MICROBIOLOGIE ALIMENTARA

LUCRAREA PRACTICA LUCRAREA PRACTICA – – 22

Ce am invatat in laboratorul 1

Ce este mediul de cultura?Un mediu de cultura trebuie sa asigure substratul nutritiv pentru cresterea si multiplicarea microbilor, sa aibe un pH care sa permita desfasurarea normala a proceselor metabolice microbiene (in general 7,2—7,4), sa asigure condiţiile de aerobioza sau anaerobioza, sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa fie usor de manevrat.

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURA

Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii:

- medii uzuale (obişnuite) - pe care se dezvolta majoritatea germenilor patogeni.

○ Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe;

- medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii de germeni.

o Ele mai pot fi sistematizate în medii: de izolare, de imbogatire, selective, diferentiale;

Dupa starea lor fizica (consistenţă) mediile se pot imparti in: solide (geloza dreaptă, înclinată, în placă), semisolide (în eprubete), lichide (repartizate în eprubete).

Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe.

MEDII DE CULTURA

Mediile de cultura folosite in laboratorul de microbiologie reprezinta substrate

pentru cresterea, dezvoltarea, inmultirea si mentinerea microorganismelor. Mediile de

cultura pot fi lichide sau solide, pot fi preparate din reactivi individuali sau se pot obtine

prin rehidratarea unei pulberi (medii deshidratate), care contine toti ingredientii necesari

cresterii microorganismelor prezente in alimente. Dupa scopul utilizarii, mediile se pot

imparti in medii simple sau de izolare si medii speciale (medii de imbogatire, medii

elective, medii selective, medii diferentiale, medii de conservare sau de mentinere).

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA

Cantarirea ingredientelor sau a mediului deshidratat (mediu complet)

I Dizolvarea si omogenizarea pulberii prin incalzire pana la fierbere

I Corectarea pH-ului, in functie de specia care urmeaza a fi cultivata

I Repartizarea mediului in baloane de sticla, eprubete sterile cu dop

I Sterilizare la 1200C, 30 min

I Depozitare la 40C

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURA

Geloză simplă Geloză simplă în coloană înclinată

Cultivarea bacteriilor - creşterea bacteriilor pe medii de cultură în condiţii “in vitro”.

Însămânţare - punerea în contact a unei culturi bacteriene sau a unui produs patologic cu mediile de cultură.

Colonie bacteriana - aglomerare de bacterii vizibilă cu ochiul liber, formată din multiplicarea unei singure bacterii de pe mediul de cultură.

Izolare - repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultură cu scopul de a obţine cultură pură.

  

Definiţii

Cercetarea şi identificarea bacteriilor pe medii de cultură Identificarea unei bacterii nu se

poate face decât după ce este cultivată pe diferite medii nutritive - solide şi lichide şi este izolată în cultură pură.

Pentru izolarea diferiţilor germeni patogeni se fac însămânţări pe medii de cultura, precum si transplantari de germeni in stare pura - cu scopul menţinerii lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie).

Reguli generale In timpul insamântarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere câteva reguli general valabile:

însămânţările se execută în boxe sterile sau în hote speciale care permit sterilizarea periodică şi nu permit formarea de curenţi de aer în timpul lucrului;

în timpul operaţiunilor de însămânţare se evită pe cât posibil conversaţia şi orice mişcare de prisos în jurul operatorului;

ansa cu care se execută însămânţarea nu trebuie să fie atinsă de nici un obiect nesteril (mână, halat, masă de lucru, etc.);

însămânţările se vor executa cât mai repede, cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de însămânţat cu atmosfera ambiantă;

în timpul cât recipientele sau tuburile de cultură, sterile sau însămânţate sunt deschise, vor fi ţinute în poziţie înclinată cât mai aproape de flacără pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosferă;

imediat după însămânţare se face notarea tuburilor cu creioane speciale fără a se omite data însămânţării.

Tehnica însamânţarii Ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee:Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita, se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si ea si racita, o cantitate de lichid organic din profunzime si se insaminteaza întâi pe mediul lichid (bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agar cu singe, agar ou ser etc.). La inchiderea si deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii, flambând gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere.Cu ajutorul acului de insamintare drept. Se cauterizeaza suprafaţa produsului alimentar si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trece si ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se inteapa prin suprafaţa cauterizata, facând câteva miscari spre interior. Se scoate acul din si se face insamântarea prin clatirea acestuia in mediul lichid.

Fara a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid, facându-se pe suprafaţa acestuia miscari in zig-zag, incepând de la baza mediului spre partea superioara, sau se clateste acul in lichidul de condensare, dupa care se umecteaza intreaga suprafaţa a mediului cu acest lichid, prin inclinari repetate. Dupa fiecare proba, acul se sterilizeaza prininrosire la flacara.

Tehnica însamânţarii Cu porţiuni de aliment. Când alimentul a fost recoltat in conditii de

sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la secţionarea unor bucaţi cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una din suprafeţele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe suprafaţa unei placi cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita aproapein exclusivitate.

Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de aliment. Metoda se foloseste mai rar, in special cind se banuieste saracia in germeni a materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de sterilitate perfecte.

 

Ca principiu general, se va evita deschiderea probelor alimentare sau secţionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic.

Tehnica transplantarilorAre ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura, fie menţinerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie).Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (câteva picaturi) din cultura veche, care apoi se insamânteaza in mediul proaspat. In cel de al doilea, se introduce ansa flambata si racita in cultura veche, dupa care se face insamântarea pe mediile proaspete (intâi in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca este cazul).Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclând o cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete.

Metode de însămânţarePe medii solide- însămânţare prin epuizare (se obţin colonii izolate)- însămânţare în sector (se obţin colonii confluente)- însămânţare prin înţeparePe medii lichide- omogenizarea unei colonii în mediu lichid

Însămânţarea prin epuizareObţinerea culturii primare

· Se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic.· Se descarcă ansa pe mediu de cultură:

- se însămânţează un prim sector [1];- din primul sector însămânțat se trasează câteva striuri paralele în

sensul acelor de ceasornic [2];- se continuă însămânțarea prin striuri

paralele [3], terminându-se printr-un striu în zig-zag [4].

Metode de însămânţareÎn ultimul sector bacteriile sunt dispersate, astfel încât după incubare se vor

forma colonii izolate.

Metode de însămânţare

Metode de însămânţareObţinerea culturii pure· Se replică o singură colonie din cultura primară pe un mediu de cultură proaspăt, fie prin epuizare, fie prin însămânţare în sector.

Însămânţarea în sectorPe o placă pot fi însămânţate mai multe specii bacteriene.Prin însămânţare în sector nu seobţin colonii izolate!Se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic.Se descarcă ansa pe mediu de cultură sub forma unui sector decerc.

Metode de însămânţareÎnsămânţarea pe medii în coloană înclinată- Se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs.- Se descarcă ansa pe partea înclinată a mediului de cultură sub forma unui striu.NU se obţin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite modele.

Metode de însămânţare

Însămânţarea prin înţepareSe practică pentru însămânţarea mediilor solide

turnate în coloană dreaptă.· Se încarcă acul de inoculare cu produs.· Se înţeapă mediul în direcţie verticală pe o distanţă de ¾ din înălţimea coloanei.

Însămânţarea în mediu lichid· Se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs.· Se omogenizează produsul recoltat în mediul de cultură lichid.

Morfologia coloniilor bacteriene

După însămânţare, prin tehnică adecvată, pe mediu nutritiv solidifiicat în vase Petri sau lichid în tuburi, se asigură incubarea la termostat.

După incubare, pe baza observaţiilor zilnice, se notează: momentul apariţiei coloniilor, gradul de uniformitate, forma coloniilor, aspectul suprafeţei, aspectul marginii, profilul, culoarea, mărimea etc.

Informaţiile despre caracterele coloniilor bacteriene obţinute pe medii nutritive permit identificarea speciei cercetate.

Va multumesc!