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TEMA 10
LA EPIGENÉTICA EN EL DIAGNÓSTICO, PRONÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER
La epigenética representa una de las más prometedoras áreas de estudio en el campo de la
investigación biomédica. Desde su nacimiento en los años 40, nuestro conocimiento sobre su papel en el correcto funcionamiento celular, y de modo paralelo su papel en el desarrollo de un gran número de patologías ha crecido exponencialmente, sobre todo en la última década. Las modificaciones epigenéticas mejor conocidas son la metilación del ADN y las modificaciones postraduccionales de las histonas, de las que sabemos son importantes reguladores de la expresión génica y cuya desregulación en un hecho clave en las primeras etapas del desarrollo tumoral. El conocimiento del perfil epigenético específico para cada tipo tumoral ha permitido el uso de las alteraciones epigenéticas como biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico y predicción de la respuesta al tratamiento de pacientes con cáncer. Otra de las ventajas de las modificaciones epigenéticas es su reversibilidad, que junto al conocimiento de las alteraciones específicas de cada tumor ha permitido el diseño de terapias cada vez más específicas. En este tema abordaremos de modo resumido nuestro conocimiento sobre el papel que juega la epigenética en el desarrollo del cáncer y como este puede contribuir a mejorar el manejo clínico de los pacientes con cáncer. ÍNDICE INTRODUCCIÓN A LA EPIGENÉTICA
La metilación del ADN Modificaciones postraduccionales de las histonas LA METILACIÓN DEL ADN EN CÉLULAS NORMALES Y CANCERÍGENAS La hipometilación del ADN en cáncer Hipermetilación de genes supresores de tumores en cáncer LA METILACIÓN DEL ADN EN LA PRÁCTICA CLÍNICA La metilación del ADN en el diagnóstico del cáncer El uso de la metilación del ADN como marcador de pronóstico
La metilación del ADN como factor predictivo de la respuesta al tratamiento La metilación del ADN como diana terapéutica LAS MODIFICACIONES DE LAS HISTONAS EN CÁNCER UTILIZACIÓN DE LA EPIGENÉTICA EN LA TERAPIA ANTICANCERÍGENA
Inhibidores de histonas desacetilasas Otras drogas epigenéticas
CONCLUSIONES
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INTRODUCCIÓN A LA EPIGENÉTICA El esfuerzo de los investigadores en las últimas décadas se ha centrado en el estudio de una amplia variedad de alteraciones genéticas, como amplificaciones, traslocaciones, deleciones y mutaciones puntuales, que pudieran tener algún papel relevante en el desarrollo del cáncer. El estudio de estas alteraciones genéticas ha conducido a la identificación de oncogenes y genes supresores tumorales implicados en el desarrollo del cáncer. Sin embargo, el desarrollo del cáncer no se debe únicamente a los cambios genéticos descritos anteriormente, sino también a cambios epigenéticos. Mientras que la genética se centra en el estudio de aquellas alteraciones en la secuencia de nucleótidos que provocan cambios en la funcionalidad de las proteínas, la epigenética la podríamos definir como la ciencia que estudia los cambios en la expresión génica que no se deben a cambios en la secuencia de nucleótidos. Las modificaciones epigenéticas mejor conocidas en mamíferos son la metilación del ADN y las modificaciones postraduccionales de las histonas. Estas modificaciones están reguladas por un gran número de enzimas entre las que encontramos las ADN metil transferasas (DNMTs), que regulan la metilación del ADN, las histonas desacetilasas (HDACs) e histonas acetil transferasas (HATs), encargadas de las reacciones de desacetilación/acetilación de las histonas, y las histonas metil transferasas (HMTs), encargadas de la metilación de las mismas. La metilación del ADN
La modificación epigenética más ampliamente estudiada es la metilación en residuos de citosina. Esta modificación epigenética consiste en la adición de un grupo metilo en el carbono 5 de las citosinas que forman parte de un dinucleótido CpG. Esta reacción enzimática se produce después de la síntesis de ADN, y está catalizada por una familia de enzimas llamadas ADN metiltransferasas (DNMTs). La proporción de dinucleótidos CpG en el genoma humano es más baja (1,2%) de lo esperado (4%) dada la abundancia de citosinas y guaninas (42% de las bases de ADN). Esta falta de CpGs en nuestro genoma puede explicarse por un fenómeno denominado supresión CpG, en el que hay un agotamiento progresivo de dinucleótidos CpG debido a la desaminación espontánea de citosinas metiladas a timidinas durante la evolución. La distribución de este dinucleótido en los genomas de vertebrados no es uniforme, y se concentran en secuencias cortas (500-‐2000 pb), denominadas islas CpG localizadas principalmente en la región promotora de la mitad de los genes humanos aproximadamente. Sin embargo, la mayor parte de CpGs se encuentran en una baja densidad en las regiones intergénicas, secuencias repetidas y transposones.
La metilación del ADN se asocia con el silenciamiento del ADN. ¿Pero cómo es interpretada esta modificación del ADN por los factores nucleares para provocar el silenciamiento génico?. Algunos estudios han encontrado que cuando esta modificación se produce en las regiones reconocidas por factores de transcripción se inhibe su unión impidiendo el reclutamiento de toda la maquinaría transcripcional. Sin embargo el mecanismo más común por el que la metilación del ADN inhibe la expresión génica e induce la condensación de la cromatina es mediante el reclutamiento de complejos represores. Las citosinas metiladas son reconocidas por las proteínas con dominios de unión a ADN metilado (MBDs) que a su vez reclutan complejos que contiene histonas desacetilasas (HDACs) que favorecen estados más cerrados de la cromatina impidiendo el acceso de la compleja maquinaria transcripcional como veremos más adelante (figura 1).
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Figura 1. Mecanismos de inhibición de la expresión por cambios epigenéticos.
La metilación del ADN impide la unión de proteínas de la maquinaria transcripcional y permite el reclutamiento de complejos que contienen histonas desacetilasas (HDACs). La suma de los cambios epigenéticos modifica la estructura de la cromatina, impidiéndose la expresión génica. Modificaciones postraduccionales de las histonas
Hasta el momento se han descrito un gran número de modificaciones postraduccionales de
las histonas entre las que podemos destacar acetilación, metilación, sumolación, fosforilación y ubiquitinación, de las que las mejor conocidas son la acetilación y la metilación de los residuos de lisina presentes en los extremos amino terminal de las histonas. En general, la acetilación de las histonas se relaciona con un estado más relajado de la cromatina, y por tanto con la transcripción génica. Cuando las lisinas no están acetiladas, las cargas negativas del ADN interaccionan con las cargas positivas de las lisinas, lo que provoca un estado más compacto de la cromatina dificultando el acceso de la maquinaria transcripcional, mientras que la acetilación de las mismas provocará el efecto contrario facilitando la transcripción génica. La acetilación de las histonas está regulada por dos grandes grupos de enzimas, las HATs y las HDACs. Las HATs transfieren un grupo acetilo a los residuos de lisina presentes en los extremos N-‐terminal de las histonas utilizando la coenzima A como sustrato, mientras que las HDACs catalizan la reacción inversa.
