teklab sds page 1

Foundations of Biology©1999 Timothy G. Standish
Protein terdapat dalam semua sel hidup dan mempunyai fungsi penting untuk kelangsungan hidup
Protein dibutuhkan setiap saat oleh setiap tubuh makluk hidup.
©1999 Timothy G. Standish
Fungsi protein dalam tubuh :
Sebagai komponen penyusun sel (lipoprotein sebagi membran sel, nukleo protein dalam ribosom dan kromosom)
Sebagai enzim
Sebagai hormon
Sebagai antibodi
Sebagai cadangan dalam tubuh
Protein merupakan rantai asam amino dengan ikatan peptida dan ikatan disulphida sehingga senyawa protein terdapat dalam bentuk rantai yang panjang sangat tidak beraturan seperti benang kusut.
Protein terdapat dalam jenis, sifat, berat molekul dan fungsi biologis yang berbeda-beda.
Beberapa protein juga mengandung senyawa atau unsur lain selain asam amino atau disebut protein komplek (conjugated protein), misalnya :
Glucoprotein, juga mengandung senyawa karbohidrat
Lipoprotein, juga mengandung senyawa lemak
Chromoprotein, mengandung senyawa pewarna misal hemoglobin, myoglobin, chlorophyl.
Protein yang terdapat dalam tubuh atau dalam suatu jenis bahan mempunyai spesifikasi yang berbeda satu dengan yang lain.
Setiap bahan mempunyai spesifikasi protein tertentu, yang berbeda dengan bahan lain.
Protein juga kemungkinan besar berubah karena pengaruh lingkungan.
Untuk mengetahui spesifikasi dan berubah tidaknya protein dalam suatu bahan, dapat dianalisis dengan menggunakan gel electrophoresis (SDS-PAGE).
Uji kandungan true protein sampel
Identifikasi jenis-jenis protein suatu bahan
Komposisi kandungan protein bahan
Uji kemurnian atau pemalsuan suatu bahan
Uji jenis enzim, hormon, antibodi
Uji DNA, RNA, Gen
Memahami prinsip analisis protein dengan SDS-PAGE
Memahami prosedur analisis protein dengan SDS-PAGE secara rinci
Electrophoresis : Pemisahan suatu senyawa berdasarkan ukuran atau beratnya dengan bantuan medan listrik (kutub negatif dan kutub positif)
PAGE : Pemisahan senyawa tersebut terjadi pada kolom-kolom pada gel yang dibuat dari senyawa polyacrylamide (campuran acrylamide-bis acrylamide)
SDS-PAGE : bahwa sebelum dianalisis dengan PAGE, sampel (protein) diperlakukan dengan larutan sodium dodecyl sulfate (SDS) untuk merubah struktur (meluruskan) bentuk protein dan untuk memberikan muatan negatif pada protein.
Jika protein suatu sampel diberi muatan listrik negatif (diperlakukan dengan larutan Laemmli bufer) kemudian dituangkan ke dalam kolom pada ujung gel yang dihubungkan dengan listrik kutub negatif dan ujung yang lain dihubungkan dengan listrik kutub positif. Karena adanya gaya tolak dari kutub listrik negatif dan gaya tarik kutub positif terhadap protein sampel dan larutan Laemmli bufer yang bermuatan negatif, maka campuran protein dan larutan Laemmli bufer tersebut akan bergerak menuju ke kutub positif.
Kecepatan gerakan tiap jenis protein sangat dipengaruhi oleh berat molekulnya (BM). Protein dengan BM besar bergerak lebih lambat dibanding protein BM rendah. Pergerakan protein juga lebih lambat dibanding larutan Laemmli bufer.
Adanya perbedaan gerakan tersebut, maka protein yang BMnya lebih besar akan tertinggal dan terpisah dengan protein yang BMnya lebih rendah.
