Tentang Penulis

Cut Muthiadin, S.Si., M.Si, lahir di bottoekabupaten Barru, 10 Nopember 1982. Beliaumendapat gelar sarjana sains (JurusanBiologi) dari Fakultas Matematika danIlmu Pengetahuan Alam (MIPA),Universitas Hasanuddin, Makassar tahun2005, dan gelar Magister sains darikonsentrasi Mikrobiologi Prodi Biomedik,

PascaSarjana Universitas Hasanuddin tahun 2007, dan sekarangsedang melanjutkan studi program Doktor (Prodi IlmuKedokteran), fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin. Saatini beliau menjadi staf pengajar di Program Studi BiologiFakultas Sains dan Teknologi, UIN Alauddin Makassar dalammata kuliah binaan Genetika. Selain mengajar, ia juga sedangmelakukan penelitian dalam tahap penyelesaian disertasi danaktif dalam penelitian-penelitian bersama mahasiswa untuktugas akhir/skripsi sebagai promotor/pembimbing. Beberapabuku yang telah ditulis diantaranya Biologi sel dan Genetika.

Pernyataan Keaslian Tulisan

Yang bertanda tangan di bawah ini :

N a m a : Cut Muthiadin., S.Si., M.Si

N I P : 19821110 200912 2 005

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa tulisan yang saya susunini benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakanpengambilalihan tulisan atau pemikiran orang lain. Apabila dikemudianhari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa sebagian atau keseluruhantulisan ini hasil karya orang lain, saya bersedia menerima sanksi atasperbuatan tersebut.

Makassar, September 2014

Yang Menyatakan

Cut Muthiadin

i

DAFTAR ISI

SAMPUL

KEASLIAN TULISAN i

KATA PENGANTAR ii

DAFTAR ISI iii

1 PENDAHULUAN 1

1.1. Apa itu Teknik Rekayasa Genetik? 1

1.2. Sejarah Perkembangan Teknik Rekayasa Genetik 2

1.3. Intisari Tulisan 6

2 PENGANTAR BIOLOGI MOLEKULER 13

2.1. Arus Informasi Genetik 13

2.2. Struktur dari DNA dan RNA 13

STRUKTUR PRIMER DNA & RNA 17

2.3. Struktur Sekunder DNA (Heliks Ganda) 20

2.4. Fungsi Asam Nukleat 23

2.5. Struktur Protein 23

2.6. Organisasi Gen 26

2.7. Struktur Gen Prokariot 27

2.8. Struktur Organisasi Pada Gen Eukariot 28

2.9. Ekspresi Gen 36

iii

3 ENZIM 39

Enzim Restriksi 40

Enzim Legase 44

4 TEKNIK REKAYASA GENETIK 47

4.1. Isolasi DNA 47

Isolasi DNA Plasmid 48

4.2. PCR 48

Komponen PCR 53

4.3. RT-PCR 53

4.4. Metoda Deteksi Produk Pcr 54

4.5. Sekuensing Dna 56

4.6. Teknik Hibridasi 60

4.7. Analisis RFLP 62

5 VEKTOR KLONING 69

5.1. DNA Sisipan 70

5.2. DNA Vektor 71

5.3. Vektor Ekpresi 77

6 PERPUSTAKAAN GEN 83

PENGERTIAN & MACAM PERPUSTAKAAN GEN 83

7 REKAYASA GENETIK & BIOTEKNLOGI 93

7.1. Penelitian Dasar 93

7.2. Proyek “Human Genom” 94

7.3. Aplikasi Di Bidang Medik 95

7.4. Aplikasi Untuk Lingkungan 99

7.5. Penggunaan Dna Rekombinan Untuk 100

Pertanian

8 TERAPI GEN 104

8.1. Definisi Dan Prinsip Terapi Gen 105

8.2. Jenis Terapi Gen 105

8.3. Hambatan Dalam Terapi Gen 110

8.4. Prasyarat Terapi Gen 111

8.5. Contoh Terapi Gen 112

9 REKAYASA GENETIK DI BIDANG PETERNAKAN 114

Bioteknologi Reproduksi Hewan 115

10 REKAYASA GENETIK DI BIDANG PERTANIAN 127

10.1. Tanaman Transgenik dan Jenisnya 127

10.2. Contoh Tanaman yang telah menggunakan Rekayasa Genetika 127

10.3.Keunggulan Tanaman Rekayasa Genetika 133

11 TINJAUAN REKAYASA GENETIKA DALAM 135

PERSPEKTIF ISLAM

12 ASPEK KEAMANAN DAN REGULASI 138

PRODUK HASIL REKAYASA GENETIKA

12.1. Pendahuluan 138

12.2. Produk Hasil Rekayasa Genetika 140

12.3. Keamanan Produk Hasil Rekayasa 141

Genetika

12.4. Etika & Hasil Regulasi Produk Hasil 144

Rekayasa Genetika

DESKRIPSI SINGKAT

TENTANG PENULIS

DAFTAR PUSTAKA

KATA PENGANTAR

Puji syukur ke hadirat Allah SWT, penulis dapatmenyusun buku ”Pengantar Rekayasa Genetika”. Rekayasa Genetikamerupakan cabang ilmu terapan dari bioteknologi. Bioteknologi mulaiberkembang dengan cepat beberapa tahun terakhir ini. Setiap haribila kita membaca surat kabar, atau menonton televisi, kita seringmendapat informasi beberapa terobosan baru yang merupakan hasillangsung dari bioteknologi.

Teknologi DNA rekombinan yang merupakan dasar darisemua produk berbasis bioteknologi sangat cepat berkembang akhir-akhir ini. Untuk mengerti apa yang ada dibalik suatu produkbioteknologi, maka sangat penting bagi mahasiswa untuk memahamiteknologi DNA rekombinan. Buku ini dimulai dengan ilmu-ilmudasar di balik bioteknologi, yaitu DNA sebagai pembawa informasigenetik. Kemudian dilanjutkan beberapa teknik yang biasa dilakukandalam teknologi DNA rekombinan dan diakhiri dengan aplikasi danproduk-produk bioteknologi.Penulis berharap buku ini dapat membantu mahasiswa untukmemahami prinsip dan metoda-metoda di bidang teknologi DNArekombinan. Penulis menyadari, masih terdapat banyak kekurangandalam buku ini, saran dan kritik akan sangat bermanfaatuntuk memperbaiki buku ini.

Makassar, September 2014Penulis

ii

DESKRIPSI SINGKAT

Sejarah perkembangan genetika sebagai ilmu pengetahuan dimulaimenjelang akhir abad ke 19 ketika seorang biarawan Austria bernamaGregorJohann Mendel berhasil melakukan analisis yang cermat denganinterpretasi yangtepat atas hasil-hasil percobaan persilangannya padatanaman kacang ercis (Pisum sativum). Sebenarnya, Mendel bukanlahorang pertama yang melakukanpercobaan-percobaan persilangan. Akantetapi, berbeda dengan parapendahulunya yang melihat setiap individudengan keseluruhan sifatnya yangkompleks, Mendel mengamati polapewarisan sifat demi sifat sehingga menjadilebih mudah untuk diikuti.Deduksinya mengenai pola pewarisan sifat inikemudian menjadilandasan utama bagi perkembangan genetika sebagai suatucabang ilmupengetahuan, dan Mendelpun di akui sebagai Bapak Genetika.

Selanjutnya, pada awal abad ke-20 ketika biokimia mulaiberkembangsebagai cabang ilmu pengetahuan baru, para ahli genetikatertarik untuk mengetahui lebih dalam tentang hakekat materi genetik,khususnya mengenai sifat biokimianya.Pada tahun 1920-an, dankemudian tahun 1940-an, terungkap bahwasenyawa kimia materigenetika adalah asam dioksiribonekleat (DNA).Denganditemukannyamodel struktur molekul DNA pada tahun1953 oleh J.D.Watson danF.H.C. Crick dimulailah era genetika yang baru, yaitu genetikamolekuler.

Perkembangan penelitian genetika molekuler terjadi demikian pesatnya.Jika ilmu pengetahuan pada umumnya mengalami perkembangan duakali lipat(doubling time) dalam satu dasa warsa, maka hal pada genetikamolekuler hanyalah dua tahun. Bahkan, perkembangan yang lebihrevolusioner dapat disaksikan semenjak tahun 1970-an, yaitu pada saatdikenalnya teknolog imanipulasi molekul DNA atau teknologi DNArekombinan atau dengan istilah yang lebih populer disebut RekayasaGenetika.

Rekayasa genetika dalam arti paling luas adalah penerapan genetikauntuk kepentingan manusia. Dengan pengertian ini kegiatan pemuliaanhewan atau tanaman melalui seleksi dalam populasi dapat dimasukkan.Demikian pula penerapan mutasi buatan tanpa target dapat puladimasukkan. Masyarakat ilmiah sekarang lebih bersepakat denganbatasan yang lebih sempit, yaitu penerapan teknik-teknik genetikamolekuler untuk mengubah susunan genetik dalam kromosom ataumengubah sistem ekspresi genetik yang diarahkan pada kemanfaatantertentu. Perubahan sifat biologis melalui rekayasa genetika tersebutmenyebabkan “lahirnya organisme baru” produk bioteknologi dengansifat-sifat yang menguntungkan bagi manusia.

Dalam buku ini, saya telah mengorganisir bab-bab selanjutnya menjaditiga bagian . Bagian I ( Dasar rekayasa genetika ; Bab 1-3 ) berkaitandengan dasar teknologi -tehnik . Bab1 (Pengantar biologi molekuler )dan Bab 2 ( Bekerja dengan asam nukleat ) memberikan informasi latarbelakang tentang DNA dan teknik digunakan ketika bekerja dengan itu. Bab 3 ( alat-alat ) melihat kisaran enzim yang dibutuhkan untukmanipulasi gen . Bagian II (Metodologi manipulasi gen ; Bab 4-7 )menguraikan tehnik dan strategi yang diperlukan untuk mengkloningdan mengidentifikasi gen . Bab 4 ( sel host dan vektor ) dan Bab 5(strategi Kloning ) menggambarkan berbagai sistem dan protokol yangdapat digunakan untuk mengkloning DNA . Bab 6 membahasPolymerase chain reaction , yang telah merevolusi banyak bidangmolekul biologi . Bab 7 ( Seleksi , screening dan analisis rekombinan )menjelaskan bagaimana sekuens DNA tertentu dapat dipilih darikoleksi kloning fragment. Dalam Bagian III ( Rekayasa genetika dalamtindakan, Bab 8-13 ) aplikasi manipulasi gen dan teknologi yang terkaityang dibahas. topik yang dibahas yaitu Memahami gen dan genom (Bab 8 ) , Rekayasa genetika dan bioteknologi ( Bab 9 ) , aplikasikedokteran dan forensik ( Bab 10 ) , dan transgenik tumbuhan danhewan ( Bab 11 ) . Kloning organisme dibahas dalam Bab 12 (jenis laindari kloning ) , dan pertimbangan moral dan etis dari ahli rekayasagenetik dalam Bab 13 ( Bioetika Kloning ) .

1

1Pendahuluan

1.1 Apa itu Teknik Rekayasa genetik?

Kemajuan dalam disiplin ilmu apapun bergantung padatersedianya teknik dan metode yang yang memperluas jangkauan dankesempurnaan dari percobaan yang akan dilaksanakan. Lebih dari 30tahun terakhir telah ditunjukkan dengan jalan yang spektakuler olehkemunculan teknik rekayasa genetik. Bidang ini berkembang dengancepat ke segala bidang, di beberapa laboratorium di seluruh dunia,sekarang ini rutin praktek mengisolasikan fragmen DNA spesifik darigenom satu organisme, menentukan urutan basanya,dan menilaifungsinya.Teknologi ini juga sekarang terpakai pada beberapa aplikasi lain,meliputi analisa forensik dari dari sampel tindakan kriminal, sengketagaris keturunan, hasil diagnosa medis, pemetaan genom dansekuensing,dan industri bioteknologi..Bentuk teknik rekayasa genetik sering dipikir agak dan bahkan remeh,namun ini mungkin label yang kebanyakan orang-orang akan akui.Akan tetapi,ada beberapa bentuk lain yang biasa dipakai untukmendeskripsikan teknologi tersebut,meliputi manipulasi gen, kloninggen, teknologi recombinasi DNA, dan modifikasi genetik.Meskipun ada banyak macam-macam dan jenis teknik yang telibat,akan tetapi prinsip dasar dari manipulasi genetik sebenarnya agakmudah.

2

Gambar 1.1. Empat langkah dalam eksperimen kloning gen.

Dasar pada teknologi tersebut berdasarkan informasi genetiknya,dikode oleh DNA, dan diatur dalam bentuk gen, merupakan satusumber yang bias dimanipulasi dalam berbagai cara untuk mendapatkantujuan yang jelas untuk kedua ilmu terapan dan murni sertakedokteran.Ada beberapa bidang dimana manipulasi genetik adalahberharga, termasuk diantaranya:

• Riset dasar pada struktur gen dan fungsi• Produksi protein berguna dengan cara terbaru• Menghasilkan tanaman dan hewan transgenik• Diagnosa medis dan pengobatan.

1.2 Sejarah Perkembangan Teknik Rekayasa Genetika

Pada awalnya, proses rekayasa genetika ditemukan oleh Crickdan Watson pada tahun 1953. Rekayasa genetika merupakan suaturangkaian metode yang canggih dalam perincian akan tetapi sederhanadalam hal prinsip yang memungkinkan untuk dilakukan pengambilangen atau sekelompok gen dari sebuah sel dan mencangkokkan gen atausekelompok gen tersebut pada sel lain dimana gen atau sekelompokgen tersebut mengikat diri mereka dengan gen atau sekelompok genyang sudah ada dan bersama-sama menaggung reaksi biokimiapenerima.

Modifikasi genetika adalah suatu perubahan yang terjadi padaDNA dengan cara transfer gen di antara dan di dalam benda hiduplainnya yang berbeda. Secara tradisional, modifikasi/ rekayasa genetikasebenarnya telah dilakukan oleh para petani melalui proses penyilangandan perbaikan tanaman. Misalnya melalui tahap penyilangan dan seleksitanaman dengan tujuan tanaman tersebut menjadi lebih besar, kuat,dan lebih tahan terhadap penyakit. Selama puluhan bahkan ratusantahun yang lalu, para petani dan para pemulia tanaman telah berhasilmemuliakan tanaman padi, jagung, dan tebu, sehingga tanaman-tanaman tersebut mempunyai daya hasil tinggi dan memiliki kualitaspanen yang lebih baik.

3

Proses pemindahan gen pada pemuliaan tradisional dilakukanmelalui proses penyerbukan dengan perantaraan angin maupunbantuan serangga penyerbuk. Proses penyerbukan ini sering kalimelibatkan bantuan manusia, misalnya melalui penyerbukan dengancara memindahkan serbuk sari tanaman yang satu ke ujung putiktanaman lainnya. Prinsip rekayasa genetika sama dengan pemuliaantanaman, yaitu memperbaiki sifat-sifat tanaman dengan menambahkansifat-sifat ketahanan terhadap cekaman mahluk hidup pengganggumaupun cekaman lingkungan yang kurang menguntungkan sertamemperbaiki kualitas nutrisi makanan. Rekayasa genetika adalahkelanjutan dari pemuliaan secara tradisional. Dalam arti paling luasmerupakan penerapan genetika untuk kepentingan manusia akan tetapimasyarakat ilmiah sekarang lebih bersepakat dengan batasan yang lebihsempit, yaitu penerapan teknik-teknik genetika molekuler untukmengubah susunan genetik dalam kromosom atau mengubah sistemekspresi genetik yang diarahkan pada kemanfaatan tertentu.

Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golonganorganisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewantingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan. Bidang kedokteran danfarmasi paling banyak berinvestasi di bidang yang relatif baru ini.Sementara itu bidang lain, seperti ilmu pangan, kedokteran hewan,pertanian (termasuk peternakan dan perikanan), serta teknik lingkunganjuga telah melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing. Tidak seperti halnya pemuliaan tanaman secara tradisional yangmenggabungkan seluruh komponen materi genetika dari dua tanamanyang disilangkan, rekayasa genetika memungkinkan pemindahan satuatau beberapa gen yang dikehendaki dari satu tanaman ke tanaman lain.

Keunggulan rekayasa genetika adalah mampu memindahkanmateri genetika dari sumber yang sangat beragam dengan ketepatantinggi dan terkontrol dalam waktu yang lebih singkat. Melalui prosesrekayasa genetika ini, telah berhasil dikembangkan tanaman yang tahanterhadap organisme pengganggu seperti serangga, penyakit dan gulmayang sangat merugikan tanaman. Rekayasa genetika bermain padatingkat molekuler khususnya DNA.

4

Gambar 1.2 Sejarah Genetika sejak 1900. Daerah yang diarsirmenunjukkan masa periode dari perkembangan utama di setiap cabangsubjek.

Di akhir tahun 1960 di situ adalah masa frustrasi di antara ahlisains yang bekerja di bidang biologi molekular. Penelitian telahberkembang ke titik dimana kemajuan dirintangi oleh batasan teknis.Bagaimanapun,sejumlah perkembangan memberikan stimulus yangperlu untuk manipulasi gen menjadi nyata. Di tahun 1967 enzim DNALigase diisolasikan. Enzim ini dapat menggabung dua untai bersama.Kemudian dilanjutkan dengan isolasi oleh enzim restriksi pertama ditahun 1970. Enzim restriksi merupakan gunting molekuler yang sangatpenting, yang memotong DNA pada urutan yang tepat. Lalu, padatahun 1970,alat dasar yang diperlukan untuk membuat DNArekombinan ditemukan. Molekul DNA rekombinan pertama dilakukandi universitas Stanford tahun 1972, menggunakan alur pembelahan darienzim restriksi dan kemampuan dari DNA ligase menggabung duauntai DNA bersama. Cara ini kemudian dikembangkan di tahun 1973dengan menggabung fragmen DNA ke plasmid pSC101, dimanamerupakan elemen ekstrakromosomal yang diisolasi dari bakteri

5

Escherichia coli. Molekul rekombinan ini bertindak sebagai replicon(mereka dapat bereplikasi ketika dikenalkan kedalam sel E.coli).Sehingga dengan membuat molekul rekombinan in vitro, danmenempatkannya ke dalam sel bakteri dimana kemudian bereplikasisecara in vivo, ketika ditumbuhkan dalam cawan agar. Hal ini kemudiandikenal sebagai kloning gen (Gbr 1.3). Penemuan pada tahun 1972dan 1973 memicu kemungkinan terjadinya revolusi ilmiah terbesar padasemua ke- genetika baru. Akan tetapi perkembangan OrganimeModifikasi Genetika (OMG), khususnya tanaman pertanian, telahmembuka kembali perdebatan tentang keamanan organisme tersebutdan konsekuensi dari pelepasan OMG ke lingkungan.

Gambar 1.3 Kloning Fragmen DNA (Desmond)

6

1.3 Intisari tulisan

Dalam buku ini, saya telah mengorganisir bab-bab selanjutnyamenjadi tiga bagian . Bagian I ( Dasar rekayasa genetika ; Bab 1-3 )berkaitan dengan dasar teknologi -tehnik . Bab1 (Pengantar biologimolekuler ) dan Bab 2 ( Bekerja dengan asam nukleat ) memberikaninformasi latar belakang tentang DNA dan teknik digunakan ketikabekerja dengan itu . Bab 3 ( alat-alat ) melihat kisaran enzim yangdibutuhkan untuk manipulasi gen . Bagian II (Metodologi manipulasigen ; Bab 4-7 ) menguraikan tehnik dan strategi yang diperlukan untukmengkloning dan mengidentifikasi gen . Bab 4 ( sel host dan vektor )dan Bab 5 (strategi Kloning ) menggambarkan berbagai sistem danprotokol yang dapat digunakan untuk mengkloning DNA . Bab 6membahas Polymerase chain reaction , yang telah merevolusi banyakbidang molekul biologi . Bab 7 ( Seleksi , screening dan analisisrekombinan ) menjelaskan bagaimana sekuens DNA tertentu dapatdipilih dari koleksi kloning fragment. Dalam Bagian III ( Rekayasagenetika dalam tindakan, Bab 8-13 ) aplikasi manipulasi gen danteknologi yang terkait yang dibahas. topik yang dibahas yaituMemahami gen dan genom ( Bab 8 ) , Rekayasa genetika danbioteknologi ( Bab 9 ) , aplikasi kedokteran dan forensik ( Bab 10 ) ,dan transgenik tumbuhan dan hewan ( Bab 11 ) . Kloning organismedibahas dalam Bab 12 (jenis lain dari kloning ) , dan pertimbanganmoral dan etis dari ahli rekayasa genetik dalam Bab 13 ( BioetikaKloning ) .

13

2Pengantar Biologi Molekuler

2.1 Arus Informasi Genetik

Sudah menjadi fakta yang luar biasa bahwa karakteristik suatuorganisme disandi oleh empat-huruf alphabet, menjadi bahasa yangterdiri dari kata- tiga huruf. Huruf alphabet tersebut adalah basaAdenine (A), Guanine (G), Cytosine (C), dan Thymine (T), dengankombinasi triplet dari ketiga basa ini menjadikan suatu”KAMUS” yangbiasa disebut kode genetik.

Tabel 2.1. Kode genetik

Basa I

(5’)

Basa II Basa III(3’)

U C A G

U

U

Phe Ser Tyr Cys

Phe Ser Tyr Cys C

Leu Ser Stop Stop A

Leu Ser Stop Trp G

C

Leu Pro His Arg U

Leu Pro His Arg C

14

Leu Pro Gln Arg A

Leu Pro Gln Arg G

A

Ile Thr Asn Ser U

Ile Thr Asn Ser C

Ile Thr Lys Arg A

Met Thr Lys Arg G

G

Val Ala Asp Gly U

Val Ala Asp Gly C

Val Ala Glu Gly A

Val Ala Glu Gly G

Keterangan :

phe =fenilalanin

ser = serin his =histidin

glu = asamglutamate

leu = leusin pro = prolin gln =glutamin

cys = sistein

ile =isoleusin

thr = treonin asn =asparagin

trp = triptofan

met =metionin

ala = alanin lys = lisin arg = arginin

15

val = valin tyr = tirosin asp = asamaspartat

gly = glisin

AUG (kodon metionin) dapat menjadi kodon awal (start codon)

stop = kodon stop (stop codon)

Sifat-sifat kode genetik

Kode genetik mempunyai sifat-sifat yang akan dijelaskan sebagaiberikut.

1. Kode genetik bersifat universal. Artinya, kode genetik berlakusama hampir di setiap spesies organisme.

2. Kode genetik bersifat degenerate atau redundant, yaitu bahwasatu macam asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu tripletkodon. Sebagai contoh, treonin dapat disandi oleh ACU, ACC,ACA, dan ACG. Sifat ini erat kaitannya dengan sifat wobble basaketiga, yang artinya bahwa basa ketiga dapat berubah-ubah tanpaselalu disertai perubahan macam asam amino yang disandinya.Diketahuinya sifat wobble bermula dari penemuan basa inosin (I)sebagai basa pertama pada antikodon tRNAala ragi, yang ternyatadapat berpasangan dengan basa A, U, atau pun C. Dengandemikian, satu antikodon pada tRNA dapat mengenali lebih darisatu macam kodon pada mRNA.

3. Oleh karena tiap kodon terdiri atas tiga buah basa, maka tiapurutan basa mRNA, atau berarti juga DNA, mempunyai tigarangka baca yang berbeda (open reading frame). Di sampingitu, di dalam suatu segmen tertentu pada DNA dapat terjaditranskripsi dan translasi urutan basa dengan panjang yang berbeda.Dengan perkataan lain, suatu segmen DNA dapat terdiri atas lebihdari sebuah gen yang saling tumpang tindih (overlapping).Sebagai contoh, bakteriofag фX174 mempunyai sebuah untaitunggal DNA yang panjangnya lebih kurang hanya 5000 basa.Seandainya dari urutan basa ini hanya digunakan sebuah rangkabaca, maka akan terdapat sekitar 1700 asam amino yang dapatdisintesis. Kemudian, jika sebuah molekul protein rata-ratatersusun dari 400 asam amino, maka dari sekitar 1700 asam aminotersebut hanya akan terbentuk 4 hingga 5 buah molekul protein.Padahal kenyataannya, bakteriofag фX174 mempunyai 11 protein

16

yang secara keseluruhan terdiri atas 2300 asam amino. Dengandemikian, jelaslah bahwa dari urutan basa DNA yang ada tidakhanya digunakan sebuah rangka baca, dan urutan basa yangdiekspresikan (gen) dapat tumpang tindih satu sama lain.

Informasi genetik mengkode DNA menjadi RNA , disebut transkripsi(TC), selanjutnya RNA diterjemahkan menjadi protein disebuttranslasi (TL). Konsep alur informasi ini dikenal sebagai DogmaCentral dari biologi molecular. ,dan merupakan satu tema dasar padasemua pembahasan pada ekspresi gen.

Gambar. 2.1. Dogma Central Biologi Molekulari

Perubahan urutan basa di dalam molekul DNA menjadi urutanbasa molekul RNA dinamakan transkripsi, sedangkan penerjemahanurutan basa RNA menjadi urutan asam amino suatu protein dinamakantranslasi. Jadi, proses tanskripsi dan translasi dapat dilihat sebagaitahap-tahap ekspresi urutan basa DNA. Namun, tidak semua urutanbasa DNA akan diekspresikan menjadi urutan asam amino. Urutanbasa DNA yang pada akhirnya menyandi urutan asam amino disebutsebagai gen. Dengan demikian, secara kimia gen adalah urutan basanitrogen tertentu pada molekul DNA yang dapat dieskpresikan melaluitahap-tahap transkripsi dan translasi menjadi urutan asam aminotertentu.

17

2.2 Struktur dari DNA dan RNA

DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida)yang tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Komponenpenyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat (Gambar 2.1). Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, urasil= U) (Gambar 2.2). Monomer nukleotida mempunyai gugushidroksil pada posisi karbon 3’, gugus fosfat pada posisi karbon 5’dan basa pada posisi karbon 1’ molekul gula. Nukleotida satudengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antaragugus 5’fosfat dengan gugus 3’hidroksil.

Gambar 2.2. Struktur Nukleotida

Struktur DNA mirip dengan struktur RNA. Perbedaan diantarakeduanya terdapat pada jenis gula dan basa pada monomernyaserta jumlah untai penyusunnya. Pada DNA, tidak terdapatgugus hidroksil pada posisi karbon 2’ dari molekulgula (2- deoksiribosa) sementara pada RNA molekul gulanyaadalah ribosa. Basa nitrogen yang terdapat pada DNA adalahadenin, guanin, sitosin dan timin, sedangkan pada RNA jenisbasanya adalah adenin, sitosin, guanin dan urasil. RNA merupakanpolinukleotida yang membentuk satu rantai/unta. SedangkanDNA merupakan polinukleotida yang membentuk 2 untai (heliksganda).

18

Gambar 2.3. Struktur Purin dan Pyrimidin (Adenin dan Guanin;Cytosin, Tymin dan Urasil

STRUKTUR PRIMER DNA DAN RNA

Asam nukleat merupakan polimer dari ratusan, ribuan,bahkan jutaan nukleotida yang bergabung satu sama lainnya melaluiikatan fosfodiester. Ikatan fosfodiester terbentuk antara gugus OHpada posisi 3’ dengan gugus fosfat pada posisi 5’. Sehingga tulangpunggung molekul DNA dan RNA terdiri dari gugus fosfat danpentosa secara bergantian (Gambar 2.4).

19

Gambar 2. 4. Struktur primer DNA dan RNA

20

2.3. STRUKTUR SEKUNDER DNA (HELIKSGANDA)Struktur sekunder DNA pertama kali ditemukan oleh Watson danCrick pada tahun 1953, dengan menggunakan teknik difraksi sinarX. Struktur molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yangmemutar ke kanan (Gambar 2.4). Kedua rantai polinukleotidamemutar pada sumbu yang sama dan bergabung satu denganyang lainnya melalui ikatan hidrogen antara basa-basanya. Basaguanin berpasangan dengan basa cytosin, sedangkan basa adeninberpasangan dengan basa tymin. Antara basa guanin dan basacytosin terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedang antara basa adenindan tymin terbentuk dua ikatan hidrogen. Sehingga dalam molekulDNA jumlah basa G akan selalu sama dengan jumlah basa C,sedangkan jumlah basa A=T. Kemudian jumlah basa purin (A + G)akan sama dengan jumlah basa pyrimidin (C + T). Kedua untaiDNA saling berkomplementasi melalui basa penyusunnya denganarah antiparalel (berlawanan 5’→3’ vs 3’→5’), ujung yangmengandung gugus fosfat bebas disebut ujung 5’ sedangkan padaujung lainnya yang mengandung gugus hidroksil bebas disebutujung 3’. Kedua untai tersebut saling melilit satu sama lainmembentuk struktur heliks ganda. Gugus fosfat dan gula yangtersusun bergantian menjadi tulang punggung (backbone) molekulDNA sementara pada bagian dalam terdapat basa yang melekatpada molekul gula.

