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Instituto Nacional Depto. de Biología Profesora: Valentina Olivares F.

TEORÍA CELULAR Y MICROSCOPÍA

Las investigaciones realizadas principalmente durante los siglos XVII y XIX, en biología celular, permitieron comprender que la célula es la unidad morfofuncional de todos los organismos y que en ellas se llevan a cabo todas las reacciones químicas que permiten el asombroso fenómeno de la vida. Por otra parte estas investigaciones además permitieron refutar la teoría sobre el origen de la vida denominada generación espontánea o abiogénesis; la cuál postulaba que la vida se originada de materia inerte o sin vida, sin la participación de forma alguna de vida. El trabajo realizado por notables científicos como Louis Pasteur, resumido en su famoso aforismo omne vivum e vivo (todo lo viviente viene de algo viviente), dejaron en claro que la vida tiene un origen orgánico y que es necesaria la presencia de estos elementos para su creación. Averigüe de que forma Pasteur, Harvey, Spallanzani, y Redi lograron refutar la idea de la generación espontánea. Escriba un breve ensayo que integre cada idea. Debido a que la mayoría de las células son demasiado pequeñas para ser observadas a simple vista, el estudio de las células ha dependido del uso del microscopio. Es por esto que el conocimiento real de las células se acompaña del desarrollo del microscopio. El primer microscopio se atribuye al holandés Zacharias Janssen, en la última década del siglo XVI. Este consistía en una lente simple, que aumentaba viarias veces el tamaño del objeto observado. En 1665 el científico e inventor inglés Robert Hooke con un simple microscopio óptico observo una delgada lámina de corcho proveniente de la corteza exterior seca del alcornoque, una especie de roble del Mediterráneo. Y vio una multitud de cajitas a las cuales denomino “células” (celdillas), siendo Hooke el primero en acuñar el término de “célula”.

Años más tarde en 1670 Antony van Leeeuwenhoek, utilizando un microscopio que ampliaba los objetos hasta 300 veces su tamaño real, fue capaz de observar diferentes tipos de células incluyendo espermatozoides, glóbulos rojos y bacterias. Finalmente los estudios microscópicos en tejidos vegetales realizados por Matthias Schleiden y los de tejidos animales hechos por Theodor Schwann, los llevaron a proponer en el año 1838 las ideas

(a) Estructura celular del corcho. Una reproducción de un dibujo de Robert Hooke de una lámina de corcho observada con uno de los primeros microscopios ópticos como el que se muestra en la imagen. Las “células” que Hooke observó fueron en realidad las paredes celulares que quedan cuando las células están muertas.

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centrales de la teoría celular, ambos investigadores llegaron a las misma conclusión: Todos los organismos están compuestos por células, mas tarde se reconoció que toda célula proviene de otra ya existente. La vida se caracteriza por una serie de propiedades que emergen en el nivel de organización celular. La teoría celular constituye uno de los principios fundamentales de la biología y establece que:

• Todos los organismos vivos están formados por una o más células. La

estructura del organismo como un todo se debe a la especial disposición de sus células y de las estructuras que éstas generan. (La célula como unidad Estructural).

• Las reacciones químicas de un organismo vivo, incluyendo los procesos

liberadores de energía y las reacciones biosintéticas, tienen lugar dentro de las células. (La célula como unidad funcional).

• Toda célula procede de la división de otra anterior. (La célula como unidad

de origen). • Las células contienen la información hereditaria de los organismos de los

cuales son parte y esta información pasa de la célula progenitora a la célula hija.

El actual reconocimiento de la célula como la unidad fundamental de todos los organismos vivos, así como el nacimiento de la biología celular contemporánea, fueron posibles debido a las observaciones realizadas con el microscopio óptico. ¿Cuánto miden las células? Muchas de las estructuras y eventos biológicos más interesantes son más pequeñas de lo que el ser humano puede observar a ojo desnudo. En realidad el ojo humano tiene una resolución de cerca de 100 µm. La gran mayoría de las células son muy pequeñas y por mucho tiempo pasaron desapercibidas por los seres humanos. En el cuadro de abajo note que de todas las estructuras nombradas, solamente la célula vegetal está escasamente dentro de nuestra resolución (capacidad de un microscopio para distinguir objetos separados por pequeñas distancias).

