tema 14 intro genet
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Tema 14. Principios de Genética Bacteriana. Variaciones Bacterianas. Mutaciones.
Tema 15. Recombinación.
Tema 16. Transferencia de material genético en bacterias: Transformación. Conjugación. Transducción.
Tema 17. Ingeniería genética. Técnicas y Aplicaciones.
BLOQUE III. MICROORGANISMOS PROCARIOTICOS
III.C. GENÉTICA BACTERIANA
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
CONCEPTOS•Genética
Estudio de la herencia y variación entre los microorganismos
segmento de DNA RNAm(transcripción) (traducción)
Cadena polipeptídica
lugar del genoma donde reside o se localiza un gen
•Gen
•Locus
• AleloCada una de las distintas versiones en que puede presentarse un gen
“forma” (secuencia) de un gen en las bacterias aisladas de su hábitat natural o estirpes silvestres.
• Alelo silvestre
distintas “formas” o secuencias que resultan de mutaciones del alelo silvestre.
• Alelo mutante
• GenotipoInformación genética contenida en un organismo.
• Fenotipo Forma en que se expresa el genotipo o el conjunto de caracteres detectables.
Material genético (nucleoide)
Nucleoide = cromosoma + elementos extracromosómicos
Modelo clásico de Watson y Crick
ADNccc
Composición química, estructura y organización del nucleoide
- 1 solo cromosoma(ADN c.c.c.)
a) Plásmidos (ADNccc)b) Elementos transponibles
Composición química, estructura y organización del nucleoide
Material cromosómico Material extracromosómico
Excepciones:Borrelia y Streptomyces: cromosoma linealAgrobacterium tumefaciens: 1 circular y 1 lineal
1. Resistencia a antibióticos (plásmidos R). 2. Resistencia a metales pesados (Ej, mercurio). 3. Plásmidos de virulencia: producción de toxinas, factores de penetración en tejidos,
adherencia a tejidos del hospedador, etc., 4. Producción de bacteriocinas5. Producción de sideróforos (quelatos para secuestrar iones Fe3+). 6. Utilización de determinados azúcares.7. Utilización de hidrocarburos, incluyendo algunos cíclicos recalcitrantes (degradación de
tolueno, xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas. 8. Inducción de tumores en plantas (plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens).9. Interacciones simbióticas y fijación de N2 en Rhizobium
Funciones de los plásmidos
Elementos genéticos extracromosómicoscon capacidad de replicación autónoma
a) Plásmidos
b) Elementos genéticos transponiblesEntidades genéticas insertadas en el cromosoma o en plásmidos y que poseen la habilidad de transponerse (saltar) a nuevos sitios de ese cromosoma o plásmido.
Secuencia de inserción (IS)
Transposón (Tn)
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
Replicación del cromosoma bacteriano
Semiconservativo y bidireccional
1.- MANTENIMIENTO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICAFUNCIONES DEL ADN
Modelo de replicación en theta (θ)
Origen de la replicación Bidireccional
2.- EXPRESIÓN GÉNICA
GEN RNAm(transcripción) (traducción)
Cadena polipeptídica
a) Transcripción
b) Traducción
c) Regulación génica
Etapas:
FUNCIONES DEL ADN
c) Regulación génica
Genes estructuralesGenes reguladores
Operón de expresión constitutivaOperón de expresión regulada
-inducible-reprimible-ADN polimerasas, ARN polimerasas
-proteínas cadena transporte electrones-proteínas ribosómicas
Condiciones ambientales
- Operón = unidad completa de expresión génica
Operón de expresión inducible Producción de β-galactosidasa
Operón de expresión reprimible
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
CONCEPTO:
cambios en el fenotipo, o genotipo de una población bacteriana
hereditarias No hereditarias
Variaciones bacterianas
1. Por adaptación al medio: regulación de la expresión génica
2. Asociadas a cambios en el genotipo:
Tipos de variaciones bacterianas
1. Por adaptación al medio: regulación de la expresión génica
2. Asociadas a cambios en el genotipo:
- sin transferencia de material genético: mutaciones
- asociadas al intercambio de material genético:
Transformación
Transducción
Conjugación
Tipos de variaciones bacterianas
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
Mutación
Alteración de la secuencia de bases de un segmento de ADN correspondiente a un gen.