Adanya gerakan protein yang lebih lambat dibanding gerakan larutan Laemmli bufer, menyebabkan larutan Laemmli bufer akan bergerak lebih cepat, terpisah dan meninggalkan protein. Protein yang tertinggal, terlepas, dan akhirnya terpisah dengan larutan Laemmli bufer akan berubah menjadi netral tidak bermuatan listrik, sehingga protein tidak terpengaruh oleh gaya tolak kutub listrik negatif maupun gaya tarik kutub listrik positif sehingga protein berhenti bergerak pada posisinya masing-masing.
Sementara itu larutan Laemmli bufer bergerak terus hingga mencapai kutub listrik positif dan meninggalkan gel (Proses electrophoresis selesai).
Dalam analisis protein menggunakan SDS-PAGE, protein suatu sampel yang akan dianalisa (sampel padat maupun cair) harus :
dipersiapkan dalam bentuk larutan,
diberi muatan listrik negatif.
Bahan yang digunakan :
Larutan Laemmli bufer konsentrasi ganda untuk sampel cair atau 1 kali konsentrasi (1 bagian larutan konsentrasi ganda + 1 bagian aquadest) untuk sampel cair.
Bahan kimia yang dibutuhkan untuk membuat Larutan Laemmli bufer konsentrasi ganda (100 ml) :
No
25 ml
1 ml
Larutan bufer Tris/HCl 0,5 M, pH 6,8 berfungsi sebagai larutan pengkondisi agar larutan yang dibuat atau sampel bersifat basa.
Larutan mercaptoethanol : untuk melonggarkan dan memutus ikatan disuphida antar protein
Larutan SDS : untuk meluruskan struktur protein dan memberikan muatan negatif pada protein
Larutan gliserol : sebagai pengental sampel agar mempunyai integritas dan berat jenis yang lebih besar.
Zat pewarna bromo phenol blue : untuk memberi warna pada sampel sehingga memudahkan pengamatan pergerakan larutan Laemmli buffer dan protein yang terjadi dalam gel selama proses electrophoresis berlangsung.
C12H25NaO4S
Because it is amphipathic, SDS is a potent detergent as a common ingredient of shampoos laundry detergent and other cleaning products
Polar
SDS is a common ingredient in detergents
Other names for SDS include lauryl sulfate and sodium lauryl sulfate
As a detergent SDS destroys protein secondary, tertiary and quaternary structure
This makes proteins rod shaped
SDS also sticks to proteins in a ratio of approximately 1.4 g of SDS for each gram of protein
Negative charge on the sulfate groups of SDS mask any charge on the protein
In aqueous solutions, SDS polarizes releasing Na+ and retaining a negative charge on the sulfate head
So much SDS binds to proteins that the negative charge on the SDS drowns out any net charge on protein side chains
In the presence of SDS all proteins have uniform shape and charge per unit length
SDS nonpolar chains arrange themselves on proteins and destroy secondary tertiary and quarternary structrure
Thus, protein shape is no longer an issue (complex) as the protein SDS complex becomes rod shaped
Gambar perubahan yang terjadi pada protein akibat diperlakukan dengan larutan Laemmli bufer
Mikro pipet otomatis (1 ml) beserta tipnya
Botol (100 ml)
Sentrifuge (20.000-30.000g atau 12.000-18.000rpm)
Timbang sampel padat 1-10mg ( + 0,1mg protein/ml dalam supernatan)
Masukkan sampel ke dalam vial (2 ml), tambahkan 2 ml lar. Laemmli bufer, aduk dengan menggunakan vortex sampai tercampur rata dan lanjutkan dengan ultrasonicator selama 10 menit
Panaskan sampel dalam air mendidih (90-95oC) selama 2-3 menit, lalu dinginkan.
Sentrifuge sampel pada kecepatan 13.000-18.000 rpm selama 5 menit
Tampung supernatan dalam vial (1,5 ml) dan sampel siap untuk dianalisis atau disimpan di freezer maks. 6 minggu.
