Tecnología del ADN Tecnología del ADN recombinanterecombinante

ADN recombinante ADN recombinante Molécula de unión Molécula de unión artificial de dos fragmentos de ADN.artificial de dos fragmentos de ADN.

Tecnología de ADN Recombinante Tecnología de ADN Recombinante Técnicas que permiten aislar un gen de un Técnicas que permiten aislar un gen de un organismo para su manipulación y organismo para su manipulación y inserción en otro diferente.inserción en otro diferente.

Resultado Resultado Un organismo, animal, vegetal, Un organismo, animal, vegetal, bacteria, hongo o virus, producirá una proteína bacteria, hongo o virus, producirá una proteína que le sea totalmente extraña.que le sea totalmente extraña.

Está regida por tres premisas fundamentales:Está regida por tres premisas fundamentales:

La lectura precisa de la secuencia de nucleótidos del ADN, La lectura precisa de la secuencia de nucleótidos del ADN, el recorte del ADN con las enzimas de restricción en los el recorte del ADN con las enzimas de restricción en los lugares precisos y conocidos (endonucleasas) y el lugares precisos y conocidos (endonucleasas) y el ligamiento de los restantes fragmentos de ADN con otras ligamiento de los restantes fragmentos de ADN con otras enzimas (ligasas); enzimas (ligasas);

Localización de vectores de clonación, es decir de Localización de vectores de clonación, es decir de fragmentos de ADN que para ello, sin perjuicio de lo ya fragmentos de ADN que para ello, sin perjuicio de lo ya expuesto en el punto anterior, deben poseer dos expuesto en el punto anterior, deben poseer dos propiedades: propiedades:

Debe ser capaz de replicarse.Debe ser capaz de replicarse.

Debe poseer un gen que le confiera una propiedad Debe poseer un gen que le confiera una propiedad particular a la célula en el que se encuentra, para poder particular a la célula en el que se encuentra, para poder entonces separar las células que contienen el vector de entonces separar las células que contienen el vector de aquellas que no lo contienen, por el empleo de marcadores.aquellas que no lo contienen, por el empleo de marcadores.

¿Cómo cortar y pegar el ¿Cómo cortar y pegar el ADN? Enzimas de ADN? Enzimas de

restricciónrestricción Las enzimas de restricción son producidas por bacterias Las enzimas de restricción son producidas por bacterias

como método de defensa contra virus y degradan el ADN como método de defensa contra virus y degradan el ADN extraño. extraño. A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción mediante contra sus enzimas de restricción mediante metilacionesmetilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un átomo específico de ciertos nucleótidos.átomo específico de ciertos nucleótidos.

Estas moléculas son indispensables para la ingeniería Estas moléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que producen fragmentos que se pueden unir genética, ya que producen fragmentos que se pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda de un “pegamento entre sí fácilmente (con la ayuda de un “pegamento molecular”: la enzima ligasa). molecular”: la enzima ligasa). Las enzimas de restricción cortan dejando extremos Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos.cohesivos o romos.

Enzimas restricciónEnzimas restricción

¿¿Cómo introducir ADN Cómo introducir ADN recombinante en las recombinante en las

bacterias?bacterias? Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a

antibióticos y son capaces de autoreplicarse, ya que contienen antibióticos y son capaces de autoreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciaciónuna secuencia de iniciación

Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido: plásmido:

Es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias Es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonaciónclonación..

ClonClon grupo de células u organismos genéticamente idénticas. grupo de células u organismos genéticamente idénticas.

Vector Vector cualquier organismo o virus capaz de mover genes de cualquier organismo o virus capaz de mover genes de un organismo a otro un organismo a otro

PlásmidosPlásmidos. Son moléculas de . Son moléculas de ADN ADN circularcircular, con un tamaño menor que el , con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio bacteriano ya que tienen su propio origen de replicaciónorigen de replicación. .

En esta secuencia de dibujos se puede ver En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en como se realiza la inserción de un gen en un plásmido. un plásmido. En la En la 1ª figura1ª figura tenemos un tenemos un gen gen (color (color rojo) que interesa insertar en un plásmido rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)(color turquesa)

En la En la 2ª figura2ª figura, vemos como una , vemos como una enzima de restricción ha cortado el enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.bordes cohesivos o pegajosos.