A continuación te presentamos una tabla con las unidades de tamaño más comunes que te servirán para estimar el tamaño de las células. Las equivalencias están en función del metro, que es un patrón de medida común.

Nombre de la unidad Abreviatura Equivalencia 1 milímetro Mm 1mm = 0,001 metro 1 micrómetro µm 1 µm = 0,000 001 metro 1 nanómetro Nm 1nm = 0, 000 000 001 metro 1 angstrom Ǻ 1 Ǻ = 0, 000 000 0001 metro

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Dato curioso La yema de un huevo también es una célula, pero tan grande que no se requiere de un microscopio para poder observarla, esta es una excepción a la mayoría de las células que son muy pequeñas.

Microscopio óptico El microscopio óptico continúa siendo un instrumento básico para los biólogos celulares, que con mejoras técnicas permite la visualización de los detalles aumentados de la estructura celular. Los microscopios ópticos contemporáneos son capaces de aumentar los objetos hasta unas mil veces. Dado que la mayoría de las células se encuentran entre 1 y 100 μm (micrones) de diámetro, pueden ser observadas en el microscopio óptico, como pueden ser también algunos de los organelos celulares como el núcleo, los cloroplastos, las mitocondrias, etc. Sin embargo, el microscopio óptico no es lo suficientemente poderoso para observar pequeños detalles de la estructura celular, cuya resolución es mucho más importante que el aumento. El límite de resolución del microscopio óptico es de 0,2 μm; dos objetos separados por menos de esta distancia aparecen como una única imagen, en lugar de distinguirse una de otra. Este limite se debe a la longitud de onda de la luz (0,4 – 0,7 µm). Las células observadas bajo el microscopio óptico pueden estar vivas o fijadas y teñidas.

Rutinariamente se utilizan diferentes tipos de microscopia óptica para estudiar varios aspectos de la estructura celular. El más simple es el microscopio de campo luminoso, en el que la luz pasa directamente a través de la célula y en el que la habilidad para distinguir las diferentes partes de la célula depende del contraste que se obtiene de la absorción de la luz visible por los componentes celulares. En muchos casos las células se tiñen con tinciones que reaccionan con proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos para resaltar el contraste entre las diferentes partes de la célula. Antes de teñir las muestras son normalmente tratadas con fijadores (como el alcohol, ácido acético, o formaldehído) para estabilizar y conservar sus estructuras. El examen de los tejidos fijados y teñidos mediante el microscopio de campo luminoso es la práctica estándar para analizar las muestras de tejidos en los laboratorios histológicos (fig.1). Tales procedimientos de tinción matan a las células, por tanto no resultan apropiados para muchos experimentos en donde se desea una observación de células vivas.

cabezal

brazo

desplazamiento de platina

macrométrico

micrométrico

condensador

Ocular

revolver

objetivos

platina

foco

base

Microscopio óptico

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Fig. 1 Esta fotomicrografía muestra varias células nerviosas.

Sin la tinción, el paso directo de la luz no proporciona el contraste suficiente para distinguir muchas de las partes de la célula, limitando la utilidad del microscopio de campo luminoso. Sin embrago, las variaciones ópticas del microscopio óptico se pueden utilizar para potenciar el contraste entre las ondas de luz que pasan a través de regiones de la célula con diferentes densidades. Los dos métodos más comunes para la visualización de células vivas son la microscopía de contraste de fases (fig.2) y la microscopía de interferencia-contraste diferencial (DIC – Nomarski) (fig.3).

Fig.2 Imágenes de microscopía óptica de contraste de fase.

La microscopía óptica es utilizada también a nivel molecular mediante métodos que marcan moléculas específicas y que pueden ser visualizadas dentro de las células. La microscopía de fluorescencia utiliza una tinción fluorescente para marcar las moléculas que interesan tanto en células fijadas como vivas. Un avance reciente importante en la microscopia de fluorescencia es el empleo de la proteína verde fluorescente (GFP: green fluorescent protein) de las medusas para observar proteínas en el interior de células vivas, en esta técnica la GFP se une a una proteína específica, la proteína marcada con GFP puede introducirse en células y detectarse por microscopía de fluorescencia (fig. 4). Fig.4 Microscopía de fluorescencia. Se observa una micrografía de una célula en mitosis. Para obtener esta imagen, se emplearon tres moléculas fluorescentes distintas con el fin de teñir tres componentes celulares diferentes. Se usó un anticuerpo acoplado a una proteína fluorescente verde para detectar a los microtúbulos, otro anticuerpo acoplado a una proteína fluorescente roja para detectar a los centrómeros, y un colorante fluorescente azul para teñir el ADN, que se encuentra condensado formando los cromosomas. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).