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Sin embargo, en el caso de la metilación de las histonas la situación es más compleja, ya que dependiendo del residuo que se metile, el efecto sobre la expresión génica y la estructura de la cromatina es distinto. Así, mientras que la metilación de las lisinas 4, 36 y 79 de la histona H3 se relaciona con regiones de eucromatina y con la expresión génica, la metilación de las lisinas 9 y 27 de esta misma histona y la lisina 20 de la histona H4 son frecuentes en regiones de heterocromatina y en los promotores de genes silenciados (figura 2). Al igual que la acetilación de las histonas, esta modificación es reversible y está regulada por las histona metil transferasas (HMTs) y las histona desmetilasas (HDMs). Mientras que en el caso de las HATs y HDAcs no hay una elevada especificidad por el por el residuo al que modifican, las HMTs y HDMs son altamente específicas por el residuo de lisina al que modifican.
Figura 2. Metilación de histonas y efectos sobre la expresión génica.
Las histonas se pueden metilar en distintos residuos. Dependiendo de la combinación de metilaciones que se dan (código de metilación de histonas), se produce un efecto distinto sobre la expresión génica.
Al conjunto de las modificaciones de histonas es a lo que se denomina código de histonas. Al
igual que la metilación del ADN este código debe ser interpretado por los factores nucleares. Así, La acetilación y metilación de las histonas son reconocidas por proteínas con bromodominios y cromodominios respectivamente que van a interpretan cada una de estas marcas. Por ejemplo, la ARN polimerasa contiene bromodominos y por tanto, se une a regiones del ADN que contienen nucleosomas con histonas acetiladas, y con una estructura de la cromatina más relajada. La metilación de la lisina 9 de la histona H3 es reconocida por la proteína de heterocroamtina (HP1) que es característica de zonas de heterocromatina como las regiones pericentroméricas y teloméricas donde la cromatina está muy condensada.
Como ya sugerimos anteriormente las modificaciones epigenéticas cooperan en la regulación de la expresión y la estructura de la cromatina. Por ejemplo el ADN metilado es reconocido por las
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MBDs que a su vez reclutan complejos multiproteicos que contienen, HDACs, HMTs, y complejos remodeladores de la cromatina, para determinar cada uno de los estados de la cromatina. Por ejemplo, las regiones de heterocromatina y los promotores de genes silenciados se caracterizan por tener el ADN metilado y las histonas desacetiladas y metiladas en la lisina 9 de la histona H3. Mientras que en los promotores de los genes que se expresan el ADN no está metilado y las histonas están acetiladas y metiladas en la lisina 4 de la histona H3.
Hasta el momento la mayoría de los estudios se han centrado en el estudio del papel de la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas en la regulación de la expresión génica en condiciones patológicas. De hecho, podríamos decir que ha sido el estudio del papel que juega la epigenética en el desarrollo de determinadas patologías el que nos ha ayudado a conocer su función en células normales. Empezaremos describiendo el patrón epigenético característico en condiciones normales y su función para después analizar cómo se altera este patrón en cáncer y como estas alteraciones nos pueden ser de gran ayuda en el manejo clínico de estos pacientes.
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LA METILACIÓN DEL ADN EN CÉLULAS NORMALES Y CANCERÍGENAS
En células normales, las regiones intergénicas, secuencias repetidas, transposones y secuencias parásitas, que suponen la mayoría de las CpGs distribuidas por el genoma, se encuentran metiladas impidiendo que estas regiones se expresen y manteniendo por tanto, la estabilidad del genoma. Por ejemplo, la falta de metilación en los transposones permitiría que estos se translocasen a cualquier región del genoma insertándose por ejemplo en exones o regiones promotoras de determinados genes e interfiriendo con su expresión. Por el contrario, y salvo unas cuantas excepciones, la mayoría de las islas CpGs presentes en los promotores de los genes no están metiladas promoviendo un estado relajado de la cromatina y permitiendo el acceso de los factores de transcripción y toda la maquinaria transcripcional siempre que la célula lo requiera. Entre las excepciones encontramos genes imprintados, genes de uno de los cromosomas X en las mujeres, genes específicos de la línea germinal y genes específicos de tejidos, en los que estas islas están metiladas en células normales, y por tanto impidiendo su expresión como parte del proceso normal de desarrollo. Los genes imprintados son aquellos en los que se expresa solo uno de los alelos, y el otro está silenciado permanentemente por metilación de su región promotora. Lo mismo ocurre con los genes de uno de los cromosomas X en las mujeres. Sin embargo, esta situación cambia completamente en las células cancerígenas. En los tumores el patrón de metilación se altera de dos formas diferentes: por un lado se produce una hipometilación global del genoma debido principalmente a una desmetilación generalizada en las CpGs dispersas en el cuerpo de los genes y secuencias repetidas, y por otro lado y de modo paralelo se produce la hipermetilación de la región promotora de un gran número de genes (figura 3).
Figura 3. Cambios en el patrón de metilación en células cancerígenas. En las células cancerígenas disminuye la metilación global del genona y de la secuencia codificante de los genes en particular, mientras que aumenta la metilación de los promotores. Estos cambios dan lugar al silenciamiento de la expresión de genes.