Buat lar. Laemmli bufer (2xkonsentrasi)
Pipet sampel cair sebanyak 0,2 ml dan masukkan sampel ke dalam vial (1,5 ml),
Tambahkan 0,2 ml lar. Laemmli bufer (2xkons.), aduk dengan menggunakan vortex sampai tercampur rata
Panaskan sampel dalam air mendidih (90-95oC) selama 2-3 menit, lalu dinginkan.
Sentrifuge sampel pada kecepatan 13.000-18.000 rpm selama 5 menit
Tampung supernatan dalam vial (1,5 ml) dan sampel siap untuk dianalisis atau disimpan di freezer maks. 6 minggu.
Gel merupakan selembar jelly tipis (tebal +1 mm) yang dicetak di antara dua lempeng kaca.
Dalam proses electrophoresis, gel berfungsi sebagai media bergeraknya senyawa dalam sampel (protein) dan lar. Laemmli bufer selama proses electrophoresis berlangsung dan menjadi tempat bertautnya protein bands pada hasil proses electrophoresis.
Gel dalam analisis menggunakan SDS-PAGE terbuat dari polimerisasi campuran larutan acrylamide dan bis solution (bis acrylamide)
2. Tahap pembuatan gel
Polyacrylamide Gels
Polyacrilamide gel is a polymer made of acrylamide (C3H5NO) and bis-acrilamide (N,N’-methylene-bis-acrylamide C7H10N2O2)
Acrylamide
Acrylamide
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
CH2
bis-Acrylamide
O
CH
CH2
NH2
C
Acrylamide
Acrylamide polymerizes in the presence of free radicals typically supplied by ammonium persulfate (AMPER)
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
SO4-
TMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine) serves as a catalyst in the reaction
SO4-.
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
NH2
O
CH
CH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
NH2
O
CH
CH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
CH2
bis-Acrylamide
Polyacrylamide Gels
Pore size in gels can be varied by varying the ratio of acrylamide to bis-acrylamide
Protein separations typically use a 29:1 or 37.5:1 acrylamide to bis ratio
Lots of bis-acrylamide
Imbangan larutan acrylamide dan bis solution (bis acrylamide) dalam pembuatan gel akan menentukan kerapatan dan ukuran pori-pori dalam gel yang terbentuk.
Semakin tinggi proporsi larutan bis solution yang digunakan semakin padat dan semakin kecil porositas dalam gel yang terbentuk.
Ada 2 macam Gel yang dibutuhkan dalam SDS-PAGE yaitu :
Separating gel (gel pemisah) merupakan gel di mana gerakan atau proses pemisahan protein terjadi karena adanya pengaruh kutub listrik negatif pada ujung atas gel dan kutub positif pada ujung bawah gel. Porositas lebih longgar dan besar (rasio acrylamide/bis solution 37,5 : 1 atau 2,6 % crosslinkers)
Stacking gel (gel padat) merupakan gel, tempat di mana sampel diletakkan (loading). Porositas lebih padat dan kecil (rasio acrylamide/bis solution 19:1 atau 5 % crosslinkers)
Keduanya menjadi satu kesatuan, stacking gel terletak di atas separating gel (lihat gambar berikut).
Alat yang digunakan :
Cassete pencetak gel (dua keping kaca bening tebal 2-3 mm ukuran 8x8 cm dan 8x7,5 cm, 2 buah penyekat (spacer) tebal 1 mm ukuran 8x0,5 cm, 4 buah penjepit kertas dan sebuah sisir pencetak kolom tebal 1 mm ukuran 8 cm dan lubang sisir 3mm
Spuit (5 ml) 2 buah beserta tip kapiler (capilary tips)
Pipet otomatis (1 ml) beserta tip
Kaca tebal 0,5 cm ukuran 40x30 cm sebagai alas.