Fig.3 Células epiteliales.

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Microscopía Confocal: permite obtener imágenes tridimensionales, a diferencia de la microscopía óptica. El microscopio confocal combina dos enfoques: óptico y computacional. Esto elimina las imágenes provenientes de otros planos que no sean los que se desea enfocar en cada momento. Las imágenes se integran mediante computadoras para obtener una imagen tridimensional (fig. 5).

Microscopios Electrónicos: desarrollados en 1930 el microscopio electrónico permite una resolución mucho mayor que la obtenida con el microscopio óptico puesto que la longitud de onda de los electrones es menor que la de la luz. En el estudio de las células se utilizan dos tipos de microscopía electrónica: transmisión y de barrido. Fig. 6 Mitocondria vista con METEl Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)

El Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) El microscopio electrónico de barrido (MEB) también tiene un límite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite mirar a células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con íones de metales pesados. Con esta técnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espécimen y se observan imágenes tridimensionales (fig.7).

El microscopio electrónico de transmisión (MET) tiene un límite de resolución de cerca de 2 nm. Esto es debido a limitaciones del lente usado para enfocar electrones hacia la muestra. Un MET mira a replicas de células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con íones de metales pesados. Los electrones son dispersados cuando pasan a través de una fina sección del espécimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente (fig.6).

Fig. 5 Comparación de la microscopía fluorescente convencional y confocal. Las dos imágenes se obtuvieron del mismo estadio de desarrollo de un embrión de la mosca Drosophila, y fueron teñidas con una proteína verde fluorescente.

Fig.7 Imagen de un glóbulo blanco visto con MEB

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ACTIVIDADES DE LABORATORIO

EL MICROSCOPIO ÓPTICO

Objetivos de la actividad: - uso del microscopio óptico. - observar y reconocer diferentes células y tejidos con distintos aumentos.

Materiales utilizados

• Microscopio.

• Lupa.

• Trozos de corcho, cebollas hojas de cardenal, mucosa bucal. • Hoja de afeitar.

• Portaobjetos.

• Cubreobjetos.

• Muestras de tejidos.

• Lugol.

• Alcohol.

• Agua estancada.

• Pipeta.

• Vaso de precipitado.

• Mechero.

• Gotario.

Estudio y manejo del microscopio

Antes de aprender el uso del microscopio, debe saber cuál es la función que cumple cada una de sus partes.

Partes del microscopio:

A) SISTEMA MECANICO Base o pie: soporta las demás estructuras del microscopio. Brazo: une a la base con el tubo ocular, contiene a los tornillos macrométricos y micrométricos, sirve de apoyo para trasladar el microscopio. Tornillo macrométrico: proporciona avances rápidos en la platina, en el orden de centímetros. Tornillo micrométrico: proporciona avances en la platina en orden de milímetros. Platina: sirve para colocar las muestras a observar y contiene al condensador y al diafragma Carro de platina: controla los desplazamientos del portaobjetos.

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Revólver: contiene a las lentes oculares. (10X, 40X, 100X) B) SISTEMA DE ILUMINACION Condensador: está situado por debajo de la platina de modo que puede subir o bajar, su función es concentrar y enfocar los rayos provenientes de la fuente luminosa situada en la base del microscopio a fin de iluminar el campo visual. Diafragma o iris: se localiza en la parte inferior del condensador, una abertura regulable por medio de una palanca lateral que va a controlar la cantidad de luz que saldrá hacia el condensador. Fuente luminosa: se localiza en el pie o base del microscopio, es generalmente una lámpara integrada a la base. C) SISTEMA OPTICO Lente objetivo: aumenta la imagen de la muestra a observar; se presenta en diversos aumentos: Lupa (X), Seco débil (10 X), Seco fuerte (40 X), e Inmersión (100 X). NOTA: El símbolo X (por) que aparece después del número de cada lente, significa que se deberá multiplicar el aumento de la lente objetivo por el aumento de la lente ocular, para así obtener el aumento total alcanzado por el juego de lentes. La palabra SECO para las lentes de 10 X y 40 X, se emplea porque para su utilización no se requiere colocar ninguna sustancia entre el lente y la preparación. La palabra INMERSION se emplea porque se debe sumergir la lente 100 X en aceite de inmersión, para poder observar con nitidez la muestra. Lente ocular: amplia la imagen producida por el lente objetivo, está localizada en la parte superior del tubo del microscopio.