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La hipometilación del ADN en cáncer Uno de los primeros trabajos que vinculan la metilación aberrante del ADN con el cáncer fueron los estudios de Lapeyre y Becker, quienes compararon por HPLC el contenido de 5-‐metilcitosina de hígado de rata normal y carcinomas hepatocelulares en ratas inducidas por acetilo de aminofluoreno. Los cánceres inducidos con este carcinógeno mostraron una disminución en el contenido global de 5-‐metilcitosina de entre 20% -‐ 40% en comparación con el hígado normal. Hoy en día, sabemos que el genoma de una célula de cáncer sufre una reducción de 20% -‐60% del contenido 5-‐metilcitosina. Esta pérdida de grupos metilo se produce sobre todo en las regiones codificantes e intrones de los genes, secuencias repetitivas y transposones. Esta disminución en la metilación global provoca la activación de los elementos transponibles y retrovirus endógenos presentes en el genoma humano, el aumento de la dosis de los genes imprintados, aquellos de los que se tiene que expresar una sola copia, y la expresión de oncogenes que están silenciados por metilación en células normales. La reactivación de los promotores asociados con elementos de transposición puede modificar los niveles de expresión y/o actividad de los genes en los que se inserte, producir mutaciones a nivel genómico y anomalías cromosómicas provocadas por los procesos de recombinación. La pérdida de metilación en las secuencias pericentroméricas es muy frecuente en los tumores, provocando fallos en la distribución de las cromátidas hermanas durante la división celular, siendo por tanto responsable de la aneuploidía observada en algunos tipos de tumores. Por ejemplo, los pacientes con síndrome de ICF (Immunodeficiency, Centromere instability and Facial anomalies), que se caracteriza por mutaciones que provocan la pérdida de función de una ADN metiltransferasa (DNMT3B) muestran numerosas aberraciones cromosómicas. Además, en un estudio usando un modelo de progresión de cáncer de piel, encontramos que la hipometilación del ADN es un evento temprano en el desarrollo del tumor, y que esta aumenta a medida que lo hace la agresividad de este lo que indica que la pérdida de metilación global podría ser un biomarcador de la agresividad del tumor. Finalmente, este fenómeno también afecta a genes de los que se expresan una sola copia y cuya pérdida de metilación provoca ganancia de función. Este es el caso de IGF2 que promueve el crecimiento celular y cuya ganancia de función por pérdida de imprinting es un evento común en varios tipos de tumores. Hipermetilación de genes supresores de tumores en cáncer
La otra alteración epigenética en cáncer relacionada con la metilación del ADN, y de la que más datos disponemos hasta el momento, es la pérdida de expresión y función de un gran número de genes supresores de tumores por hipermetilación de su región promotora. Hasta el momento se han descrito más de 200 genes hipermetilados en cáncer que regulan casi todas las funciones celulares, tales como el ciclo celular (p16INK4a, p15INK4b, Rb, p14ARF) (ver tema 2), reparación del ADN (BRCA1, hMLH1, MGMT, AVS) (ver tema 6), la adhesión celular y la invasión (CDH1, CDH13, EXT1, Slit2, EMP3) (ver tema 7), la apoptosis (DAPK, TMS1, sFRP1) (ver tema 5), el metabolismo de carcinógenos (GSTP1), la respuesta hormonal (RARB2, ER, PRL y los receptores de TSH), la señalización de Ras (RASSF1A, Nore1a) (ver tema 4), microRNAs, etc, es decir genes que regulan el mantenimiento de la homeostasis celular, y cuya pérdida de función es uno de los eventos clave en el proceso de desarrollo tumoral. Por ejemplo, la pérdida de expresión por metilación de p16INK4a en diferentes tipos de tumores provoca la desregulación del ciclo celular y el crecimiento incontrolado de las células tumorales. Aunque la pérdida de expresión y función por metilación de muchos de estos genes es común a diferentes tipos de tumores, como es el caso de p16INK4a que está metilado en más del 30% de tumores, existe un perfil de hipermetilación característico para cada tipo tumoral. Esto no quiere
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decir que cada gen se metila específicamente en cada tipo de tumor, sino que existen combinaciones de genes cuya metilación es específica para cada tipo tumoral. Por ejemplo, la metilación de BRCA1, GSTP1 y p16INK4a es específica de cáncer de mama y ovario. La hipermetilación de p16INK4a, p14ARF, MGMT, APC y hMLH1 es característica de tumores gastrointestinales. En otros casos la metilación de un gen es característica de un tipo tumoral, como es el caso de EXT1 que sólo está metilado en leucemia promielocítica aguda (APL) y leucemia linfoblástica aguda (ALL), y no lo está en el resto de tumores hematológicos y tumores sólidos. Hay otros trabajos que muestran que además el grado de metilación varía muy significativamente de unos tumores a otros: por ejemplo, los tumores más hipermetilados son aquellos que se originan en el tracto gastrointestinal (esófago, estómago, colon), mientras que los tumores de ovario y sarcomas presentan un menor número de genes hipermetilados en general. No sabemos exactamente la razón de estas diferencias, pero una posible explicación es que los tumores con más genes supresores de tumores hipermetilados son los que están más expuestos a agentes carcinógenos externos. Otra posibilidad es que en los tumores con pocos genes hipermetilados son en los que menor número de estudios se han realizado y por tanto aún no se han encontrado.
Otras preguntas que quedan por responder es por qué se metilan unos genes y otros con funciones muy parecidas no y porque ese patrón específico del tipo tumoral cuando los genes que se metilan son cruciales para el correcto funcionamiento de todos los tipos celulares: por ejemplo, por qué los genes que regulan los pasos cruciales en la regulación del ciclo celular están metilados sólo en ciertos tipos de tumores. Como ya se ha sugerido para explicar el por qué de los cambios genéticos, aquí podríamos hipotetizar que el perfil de metilación específico de cada tumor le confiere una ventaja selectiva. Otros autores han propuesto que la hipermetilación está directamente dirigida, como se ha propuesto para las proteínas de fusión características de algunos tipos de leucemias, como la PML-‐RAR, que pueden contribuir a la hipermetilación mediante el reclutamiento de la maquinaria epigenética (DNMTs y HDACs) a la región promotora. Sin embargo, esta posibilidad no parece un mecanismo general, al menos en leucemias. Finalmente, es posible que otros genes epigenéticos, tales como el complejo polycomb que regula la metilación de la lisina 27 de la histona H3 dirija el silenciamiento génico de estos genes mediante la interacción con una compleja maquinaria epigenética que incluya HDACs, HMTs y DNMTs y que tiene como resultado final la inhibición de la expresión génica. Este último dato vuelve a incidir en la idea de que todas las modificaciones epigenéticas cooperan en la regulación de la expresión y la estructura de la cromatina.
Todos estos datos sugieren que la definición del patrón de metilación específico para cada tipo de tumor es una valiosa herramienta para el diagnóstico. Pero además la pérdida de función por metilación de genes implicados en los procesos de adhesión celular, reparación del ADN y metabolización de fármacos, nos ayuda a conocer como se producen los procesos de invasión y metástasis y nos proporciona una valiosa herramienta para el pronóstico y la evaluación de la respuesta al tratamiento como veremos en los siguientes apartados.
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LA METILACIÓN DEL ADN EN LA PRÁCTICA CLÍNICA Gran parte de los esfuerzos de los investigadores están dirigidos a la búsqueda de
marcadores que nos permitan diagnosticar el cáncer en estadios tempranos de la enfermedad, conocer el pronóstico, y definir el tratamiento más eficaz para cada grupo de pacientes con una elevada sensibilidad y especificidad. El desarrollo de técnicas de alcance genómico, como la inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP) o los “microarrays” de metilación, que permiten determinar el estado de metilación de un gran número de genes ha permitido definir el perfil de metilación específico de cada tipo de tumor con una mayor precisión. Por ejemplo, en un estudio publicado recientemente en el que se comparó el estado de metilación de más de 40000 CpGs en 48 muestras de cáncer de mama y sus correspondientes tejidos normales ha permitido identificar un panel de 10 genes cuyo estado de metilación permite distinguir entre tejido de mama normal y tumoral. Además, estos métodos nos han permitido definir la firma epigenética característica para cada subtipo tumoral, y siguiendo con el mismo ejemplo, en cáncer de mama se ha visto que el subtipo luminal B está más frecuentemente metilado que los subtipos luminal A y el “basal-‐like”. En otro trabajo en el que se comparó el estado de metilación de 14000 genes en 154 muestras de cáncer de colon y sus correspondientes tejidos normales se identificaron subgrupos que compartían una misma firma epigenética y genética y que esta no solo nos ayuda clasificar el subtipo tumoral sino también a evaluar el pronóstico.