21

Gambar 2.5. Struktur double heliks DNA

Untuk memudahkan pembacaan dan penulisannya, urutanDNA hanya dituliskan nama-nama basanya dengan menuliskantanda 5’ dan 3’ pada ujung-ujungnya. Contoh :

5’-GATCGGTAACTG-3’

3’-CTAGCCATTGAC-5’Contoh diatas, merupakan oligonukleotida dengan ukuran 12pasang basa (=pb). Rantai pertama komplemen dengan rantaikedua. Untuk memudahkan, DNA untai ganda biasanya hanyadituliskan satu untai saja dengan menuliskan tanda 5’ dan 3’pada ujung-ujungnya.

Rantai RNA berbentuk untai tunggal sehingga tidakmembentuk struktur heliks yang teratur seperti DNA. Walaupundemikian RNA mungkin bisa membentuk struktur sekunder dantersier karena pasangan basa bisa terbentuk pada daerah yang

22

membentuk loops. Terdapat tiga tipe molekul RNA dalam sel, yaitumRNA, tRNA dan rRNA. Molekul mRNA mengandung urutannukleotida yang akan mengode urutan asam amino dari proteinpada proses translasi. mRNA eukariot terdiri dari urutan leaderpada ujung5’, daerah pengode, dan ekor poli A pada ujung 3’.

rRNA dan tRNA merupakan perangkat untuk sintesaprotein, tapi tidak mengode protein. Struktur rRNA mengandungbanyak loops, dan terdapat pasangan basa diantara loops,sedangkan struktur tRNA berbentuk seperti daun (cloverleaf). rRNAmemiliki pasangan basa internal yang membentuk kompleks denganprotein membentuk partikel ribonukleoprotein yang disebutribosom.

Gambar 2.6. Perbedaan DNA dan RNA

23

2.4. FUNGSI ASAM NUKLEAT

Asam nukleat DNA berperan penting dalam menjagakelestarian spesies dari generasi ke generasi. DNA melalui urutanbasanya membawa kode informasi genetik yang spesifik untuk setiapindividu dan untuk spesies tertentu. Informasi genetik pada DNAakan ditranskripsi menjadi RNA dan selanjutnya RNA akanditranslasikan menjadi protein. Tidak semua informasi genetiktersimpan dalam bentuk DNA, pada virus tertentu seperti retrovirusmateri genetik tersimpan dalam bentuk RNA.

2.5. STRUKTUR PROTEIN

Protein adalah polimer lurus yang tersusun dari asam aminoyang dihubungkan dengan ikatan peptida. Struktur dasar asam aminoterdiri dari atom karbon Cα sebagai pusatnya yang terikat dengangugus amino (atau imino pada prolin), gugus karrboksil,atom hidrogen, dan rantai samping yang disebut gugus R. GugusR ini membedakan sifat antara asam amino yang satu dengan asamamino yang lain.

Rantai samping

Gugus Amino Gugus Karboksil

Gambar 2.7. Struktur asam amino

24

Berdasarkan muatan listrik totalnya pada kondisi fisiologi,asam amino diklasifikasikan menjadi (1) asam amino netral (tidakbermuatan), (2) asam amino asam (bermuatan positif), dan (3) asamamino basa (bermuatan negatif). Asam amino netral dapatdigolongkan menjadi asam amino nonpolar dan hidrofob (Ala, Val,Ile, Leu, Trp, Pro, Met, Phe, Cys, Tyr); dan yang lainnya adalah polardan hidrofil ( Ser, Thr, Gln, Asn). Di antara asam amino yang polardan hidrofil, dua bersifat asam (bermuatan negatif) yaitu asam aspartatdan asam glutamat dan tiga bersifat basa (bermuatan positif) yaitulisin, arginin dan histidin. Gugus R pada asam amino glisin adalahatom hidrogen yang tidak memberikan sifat hidrofob ataupun hidrofilpada asam amino berukuran paling kecil ini. Dua asam aminomengandung sulfur yaitu sistein dan metionin. Hanya sistein yangmembentuk ikatan disulfida. Penulisan asam amino dapatmenggunakan simbol satu huruf (A untuk alanin, W untuktriptofan)atautigahuruf(ala untuk his.

Struktur linier asam amino yang dihubungkan melalui ikatan peptidadisebut polipeptida. Ikatan peptida terjadi antara gugus amino (NH2)dari satu asam amino dengan gugus karboksil (COOH) asam aminoyang berdekatan. Reaksi ini disebut reaksi kondensasi yangmelepaskan molekul air. Polipeptida yang terdiri dari kurang dari 30asam amino disebut oligopeptida atau peptida saja. Panjang polipeptidapada sel hidup sangat beragam, umumnya berukuran 40-1000 asamamino. Satu molekul protein dapat terdiri atas dua atau lebih rantaipolipeptida identik (homopolimer), atau rantai berbeda(heteropolimer). Setiap rantai polipeptida mempunyai polaritas, gugusamino berada pada ujung N dan gugus karboksil terdapat pada ujungC.

Protein yang ada di alam tidak hanya berbentuk rantai linierlurus. Adanya interaksi antar asam amino penyusunnya melaluiikatan kovalen dan menyebabkan terbentuknya struktur sekunder,tersier dan kuarterner pada protein. Struktur primer suatuprotein terdiri atas urutan linier asam amino. Struktur sekunderprotein dapat berupa heliks-α dan β–pleated sheet. Struktur tersierprotein tejadi oleh adanya ikatan nonkovalen lemah (ikatan hidrogen,

25

dan ikatan ion, ikatan hidrofob) dan ikatan kovalen yang lebih kuat(ikatan disulfida) pada rantai polipeptida membentuk konformasitertentu yang menstabilkan struktur protein. Struktur kuartenerdibentuk bila dua atau lebih rantai polipeptida berasosiasi secaraspontan. Protein hanya berfungsi pada kondisi alaminya yang biasanyamembentuk konformasi tertentu baik dalam bentuk struktur tersiermaupun kuartener.

Gambar 2.8. Tingkatan struktur protein

26

Struktur primer protein ditentukan oleh gen pengkodenya.Jika terjadi mutasi (perubahan) pada gen normal, protein yangterbentuk dari hasil mutasi dapat mempunyai urutan asam aminoberbeda. Perubahan satu asam amino dapat mengubah ataumenghilangkan fungsi protein.

Bakteri pada umumnya mampu membentuk semua asamamino, tetapi hewan (termasuk manusia) hanya dapat membentukjenis asam amino tertentu. Manusia misalnya tidak mampumensintesis delapan dari dua puluh asam amino. Kedelapanasam amino tersebut disebut asam amino esensial yang terdiri darivalin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, threonin, fenilalanin, dantriptofan. Tirosin dapat disintesis dari asam amino esensialfenilalanin, oleh karena itu tirosin juga dianggap sebagai asamamino esensial.

2.6. Organisasi gen

Setiap sel dari organisme multiselular, mengandung materigenetik yang sama. Molekul DNA merupakan makromulekul yangpaling panjang dalam sel dan terbungkus dalam kromosom. Bakteridan virus pada umumya memiliki satu kromosom, sementara seleukaryot memiliki banyak kromosom. Didalam satu kromosomterdapat ribuan gen. Kumpulan semua gen yang terdapat dalamkromosom, dan termasuk daerah antar gen disebut genom.

Gen merupakan segmen DNA yang mengkode polipeptidaatau RNA. Dimana polipeptida atau RNA tersebut mempunyaifungsi struktural atau katalitik. Disamping gen, DNA jugamempunyai segmen yang berfungsi sebagai pengatur yangdisebut urutan regulator. Urutan ini menyediakan sinyal-sinyal padaawal atau akhir gen, yang berfungsi untuk memulai atau mengakhiritranskripsi serta sebagai titik awal dimulainya proses replikasi DNA.

27

Gambar 2.9 Gen merupakan segmen DNA yang mengkodeprotein/ polipeptida.

Ukuran gen bisa kita perkirakan dari jumlah asam aminopada protein/ polipeptida. Satu asam amino dikode oleh tiganukleotida. Bila ukuran rantai polipeptida mengandung 50 asamamino-ribuan asam amino, maka ukuran gen yang mengkodepelipeptida ini kita kalikan 3 pasang basa. Sehingga polipeptidayang mengandung 350 asam amino dikode oleh 1.050 pb. Genpada eukariot pada umumnya di interupsi oleh urutan DNA yangtidak mengkode, sehingga biasanya ukuran gennya lebih panjangdaripada perhitungan di atas.

Berapa jumlah gen yang terdapat dalamsatu kromosom? Kromosom Escherichia

coli, yang merupakan salah satu genom prokariot yang telahditentukan urutannya, mengandung molekul DNA sirkular denganukuran 4.638.858 pasang basa. Dan mengkode 4.300 gen pengkodeprotein dan 115 gen pengkode mulekol RNA stabil. Manusia

28

mempunyai 24 kromosom yang berbeda. genom manusiakira kira mengandung DNA dengan ukuran 3 milyar pasangbasa yang mengkode 50.000 –100.000 gen.

2.7. Struktur Gen ProkariotBakteri hanya memiliki satu kromosom yang mengandung

hanya satu copy masing-masing gen, kecuali beberapa gen yangmengkode rRNA. Hampir semua DNA prokariot mengkode gendan regulator. Dan setiap gen ko-linear dengan urutan asam aminoyang dikodenya.

Gambar 2.10 Kromosom E. coli

Secara struktur maupun fungsi, organisasi gen dalam DNAeukariot jauh lebih kompleks dibandingkan prokariot. Sekitar 10%DNA tikus terdiri dari urutan pendek (kurang dari 10 pb) yangberulang jutaan kali per sel. Urutan ini disebut urutan highly repetitiveatau urutan DNA sederhana. Selain itu juga ditemukan urutansekitar 100 pasang basa yang berulang sekitar 1000x pada 20%DNA tikus. Bagian DNA ini dikenal dengan istilah moderatelyrepetitive. Sisanya 70% DNA tikus mengandung urutan yang unikyang terdapat pada kromosom eukariot, termasuk sejumlah gen.

29

Urutan DNA sederhana disebut juga ’DNA satelit’, karenadapat berpindah- pindah tempat. Urutan ini tidak mengkodeprotein maupun RNA, namun berhubungan dengan strukturcentromer dan telomer pada kromosom eukariot. Centromermerupakan bagian dari kromosom yang berfungsi sebagai tempatpengikatan protein selama pembelahan sel. Telomer merupakanurutan pada ujung kromosom eukariot yang membantumenstabilkan kromosom.

(a)

(b)

30

(c)

Gambar 2.11. (a) Kromosom eukariot. (b) Posisi centromer dantelomer pada kromosm eukariot. (c) DNA pada kromosom eukariot.

Yuwono (2008) menyebutkan bahwa pada umumnya, gen yangmengkode protein pada prokariot adalah gen dengan kopi tunggal(single copy), sedangkan gen yang mengkode tRNA dan rRNA berupagen dengan jumlah kopi banyak (multiple copies). Organisasi gen dalamorganisme prokariot disebut operon. Suatu operon adalah organisasibeberapa gen struktural yang ekspresinya dikendalikan oleh satupromoter yang sama.

Contoh dari operon adalah lac operon, operon yangmengendalikan kemampuan metabolisme pada E. coli. Terdapat 3macam gen dalam lac operon, yaitu gen Z (mengkode β-galaktosidase),gen Y (mengkode permease), dan gen A (mengkode trans-asetilase).

31

Masing-masing gen struktural memiliki kodon inisiasi awal dan kodonterminasi, tetapi ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yangsama. Pada saat transkripsi, terbentuk 1 RNAd yang membawa kodonuntuk 3 macam polipeptida yang berbeda (polisistronik). Masing-masing polipeptida akan ditranslasi secara independen dari satu untaianRNAd yang sama (Yuwono, 2008).

Gambar 2.12 Operon lac

Proses transkripsi terdiri dari tahap inisiasi, elongasi(polimerisasi) dan terminasi. Transkripsi dikatalisis oleh suatuenzim yang dikenal sebagai RNA polimerase. RNA polimerase padabakteri terdiri atas enam subunit, yaitu dua subunit α,dua subunit β, satu subunit ω, dan satu subunit σ. RNApolimerase bersama-sama dengan subunit σ (disebut holoenzim)akan berjalan sepanjang molekul DNA untuk menemukan lokasiawal transkripsi. Fungsi subunit σ adalah membantu RNApolimerase untuk mengenali suatu urutan tertentu pada molekulDNA yang menandai tempat awal transkripsi (awal suatu gen)yang dikenal sebagai promotor. Pada tahap inisiasi, RNApolimerase bersama-sama subunit σ mengikat daerah promotordengan kuat dan memisahkan untai ganda DNA agar inisiasitranskripsi dapat terjadi. Kemudian dilanjutkan dengan tahapelongasi, dimana rantai RNA disintesis, subunit σ terlepas dariRNA polimerase (RNA polimerase tanpa subunit σ disebut coreenzyme) dan transkripsi berlangsung terus sampai mencapai suatudaerah pada akhir gen yang disebut terminator. Urutan terminatormenandai tempat akhir transkripsi (akhir suatu gen) (Gambar

32

4.8). Pada E. Coli, terdapat dua mekanisme terminasi yaitu:adanya protein ρ (rho) yang membantu melepaskan RNA atauterminasi tanpa bantuan protein ρ (rho-independen) dimana padadaerah terminator membentuk seperti loop.

Gambar 2.13. Mekanisme transkripsi pada prokariot.

RNA polimerase tidak mempunyai aktifitas proofreading(pembacaan kembali) eksonuklease 3’→5’ (seperti yang dimilikioleh DNA polimerase), sehingga sekitar satu kesalahan terjadisetiap 104-105 ribonukleotida yang dimasukkan selamatranskripsi RNA. Karena di dalam sel diproduksi banyak copy RNAdari satu gen dan semua RNA segera di degradasi dan diganti, makakesalahan pada molekul RNA tidak terlalu berpengaruh terhadapsel dibandingkan kesalahan pada informasi yang tersimpan dalamDNA.

Setiap gen organisme mempunyai sinyal transkripsi

33

(promotor dan terminator) yang spesifik. Untuk kesepakatandaerah sebelum awal gen (start site) diberi penomoran negatif,dan daerah dalam gen diberi penomoran positif. Pada E. coli, RNApolimerase mengikat sekitar 70 basa sebelum start site sampaisekitar 30 basa setelah start site. Berdasarkan penelitian padapromotor-promotor gen-gen E. coli ditemukan urutan yang selaluada (urutan konsensus) yaitu TTGACA (sekitar daerah -35) danTATAAT (sekitar daerah -10). Selain itu sebelum promotor(daerah -40 sampai -60) juga terdapat daerah yang disebut UPelement yang berfungsi untuk mengikat subunit α RNApolimerase. Sedangkan promotor untuk eukariot adalah urutanvariabel TATAAA (daerah -30) dan urutan Inr (inisiator) yangberada dekat dengan strat site (Gambar 4.9).

(a)

(a)

(b)

Gambar 2.14 (a) Tipikal promotor E. coli yang dikenali oleh RNA

34

polimerase; (b)promotor pada eukariot yang dikenali oleh RNApolimerase II

2.8. Struktur Organisasi Pada Gen Eukariot

Gen-gen pada DNA kromosom eukariot pada umumnyamengandung segmen DNA yang tidak mengkode asam aminoyang disebut intron. Segmen yang mengkode protein disebutekson. Hanya beberapa gen prokariot yang mengandungintron. Panjang intron bervariasi antara satu gen dengan genlainnya. Sebagai contoh gen yang mengkode satu rantai polipeptidapada protein ovalbumin telur burung memiliki intron yang lebihpanjang dibandingkan ekson, terdapat tujuh intron yang mengisi85% bagian gen. Sementara gen yang mengkode ovalbumin padatelur ayam mengandung 17 intron. Gen yang mengkode proteinhiston tidak mengandung intron. Sampai saat ini fungsi dariintron belum dikatahui.

35

Gambar 2.15. Gen Ovalbumin dan Hemoglobin subunit β.(A, B,.... = Intron; 1, 2, ... = Ekson)

Gen organisme prokariot pada umumnya mempunyai strukturyang berbeda dengan gen organisme eukariot. Gen organismeprokariot bersifat kontinyu, artinya seluruh nukleotidamenspesifikasi asam amino, sedangkan gen organisme eukariotbersifat tidak kontinyu, artinya tidak seluruh urutan nukleotidamengkode asam amino. Bagian gen yang mengkode asam aminodisebut ekson, sedangkan yang tidak mengkode asam aminodisebut intron. Ekson dan intron letaknya bergantian. Hasiltranskripsi gen organisme prokariot dapat langsung ditranslasimenjadi protein, sedangkan transkrip gen organisme eukariot

36

pada umumnya masih harus melalui proses tambahan untukmenghilangkan intron. Transkrip mRNA yang mengandung introndisebut transkrip primer (pre mRNA). Proses penghilanganintron terjadi di dalam nukleus dan disebut dengan splicing.Transkrip bebas intron ini berfungsi sebagai mRNA yang kemudianditranslasi menjadi protein. mRNA eukariot juga mengalamimodifikasi pada kedua ujungnya. Pada ujung 5’ ditambahkanbeberapa residu guanilat yang termodifikasi yang disebut 5’cap (5’-kepala) Sementara ujung 3’ dipotong dan ditambahkan 80-250residu adenilat untuk membentuk ekor poli-A.

Gambar 2.16 Transkripsi eukariot

2.9 Ekspresi Gen

Seperti tlah diuraikan di gambar 2.1, alur informasi genetic adalah dariDNA ke protein. Pembahasan detail mengenai ekspresi gen tidakdiperlukan untuk memahami prinsip rekayasa genetic, hanya sajapenting untuk mengenali wujud dasar dari transkripsi dan translasi.Deskripsi singkat mengenai proses tersebut akan dijelaskan disini.

37

Transkripsi meliputi sintesis RNA dari template DNA, dibantu olehuntai anti-kodon pada unit transkripsi. Enzim yang bertanggung jawabadalah RNA polymerase (RNA Polimerase bergantung-DNA).Pada prokariot, ada enzim tunggal RNA polymerase, tapi pada eukariotada tiga tipe RNA polymerase (I,II, III). Sintesis berupa messengerRNA (mRNA), ribosom RNA (rRNA), dan transfer RNA(tRNA).Semua RNA polymerase merupakan protein multisub unit besardengan massa relative molecular sekitar 500.000.Transkripsi memiliki beberapa komponen tahapan, yaitu (1)pengikatanDNA/RNA polymerase, (2)rantai inisiasi, (3)rantai elongasi, (4) rantaiterminasi dan pelepasan RNA. Struktur promoter sangat penting untukmenetapkan ikatan pada RNA polymerase, tetapi tidak berlaku disini.Ketika molekul RNA dilepaskan, dengan segera dilanjutkan translasi(berlaku bagi prokariot) atau mungkin berproses dan diekspor kesitoplasma (pada eukariot) sebelum translasi terjadi.Translasi memerlukan molekul mRNA, didukung oleh daya tRNA danribosom (tersusum atas rRNA dan protein ribosomal). Ribosom adalahletak dimana sintesis protein berlangsung, pada prokariot ribosomtersusun atas tiga rRNA, dan sekitar 52 protein ribosomal yangberbeda. Ribosom merupakan struktur kompleks yang sangat pentingberperan sebagai “penari” yang memegang RNA di tempatnya sehinggakodon akan sesuai dengan antikodon yang tepat pada tRNA.Kemudian memastikan asam amino yang tepat disisipkan ke dalamrantai polipeptida yang berkembang. Molekul mRNA ditranslasi padaarah 5 3, bersamaan dengan elongasi polipeptida dari terminal Nke C.

38

Gambar 2.17. Ringkasan ekspresi gen

39

3Enzim

Teknologi DNA rekombinan berperan penting dalam perkembanganpengetahuan yang berkaitan dengan ekspresi gen yang terjadi padatahun 1970-an dan 1980-an. Dasar teknologi DNA rekombinan adalahkemampuan untuk memanipulasi molekul DNA dalam tabung reaksi.Kemampuan teknologi ini tergantung pada ketersediaan enzim-enzimmurni yang aktivitasnya diketahui dan dapat dikontrol sehingga dapatdigunakan untuk memanipulasi secara spesifik molekul DNA.

Enzim yang digunakan dalam biologi molekuler dapat dibagi dalamempat kategori, yaitu

1. DNA polimerase, yaitu enzim yang mampu mensintesispolinukleotida baru yang komplementer dengan templat DNAatau RNA yang telah ada sebelumnya. Beberapa teknik yangdigunakan untuk mengkaji DNA tergantung pada sintesis kopiseluruh atau sebagian molekul DNA atau RNA yang telah ada.Enzim ini merupakan komponen esensial PCR, sekunsingDNA, pelabelan DNA, dan banyak prosedur penting laindalam riset biologi molekuler.

2. Nuklease, yaitu enzim yang mampu mendegradasi molekulDNA dengan memotong ikatan fosfodiester yangmenghubungkan satu nukleaotida dengan nukleotidaberikutnya. Endonuklease restriksi (enzim restriksi) merupakansalah satu contoh nuklease yang berperan penting dalambanyak aspek teknologi DNA rekombinan.

3. Ligase, yaitu enzim yang dapat digunakan untuk menyambungmolekul DNA dengan mensintesis ikatan fosfodiester di antaranukleotida pada ujung dua molekul DNA berbeda, atau padadua ujung molekul tunggal.

40

4. Enzim pemodifikasi-ujung, yaitu enzim yang mampumengubah ujung molekul DNA. Enzim ini berperan pentinguntuk merancang percobaan ligasi dan pelabelan molekulDNA dengan radioaktif dan marker lain. Deoksinukleotidiltransferase terminal, yang berasal dari jaringan timus sapi,adalah satu contoh enzim pemodifikasi ujung.

ENZIM RESTRIKSIAsam nukleat baik DNA maupun RNA mampu dipotong

dengan menggunakan suatu enzim yaitu nuklease. Enzim nukleaseyang mampu memotong RNA disebut ribonuklease atau Rnase,sementara enzim yang mampu memotong DNA disebutdeoksiribonuklease atau Dnase. Beberapa nuklease hanya memotongurutan asam nukleat yang single strand dan apa pula yang mampumemotong asam nukleat yang double strand. Nuklease ada dua macamyakni eksonuklease yang mampu memotong molekul asam nukleatsingle strand atau beberapa oligonukleotida pendek yang hanyamengenali salah satu ujung asam nukleat, yaitu ujung 5′ atau ujung 3′;sementara endonuklease mampu memotong asam nukleat di dareahtengah daru sekuens asam nukleat yang mampu mengenali daerahspesifik pada urutan asam nukleat (Clark, 2010; Howe, 2007; Murray etal., 2009).

Salah tujuan untuk memperoleh suatu daerah DNA dalamsuatu genom adalah untuk melakukan perbanyakan (kloning). Untukmemperoleh suatu urutan DNA tersebut maka dilakukan pemotongangenom DNA menjadi fragmen-fragmen dengan menggunakan enzimtertentu yang mampu memotong ikatan fosfodiaeter pada untaianDNA tersebut yakni berupa enzim restriksi. Enzim restriksi yangdiproduksi oleh bakteri dinamakan endonuklease yang secara tipikalmampu mengenali 4 – 8 bp urutan nukleotida yang spesifik. Urutannukleotida yang spesifik tersebut dinamakan restriction sites yang secaraumum merupakan sekuens palindromic (run back) yang pendek denganpola urutan sekuens yang sama ketika dibaca pada arah 5′ → 3′ (Howe,2007; Lodish et al., 2003; Ream et al., 2003). Pada Gambar1 ditunjukkanenzim EcoRI yang mampu mengenali enam urutan nukleotida spesifikyang kemudian dipotong menjadi dua. Sementara beberapa contohenzim restriksi dengan daerah spesifikny disajikan pada Tabel 1.

41

Gambar 1. Suatu double strand dari DNA yang dipotong oleh enzimrestriksi EcoRI (Lodge et al., 2007).

Tabel 1. Beberapa contoh endonuklease dengan daerah spesifiknya(Lehninger et al., 2000).

Enzim restriksi endonuklease dibagi menjadi tiga tipe dengankarakteristik yang berbeda-beda dan disajikan dalam Tabel 2.

Tabel 2. Karakteristik dari masing-masing tipe endonuklease (Howe,2007; Reece, 2004).

42

Adapun cara kerja enzim endonuklease tersebut berbeda-beda.Enzim endonuklease tipe II telah diketahui strukturalnya yang sisikatalitiknya tersusun atas 5 macam protein sekunder dalam bentuk β-sheet yang diapit oleh 2 protein sekunder dalam bentuk α-heliks(Gambar 2). Enzim restriksi endonuklease tersebut dapat melakukan‘scanning’ pada untain molekul DNA jika tidak menemukan restriction sitesyang spesifik. Peristiwa tersebut dinamakan mekanisme sliding.Mekanisme sliding tersebut melibatkan pergerakan di sepanjang lekukanDNA. Namun enzim restriksi endonuklease tersebut akan mengubahkonformasinya ketika mengenali daerah restriction sites yang spesifik.Ketika sudah mengenali daerah spesifik, maka enzim tersebut akanmemotong dua ikatan gula deoksiribosa dengan fosfat dari double helixDNA yang berbeda dan menghasilkan gugus 3′ hidroksil (OH) dangugus 5′ fosfat (PO4-). Selanjutnya DNA tersebut menjadi fragmen-fragmen yang sesuai dengan daerah pemotongannya. Enzimendonuklease tidak selamanya memotong DNA menjadi fragmen yangujungnya simetris (blunt ends), namun ada juga yang ujungnya asimetris(sticky ends) (Gambar 3). Pola potongan simetris atau tidaknyatergantung kinerja enzim endonuklease seperti yang tertera pada Tabel1(Allison, 2007; Reece, 2004).

43

Gambar 3.1 Struktur enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA.Enzim tersebut mengenali double strand dari DNA dengan sekuensspesifik 5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiesterantara dua residu G. Hasilnya adalah berupa dua fragmen yangujungnya sticky ends. Pada gambar tersebut warna hijau dan birumenunjukkan subunit protein dimer yang identik (Reece, 2007).

Gambar 3.2 Contoh pola pemotongan enzim restriksi endonuklease.Enzim tersebut menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkanformasi 5′–PO4– dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentukasimetris atau sticky ends (BamHI) dan bentuk simetris atau blunt ends(SmaI) (Allison, 2007).

44

Enzim BamHI ini memiliki kofaktor berupa ion Mg2+,sehingga dalam prosedur protokol restriksi suatu sekuens DNAterkadang diberi MgCl. Kation bivalen Mg2+ dari MgCl tersebutberfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untukmeningkatkan aktivitas enzim restriksi (Ausubel, 2003; Reece, 2004).Adapun kinerja enzim BamHI tersebut mampu memotong ikatanfosfodiester pada urutan DNA pada sisi:5′ G↓G-A-T-C-C 3′3′ C-C-T-A-G↑G 5′

Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotidayang sama (G-G), sehingga BamHI disebut juga sebagai isoschizomer.Hasil potongan oleh enzim BamHI berupa formasi 5′–PO4– dan 3′–OHyang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends. (Ausubel,2003; Becker et al., 1996).

Enzim BamHI bekerja dengan cara melakukan scanning sekuensnon-spesifik di sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), setelahitu ketika enzim tersebut menemukan sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa konformasinyan dan sisi katatiliknyabekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara nukleotida Gmenjadi fragmen yang terpisah (Allison, 2007).

Sebagian besar enzim restriksi mempunyai urutan targetheksanukleotida, sedangkan yang lain mengenali urutan yang lebihpendek atau lebih panjang (Table 4.3).