Cambio en el genotipo estable y heredable
(del latín mutare, cambiar)
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
TIPOS DE MUTACIONES SEGÚN SU EFECTO FENOTÍPICO
no hay efecto fenotípico
SilenciosasLetales
alteración del fenotipo silvestre
No letalesCondicionalmente letales
Cambios morfológicosRequerimientos nutritivosResistencia a antibióticos y bacteriófagos
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
TIPOS DE MUTACIONES A NIVEL MOLECULAR
a) Mutaciones espontáneas
resultado de la actividad normal de la célula, o de sus interacciones con su medio natural.
b) Mutaciones inducidas
aquellas provocadas por previa alteración experimental del ADN, bien sea directamente, o indirectamente, por agentes físicos o químicos denominados mutágenos
Frecuencia: 10-10 y 10-5
Errores en replicación, reparación o recombinación del ADN
Demostración de la espontaneidad de las mutaciones bacterianas
Las mutaciones son espontáneas, surgen al azar e independientemente de las condiciones ambientales
¿Se produce mutación como consecuencia de la exposición al antibiótico?
¿Mutaciones espontáneas, al azar?las células son resistentes antes de la exposiciónAdaptación ambiental
¿?
Antiguamente:Las adaptaciones ambientales se podían transmitir a la descendencia
Ej. resistencia en medio con antibióticos
PRUEBA DE FLUCTUACIÓN (LURIA Y DELBRÜCK, 1943)
Fago T1 infecta y mata a la mayoría de las células
Cultivo bacterias+
fagos
¿Mutación al azar?TonS TonR
¿Adaptación fisiológica en presencia del fago?
PRUEBA DE FLUCTUACIÓN (LURIA Y DELBRÜCK, 1943)
¿Mutación al azar?TonS TonR
¿Adaptación fisiológica en presencia del fago?
- Suceso poco frecuente
- Si se producía: -al principio del crecimiento ↑ TonR
-al final del crecimiento ↓ TonR
Muchos cultivos pequeños darían VARIABILIDAD en el número bacterias resistentes
Muchos cultivos pequeños darían POCA VARIABILIDADen el número bacterias resistentes
Constante
PRUEBA DE FLUCTUACIÓN (LURIA Y DELBRÜCK, 1943)
0,2 mlcultivo bacterias
103
0,2 mlcultivo bacterias
109
g x 20
X 20
capa de fagosNúmero de bacterias resistentes
103
g x 20 10 alícuotas de 0,2 mlcultivo bacterias
capa de fagos+
Número de bacterias resistentes
Control
Mutación al azar = gran variabilidadAdaptación = Nº resistentes igual
PRUEBA DE FLUCTUACIÓN (LURIA Y DELBRÜCK, 1943)
Max Delbrück
Salvadore E. Luria
PRUEBA DE FLUCTUACIÓN (LURIA Y DELBRÜCK, 1943)
Max Delbrück
Salvadore E. Luria
Carácter preadaptativo de la mutación
El fago T1 selecciona a las bacterias resistentesNO INDUCE SU APARICIÓN
¿ Es posible demostrar la existencia previa de los mutantes resistentes antes de introducir el agente selectivo?
Experimento de la Placa Replicada(Lederberg y Lederberg 1952)
El fago T1 selecciona a las bacterias resistentesNO INDUCE SU APARICIÓN
TIPOS DE MUTACIONES A NIVEL MOLECULAR
a) Mutaciones espontáneas
resultado de la actividad normal de la célula, o de sus interacciones con su medio natural.
Frecuencia: 10-10 y 10-5
Errores en replicación, reparación o recombinación del ADN
TransicionesPu:Py x Pu:Py (A:T por G:C)
TransversionesPu:Py x Py:Pu
(A:T por T:A ó G:C por C:G)SilvestreSilenciosaSin sentidoSentido
erróneo
1.- Mutaciones puntuales
Sustituciones de pares de bases
a) Mutaciones espontáneas
2.- Mutaciones por desplazamiento de la pauta de lectura
Por pérdida o ganancia de un pequeño número de nucleótidos
Deslizamieno en la cadena nueva
Deslizamiento que conduce a una adición Deslizamiento que conduce a una deleción
Deslizamiento en la cadena parental
3.- Grandes delecciones o borraduras- Eliminación de gran número de nucleótidos
bucles intracatenarios
delección
Mutación irreversible e inactivadora de uno o varios genes
Mutación pleiotrópica
4.- Mutaciones insercionalesOcasionadas por elementos genéticos transponibles
Secuencias de inserción (IS) Transposones (Tn)
NO HAY TRANSCRIPCION
Tienen regiones terminales idénticas y repetidas: promotor y terminador
NO HAY TRANSCRIPCIÓN
SI HAY TRANSCRIPCIÓN
Resultado: inactivación del gen debida a desplazamientos de la pauta de lectura
Mutantes resistentes a kanamicina
Duplicaciones en Tandem
5.- Otras mutaciones espontáneas
Reordenamientos causados por errores en la recombinación
Inversiones Translocaciones
a b
Giros de 180º Movimiento a zona diferente a
a
a b
Copia a continuación