Un aspecto tremendamente atractivo de la caracterización de los patrones de metilación aberrante en cáncer es su uso en el diagnóstico y seguimiento de los pacientes con esta enfermedad (figura 4). En particular, la hipermetilación de genes supresores de tumores constituye un prometedor biomarcador por varias razones. Primero, a diferencia de las mutaciones, la metilación siempre ocurre en regiones definidas del ADN y puede ser detectada con una elevada especificidad, sensibilidad y resolución. Segundo, existe un perfil de metilación típico de cada tipo tumoral. Y tercero, la invención de la PCR específica de metilación (MSP) ha hecho de la metilación una modificación fácil y rápida de detectar. Este ensayo permite de una forma rápida y sencilla la detección de alelos metilados de un determinado gen en un "pool" de células normales contaminantes, que podrían dar falsos negativos usando otros métodos. La estandarización de esta técnica, junto con otros métodos cuantitativos han hecho posible detectar la hipermetilación de genes supresores de tumores en muestras clínicas obtenidas mediante procedimientos mínimamente invasivos como son esputos, lavados broncoalveolares, ganglios linfáticos aspirados mamarios y orina. Incluso, como la mayoría de tumores primarios liberan cierto ADN al suero, es posible detectar metilación aberrante en sangre periférica de pacientes con distintas neoplasias solidas. En este sentido, se ha demostrado que la septina 9, un marcador de metilación único para el cáncer colorrectal, podría ser detectada con una elevada especificidad (95%) en la sangre de estos pacientes. Es este mismo tipo de tumores se ha visto que es posible detectar la metilación de APC, MGMT, RASSF2 y WIF1 en muestras de suero con una sensibilidad y especificidad del 87% y el 92% respectivamente. En otro estudio encontraron que es posible detectar cáncer de próstata con una especificidad del 98% y una sensibilidad del 73% analizando la metilación del gen GSTP1 en orina.
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Figura 4. Usos potenciales de la epigenética en la clínica
La metilación del ADN en el diagnóstico del cáncer
Una buena noticia para el uso de la metilación en el diagnóstico de los pacientes con cáncer
es que esta alteración es un hecho temprano en el desarrollo de esta patología. Por ejemplo, la metilación de la ciclina D2 (CCND2), un importante regulador del ciclo celular, es un hecho frecuente en cáncer de mama que se encuentra ya en carcinomas in situ, lo que indica que la metilación de este gen es un evento muy temprano en el desarrollo del cáncer de mama. Otros trabajos indican que también es posible detectar la metilación de RARβ y RASSF1A en lesiones in situ. Incluso es posible que la aparición de alteraciones epigenéticas tempranas en tejidos normales sea un indicador de riesgo para el desarrollo del cáncer. En este sentido, la hipermetilación de p16INK4a en células epiteliales de mama parece preceder el desarrollo de lesiones premalignas.
En el caso del cáncer de próstata, la hipermetilación del promotor del gen GSTP1 (gen implicado en la reparación del ADN) es una de las alteraciones más tempranas y más comunes en el cáncer de próstata e incrementa con la progresión de la enfermedad. La metilación de GSTP1 se ha detectado en el 75-‐100% de los cánceres de próstata, en aproximadamente el 70% de las lesiones PIN (neoplasia prostática intraepitelial) y en el 6% de las lesiones PIA (atrofia inflamatoria proliferativa). Por otro lado, se ha observado que la metilación del promotor del gen que codifica para el receptor de andrógenos es más abundante en cáncer de próstata independiente de
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andrógenos que en el dependiente de andrógenos, lo que sugiere que el silenciamiento epigenético del receptor de andrógenos podría ser el mecanismo responsable de la independencia androgénica en ese 20%-‐30% de los tumores de próstata independientes de andrógenos que no expresan el citado receptor. En cáncer de vejiga, entre los genes inactivados por hipermetilación de su región promotora encontramos genes implicados en la regulación del ciclo celular, los procesos de apoptosis, la migración e invasión celular entre otros. En concreto, el gen supresor de tumores RASSF1 está metilado en un 32-‐67% de tumores de vejiga y se ha asociado con estadios avanzados de la enfermedad así como con una disminución de la supervivencia. La inactivación por metilación de los genes reguladores del ciclo celular p14ARF y p16Ink4a se ha asociado con el estadio y el pronóstico de los pacientes con cáncer de vejiga. Aunque existe un gran número de estudios que muestran que la hipermetilación del ADN es un hecho frecuente en cáncer de vejiga, no hay trabajos concluyentes que indiquen que la metilación de un solo gen sea altamente específica de este tipo tumoral y que pueda ser utilizado por tanto como marcador de esta enfermedad. Sin embargo, hay otros estudios que indican que el análisis conjunto de la hipermetilación de un grupo de genes muestra una mayor especificad y sensibilidad en su uso como biomarcadores. Por ejemplo, la metilación conjunta de RASSF1, CDH1 y APC mostró una sensibilidad y una especificidad del 86% y 60% respectivamente en el diagnóstico del cáncer de vejiga. Todos estos datos indican que podemos usar la metilación de estos genes no solo como herramienta para el diagnóstico del cáncer sino que además nos va a permitir detectarlo en fases tempranas de la enfermedad. Aunque aún no se ha aprobado el uso de test epigenéticos para el diagnóstico del cáncer, ya hay disponibles algunos para su uso en el laboratorio y en ensayos clínicos. Dos ejemplos son los ensayos que permiten determinar la metilación de GSTP1 y APC para el diagnóstico de cáncer de próstata y el que determina la pérdida de metilación de IGF2 como un factor de riesgo en cáncer de colon. El uso de la metilación del ADN como marcador de pronóstico
Otro de los grandes retos en la práctica clínica es poder distinguir, entre dos tumores muy
similares desde el punto de vista morfológico, cuál de ellos va crecer más rápido y va a tener un comportamiento más agresivo. En este punto, la metilación del ADN también puede ser una valiosa herramienta, ya que también nos va a proporcionar información sobre el pronóstico de la enfermedad, y de hecho la podremos utilizar como biomarcador de pronóstico.
Como ejemplos clásicos del uso de genes metilados como marcadores de mal pronóstico podemos mencionar a la proteína quinasa asociada a mortalidad celular (DAPK) y p16INK4a, cuya metilación se ha relacionado con un comportamiento más agresivo del cáncer de pulmón y colon respectivamente. Más recientemente hemos demostrado que la metilación de la histona metil transferasa NSD1 es un hecho frecuente en neuroblastoma y que se metila mas frecuentemente en los tumores con peor pronóstico.
