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TerapiaTerapia CellulareCellulare Non Non TrapiantologicaTrapiantologica

In In EmatologiaEmatologia ed ed OncologiaOncologia

Terapia Cellulare:

Trattamento che prevede la ricostituzione, l’aumento di numero o di efficacia di una funzione biologica ottenuto mediante l’impiego di popolazioni cellulari.

Possibile Definizione

Terapia Cellulare

Trapianto di Celulle Staminali Ematopoietiche Allogeniche

• Donor Lymphocites Infusion

• ,, ,, Allo-EBV-CTL nel trattamento delle Post Tramplant Lymphoprolipherative Disorders (PTLD) in pzsottoposti a BMT; AutoEBV-CTL nelle PTLD post SOT

• Utilizzo di CTLp anti-leucemia (LAM)

Terapia Cellulare anti-infettiva CTL anti CMV, BK e Aspergillo

APC artificiali (CD3+/CD28+ beads) nel contesto di Auto-TMO (NHL, CML, MM)

Terapia Cellulare Correlata a Procedura Trapiantologica

Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)

Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per

incrementare la loro avidità

Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione

(es:. α-TGF-β, α-IL-10, T Reg /CD4+25+)

Terapia Genica

Strategie per stimolare/amplificarela risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata

Terapia Cellulare non Trapiantologica

La storia dell’immunoterapia

M. Burnet e L. Thomas nel 1957 proposero il concetto di “Cancer Immunesurveilance”

Le prime prove di tale ipotesi furono testate mediantel’utilizzo di ceppi murini per K.O. per alcuni geni dimostratisiessenziali per lo sviluppo di alcuni componenti fondamentalidel sistema immunitario:

Es.: RAG2-/- pertanto incapaci di formare T Ly, B ly, NKT; perforina-/-; IFN gamma-/- ecc.

Questi animali sviluppano, con diverse caratteristiche, tumorispontanei o elevata percentuale dopo stimolazione con sostanze chimiche

Tumor Immunology: Cancer ImmunoeditingDunn & Schreiber Nature Immunology 2002 (3)11; 991-998

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Immunosorveglianza

Immunosorveglianza

Possibili Meccanismi di Tumor-Escape

Fattori del compartimento linfocitario:•Scarso numero T cell help•Insufficiente numero CTL anti-tumorali• ,, avidita’ dei CTL per il tumore•Tolleranza immunologica•Down-regulation di TCR signaling•Apoptosi CTL•Inadeguata funzione T cell (citochine, lisi)•Aumento di T cellule a carattere soppressivo (T reg, CD4+CD25+)•Produzione di citochine immunosoppressive (IL-10)

Fattori Tumorali•Insufficiente/assente espressione dell’antigene•Perdita di espressione MHC•Assenza di molecole co-stimolatorie•Produzione di citochine immunosoppressive (VEGF, IL-10,TGFb)

CellulaTumorale

Ag TCRSIGNAL# 1

SIGNAL # 2

T- Cell

ATTIVAZIONE/ATTIVAZIONE/INSUFFICIENTE INSUFFICIENTE ESPANSIONESPANSIONEESpeiser D.E. et Al.J.Exp.Med. 1997; 186, 645-653

APC

Cross priming

Ag

Ag Ag

TOLLERANZATOLLERANZA-- delezione clonale- anergia clonale

Jenkins MK. JExpMed 1987;165 302Pardoll D. Nature, 2001; 411, 1010

IMPLICAZIONI IMPLICAZIONI TERAPEUTICHETERAPEUTICHE

Terapie immunologicheOttimizzare presentazionedell’Ag (DCs, vaccini)Amplificazione dellarisposta T cellulo mediataTerapia anti-soppressiva

Ripopolazione con T cell Adottiva

Ottimizzarepresentazione dell’AgStrategia DC based, peptide based, APC artificiali, ecc.

NEGLETTANEGLETTAOchsenbein A.F et Al Nature, 2001, 411: 1058

Possibili Effetti Indotti dalla Crescita Tumoralesul Compartimento T Cellulare

STIMOLAZIONESTIMOLAZIONE

Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)

Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per

incrementare la loro avidità

Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione

(es:. α-TGF-β, α-IL-10, T Reg /CD4+25+)

Terapia Genica

Strategie per stimolare/amplificarela risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata

Terapia Cellulare non Trapiantologica

• CTL: T Linfociti che esercitano la loro attività citotossicamediante riconoscimento di cellule target (antigenicamentedifferenti) nel contesto del MHC classe I e II.

• TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes): popolazione eterogenea di linfociti (prevalentemente CD8+CD4+NK) localizzati nel contesto tumorale (es. melanoma, ca.ovarico) o linfonodi drenanti il tumore, aventi azione citotossica per lo più LAK-type, spesso non MHC-mediata).

• LAK (Lymphokine-Activated Killer): cellule con un’azione citotossica su target cellulari NK-resistenti (es. Daudi cell) questa è implementata da IL-2.

• Cellule NK: hanno una spontanea attività citotossica nei confronti di cellule target (es. cellula tumorale) con una modalità non-MHC ristretta.

Cellule Effettrici ad Azione Citotossica

Impianto K7M2 Amputazione Monitoraggio Recidiva

Monitoraggio volume Tum.

Volume: 0.8-1 cm3

MRD

Immunosorveglianza: Modello Murino

Osteosarcoma nell’Ospite SCID:

Invariata la crescita tumorale primariasignificativo incremento di recidive/metastasi

0 25 50 75 100 125 1500

20

40

60

80

100

p=0.008

Days after tumor implant

Balb/c

SCID

Primary Tumor Growth

0 10 20 30 40 50 60 700.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Days After Implant

Balb/c

SCID

Amputation size

Death from Recurrent Disease

K7M2 Impianto

K7M2 Osteosarcoma MRD

SCIDMonitoraggia volume

Amputazione MonitoraggioDi Recidiva

LN lateImmuno-ricostituzioneCD4+ e CD8+ 25x 106 cells = 10 % T cell repertoire

MRD

LN early Immuno-ricostituzioneCD4+ e CD8+ 25x 106 cells = 10 % T cell repertoire

Tumor Burden

Ruolo dell’Immuno-ricostituzione nella Prevenzione di Metastasi

Primary Tumor Growth

0 10 20 30 40 50 60 700.00

0.25

0.50

0.75

1.00scid

LN e

Days After Implant

arly

Death From Recurrent Disease

0 50 100 150 2000

20

40

60

80

100 scid

LN early

LN late

Days After Implant

p= 0.002 vs. SCID

p= 0.005 vs. SCID

EsposizioneEsposizione didi cellule T cellule T allaalla CrescitaCrescita TumoraleTumorale PrimariaPrimariaNon Non EnficiaEnficia la la CapacitaCapacita’’ didi ControlloControllo didi RecidivaRecidiva

T Cell Immuno-Ricostituzione Puo’ PrevenireRecidiva Tumorale

Produzione di IFNγdopo stimolazione in vitro con

cellule K7M2

Naive T. Bearing0

20

40

60

80

100

120

140

160 p= 0.0092

Evidenza di Priming Immunologico in Animalicon Progressiva Crescita di Osteosarcoma

Tum. Bear.+DCs

Tum. Bear.+Lisato tum.- DC

Naive+Tum. Lysate DC

0

20

40

60

80

100

120

140

160

p= 0.03

Produzione di IFNγdopo stimolazione in vitro con

DC pulsate Lisato Tumorale

Terapia Cellulare non Trapiantologica

PNAS 2004

Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)

Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per

incrementare la loro avidità

Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione

(es:. α-TGF-β, α-IL-10, T Reg /CD4+25+)

Terapia Genica

Strategie per stimolare/amplificarela risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata

Terapia Cellulare non Trapiantologica

Ottimizzazione di Strategie VaccinaliMediante l’Utilizzo di DC

Copyright © 2000-2003Cell Systems Initiative, University of Washington

Cellule Dendritiche (DC): biologia

Le Sentinelle del Sistema Immunitario

M. Jefford et al. Lancet 2003

Cellule Dendritiche: biologia …

endocitosi

MHC-II

Endosoma/lisosomi

TAP

MHC-I

Golgi

Proteosoma

peptidicitosol

PatogenoCross-presentation

MHC-IIpeptide

CD4

MHC-Ipeptide

CD8

La Processazione dell’Antigene

DC

Uptake antigeneEndocitosi

Migrazione vs linf. Presentazione del AgStimolazione cell TSviluppo cellule CD4+ CD8 T antigene specifiche (CTL)