Prosedur pembuatan gel
Bahan yang digunakan :
Larutan agarose (1 %) sebagai penyumbat bagian bawah, samping kiri dan kanan cassete pencetak gel
Bahan kimia untuk membuat separating gel
Bahan kimia untuk membuat stacking gel
*) disebut juga larutan starter (katalisator polimerisasi), harus dicampurkan menjelang pembuatan gel dilaksanakan
No
2,5 ml
5,0 ml
*) disebut juga larutan starter (katalisator polimerisasi), harus dicampurkan menjelang pembuatan gel dilaksanakan
No
1,0 ml
0,4 ml
Prosedur :
Persiapkan cassete pencetak gel dengan dua keping kaca dan menaruh penyekat diantaranya pada sisi kanan dan kiri. Sisi kanan, kiri, dan bawah harus rata.
Jepit kedua lempeng kaca tersebut dengan jepit kertas pada sisi kanan dan kiri.
Berdirikan cassete pada alas kaca datar.
Sumbat bagian sisi kiri, kanan, dan bawah cassete dengan menyemprotkan larutan agar panas (cair) menggunakan pipet kapiler secara pelan dan hati-hati. Yang harus diperhatikan saat menyumbat cassete adalah harus tersumbat sempurna (tidak bocor), tinggi larutan agar penyumbat bagian bawah cassete maksimal 2 mm dan rata (datar), serta tidak ada gelembung udara yang dapat mengurangi gaya tarik saat electrophoresis berlangsung.
Tunggu sampai larutan agar mengeras, sehingga cassete siap dituangi larutan pembentuk gel.
Prosedur :
Jika cassete telah siap, siapkan larutan pembentuk separating gel dengan melarutkan semua bahan. TEMED dan AMPER yang harus dicampurkan sesaat menjelang larutan dituangkan ke dalam cassete.
Isi/basahi dengan larutan SDS sampai penuh. Yakinkan bahwa cassete tidak bocor dan tidak ada gelembung udara, kemudian hisap larutan SDS dengan pipet kapiler sampai bersih.
Tuangkan larutan gel ke dalam cassete sampai setinggi + 6 cm atau + 2 dari permukaan atas lempeng kaca yang pendek. Catat volumen yang dibutuhkan dan perhatikan betul apakah cassete benar-benar tidak bocor.
Tuangkan aquadest diatas larutan separating gel secara pelan. Aquadest untuk menutup larutan gel agar tidak kontak dengan udara dan agar permukaan gel benar-benar datar.
Biarkan/tunggu sampai gel terpolimerisasi (30-60 menit), terlihat jika ada garis pemisah jelas antara gel dan aquadest.
Jika sudah terpolimerisasi dengan sempurna, siapkan larutan pembentuk stacking gel.
Jika larutan stacking gel siap, hisap aquadest dari cassete sampai bersih dengan menggunakan pipet kapiler.
Pasang sisir pencetak kolom pada cassete kemudian tuangkan larutan stacking gel ke dalam cassete. Perhatikan jangan sampai ada gelembung udara terutama di antara gigi sisir. Jika ada gelembung udara, goyang-goyang sisir agar gelembung hilang atau hisap dengan pipet kapiler.
Tunggu gel hingga mengalami polimerisasi (30-60 menit). Perhatian tambahkan larutan stacking gel jika di dalam cassete berkurang secara sering agar permukaan atasnya tidak kering.
Setelah terpolimerisasi dengan sempurna (terlihat jelas terbentuknya kolom pada gigi-gigi sisir), angkat sisir dari cassete. Cuci dengan aquadest 2 kali dan akhirnya isi dengan larutan bufer electrophoresis negatif.
Gel siap dipergunakan.
Electrophoresis ; proses pemisahan/ pergerakan senyawa (protein) pada gel akibat adanya pengaruh muatan listrik.
