terapia genética: onde estamos e para onde iremos. esperança ou
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TERAPIA GÊNICA:Onde estamos e para onde iremos!
esperança ou ilusão?
Melissa Gava ArmeliniLaboratório de Reparo de DNADepartamento de Microbiologia
ICB -USP
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Terapia Gênica“Intervenção médica baseada na modificação do
material genético de células vivas, resultando em benefício terapêutico.” (FDA, 1993)
Revolução da Medicina!!!
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Alvos de Terapia Gênica
Doenças hereditárias:Imunodeficiência (ADA)
Fibrose cística
Hemofilia
Xeroderma Pigmentosum
Doenças adquiridas:Câncer
AIDS
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Doenças com protocolos envolvendo Terapia Gênica
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Estratégias de Terapia Gênica
In Vivo
Ex Vivo
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? ? ?Mas como introduzir genes em um
organismo?
??? ??
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1) Diretamente por injeção de DNA
•Útil para imunizações
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2) Uso de lipossomos
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3) Vetores virais.
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Vetor Vantagens Desvantagens
Retrovírus(RNAss)
•Tempo maior de expressão do transgene•Alta eficiência de transdução ex vivo•Experiência clínica ex vivo• Baixa imunogenicidade
•Baixa eficiência de transdução in vivo•Tamanho do inserto limitado a 8 Kb•Infecta apenas células proliferativas•Integração aleatória podendo causar alterações gênicas •Manipulação e armazenamento extremamente difíceis
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Terapia gênica para a síndrome X-SCID
Resultados:
As crianças começam a recuperar o sistema imunológico. Não precisam mais de injeção de imunoglobulinas!
Problemas:
Até 2005 apareceram 3 casos de leucemia, entre pacientes tratados com retrovírus: inserção do retrovírus próximo a um oncogene.
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Uso de adenovírus para terapia gênica
Vetor Vantagens Desvantagens
Adenovirus(DNAds)
•Alta eficiência de infecção e transdução in vivo e ex vivo•Infecta células proliferativas e não proliferativas•Mais clinicamente testado•Capacidade de infectar vários tipos celulares
•Forte resposta imune•Tamanho do inserto limitado a 7,5 Kb•Condições de armazenamento e manipulação moderadamente difíceis•Permite apenas umaaplicação (se tanto).•Expressão transiente(epissomo)
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+ + XPD
pCMV
KanR XPD
EGFPPI- ISce
I- ICeu
pSHIRES-XPD7,9 Kb
Dupla digestão
PI-Sce I/I-CeuI
AMPLIFICAÇÃO DO PLASMÍDEO
DIGESTÃO DO PLASMÍDEO COM PAC I
Transfecçãoem células HEK 293
Produção das partículas
recombinantes
Clonagem do cassete no pAdeno-X
Construção de um vetor
adenoviral
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Produção de adenoGFP em células HEK 293
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Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER)
Remove lesões que distorcem DNA;
Envolve múltiplas proteínas;
Subdividido em 2 vias: GGR e TCR
GGR: reparo do genoma global
TCR: reparo das fitas transcritas
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Xeroderma pigmentosum (XP)
Síndrome rara
Herança autossômica recessiva;
Elevada incidência de câncer de pele;
Problemas neurológicos;
XP clássicos (XPA-XPG): deficientes em NER;
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Xeroderma Pigmentosum Society
“Crianças da Lua”
Síndrome XP nos ajudou a entender vários aspectos da carcinogenesis: será que podemos ajudá-los?
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O estudo começa in vitro...Luz visível Luz UV
2 meses após a infecção
Muotri et al. 2002.
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Células de pacientes XP-D são mais resistentes a UV quando infectadas com AdXPD
Armelini et al, 2005
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Principais conclusões dos ensaios in vitro
A transdução de XPA, XPC, XPD e XPV foi eficiente na correção do defeito molecular em células provenientes de pacientes XP;
Células XP
+ AdXPA
+ AdXPC
+ AdXPD
+ AdXPV
Expressão do transgene por, pelo menos, 2 meses!!
Sucesso na correção fenotípica de células provenientes de pacientes XP!!!!
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Mas... e in vivo?
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Detecção de GFP em camundongos infectados com AdXPA
Marchetto et al 2004
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AdXPA protege camundongos XPA da UVB
3 semanas após UVMarchetto et al 2004
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Histologia da pele de camundongos irradiados
XPA XPA + AdXPA selvagem
3 semanas após UV
Marchetto et al 2004
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AdXPA previne formação de tumores induzidos por UVB em camundongos XPA-/-
Marchetto et al 2004
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•1999/Setembro: Falecimento do jovem de 18 anos - JesseGelsinger submetido à terapia gênica com adenovírus recombinante
•Doença a ser tratada: Ornitina transcarbamilase (OTC-deficiência em uma enzima do ciclo da uréia, promovendo o acúmulo de substâncias tóxicas no fígado como amônia)
•Administração de vírus foi muito alta, causando violenta resposta imune
•O garoto morre poucos dias depois de falência generalizada dos órgãos
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Questões que permanecem...
Adenovírus diretamente na pele de humanos?
De que vale uma terapia por apenas 2 meses?
Quantas vezes?
Uso de imunossupressores?
Uso de vetores menos imunogênicos, ex. AAV (vírus adeno-associado).
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Vetor Vantagens Desvantagens
Virus AdenoAssociado(AAV) (DNAss)
•Transduzeficientemente uma grande variedade de células in vivo•Expresão prolongada in vivo (até 4 anos) •Baixa imunogenicidade•Nenhuma relação com infecções humanas•Integração preferencial(braço curto do cromossomo 19)• Diferentes sorotipos
•Condições de armazenamento e manipulação muito difíceis •Tamanho do inserto limitado a 4,5 Kb•Pouca experiência clínica•Pode ser neutralizado por anticorpos
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Esquema da construção de um vetor adeno associado (AAV)
Plasmídeo principal
Plasmídeo “helper”+
Co- transfecção
Células HEK 293
72 horas, lisado celular
Gradiente de iodixanol
Partículas viraispurificadascromatografia
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1) AAV infecta pele????
primer foward primer reverse
XPA EGFP
Neg
ativ
e co
ntro
l
AA
V-X
PA
-EG
FP
8
AAV-XPA-EGFP 1 AAV-XPA-EGFP 2 AAV-XPA-EGFP 5A B C A
XPA-EGFP
β - actin
A B C A B C
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2) Quais os tipos celulares da pele que o AAV écapaz de infectar?
XPA-/- + AAV-XPA-EGFP 2XPA-/-
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1
wt XPA-/-XPA-/- +AAV8
XPA-/- +AAV2
Tempo após a irradiação em
semanas
2
3
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TERAPIA GÊNICA:
MUITA ESPERANÇA!!!
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Agradecimentos
Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck – ICB/USPDr. Alysson Renato Muotri
Dra. Maria Carolina Nasser Marchetto
Dra. Keronninn Moreno de Lima Bessa
Ricardo Alexandre Leite
Carolina Quayle
Prof. Dr. Errol Friedberg – University of Texas
Suporte: