terapia gênica - princípios gerais modificação genética das células para produzir efeito...
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Terapia gênica - Terapia gênica - Princípios geraisPrincípios geraisTerapia gênica - Terapia gênica - Princípios geraisPrincípios gerais
Modificação genética das células para Modificação genética das células para
produzir efeito terapêuticoproduzir efeito terapêutico
• Ex vivo:Ex vivo: modificação genética feita em células modificação genética feita em células em cultura que são administradas ao pacienteem cultura que são administradas ao paciente
• In vivo:In vivo: modificação feita diretamente no modificação feita diretamente no pacientepaciente
Modificação genética das células para Modificação genética das células para
produzir efeito terapêuticoproduzir efeito terapêutico
• Ex vivo:Ex vivo: modificação genética feita em células modificação genética feita em células em cultura que são administradas ao pacienteem cultura que são administradas ao paciente
• In vivo:In vivo: modificação feita diretamente no modificação feita diretamente no pacientepaciente
Necessidade de Necessidade de
– se conhecer o gene terapêutico (clonagem se conhecer o gene terapêutico (clonagem
do gene)do gene)
– método para liberar o gene na célula alvo método para liberar o gene na célula alvo
Métodos mais promissores:Métodos mais promissores: transferência transferência
gênica através de adenovirus associado e gênica através de adenovirus associado e
lentiviriuslentivirius
Necessidade de Necessidade de
– se conhecer o gene terapêutico (clonagem se conhecer o gene terapêutico (clonagem
do gene)do gene)
– método para liberar o gene na célula alvo método para liberar o gene na célula alvo
Métodos mais promissores:Métodos mais promissores: transferência transferência
gênica através de adenovirus associado e gênica através de adenovirus associado e
lentiviriuslentivirius
Terapia gênica - Terapia gênica - Princípios geraisPrincípios geraisTerapia gênica - Terapia gênica - Princípios geraisPrincípios gerais
Células alvo para introdução de genesCélulas alvo para introdução de genesCélulas alvo para introdução de genesCélulas alvo para introdução de genes
Células humanasCélulas humanas: :
hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos, hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos,
mioblastos, etcmioblastos, etc
Células xenogênicasCélulas xenogênicas: murinas, porcinas, : murinas, porcinas,
bovinas, outros primatas, etc bovinas, outros primatas, etc
– Desvantagens: transmissão de retrovírus e Desvantagens: transmissão de retrovírus e
xenoosis (algumas desconhecidas)xenoosis (algumas desconhecidas)
Células humanasCélulas humanas: :
hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos, hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos,
mioblastos, etcmioblastos, etc
Células xenogênicasCélulas xenogênicas: murinas, porcinas, : murinas, porcinas,
bovinas, outros primatas, etc bovinas, outros primatas, etc
– Desvantagens: transmissão de retrovírus e Desvantagens: transmissão de retrovírus e
xenoosis (algumas desconhecidas)xenoosis (algumas desconhecidas)
Métodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvo
ViraisVirais
– RetrovírusRetrovírus
– LentivírusLentivírus
– AdenovírusAdenovírus
– Adenovírus associadoAdenovírus associado
– Herpes simplesHerpes simples
ViraisVirais
– RetrovírusRetrovírus
– LentivírusLentivírus
– AdenovírusAdenovírus
– Adenovírus associadoAdenovírus associado
– Herpes simplesHerpes simples
LTRLTR gaggag polpol envenv
Retrovirus (wild-type) DNARetrovirus (wild-type) DNA
LTRLTR
LTRLTR Target DNATarget DNA LTRLTR
RetrovirusRetrovirusvector DNAvector DNA
GenomeGenome
PackagingPackagingcell linecell line
PackagingPackagingcell linecell line
GenomeGenomeProduct ofProduct ofexpressionexpression
cassettecassette
ProviralProviralRNARNA
ProviralProviralDNADNA
RTRT
IntegrationIntegration
Target cellTarget cell
ReceptorReceptorPackagedPackagedretrovirusretrovirus
vectorvector
Transferência GênicaTransferência GênicaTransferência GênicaTransferência Gênica
Lentivirus (HIV-1)Lentivirus (HIV-1)Lentivirus (HIV-1)Lentivirus (HIV-1)
também codificamtambém codificam
tat tat e e rev rev genes regulatórios da expressãogenes regulatórios da expressão
genes acessóriosgenes acessórios
VantagensVantagens
promovem transporte ativo do complexo através do promovem transporte ativo do complexo através do nucleoporo nucleoporo
infectam células que não estão em duplicaçãoinfectam células que não estão em duplicação