Jika sampel di loading pada kolom stacking gel, kemudian ujung stacking gel dihubungkan dengan listrik kutub negatif dan ujung separating gel dihubungkan dengan listrik kutub positif dari electrophoresis power supply (EPS) maka protein sampel akan bergerak menuju ke kutub positif.
3. Tahap proses electrophoresis
0,5 ml
0,5 ml
No
250 ml
250 ml
Buat denah atau urutan sampel beserta volume sampel sesuai dengan urutan kolom di mana masing-masing sampel akan diloading. Selalu letakkan sampel standar pada kolom pertama.
Letakkan dan urutkan sampel yang akan diloading sesuai dengan denah yang telah dibuat pada rak sampel
Masukkan (loading) sampel sebanyak 6-10 μl secara pelan-pelan ke dalam masing-masing kolom sesuai dengan denah menggunakan pipet kapiler (kapasitas 20 μl).
Jika sampel sudah di loading semua maka cassete sampel siap dilakukan electrophoresis.
Prosedur loading sampel
Catatan penting dalam meloading sampel :
Jumlah sampel disesuaikan dengan kandungan protein pada sampel. Jika terlalu banyak band yang terbentuk terlalu tebal sehingga kemungkinan berhimpitan satu dengan yang lain, sebaliknya sampel terlalu sedikit band yang terbentukl terlalu tipis sehingga kemungkinan tidak semua protein dapat teridentifikasi.
Memasukkan sampel ke dalam masing-masing kolom harus benar-benar tuntas dengan cara menekan pipet secara penuh 3-4 kali sampai keluar gelembung udara pada ujung pipet dan dengan tetap ditekan pipet ditarik dari kolom.
Letakkan bagian bawah cassete sampel pada mangkok yang berisi larutan bufer electrophoresis positif (dasar cassete sampel harus terendam dalam larutan)
Pasang mangkok yang lain pada bagian atas cassete sampel dan tutup lubang antara mangkok dan cassete sampel dengan larutan agarose (1%) panas. Tunggu hingga lar. agarose mengeras dan menyumbat dengan sempurna (tidak bocor).
Isi mangkok atas dengan larutan bufer electrophoresis negatif.
Tutup tataan cassete sampel dengan tutup yang disediakan.
Hubungkan kabel mangkok bawah (warna merah) dengan kutup positif EPS dan kabel mangkok atas (warna hitam) dengan kutup negatif EPS.
Maka proses electrophoresis siap dilaksanakan.
Prosedur :
PANAH lalu tekan ENTER
- Set Voltase yang dibutuhkan, tergantung jumlah gel yang
dianalisa setiap gel dibutuhkan voltase 10 V dan minimal 30 V
dengan menekan TANDA PANAH lalu ENTER.
- Set Ampere yang dibutuhkan, yaitu pilih 100 mA dengan
menekan TANDA PANAH lalu ENTER.
- Pemrograman selesai.
Jika selesai setting program selesai, lalu aktifkan EPS dengan menekan ENTER 3 kali hingga muncul tulisan OFF lalu tekan RUN
Perhatikan adanya gerakan sampel pada gel, jika sudah mencapai ujung atas separating gel (+ 15 menit) tingkatkan voltase menjadi 80 V, dengan cara :
- Tekan tombol PAUSE CONTINUE untuk menghentikan sementara proses
electrophoresis.
- Tekan tombol ENTER berkali-kali sampai angka voltase berkedip, lalu tekan
TANDA PANAH ke atas sampai menunjuk angka 80 V, tekan ENTER sampai tanda OFF berkedip lalu tekan tombol RUN.
- Dengan cara yang sama tingkatkan voltase setiap 15 menit sebanyak 20 V (lakukan 2 kali) sampai voltase 120 V. Kemudian tunggu sampai proses electrophoresis selesai (+ 90 menit) lalu tekan tombol OFF.
Pelaksanaan proses electrophoresis

teklab sds page 1

Documents