Processazione antigenevia MHC class I/II

Immature vs Mature DCsImportanza della maturazione, effetti sulla risposta immunitaria

Costimolazionehigh CD40, CD54, Class II

Bacterial productsCytokines

T cells

DC Immature DC Mature

Danger signals

Terapia Cellulare non Trapiantologica

Possibili Fonti di Antigeni Tumoralinella strategia Vaccinale DC-based

PeptidiPeptidi sinteticisintetici(modificati)

PeptidiPeptidi

cRNAcRNA

cDNAcDNA

Estratti proteiciEstratti proteici

Corpi Corpi apoptoticiapoptotici

DCs

DCs

DCs

DCs

Tumor cells

rProteinerProteine mRNAmRNA

Cellule di Cellule di fusionefusione

•Tumore specifici•bcr/abl protein (CML, ALL)

•Idiotipo immunoglobuline (NHL, MM)

•Pml/Rar alfa protein (APL)

•Shared Tumor-specific Ag(cancer testis Ag, o Melanoma associate)

•MAGE

•BAGE

•GAGE

•Antigeni di differenziazione(espressi anche dai normali tessuti)

•Melan A

•Mart-1

•Proteinase-3

•WT-1

•Oncogene/tumor suppression Ag•P53

•Ras mutated protein

•Virus Associated Ag•EBV

Terapia Cellulare non Trapiantologica

Classificazione degli Antigeni Tumorali

L’attivita’ di Antigen discovery nei tumori dell’adultoimplicazioni nei tumori pediatrici

NBL GAGE-1 (80%)MAGE-1 (50-80%)

EWS GAGE-1XAGE-1,2

RMS XAGE-1,2Sarcomas GAGE-2 (25%)

NY-ESO-1(80%)MAGE

Glioblastoma GAGE-3,6 (70%)MAGE-1Her-2gp100

Medulloblastoma GAGE-3,6 (45%)Head & Neck PRAMEALL t(8;21) PRAME

Terapia Cellulare non Trapiantologica

Quando? MRD/low tumor burdenImmmuno RiconstituzionePost alte dosi CT

Utilizzo diadiuvanti?

Selezione?

Quanto?

Terapia Cellulare: Strategia Vaccinale

Terapia Cellulare non Trapiantologica

Fonti alternative di APC• CD40 Activated B cell (CD40-B cell): Linfociti B attivati ex-vivo

mediante stimolazione con CD40. Tale trattamento media la up-regolazione di molecole co-stimolatorie ed incremento della presentazione dell’Ag. Conferendo alla cellula caratteristiche che assomigliano a quelle tipiche della DC. ( espressione Rec. Chemochine, produzione di citochine, ecc.) Possono essere facilmente ottenute ed espanse in vitro, pertanto rappresentano una potenziale alternativa fonte di APC autologhe.

• APC artificiali: CD3/CD28 stimolazione mediante anticorpi coniugati con microbiglie. Mediano l’attivazione e l’espansione policlonale di popolazioni T cellulari (NHL, CML)

Von Bergwelt et al. Cancer Res 2004; Lapointe R. Cancer Res 2004

• Expression of MHC class I, MHC class II and cancer germline antigens in neuroblastoma (Wolfl et al Cancer Immunol Immunother 2004)

• Neuroblastona and DC function (Redlinger RE et al Semin Pedatr Surg 2004)• Results of phase 1 study utilizing monocyte-derived Dendritic cells pulsed with

tumor RNA in children and young adults with brain tumor (DA Caruso et al. Neuro-Oncol 2004)

• Restored immune response to an MHC-II restricted antigen in tumor bearing hosts after elimination of regulatory T cell. (Nicholl et al. J ped. Surg 2004)

• Characterization of CD34+progenitor-derived DC pulsed with tumor cell lysatefor a vaccination strategy in children with malignant solid tumor and a poor prognosis (Ackermann et al Klin Pediatr 2004)

• Functional and molecular characterization of interleukin-2 transgenic Ewingtumor cell for in vivo immunotherapy (Burdach et al Ped Blood Cancer 2004)