a b a b
b ab
b
b
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
-AGENTES FÍSICOS *CALOR*RADIACIONES
-AGENTES QUÍMICOS
*Análogos de bases
*Agentes desaminantes o hidroxilantes
*Agentes alquilantes
*Agentes intercalantes
Agentes mutagénicos
Mutaciones inducidas
Efecto de las radiaciones
Mayor energía
Altamente mutagénicas
a) Radiaciones no ionizantes
a) Radiaciones ionizantes
a) Radiaciones no ionizantes
Luz ultravioleta Letal o mutagénica según dosis
• ADN formación de dímeros de pirimidinas T=T, C-C, T-C impiden la correcta replicación y transcripción del ADN
rayos X y rayos gamma
b) Radiaciones ionizantes
Letales
-Efecto directo: roturas y entrecruzamiento sobre el ADN no reparables
-Efecto indirecto debido a la ionización del agua
H20 H+ + OH-
ADN roturas muerte
Reacciones de autooxidación
02
·H+ O2 ·HO22 ·HO2 H2O2 + O2
Epóxidosperóxidos Efectos letales
corta longitud de onda y elevada energía
-AGENTES FÍSICOS *CALOR*RADIACIONES
-AGENTES QUÍMICOS
*Análogos de bases
*Agentes desaminantes o hidroxilantes
*Agentes alquilantes
*Agentes intercalantes
Agentes mutagénicos
Mutaciones inducidas
1. Análogos de bases
2-aminopurina
5-bromouracilo
Se incorporan durante la replicación del ADN
T:A G:Ctransición
2. Agentes desaminantes o hidroxilantes
- Ácido nitroso
Desaminación oxidativa de adenina y citosina
Adenina hipoxantinaA:T hipoxantina: C (transición)
- HidroxilaminaAñade un grupo hidroxilo al grupo amino de citosina
3. Agentes alquilantes
•Etil etano sulfonato (EES)
•Etil metano sulfonato (EMS)
•Nitrosoguanidina (NTG)
Introducen radicales alquílicos en las cadenas de ADN
C-G
G-(metilada)T-A
4. Agentes intercalantesSe introducen entre las pares de bases del ADN
pérdida o ganancia de nucleótidos
5. Agentes que bloquean totalmente el emparejamiento de bases
Benzo-α-pireno
Modifican purinas grandes lesiones ADN inducen sistema SOS
- Naranja de Acridina- Bromuro de etidio- Derivados de la flavina
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
2.5. Reversibilidad de las mutaciones bacterianas(excepto las grandes delecciones o borraduras)
Segunda mutaciónRestauración del fenotipo original
Restauración del Genotipo original
REVERSIÓN SUPRESIÓN
Restauración del Genotipo original
Bacteria con 2 mutaciones
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
Errores en la replicaciónAcción de mutágenos
Mutaciones
Reparación
1.Mecanismos prerreplicativos:-Reparación fotoenzimática o fotorreactivación-Reparación por escisión y resíntesis
2.Mecanismos posreplicativos:-Reparación por recombinación-Reparación inducible de emergencia (SOS)
Enzimas que comprueban la lectura
Reparación de fotoproductos (luz uv)
2.6. Sistemas de reparación de daños
1. Mecanismos prerreplicativos:
a) Reparación fotoenzimática o fotorreactivación
Fotoliasa: separa dímeros de timinaLuz UV
Dímero de Timina
Fotoliasa
Luz Visible
1. Mecanismos prerreplicativos:
Endonucleasa uvrABC: elimina bases dañadas
ADN polimerasa I: rellena el hueco
Ligasa
+
+
b) Reparación por escisión y resíntesis
Daño UV
Formación deldímero T-T
2. Mecanismos posreplicativos:
a) Reparación por recombinación
4
5
- Repara ADN que no tiene cadena molde
- Proteína recA: intercambia un fragmento del ADN molde similar
2. Mecanismos posreplicativos:
Daño intenso Parada en la síntesis ADN
SOSProteína recA
- Intercambio de cadenas- Destruye a la proteína represora lexA
b) Reparación inducible de emergencia (SOS)
1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.
2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
2.7. Métodos de detección de mutantes
Método en placa
Mutantes resistentes a antimicrobianos, metales pesados, etc
Cultivo microorganismo Medio con agente mutagénico
Técnica de gradiente en placa
Método réplica en placaMutantes auxotrofos
Mutantes auxotrofos
Las bacterias como indicadores de sustancias mutagénicas y potencialmente carcinogénicas.
Bruce Ames, 1970
Establece el número de mutantes revertidos de una bacteria auxotrofa en presencia y
ausencia del agente mutagénico
Bacterias indicadoras: poseen mutaciones puntuales
2.8. Test de Ames
Test de AmesSalmonella typhimurium his(-)
Medios sin histidina
Agente mutagénico
Agente mutagénico = Nº mutantes revertidos en presencia del agente debe ser doble al del que existiría en ausencia del mismo