples

• Diferenciales

Conservación

• Liofilización

• Congelación

• Subcultivos seriados

Aislamiento

• Medio sólido (estrías)

• Biológico (vegetales o

animales)

Tipos de Colorantes

• Catiónicos

• Aniónicos