• Pilot trial of tumor specific peptide vaccination and continous infusion of IL2 in patients with recurrent Ewing sarcoma and Alveolar Rhabdomiosarcoma(Dagher R Med. Ped. Oncol. 2002)

Terapia cellulare non Trapiantologica

Studi in ambito pediatrico

Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)

Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per

incrementare la loro avidità

Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione

(es:. α-TGF-β, α-IL-10, T Reg /CD4+25+)

Terapia Genica

Strategie per stimolare/amplificarela risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata

Terapia Cellulare non Trapiantologica

ILIL--1515TherapyTherapy

Proliferation of activated T cellDifferentiation of CTL

Synergize for production of other cytokines (e.g. IFNγ, TNFα)

Expand NK cells (low dose)

ILIL--22TherapyTherapy

Substitute IL15in NK cell differentiation(via IL2/15Rβγc)

Innate ImmunityInnate Immunity

NKNKNK NK

NK

Activate NK cell (high dose)

NK

Lysis

NK effector function

Tumor

Innate ImmunityInnate Immunity

Activation-Induced Cell Death

(AICD)

NKpre NK cell

Innate ImmunityInnate Immunity

CD56- CD56+

Type 1 CytokinesType 1 Cytokines

Effetti IL-2 mediati Potenzialmente UtiliNel contesto di Immunoterapia

T Cell T Cell trophictrophic factorfactor

ILIL--7 7 TherapyTherapy

Induce Other Cytokines(e.g. IL-2, IFNγ)

Expand High affinity CD8+ clonesExpand High Affinity CD4+ clones

Recruit Low Affinity clones

TGFβ production

Induce Lak cells

GM- �C SF + IL7Generate Monocytes

derived DCs

Partially substituteIL-15 in the generation of memory CD8+ pool

?

Tumor cell

TGFβproduction

Tumor Induced Suppression

Expansion of existing or vaccine-induced Immune response

Broaden Immune response

Memory T cell

DCsmono

Ag Presenatation

Induce Type 1 cytokines

Lytic Activity (CTLs, NK)

Up-regulation bcl-2family molecules

Programmed Cell death

Effetti IL-7 mediati Potenzialmente UtiliNel contesto di Immunoterapia

ILIL--1515TherapyTherapy

ExpandHigh AffinityCD8+ clones

Recruit Low Affinity CD8+ clones

Critical in the generation andMaintenance

of Memory CD8+ pool

No effect on naïve CD4+ T cell(low expression IL2/15Rβ)

Expansion of existing or vaccine-induced Immune response

BroadenImmune response

Increase Memory CD8+ T cell

MaintenanceExpansion

of NK cells ILIL--1515TherapyTherapy

Innate Immunity

NKNKNK NK

NK

NK cellDifferentiation

NKpre NK cell

Innate Immunity

CD56- CD56+

Synergize for production of other cytokikens(e.g. IFNγ, TNFα)

Type 1 Cytokines

Effetti IL-15 mediati Potenzialmente UtiliNel contesto di Immunoterapia

Ripopolazione Adottiva (T cell)• T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK)

Ottimizzazione della presentazione dell’antigene• Aumento antigen up-take e processing• Modulazione della maturazione delle DCs• Fornire co-stimulazione• Antige discovery e modificazione dei peptidi per

incrementare la loro avidità

Manipolazione della risposta immune • Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15)• Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione

(es:. α-TGF-β, α-IL-10, T Reg /CD4+25+)

Terapia Genica

Strategie per stimolare/amplificarela risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata

Terapia Cellulare non Trapiantologica

Terapia Genica:

Trattamento che si propone di correggere il/i difetti molecolari causa di una determinata patologia mediante introduzione nelle cellule somatiche del gene mancante o difettivo.

Possibile Definizione

Terapia Genica e Vaccinoterapia

Inserzione di geni in grado di ottimizzare la risposta immunitaria nel contesto di vacciniantitumoralies:

Gene hIL-2 in TIL (vettori retrovirali)

TCR antigene specifico (es. Anti-gp100)

Gene per hIL-12 in DC

Gene per GM-CSF in cellule tumorali

Molecole co-stimolatorie (es. CD80) in cellule tumorali

Vaccinoterapia

Antigene specifici

GM-CSF

APCartificiali

Proteine

AdoptiveT cell

Terapia genica

Citochine

DCs