também codificamtambém codificam
tat tat e e rev rev genes regulatórios da expressãogenes regulatórios da expressão
genes acessóriosgenes acessórios
VantagensVantagens
promovem transporte ativo do complexo através do promovem transporte ativo do complexo através do nucleoporo nucleoporo
infectam células que não estão em duplicaçãoinfectam células que não estão em duplicação
AdenovirusAdenovirusAdenovirusAdenovirus
derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria
dos adultos já foi expostados adultos já foi exposta
eficientes para transferência gênicaeficientes para transferência gênica
não se integram no genoma (episomal)não se integram no genoma (episomal)
derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria
dos adultos já foi expostados adultos já foi exposta
eficientes para transferência gênicaeficientes para transferência gênica
não se integram no genoma (episomal)não se integram no genoma (episomal)
GenomeGenome
ComplementingComplementingcell linecell line
AdenovirusAdenovirusvectorvector
GenomeGenome
Product ofProduct ofexpressionexpression
cassettecassette
Target cellTarget cell
ReceptorReceptor
EndosomeEndosome
EpisomalEpisomalactionaction
Adenovirus (wild-type) DNAAdenovirus (wild-type) DNA
E1E1 E3E3
Transferência GênicaTransferência GênicaTransferência GênicaTransferência Gênica
AdenovirusAdenovirusvector DNAvector DNA
ExpressionExpressioncassette cassette (Target DNA)(Target DNA)
E3E3
Adenovirus associado (AAV)Adenovirus associado (AAV)Adenovirus associado (AAV)Adenovirus associado (AAV)
Parvovírus humanos que requerem um adenovirus Parvovírus humanos que requerem um adenovirus
para mediar infecçãopara mediar infecção
Eficientes para transferência gênicaEficientes para transferência gênica
Não há doença conhecida associada com infecção Não há doença conhecida associada com infecção
pelo AAVpelo AAV
Podem integrar o genoma aleatoriamente Podem integrar o genoma aleatoriamente ouou
Podem ter localização episomalPodem ter localização episomal
Parvovírus humanos que requerem um adenovirus Parvovírus humanos que requerem um adenovirus
para mediar infecçãopara mediar infecção
Eficientes para transferência gênicaEficientes para transferência gênica
Não há doença conhecida associada com infecção Não há doença conhecida associada com infecção
pelo AAVpelo AAV
Podem integrar o genoma aleatoriamente Podem integrar o genoma aleatoriamente ouou
Podem ter localização episomalPodem ter localização episomal
Métodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvo
Não-ViraisNão-Virais
– LIpofecçãoLIpofecção
– EletroporaçãoEletroporação
– Precipitação com Fosfato de cálcioPrecipitação com Fosfato de cálcio
– Bombardeio de partículasBombardeio de partículas
Não-ViraisNão-Virais
– LIpofecçãoLIpofecção
– EletroporaçãoEletroporação
– Precipitação com Fosfato de cálcioPrecipitação com Fosfato de cálcio
– Bombardeio de partículasBombardeio de partículas
Plasmid withPlasmid withexpressionexpression
cassettecassette(target DNA)(target DNA)
GenomeGenome
Product ofProduct ofexpressionexpression
cassettecassette
Target cellTarget cellEndosomeEndosome
EpisomalEpisomalactionaction
Fuse withFuse withplasma membraneplasma membrane
Transferência GênicaTransferência GênicaTransferência GênicaTransferência Gênica
LipossomesLipossomes
Transferência GênicaTransferência GênicaTransferência GênicaTransferência Gênica
Injeção direta de DNA em células alvoInjeção direta de DNA em células alvo
– Ex:Ex: Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX
Anemia - injeção IM do gene da eritropoetinaAnemia - injeção IM do gene da eritropoetina
Neoplasias - injeção no tumor : Neoplasias - injeção no tumor : Gene p53 Gene p53
Gene suicidaGene suicida
Anti-senseAnti-sense
Infusão ou implante de células geneticamente Infusão ou implante de células geneticamente modificadasmodificadas
Injeção direta de DNA em células alvoInjeção direta de DNA em células alvo
– Ex:Ex: Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX
Anemia - injeção IM do gene da eritropoetinaAnemia - injeção IM do gene da eritropoetina
Neoplasias - injeção no tumor : Neoplasias - injeção no tumor : Gene p53 Gene p53
Gene suicidaGene suicida
Anti-senseAnti-sense
Infusão ou implante de células geneticamente Infusão ou implante de células geneticamente modificadasmodificadas
Regulatory Review Required for Gene Regulatory Review Required for Gene Transfer TrialsTransfer Trials
Regulatory Review Required for Gene Regulatory Review Required for Gene Transfer TrialsTransfer Trials
U.S. U.S.