Por último, la metilación del ADN nos puede indicar también como va ser el comportamiento biológico de cada tumor particular. Por ejemplo, un tumor en el que se silencia por metilación el gen de la E-‐cadherina (CDH1) y del inhibidor tisular de metaloproteinasas-‐3 (TIMP-‐3) es más probable que tenga un comportamiento agresivo con tendencia a metastatizar (ver tema 7). O por ejemplo aquellos tumores con inactivación epigenética de la Trombospondina-‐1 pueden tener mayor propensión a crear estructuras neovasculares (ver tema 8).
La metilación del ADN como factor predictivo de la respuesta al tratamiento
Las propiedades anticancerígenas de la mayoría de las terapias contra el cáncer reside en sus
efectos sobre la integridad del ADN, interfiriendo con su síntesis y replicación, provocando en última
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instancia la muerte celular. Así, el tratamiento con agentes alquilantes que inducen aductos en el ADN serán más eficaces en las células cancerígenas, que tienen una elevada tasa de duplicación, que en las células que crecen lentamente o en células diferenciadas. La respuesta a estos tratamientos depende de la expresión de las enzimas reparadoras del ADN, ya que cuando éstas funcionan correctamente, gran parte del daño causado sobre el material genético llega a ser reparado lo que disminuye la eficacia de estos tratamientos. Pero algunas de estas enzimas pierden su expresión por metilación en algunos tipos tumorales, afectando así a la respuesta de estos al tratamiento con agentes alquilantes. Uno de los ejemplos mejor conocidos es la pérdida de expresión por metilación de la O6-‐metilguanina-‐ADN methyltranferase (MGMT) en cáncer humano. La proteína MGMT es directamente responsable de la reparación de la adición de grupos alquilo en los restos de guanina. Esta base es el punto preferido de ataque de varios fármacos quimioterapéuticos alquilantes, como BCNU (1,3-‐bis (2-‐cloroetil)-‐1-‐nitrosourea), ACNU (1 -‐ (4-‐amino-‐2-‐metil-‐ 5-‐pirimidinilo) metil-‐3-‐(2-‐cloroetil)-‐3-‐nitrosourea), Procarbazina, Estreptozotocina o Temozolamida. Así, la idea es que los tumores que han perdido la expresión de MGMT por metilación de su región promotora son más sensibles a la acción de estos agentes quimioterapéuticos, ya que las lesiones que provocan en el ADN no podrán ser reparadas, y provocarán la muerte celular. De hecho, se ha demostrado que los pacientes con gliomas en los que MGMT está metilado presentan una mejor respuesta a la quimioterapia, una supervivencia global mayor y un mayor tiempo hasta la progresión en los pacientes tratados con Carmustina. En otros estudios, el papel de la hipermetilación de MGMT como factor predictivo fue confirmada para el tratamiento con otros dos agentes alquilantes, como Temozolomida y Procarbazina. Sin embargo, es importante señalar que la hipermetilación de MGMT, en pacientes que no han recibido agentes alquilantes, es un factor de mal pronóstico probablemente porque los pacientes que tienen inactivada esta enzima acumulan más mutaciones. En este sentido, se ha visto que en los tumores colorrectales, cerebrales y de pulmón que tienen inactivada esta enzima, la frecuencia de las mutaciones de p53 y K-‐Ras es más elevada que en los tumores que expresan MGMT.
Existen varios trabajos que muestran el papel de la metilación de otras enzimas reparadoras en la respuesta a los diferentes agentes quimioterapéuticos. Uno de estos ejemplos es la relación entre la metilación de hMLH1 y la respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer de colón. En estos tumores, el tratamiento combinado con 5-‐Fluorouracilo (5-‐FU) y Oxaliplatino o Irinotecán se considera una quimioterapia estándar para la enfermedad avanzada. En estos, se ha demostrado que la pérdida de función de hMLH1. Induce resistencia al tratamiento con 5-‐FU en líneas celulares de cáncer colon y tumores primarios. Casos similares a los descritos para MGMT y hMLH1 pueden ser citados por otros genes. Por ejemplo, la respuesta a Doxorrubicina puede estar relacionada con el estado de metilación de GSTP1 y la respuesta a ciertas drogas que dañan el ADN podría ser una función del estado de la metilación de BRCA1.
Por último, la inactivación de genes por metilación puede ser la clave para entender la pérdida de sensibilidad del cáncer de mama a los tratamientos hormonales. Puesto que varios genes que codifican para los receptores de hormonas esteroideas están inactivados por metilación, la ineficacia de los tratamientos con antiestrógenos, como Tamoxifeno en el tratamiento del cáncer de mama, puede ser una consecuencia directa del silenciamiento por metilación de sus respectivos receptores celulares. Un escenario similar se podría sugerir para la falta de respuesta a las terapias endocrinas de los pacientes con cáncer de endometrio, ovario y próstata que presentan pérdida de expresión por metilación de los receptores responsables de la respuesta a este tratamiento.
La metilación del ADN como diana terapéutica
Un aspecto tremendamente interesante del papel de las alteraciones epigenéticas, y en particular de la metilación del ADN en la iniciación y progresión del cáncer es su uso como nuevas dianas terapéuticas. Esto es posible porque a diferencia de lo que ocurre con las alteraciones
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genéticas, que son casi imposibles de revertir, las modificaciones epigenéticas en general y la metilación del ADN en particular son eventos reversibles.
Por tanto, la desmetilación y consiguiente reactivación de genes supresores de tumores podría ser considerada como una posible diana terapéutica en el tratamiento del cáncer, lo que se ha traducido en el desarrollo de inhibidores de la metilación del ADN. De hecho, durante muchos años se han utilizado agentes desmetilantes como la 5-‐azacitidina y 5-‐aza-‐2-‐deoxicitidina en el laboratorio para reactivar genes supresores de tumores in vitro. Estos compuestos son análogos de citosina que se incorporan en el ADN en lugar de la citosina durante la replicación. Una vez incorporado en el ADN, inhiben e inducen la degradación de las ADN metiltranferasas cuando estas se unen al ADN para restablecer el patrón de metilación de las células hijas. Por lo tanto, el tratamiento con estos agentes induce una desmetilación pasiva que aumenta a la vez que lo hacen el número de generaciones. Hasta el momento, no se ha encontrado una desmetilasa de ADN por lo que no se dispone de ningún otro mecanismo para inhibir la metilación del ADN.
Si tenemos en cuenta que sólo los genes supresores de tumores están metilados, el uso de estos inhibidores es una buena noticia para el tratamiento del cáncer, porque la restauración de la expresión de estos genes podría restablecer su efecto protector en la aparición de tumores. Sin embargo, la pérdida de metilación no solo afectará a los genes supresores de tumores sino también al resto del genoma, y la hipometilación global, como hemos visto anteriormente, es otro evento epigenético característico del desarrollo tumoral, ya que puede estar asociada con una mayor inestabilidad cromosómica. Pero dado que el tratamiento con estos compuestos se basa en su incorporación al ADN durante la división celular y que las células tumorales son las que más activamente se dividen dentro del organismo, el tratamiento con estos agentes presentaría cierta especificidad y no debería producir grandes efectos secundarios, como así se ha demostrado en estudios en los que el tratamiento prolongado con estos inhibidores no produce efectos secundarios relevantes.
Hasta el momento se han identificado y sintetizado un gran número de inhibidores de DNMTs de los que Vidaza® (5-‐azacitidina) y Decitabina® (5-‐aza-‐2'deoxicitidina) han sido los primeros que han demostrado su eficacia como agentes capaces de inhibir la proliferación celular y de hecho, ya han sido aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) para el tratamiento de pacientes con síndromes mielodisplásicos y se están obteniendo buenos resultados en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda y la leucemia mieloide crónica. El 5-‐fluoro-‐2´-‐deoxicitidina es otro análogo de la citidina que está siendo probado en ensayos clínicos en combinación con otros agentes como la tetrauridina para el tratamiento de varios tipos de tumores.
Un enfoque alternativo para inhibir la metilación del ADN ha sido el desarrollo de pequeñas moléculas no análogos de nucleósidos como SGI-‐1027, RG108 y MG98, que actúan inhibiendo directamente las DNMTS, bloqueando el centro catalítico o la unión de cofactores necesarios para llevar a cabo su actividad. Sin embargo, estos compuestos tienen un efecto inhibitorio muy débil, lo que hace necesario el desarrollo de nuevos compuestos que aumenten tanto su potencia inhibitoria como su especificidad.
Como veremos más adelante con un poco más de detalle, cuando hablemos del resto de drogas epigenéticas, la metilación del ADN no es un evento epigenético solitario, ya que esta modificación y la desacetilación de las histonas trabajan conjuntamente para regular la expresión génica. Por tanto, la inhibición simultánea de ambos procesos sería una buena estrategia para la reactivación de genes silenciados epigenéticamente, que además permitiría la reducción de las dosis individuales para minimizar los efectos secundarios y optimizar la respuesta terapéutica de estas combinaciones. Estos tratamientos los trataremos con más detalle más adelante cuando hablemos de los inhibidores de las histonas desacetilasas.
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LAS MODIFICACIONES DE LAS HISTONAS EN CÁNCER Como se ha descrito en la introducción, las modificaciones postaduccionales de las histonas
son actores clave en la compleja regulación de la expresión génica. Por ejemplo, los promotores de genes silenciados se caracterizan por la presencia de nucleosomas en los que las histonas presentan pérdida de acetilación de la lisina 9 de la histona H3 junto con la metilación de este mismo residuo. Por el contrario, las marcas características de los genes que se expresan son la acetilación en general y la metilación de la lisina 4 de la histona H3. Por lo tanto, los cambios en estos patrones podrían jugar un papel clave en la desregulación de la expresión génica y por lo tanto en el desarrollo del cáncer (figura 1). Así sabemos que la pérdida de acetilación de la lisina 16 y de la metilación de la lisina 20 de la histona H4 es un evento común en cáncer, que además está asociado con la hipometilación de secuencias repetitivas.
Estos cambios se pueden explicar por alteraciones genéticas y/o la expresión desregulada de genes que codifican enzimas modificadoras de histonas. En el caso de la pérdida de acetilación, esta puede ser debida a la falta de actividad de las HATs o a un aumento de las HDACs. En leucemias promielocíticas, por ejemplo, una característica genética directamente relacionada con el desarrollo de esta patología es la translocación cromosómica que producen las proteínas de fusión que contienen RAR-‐PML y RAR-‐PLZF. Estas proteínas de fusión se unen a elementos de respuesta a ácido retinoico (RARE) y reclutan con alta afinidad complejos represores que contienen HDACs, impidiendo la unión del ácido retinoico, y reprimiendo la expresión de genes que regulan la proliferación y diferenciación de las células del linaje mieloide durante la hematopoiesis.
Aunque no existe un patrón definido para la expresión de las HDACs en cáncer, si hay un gran número de estudios que muestran que la expresión de éstas está alterada en esta patología. Por ejemplo, se ha encontrado un aumento en la expresión de HDAC1 en tumores gástricos, de próstata, colon y mama. También se ha descrito la sobreexpresión de HDAC2 en tumores gástricos y del cuello uterino, y en carcinomas colorrectales con pérdida de expresión de APC. Otros estudios han encontrado elevados niveles de expresión de HDAC3 y HDAC6 en muestras de cáncer de colon y mama, respectivamente.
Estos hallazgos sugieren que la represión transcripcional de genes supresores de tumores mediante la sobreexpresión y el reclutamiento aberrante de las HDACs a su región promotora podría ser un fenómeno común en la aparición y progresión tumoral. Un ejemplo típico es el de p21, que inhibe la progresión del ciclo celular y cuya expresión se pierde en un gran número de tumores. En algunos tumores la falta de expresión de p21 se produce por hipoacetilatión del promotor, y el tratamiento con inhibidores de HDAC conduce a un aumento en la acetilación de las histonas presentes en la región promotora, la expresión del gen y la inhibición del crecimiento celular. Los factores de transcripción que regulan la expresión de la E-‐caderina reclutan HDAC1, HDAC2, Snail y otros complejos represores como mecanismo para inhibir su expresión. La disminución o pérdida de función de la E-‐caderina se ha relacionado con la adquisición de potencial invasivo, por lo que el reclutamiento aberrante de las HDACs a este promotor puede tener un papel crucial en la invasión tumoral y en las metástasis (ver tema 7).
El papel de las HDACs en el cáncer no se limita a su función en la desacetilación de histonas, sino también a su papel en la desacetilación de otras proteínas. Por ejemplo, HDAC1 desacetila el supresor tumoral p53, y dado que la estabilidad y la actividad de esta proteína depende, al menos en parte, de su nivel de acetilación, los cambios en la actividad de las HDACs podría estar modulando el ciclo y la muerte celular mediante la regulación de la actividad de este supresor tumoral (ver tema 6).
En otros casos se producen cambios en la actividad de las HDACs provocada por mutaciones. Recientemente hemos encontrado una mutación de HDAC2 en los tumores de colon, gástricos y de endometrio con inestabilidad de microsatélites que conduce a la pérdida de expresión y actividad de esta proteína. A pesar de que no se conocen con detalle los mecanismos moleculares por los que la pérdida función de HDAC2 podría ser clave en el desarrollo del cáncer, podemos especular que
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podría ser debido a un aumento en la expresión de oncogenes. De hecho, existen otros trabajos que sugieren que las mutaciones o alteraciones que inducen la pérdida de la función de las HDACs de clase I pueden contribuir al desarrollo del cáncer. Por ejemplo, el gen supresor de tumores Rb requiere el reclutamiento de las HDAC de clase I para reprimir la transcripción de genes. Así, la pérdida de la actividad de HDAC de clase I podría inducir la expresión de genes regulados por Rb, suprimiendo de este modo su papel protector en el desarrollo de tumores. En este caso, por tanto, HDAC2 se estaría comportando como un gen supresor en este tipo de tumores, y de hecho, la expresión de HDAC2 en líneas celulares de cáncer que expresan la forma mutante, inhibe el crecimiento de tumores en ratones desnudos.