Enzim Ligase

Enzim ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukanikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNAyang mengalami nick. Nick pada DNA dapat terjadi pada saat replikasiDNA, rekombinasi dan kerusakan. Secara biologis, DNA ligasediperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat prosesreplikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis,serta berperan dalam proses reparasi DNA. Oleh karena pentingnyaperanan DNA ligase, sekarang ini telah dikembangkan obat

45

antibakterial yang menginhibisi DNA ligase. Dengan diinhibisinyaDNA ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi dan sel akanmati. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalamsel, maupun di luar sel. Untuk penggunaan di luar sel, penggabungandengan enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidangteknologi DNA rekombinan. Enzim restriksi diibaratkan sepertigunting yang memungkinkan kita untuk memotong DNA di tempatyang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yangmenyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yangfungsional

Peranannya.

Enzim Ligase adalah menyambung dua molekul/fragmen DNA.

Mekanisme Enzim Ligase

Mekanisme DNA ligase dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+

atau ATP. Peristiwa ini menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMPyang berikatan kovalen dengan grup α-amino residu lysin pada sisi aktifdengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi), jika kofaktor berupaATP; atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika kofaktor berupaNAD+. Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin keujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA. Pada akhirnya,iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada diujung nick dengan 5’-fosfat dan melepaskan AMP dan enzim adenylate.

Enzim polymerase nukleotida adalah enzim penting dalam replikasiDNA maupun dalam reparasi DNA. DNA polimerase merupakansebuah enzim yang mengkatalisasi reaksi polimerisasideoksiribonukleotida menjadi rantai DNA, dengan kata lain enzim inimengkatalisasi reaksi pembentukan DNA. DNA polimerase pertamakali ditemukan pada tahun 1957 oleh Arthur Kornberg. DNApolimerase membaca rantai DNA utuh sebagai cetakan (templat) danmenggunakannya untuk membentuk rantai baru. Molekul polimer yangbaru terbentuk merupakan komplemen atau pasangan dari rantai yangdigunakan sebagai cetakan, dan identik dengan pasangan dari rantaicetakan sebelum terjadi reaksi.

46

Peranannya.

Enzim Polimerase adalah mengisi kekosongan dalam dufleks denganpenambahan nukleotida pada ujung 3’.

47

4

Teknik Rekayasa Genetik

Sebelum menguji beberapa teknik spesifik yang dipakai padamanipulasi gen, sangat berguna menentukan metode dasar yangdiperlukan untuk melaksanakan,menghitung, dan menganalisa molekulasam nukleat. Seringkali sulit untuk membuat rangkaian antara aspekteori dan praktek pada subjek dari metode yang dipakai padapengerjaan rutin dengan asam nukleat, sehingga perlu digambarkanlebih detail disini tentang teknik untuk cloning dan analisis gen.

4.1 ISOLASI DNA

Semua organisme disusun oleh sel yang mengandungelemen genetik yang sama yaitu DNA yang terdapat dalamkromosom. Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkankromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain

itu prokariot juga mengandung satuatau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkulardengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom.Isolasi DNA kromosom.

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atauDNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNAbisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untukmembebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebutditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) danRNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yangtinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan

sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasiDNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi denganetanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.

48

Gambar 4.1 Isolasi DNA

Isolasi DNA plasmid

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untukkloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dariDNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauhlebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNAplasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda denganprosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahandetergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA

49

plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosomdan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA +protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan carasentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNAdan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNasedan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNAplasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.Isolasi RNA

RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yangmengkode suatu protein. Jumlah populasi mRNA akan lebihbanyak dibading dengan DNA. mRNA eukariot dapatdipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT.Atau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkanenzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA

4.2 PCR (Polimerase Chain Reaction)

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknikperbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro padadaerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyakadalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen denganDNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasiDNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.

PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara duaprimer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannyake dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untaiganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandungDNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekulDNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat(dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisitertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan denganuntaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhirfragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akanmenyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah keduaprimer menempel pada DNA templat, DNA polimerase

50

mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer denganmenambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutannukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukanikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahandNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsungdengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim

DNA polimerase hanya akanmenambahkan dNTP yang komplemen

dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri

dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNAtemplat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA targetdan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yangdikaalisis oleh DNA polimerase.Tahapan PCR

1. Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membukamenjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhudenaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogendiantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruhreaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi padasiklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antarasuhu 90 oC – 95 oC.

2. Penempelan primer

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akanmenuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutanprimer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentukantara primer dengan urutan komplemen pada templat. Proses inibiasanya dilakukan pada suhu 50 oC – 60 oC. Selanjutnya, DNApolymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akanmenjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila

51

dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 oC.

3. Reaksi polimerisasi (extension)

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini,terjadi pada suhu 72 oC. Primer yang telah menempel tadi akanmengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahandNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.

Gambar 4.2. Siklus PCR, yang terdiri dari denaturasi,penempelan primer (annealing)dan polimerisasinya.

Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasioleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebutamplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlahcopy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalahjumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi,seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelahsatu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4,sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehinggaperubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan

52

menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiapsiklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A padaujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinyaproduk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektoryang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya. ProsesPCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.

2

4

8

16

220

Gambar 4.3. Jumlah copy fragmen DNA padatahapan PCR.

53

Komponen PCR

1. Enzim DNA Polymerase

Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakanKlenow fragment DNA Polimerase I selama raksipolimerisainya. nzime ini ternyata tik aktif secra termal selamaproses denaturasi, sehingga peneliti harus menambhkan enzim disetiap siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa dipakai untukperpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik. Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim tidak perlu dilakukan di setiap siklusnya, danproses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin

2. Primer

Primer merupakan oligonukleotida pendek rantaitunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNAtemplat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang urutan primer, perlu diketahuiurutan nukleotida pada awal dan akhir DNA taret. Primeroligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebutDNA synthesizer.

3. Reagen lainnya

Selain nzim dan primer, terdapat jugakomponen lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksi PCR.Komponen tersebut adalah dNTP untuk reaksi polimerisasi, danbuffer yang mengandung MgC2. Konsentrasi ion M2+

dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangt ritis.Konsntrai ion Mg2+ sangat mempengaruhi proses primerannealing, dnaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim danfidelitas reaksi.

54

4.3 REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASECHAIN REACTION (RT-PCR)

RT-PCR merupakan singkatan Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction. Seperti namanya, proses RT-PCRmerupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCRyang biasa, pada proes ini berlangsung satu siklus tambahan yaituadanya perubahan RNA menjadi cDNA complementary DNA)dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. ReverseTranscriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekulDNA secara in vitro menggunakan template RNA.

Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR inijuga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP.Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempelpada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasiproses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yangmempunyai poly(A) tail pada ujung 3', maka oligo dT, randomheksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapatdimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA.

4.4 METODA DETEKSI PRODUK PCR

Produk PCR adalah segmen DNA (amplikon) yang beradadalam jumlah jutaan copy, tetai tidak dapat diliat denan matatelanjang. Oleh karena itu PCR perlu diikuti dengan suatu tahapakhir yang bertujuan untuk memvisualisasikan produk PCR sertasekaligus bertujuan untuk mengetahui ukuran produk PCR danmengetahui apakah produk yang dihasilkan adalah benar sepertiyang diinginkan. Salah satu metoda deteksi yang umum dilakukanadalah elektroforesis gen agarosa.

55

1. Elektroforesis gel agarosa.

Metoda ini didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatandalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruhmedan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosaatau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untukmemisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari100 pb dan dijalankan ecara horizntal, sedankan elektroforesispoliakrilamid dapat memisahkan1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamidbiasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing).

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan kedalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkandi kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakanlarutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutuppositi. Laju migrasi DNA dalam medan lisrik erbanding rbaikdengn massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan olehukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yangberukuran kecil akan bermigrsi lebih cepat dibanding yangberukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkanfragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasimaka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masukdiantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNAakan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisadiperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNAstandar.

56

Gambar 4.4. Foto produk PCR pada gel agarosa.

4. 5 SEKUENSING DNA

Sekuensing DNA merupakan suatu metode yangdigunakan untuk mengetahui urutan nukleotida atau basa dalamsuatu fragmen DNA. DNA menyimpan informasi genetik dalambentuk urutan nukleotida. Dengan mengetahui urutan nukleotidasuatu gen, maka dapat ditentukan urutan asam amino protein yangdikodenya. Sebaliknya, urutan asam amino protein tidak dapatmemberikan informasi lengkap tentang urutan nukleotida gen yangmengkodenya. Karena alasan tersebut, selain karena mahalnyasekuensing protein, maka sekuensing DNA jauh lebih banyakdigunakan.

Metode sekuensing DNA yang paling banyak digunakanadalah metode dideoksi Sanger. Reaksi sekuensing dimulai denganreaksi PCR untuk memperbanyak fragmen DNA dan diikutidengan elektroforesis gel poliakrilamida untuk memisahkan basa-basa DNA. Seperti proses PCR, reaksi sekuensing juga meniruproses pembentukan leading strand pada replikasi DNA di alam.

Ada tiga tahapan penting yang harus dilakukan padasekuensing, yaitu:

1. pembentukan fragmen-fragmen DNA untai tunggal dengan

57

berbagai ukuran melalui proses PCR2. pemisahan fragmen-fragmen DNA dengan gel elektroforesispoliakrilamida

3. pembacaan hasil elektroforesis.

Tahap pertama reaksi sekuensing serupa dengan teknikPCR yang memerlukan siklus suhu berulang. Sekuensingdilakukan dengan menggunakan enzim DNA

(a) (b)

58

Gambar 4.5 Hasil Elektroforesispolimerase untuk memperpanjang primer sepanjang templat DNAuntai tunggal dengan adanya empat deoksinukleotida trifosfat(dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Berbeda dengan PCR, DNAyang akan disekuensing dapat berupa untai tunggal maupun untaiganda dan primer yang diperlukan hanya satu.

Komponen kunci dalam reaksi sekuensingadalah analog dNTP yaitu dideoksinukleotida trifosfat (ddNTP)yang tidak memiliki gugus 3’-OH. Reaksi sekuensing diterminasisecara acak dengan masuknya ddNTP. Dengan menggunakansejumlah kecil ddNTP (dibandingkan dengan dNTP), maka setelah20-30 siklus suhu akan diperoleh fragmen-fragmen DNA yangpanjangnya berbeda-beda dengan selisih satu nukleotida yangsemuanya memiliki ddNTP pada ujung 3’-nya.

Pada tahap kedua, fragmen-fragmen DNA ini dipisahkandengan elektroforesis gel poliakrilamid. DNA bermuatan negataif,jadi akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Gel harusmemiliki kemampuan yang cukup tinggi untuk memisahkanfragmen-fragmen yang ukurannya hanya berbeda satu nukleotida.Fragmen DNA yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat daripadafragmen yang lebih besar. Fragmen yang pertama mencapai ujungbawah gel merupakan fragmen terkecil.

Pembacaan hasil elektroforesis dapat dilakukan bila adalabel pada fragmen- fragmen DNA yang terbentuk. Label dapatberbentuk isotop radioaktif atau fluoresen. Pelabelan dapatdilakukan terhadap primer maupun pada ddNTP.

1. Pelabelan dengan Radioisotop

Pada awal perkembangan teknik DNA sekuensing,pelabelan fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan

radioisotop, seperti 32P. Komponen reaksi yang dilabel adalahprimer atau ddNTP. Dengan menggunakan pelabelan radioisotop,reaksi pembentukan fragmen DNA harus dilakukan dalam empattabung terpisah, masing- masing mengandung ddNTP yang

59

berbeda. Keempat hasil reaksi sekuensing tersebut selanjutnya harusdi-run di empat lajur yang berbeda pada elektroforesis gelpoliakrilamid.

2. Pelabelan dengan Pewarnaan Fluoresen

Pelabelan fluoresen dilakukan dalam satu tabung, sehinggamemungkinkan pemisahan fragmen-fragmen hasil reaksisekuensing dilakukan hanya pada satu lajur gel poliakrilamid karenafragmen dengan nukleotida terakhir yang berbeda akanmemberikan warna yang berbeda. Terdapat dua cara pelabelan,yaitu menggunakan dyeprimer dan dye terminator.

Dye primer

Jika pewarnaan fluoresen dilakukan pada primer, reaksipembentukan fragmen DNA harus dilakukan dalam empat tabungterpisah, masing-masing mengandung ddNTP yang berbeda danprimer yang dilabel dengan empat warna yang berbeda. Keempathasil reaksi sekuensing tersebut selanjutnya di-run di satu lajur padaelektroforesis gel poliakrilamid.Dye terminator

Pelabelan fluoresen yang dilakukan pada ddNTP (dyeterminator labeling) memberikan kemudahan karena reaksi sekuensingdapat dilakukan hanya dalam satu tabung, dan tentu saja di-run disatu lajur pada elektroforesis gel poliakrilamid.

Mesin sekuensing otomatis dilengkapi dengan laserpenginduksi fluoresen yang bergerak bolak-balik horisontalsepanjang gel poliakrilamid. Jika ada DNA pada lokasi tersebutmaka laser akan mengeksitasi dye yang terikat pada primer atauddNTP. Sebuah kamera atau tabung fotomultiplier akanmenangkap sinar yang diemisikan. Keempat jenis dye mengemisisinar dengan warna (panjang gelombang) yang berbeda- beda.

60

4.6 TEKNIK HIBRIDISASI

Teknik ini berdasarkan kemampuan urutan asam nukleatyang kompelmen untuk berikatan satu sama lain. Dengan hibridisasifragmen DNA tertentu dapat diidentifikasi dan dipisahkan darifragmen lain. Untuk melakukan hibridisasi, maka terlebih dahulukita harus mengetahui urutan gen yang dicari.

Teknik hibridisasi dapat digunakan untukmengidentifikasi klon yang mengandung DNA sisipan.Pertama, kita harus membuat replika menggunakan master plate(plate/petri yang mengandung koloni bakteri padapermukaanya). Replika ini dibuat menggunakan filter nitroselulosa.Sel bakteri yang menempel pada replika di lisis denganmenambahkan detergen, dan DNAnya dibebas ke filter. DNA untaiganda akan didenaturasi oleh nantrium hidroksida, DNA untaitunggal yang dihasilkan akan tetap menempel pada filter pada posisiyang sama dengan koloni asalnya. Sehingga pola koloni pada masterplate akan sama dengan pola DNA yang menempel pada filter.

Selanjutnya ditambahkan probe radioaktif. Probe adalaholigonukleotida untai tunggal yang komplemen dengan urutanDNA yang kita cari. Probe di label sehingga dapat divisualisasi.Bila probe ditambahkan, maka akan berikatan dengan urutan yangkomplemen, membentuk hibrida untai ganda. Setelah itu filterdicuci, sehingga probe yang tidak berikatan akan terbuang, dandivisualisasikan dengan sinar X. DNA yang berikatan dengan probeakan kelihatan seperti spot hitam. Spot ini dibandingkan posisinyadengan koloni pada master plate, sehingga koloni yangmengandung fragmen DNA yang diklon dapat diketahui posisinya.

Hibridisasi merupakan teknik yang sangat bermanfaat.Teknik ini sangat sensitif: sejumlah kecil probe yang berikatan kemembran dapat dideteksi, dan selektif: karena berdasarkankomplementari urutan DNA sehingga urutan spesifik dapatdiidentifikasi. Hibridisasi dapat dilakukan terhadap DNA danRNA, dari koloni atau dari gel. Bila kita tidak memilikiinformasi tentang urutan DNA untuk merancang probe, makakita bisa juga memperkirakan dari urutan asam amino dari protein.

61

Dengan adanya kode genetik, maka kita dapat menerjemahkanurutan nukleotida dari urutan asam amino. Masalahnya adalahterdapat degenerasi pada kode genetik, terdapat beberapa asamamino yang memiliki lebih dari satu kodon. Untuk mengatasimasalah ini maka kita dapat merancang berbagai

urutan probe yang mungkin, dan mensintesisnyadengan DNA syntetizer.

Aplikasi utama dari hibridisasi adalah penelitian tentangregulasi gen. Regulasi ekspresi gen sangat vital pada sel-sel tertentu.Peneltian yang intensif telah dilakukan untuk menentukanbagaimana gen-gen tertentu diregulasi untuk menyediakan tipe seltertentu, atau untuk memungkinkan sel merespon perubahanlingkungan. Karena regulasi berhubungan dengan tingkattranskripsi, maka penelitian tentang produksi mRNA dari gentertentu sangatlah penting.

Sebagai contoh, mari kita lihat satu tipe sel dengan duakondisi lingkungan yang berbeda. Sel-sel pada kulit kita terpaparterhadap semua kondisi lingkungan: dingin, panas, angin, air,cahaya, dan gelap. Dalam merespon kondisi ini, selmensintesis protein yang dapat membantu memproteksi selterhadap lingkungan. Sebagai contoh, kebanyakan sel meresponsinar UV dosis tinggi dengan mensintesis sejumlah enzim yangterlibat pada perbaikan mutasi DNA. Sinar UV merupakanmutagen yang potensial. Tanpa enzim untuk repair (perbaikan),mutasi akan terakumulasi dan mungkin dapat menyebabkankanker. Namun, pada kondisi normal enzim repair tidak akandiproduksi, sehingga gennya inaktif. Jadi ekspresi dari gen ini diinduksi oleh sinar UV.

62

Induksi ekspresi gen dapat di deteksi dengan metoda hibridisasi.Pertama, bila perlu gen tersebut dikloning, probenya dirancang,selanjutnya hibridisasi. Sel-sel kulit dapat diambil dan dikulturkandilaboratorium. Setelah waktu pemaparan yang berbeda- beda,mRNA diisolasi dari sel, dipisahkan dengan gel elektroforesis, dankemudian ditransfer ke membran nitroselulosa dan dihibridisasidengan probe. Ketebalan pita yang terlihat setelah autoradiografimenggambarkan jumlah mRNA tertentu dalam sel.

4.7 ANALISIS RFLP

Teknik lain yang berdasarkan elektroforesis dan hibridisasi adalahanalisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP). Sebagian besarDNA eukariot tidak mengkode protein. Dalam daerah noncodinglebih banyak terdapat mutasi dibandingkan di dalam gen, karenamutasi ini tidak berpengaruh terhadap sel, jaringan, organ danorganisme. Karena mutasi pada daerah noncoding tidakmenghasilkan perubahan fenotip, sehingga tidak menunjukkanperbedaan diantara individu.Jika dua individu X dan Y, masing-masing mengandung gen A danB yang dipisahkan oleh daerah noncoding pada kromosom. Dalamgen A dan B pada kedua individu tersebut terdapat sisi restriksienzim HindIII. Sisi ini sama pada kedua individu tersebut, karenatidak ada mutasi pada gen A dan B. Namun terdapat juga sisirestriksi di antara gen A dan B. Pada sisi restriksi ini, keduaindividu tersebut berbeda, X memiliki dua sisi pemotongan, danY hanya memiliki satu sisi pemotongan. Mutasi pada Y telahmerubah satu basa pada salah satu sisi pengenalan enzim HindIII,sehingga tidak bisa memotong pada sisi tersebut. Keberadaanmutasi ini dapat dideteksi dengan mengisolasi DNA dari keduaindividu tersebut, kemudian dilakukan pemotongan denganenzim HindIII. Fragmen DNA dipisahkan dengan gelelektroforesis, kemudian ditransfer ke membran nitroselulosa dandilakukan hibridisasi dengan menggunakan probe spesifik sepertiyang sudah dijelaskan diatas.Kenapa RFLP menjadi penting? RFLP sama seperti mutasi lain,

63

merupakan marker genetik yang diturunkan dari satu generasi kegenerasi berikutnya. Namun tidak terdapat fenotip yangberhubungan dengannya, hanya menghasilkan variasi panjangfragmen restriksi. Banyaknya penemuan mutasi gen yangberhubungan dengan penyakit manusia, kemampuan untukmengkloning gen ini dan mempelajarinya, menjadi bermanfaat.Lebih banyak informasi yang diketahui tentang gen ini, semakinmudah mengkloningnya. Marker genetik berguna untukmemetakan gen. Peta gen lebih mudah dibuat menggunakan RFLPsebagai marker.

Teknik Sekuensing DNA

Teknik Sekuensing DNA (DNA sequencing) adalah cara untukmenentukan urutan basa-basa nukleotida suatu fragmen DNA.Teknik ini merupakan salah satuteknik yang sangat penting dalambidang biologi molecular, yang dapat dimanfaatkan untukmenentukan urutan basa nukleotida suatu gen ataupun sekuengenom total suatu sel atau organisme.

Teknik pengurutan basa DNA terdiri dari 2 macam cara yangdikembangkan hamper secara bersamaan yaitu (i). Cara degradasikimiawi oleh A. Maxam da n W. Gilbert di Amerika, dan (ii). Caraterminasi oleh F. Sanger dan A.R. Coulson di Inggris.

Teknik Maxam-Gilbert

Teknik pengurutan basa DNA yang pertama dikenal adalah teknikkimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert padatahun 1977. Fragmen DNA yang diurutkan dilabel denganradioaktif (32P) pada salah satu ujung 5’. Teknik Maxam danGilbert, dapat ditetapkan, baik untuk DNA untai ganda maupunDNA untai tunggal.

64

Gambar.4.6 DNA sequencing using the chemical (Maxam–Gilbert)method. (a) Radiolabelled single-stranded DNA is produced. (b) The bases inthe DNA are chemically modified and removed, with, on average, one basebeing affected per molecule. (c) The phosphodiester backbone is thencleaved using piperidine. (d) The process produces a set of fragmentsdiffering in length by one nucleotide, labelled at their 5 termini.

65

Molekul DNA dipotong terlebih dahulu secara parsial denganpiperidin. Pengaturan lama inkubasi atau konsentrasi piperidinyang digunakan dapat menghasilkan potongan fragmen DNAdalam berbagai ukuran. Selanjutnya basa DNA di modifikasisedemikian rupa, dengan menggunakan senyawa kimia tertentu.Dimetilsulfat digunakan untuk metilasi basa G, asam format untukmenghidrolisis basa A dan G, sedangkan hidrazin digunakan untukmenghidrolisis basa C dan T. Akan tetapi dengan penambahanlarutan 1,5 M NaCl, hidrazin hanya dapat bereaksi dengan baikuntuk memecah sitosin (C). Dengan demikian akan dihasilkanempat jenis fragmen DNA yang memiliki ukuran berbeda denganmasing-masing memiliki ujung G, ujung C, ujung A, dan ujung T.

Fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan dielektroforesis dengangel poliakrilamida. Berdasarkan pola migrasi pada gel elektroforesisdapat ditentukan urutan basa-basa DNA dari molekul DNA yangakan ditentukan urutan basa-basanya.

Teknik Sanger-Coulson

Teknik Sanger-Coulson merupakan teknik yang saat ini lebihsering digunakan urutan basa DNA. Teknik Sanger-Coulson lebihpraktis daripada teknik Maxam-Gilbert, sehingga teknik Sangerlebih banyak dikembangkan dan digunakan untuk sekuensingDNA.

Teknik Sanger-Coulson pada dasarnya memanfaatkan sifat enzimDNA polymerase yaitu fragmen klenow, yang memilikikemampuan untuk mensintesis DNA dengan adanya (dNTP),dengan dideoksinukleotida trifosfat (ddNTP). Molekul dNTP,tidak memiliki gugus hidroksil (OH), pada atom C nomor 2 padacincin gula pentose, sedangkan molekul ddNTP, tidak memiliki 2gugus OH pada posisi atom C nomor 2 dan nomor 3 pada cincingula pentose, seperti yang terlihat pada gambar 3.8.

66

Gambar. 4.7 DNA sequencing using the dideoxy chain termination(Sanger–Coulson) method. (a) A primer is annealed to a single-strandedtemplate and (b) the Klenow fragment of DNA polymerase I used tosynthesise a copy of the DNA. A radiolabelled dNTP (often [ -35S]dNTP,filled circles) is incorporated into the DNA. (c) Chain termination occurswhen a dideoxy nucleoside triphosphate (ddNTP) is incorporated. (d) Aseries of four reactions, each containing one ddNTP in addition to the fourdNTPs required for chain elongation, generates a set of radiolabellednested fragments.

Teknik sekuensing DNA menggunakan teknik dideoksinukleotidadilakukan pada 4 tabung reaksi yang berbeda, dimana pada setiaptabung reaksi berisi campuran reagen yang terdiri dari cetakanDNA untai tunggal yang akan disekuens, polimer oligonukleotida.DNA polymerase, campuran dNTP dan larutan buffer.

67

DNA cetakan yang akan disekuensing adalah DNA untai tunggalsehingga biasanya diklon terlebih dahulu dalam vector M13.Sedangkan molekul ddNTP yang dilabel dengan senyawa radioaktifatau non radioaktif, hanya ditambahkan pada campuran reaksiyang sesuai, yaitu, untuk tabung A hanya ditambahkan ddATP,untuk tabung C hanya ditambahkan dd CTP, untuk tabung Ghhanya ditambahkan ddGTP, sedangkan untuk tabung T hanyaditambahkan ddGTP.

Pada proses pemanjangan untai DNA, selain menggunakan dNTP,secara acak jugga menggunakan ddNTP, maka jika ddNTP terikat,polimerisasi lebih lanjut basa-basa DNA tidak terjadi atau terhenti,pada ujung molekul DNA yang memiliki ujung ddNTP.

Disiapkan 4 tabung reaksi yang masing-masing mengandung DNAuntai tunggal yang akan disekuens, primer oligonukleotida,keempat jenis dNTP, enzim DNA polymerase, dan larutan buffer.Kemudian kedalam tabung no. 1 ditambahkan ddGTP, tabung No.2, tabung No. 3. ddATP, dan tabung No. 4. ddTTP. DNA cetakandalam masing-masing tabung kemudian secara in vitro denganteknik PCR. Dengan demikian dalam setiap reaksi akan dihasilkansejumlah fragmen DNA dengan ukuran bervariasi dimana setiapfragmen DNA tersebut memiliki gugus ddNTP yang telah dilabeldengan radioaktif pada setiap ujung 3’ nya. Untuk mengetahuiukuran fragmen-fragmen DNA yang terbentuk dilakukanelektroforesis menggunakan gel poliakrilamida, kemudian dideteksidengan autoradiografi.

Berdasarkan perbedaan migrasi masing-masing fragmen DNAakan dapat ditentukan urutan basa-basa DNA-nya. Hasilsekuensing DNA merupakan urutan basa yang komplementerterhadap urutan basa-basa yang terbaca pada hasil elektroforesis.

Dewasa ini sebagai mesin DNA sekuensing otomatis telahdikembangkan dan mampu mengurutkan sekitar ratusansampel DNA sekaligus dalam sekali elektroforesis.

Sistem pelabelan yang semula dilakukan dengan radioisotope,telah dikembangkan dengan sistem pelabelan senyawa

68

fluoresen yang berbeda warna pendarannya untuk setiapddNTP terminal. Perbedaan emisis cahaya senyawa fluoresenketika tereksitasi oleh sinar laser, akan terbaca dengan jelasoleh alat pendeteksi optic (detektor) yang terdapat pada mesinDNA sekuensing, sehingga urutan basa-basa DNA dapatterdeteksi pada sistem elektroforesis kapiler.

Mesin DNA sekuensing otomatis yang dilengkapi denganperangkat lunak pengolah data menampilkan warna spesifikdari masing-masing keempat basa DNA, yang sekaligusmerupakan urutan sekuen DNA.

69

5Vektor Kloning

Sejak ditemukannya enzim restriksi (enzim yang dapat memotongDNA pada urutan yang spesifik) dan ditemukannya enzim ligase(enzim yang dapat menyambungkan potongan DNA), makaDNA dari organisme apa saja dapat diisolasi, dipotong-potong,disambungkan kembali dan dipindahkan ke organisme lain.Proses mengkombinasikan beberapa DNA dan memperbanyakDNA rekombinan tersebut di dalam sel disebut kloning(Gambar 6.4). Proses memasukkan DNA ke dalam sel disebuttransformasi dan sel yang dihasilkan disebut transforman. Agarsuatu DNA dapat diperbanyak di dalam sel, maka DNA tersebutharus disisipkan ke dalam suatu plasmid (berfungsi sebagaivektor/pembawa) yang dapat bereplikasi di dalam sel. Kumpulansel-sel yang mengandung plasmid rekombinan yang sama disebutsebagai suatu klon.