Comitê de Ética LocalComitê de Ética Local
Comitê Local de BiosegurançaComitê Local de Biosegurança
FDAFDA
Recombinant DNA Advisory Committee, NIHRecombinant DNA Advisory Committee, NIH
BrazilBrazil
Comitê de Ética LocalComitê de Ética Local
CONEPCONEP
Comitê Nacional de Biosegurança Comitê Nacional de Biosegurança
U.S. U.S.
Comitê de Ética LocalComitê de Ética Local
Comitê Local de BiosegurançaComitê Local de Biosegurança
FDAFDA
Recombinant DNA Advisory Committee, NIHRecombinant DNA Advisory Committee, NIH
BrazilBrazil
Comitê de Ética LocalComitê de Ética Local
CONEPCONEP
Comitê Nacional de Biosegurança Comitê Nacional de Biosegurança
Terapia gênica para hemofilia Terapia gênica para hemofilia Terapia gênica para hemofilia Terapia gênica para hemofilia
VantagensVantagens
níveis > 2% efeito terapêuticoníveis > 2% efeito terapêutico
não é necessária regulação gênica refinadanão é necessária regulação gênica refinada
não é necessária expressão tecido específicanão é necessária expressão tecido específica
rFVIII ou rFIX comerciais já existemrFVIII ou rFIX comerciais já existem
avaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticosavaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticos
VantagensVantagens
níveis > 2% efeito terapêuticoníveis > 2% efeito terapêutico
não é necessária regulação gênica refinadanão é necessária regulação gênica refinada
não é necessária expressão tecido específicanão é necessária expressão tecido específica
rFVIII ou rFIX comerciais já existemrFVIII ou rFIX comerciais já existem
avaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticosavaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticos
Ensaios ClínicosEnsaios ClínicosEnsaios ClínicosEnsaios Clínicos
Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos
com plasmideo contendo F.VIIIcom plasmideo contendo F.VIII
Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos
com plasmideo contendo F.VIIIcom plasmideo contendo F.VIII
Transplante de fibroblastos autólogoTransplante de fibroblastos autólogoTransplante de fibroblastos autólogoTransplante de fibroblastos autólogo
Implantar células no omentumImplantar células no omentum
Ex vivo Ex vivo pouco risco de transmissão para células pouco risco de transmissão para células
germinativasgerminativas
Expansão clonal de uma célula Expansão clonal de uma célula risco mínimo de risco mínimo de
mutagenesismutagenesis
Procedimento trabalhosoProcedimento trabalhoso
Implantar células no omentumImplantar células no omentum
Ex vivo Ex vivo pouco risco de transmissão para células pouco risco de transmissão para células
germinativasgerminativas
Expansão clonal de uma célula Expansão clonal de uma célula risco mínimo de risco mínimo de
mutagenesismutagenesis
Procedimento trabalhosoProcedimento trabalhoso
Ensaios ClínicosEnsaios ClínicosEnsaios ClínicosEnsaios Clínicos
In vivoIn vivo
Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIIIInfusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII
Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIIIInfusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII
injeção IM de AAV/hF.IXinjeção IM de AAV/hF.IX
infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IXinfusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX
In vivoIn vivo
Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIIIInfusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII
Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIIIInfusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII
injeção IM de AAV/hF.IXinjeção IM de AAV/hF.IX
infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IXinfusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX
HemofiliaHemofilia HemofiliaHemofilia
• Administração do vetor bem toleradaAdministração do vetor bem tolerada
• Não houve formação de anticorposNão houve formação de anticorpos
• Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria hepática retrovirus ou adenovirus em artéria hepática
• Risco de transmissão para células germinativas parece baixaRisco de transmissão para células germinativas parece baixa
• Administração do vetor bem toleradaAdministração do vetor bem tolerada
• Não houve formação de anticorposNão houve formação de anticorpos
• Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria hepática retrovirus ou adenovirus em artéria hepática
• Risco de transmissão para células germinativas parece baixaRisco de transmissão para células germinativas parece baixa
HemofiliaHemofiliaHemofiliaHemofilia
• Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação
biologicamente ativobiologicamente ativo
• F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento
transitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientestransitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientes
• Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou
em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até
4%)4%)
• Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento
de até 11% nos níveis de F.IX. de até 11% nos níveis de F.IX.
• Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação
biologicamente ativobiologicamente ativo
• F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento
transitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientestransitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientes
• Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou
em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até
4%)4%)
• Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento
de até 11% nos níveis de F.IX. de até 11% nos níveis de F.IX.