En los últimos años, la sirtuinas o HDACs de clase III han recibido una atención especial ya que regulan la expresión génica, los procesos de apoptosis, la respuesta a estrés, la reparación del ADN, el ciclo celular, la estabilidad genómica, etc, lo que indica que este grupo de HDACs son importantes reguladores del crecimiento y proliferación celular. En particular, el miembro más prominente de la familia, SIRT1, regula los niveles de acetilación de histonas ,principalmente la lisina 16 y 9 de las histonas H4 y H3 respectivamente, y la acetilación de factores de transcripción tales como p53, la histona acetiltransferasa p300, E2F1, NF-‐ΚB, el reparador del ADN Ku70, y el receptor de andrógenos.
Por lo tanto, la desregulación de estas HDACs también tiene cierta relevancia en el desarrollo del cáncer. Por ejemplo, la expresión de SIRT1 se ha encontrado aumentada en cáncer de pulmón, próstata y en leucemias y disminuida en cáncer de colon. Además, los niveles de acetilación de la lisina 16 de la Histona H4 y la lisina 9 de la histona H3, que son sustratos de SIRT1, se has encontrado alterados en diferentes tipos de tumores. Además, el tratamiento con inhibidores de esta sirtuina induce la rexpresión de genes supresores de tumores junto con un aumento en los niveles de acetilación de la lisina 16 de la Histona H4 y la lisina 9 de la histona H3 en líneas celulares de cáncer de colon y mama. La lisina 16 es también sustrato de SIRT2, pero la alteración de esta HDAC en cáncer no está tan clara.
Sin embargo, también se ha visto que el aumento en la expresión y actividad de SIRT1 puede inducir la desregulación de proteínas con importantes funciones celulares, y estar implicada por tanto en la progresión tumoral. Por ejemplo, el aumento de expresión de SIRT1 en células de cáncer produce la desacetilación e inactivación de p53, y por tanto la inhibición de las funciones reguladas por esta proteína. SIRT1 inhibe la muerte celular inducida por estrés mediante la desacetilación del factor de reparación del ADN Ku70, lo que permite la supervivencia a largo plazo de las células cancerígenas. La interacción de SIRT1 con el factor de transcripción E2F1 disminuye su actividad transcripcional y sus funciones apoptóticas. Por tanto, todos estos indican que SIRT1 podría estar implicada en el desarrollo tumoral mediante varios mecanismos.
En cuanto a la metilación de histonas, las alteraciones observadas en cáncer están provocadas por cambios en la actividad o expresión de las HMTs y HDMS como consecuencia de translocaciones cromosómicas, amplificación, deleción, sobreexpresión o silenciamiento génico. Las proteínas de fusión que se generan por translocación y que son frecuentes en leucemias afectan en muchos casos la proteína MLL, que codifica para HMT que metila la lisina 4 de la histona H3. La expresión de SMYD3, otra HMT específica para la lisina 4, está aumentada en líneas celulares de cáncer de colon y hepatocarcinoma, en las que aumenta el crecimiento celular y promueve la transformación. La HMT de la lisina 27 de H3, EZH2, está sobrexpresada en algunos tumores sólidos como los de próstata, mama, colon, piel y pulmón, pero en esta caso también se han encontrado mutaciones que provocan la pérdida de función en algunos tipos de leucemias. Por último, NSD1 que metila la lisina 36 de H3 y la 20 de H4 presenta pérdida de expresión por metilación en gliomas y neuroblastomas. Por tanto, la desregulación de las enzimas implicadas en la metilación de las histonas también parecen tener cierta importancia en la desregulación de la expresión típica del cáncer, aunque en este la complejidad es algo mayor que en el caso de la acetilación debido a la alta especificidad que presentan las enzimas que regulan cada una de las marcas.
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UTILIZACIÓN DE LA EPIGENÉTICA EN LA TERAPIA ANTICANCERÍGENA Inhibidores de histonas desacetilasas
La gama de proteínas y procesos regulados por las HDACs descritos anteriormente y el papel
que su desregulación juega en el desarrollo el cáncer hace de estas proteínas atractivos candidatos para ser utilizados como dianas terapéuticas en el tratamiento del cáncer. Hasta la fecha, se han identificado una gran variedad de compuestos naturales y sintéticos capaces de inhibir la actividad de las HDACs. En función de su naturaleza química y el mecanismo de inhibición los podemos clasificar como: ácidos grasos de cadena corta, ácidos hidroxámicos, derivados de benzamidas y péptidos cíclicos entre otros (tabla 1). Aunque existen unas pocas excepciones, estos compuestos no presentan especificidad por las diferentes HDACs de clase I y II. Por ejemplo, MS-‐275 es más activo frente a HDAC1 que contra HDAC3. El Depsipéptido inhibe con mayor potencia HDAC1 y HDAC2 que HDAC4 y HDAC6. El conocimiento de la especificidad de los diferentes inhibidores de HDACs debería ser muy útil en el manejo clínico de los pacientes con cáncer, pero primero tenemos que definir el papel de las diferentes HDACs en los diferentes tipos de tumores. Por ejemplo, se sabe que la pérdida de la función de HDAC2 en células de cáncer de colon con inestabilidad de microsatélites induce la resistencia de estas líneas celulares al tratamiento con el ácido hidróxamico TSA. Puesto que esta mutación está presente en aproximadamente el 20% de los tumores primarios con inestabilidad de microsatélites, este hallazgo puede ser de importancia para la selección de los pacientes tratados con inhibidores de HDAC.
INHIBIDORES DE HDACs
Grupo Compuesto Observaciones
Ácidos grasos de cadena corta
Butirato Sódico Fenilacetato Fenilbutirato Valproato
Ácidos hidroxámicos Tricostatina A (TSA) Vorinostat (SAHA) Panobinostat Belinostat
Aprobado por FDA para tratamiento tumores hematológicos Ensayos clínicos tratamiento CML, CTCL y mieloma múltiple Ensayos clínicos tratamiento tumores hematológicos y sólidos
Péptidos cíclicos Romidepsin (FK-‐228) Aprobado por FDA. Ensayos clínicos tratamiento AML, CML y CTCL
Derivados de Benzamida
MS-‐275 MGCD-‐0103
Ensayos clínicos tratamiento tumores hematológicos y sólidos
Tabla 1. Inhibidores de HDACs
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Como se ha mencionado anteriormente, el estado de acetilación de las histonas se asocia con la cromatina activa y la expresión de genes, por lo que cabe esperar que el tratamiento con inhibidores de HDACs produzca un aumento general en el perfil de expresión. Sin embargo, la mayoría de los estudios realizados indican que estos compuestos inducen cambios en la transcripción de un número limitado de genes, y que el número de genes cuya expresión se ve aumentada y disminuida es muy similar, lo que indica que la transcripción está estrechamente regulada por varios mecanismos que implican otras modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas, la metilación del ADN, y el reclutamiento de complejos remodeladores de la cromatina. Muchos de estos genes son reguladores clave de procesos biológicos fundamentales en la progresión tumoral. Por ejemplo, el tratamiento con inhibidores de HDAC induce la expresión de p21CIP. Además, estos compuestos presentan actividades antiangiogénicas por que disminuyen la expresión de genes proangiogénicos, tales como el factor de crecimiento vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor inducible por hipoxia 1α (ver tema 8).