Pada kloning gen: suatu fragmen DNA yang mengandunggen yang akan di klon disisipkan pada molekul DNA vektor untukmenghasilkan molekul DNA rekombinan. DNA rekombinan inidigunakan untuk mentransformasi sel inang (biasanya bakteri). Didalam sel, vektor mengadakan replikasi, menghasilkan banyak copyatau turunan yang identik, baik vektornya maupun gen yangdibawanya. Ketika sel inang membelah, copy molekul DNArekombinan diwariskan pada progeni. Setelah terjadi sejumlah besarpembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klon sel inang yangidentik. Tiap-tiap klon mengandung satu copy atau lebih molekulDNA rekombinan.

70

Gambar 5.1. Proses kloning

Kloning melibatkan lima komponen utama, yaitu :fragmen DNA (gen) yang akan di kloning (disebut juga DNAsisipan), DNA vektor (bisa plasmid, bakteriofaga atau cosmid),enzim restriksi, enzim ligase dan sel inang (bakteri atau ragi).

5.1. DNA sisipan.

Tujuan kloning adalah memperbanyak suatu fragmen DNAdari suatu organisme dalam suatu sel inang. Namun tujuan akhirnyabisa bermacam-macam, diantaranya: produksi protein pentingdengan skala besar, untuk deteksi patogen atau sel abnormal. DNAsisipan bisa diperoleh dengan dua cara, yaitu :

1. Produk PCR.2. Fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi

71

5.2. DNA vektor

Vektor merupakan suatu mulekul DNA sirkular yangbertindak sebagai wadah untuk membawa DNA sisipan masuk kedalam sel inang dan bertanggung jawab atas replikasinya.Berdasarkan fungsinya vektor dapat dibagi dua, yaitu : vektorkloning dan vektor ekspresi. Vektor kloning hanya berfungsi untukmemperbanyak fragmen DNA yang disisipkan, sehingga fragmenDNA tersebut hanya direplikasi, tidak di transkripsi. Biasanyavektor ini digunakan untuk tujuan sekuensing atau untukperbanyakan DNA yang nantinya akan di sisipkan ke vektorekspresi. Sementara vektor ekspresi digunakan untuk memproduksiprotein dari gen yang diklon.

Syarat suatu vektor adalah : (1) mampu memasuki selinang, (2) bereplikasi sendiri (memiliki ori), (3) menghasilkan jumlahcopy yang banyak dan (4) mempunyai ukuran yang relatif kecil (<10 kb). Molekul DNA yang memenuhi persyaratan tersebut adalah :plasmid dan kromosom virus terutama bakteriofaga.

Plasmid

Plasmid merupakan DNA rantai ganda yang berbentuksirkular dan terdapat bebas di dalam sel. Plasmid dapat bereplikasisendiri di dalam sel inang karena mempunyai suatu urutan DNAspesifik yang disebut ori (origin of replication/titik awal replikasi).Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau lebih yangmenyebabkan ciri- ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri inang,misalnya plasmid yangmembawa gen resistan antibiotik

Banyak spesies bakteri mempunyai plasmid, tetapi plasmidyang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan bukan plasmiddalam bentuk alami, melainkan yang sudah direkayasa. Plasmidtersebut telah diberi sisi pengenalan beberapa enzim restriksi agardapat disisipi dengan DNA asing. Plasmid juga telah diberi dua genmarker, satu gen diperlukan untuk mendeteksi dengan mudahadanya plasmid di dalam sel, dan gen yang kedua diperlukan untukmendeteksi adanya DNA asing.

72

Bakteriofaga merupakan virus yang menginfeksi bakteri.Bakteriofaga mempunyai struktur yang sangat sederhana, hanyaterdiri dari satu molekul DNA atau RNA yang membawa sejumlahgen, dan dikelilingi oleh selubung atau kapsid yang disusun olehmolekul protein. Pada proses infeksi bakteri oleh faga, partikelfaga melekat pada bagian luar bakteri dan memasukkan DNAkromosomnya ke dalam sel. Molekul DNA faga kemudianmengadakan replikasi, gen-gen faga mengatur sintesis proteinkomponen kapsid. Partikel-partikel faga yang baru kemudian dirakitdan dilepaskan dari bakteri. Sel bakteri mengalami lisis. Sama sepertiplasmid, DNA faga yang digunakan dalam teknologi DNArekombinan umumnya sudah dimodifikasi dengan penambahansisi restriksi. Perbedaanya dengan plasmid, bakteriofaga dapatmenampung fragmen DNA dengan ukuran yang lebih besar.

Bakteriofag

Bakteriofag atau fag l merupakan virus kompleks yang menginfeksibakteri E. coli. Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini,kita dapat memanfaatkannya sebagai vektor kloning semenjak masa-masa awal perkembangan rekayasa genetika. DNA l yang diisolasidari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai gandadengan panjang 48,5 kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnyaberupa untai tunggal sepanjang 12 pb yang komplementer satu samalain sehingga memungkinkan DNA l untuk berubah konformasinyamenjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnyakedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos.Seluruh urutan basa DNA l telah diketahui. Secara alami terdapatlebih dari satu tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzimrestriksi yang biasa digunakan. Oleh karena itu, DNA l tipe alamitidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi,saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA l yangmemenuhi syarat sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektorkloning yang berasal dari DNA l, yaituvektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmenDNA asing, vektor substitusi, yang untuk membawa fragmen DNAasing harus membuang sebagian atau seluruh urutan basanya yang

73

terdapat di daerah nonesensial dan menggantinya dengan urutanbasa fragmen DNA asing tersebut.Di antara kedua macam vektor l tersebut, vektor substitusi lebihbanyak digunakan karena kemampuannya untuk membawa fragmenDNA asing hingga 23 kb. Salah satu contohnya adalah vektor WES,yang mempunyai mutasi pada tiga gen esensial, yaitu gen W, E, danS. Vektor ini hanya dapat digunakan pada sel inang yang dapatmenekan mutasi tersebut.Cara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensialmembutuhkan dua tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzimrestriksi. Jika suatu enzim restrisksi memotong daerah nonesensialdi dua tempat berbeda, maka segmen DNA l di antara kedua tempattersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh fragmenDNA asing. Jika pembuangan segmen DNA l tidak diikuti olehsubstitusi fragmen DNA asing, maka akan terjadi religasi vektorDNA l yang kehilangan sebagian segmen pada daerah nonesensial.Vektor religasi semacam ini tidak akan mampu bertahan di dalamsel inang. Dengan demikian, ada suatu mekanisme seleksi automatisyang dapat membedakan antara sel inang dengan vektorrekombinan dan sel inang dengan vektor religasi.

Bakteriofag l mempunyai dua fase daur hidup, yaitu faselitik dan fase lisogenik. Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilahtransformasi untuk DNA fag) dimulai dengan masuknya DNA lyang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan mengalamireplikasi secara independen atau tidak bergantung kepadakromosom sel inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlahsalinan DNA l sirkuler, masing-masing DNA ini akan melakukantranskripsi dan translasi membentuk protein kapsid (kepala).Selanjutnya, tiap DNA akan dikemas (packaged) dalam kapsidsehingga dihasilkan partikel l baru yang akan keluar dari sel inanguntuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada faselisogenik DNA l akan terintegrasi ke dalam kromosom sel inangsehingga replikasinya bergantung kepada kromosom sel inang. Faselisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel inang.Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akanmembentuk plak (plaque) berupa daerah bening di antara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh karena itu, seleksi vektor

74

rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plaktersebut.

Bakteriofag M13

Ada jenis bakteriofag lainnya yang dapat menginfeksi E.coli. Berbeda dengan l yang mempunyai struktur ikosahedralberekor, fag jenis kedua ini mempunyai struktur berupa filamen.Contoh yang paling penting adalah M13, yang mempunyai genomberupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang 6.408 basa. Infeksinyapada sel inang berlangsung melalui pili, suatu penonjolan padapermukaan sitoplasma.Ketika berada di dalam sel inang genom M13 berubah menjadiuntai ganda sirkuler yang dengan cepat akan bereplikasimenghasilkan sekitar 100 salinan. Salinan-salinan ini membentukuntai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke permukaansel inang. Dengan cara seperti ini DNA M13 akan terselubungi olehmembran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang infektiftanpa menyebabkan lisis. Oleh karena fag M13 terselubungi dengancara pembentukan kuncup pada membran sel inang, maka tidak adabatas ukuran DNA asing yang dapat disisipkan kepadanya. Inilahsalah satu keuntungan penggunaan M13 sebagai vektor kloning biladibandingkan dengan plasmid dan l. Keuntungan lainnya adalahbahwa M13 dapat digunakan untuk sekuensing (penentuan urutanbasa) DNA dan mutagenesis tapak terarah (site directedmutagenesis) karena untai tunggal DNA M13 dapat dijadikancetakan (templat) di dalam kedua proses tersebut.

Meskipun demikian, M13 hanya mempunyai sedikit sekali daerahpada DNAnya yang dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu,tempat pengenalan restriksinya pun sangat sedikit. Namun,sejumlah derivat M13 telah dikonstruksi untuk mengatasi masalahtersebut.

KosmidKosmid merupakan vektor yang dikonstruksi denganmenggabungkan kos dari DNA l dengan plasmid. Kemampuannya

75

untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kbmenjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag l danplasmid.

FasmidSelain kosmid, ada kelompok vektor sintetis yang merupakangabungan antara plasmid dan fag l. Vektor yang dinamakan fasmidini membawa segmen DNA l yang berisi tempat att. Tempat attdigunakan oleh DNA l untuk berintegrasi dengan kromosom selinang pada fase lisogenik.

Vektor YACs

Seperti halnya kosmid, YACs (yeast artifisial chromosomesatau kromosom buatan dari khamir) dikonstruksi denganmenggabungkan antara DNA plasmid dan segmen tertentu DNAkromosom khamir. Segmen kromosom khamir yang digunakanterdiri atas sekuens telomir, sentromir, dan titik awal replikasi.

YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjanglebih dari 1 Mb. Oleh karena itu, YACs dapat digunakan untukmengklon gen utuh manusia, misalnya gen penyandi cystic fibrosisyang panjangnya 250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs sangatberguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukanpada Proyek Genom Manusia.

Vektor YEps

Vektor-vektor untuk keperluan kloning dan ekspresi genpada Saccharomyces cerevisiae dirancang atas dasar plasmid alamiberukuran 2 μm, yang selanjutnya dikenal dengan nama plasmid 2mikron. Plasmid ini memiliki sekuens DNA sepanjang 6 kb, yangmencakup titik awal replikasi dan dua gen yang terlibat dalamreplikasi.

76

Vektor-vektor yang dirancang atas dasar plasmid 2 mikrondisebut YEps (yeast episomal plasmids). Segmen plasmid 2mikronnya membawa titik awal replikasi, sedangkan segmenkromosom khamirnya membawa suatu gen yang berfungsi sebagaipenanda seleksi, misalnya gen LEU2 yang terlibat dalam biosintesisleusin. Meskipun biasanya bereplikasi seperti plasmid padaumumnya, YEps dapat terintegrasi ke dalam kromosom khamirinangnya.

Plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens

Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yangdapat digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi, ada suatubakteri, yaitu Agrobacterium tumefaciens, yang membawa plasmidberukuran 200 kb dan disebut plasmid Ti (tumor inducing ataupenyebab tumor). Bakteri A. tumefaciens dapat menginfeksitanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanamanmonokotil, khususnya padi. Ketika infeksi berlangsung bagiantertentu plasmid Ti, yang disebut T-DNA, akan terintegrasi kedalam DNA kromosom tanaman, mengakibatkan terjadinyapertumbuhan sel-sel tanaman yang tidak terkendali. Akibatnya, akanterbentuk tumor atau crown gall.

Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yangdisisipkan pada daerah T-DNA dapat mengintegrasikan gentersebut ke dalam DNA tanaman. Gen target ini selanjutnya akandieskpresikan menggunakan sistem DNA tanaman.

Dalam prakteknya, ukuran plasmid Ti yang begitu besarsangat sulit untuk dimanipulasi. Namun, ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan dari bagian-bagian lain plasmid Ti, integrasidengan DNA tanaman masih dapat terjadi asalkan T-DNA danbagian lainnya tersebut masih berada di dalam satu sel bakteri A.tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmenDNA asing hanya dilakukan pada T-DNA dengan cara sepertihalnya yang dilakukan pada plasmid E.coli. Selanjutnya, plasmid T-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalam selA. tumefaciens yang membawa plasmid Ti tanpa bagian T-DNA.

77

Perbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-genpembentuk tumor yang terdapat pada T-DNA.

Baculovirus

Baculovirus merupakan virus yang menginfeksi serangga. Salah satuprotein penting yang disandi oleh genom virus ini adalah polihedrin,yang akan terakumulasi dalam jumlah sangat besar di dalam nukleisel-sel serangga yang diinfeksi karena gen tersebut mempunyaipromoter yang sangat aktif. Promoter ini dapat digunakan untukmemacu overekspresi gen-gen asing yang diklon ke dalam genombacilovirus sehingga akan diperoleh produk protein yang sangatbanyak jumlahnya di dalam kultur sel-sel serangga yang terinfeksi.

Vektor Kloning pada Mamalia

Vektor untuk melakukan kloning pada sel-sel mamalia jugadikonstruksi atas dasar genom virus. Salah satu di antaranya yangtelah cukup lama dikenal adalah SV40, yang menginfeksi berbagaispesies mamalia. Genom SV40 panjangnya hanya 5,2 kb. Genom inimengalami kesulitan dalam pengepakan (packaging) sehinggapemanfaatan SV40 untuk mentransfer fragmen–fragmen berukuranbesar menjadi terbatas.Retrovirus mempunyai genom berupa RNA untai tunggal yangditranskripsi balik menjadi DNA untai ganda setelah terjadi infeksi.DNA ini kemudian terintegrasi dengan stabil ke dalam genom selmamalia inang sehingga retrovirus telah digunakan sebagai vektordalam terapi gen. Retrovirus mempunyai beberapa promoter yangkuat.

5.3. Vektor ekspresiVektor ekspresi merupakan vektor yang mana disamping

dapat bereplikasi sendiri juga mengandung sinyal-sinyal ekspresi,sehingga gen yang di klon juga akan ditranskripsi menjadi mRNA dankemudian ditranslasi menjadi protein. Vektor ekspresi memungkinkanuntuk produksi protein hewan, manusia atau tanaman di dalam bakteri.Tiga sinyal ekspresi yang paling penting adalah : (1) Promotor

78

transkripsi, (2) terminator transkripsi, dan (3) tempat pengikatanribosom. Selain sistem vektor ekspresi untuk bakteri, juga terdapatbeberapa sistem vektor ekspresi untuk Saccaromyces cerevisiae dan vektorekspresi untuk Pichia pastoris. Kedua jenis sistem ekspresi ini terbuktidapat memproduksi protein eukariot dengan hasil yang tinggi danberfungsi seperti protein natif (asli).

Tahapan-tahapan kloning.

Tahapan pengerjaan kloning DNA/gen adalah sebagai berikut :

1. Isolasi/ preparasi DNA sisipan dan DNA vektor

2. Pemotongan molekul DNA

3. Penggabungan fragmen DNA sisipan ke DNA vektor (prosesligasi)

4. Transformasi (proses memasukkan molekul DNA plasmidrekombinan ke dalam sel inang.

5. Identifikasi sel yang mengandung DNA plasmid rekombinan.

6. Isolasi DNA rekombinan

1. Isolasi/ preparasi DNA

Sebelum disisipkan ke suatu DNA vektor, maka DNAsisipan harus diisolasi terlebih dulu. Beberapa prinsip isolasi DNAsudah dijelaskan di atas. Selain itu DNA sisipan juga dapatdiperoleh dari produk PCR.

2. Pemotongan DNA dengan enzim restriksiMolekul plasmid yang digunakan sebagai vektor harus

dipotong untuk membuka DNA lingkaran, sehingga molekul DNA

79

asing bisa disisipkan. Enzim restriksi merupakan suatuendonuklease yang mengenal urutan spesifik pada molekul DNAdan memotong pada urutan yang spesifik tersebut. Sisi pengenalanenzim restriksi umumnya merupakan suatu polindrom, dimanaurutan nukleotida rantai atas sama dengan urutan nukleotida rantaibawah. Misalnya :

Enzim restriksi hanya terdapatpada beberapa bakteri, danberfungsi untuk mempertahankan diri dari infeksi bakteriofaga. Contohbeberapa enzim restriksi dan sisi pengenalannya:

Tabel 5.1. Beberapa enzim restriksi dan urutanpengenalnya

Nama enzim Sumber bakteri Urutan pengenalan

AluI Arthrobacter luteus AG↓CT

BamHI Bacillus G↓GATCC

ClaI Caryophanon latum AT↓GCAT

EcoRI Escherichia coli G↓AATTC

HaeIII Haemophilus aegyptius GG↓CC

HindIII Haemophylus influenzae A↓AGCTT

KpnI Klebsiella pneumonia GGTAC↓C

NotI Nocardia otidis-caviarum GC↓GGCCGC

PstI Providencia stuartii CTGCA↓G

XbaI Xanthomonas bradii T↓CTAGA

XhoI Xanthomonas holcicola C↓TCGAG

80

3. Penyambungan DNA dengan enzim ligase.Apabila dua molekul DNA mpunyaiujung rantai

tunggal yang komplementer, maka kedua ujung DNA tersebutdapat berpansangan, kemudian enzim ligase dapat membentukikatan fosfodiester antara kedua molekul DNA tersebut. Reaksienzimatik ini memerlukan energi dari ATP.

Gambar 5.2 penyambungan dengan enzim ligase

4. Transformasi sel

Untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri, seltersebut harus diberi perlakukan agar menjadi sel kompeten, yaitusel yang mampu menerima DNA dari luar. Kemampuan palingtinggi untuk memasukkan DNA dari luar terjadi pada sel yangberada dalam fase logaritmik, yaitu pada waktu pertumbuhan selsedang cepat. Perlakukan dengan CaCl2 menyebabkan dinding selmenjadi lebih permeabel dan bermuatan positif, sehingga dapatmenarik DNA yang bermuatan negatif.

Transformasi (pengambilan DNA oleh sel bakteri) dapatdilakukan dengan dua cara, yaitu : (1) dengan cara heat shock (kejutanpanas) dimana campuran sel dan DNA plasmid rekombinandidinginkan dalam waktu yang lama, kemudian di panaskandengan segera pada suhu 42 oC. (2) dengan cara elektroporasi(kejutan listrik) menggunakan suatu alat yang dialiri arus listrik.

81

5. Seleksi klon rekombinan

Sel inang yang telah ditansformasi kemudian ditumbuhkanpada media padat yang sesuai pada suhu 37 oC. Setelah inkubasisemalam, maka kita akan mendapatkan koloni-koloni bakteri yangtumbuh di media padat. Satu koloni bakteri terdiri dari jutaan selbakteri yang mempunyai sifat yang sama. Sehingga klon-klon iniperlu dipilih untuk menentukan mana koloni bakteri yangmembawa plasmid rekombinan. Terdapat beberapa cara seleksiklon tekombinan, diantaranya :

1. Seleksi berdasarkan sifat resistan terhadap antibiotik.Pada seleksi ini plasmid yang digunakan mempunyai duagen resistan terhadap antibiotik. Misalnya gen Ampr (gen

resistan ampisilin dan gen Tetr (gen resistan terhadaptetraciclin). Penyisipan DNA asing dilakukan di dalam genTetr, sehingga bila mengandung

sisipan DNA asing gen Tetr tidak akan aktif. Bakteritransforman pertama

ditumbuhkan pada media yang mengandung Ampicilin,sehingga koloni yang tumbuh adalah koloni yangmembawa plasmid. Kemudian koloni-koloni inidipindahkan ke media yang mengandung tetrasiklin,sehingga koloni yang mengandung DNA sisipan (dimanagen Tetr-nya sudah tidak aktif) tidak akan tumbuh. Makakita akan tahu koloni maka yang mengandung DNAsisipan.

2. Seleksi dengan melibatkan gen LacZ. Pada seleksi ini

plasmid yang digunakan mempunyai gen Ampr dan genLacZ. Gen LacZ mengkode enzim β- galakotosidase yangmengkatalisis pemecahan laktosa menjadi glukosa dangalaktosa. Penyisipan DNA dilakukan di dalam gen LacZini, sehingga bila mengandung DNA sisipan maka gen

82

LacZ akan inaktif. Seleksi dilakukan denganmenambahkan substrat analog laktosa yaitu X-gal yangakan dipecah oleh enzim β-galakotosidase menjadi senyawayang berwarna biru (5-bromo-4 kloro-3-indigo). IPTG(isopropil tiogalaktopiranosida) digunakan sebagaiinducer. Bakteri transforman ditumbuhkan pada mediayang mengandung Ampicilin, X-gal dan IPTG. koloni yangtumbuh adalah koloni yang membawa plasmid. Akantetapi terdapat dua jenis koloni, yaitu yang berwarnaputih dan biru. Koloni yang berwarna biru menandakanterdapat senyawa 5-bromo-4 kloro-3-indigo (hasilpenguraian X-gal oleh β-galaktosidase), artinya gen LacZnyaaktif sehingga tidak ada DNA sisipan. Sedangkankoloni yang berwarna putih, adalah koloni yang tidakmenghasilkan senyawa berwarna, gen LacZ inaktif danmengandung DNA sisipan.

6. Isolasi DNA plasmid rekombinan.

DNA plasmid rekombinan, kemudian dapat diisolasi untukkepentingan pengerjaan berkutnya dengan menggunakan metodayang sudah dijelaskan di atas. DNA ini selanjutnya dapat dikarakterisasi, misalnya disekuensing untuk menentukan urutannukleotidanya atau dapat juga di potong dengan enzim restriksikemudian di kloning ke vektor ekspresi.

83

6Perpustakaan Gen

Pokok bahasan di dalam bab ini menguraikan pengertian dan macamperpustakaan gen, besarnya perpustakaan gen, prinsip kerjaelektroforesis, dan prosedur skrining DNA rekombinan dariperpustakaan gen. Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab inimahasiswa diharapkan mampu menjelaskan

1. pengertian perpustakaan gen,

2. perbedaan antara perpustakaan genom dan perpustakaancDNA,

3. cara menghitung besarnya perpustakaan gen yang diperlukan,

4. prinsip kerja dan kegunaan elektroforesis, dan

5. macam-macam prosedur skrining DNA rekombinan dariperpustakaan gen.

Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapatmempelajari pokok bahasan ini dengan lebih baik adalah pengertianteknologi DNA rekombinan beserta tahapan-tahapan kloning genseperti telah dibahas pada Bab sebelumya

6.1. Pengertian dan Macam Perpustakaan Gen

Suatu perpustakaan gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuens(urutan) DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah diklonke dalam vektor tertentu untuk memudahkan pemurnian,penyimpanan, dan analisisnya. Pada dasarnya terdapat dua macamperpustakaan gen yang dapat dikonstruksi, bergantung kepada sumberDNA digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA

84

genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebutperpustakaan genom. Sementara itu, jika DNA yang digunakanmerupakan hasil transkripsi balik suatu populasi mRNA seperti yangumum dijumpai pada eukariot, maka perpustakaan yang diperolehdinamakan perpustakaan cDNA.

Hal yang perlu diperhatikan ketika kita melakukan konstruksi suatuperpustakaan gen adalah bahwa perpustakaan tersebut harusmerepresentasikan semua gen yang ada di dalam sumber DNA asalnya.Dengan perkataan lain, suatu perpustakaan gen dikatakan representatifapabila berisi semua sekuens aslinya. Selain itu, jika suatu perpustakaantidak mengandung klon dalam jumlah yang mencukupi, maka sangatdimungkinkan hilangnya beberapa gen tertentu.

Untuk mendapatkan perpustakaan genom yang representatif, DNAgenomik harus dimurnikan dan kemudian dipotong secara acakmenjadi fragmen-fragmen yang ukurannya sesuai dengan keperluankloning menggunakan vektor yang dipilih. Fraksionasi sel pada eukariotakan mengurangi kontaminasi oleh DNA organel (mitokondria,kloroplas). Oleh karena itu, pemurnian DNA genomik eukariotbiasanya dilakukan dengan terlebih dahulu mengisolasi nukleus danmenghilangkan protein, lemak, serta makromolekul lain yang tidakdiinginkan dengan memberikan protease dan melakukan ekstraksifenol-kloroform. Sementara itu, DNA prokariot dapat diekstraksilangsung.

DNA genomik hasil pemurnian tersebut selanjutnya dipotong-potongsecara acak. Pada dasarnya ada dua cara pemotongan, yaitupemotongan fisik seperti sonikasi dan digesti menggunakan enzimrestriksi. Pemotongan dengan enzim restriksi akan menghasilkanfragmen-fragmen dengan ujung tertentu (lihat Bab IX). Untukmendapatkan fragmen-fragmen dengan ukuran relatif besar dilakukandigesti parsial dengan cara mengurangi jumlah enzim restriksi atauwaktu pemotongan yang digunakan Dengan digesti parsial ini enzimrestriksi tidak akan memotong DNA genomik pada setiap tempatpengenalan yang ada sehingga akan diperoleh fragmen-fragmen DNAgenomik yang relatif panjang.

85

Besarnya Perpustakaan Gen

Besarnya suatu perpustakaan gen dilihat dari banyaknya rekombinanyang terdapat di dalamnya. Untuk menghitung banyaknya rekombinanyang harus ada di dalam suatu perpustakaan gen digunakan rumussebagai berikut.

N = ln (1 – P) / ln (1 – f)

Pada rumus tersebut N adalah banyaknya rekombinan yang harus adadi dalam perpustakaan gen, P peluang yang diinginkan, dan f nisbahpanjang fragmen sisipan terhadap panjang genom. Sebagai contoh,untuk mendapatkan fragmen sisipan berukuran 20 kb (20.000 pb)dengan peluang 0,99 diperlukan perpustakaan gen yang besarnyaberbeda antara E .coli dan manusia.

N E. coli = ln (1 – 0,99) / ln (1 – 20.000 / 4,6 x 106) = 1,1 x 103

N manusia = ln (1 – 0,99) / ln (1 – 20.000 / 3 x 109) = 6,9 x 105

Kita bisa melihat bahwa banyaknya rekombinan yang diperlukan untukmendapatkan fragmen dengan ukuran dan peluang yang sama ternyataberbeda, bergantung kepada panjang genom organismenya. Pada E. colidengan panjang genom yang lebih pendek (4,6 x 106) daripada panjanggenom manusia (3 x 109) diperlukan rekombinan yang lebih sedikit (1,1x 103) daripada rekombinan untuk perpustakaan gen manusia (6,9 x105).

Perhitungan seperti tersebut di atas juga dapat menjelaskan alasanbahwa apabila genom suatu prokariot dengan fragmen sisipansepanjang 5 hingga 10 kb diklon menggunakan plasmid akanmenghasilkan perpustakaan gen yang baik meskipun hanya membawabeberapa ribu rekombinan. Demikian pula, untuk genom-genom yangbesar cukup diperlukan sedikit rekombinan meskipun fragmensisipannya panjang. Penggunaan vektor yang dapat mengklon fragmen-fragmen panjang, misalnya kosmid dan YAC, memungkinkan

86

konstruksi perpustakaan genom dengan jumlah rekombinan yang tidakterlalu besar.

Elektroforesis

Sebelum fragmen-fragmen DNA genomik hasil digesti restriksidiligasikan ke dalam suatu vektor tertentu (lihat Bab IX) terlebihdahulu perlu dilakukan pemeriksaan atas keberhasilan digesti tersebut.Untuk melihat keberhasilan digesti restriksi, DNA divisualisasikanmenggunakan teknik elektroforesis. Namun, elektroforesis sendirisebenarnya bukanlah teknik visualisasi DNA semata-mata karenateknik ini dapat juga digunakan untuk keperluan isolasi dan pemurnianfragmen DNA tertentu.

Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-molekulbermuatan listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatanlistriknya. Khusus untuk DNA, pemisahan tidak didasarkan atasperbedaan muatan listriknya, tetapi menurut ukuran dan konformasiatau struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan adalah agarosadan poliakrilamid. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan sampelDNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa(pb), sedangkan gel poliakrilamid digunakan untuk fragmen-fragmenDNA yang lebih kecil.