Utilización del microscopio:

l. Colocar el portaobjetos sobre la platina del microscopio. 2. Utilizar el objetivo de menor aumento. 3. Deslizar el tubo del microscopio por medio del tornillo macrométrico, observando lateralmente hasta que el objetivo quede cerca del portaobjetos. 4. Observar a través de los oculares subiendo lentamente el tubo del microscopio hasta observar la preparación enfocada, no debe bajarse el tubo del microscopio mientras se está observando, porque puede llegar a chocar el objetivo con el portaobjetos y ocasionar desperfectos.

5. Afinar la imagen moviendo lentamente el tornillo micrométrico, mover el diafragma para buscar la iluminación que mejor contraste nos de.

6. Si se desea mayor aumento, girar el revolver al objeto adecuado. 7. Si se utiliza el objeto de inmersión (100 X) colocar sobre la preparación una gota de aceite de inmersión y baja el tubo del microscopio hasta que la lente del objetivo toque a la gota, observa y ajusta cuidadosamente después de su uso limpiar el objetivo con un tejido suave (papel seda) y xilol.

Observando Células

- Gotas de agua estancada. - Láminas de corcho. - Catáfilo de cebolla.

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- Mucosa bucal. - Frotis de sangre.

Actividad N° 1: Con un gotero coloque una gota de agua estancada en un portaobjeto, luego continúe enfocando con el objetivo de menor aumento. Dibuje la muestra observada.

Observación: Agua estancada.

10 X 40 X

Registre sus observaciones: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Actividad N° 2: Con la hoja de afeitar, corte finas láminas de corcho, y obsérvelas primero con la lupa y luego con el microscopio utilizando los objetivos de menor. Dibuje y describa sus observaciones. 2 X 4 X 10 X 40 X

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Registre sus observaciones: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ Actividad N° 3: Separe con la hoja de afeitar las hojas que forman la cebolla y traten de desprender la fina tela que la cubre internamente. Colóquenla sobre un portaobjetos y añadan sobre la fina tela una gota de agua, luego pongan encima un cubreobjetos. Comience observando con el objetivo de menor aumento y luego utilice el aumento mayor de 100 X, recuerde que antes de usarlo debe agregar una gota de aceite de inmersión sobre la muestra. Repita el mismo procedimiento pero esta vez agregue a la muestra de catáfilo de cebolla lugol, y coloque un cubreobjetos sobre la muestra. Observe partiendo desde el menor aumento.

10 X 40 X 100 X

10 X 40 X 100 X Registre sus observaciones: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Actividad N° 4: Con un palito de helados frote suavemente la parte interna de la mejilla de algún integrante del grupo, con el fin de obtener una muestra de mucosa bucal. El contenido colóquelo en un portaobjeto, agregue una gota de agua sobre la muestra, y un cubreobjetos. Observe comenzando con el menor aumento, dibuje y registre sus observaciones.

10 X 40 X 100 X

Registre sus observaciones: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

Actividad N° 5: Ponga a calentar a baño María la hoja de cardenal en alcohol, cuando observe que la hoja empieza a ponerse blanca, sáquela del fuego, y coloque una pequeña muestra de hoja blanca y de hoja verde sobre un portaobjetos (cada una), agregue a cada muestra una gota de lugol, ponga sobre ellas el cubreobjetos y observe comenzando con el menor aumento. Dibuje y registre sus observaciones

10 X 40 X 100 X

10 X 40 X 100 X

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Registre sus observaciones: ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

Actividad N° 6: Con la ayuda de tu profesor pincha levemente con un alfiler desinfectado el dedo de algún integrante del grupo, extraiga una gota de sangre y colóquela en el portaobjetos, luego con otro portaobjetos haga un frotis sobre la muestra. Y ponga el cubreobjetos sobre el frotis. Observe comenzando por el menor aumento, dibuje y registre sus observaciones.

10 X 40 X 100 X

Registre sus observaciones: ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________