La unión del ADN que contiene el gen La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el que se desea clonar con el vector de vector de clonaciónclonación, se realiza por medio de , se realiza por medio de otras enzimas, denominadas otras enzimas, denominadas ADN-ADN-ligasasligasas, que unen ambos trozos de , que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta fragmentos de ADN de distinta procedencia.procedencia.

¿Cómo amplificar el ADN? ¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la Reacción en cadena de la

polimerasapolimerasa Reacción en cadena de la polimerasa:Reacción en cadena de la polimerasa:

Se basa en la separación de ambas hebras de Se basa en la separación de ambas hebras de ADN, la posterior unión de pequeños fragmentos ADN, la posterior unión de pequeños fragmentos (denominados (denominados primersprimers) y la extensión de estos ) y la extensión de estos fragmentos usando de molde el ADN de la fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. Así se obtienen dos copias idénticas por muestra. Así se obtienen dos copias idénticas por cada molécula en cada ciclo de reacción. cada molécula en cada ciclo de reacción.

La reacción en cadena de la polimerasa permite La reacción en cadena de la polimerasa permite amplificar la muestra de manera espectacular y amplificar la muestra de manera espectacular y su sensibilidad es tal que alcanza con una su sensibilidad es tal que alcanza con una molécula para que la reacción genere una molécula para que la reacción genere una infinidad de copias. infinidad de copias.

Cadena polimerasaCadena polimerasa

¿Cómo encontrar el gen ¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos: adecuado? Imanes biológicos:

sondas y anticuerpossondas y anticuerpos Las Las sondassondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena

complementarias a la región de ADN o ARN que queremos complementarias a la región de ADN o ARN que queremos encontrar. Contienen alguna “marca” que permite revelar su encontrar. Contienen alguna “marca” que permite revelar su unión (hibridación) a la secuencia elegida y de esa manera unión (hibridación) a la secuencia elegida y de esa manera revela presencia de la región buscada.revela presencia de la región buscada.

¿Cómo se marcan? ¿Cómo se marcan?

-Las sondas pueden ser “coloreadas” durante su síntesis -Las sondas pueden ser “coloreadas” durante su síntesis utilizando nucleótidos marcados con isótopos radiactivos. utilizando nucleótidos marcados con isótopos radiactivos.

-mediante la unión con una molécula que pueda ser detectada -mediante la unión con una molécula que pueda ser detectada posteriormente como fluorescente, un marcador químico que posteriormente como fluorescente, un marcador químico que puede ser detectado por un anticuerpo, o una enzima cuya puede ser detectado por un anticuerpo, o una enzima cuya actividad produce el cambio de color de su sustrato. actividad produce el cambio de color de su sustrato.

Una de las técnicas más empleadas para localizar fragmentos Una de las técnicas más empleadas para localizar fragmentos determinados del genoma es la determinados del genoma es la hibridación in situhibridación in situ. .

Hibridación in situHibridación in situ con sondas con sondas fluorescentes (FISH). Mediante el uso fluorescentes (FISH). Mediante el uso de sondas fluorescentes dirigidas de sondas fluorescentes dirigidas contra los ribosomas, y específicas contra los ribosomas, y específicas para taxones concretos se puede para taxones concretos se puede identificar la abundancia y morfología identificar la abundancia y morfología de éstos. En este caso observamos en de éstos. En este caso observamos en verde Salinibacter ruber y en azul una verde Salinibacter ruber y en azul una haloarchaea en una muestra de haloarchaea en una muestra de salmuera de salinas solares.salmuera de salinas solares.

Este es el proceso de Hibridación in Situ por el cual Este es el proceso de Hibridación in Situ por el cual las cadenas Monocatenarias de ADN se hibridan con las cadenas Monocatenarias de ADN se hibridan con los fragmentos de RNA que hay en las células, como los fragmentos de RNA que hay en las células, como resultado vemos el diagnóstico de las enfermedades resultado vemos el diagnóstico de las enfermedades que buscamos. Esta es una Técnica antigua que buscamos. Esta es una Técnica antigua

HIstosondaHIstosonda® representa una nueva generación de ® representa una nueva generación de Herramientas para el Diagnóstico que sin duda Herramientas para el Diagnóstico que sin duda revolucionará la medicina actual pues permite ver la revolucionará la medicina actual pues permite ver la expresión Génica de Genes que hasta ahora no se expresión Génica de Genes que hasta ahora no se podían ver. podían ver.