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akanbermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makinbesar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Jika hubunganantara ukuran molekul dan laju migrasi dipetakan dalam suatu grafiklogaritmik, maka akan diperoleh kurva linier. Oleh karena itu, kitadapat memperkirakan berat molekul suatu fragmen DNA denganmelihat atau membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasifragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahuiukurannya.

Fragmen-fragmen DNA divisualisasikan di bawah sinar ultravioletsetelah terlebih dulu direndam di dalam larutan etidium bromid,pewarna yang akan menyisip atau melakukan interkalasi di sela-selabasa DNA. Perendaman dilakukan setelah migrasi dianggap cukup

87

untuk dihentikan. Fragmen DNA akan nampak sebagai pita berwarnamerah dengan posisi migrasi yang sesuai dengan berat molekulnya.Cara ini dapat memvisualisasikan fragmen DNA hingga sekecil 0,05 µg.

Seperti telah dikatakan di atas bahwa selain karena perbedaanukurannya, laju migrasi DNA pada gel elektroforesis juga ditentukanoleh konformasi molekulnya. DNA dengan bentuk covalently closedcircular (CCC) akan bergerak paling cepat, disusul berikutnyakonformasi open circular (OC), dan yang terakhir linier. Oleh karenaperbedaan konformasi menyebabkan perbedaan laju migrasi, makapenentuan ukuran suatu fragmen DNA selalu dilakukan padakonformasi linier.

Marilah kembali kita bicarakan visualisasi fragmen-fragmen DNAgenomik hasil digesti restriksi. DNA genomik, baik yang utuh maupunyang telah dipotong menggunakan enzim restriksi, perludivisualisasikan pada gel elektroforesis. Begitu pula halnya denganvektor utuh dan vektor yang telah dilinierkan serta vektor rekombinanhasil ligasi dengan fragmen DNA genomik (lihat Bab IX). Selain itu,molekul DNA marker yang telah diketahui ukurannya jugadimigrasikan sebagai standar untuk menentukan ukuran sampel-sampelDNA yang kita analisis.

DNA genomik utuh pada lajur 2 nampak sebagai pita dengan lajumigrasi paling lambat. Jika dibandingkan dengan marker, akan terlihatbahwa ukurannya lebih besar dari 21,3 kb. Berikutnya pada lajur 3,DNA genomik yang telah dipotong menggunakan enzim restriksitertentu tervisualisasi sebagai pita melebar (smear). Pita ini merupakankumpulan fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan tersebut yangsangat bervariasi ukurannya. Sementara itu, pada lajur 4 dan 5 terlihatjelas perbedaan laju migrasi antara plasmid utuh yang mempunyaikonformasi CCC dan plasmid linier hasil pemotongan dengan suatuenzim restriksi. Plasmid linier bergerak lebih lambat daripada plasmidCCC, dan posisi migrasinya digunakan untuk menentukan ukurannya(sekitar 4,9 kb). Terakhir pada lajur 6, plasmid rekombinan hasil ligasidengan fragmen DNA genomik menunjukkan ukuran yang lebih besardari 4,9 kb. Hal ini terlihat dari migrasinya yang lebih lambat daripadaplasmid linier tanpa fragmen sisipan.

88

Prosedur Skrining

Proses untuk mengidentifikasi suatu klon yang membawa gen tertentuyang diinginkan di antara sejumlah besar klon lainnya di dalamperpustakaan gen dinamakan skrining. Pada dasarnya skriningdilakukan dengan teknik hibridisasi menggunakan suatu molekulpelacak DNA (DNA probe). Beberapa pengetahuan mengenai genyang akan dicari, atau produknya, diperlukan dalam pembuatanmolekul pelacak bagi gen tersebut. Di dalam proses skrining, molekulpelacak akan menempel pada sekuens DNA yang komplementerdengannya sehingga klon yang diinginkan dapat dikenali.

Apabila diperoleh protein yang merupakan produk gen tertentu dalamjumlah yang memungkinkan untuk penentuan sekuens asam aminonya,maka dari informasi sekuens asam amino ini dapat disusun beberapakemungkinan sekuens DNA yang menyandinya. Selanjutnya, informasisekuens DNA yang disusun dapat digunakan untuk membuat molekulpelacak.

Hibridisasi koloni dan plak

Seleksi transforman dengan vektor rekombinan yang dikonstruksimenggunakan vektor λ dilakukan dengan melihat terbentuknya plakpada medium kultur sel inang. Sementara itu, seleksi transformandengan vektor rekombinan yang dikonstruksi menggunakan plasmiddilakukan dengan melihat pertumbuhan koloni pada medium seleksi(lihat Bab XI). Namun, prosedur skrining bagi kedua sistem kloningtersebut pada dasarnya sama saja.

Langkah pertama adalah mentransfer DNA di dalam plak atau kolonike suatu membran nilon atau nitroselulosa. Untuk plak, DNA λdapat langsung diperoleh dan ditransfer ke membran karena plakmerupakan area tempat keberadaan bakteri inang yang mengalami lisis.Akan tetapi, jika yang ditransfer ke membran adalah koloni-kolonibakteri, maka perlu dilakukan lisis sel bakteri untuk mendapatkanDNA. Sebelumnya, dibuat replika bagi koloni-koloni yang ditransfertersebut di dalam medium kultur yang baru.

89

Lisis sel bakteri biasanya dilakukan dengan merendam membran nilondi dalam sodium dodesil sulfat (SDS) dan protease. Selanjutnya, DNAyang keluar dari sel didenaturasi menggunakan alkali sehingga diperolehDNA untai tunggal, yang kemudian difiksasi ke membran denganpengeringan atau iradiasi UV. Membran dicelupkan ke dalam larutanpelacak DNA dan diinkubasi agar terjadi hibridisasi antara pelacak,yang juga berupa untai tunggal, dan beberapa DNA untai tunggal yangkomplementer dengannya. Pelacak DNA biasanya diberi labelradioaktif.

Setelah hibridisasi, membran dicuci untuk menghilangkan sisa-sisapelacak yang tidak terhibridisasi. Beberapa DNA di dalam membranyang mengalami hibridisasi divisualisasikan menggunakanautoradiografi dengan sinar X. Dengan membandingkan posisi DNAyang terhibridisasi oleh pelacak dengan posisi koloni pada kulturreplika akan diketahui koloni-koloni yang membawa DNA rekombinandengan fragmen sisipan yang diinginkan.

Gambar 6.1 Prinsip Dasar hibridisasi koloni

Skrining ekspresi

Pada dasarnya skrining ekspresi sama dengan skrining perpustakaangen melalui hibridisasi koloni/plak. Hanya saja pada skrining ekspresi,bukannya DNA yang dideteksi pada membran, melainkan protein yangmerupakan produk suatu gen yang diinginkan. Sebagai pelacakdigunakan antibodi, sedangkan untuk mengetahui terjadinya hibridisasidigunakan antibodi lain atau bahan kimia yang dapat mengenalinya.

90

Dengan cara seperti ini dapat ditentukan koloni/plak yangmengekspresikan protein yang dikehendaki.

Penghambatan dan pelepasan translasi oleh hibrid

Klon-klon cDNA dapat digunakan untuk menghibridisasi mRNA yangdiisolasi. Setelah dilakukan hibridisasi, populasi mRNA langsungditranslasi menjadi protein. Translasi tidak akan terjadi pada segmenmRNA yang terhibridisasi oleh cDNA, atau dengan perkataan lain,translasi telah dihambat oleh hibrid (hybrid-arrest translation).Dengan mendeteksi produk-produk protein yang tidak terbentuk dapatdiketahui cDNA yang menghambat translasi suatu protein. Artinya,cDNA ini dapat dipastikan membawa sekuens yang menyandi proteinyang tidak ditranslasi tersebut.

Cara kebalikannya juga dapat dilakukan. Hibrid-hibrid antara cDNAdan mRNA dimurnikan. Kemudian, mRNA dilepaskan dari hibriddengan pemanasan atau menggunakan agen denaturasi. Setelah itu,mRNA ditranslasi (hybrid-release translation) untuk menghasilkanproduk protein tertentu. Dengan mengetahui protein yang terbentukdapat diketahui klon cDNA yang membawa sekuens penyandi proteintersebut. Secara skema perbandingan kedua prosedur skrining tersebutdapat dilihat pada Gambar 10.4.

Southern blotting dan Northern blotting

Kedua prosedur skrining ini digunakan untuk mendeteksi keberadaansekuens tertentu tetapi tidak dilakukan langsung pada klon-klonrekombinannya. Skrining didasarkan atas hasil hibridisasi antaramolekul asam nukleat dan pelacaknya pada gel agarosa. Istilah Southernblotting berasal dari nama penemunya, sedangkan Northern blottingdiekstrapolasi dari nama tersebut. Jika Southern blotting ditujukanuntuk DNA, Northern blotting digunakan untuk hibridisasi RNA.

Tahap pertama untuk kedua prosedur tersebut adalah migrasi molekulasam nukleat pada gel agarosa. Khusus untuk Southern blotting,dilakukan denaturasi DNA (biasanya menggunakan alkali) sehinggaakan diperoleh DNA untai tunggal. Pita-pita untai tunggal, baik DNA

91

maupun RNA, kemudian dipindahkan ke membran nilon ataunitroselulosa seperti halnya pada hibridisasi koloni.

Gambar 6.2 Analisis Sothern blotting

Begitu asam nukleat dipindahkan ke membran, tahap-tahap selanjutnyapada kedua prosedur skrining tersebut sama, yaitu fiksasi asam nukleatpada membran, hibridisasi dengan pelacak, pencucian sisa pelacak, dandeteksi fragmen yang mengalami hibridisasi menggunakanautoradiografi. Di antara tahap-tahap tersebut kondisi hibridisasimerupakan faktor yang paling memerlukan perhatian. Jika antarapelacak dan sekuens target terdapat homologi yang sangat tinggi(mendekati atau sama dengan 100%), maka dapat diberlakukan kondisihibridisasi yang ketat, yaitu dengan suhu hibridisasi tinggi dankonsentrasi garam rendah pada bufer hibridisasi. Sebaliknya, jikasekuens pelacak tidak terlalu homolog dengan sekuens target, makaketetatan kondisi hibridisasi harus diturunkan sampai pada tingkatanyang memungkinkan terbentuknya hibrid-hibrid yang kurangsempurna. Namun, jika keketatannya diturunkan terlalu banyak,fragmen pelacak mungkin akan berikatan dengan sekuens-sekuens lainyang tidak spesifik.

92

Southern blotting terhadap fragmen-fragmen DNA genomik yangdiklon dapat dilakukan menggunakan pelacak berupa cDNA untukmencari bagian-bagian klon genomik yang sesuai dengan fragmencDNA pelacak. Jika fragmen DNA genomik yang membawa suatu gentertentu dapat dideteksi, maka akan diketahui ukuran fragmen yangmembawa gen tersebut. Blot-blot dengan sampel DNA atau RNA dariorganisme yang berbeda (zoo blots) dapat menunjukkan betapakonservatifnya suatu gen di antara spesies yang satu dan lainnya.

93

7Rekayasa Genetik dan Bioteknologi

Kita sudah mempelajari bagaimana gen di kloning, dan kita juga telahmelihat beberapa teknik yang digunakan pada rekayasa genetika.Sekarang kita akan melihat beberapa aplikasi dari teknologi DNArekombinan.

7.1. PENELITIAN DASAR

Pengaruh langsung teknologi DNA rekombinan adalahterhadap penelitian dasar. Terdapat dua topik utama dimana yangdapat dipelajari dengan teknologi ini, yaitu: pertama untuk mempelajarigen yang bertanggung jawab terhadap fungsi tertentu dari sel dan keduauntuk menemukan lokasi dimana produk suatu gen bekerja.

Sebagai contoh: penyakit genetik cystic fibrosis (kerusakan sisitempencernaan). Bukti mengatakan bahwa kerusakan pada satu genbertanggung jawab terhadap penyakit ini. Untuk mengerti penyakit inimaka sangat penting untuk mengetahui bagaimana gen normalnya.Protein apa yang dikodenya? Bagaimana ekspresinya diregulasi?Mutasinya dimana? Untuk menjawab pertanyaan ini kita harusmengkloning gen tersebut.

Aplikasi umum lain dari teknologi DNA rekombinan adalah dariproses yang berlawanan. Misalkan kita mempelajari adanya populasimRNA pada sel hati yang terpapar terhadap senyawa kimia tertentu.Kita menemukan mRNA tertentu hanya diekspresikan setelahpemaparan terhadap zat kimia tersebut. Logikanya mRNA inimengkode protein yang terlibat pada respon sel terhadap racun.Apakah fungsi spesifik dari gen tersebut? Apakah mengkode proteinyang mendetoksifikasi senyawa kimia? Terdapat berbagai kemungkinan.Bagaimana rekayasa genetika dapat mengetahui fungsi dari gen ini?

Tahap pertama adalah mengkloning gen tersebut. Kita dapatmengkloning gen dari mRNA dengan merubahnya menjadi urutanDNA terlebih dahulu melalui proses RT-PCR, dan kemudianmenentukan urutan nukleotida dari gen tersebut. Urutan nukleotida

94

gen dapat digunakan untuk memprediksikan urutan asam amino yangdikodenya. Dengan mengetahui urutan asam amino dari protein, dapatmembantu kita untuk mengidentifikasi, memurnikan danmenentukan fungsinya. Urutan DNA juga dapat dibandingkandengan urutan yang sudah ditemukan sebelumnya yang sudahdipublikasikan.

7.2. PROYEK ”HUMAN GENOME”

Proyek ”human genome” atau penentuan urutan nukleotidadalam genom manusia, merupakan proyek yang besar. Dapat kitabayangkan bagaimana menentukan urutan DNA genommanusia yang berjumlah 9 milyar pasang basa? Untukmendapatkan urutan keseluruhan genom manusia maka pertamaperlu dibuat peta restriksinya. Genom manusia dipotong-potongdengan enzim restriksi, potongan ini kemudian di kloning danditentukan urutan nukleotidanya.

Sekarang timbul pertanyaan: untuk apa urutan DNAmanusia ditentukan? Dengan diketahuinya urutan DNA manusiamaka kemudian dapat dipelajari lokasi gen dan nama gen (misalnyagen A di kromosom 1 pada posisi sekian). Data ini akanmemberikan petunjuk ke arah produk dari gen tersebut. Bilaproduknya diketahui, kemudian bisa dipelajari fungsinya. Hal iniakan memberikan manfaar besar di bidang kesehatan. Bila bentukgen normal diketahui, maka untuk mengetahui apakah ada gen yangrusak akan lebih mudah.

Beberapa urutan genom dari organisme lain juga telahditentukan urutannya. Diantaranya E. coli, ragi S. cerevisieae, jamurArabidopsis thaliana, dan cacing Caenorhabditis elegans. Masing-masingorganisme ini sangat penting untuk penelitian, dan denganmengetahui urutan genomnya akan membantu penelitian biologimolekuler.

95

7.3. APLIKASI DIBIDANG MEDIK

Salah satu promosi akibat perkembangan teknologi DNA rekombinanadalah peningkatan prosedur dibidang medis.Sebagai contoh, perusahaan farmasi menghabiskan banyak uanguntuk penelitian pengembangan produk farmasi. Mereka melakukan inikarena besarnya pangsa pasar dari produk-produk medis tersebut.

Produk farmasi.

Kita sudah melihat contoh produksi insulin rekombinan.Bioteknologi telah menyediakan metoda untuk produksi insulinyang lebih murah, mengurangi resiko penggunaan produk akhir danmenghilangkan ketergantungan terhadap organ binatang. Disamping itu produk farmasi lain juga sudah diproduksimenggunakan teknologi ini (Tabel 7.1). Tidak seperti insulin, tanpaadanya teknologi DNA rekombinan produk ini tidak akan pernahada atau sangat mahal.

96

Tabel 7.1. Beberapa produk farmasi hasil teknologi DNA rekombinan

Produk KegunaanHormon adenocorticotropic Pengobatan penyakit rematik

Alfa dan gamma interferon Terapi kanker dan infeksi virus

Sel beta faktor pertumbuhan Penggobatan kelainan imun

Erytropoietin Pengobatan anemia

Hormon pertumbuhan manusia Terapi defisiensi pertumbuhan padaanak-anak

Lympotoxin Antitumor

Vaksin hepatitis B Mencegah hepatitis B

Interleukin-2 Pengobatan kanker, merangsangsistem imun

Antibodi monoclonal Terapi kanker dan rejeksitransplantasi

Nerve growth factor Memperbaiki syaraf yang rusak

Praurokinase Antikoagulan; terapi serangan jantung

Platelet-derived growt factor Mengobati artherosclerosis

Diagnosa penyakit

Diagnosis yang akurat dan cepat merupakan sesuatu yangmutlak pada diagnosa penyakit. Terdapat dua cara diagnosapenyakit menggunakan teknologi DNA rekombinan, yaitu (1)melibatkan penggunaan antibodi, (2) berdasarkan teknikhibridisasi DNA. Konsepnya adalah: jika seseorang terinfeksivirus tertentu maka materi genetik dari virus itu akan terdapat didalam tubuhnya dan berbeda dengan DNA manusia. DNA dapat

97

di isolasi dari darah pasien, yang mengandung DNA virus danDNA manusia. Jika kita mengetahui virus apa yang akan kita caridan jika urutan DNA virus ini sudah tersedia (di internet) makakita dapat merancang oligonukleotida pendek (probe) yang dilabelradioaktif dan akan dapat berhibridisasi dengan DNA virus. Jadiapabila terdapat DNA virus dalam sampel, maka probe akanmenempel dan dapat dilihat dengan autoradiografi.

Masalah yang dihadapi dengan teknik ini adalah bila levelinfeksinya rendah, hanya terdapat sedikit DNA virus, sehinggasulit dideteksi. Masalah ini dapat di atasi dengan adanya teknikPCR. PCR digunakan untuk memperbanyak DNA. Primer PCRdapat dirancang, yang akan memperbanyak potongan DNA virus.Setelah itu produk PCR dihibridisasi menggunakan probeseperti diatas. Diagnosa ini sangat akurat, spesifik dan cepatdibandingkan teknik tradisional seperti pengkulturan organisme.

Diagnosa dan pengobatan penyakit genetik

Prinsip diagnosa berdasarkan teknik hibridisasi dapatdigunakan untuk diagnosa penyakit genetik. Misalkan mutasispesifik diketahui merupakan penyebab dari penyakit tertentu,seperti penyakit Alzheimer. Bila kita mengetahui mutasispesifik tersebut, maka kita dapat merancang probe DNA yangdapat berhibridisasi untuk mendeteksi mutasi tersebut. Sehinggadiagnosa genetik dapat dilakukan menggunakan teknik yang samadengan yang digunakan untuk diagnosa penyakit infeksi.

Bila perbedaan genetik dapat dideteksi, kerusakan genetikdapat didiagnosa, maka mungkin juga dapat diperbaiki. Proses inidikenal dengan terapi gen, yang akan dibahas pada bab 8.

Vaksin subunit rekombinan

Vaksin jenis ini mengandung protein antigen patogenyang diproduksi dengan teknologi DNA rekombinan. Contohnyavaksin hepatitis B yang digunakan untuk mencegah inveksihepatitis B. Antigen virus hepatitis B yang telah diketahui dapat

98

menginduksi antibodi protektif adalah HbsAg (Hepatitis B SurfaceAntigen). Gen pengkode HbsAg di klon dan di ekspresikan di E.coli, ragi (Saccaromyces cerevisiae). Protein HbsAg yang diperoleh dariragi digunakan sebagai vaksin rekombinan pertama utnukperdagangan pada tahun 1986, dan harganya lebih murahdaripada vaksin Hepatitis B konvensional.Keunggulan vaksin subunit rekombinan:

1. aman, hanya mengandung antigen tunggal terhadap imunitasyang diharapkan.

2. tidak menimbulkan penyakit.

3. tidak ada kemungkinan terkontaminasi patogen lain.

4. jarang menginduksi reaksi yang tidak diinginkan.

5. menjamin penyediaan kontinu dan mudah dari sumber yangaman.

6. harga murah

7. mencegah transmisi penyakit dengan tidak sengaja padapegawai produksi dan pemakai.

Kerugian vaksin subunit rekombinan:

Protein antigen dapat mempunyai konformasi yangberbeda dibandingkan bila terletak pada sel atau virus asal. Hal inidapat ditanggulangi dengan mentargentkan antigen rekombinanpada permukaan suatu sel mikroorganisme. Vaksin ini disebutdisebut dengan vaksin rekombinan hidup karier.

99

FORENSIK

Salah satu yang sudah dipublikasikan secara legal adalahpenggunaan ”DNA fingerprinting”. Teknik ini berdasarkan padaaplikasi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) yangberdasarkan kenyataan bahwa setiap individu, walaupunmempunyai gen yang sama, tapi pasti punya perbedaan pada materigenetiknya (DNA). Perbedaan ini umumnya terjadi pada daerah”bukan pengkode protein”. DNA fingerprinting bertujuan untukmengidentifikasi perbedaan materi genetik, dalam rangkamenentukan apakah dua sampel DNA berasal dari orang yang samaatau orang yang berbeda. Teknik ini dapat digunakan untukmembuktikan suatu tindak kriminal. Metoda yang digunakan adalahPCR, RFLP, elektroforesis dan hibridisasi.

Sampel DNA dapat disiapkan dati materi yang ditemukandilokasi kriminal, seperti darah, semen atau rambut. PCRdigunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik daritersangka dan korban kejahatan. Produk PCR dipotong denganenzim restriksi dan dipisahkan dengan gel elektroforesis, diikutidengan transfer ke membran nitroselulosa dan hibridisasi denganprobe spesifik. Bila sampel DNA dari tersangka dan korbanmemperlihatkan pita DNA yang sama setelah hibridisasi, makadengan perhitungan statistik dapat dikatakan bahwa sampel tersebutberasal dari orang yang sama.

7.4 APLIKASI UNTUK LINGKUNGAN

Aplikasi lain dari teknologi DNA rekombinan adalahmanajemen lingkungan. Salah satunya adalah melalui pennggunaanbiomassa. Biomassa merupakan materi yang dihasilkan selamaproduksi dan pemrosesan produk agrikultur dan makanan danbiasanya dibuang sebagai sampah yang tidak dapat diolah lebihlanjut. Sampah ini biasanya dihasilkan dalam jumlah banyak danbiasanya tidak toksik dan tidak berbahaya. Komponen utama darisampah ini adalah bagian dari tanaman yang tidak dimanfaatkanuntuk produk, seperti selulosa dan lignin. Limbah pabrik makanan,

100

kertas timber pada umumnya mengandung selulosa.Selulosa dapat didegradasi oleh enzim selulase. Sehingga

penelitian tentang identifikasi, isolasi dan purifikasi selulase menjadipenting. Produksi selulase oleh organisme biasanya tidak akanmencukupi untuk penggunaan industri. Disinilah peran dariteknologi DNA rekombinan, untuk mengisolasi gen pengkodeselulosa dan mengekspresikannya pada organisme yangberbeda. Kegunaannya adalah untuk pengolahan limbah kertasdengan selulase rekombinan yang membebaskan glukosa dandigunakan pada fermentasi ragi. Salah satu produk akhir darifermentasi ini adalah alkohol, yang merupakan bahan industri yangpenting dan juga dapat digunakan untuk bahan bakar. Sehinggaakan mengurangi penggunaan bahan bakar fosil.

Manfaat lain teknologi DNA rekombinan adalah untukpengolahan limbah toksik dan berbahaya. Pengolahan limbahdengan mikroba bukanlah hal baru. Beberapa mikroba, secara alamidapat mendegradasi dan mendetoksifikasi senyawa kimia sepertiherbisida dan pestisida, senyawa organik dan senyawa yangmengandung logam berat. Salah satu genus bakteri, Pseudomonas,mengandung beberapa spesies yang dapat beradaptasi denganlingkungan ini. Pada umumnya senyawa-senyawa tersebut diuraikan menjadi senyawa metabolit antara dan kemudian digunakansebagai makanan. Salah satunya, ”oil eating bacteria” sudah direkayasasecara genetik sehingga dapat menggunakan limbah minyak sebagaisumber makanan.

7.5. PENGGUNAAN DNA REKOMBINAN UNTUKPERTANIAN

Penggunaan yang baru dibidang pertanian adalah usahauntuk meningkatkan hasil tanaman dan hewan ternak denganteknologi DNA rekombinan. Selain itu tanaman dan hewan ternakjuga dapat digunakan untuk produksi protein rekombinan, ataudikenal dengan istilah ”molecular farming”.

101

Aplikasi untuk hewan ternak

Dua proses yang telah diteliti adalah: insersi gen dari hewanlain dan insersi gen manusia ke hewan ternak. Proses transfer genke mamalia tidak sama dengan pada prokariot dan relatif lebih sulit.

Misalkan kita sudah mengidentifikasi sapi yang secaragenetik resistan terhadap mastitis, yaitu bakteri yang menginfeksi selkelenjar susu, dan kita ingin memindahkan gen resistan mastitis inike sapi lain. Pertama kita harus mengidentifikasi gen tersebut danmengklonignya menggunakan prosedur standar. Kemudian gentersebut harus ditransfer ke sapi lain. Supaya gen itu diturunkan keanak, maka cara yang paling masuk akal adalah mentransfer gentersebut ke sel telur atau sel sperma. Karena sel telur yang sudahdibuahi akan memproduksi setiap sel dalam organisme, makatelur yang membawa gen asing tersebut akan menghasilkan anakdimana setiap sel mengandung gen tersebut. Konstruksi hewantransgenik ini dilakukan dengan memanipulasi embrio diluar tubuhsapi. Gen asing disisipkan melalui proses mikroinjeksimenggunakan jarum yang sangat halus. Didalam sel DNA akanbergabung dengan kromosom. Setelah mikroinjeksi, telur dibuahi invitro dan kemudian di inplantasikan ke sapi. Karena telur yang telahdibuahi mengandung DNA asing, maka setiap sel yang berkembangbiak selama perkembangan embrio akan mengandung DNA asing.Asumsikan juga gen asing tersebut diekspresikan dan berfungsidengan tepat, maka sapi transgenik tersebut akan resistan terhadapmastitis.

Teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untukmeningkatkan produksi ternak dan tanaman dengan cara yang tidakmungkin dilakukan secara tradisional. Hasil juga dapat diperolehdengan cepat karena perubahan yang terjadi lebih terarah. Namunperubahan pada satu gen dapat mempengaruhi banyakketurunan. Proses yang sederhana kadang dapat menjadi rumitkarena adanya efek genetik yang tidak kita mengerti seluruhnya.

Hewan ternak juga dapat dimanfaatkan oleh industribioteknologi melalui cara lain. Salah satu kesulitan ekspresi geneukariot pada prokariot adalah produk gen eukariot pada umumnyamengalami modifikasi pasca translasi, contohnya penambahangugus karbohidrat pada protein. Sel prokariot tidak dapat

102

melakukan proses ini, sehingga inang lain harus digunakanuntuk mendapatkan produk yang dimodifikasi. Pada beberapakasus, tidak ada organisme disamping mamalia yang dapatmelakukan modifikasi yang dibutuhkan untuk sintesis proteinmanusia. Sebagai contoh adalah faktor IX, protein yangditemukan dalam darah mamalia yang terlibat pada pembekuandarah dan umumnya tidak terdapat pada penderita hemofili.

Gen pengkode protein ini digunakan untukmengkonstruksi sapi transgenik, namun ekspresinya tidak dikontrololeh promotornya sendiri, namun oleh promotor untuk proteinyang membantu produksi susu sapi. Promotor ini hanya akan aktifpada sel-sel di kelenjar susu. Bila sapi transgenik dapat diperolehdengan teknik ini, maka protein faktor IX akan terdapat didalamsusu sapi.

Sekresi protein oleh kelenjar susu sapi ini mempunyaibeberapa keuntungan disamping mengalami modifikasi yang tepat,yaitu: (1) karena sapi memproduksi susu dalam jumlah besar, makasekresi protein juga akan melimpah. Sehingga kelenjar susu akanmenjadi bioreaktor untuk memproduksi produk farmasi. (2) proteinfaktor IX akan disekresikan dalam bentuk yang mudah untukdimurnikan. Karena terdapat beberapa jenis protein yang berbedadalam susu, proses pemisahan dan purifikasi akan berkurang.Sejumlah binatang ”pabrik” ini telah digunakan pada saat ini,dan beberapa masih dalam perencanaan.