Dado que la acetilación de histonas regula otras funciones distintas de la transcripción, como la reparación del ADN y la replicación, otro efecto de los inhibidores de HDAC es la inhibición de la reparación del ADN, por lo que también pueden sensibilizar a las células cancerígenas a la quimioterapia y la radioterapia mediante el aumento de los efectos sobre el daño del ADN inducido por estos tratamientos.
De igual modo el conocimiento del papel de las sirtuinas en el cáncer ha inspirado el desarrollo de inhibidores de éstas. Además de nicotinamida, que fue el primero que se identificó, en los últimos años han aparecido un gran número de inhibidores entre los que podemos destacar Sirtinol, Esplitomicina, Cambinol y Salermida. Sirtinol inhibe la actividad de SIRT1 y SIRT2 y se ha demostrado que es un potente inhibidor de la proliferación celular y que potencia el efecto anticancerígeno de algunos quimioterápicos clásicos como Camptotecina y Cisplatino. El cambinol también inhibe estas dos sirtuinas y ejerce sus efectos antitumorales mediante la inducción de apoptosis como se ha demostrado en células de linfoma de Burkitt. De igual modo la Salermida también induce apoptosis mediante la reactivación epigenética, es decir el aumento de los niveles de acetilación de la lisina 16 de la histona H4, de genes proapoptóticos.
Como ya se ha comentado al principio de este tema, las modificaciones epigenéticas cooperan entre ellas. Así, la desacetilacion de las histonas colabora con la metilación del ADN en el silenciamiento de genes supresores de tumores. Por esto, el uso de terapias epigenéticas combinadas podría tener muy buenos resultados en el tratamiento de pacientes con cáncer, ya que permitiría el uso combinado de concentraciones más bajas de los dos agentes para mejorar la respuesta minimizando los efectos secundarios. De hecho, en la actualidad se están realizando ensayos clínicos en los que se está probando la eficacia de los tratamientos combinados con inhibidores de HDACs y DNMTs.
Otros estudios han probado la eficacia del tratamiento con inhibidores de HDACs, sirtuinas y DNMTs en combinación con agentes quimioterápicos. Por ejemplo en un ensayo en fase II reciente se probó el tratamiento combinado con 5-‐azacitidina y Romiplostina para el tratamiento de pacientes con síndrome mielodisplásico. En otros casos, el inhibidor de HDACs Romidepsina potenció el efecto antitumoral de Gemcitabina en células de cáncer de próstata que no responden a los tratamientos hormonales, y Sirtinol aumentó la sensibilidad de las células de cáncer de próstata a Camptotecina y Cisplatino. El mecanismo por el que podríamos explicar la eficacia de estas combinaciones es que los inhibidores de HDACs inducen un estado más relajado de la cromatina que la hace más accesible a los quimioterápicos que actúan como agentes intercalantes del ADN. Siguiendo el mismo razonamiento, los inhibidores de HDAcs podrían potenciar el efecto de la radioterapia, que es más efectiva cuanto más accesible es el ADN. En estudios preclínicos se ha demostrado que el tratamiento de tumores de colon inducidos en ratones desnudos con Vorisnostat y radioterapia reduce el tamaño del tumor más de lo que lo hace el tratamiento con cada uno de ellos por separado.
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Para una información más completa sobre los compuestos que están actualmente en ensayos clínicos ver: http://clinicaltrials.gov/ Otros fármacos epigenéticos La metilación del ADN y la acetilación de histonas no son las únicas modificaciones epigenéticas alteradas en cáncer, la metilación de las lisinas también cambia su patrón y, dado que, también es una modificación reversible se está utilizando como diana terapéutica. Sin embargo aquí el panorama es más complejo por dos motivos: primero porque según el residuo que se metile el efecto sobre la expresión es diferente, y en segundo lugar porque existe una alta especificidad en cuanto al residuo que modifican las HMTs y HDMs. Hasta el momento se han descrito inhibidores de HMTs y HDMs pero estos son más recientes y hasta ahora se disponen solo de unos pocos datos de estudios in vitro y preclínicos con resultados preliminares. Reciéntemente se ha publicado un estudio en el que ha demostrado que el tratamiento de líneas celulares de linfoma B difuso que expresan una forma mutante constitutivamente activa de la histona metil transferasa EZH2 con un inhibidor de esta, GSK126, disminuye la metilación de la lisina 27 de la histona H3 e inhibe el crecimiento de este tipo de tumores inducidos en ratones desnudos. Para el caso de los inhibidores de HDMs aún no existen datos a cerca de sus efectos antitumorales.
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CONCLUSIONES La imagen que ha surgido en los últimos años indica que el cáncer no es solo una enfermedad
poligenética sino también una enfermedad poliepigenética, y donde esta última juega un papel decisivo en la regulación de los genes que participan en la regulación del ciclo celular, la apoptosis, la adhesión y la migración. El desarrollo de técnicas de alcance genómico que permite determinar el perfil epigenético específico para cada tipo tumoral junto con el uso de técnicas que permiten detectarlas con una elevada sensibilidad y especificidad utilizando en algunos casos muestras obtenidas con métodos mínimamente invasivos, como es el caso de los fluidos biológicos, ha hecho de estas alteraciones una herramienta valiosa para el diagnóstico, el pronóstico y la medición de la repuesta al tratamiento del cáncer.
Por último, la reversibilidad de las modificaciones epigenéticas hacen de estas una excelente diana terapéutica que permite el diseño de terapias cada vez más personalizadas en función de las características patológicas de cada tumor. Sin embargo, aún queda mucho por aprender sobre el uso de estos compuestos tanto en monoterapia como en combinación con otros agentes antitumorales (dosis, combinaciones, esquema de combinación). Dado que algunos de estas drogas epigenéticas no son igual de eficaces en todos los tumores y que en algunos casos tienen efectos secundarios, los próximos estudios deberán encaminarse al diseño de nuevos agentes dirigidos específicamente contra cada una de las enzimas en vez de dirigirse contra los procesos globales.
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