Hibridacion in situ, HistosonaHibridacion in situ, Histosona

¿Cómo estudiar la expresión de ¿Cómo estudiar la expresión de

diversos genes?diversos genes? Electroforesis en gel, muy usado para separar Electroforesis en gel, muy usado para separar

moléculas de diversos tamaños y es la base de las moléculas de diversos tamaños y es la base de las técnicas para identificar ADN, ARN, y proteínas.técnicas para identificar ADN, ARN, y proteínas.

Separación de ácidos nucleicos y proteínas. Separación de ácidos nucleicos y proteínas. Electroforesis en gel:Electroforesis en gel:

-Esto se logra por la diferencia de desplazamiento -Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. La carga eléctrica sirve como campo eléctrico. La carga eléctrica sirve como fuerza impulsora que atrae las moléculas cargadas fuerza impulsora que atrae las moléculas cargadas negativamente hacia el otro extremo del gel que negativamente hacia el otro extremo del gel que posee carga positiva. Existen distintos tipos de gel; posee carga positiva. Existen distintos tipos de gel; comúnmente se utiliza agarosa o poliacrilamida. comúnmente se utiliza agarosa o poliacrilamida.

ElectroforesisElectroforesis

¿Cómo estudiar la expresión de ¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern, Northern y diversos genes? Southern, Northern y

Western BlotWestern Blot El nombre de la técnica deriva en parte del apellido del investigador que El nombre de la técnica deriva en parte del apellido del investigador que

la desarrolló (Edward M. Southern) y de la palabra inglesa Blot, que la desarrolló (Edward M. Southern) y de la palabra inglesa Blot, que significa traspasar. El Southern Blot es una técnica que permite la significa traspasar. El Southern Blot es una técnica que permite la identificación (presencia o ausencia) de secuencias específicas de DNA de identificación (presencia o ausencia) de secuencias específicas de DNA de diferentes fuentes e identificar el tamaño del fragmento de restricción que diferentes fuentes e identificar el tamaño del fragmento de restricción que contiene la secuencia.contiene la secuencia.

Las técnicas Northern y Southern Blot persiguen fines distintos:Las técnicas Northern y Southern Blot persiguen fines distintos:

El El Southern BlotSouthern Blot detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma.

El El NorthernNorthern, en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en , en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. determinadas condiciones.

Dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que Dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material genético y el El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes genes.Northern Blot, la expresión de diferentes genes.

Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el WesternWestern Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. mediante la utilización de anticuerpos específicos.

Northern blotNorthern blot

Western blotWestern blot

Southern blotSouthern blot

¿Cómo sacar fotos de genes ¿Cómo sacar fotos de genes activados? Microarreglosactivados? Microarreglos

Los microarreglos de DNA son soportes sólidos en los cuales se Los microarreglos de DNA son soportes sólidos en los cuales se encuentran inmovilizados, en un área pequeña, de cientos a miles encuentran inmovilizados, en un área pequeña, de cientos a miles de genes de manera ordenada.de genes de manera ordenada.

En los microarreglos, el DNA puede ser impreso, depositado o En los microarreglos, el DNA puede ser impreso, depositado o sintetizado directamente sobre la superficie sólida.sintetizado directamente sobre la superficie sólida.

Los microarreglos de DNA son una versión Los microarreglos de DNA son una versión paralelaparalela y y masivamasiva a las a las técnicas de Northern y Southern blot; sin embargo, en vez de que técnicas de Northern y Southern blot; sin embargo, en vez de que las sondas de oligonucleótidos sean reconocidas a lo largo de un las sondas de oligonucleótidos sean reconocidas a lo largo de un gel de DNA o RNA, en el microarreglo, las sondas son gel de DNA o RNA, en el microarreglo, las sondas son inmovilizadas en una superficie sólida. Además, la muestra no se inmovilizadas en una superficie sólida. Además, la muestra no se marca con isótopos radioactivos, en su lugar se usan colorantes marca con isótopos radioactivos, en su lugar se usan colorantes fluorescentes que pueden detectarse por un escáner.fluorescentes que pueden detectarse por un escáner.