Aplikasi untuk tumbuhan dan bakteri

Gen dapat dimasukkan kedalam tanaman melalui plasmidyang dibawa oleh Agrobacterium tumifaciens, yang merupakanpatogen tanaman dan menyebabkan kondisi seperti kanker padasejumlah tanaman. Pertumbuhan tumor pada tanaman disebabkanoleh Ti (tumor-inducing) plasmid yang dapat berintegrasi kekromosom tumbuhan.

Gen yang akan dikloning dapat diinsersikan ke plasmid Tipada daerah tertentu. Insersi ini akan menghentikan plasmidmenginduksi tumor. Plasmid ini kemudian dimasukkan kembali keA. tumifaciens, dan bakteri dibiarkan menginfeksi sel tumbuhan yangditumbuhkan pada kultur jaringan. Setelah didalam sel tumbuhan,

103

gen yang diinsersikan bersama keseluruhan plasmid Ti akanterintegrasi ke kromosom tanaman. Selanjutnya setiap sel anak akanmengandung gen asing tersebut. Akhirnya, sel dari kultur jaringanitu ditumbuhkan untuk memproduksi tanaman utuh, dan masing-masing sel dari tanaman mengandung gen asing tersebut. Ketikatumbuhan menghasilkan biji, setiap biji akan membawa gen ini.

104

8TERAPI GEN

Salah satu aplikasi kloning dalam bidang kedokteran adalahterapi gen. Terapi ini bertujuan untuk mengobati penyakit genetikdengan memberikan fragmen asam nukleat tertentu, seringkali berupaDNA pada penderita penyakit genetik. Terapi gen telah dilakukandengan sukses pada hewan dan percobaan klinik pada manusia telahdisetujui oleh Food and Drug Administration (FDA).

Hingga kini kira-kira ada 5000 penyakit bawaan pada manusiayang telah diketahui.1 Akan tetapi dari semua penyakit bawaan tersebuthanya sedikit sekali yang dapat diobati. Pada penyakit bawaan inididapatkan adanya defisiensi produk gen tertentu. Kekurangan produkgen tertentu tersebut umumnya tidak dapat digantikan dengan materialyang sama yang berasal dari luar tubuh. Hanya sedikit yang dapatdigantikan dengan material dari luar tubuh, misalnya pemberian insulinpada penderita diabetes.

Defisiensi ensim1 yang disebabkan oleh adanya defek pada genumumnya tidak dapat digantikan dengan ensim dari luar tubuh karena(1) ensim merupakan senyawaan kimia yang tidak stabil dan mudahrusak; (2) tidak dapat dimasukkan kedalam tubuh ke lokasi kerjanyadalam bentuk aktif; (3) membran sel bersifat impermeabel terhadapmolekul-molekul besar termasuk ensim.

Pengobatan penyakit herediter umumnya terbatas hanya padapenyakit herediter yang menyebabkan hilang atau kurangnya metabolittertentu yang mempunyai molekul yang kecil yang didistribusikankejaringan tubuh tertentu melalui sirkulasi darah. Disamping itupengobatan penyakit herediter yang menyebabkan terjadinya defekpada ensim juga dilakukan dengan mengontrol makanan.

Salah satu metoda pengobatan untuk mengatasi penyakitherediter adalah menggunakan terapi gen (gene therapy).1,2,3,4 Persetujuanprosedur terapi gen masih sangat sulit dan berliku serta kontroversial.

105

Aspek biologi terapi gen pada manusia sangat kompleks dan masihmembutuhkan banyak teknik yang hingga kini masih terusdikembangkan.

8.1. DEFINISI & PRINSIP TERAPI GEN

Terapi gen (Gene therapy)1,2,34 adalah suatu proses terapi untukmengobati penyakit tententu dengan cara menginsersikan gen yangtelah diperbaiki atau gen tertentu kedalam genom sel-sel atau jaringanindividu untuk menggantikan gen yang abnormal yang menyebabkanterjadinya penyakit tersebut.

Ada beberapa prinsip yang digunakan untuk menggantikan ataumemperbaiki gen yang rusak

1. Insersi gen yang normal pada lokasi yang tidak spesifik didalam genom untuk menggantikan gen yang tidak berfungsi.Prinsip ini merupakan pendekatan umum yang paling seringdigunakan.

2. Gen yang tidak normal dihilangkan dari genom individu dandigantikan oleh gen yang normal menggunakan cara homologousrecombination.

3. Gen yang tidak normal dapat diperbaiki melalui cara selectivereverse mutation.

4. Mengubah regulasi (pengaturan) gen tertentu.

8.2. JENIS TERAPI GEN

Terapi gen dibedakan atas 2 jenis yaitu

1. Terapi gen sel somatik (somatic-cell gene therapy) atau genetherapy non hereditable.Pada terapi gen sel somatik, gen yang normal atau telahdimodifikasi ditransfer ke dalam sel-sel somatik pasien. Terapigen ini hanya dapat mengatasi penyakit atau kelainan padapasien yang bersangkutan. Gen yang telah diperbaiki ataudimodifikasi ini tidak dapat diturunkan kepada generasi

106

selanjutnya, karena gen yang telah diperbaiki ini hanya adapada sel-sel somatik saja dan tidak ada pada sel-sel germinal.

Terapi gen somatik (somatic cell gene therapy) mirp dengantransplantasi sel, jaringan atau organ. Pada transplantasi organketubuh resipien, organ yang ditransplantasikan itumengandung gen-gen yang berbeda dengan pasien. Pada terapigen ini beberapa sel pasien diambil, diperbaiki diperbaikigennya dan kemudian dikembalikan ke pasiennya. Hal inimenyebabkan terapi gen sel somatik tidak serumit dan tidakseberbahaya transplantasi organ.

2. Terapi gen sel germinal (Germ line /hereditable gene therapy)Pada terapi gen sel germinal, gen yang mengalami defek padasel-sel germinal akan diperbaiki dengan cara menginsersikandan mengintegrasikan gen yang normal atau gen yang telahdimodifikasi kedalam genom sel-sel germinal. Gen yang telahdiinsersikan ini kemudian akan diturunkan ke generasiberikutnya. Terapi gen sel germinal sangat bermanfaat untukmengatasi penyakit-penyakit genetik dan penyakit-penyakityang bersifat herediter. Akan tetapi terapi gen sel germinalhingga kini masih sulit dilakukan karena alasan tehnis dan etik.Bila gen yang mengalami defek pada sel-sel germinal inidiperbaiki dan diturunkan berarti kita telah mengubah genetikseseorang. Hal inilah yang menjadi kendala untuk melakukanterapi gen sel germinal

8.3. METODA TERAPI GEN

Metoda terapi gen dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompokbesar yaitu

1. transfer gen yang telah dimodifikasi atau gen normal kedalamsel-sel sasaran pada pasien dengan menggunakan vektorbiologi yaitu virus.

2. transfer gen yang telah dimodifikasi atau gen yang normalkedalam sel-sel sasaran pada pasien dengan menggunakan cara

107

non virus. Beberapa cara non virus yang dapat digunakanadalah Naked DNA, Oligonucleotides, lipoplexes danpolyplexes, hibrid methods, dendrimers.

Transfer gen menggunakan vektor biologis

Vektor biologi yang digunakan untuk membawa gen yang telahdiperbaiki adalah virus yang susunan genetiknya telah diubah sehinggadapat membawa gen manusia yang normal. Virus-virus ini akanmembawa gen yang telah diperbaiki kedalam sel-sel sasaran padatubuh manusia dengan cara tertentu dan kemudian berintegrasi padagenom tertentu.4 Untuk mencapai tujuan ini gen-gen pada virus yangdapat menyebabkan penyakit harus dihilangkan dan diganti dengangen-gen yang telah diperbaiki. Sebagai contoh virus A diketahui dapatberreplikasi atau memperbanyak diri dengan cara menginsersikan gen-gen nya kedalam genom sel-sel host. Virus ini mempunyai 2 jenis geneyaitu gen A dan gene B. Gen A adalah gen yang mengkode proteinyang berguna untuk menginsersikan gen-gen nya kedalam genom selhost (inang). Sebaliknya gen B adalah gen yang menyebabkantimbulnya penyakit pada host. Gen C adalah gen yang telah diperbaikidan akan menggantikan gen B. Dengan dilakukannya reengineeringsedemikian rupa sehingga gen C dapat menggantiksn gen B. Dengandemikian gen A tetap dipertahankan untuk menjalankan fungsinya.

Adenovirus merupakan virus generasi pertama yang digunakandalam terapi gen dan sangat efektif sebagai vektor pembawa transgen.2,4

Virus lain yang dapat digunakan dalam terapi gen adalah retrovirus,adeno-associated viruses, virus herpes simplex dan lain-lainnyatermasuk virus penyebab HIV.2,4 2 jenis virus yang banyak digunakansebagai vektor adalah

A. Retrovirus.Materi genetik pada virus ini adalah dalam bentuk RNA, sebaliknyamateri genetik pada sel-sel tubuh sasaran adalah dalam bentukDNA. Ketika retrovirus menginfeksi sel sasaran (host), selainmemasukkan RNA-nya, ia juga akan memasukkan ensim reversetranscriptase dan integrase kedalam sel sasaran tersebut. RNA inikemudian akan diubah menjadi DNA melalui proses reverse

108

transcription menggunakan ensim reverse transcriptase. DNAkemudian akan ditransfer kedalam inti sel sasaran dan kemudianakan berintegrasi pada tempat tertentu di genom sel sasarandengan bantuan ensim integrase. Setelah DNA yang telahdiperbaiki ini terintegrasi pada tempat tertentu di genom selssasaran maka dikatakan bahwa genom sel-sel sasaran (host) initelah dimodifikasi

Salah satu masalah yang dapat terjadi pada terapi gen menggunakanretrovirus adalah ensim integrase dapat menginsersikan materigenetik virus pada tempat yang kurang sesuai misalnya pada bagiantengah gen-gen endogen pada host, sehingga gen endogen ini tidakdapat berfungsi, dikenal sebagai insertional mutagenesis. Bila gen-gen virus ini berinsersi pada gen pengatur fungsi gen lainnya, makaproses pembelahan sel dapat tidak terkendali dan berubah menjadisel kanker. Hal ini sekarang dapat diatasi dengan menggunakanensim Zinc finger nucleases.5 Keuntungan menggunakan retrovirusadalah transgen yang dimasukkan bisa di transmisikan kesemua selyang terinfeksi dan turunanannya, tetapi kerugiannya dapatmenyebabkan terjadinya mutasi genetik yang berbahaya selamatahap pengintegrasian.

B. AdenovirusKetika virus adenovirus meninginfeksi sebuah sel inang,

molekul DNA virus tersebut akan dimasukkan kedalam sel inangtersebut. Materi genetik adenovirus tidak bersatu dengan materi genetiksel inang. Molekul DNA virus terletak bebas dalam inti sel dan prosestranskripsinya berlangsung secara sendiri. Molekul DNA virus tidakikut berreplikasi ketika sel mengalami pembelahan sehingga sel-selinang hasil pembelahan tidak mengandung DNA virus. Akibatnya padaterapi gen menggunakan vektor adenovirus membutuhkan pemasukkankembali gen-gen yang sudah dimodifikasi ke dalam populasi sel yangbaru. Sebaliknya keadaan ini akan mencegah terjadinya kanker.Gendicine adalah adenovirus yang telah mengandung gen p53 yangdigunakan pada terapi gen untuk mengobati penyakit kanker padakepala dan leher. Gendicine sudah diizinkan oleh FDA China untukdigunakan pada manusia pada tahun 2003, sementara itu FDA AmerikaSerikat telah menyetujui advexin, suatu vektor yang serupa denganGendicine untuk digunakan di Amerika serikat pada tahun 2008.

109

Transfer gen menggunakan cara non virus

Disamping menggunakan cara tranfer gen yang diperantaraioleh virus (virus-mediated gene-delivery systems, ada beberapa metodalain tanpa menggunakan virus. Metoda non virus ini mempunyaikeuntungan yaitu dapat diproduksi dalam jumlah besar danimmunogenisitas pada sl inang yang rendah. Beberapa metoda nonvirus yang dapat digunakan adalah

1. Naked DNAMetoda ini merupakan metoda transfeksi non virus yangsangat sederhana. Penelitian klinik dengan cara menyuntikannaked DNA secara intramuskular menunjukkan sebagian hasilyang sukses dan sebagian lagi mengalami kegagalan. Ekspresigen pada metoda transfeksi ini sangat rendah dibandingkandengan cara transfeksi lainnya.

2. OligonukleotidaOligonukleotida sintetik digunakan untuk menginaktifkan gen-gen yang terlibat dalam proses penyakit. Beberapa metodayang dapat digunakan antara lain adalah

a. Menggunakan antisense yang spesifik untuk gensasasaran yang akan mengganggu proses transkripsigen sasaran yang rusak.

b. Menggunakan oligonukleotida rantai ganda (doublestrand oligonucleotide) yang akan mengikat faktor-faktor transkripsi yang diperlukan untuk regulasipromoter gen sasaran.

3. Lipoplexes and polyplexesUntuk meningkatkan kwalitas pengangkutan DNA yang baruke dalam sel, DNA tersebut harus dilindungi dari kerusakandan pemasukkannya kedalam sel harus difasilitasi. Untukmemfasilitasi pemasukan gen ke dalam sel dapat digunakanmolekul lipid yang dikenal sebagai lipoplexes dan polyplexesyang dirancang untuk melindungi DNA dari proses degradasiselama proses transfeksi. Molekul lipid ini digunakan untukmembungkus plasmid yang mengandung DNA dalam bentukseperti micelle atau liposome. Lipoplexes atau polyplexes yang

110

telah mengandung DNA dikenal sebagai lipoplex. Lipoplexakan berinteraksi dengan membran sel dan masuk kedalamsecara endositosis. Endosome yang mengandung lipoplex inikemudian akan lisis dan transgen yang ada di dalamnya akandikeluarkan ke dalam sitoplasma sel untu kemudian akanmasuk ke dalam inti sel

4. Metoda Hibrid (Hybrid method)Untuk meningkatkan efisiensi trnasfer transgen dikembangkanmetoda hibrid (campuran) yaitu kombinasi liposome denganvirus influenza atau HIV yang diinaktifkan.

8.3. HAMBATAN DALAM TERAPI GEN

Ada beberapa faktor yang menghambat efektivitas penggunaanterapi gen dalam mengatasi penyakit-penyakit genetik yaitu

1. Masa hidup alami terapi gen yang pendek (Short-lived natureof gene therapy). Agar terapi gen menjadi efektif , gen yangdimasukkan kedalam sel-sel target harus dapat berfungsi dansel-sel yang mengandung gen terapi ini harus dapat hidup lamadan stabil.

2. Respons Imunologik. Adanya stimulus tertentu yangmerangsang timbulnya respons imunologik yang dapatmenurunkan efektivitas terapi gen tentu sangat merugikan.Lebih jauh adanya respon imunologik ini juga akanmenyulitkan pengulangan terapi gen pada pasien.

3. Masalah dengan virus yang berfungsi sebagai vektor. Beberapamasalah yang harus dipertimbangkan pada penggunaan virussebagai kendaraan pembawa gen yang telah diperbaiki adalahtoksisitas, reaksi imunologik dan inflamasi, kontrol gen danjaringan sasaran. Ketakutan lainnya adalah kemungkinanpulihnya kembali kemampuan virus untuk menyebabkanpenyakit pada manusia

111

4. Kelainan gen yang multipel. Terapi gen sulit digunakan untukmengobati penyakit-penyakit yang disebabkan oleh adanyakombinasi gen-gen yang mengalami kerusakan, misalnya padapenyakit jantung, tekanan darah tinggi, Alzheimer, artritis dandiabetes.

5. Potensi untuk timbulnya tumor.Bila DNA diintergrasikan pada tempat yang salah di dalamgenom, misalnya pada daerah tumor suppressor gene, hal inidapat menyebabkan timbulnya tumor. Hal ini pernah terjadipada percobaan klinis pada pasien dengan X-linked severecombined immunodeficiency (X-SCID) yang diterapi dengansel punca darah (Hematopoietic stem cells yang diinfeksi olehretrovirus yang mengandung transgen. Tiga dari 20 pasien yangditerapi dengan cara ini kemudian menderita leukemia.

8.4. PRASYARAT TERAPI GEN

Untuk melakukan terapi gen ada persyaratan yang harusdipenuhi yang dikembangkan oleh National Institute of Health (NIH).Beberapa prasyarat yang harus dipenuhi agar prosedur terapi gen dapatdi izinkan adalah

1. Gen harus di klon dan diketahui karakteristiknya, sehinggaharus tersedia dalam bentuk murni.

2. Harus ada metoda efektif yang digunakan untuk memasukkantrasngen ke dalam jaringan atau sel yang dituju

3. Resiko terapi gen harus dievaluasi secara berhati-hati dandibuat seminimal mungkin

4. Penyakit tidak dapat diobati dengan cara lainnya.5. Harus ada data penelitian pendahuluan dengan hewan model

atau sel manusia dan hasilnya menunjukkan bahwa usulanterapi gen tersebut adalah efektif.

8.5. CONTOH TERAPI GEN

112

Terapi gen pada manusia pertama kali dilakukan tahun 1990pada seorang anak perempuan berusia 4 tahun yang menderita penyakit”Adenosine deaminase-deficient severe combined immunodeficiencydisease (ADA-SCID). SCID merupakan penyakit autosomal yangjarang terjadi yang mengenai system imun. Penderita penyakit ini tidakmempunyai sistem imun sehingga infeksi yang ringan sekalipun dapatmengakibatkan gangguan yang serius dan sering berakhir fatal.Beberapa penderita mengalami defisiensi ensim adenosine deaminase(ADA).

Ketiadaan ensim ini menyebabkan kadar deoxyadenosine yangterfosforilasi meningkat mencapai tingkat toksik dan terakumulasidalam limfosit T yang pada akhirnya akan membunuh sel limfosit.Limfosit T akan menstimulasi limfosit B yang akan berkembangmenjadi sel plasma yang menghasilkan antibodi.

Langkah-langkah terapi gen yang dilakukan terdiri atas

1. pertama kali dirancang konstruksi gen dengan caramemasukkan gen ADA ke vektor DNA dengan promotoryang kuat.

2. Vector yang mengandung gen ADA ini kemudiandiintegrasikan ke dalam virus retrovirus.

3. Sel darah putih diisolasi dari darah penderita4. Sel darah putih ini kemudian diinfeksi dengan virus yang

mengandung gen ADA5. Sel darah putih yang telah terinfeksi virus ini kemudian

dikembang biakan didalam media kultur dan di identifikasi sel-sel darah putih yang mengandung transgen.

6. Sel darah putih yang mengekspresikan gen ADA kemudiandiinfuskan kedalam sirkulasi sistemik

7. Sel-sel darah putih ini kemudian menghasilkan produk genADA yang akan memperbaiki sistem imun penderita selamawaktu tertentu dan terapi ini harus diulang kembali secaraperiodik.

Untuk mengatasi keterbatasan lifespan sel darah putih yangpendek, dapat digunakan sel punca (stem cells) sumsum tulang yangmerupakan sel induk sel darah putih. Stem cells yang telah dimodifikasi

113

ini akan menghasilkan sel–sel limfosit T yang mengandung transgenADA secara terus menerus.

Contoh penggunaan adenovirus dalam terapi gen adalah terapi genyang dipakai untuk mengobati cystic fibrosis (CF). Pada terapi gen inivirus adenovirus yang membawa gen CF diinhalasi oleh pasien, denganharapan sel-sel paru akan terinfeksi dan mensintesa produk gen CFuntuk mengatasi simptom dan gejala penyakit. Akan tetapi kuatnyareaksi imunologik tubuh menyebabkan terapi gen menjadi tidak efektif.Sel-sel yang terinfeksi virus dan mengandung transgen akan mati dantidak bisa memperbanyak diri sehingga mengakibatkan ekspresikan genakan menurun. Untuk ini transgen lebih baik bila dibawa oleh virusretrovirus.

114

9Rekayasa Genetik bidang Peternakan

Menurut Sudrajat (2003) aplikasi bioteknologi peternakandilakukan pada tiga bidang utama, yaitu bioteknologi reproduksi(inseminasi buatan, transfer embrio dan rekayasa genetik), bioteknologipakan ternak dan bioteknologi bidang kesehatan hewan. Bioteknologipeternakan dapat digunakan mempercepat pembangunan peternakanmelalui peningkatan daya reproduksi dan mutu genetik ternak,perbaikan kualitas pakan dan kualitas kesehatan ternak

Bioteknologi adalah penggunaan biokimia, mikrobiologi, danrekayasa genetika secara terpadu, untuk menghasilkan barang ataulainnya bagi kepentingan manusia. Biokimia mempelajari strukturkimiawi organisme. Rekayasa genetika adalah aplikasi genetik denganmentransplantasi gen dari satu organisme ke organisme lain.Ciri utama bioteknologi:1. Adanya Benda biologi berupa mikroorganisme, tumbuhan atauhewan2. Adanya pendayagunaan secara teknologi dan industri3. Produk yang dihasilkan adalah hasil ekstraksi dan pemurnian

Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golonganorganisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewantingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan. Bidang kedokteran danfarmasi paling banyak berinvestasi di bidang yang relatif baru ini.Sementara itu bidang lain, seperti ilmu pangan, kedokteran hewan,pertanian (termasuk peternakan dan perikanan), serta teknik lingkunganjuga telah melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing.

Teknologi Rekayasa Genetika merupakan inti dari bioteknologididifinisikan sebagai teknik in-vitro asam nukleat, termasuk DNArekombinan dan injeksi langsung DNA ke dalam sel atau organel; ataufusi sel di luar keluarga taksonomi; yang dapat menembus rintanganreproduksi dan rekombinasi alami, dan bukan teknik yang digunakandalam pemuliaan dan seleksi tradisional.

115

Prinsip dasar teknologi rekayasa genetika adalah memanipulasiatau melakukan perubahan susunan asam nukleat dari DNA (gen) ataumenyelipkan gen baru ke dalam struktur DNA organisme penerima.Gen yang diselipkan dan organisme penerima dapat berasal dariorganisme apa saja.

Dampak produk rekayasa genetika bagi kesehatan manusiatidak perlu dikhawatirkan sepanjang jenis produk yang dilepas kemasyarakat telah memenuhi Protokol Cartagena dan terlebih dulumelalui proses pemeriksaan keamanan pangan dan lingkungan. Halyang sering dikhawatirkan para ilmuwan bioteknologi adalah keikutangen marker (biasanya gen tahan antibiotika) terselip ke dalamkhromosom organisme penerima, sehingga jika makan produk tersebutkita juga akan memakan zat tahan antibiotika. Tentang hal ini telah adateknologi untuk menghilangkan gen tersebut agar tidak ikut terselip keorganisme penerima. Di samping itu konsentrasi zat ini tidak tinggiuntuk ukuran manusia. Kekhawatiran juga muncul terhadap adanyagene flow yaitu menyebarnya gen baru yang diselipkan pada organismepenerima kepada organisme lain yang sejenis di sekitarnya melaluiproses penyerbukan atau kawin silang.

9.1. BIOTEKNOLOGI REPRODUKSI HEWANBioteknologi reproduksi terus berkembang untuk

meningkatkan konsistensi dan keamanan produk dari ternak yangberharga secara genetik dan menyelamatkan spesies langka.Bioteknologi reproduksi juga memudahkan antisipasi kemungkinanindustri yang mengarah pada produk dengan sifat-sifat genetik bernilaiekonomis seperti pertumbuhan jaringan otot, produk rendah lemak,dan ketahanan terhadap penyakit.1. Inseminasi Buatan dan Seksing Sperma

Program peningkatan produksi dan kualitas pada ternakberjalan lambat bila 13 proses reproduksi berjalan secara alamiah.Melalui rekayasa bioteknologi reproduksi, proses reproduksi dapatdimaksimalkan antara lain dengan teknologi IB (inseminasi buatan).Tujuan utama dari teknik IB ialah memaksimalkan potensi pejantanberkualitas unggul. Sperma dari satu pejantan berkualitas unggul dapatdigunakan untuk beberapa ratus bahkan ribuan betina, meskipunsperma tersebut harus dikirim ke suatu tempat yang jauh.

116

Jenis kelamin anak pada ternak yang diprogram IB dapatditentukan dengan memanfaatkan teknologi seksing sperma X dansperma Y. Dewasa ini ada dua teknik yang umum dipakai untuk seksingsperma yaitu separasi albumin yang menghasilkan 75 sampai 80 persensperma Y dan filtrasi sephadex yang menghasilkan 70 hingga 75 persensperma X. Perubahan proporsi sperma X atau Y akan menyebabkanpeluang untuk memperoleh anak dengan jenis kelamin yang diharapkanlebih besar. Seleksi gender pada hewan digunakan untuk beberapatujuan diantaranya:1. memproduksi lebih banyak anak betina dari induk superior untukmeningkatkanproduksi susu, daging dan kulit.2. menghasilkan lebih banyak anak jantan untuk produksi daging daribetina-betina yangtelah diculling.3. mencegah intersex pada kelahiran kembar (khususnya ternak sapi).2. Transfer Embrio

TE (transfer embrio) merupakan teknologi yangmemungkinkan induk betina unggul memproduksi anak dalam jumlahbanyak tanpa harus bunting dan melahirkan. TE dapatmengoptimalkan bukan hanya potensi dari jantan saja tetapi potensibetina berkualitas unggul juga dapat dimanfaatkan secara optimal. Padaproses reproduksi alamiah, kemampuan betina untuk bunting hanyasekali dalam 1 tahun (9 bulan bunting ditambah persiapan untukbunting berikutnya) dan hanya mampu menghasilkan 1 atau 2 anak bilaterjadi kembar. Menggunakan teknologi TE, betina unggul tidak perlubunting tetapi hanya berfungsi menghasilkan embrio yang untukselanjutnya bisa ditransfer (dititipkan) pada induk titipan (resipien)dengan kualitas genetik rata-rata etapi mempunyai kemampuan untukbunting.3. Bayi Tabung

Kematian bukan lagi merupakan berakhirnya proses untukmelahirkan keturunan. Melalui teknik bayi tabung, sel telur yang beradadi dalam ovarium betina berkualitas unggul sesaat setelah mati dapatdiproses in vitro di luar tubuh sampai tahap embrional. Selanjutnyaembrio tersebut ditransfer pada resipien sampai dihasilkan anak.

Secara alamiah sapi betina berkualitas unggul dapatmenghasilkan sekitar tujuh ekor anak selama hidupnya. Jumlah tersebut

117

dapat berkurang atau menjadi nol bila ada gangguan fungsi reproduksiatau kematian karena penyakit. Untuk menyelamatkan keturunan daribetina berkualitas unggul tersebut, embrio dapat diproduksi dengancara aspirasi sel telur pada hewan tersebut selama masih hidup atausesaat setelah mati. Dari ovarium yang diperoleh di rumah potonghewan bisa diperoleh sekitar 20 sampai 30 sel telur untuk setiap ternakbetina yang dipotong. Sel telur hasil aspirasi tersebut selanjutnyadimatangkan secara in vitro. Sel telur yang sudah matang diproses lebihlanjut untuk dilakukan proses fertilisasi secara in vitro denganmelakukan inkubasi selama lima jam mempergunakan semen beku daripejantan berkualitas unggul. Sel telur yang dibuahi dikultur kembaliuntuk perkembangan lebih lanjut. Pada akhirnya embrio yang diperolehakan dipanen dan dipndahkan rahim induk betina dan dibiarkantumbuh sampai lahir.

4. Kriopreservasi EmbrioKriopreservasi merupakan komponen bioteknologi yang

memiliki peranan yang sangat besar dan menentukan kemajuanteknologi transfer embrio. Hal ini dikaitkan dengan kemampuannyadalam mempertahankan viabilitas embrio beku dalam waktu yang tidakterbatas sehingga sewaktu-waktu dapat ditransfer ketika betina resipientelah tersedia, serta dapat didistribusi ke berbagai tempat secara luas.Dengan kata lain, Kriopreservasi merupakan suatu proses penghentiansementara kegiatan metabolism sel tanpa mematikan sel dimana proseshidup dapat berlanjut setelah kriopreservasi dihentikan. Metodekriopreservasi dapat dilakukan dengan dua cara yakni kriopreservasisecara bertahap dan kriopreservasi secara cepat (vitrifikasi).

Secara umum, mekanisme kriopreservasi merupakanperubahan bentuk fisik timbal balik dari fase cair ke padat dan kembalilagi ke fase cair. Mekanisme fisika kriopreservasi meliputi penurunantemperatur pada tekanan normal disertai dengan dehidrasi sampaitingkat tertentu dan mencapai temperatur jauh di bawah 0oC (-196oC). Proses ini harus reversibel ke kondisi fisiologis awal. Tujuankriopreservasi adalah mempertahankan sesempurna mungkin sifat-sifatmaterial biologis terutama viabilitasnya.

5. Hewan Transgenik

118

Hewan transgenik merupakan satu alat riset biologi yangpotensial dan sangat menarik karena menjadi model yang unik untukmengungkap fenomena biologi yang spesifik (Pinkert, 1994).Sedangkan hewan transgenik menurut Federation of EuropeanLaboratory Animal Associations adalah hewan dimana dengan sengajatelah dimodifikasi genome-nya, gen disusun dari suatu organisme yangdapat mewarisi karakteristik tertentu. Dua alasan umum mengapahewan transgenic tetap diproduksi :

- Beberapa hewan transgenic diproduksi untuk mempunyai sifatekonomis spesifik. Contoh, ternak transgenic diciptakan untukmemproduksi susu yang mengandung protein khusus manusia, dimanamungkin dapat membantu dalam perawatan penyakit emphysema padamanusia (penyakit pembengkakan paru-paru karena pembuluh darah).

- Hewan transgenic lainnya diproduksi sebagai model penyakit (secaragenetic hewan dimanipulasi untuk menunjukkan gejala penyakitsehingga perawatan efektif dapat dipelajari). Contoh, ilmuwan Harvardmembuat terobosan besar secar ilmiah ketika mereka diterima sebuahpaten U.S. untuk keahlian tikus secara genetic, dimana tikus membawagen yang mengembangkan variasi kanker manusia.

Kemampuan untuk mengintroduksi gen-gen fungsional kedalam hewan menjadi alat berharga untuk memecah proses dan sistembiologi yang kompleks. Transgenik mengatasi kekurangan praktekpembiakan satwa secara klasik yang membutuhkan waktu lama untukmodifikasi genetik. Aplikasi hewan transgenik melingkupi berbagaidisiplin ilmu dan area riset diantaranya:1. basis genetik penyakit hewan dan manusia, disain dan pengetesanterapinya;2. resistensi penyakit pada hewan dan manusia;3. terapi genHewan transgenik merupakan model untuk pertumbuhan,immunologis, neurologis, reproduksi dan kelainan darah);4. obat-obatan dan pengetesan produk;5. pengembangan produk baru melalui “molecular farming”Introduksi gen ke dalam hewan atau mikroorganisme dapat merubahsifat dari hewan atau organisme tersebut agar dapat menghasilkanproduk tertentu yang diperlukan oleh manusia seperti factor IX danhemoglobin manusia.6. produksi peternakan

119

a) TernakPemanfaatan teknologi transgenik memungkinkan diperolehnya ternakdengan karakteristik unggul (Pinkert, 1994; Prather et al, 2003). Petaniselalu menggunakan peternakannya yang selektif untuk menghasilkanhewan yang sesuai dengan keinginan. Misalnya meningkatkan produksisusu, meningkatkan kecepatan pertumbuhan. Peternakan tradisionalmemakan waktu dan sulit memenuhi permintaan. Ketika teknologimenggunakan biologi molekuler untuk mengembangkan karakteristikhewan dengan waktu yang singkat dan tepat. Disamping itu, transenikhewan menyediakan cara yang mudah untuk meningkatkan hasil.

b) Kualitas produksiSapi transgenic bisa memproduksi susu yang banyak dan rendah laktosadan kolesterol, babi dan unggas menghasilkan daging yang lebihbanyak, dan domba yang memiliki wool yang tebal. Di masa lampau,petani menggunakan hormone pertumbuhan untuk memacuperkembangan hewan tetapi teknik ini bermasalah, khususnya sejakresidu hormone masih terkandung dalm produk.

c) Resistensi penyakitIlmuwan mencoba menghasilkan hewan yang resisten terhadappenyakit, seperti babi yang resisten terhadap influenza, tetapi jumlahgen yang berperan masih terbatas jumlahnya.6. Aplikasi Kesehatan

a) Pasien yang meninggal tiap tahun karena butuh pengganti jantung,hati, atau ginjal. Contoh, sekitar 5000 organ dibutuhkan tiap tahun diUK. Babi transgenic menyediakan transpalantasi organ yangdibutuhkan untuk meredakan. Xenotransplantation adalah wadah yangdiproduksi oleh protein babi yang dapat menyebabkan alergi padapenerima donor, tetapi bisa dihindarkan dengan mengganti proteinbabi dengan protein manusia.

b) Suplement nutrisi dan Obat-obatanProduk seperti insulin, hormone pertumbuhan, factor antipenggumpalan darah mungkin terkandung dalam susu sapi, kambing,dan domba transgenic. Penelitian merupakan cara untuk menghasilkansusu melalui transgenesis untuk penyembuhan penyakit seperti

120

phenylketonuria (PKU), penyakit pembengkakan paru-paru yangmenurun, dan penyakit kista.Contoh : Pada tahun 1997, sapi transgenic pertama kali, memproduksiyang kaya akan protein 2,4 gr per liter. Susu sapi transgenic ini lebihbernutrisi daripada susu sapi biasa. Susu ini dapat diberikan pada bayiatau dan orang dewasa dengan gizi yang dibutuhkan dan mudahdicerna. Karena mengandung gen alpha-lactalbumin.

c) Terapi Gen ManusiaTerapi gen manusia meliputi penambahan copyan gen normal padagenome orang yang memiliki gen yang tidak normal. Perlakuan tersebutberpotensi pada 5000 penyakit genetic yang besar dan hewantransgenic. Contoh, salah satu institute di finladia memproduksi genanak sapi mampu memacu pertumbuhan sel darah merah di manusia(Margawati,2009).7. Aplikasi industri

Pada tahun 2001, 2ilmuwan di Canada menyambung genlaba-laba ke dalam sel penghasil susu kambing. Kambing mulaimenghasilkan strand seperti serabut sutra saat pemerahan susu.Dengan mengekstrak polimer strand dari susu dan menenunnyamenjadi benang, kemudian ilmuwan membuatnya menjadi mengkilat,keras, dan fleksibel dan diaplikasikan pada pembuatan kain, kasa steril,dan string raket tenis.

Hewan transgenic yang sensitive terhadap racun telahdiproduksi untuk uji keamanan kimia. Mikroorganisme telah dirancanguntuk meproduksi varietas protein yang dapat memproduksi enzimuntuk mempercepat reaksi kimia pada industri.

8. Kualitas produk transgenicDi masa yang akan datang hewan transgenik akan diproduksi

dengan penyisipan gen pada lokasi yang spesifik dalam genom. Teknikini telah terbukti berhasil pada mencit tetapi masih Iintensif ditelitipada hewan-hewan besar.Tabel 9.1 Contoh–contoh Locyt-Locyt Gen dan Aplikasi pada TernakSpesies Gen AplikasiBabi α -1,3-galactosyl trasferase Mencegah rejeksi

hiperakut dalamxenotransplantasi

121

Babi, sapi Fas, Fas-L Menekan rejeksi yangdimediasisel padaxenotransplantasi

Sapi Menekan rejeksi yangdimediasisel pada xenotransplantasi

Produksi serumlabumin manusiadalam susu

Sapi Milk casein Meningkatkanproduksi proteindan formula bayi

Semua SRY dan penentu sexlainnya

Produksi daging dansusu yanglebih efisien

Semua Growth/differentitianfactor 8

Produksi daging yanglebih efisien

9. KloningKloning adalah upaya multiplikasi hewan secara asexual yang

menghasilkan turunan-turunan dengan komposisi genetik yang identik.Klon sapi dan kuda pertama kali diproduksi pembelahan embrio tahapblastosis umur 8-10 hari (jumlah sel embrio ± 64 sel). Dengan memakaiteknik bedah mikro untuk memproduksi turunan-turunan bergenetikidentik, para peneliti menemukan bahwa setiap sel embrio dapattumbuh menjadi satu embrio utuh dengan jumlah sel ± 128 sel. Hal inimemungkinkan penggunaan inti sel embrio untuk memproduksilusinan klon sapi dari satu embrio yang tumbuh.

Kemajuan teknologi ini berlangsung cepat, tetapi prosedurkerja membutuhkan teknik yang rumit dan efisiensi masih rendah.Untuk saat ini, kloning belum terbukti mampu menghasilkan ternakdalam jumlah besar secara ekonomis. Terobosan penting metodecloning hewan ditandai lahirnya “Dolly”, domba hasil kloning parapeneliti Roslin Institute (Skotlandia). Sel-sel diperoleh dari kelenjarambing domba betina dewasa dan dikultur di laboratorium. Sel hasilkultur tersebut selajutnya digunakan sumber inti berisi material genetik

122

yang menggantikan inti sel telur domba setelah percobaan diulang 273kali, diperoleh seekor domba hasil kloning (Wilmut et al, 1997).Produksi ”Dolly” sangat signifikan karena: pertama, merupakanmamalia pertama yang diproduksi menggunakan material genetik yangberasal dari sel hewan dewasa. Kedua, memungkinkan pengembanganmetode baru dan lebih efisien untuk memproduksi hewan transgenikyang mengandung gen sintetik manusia di dalamnya (Niswender, 2004).Menyusul keberhasilan Dolly, kloning berhasil dibuat pada berbagaihewan lain seperti sapi dan kuda. Penelitian tentang kloning iniberlanjut terus dan menjadi perhatian dari banyak peneliti di berbagainegara khususnya Amerika Serikat,Perancis, Inggris, Skotlandia, danJepang.

Pengembangan kloning yang sangat menarik adalahpembuatan hewan transgenik. Embrio hasil kloning disisipi gen-gentertentu (umumnya gen manusia) sehingga ternak kloning yang lahirmemiliki sifat genetik baru yang bermanfaat. Hewan kloning transgenikpertama kali dihasilkan adalah ”Moly” dan ”Poly” yang juga diproduksidi Roslin Institute. Para peneliti berharap hewan kloning transgenikakan menghasilkan substansi kimia tertentu dalam jumlah besar(umumnya lewat air susu) untuk keperluan biomedis dan farmasi (Sticeet al., 1998).Para peneliti saat ini telah membuat banyak kemajuan dalam metodekloning, dan diprediksi adanya kemungkinan produksi ratusan hinggaribuan individu yang identik secara genetik menggunakan teknologi ini(Han et al, 2003; Wells et al, 2003). Produksi ternak transgenik hasilkloning secara komersial sudah dirintis di beberapa negara (Faber et al,2003)10. Kloning Terapeutik Dengan Teknik SCNT pada Domba

DollyTeknologi SCNT meliputi suatu teknologi rekayasa terhadap

sel telur, dengan cara mentransfer inti dari sel donor ke sel telur yangtelah dikeluarkan intinya (enucleated oocyte). Kedua jenis kloningmemiliki kegunaannya masing-masing. Kloning reproduktif berperanpenting dalam pelestarian hewan-hewan langka yang hampir punah.Sedangkan, kloning terapeutik bertujuan untuk menghindari adanyareaksi penolakan terhadap sistem imun pasien dalam terapi sel punca(stem cell) . Keberhasilan suatu penelitian yang menghasilkan sel puncaembrionik monyet dengan teknik SCNT. Akhir-akhir ini membawa

123

dunia semakin dekat dengan produksi sel punca embrionik manusiadari sel somatik dewasa sehingga risiko penolakan terhadap sistemimun akan semakin berkurang..

Domba dolly yang berhasil diklon oleh Ian Wilmut padatahun 1996. Domba Dolly merupakan salah satu contoh dari kloningreproduktif. Sebenarnya terdapat dua jenis kloning, yaitu kloningreproduktif dan kloning terapeutik. Kedua jenis kloning ini merupakanpenerapan dari aplikasi teknologi Somatic Cell Nuclear Transfer atauSCNT.11. TEKNIK SCNT

Perbedaan fertilisasi dengan SCNT:

Pada fertilisasi alami, setelah mengalami pembelahan meiosis,sel telur dan sel sperma memiliki materi genetik haploid (n). Terjadinyapembuahan sel telur oleh sel sperma atau fertilisasi akan menghasilkanembrio satu sel yang memiliki materi genetik 2n. Kemudian, embrio iniakan terus berkembang ke tahapan perkembangan selanjutnyamenjadi 2 sel, 4 sel, 8 sel, 16 sel, dan seterusnya.

Teknik SCNT merupakan suatu teknik rekayasa sel telurdengan cara mentransferinti dari sel donor ke dalam sel telur yang telah dikeluarkan intinya(enucleated oocyte). Enucleated oocyte tidak memiliki materi genetik.Oleh karena itu, untuk mendapatkan embrio konstruksi yang diploid,sel telur harus direkonstruksi dengan cara mentransfer sel somatik (2n)ke dalam enucleated oocyte1. Proses enukleasi sel telur dapat dilakukansecara mekanik menggunakan teknik mikromanipulasi. Sedangkan,proses introduksi sel donor dapat dilakukan dengan teknikmikroinjeksi. Keberadaan cytochalasin B (CB) pada medium kulturbertujuan untuk menghambat sitokinesis atau pembelahan sel sehinggadapat dihasilkan klon embrio diploid2.

Aplikasi dari teknologi SCNT adalah pada penelitian kloningreproduktif dan juga kloning terapeutik. Pada perkembangan secaranormal (A), zigot diploid terbentuk setelah terjadi fertilisasi. Kemudian,zigot akan membelah sampai terbentuk blastosit yang akan menempelpada dinding uterus sampai akhirnya berakhir pada proses melahirkan.Pada kloning reproduktif (B), sel donor yang berupa sel somatik (2n)diintroduksikan ke enucleated oocyte. Keberhasilan proses aktivasiembrio konstruksi secara kimiawi atau mekanik mengakibatkan

124

terjadinya proses pembelahan sampai ke tahap blastosit. Kemudian,embrio ”dititipkan” ke surrogate mother untuk dilahirkan secaranormal. Sedangkan, pada kloning terapeutik (C), setelah embriomencapai tahapan blastosit, embrio dikultur secara in vitro untukdidiferensiasikan menjadi berbagai jenis sel untuk kegunaan terapeutik.

Kloning reproduktif adalah suatu teknologi yang digunakanuntuk menghasilkan individu (hewan) baru. Genetika hewan klon tidakseluruhnya memiliki kesamaan dengan sang induk1. Denganmenggunakan teknik SCNT, persamaan genetika hewan klon denganinduknya hanya terletak pada inti DNA donor yang berada dikromosom. Hewan klon juga memiliki material genetik lainnya yangberasal dari DNA mitokondria di sitoplasma1. Teknologi kloningreproduktif dapat digunakan untuk mencegah terjadinya kepunahanhewan-hewan langka ataupun hewan-hewan sulit dikembangbiakkan.Namun,laju keberhasilan teknologi ini sangatlah rendah.

Parameter yang dijadikan sebagai tolak ukur keberhasilandalam SCNT adalah kemampuan sitoplasma pada sel telur untukmereprogram inti dari sel donor dan juga kemampuan sitoplasmauntuk mencegah terjadinya perubahan-perubahan secara epigenetikselama dalam perkembangannya12. Dari semua penelitian yang telahdipublikasikan, tercatat hanya sebagian kecil saja dari embrio hasilrekonstruksi (menggunakan sel somatik dewasa atau fetal) yangberkembang menjadi individu muda yang sehat, dan umumnya lajukeberhasilannyakurang dari 4%

SCNT merupakan bagian dari terapi sel punca yang bertujuanuntuk menghindari Adanya reaksi penolakan terhadap system imunpasien pada saat dilakukan terapi. Dalam beberapa dekade terakhir,minat terhadap penelitian sel punca terus meningkat tajam. Sel puncamemiliki potensi yang sangat menjanjikan untuk terapi berbagaipenyakit sehingga menimbulkan harapan baru untuk mengobatinya.Sampai saat ini, ada 3 golongan penyakit yang dapat diatasi denganpenggunaan sel punca di antaranya adalah:1. Penyakit autoimun,contoh penyakit lupus.2. Penyakit d e g e n e r a tif, contoh stroke, Parkinson, Alzhimer.3. Penyakit kanker, contoh leukemia.

Sel punca embrionik sangat plastis dan mudah dikembangkanmenjadi berbagai macam jaringan sel, seperti neuron, kardiomiosit,

125

osteoblast, fibroblast, dan sebagainya. Oleh karena itu, sel puncaembrionik dapat digunakan untuk transplantasi jaringan yang rusak14.Selain itu, sel punca embrionik memiliki tingkat imunogenisitas yangrendah selama belum mengalami diferensiasi .

Salah satu cara untuk menghindari terjadinya graft versus hostdisease (GVHD) adalah dengan menggunakan sel punca embrionikdengan sel somatik yang bersumberdari pasien itu sendiri sehinggatidak akan ada penolakan lagi terhadap sistem imunnya. Denganmenggunakan teknologi SCNT, sel punca embrionik yang dihasilkanakan identik dengan induknya (dalam hal ini adalah pasien itu sendiri).

Hal itu mengakibatkan tidak akan adanya reaksi penolakanterhadap system imun pasien apabila dilakukan transplantasi. Secarateoritis,teknik SCNT memiliki potensi besar dalam dunia kesehatankarena dapat dipergunakan untuk transplantasi berbagai organ danjaringan pada manusia. Secara singkat tahapan untuk melakukankloning terapeutik pada manusia adalah mengambil biopsy sel somatikdari tubuh pasien dan inti dari sel somatic tersebut ditransfer ke dalamsel telur donor yang telah dikeluarkan intinya (unfertilized enucleatedoocyte). Sel telur hasil manipulasi dikultur sampai ke tahapan tertentudan setelah mengalami berbagai proses akan didapatkan sel puncaembrionik. Sel punca embrionik ini diarahkan perkembangannyamenjadi suatu jaringan atau organ tertentu yang akan dapat digunakanuntuk transplantasi jaringan atau organ dan tidak akan mengalamirejeksi sistem imun pada pasien itu sendiri (immunologicallycompatible transplant).

12. Kultur Sel HewanKultur sel hewan adalah sisitem menumbuhkan sel manusia

maupun hewan untuk tujuan memproduksi metabolit tertentu. Padasaat sekarang aplikasi dari system ini banyak digunakan untukmenghasilkan untuk menghasilkan produk-produk farmasi dan kitdiagnostik dengan kebanyakan jenis produk berupa molekul proteinkompleks. Hal yang paling mendorong kearah aplikasi ini adalah karenabiaya operasionalnya yang tinggi, terutama medium. Selain itu systemmetabolisme sel hewan tidak “seramai” pada system metabolisme seltanaman. Sekalipun demikian ada aplikasi yang berhubungan tidaklangsung dengan masalah pangan, misalnya: penetapan jenis kelamindari embrio yang akan ditanam, penentuan masa ovulasi dari sapid an

126

fertilisasi in vitro untuk hewan. Aadapun contoh-contoh produk yangbiasa dihasilkan oleh sel hewan misalnya: interferon, tissue plasminogenactivator, erythroprotein, hepatitis B surface antigen.

127

10Rekayasa Genetik di bidang Pertanian

10.1. Tanaman Transgenik dan Jenisnya

Apakah transgenik itu? Transgenik terdiri dari kata trans yangberarti pindah dan gen yang berarti pembawa sifat. Jadi transgenikadalah memindahkan gen dari satu makhluk hidup ke makhluk hiduplainnya, baik dari satu tanaman ke tanaman lainnya, atau dari genhewan ke tanaman. Transgenik secara definisi adalah the use of genemanipulation to permanently modify the cell or germ cells oforganism (penggunaan manipulasi gen untuk mengadakan perubahanyang tetap pada sel makhluk hidup).

Tujuan rekayasa genetika dan contohnya pada tanaman:

1. Menghambat pematangan dan pelunakan buah (Tomat)2. Tahan terhadap serangan insektisida (Tomat, kentang, jagung)3. Tahan terhadap serangan ulat (Kapas)4. Tahan terhadap insekta dan virus (Kentang)5. Tahan terhadap virus (Squash, Pepaya)6. Tahan terhadap insekta dan herbisida (Jagung, Padi, Kapas dan Canola)7. Toleran terhadap herbisida (Kedelai, Canola, Kapas, Jagung)8. Perbaikan komposisi nilai gizi (Canola (high laurate oil), Kedelai (high

oleid acid oil), Padi (high beta-carotene))

10.2. Contoh Tanaman yang telah Menggunakan RekayasaGenetika

a. Kedelai TransgenikDengan rekayasa genetika, dihasilkan tanaman transgenik yang

tahan terhadap hama, tahan terhadap herbisida dan memiliki kualitashasil yang tinggi. Saat ini secara global telah dikomersialkan dua jenis

128

kedelai transgenik yaitu kedelai toleran herbisida dan kedelai dengankandungan asam lemak tinggi

b. Jagung Transgenik

Di Amerika Serikat, komoditi jagung telah mengalami rekayasagenetika melalui teknologi rDNA, yaitu dengan memanfaatkan gen daribakteri Bacillus thuringiensis (Bt) untuk menghindarkan diri dari seranganhama serangga yang disebut corn borer sehingga dapat meningkatkanhasil panen. GenBacillus thuringiensis yang dipindahkan mampumemproduksi senyawa pestisida yang membunuh larva cornborer tersebut

Gambar 10.1 Jagung transgenik

c. Kapas TransgenikGen yang paling banyak digunakan adalah gen cry (gen

toksin) dari Bacillus thuringiensis, gen-gen dari bakteri untuk sifattoleransi terhadap herbisida, gen yang menunda pematangan buah. Bagipara petani, keuntungan dengan menggunakan kapas transgenik adalahmenekan penggunaan pestisida atau membersihkan gulma tanamandengan herbisida secara efektif tanpa mematikan tanaman kapas.Serangga merupakan kendala utama pada produksi tanaman kapas. Di

129

samping dapat menurunkan produksi, serangan serangga hama dapatmenurunkan kualitas kapas.Saat ini lebih dari 50 persen arealpertanaman kapas di Amerika merupakan kapas transgenik danbeberapa tahun ke depan seluruhnya sudah merupakan tanaman kapastransgenik.

Gambar 10.2 Kapas transgenik

d. Tomat Transgenik

Tomat transgenik memiliki suatu gen khusus yangdisebut antisenescens yang memperlambat proses pematangan (ripening)dengan cara memperlambat sintesis enzim poligalakturonase sehinggamenunda pelunakan tomat. Dengan mengurangi produksi enzimpoligalakturonase akan dapat diperbaiki sifat-sifat pemrosesan tomat.Varietas baru tersebut dibiarkan matang di bagian batang tanamannyauntuk waktu yang lebih lama sebelum dipanen. Bila dibandingkandengan generasi tomat sebelumnya, tomat jenis baru telah mengalamiperubahan genetika, tahan terhadap penanganan dan ditransportasilebih baik, dan kemungkinan pecah atau rusak selama pemrosesan lebihsedikit.

130

Gambar 10.3 Tomat transgenik

F. Buah tanpa biji

Tren baru dalam budi daya buah-buahan adalah menghasilkanbuah tanpa biji (seedless), terutama untuk buah yang harganya mahalseperti anggur, jeruk, dan durian. Selain meningkatkan daya tarikkonsumen, harga buah tanpa biji juga lebih mahal. Secara alami, bijisebenarnya diperlukan tanaman untuk berkembang biak, terutama bagitanaman yang tidak bisa diperbanyak secara vegetatif. Biji biasanyaterlindung di dalam buah.

131

Gambar 10.4 Anggur transgenik

Biji merupakan sumber hormon (auksin) yang diperlukandalam proses pertumbuhan dan perkembangan buah. Namun, padabeberapa jenis buah-buahan, biji terkadang mengganggu dan tidakdiinginkan karena merepotkan pada saat buah dikonsumsi.

132

Gambar 10.5 Semangka transgenik

Kontra

secara ekonomi: Tanaman transgenik diperkirakan berbahaya,di beberapa Negara telah mengatur dan menolak produktransgenik, sehingga menutup pasar ekspor transgenik

· Produk bebas transgenik memperoleh harga yanglebih baik di pasaran internasional

· Perusahaan transgenik memonopoli sistem produksipangan

· Perubahan pasar internasional atas produk minyaktangan

Dari segi konsumen:· Keracunan makanan transgenik· Berisiko kanker· Alergi terhadap makanan· Rusaknya kandungan gizi dan kualitas makanan· Kekebalan bibit penyakit terhadap antibiotik

Dari segi pertanian:

· Hasil panen lebih rendah· Biaya produksi lebih tinggi

133

· Memicu pertanian monokultur yang tidakberkelanjutan

· Hilangnya varietas lokal· Peningkatan penggunaan bahan kimia pertanian

Dari segi lingkungan:

· Polusi genetika· Hilangnya keanekaragaman hayati· Virus tanaman baru yang lebih berbahaya· Dampak negative pada ekologi tanah· Gulma super· Hama super

Keuntungan buah tanpa biji yaitu lebih mudah dalammengkonsumsinya

10.3. Keunggulan Tanaman Rekayasa Genetika (GeneticallyModified Organism)

Berbagai keunggulan dari tanaman yang diperoleh denganteknik rekayasa genetika adalah sebagai berikut :

1. Menghasilkan jenis tanaman baru yang tahan terhadap kondisipertumbuhan yang keras seperti lahan kering, lahan yangberkadar garam tinggi dan suhu lingkungan yang ekstrem.

2. Toleran terhadap herbisida yang ramah lingkungan yang dapatmengganggu gulma, tetapi tidak mengganggu tanaman itusendiri. Contoh kedelai yang tahan herbisida dapatmempertahankan kondisi bebas gulamnya hanya denganseparuh dari jumlah herbisida yang digunakan secara normal

134

3. Meningkatkan sifat-sifat fungsional yang dikehendaki, sepertimereduksi sifat atau daya alergi (toksisitas), menghambatpematangan buah, kadar pati yang lebih tinggi serta dayasimpan yang lebih panjang. Misalnya, kentang yang telahmengalami teknologi rDNA, kadar patinya menjadi lebih tinggisehingga akan menyerap sedikit minyak bila goreng (deep fried).Dengan demikian akan menghasilkan kentang goreng dengankadar lemak yang lebih rendah.

4. Sifat-sifat yang lebih dikehendaki, misalnya kadar protein ataulemak dan meningkatnya kadar fitokimia dan kandungan gizi.

Penggunaan rekayasa genetika khususnya pada tanaman tidak terlepasdari pro kontra mengenai penggunaan teknologi tersebut. Berikut inidisebutkan berbagai pandangan yang setuju terhadap tanamantransgenik :

1. Tanaman transgenik memiliki kualitas yang lebih tinggi dibandingdegan tanaman konvensional.

2. Teknik rekayasa genetika sama dengan pemuliaan tanaman yaitumemperbaiki sifat-sifat tanaman dengan menambah sifat-sifatketahanan terhadap cengkeraman hama maupun lingkungan yangkurang menguntungkan.

3. Mengurangi dampak kerusakan dan pencemaran lingkungan.

Selain pandangan yang setuju terhadap tanaman transgenik adajuga pandangan-pandangan yang tidak setuju atau kontra terhadaptanaman transgenik, berikut alasan-alasannya:

1. Pengaruh pada kesehatan manusia2. Pengaruh pada lingkungan (ekologis)3. Pengaruh etika dan agama4. Pengaruh terhadap ekonomi global

135

11Tinjauan Rekayasa Genetik dalamPerspektif Islam

Hukum kloning pada hewan dan tumbuhan masihdiperbolehkan selama benar-benar digunakan untuk kemaslahatanumat manusia. Teknik kloning di sini dimaksudkan untuk memperbaikikualitas hewan dan tumbuhan yang dikonsumsi manusia. Dengan katalain, juga merupakan tujuan untuk meningkatkan kualitas kehidupanmanusia itu sendiri. Adapun Hadis yang dikeluarkan oleh AbdulRazzaq di dalam kitab Jami’nya, adalah sebagai berikut:

وعلى العامل عنـد الإطلاق مایحتاجھ الثمر مما یتـكرر كل سنة كسقي وتـنـقیة نھر (الجمل شرح المنج وإصلاح احاجین وتـلقـیح للنحل وھو وضع طلع ذكر في طلع أنثى

٣/۵٢٧(Artinya: “Dan bagi pekerja, maka ia diperbolehkan untuk melakukan apapunyang diperlukan oleh buah yang berulang-ulang setiap tahun, seperti pengairan,penjernihan sungai, perbaikan peralatan pertanian yang rusak, dan mengawinkankurma, yakni meletakkan tepung sari jantan ke tepung sari betina.”[12]

)٣/٦٨فإن تناسل الحیوان مطلوب لذاتـھ لمصالح العبد. (الجمل شرح المنھجArtinya: “Sesungguhnya reproduksi hewan itu memang dicari bagi kemaslahatanmanusia.”[13]

Kloning pada manusia haram menurut hukum Islam dan tidakboleh dilakukan. Dalil-dalil keharamannya adalah sebagai berikut :

1. Anak-anak produk proses Kloning tersebut dihasilkan melaluicara yang tidak alami. Padahal justru cara alami itulah yangtelah ditetapkan oleh Allah untuk manusia dan dijadikan-Nyasebagai sunnatullah untuk menghasilkan anak-anak danketurunan. Allah SWT berfirman :

136

“Dan bahwasanya Dialah yang menciptakan berpasang-pasangan laki-laki danperempuan, dari air mani apabila dipancarkan.” (QS. An Najm : 45-46)

Allah SWT berfirman :

“Bukankah dia dahulu setetes mani yang ditumpahkan (ke dalam rahim),kemudian mani itu menjadi segumpal darah, lalu Allah menciptakannya, danmenyempurnakannya.” (QS. Al Qiyaamah : 37-38)

2. Anak-anak produk Kloning dari perempuan saja (tanpa adanyalaki-laki), tidak akan mempunyai ayah. Dan anak produkKloning tersebut jika dihasilkan dari proses pemindahan seltelur-yang telah digabungkan dengan inti sel tubuh-ke dalamrahim perempuan yang bukan pemilik sel telur, tidak pula akanmempunyai ibu. Sebab rahim perempuan yang menjadi tempatpemindahan sel telur tersebut hanya menjadi penampung,tidak lebih. Ini merupakan tindakan menyia-nyiakan manusia,sebab dalam kondisi ini tidak terdapat ibu dan ayah. Hal inibertentangan dengan firman Allah SWT :

"Hai manusia, Sesungguhnya Kami menciptakan kamu dari seorang laki-laki danseorang perempuan dan menjadikan kamu berbangsa - bangsa dan bersuku-sukusupaya kamu saling kenal-mengenal. Sesungguhnya orang yang paling muliadiantara kamu disisi Allah ialah orang yang paling taqwa diantara kamu.Sesungguhnya Allah Maha mengetahui lagi Maha Mengenal.” (QS. Al Hujuraat

: 13)

3. Kloning manusia akan menghilang nasab (garis keturunan).Padahal Islam telah mewajibkan pemeliharaan nasab. [14]Rasulullah SAW telah bersabda :

علیھ وسلم قال من ادعى إلى غیر أبیھ صلى الله وھو یعلم أنھ غیر أبیھ أن رسول اللهفالجنة علیھ حرام

Nabi saw. Bersabda: “Barang siapa mengaku bernasab kepada orang selainayahnya sedangkan ia tahu bahwa ia bukan ayahnya maka ia diharamkanmasuk surga”. (HR. Bukhari dan Muslim).[15]

137

Berdasarkan dalil-dalil itulah proses Kloning manusiadiharamkan menurut hukum Islam dan tidak boleh dilaksanakan.

138

12BIOETIKA, ASPEK KEAMANAN DANREGULASI PRODUK HASIL REKAYASAGENETIKA

12.1. PENDAHULUAN

Teknologi rekayasa genetika telah memberikan kontribusi yangbermanfaat dalam perkembangan produk dan jasa dalam berbagaikepentingan umat manusia. Namun demikian beberapa produk hasilrekayasa genetika dikhawatirkan dapat menimbulkan dampak negative,baik ditinjau dari aspek meliputi etika, agama, maupun dari aspeksocial, ekonomi, kesehatan, dan lingkungan.

Kehawatiran yang paling vocal dating dari para pecintalingkungan hidup yang mengatakan bahwa produk hasil rekayasagenetika telah mengancam kelestarian ekosistem. Keadaan ini bisadimengerti karena kemungkinan adanya dampak negative yangdisebabkan oleh produk hasil rekayasa genetika. Salah satu contoh yangpaling menarik adalah tanaman transgenic (jagung Bt), yang membawagen Bt, yang menyandi protein Cry bakteri Bacillus thuringiensis ,disinyalir dapat menyebabkan kematian larva spesies kupu-kupu raja(Danaus plexipus). Meskipun kebenaran bahwa kematian kupu-kupu rajadisebabkan oleh serbuk sari tanaman jagung transgenic masihcontroversial, namun perlu diantisipasi kemungkinan dampak negatiftanaman transgenic terhadap keseimbangan ekosistem karenabagaimanapun kecilnya kemungkinan tersebut tetap ada.

Target utama produksi jagung Bt adalah proteksi terhadapserangga pemakan daun, namun gen cry pada jagung Bt jugamengekspresikan protein Cry pada serbuk sari tanaman tersebut.Diduga bahwa serbuk sari jagung Bt tertiup angin dan menempel padadaun tanaman gulma yang berada tidak jauh dari perkebunan tanamanjagung Bt, sehingga larva kupu-kupu raja yang memakan daun gulmayang telah dilapisi oleh serbuk sari tanaaman transgenic tersebutmengalami kematian. Berdasarkan hasil percobaan laboratorium yang

139

dilakukan oleh John Losey dan kawan-kawan yang dipublikasi padaMajalah Nature, bulan Mei 1999, menyebutkan bahwa daun tanamangulma (Asclepias curassavica) yang ditebari dengan serbuk sari jagung Btdapat mematikan ulat kupu-kupu raja. Kematian larva kupu-kupu raja,selain akan mengancam kehidupan kupu-kupu raja, juga dihawatirkandapat menyebabkan kematian pada organisme bukan target lainnya.

Tanaman transgenik yang dibuat tahan terhadap seranganhama tertentu misalnya terhadap serangga Lepidoptera, setelah ditanamternyata memiliki akar yang dapat mematikan mikroorganisme danorganism tanah, misalnya cacing tanah, sehingga dihawatirkan bahwatanaman transgenic dapat mengalami pergeseran genetic dan dapatmenyebabkan gangguan pada ekosistem.

Penggunaan gen yang berasal dari babi untuk memproduksibahan makanan, cloning manusia, xenotransplantasi, kloning sel punca(stem cell) dari embrio manusia untuk kepentingan medis juga dinilaidapat menimbulkan kontroversi, baik dari segi norma agama maupunnilai-nilai moral kemanusiaan.

Organisme transgenik terutama pangan transgenik misalnyaikan atau tomat transgenic dihawatirkan dapat menjadi sumber transfergenetik yang berpotensi menimbulkan efek yang tidak diinginkan.

Rekayasa genetika bahan pangan dapat menghasilkan allergenatau toksin baru yang semula tidak pernah dijumpai pada bahan panganalamiah. Perlu diwaspadai kemungkinan timbulnya risiko yang terkaitdengan akumulasi hasil metabolisme hewan, tanaman, ataumikroorganisme transgenik yang dapat menghasilkan produksampingan yang berbahaya baik toksin, allergen, bahan karsinogenikatau kemungkinan adanya transfer genetik yang dapat menimbulkangangguan pada kesehatan. Dalam bab ini akan diuraikan tentangberbagai aspek yang dapat menjadi rambu-rambu dalam pemanfaatanteknologi rekayasa genetika agar dapat mengurangi atau menghindaridampak negatif yang dapat ditimbulkan.

12.2. PRODUK HASIL REKAYASA GENETIKA

140

Produk hasil rekayasa genetika adalah suatu organisme yangmemiliki materi genetic yang diperoleh melalui teknologi rekayasagenetika. Prinsip umum dalam menghasilkan produk hasil karyagenetika dilakukan dengan cara memasukkan materi genetik baru kedalam genom individu suatu organism.

Jenis-jenis produk hasil rekayasa genetika antara lain terdiri dari (i).Hewan hasil rekayasa genetika, dan hasil olahannya, (ii). Tanaman hasilrekayasa genetika, dan hasil olahannya, dan (iii). Mikroorganisme hasilrekayasa genetika dan hasil olahanyya.

Produk hasil rekayasa genetika yang merupakan hasil inovasi pentingdalam biologi, dan data dimanfaatkan dalam berbagai kebutuhan umatmanusia karena memiliki berbagai keuntungan antara lain:

1. Tahan terhadap serangan hama dan penyakit tanaman.Keunggulan ini dapat memberikan keuntungan pada petanidengan cara menekan biaya pembelian peptisida, danmengurangi penolakan konsumen atas hasil pertanian yangterkontaminasi dengan peptisida, serta dapat menekankerusakan lingkungan akibat akumulasi pemakaian peptisida.

2. Toleran terhadap herbisida, sehingga tak memiliki efek negatifterhadap penggunaan herbisida.

3. Tahan terhadap cuaca dingin. Gen anti beku ikan yang dapathidup pada air laut di luar daerah kutup yang dingin diisolasidan dipindahkan ke dalam tanaman tembakau dan tomat,sehingga tanaman transgenic tersebut tahan apabila ditanampada musim dingin.

4. Tahan terhadap kekeringan dan air payau, sehingga tanamanhasil rekayasa genetika mampu tumbuh pada kondisilingkungan yang kering dan tanah yang mengandung garamtinggi.

5. Dapat membantu menambah kekurangan jenis vitamin dannutrisi tertentu, misalnya galur padi transgenik yangmengandung provitamin A, sehingga mampu mencegahkebutaan pada penduduk di Negara berkembang.

6. Sebagai sumber produksi obat dan vaksin. Vaksin yangdiproduksi oleh tanaman hasil rekayasa genetika memudahkan

141

dalam pemberian, pengiriman, dan cara penyimpanannyadibandingkan dengan vaksin injeksi.

7. Sebagai remediasi lingkungan yang dapat dimanfaatkan untukmengurangi kualitas hidup manusia dengan dapatdiproduksinya berbagai jenis protein terapetik yang dapatdigunakan sebagai obat maupun untuk alat bantu diagnosispenyakit.

12.3. KEAMANAN PRODUK HASIL REKAYASAGENETIKA

Kontroversi tentang keamanan produk hasil rekayasa genetikasampai saat ini masih terus terjadi. Sebagian pendapat menanggapbahwa produk hasil rekayasa genetika telah memberikan berbagaimanfaat yang besar pada peningkatan kesejahteraan manusia, baikdalam bidang pertanian, pangan, industry, kesehatan, dan lingkunganhidup. Di pihak lain ada anggapan bahwa produk hasil rekayasagenetika, dapat menimbulkan dampak buruk terhadap ekosistem.Untuk meminimalkan dampak yang merugikan dari produk hasilrekayasa genetika, melalui Konvensi Keanekaragaman Hayati telahdiatur ketentuan umum mengenai keamanan hayati produk hasilrekayasa genetika. Protokol ini mengatur pergerakan lintas batas,penanganan dan pemanfaatan produk hasil rekayasa genetika. Protokolyang dikenal dengan Protokol Cartagena ini secara langsung mengikatNegara-negara yang telah meratifikasinya termasuk Indonesia. Sebagaitindak lanjut dari ratifikasi Protokol Cartagena, Indonesia telahmembuat Undang-Undang Nomor 21/2004, mengenai PengesahanProtokol Cartagena tentang Keamanan Hayati dan kemudiandilengkapi dengan Peraturan Pemerintah Nomor 21 Tahun 2005tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetika. Melalui undang-undang dan Peraturan Pemerintah tersebut Indonesia telah menyikapisetiap permasalahan yang terkai dengan produk hasil rekayasa genetika,dengan prinsip pendekatan kehatia-hatian dalam dalam rangkamemperhatikan aspek keamanan berdasarkan kaidah-kaidah ilmiah danmempertimbangkan aspek agama, etik, social budaya dan estetika.Implementasi dari peraturan perundang-undangan tersebut, harusdibentuk suatu kelembagaan dan infra struktur untuk menyusun sistemdan prosedur pengawasan baik di tingkat pusat maupun di daerah.

142

Menurut PP No. 21/2005 tentang Keamanan Hayati ProdukRekayasa Genetika yang dimaksud dengan keamanan hayati produkhasil rekayasa genetika, meliputi keamanan lingkungan, dan keamananpangan produk hasil rekayasa genetika. Keamanan lingkungan adalahkondisi dan upaya yang diperlukan untuk mencegah kemungkinantimbulnya resiko yang merugikan keanekaragaman hayati sebagai akibatpemanfaatan produk hasil rekayasa genetika.

Keamanan pangan produk hasil rekayasa genetika adalah kondisi danupaya yang diperlukan untuk mencegah kemungkinan timbulnyadampak yang merugikan dan membahayakan kesehatan manusia, akibatproses produksi, penyiapan, penyimpanan, peredaran, dan pemanfaatanpangan produk hasil rekayasa genetika.

Informasi dan petunjuk tentang keamanan lingkungan produk hasilrekayasa genetika harus menjadi perhatian antara lain adalah (i).Deskripsi dan tujuan penggunaan produk hasil rekayasa genetika, (ii).Perubahan genetik dan fenotip yang diaharapkan harus terdeteksi, (iii).Identitas yang jelas tentang taksonomi, fisiologi, dan reproduksi produkhasil rekayasa genetika, (iv). Organisme yang digunakan sebagai sumbergen, harus dinyatakan secara jelas dan lengkap, (v). Metode rekayasagenetika yang digunakan harus mengikuti prosedur baku yang secarailmiah dapat dipertanggungjawabkan, (vi). Karakterisasi molecularproduk hasil rekayasa genetika harus terperinci dengan jelas, (vii).Ekspresi gen yang ditransformasikan ke dalam sistem ekspresi harusstabil, dan (viii). Cara pemusnahan produk hasil rekayasa genetika yangdigunakan bila terjadi penyimpangan.

Sedangkan informasi dan petunjuk tentang keamanan pangan produkhasil rekayasa genetika antara lain adalah (i). Metode rekayasa genetikayang digunakan harus mengikuti prosedur baku yang secara ilmiahdapat dipertanggungjawabkan (ii). Kandungan gizi produk hasilrekayasa genetika, secara substansial harus sepadan dengan produkalamiah, (iii). Kandungan senyawa beracun, dan penyebab alergi dalamproduk hasil rekayasa genetika, secara substansial harus sepadandengan produk alamiah, (iv). Kandungan Karbohidrat, protein, lemak,serat, asam amino, asam lemak, mineral dan vitamin dalam produk hasilrekayasa genetika, secara substansial harus sepadan dengan produkalamiah, (v). Protein yang diekspresikan oleh gen yang dipindahkan ke

143

dalam sistem ekspresi tidak bersifat sebagai allergen, dan (vi). Harusdiinformasikan cara pemusnahan bila terjadi penyimpangan pada prdukhasil rekayasa genetika.

Penggunaan gen asing yang ditransfer ke dalam sel hospes untukmemproduksi organisme transgenik dapat menimbulkan dampaknegative terhadap keamanan hayati dan ekosistem. Oleh sebab itu,diperlukan cara pengujian yang cepat dan cermat sebelum produk hasilrekayasa genetika tersebut digunakan. Pada dasarnya cara pengujiiankeamanan hayati adalah mengetahui tingkat ekspresi DNA rekombinanyang sengaja dimasukkan, dan memastikan bahwa materi genetiktersebut tidak dipindahkan atau me-nyebar ke organism lain yangterdapat di lingkunan sekitarnya.

Produk hasil rekayasa genetika yang akan dimanfaatkan dan diedarkantelebih dahulu harus dilakukan kajian tentang tingkat keamanannya(premarket food safety assessment). Jika dianggap aman untuk dikonsumsidan dijual maka harus diberikan label yang menyatakan bahwa produktersebut adalah “produk hasil rekayasa genetika”.

Pengujian yang dapat dilakukan sebelum produk hasil rekayasa genetikadiedarkan pada masyarakat antara lain meliputi (i). Kajian dampakproduk hasil rekayasa genetika terhadap keamanan lingkungan, (ii).Kajian dampak produk hasil rekayasa genetika terhadap kesehatanmanusia, dan (iii). Kajian dampak produk hasil rekayasa genetikaterhadap aspek social ekonomi.

Badan internasional Food and Agriculture Organization (FAO), telahmemberikan beberapa petunjuk mengenai pengawasan produk hasilrekayasa genetika antara lain adalah :

1. Peraturan dan regulasi mengenai keamanan pangan yangterpadu harus diterapkan dengan baik untuk melindungikesehatan masyarakat, dimana semua Negara harusmenempatkan peraturan dan regulasi tersebut seimbangdengan perkembangan teknologi.

2. Pemindahan gen yang dapat menyebabkan alergi hendaknyadihindari, kecuali telah tebukti bahwa gen yang dipindahkantidak menunjukkan terjadinya alergi.

144

3. Pemindahan gen dari bahan pangan yang mengandung allergenke organisme lain tidak boleh dipasarkan.

4. Senyawa allergen yang dapat menimbulkan reaksi imunitasharus diidentifikasi.

5. Validasi metode pengujian keamanan produk hasil rekayasagenetika harus divalidasi secara berkala,

6. Perlu adanya pangkalan data tentang organism transgenik yangdigunakan sebagai sumber produksi pangan.

7. Perlu dibentuk jejaring badan pengawas antar Negara FAOuntuk membahas dan memutuskan segala sesuatu yangberhubungan dengan keamanan produk hasil rekayasagenetika.

8. Negara berkembang harus dibantu dalam pendidikan danlatihan tentang keamanan pangan dan komponen pangan yangditimbulkan oleh modifikasi genetik.

9. Perlu ditingatkan penelitian dan pengembangan metode untukmeningkatkan kemampuan dalam melakukan penilaianterhadap keamanan produk hasil rekayasa genetika.

12.4. ETIKA DAN REGULASI PRODUK HASIL REKAYASAGENETIKA

Teknologi rekayasa genetika merupakan capaian yang menakjupkandalam bidang biologi molekular, apabila digunakan dengan baik dantepat dapat memberikan banyak manfaat dalam meningkatkan tarafkehidupan umat manusia di dunia.

Kemampuan manusia untuk merekayasa mahkluk hidup dengan caramerubah sifat filogenik suatu organisme melalui rekayasa genetika tentumemerlukan rambu dan batasan agar tidak terjadi penyalahgunaanataupun menimbulkan gangguan pada kesehatan manusia dankelestarian ekosistem. Oleh sebab itu, penciptaan suatu organisme yangmemiliki sifat-sifat baruini perlu diatur baik dari aspek etik profesisebagai ilmuan maupun dari aspek regulasi dan perundangan.

Kode etik dan standar perilaku yang diaharapkan dapat diberlakukanbagi para pakar khususnya kelompok ilmuan rekayasa genetika antaralain:

145

1. Ilmuan yang berkecimpung dalam bidang rekayasa genetika,hendaknya menghormati standar kode etik tertinggi yangbersifat universal yang secara aktif dan proaktif melayani danmemperjuangkan kepentingan dan kesejahteraan masyarakatsecara luas. Penemuan dan pernyataan ilmiah untuk umumharus terpelihara ketepatannya jauh dari sensasi danpenyalahgunaan, tanpa membesar-besarkan kelebihannyaataupun menutupi kekurangan atau efek pegembangan suatuteknologi tersebut.

2. Berkewajiban memajukan, mengembangkan, memanfaatkanbidang keahliannya untuk didarmabaktikan bagi kepentingankesejahteraan umat manusia, dan dapat memahamiketerbatasan pengetahuan dan ilmunya, serta menghormatimakna dari kebenaran ilmiah.

3. Harus senantiasa berusaha untuk memajukan profesinyadengan cara meningkatkan kemampuan dan kompetensinyasehingga selalu dapat mengikuti perkembangan mutahir dalambidang ilmunya, dan dapat meningkatkan kemitraan sertajejaring ilmiah diantara sesama ilmuan lainnya.

4. Dituntut untuk memahami dan mengantisipasi dampak negatifdari pengembangan ilmu dan teknologi terhadap kesehatandan lingkungan.

Regulasi dan perundangan tentang keamanan hayati produk hasilrekayasa genetika, antara lain Undang-Undang Nomor 21 tahun 2004,dan PP No. 21/2005, dibuat untuk menjadi dasar hukum dalammewujudkan keamanan hayati, keamanan pangan dan kesehatan bagimasyarakat, serta pengelolaan sumber daya hayati, perlindungankonsumen dan kepastian berusaha, meggunakan pendekatan kehati-hatian dan prinsip kaidah metodologi ilmiah, asek agama, estetika dansosial budaya.

Cakupan regulasi dan perundangan tentang keamanan hayati produkhasil rekayasa genetika, meliputi :

1. Jenis dan persyaratan produk hasil rekayasa genetika.2. Penelitian dan pengembangan.3. Regulasi dan cara pemasukan produk hasil rekayasa genetika

dari luar negeri.

146

4. Pengkajian, pelepasan, dan peredaran serta pemanfaatanproduk hasil rekayasa genetika.

5. Pengawasan dan pengendalian produk hasil rekayasa genetika.6. Kelembagaan yang mengawasi produk hasil rekayasa genetika.

Penelitian dan Pengembangan

Setiap orang yang melakukan penelitian dan pengembangan produkhasil rekayasa genetika, wajib mencegah atau menanggulangi dampaknegative yang ditimbulkan oleh kegiatan penelitiannya terhadapkesehatan manusia dan lingkungan. Proses penelitian danpengembangan produk hasil rekayasa genetika, harus dilakukan dilaboratorium atau di lapangan uji yang terbatas. Produk hasil rekayasagenetika, sebelum diusulkan untuk dilepas atau diedarkan harus melaluiuji efikasi dan memenuhi persyaratan kemanan hayati. Tata carapenelitian dan pengembangan produk hasil rekayasa genetika,dilaksanakan berdasarkan kaidah penelitian dan pengembangan yangberlaku di Indonesia serta diatur oleh kementrian yang terkait.

Pemasukan produk hasil rekayasa genetika dari luar negeri

Setiap orang atau badan usaha yang akan memasukkan produk hasilrekayasa genetika dari luar negeri untuk pertama kali, wajib mengajukanpermohonan kepada kementrian yang berwenang. Permohonan untikmemasukkan produk hasil rekayasa genetika, wajib dilengkapi denganinformasi tentang roduk meliputi (i). Dokumen yang menerangkanbahwa telah memenuhi persyaratan keamanan lingkungan, keamananpangan, (ii). Surat keterangan yang menyatakan bahwa produk hasilrekayasa genetika tersebut telah diperdagangkan secara bebas di Negaraasalnya, dan (iii). Dokumentasi pengkajian dan pengelolaan resiko dariinstitusi yang berwenang dimana pengkajian resiko tersebut pernahdilakukan.

Pengkajian, pelepasan dan peredaran serta pemanfaatan

Pengkajian terhadap produk hasil rekayasa genetika, wajib dilakukansebelum pelepasan dan peredaran. Pengkajian dilaksanakanberdasarkan permohonan tertulis dari pemohon, dan lembaga

147

keanekaragaman hayati atau kementrian lingkungan hidup harusmelaksanakan kajian menyeluruh terhadap produk hasil rekayasagenetika yang akan diedarkan tersebut. Sebelum diedarkan untukpertama kali, pemohon wajib melakukan pengujian keamanan produkhasil rekayasa genetika, di laboratorium, di fasilitas pengujian atau dilapangan uji yang terbatas.

Produk hasil rekayasa genetika yang telah memperoleh rekomendasikeamanan hayati, maka kementrian yang berwenang memberikan izinpelepasan atau peredaran sesuai dengan perundangan yang berlaku.Produk hasil rekayasa genetika yang diedarkan dapat dmanfaatkanuntuk kebutuhan berbagai bidang sesuai dengan peruntukannya.

Pengaturan dan regulasi pemanfaatan organisme transgenik perludilakukan secara berhati-hati dan berdasarkan pada data ilmiah yangmemadai, sehingga regulasi yang dibuat tidak hanya melindungimasyarakat dari dampak negatif yang ditimbulkan oleh organismetransgenik akan tetapi juga memungkinkan bagi masyarakat dapatmemanfaatkan produk transgenik secara maksimal.

Penelitian pengembangan dan pemanfaatn produk rekayasa genetikadalam bidang kefarmasian dan kedokteran sudah tentu harusmwngikuti kaidah dank kode etik penelitian dan uji klinik yang telahdiatur oleh komisi etik uji klinik berlaku secara universal.Pengembangan suatu produk yanag akan digunakan sebagaipengobatan harus melalui tahapan tertentu yang dimulai uji praklinikmeliputi uji bioaktifitas farmakologis pada binatang percobaan, ujitoksisitas akut, sub akut, dan kronis, yang kemudian dilanjutkan denganbeberapa fase uji klinik pada manusia.

Tahapan uji klinik suatu obat termasuk senyawa hasil rekayasa genetikaharus mengikuti fase-fase uji klinik yang dipersyaratkan. Uji klinik faseI, dilakukan untuk mengetahui keamanan obat jika digunakan padamanusia. Lama uji klinik fase I biasanya lebih dari satu tahun, dengansubjek sukarelawan sehat sebanyak 20-100 orang. Uji klinik fase II,dilakukan untuk mengetahui efikasi dari senyawa obat, dilakukanselama lebih dari 2 tahun pada 100-300 orang pasien. Sefangkan ujiklinik fase III, dilakukan untuk mengetahui efikasi dan adanya efeksamping dari obat, dilakukan selama 1-4 tahun setelah obat digunakan

148

oleh 1000-3000 orang pasien. Setelah uji klinik fase ke III, biasanyaobat didaftarkan Badan Pengawas Obat dan Makanan untukmendapatkan persetujuan peredaran dan penggunaan obat. BPOMmelakukan suatu tinjauan menyeluruh terhadap senyawa obat yangdidaftarkan berdasarkan analisis data hasil uji laboratorium maupunhasil uji klinik yang telah dilakukan.

Umumnya waktu yang dibutuhkan mulai dari penemuan senyawa barusampai mendapatkan persetujuan dan digunakan sebagai pengobatanmemerlukan waktu sekitar 10 sampai 14 tahun.

Setelah mendapatkan persetujuan edar dari BPOM, produsen masihharus melakukan survailans untuk memantau secara berkesinambungantentang kemungkinan adanya efek samping obat selama dipasarkan.

Dalam pelaksanaan uji klinik produkhasil rekayasa genetika, kaidah-kaidah etik uji klinik harus dipatuhi. Para sukarelawan, baik sehatmaupun sakit harus diinformasikan dengan melalui suatu formulirpersetujuan (informed consent), bahwa para sukarelawan tersebut setujuuntuk diikutsertakan dalam proses uji klinik produk hasil rekayasagenetika.

Menurut Permenkes no 290/MenKes/Per/III/2008 dan UU nomor29 tahun 2004 Pasal 45, informed consent adalah tindakan kedokteranyang diberikan oleh pasien setelah mendapatkan penjelasan secaralengkap mengenai tindakan kedokteran atau terapi yang akan dilakukanterhadap pasien tersebut.

149

Daftar Pustaka

Jamsari. 2007. Bioteknologi Pemula, Prinsip Dasar TeknikAnalisis Molekuler. Unri- Press. 180 halaman.

Jamsari, 2008. Pengantar Pemuliaan, Landasan Biologis, Genetisdan Molekuler. Unri Press.

Nicholl, D. 2002. An Introduction Genetics Engineering.Cambridge University Press. NewYork

Lewin, B. 2000. Genes. Oxford-University Press. 990 pp.

Watson, J.D., J. Tooze, D.T. Kurtz. 1983. Recombinant DNA, Ashort course. Scientific American Book. 260 pp.

Marshall, G., D. Walters. 1994. Molecular Biology in CropProtection. Chapmann & Hall. 283 pp.

Suzuki, D.T., A.J.F. Griffith, J. H. Miller, R.C. Lewontin. 1989.An Introduction to Genetic Analysis. W.H. Freeman andCompany. 768 pp.

Kempken, F and R. Kempken. 2000. Gentechnik bei Pflanzen.Springer-Verlag. Berlin. 245 pp.

Brown, T.A. 2007. Genomes 3. Garland Science Publishing.Academic Press. USA.