Ensaios ClínicosEnsaios ClínicosEnsaios ClínicosEnsaios Clínicos
41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia gênicagênica
DesafiosDesafios
sustentar efeitosustentar efeito
inibir resposta imuneinibir resposta imune
aumentar expressão do transgeneaumentar expressão do transgene
41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia gênicagênica
DesafiosDesafios
sustentar efeitosustentar efeito
inibir resposta imuneinibir resposta imune
aumentar expressão do transgeneaumentar expressão do transgene
Gene da Eritropoetina para Gene da Eritropoetina para tratamento de anemiatratamento de anemia
Gene da Eritropoetina para Gene da Eritropoetina para tratamento de anemiatratamento de anemia
Vetor não viralVetor não viral
injeção IM em injeção IM em
camundongoscamundongos
estímulo elétricoestímulo elétrico
Vetor não viralVetor não viral
injeção IM em injeção IM em
camundongoscamundongos
estímulo elétricoestímulo elétrico
Hematócrito antes e após terapia gênica Hematócrito antes e após terapia gênica com gene da EPOcom gene da EPO
Hematócrito antes e após terapia gênica Hematócrito antes e após terapia gênica com gene da EPOcom gene da EPO
35
45
55
65
75
85
95
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Hem
ató
crit
o (
%)
EPOEPO
O Sistema Tet-Off para controle da O Sistema Tet-Off para controle da expressão gênicaexpressão gênica
O Sistema Tet-Off para controle da O Sistema Tet-Off para controle da expressão gênicaexpressão gênica
Doxociclina ou Doxociclina ou tetraciclinatetraciclina
Doxociclina ou Doxociclina ou tetraciclinatetraciclina
Ausência de transcrição
Ausência de transcrição
TRETRETRETRE
PCMVPCMV tetRtetRtetRtetR ADADADAD
transativadortransativador
TRETRETRETRE pCMVpCMVpCMVpCMV Gene alvoGene alvoGene alvoGene alvo
pCMVpCMVpCMVpCMV Gene alvoGene alvoGene alvoGene alvoPresença de transcrição
Presença de transcrição
Controle da expressão gênica pela Controle da expressão gênica pela administração de Doxociclinaadministração de Doxociclina
Controle da expressão gênica pela Controle da expressão gênica pela administração de Doxociclinaadministração de Doxociclina
35
45
55
65
75
85
95
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Semanas
Hem
ató
cri
to (
%)
DoxociclinaDoxociclina
Células Células
ProgenitorasProgenitoras
HematopoéticasHematopoéticas
Células Células
ProgenitorasProgenitoras
HematopoéticasHematopoéticasPlacenta
Medula ÓsseaSangue Periférico
+ fatores de crescimento
Seleção CD34+
Crescimento in vitro
Transferência gênica
Infusão de células genéticamente alteradas
Correção de hemoglobinopatiaCorreção de hemoglobinopatiaCorreção de hemoglobinopatiaCorreção de hemoglobinopatia
anemia falciforme e talassemia (camundongos) anemia falciforme e talassemia (camundongos)
Vetor: lentivirusVetor: lentivirus
Gene: beta-globinaGene: beta-globina
Transferência do gene para células CD 34+Transferência do gene para células CD 34+
Mieloablação e infusão das células modificadasMieloablação e infusão das células modificadas
anemia falciforme e talassemia (camundongos) anemia falciforme e talassemia (camundongos)
Vetor: lentivirusVetor: lentivirus
Gene: beta-globinaGene: beta-globina
Transferência do gene para células CD 34+Transferência do gene para células CD 34+
Mieloablação e infusão das células modificadasMieloablação e infusão das células modificadas
Correção de talassemiaCorreção de talassemiaCorreção de talassemiaCorreção de talassemia
Correção de doença falciformeCorreção de doença falciformeCorreção de doença falciformeCorreção de doença falciforme
*
* *
X-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OFX-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OFTHERAPEUTIC GENE TRANSFERTHERAPEUTIC GENE TRANSFER
X-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OFX-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OFTHERAPEUTIC GENE TRANSFERTHERAPEUTIC GENE TRANSFER
Lethal diseaseLethal disease
Caused by gc cytokineCaused by gc cytokine
receptor deficiencyreceptor deficiency
Curable by bone marrow Curable by bone marrow
transplantationtransplantation
Lethal diseaseLethal disease
Caused by gc cytokineCaused by gc cytokine
receptor deficiencyreceptor deficiency
Curable by bone marrow Curable by bone marrow
transplantationtransplantation
Cavazzana-Calvo et al.Cavazzana-Calvo et al. Gene Gene
therapy of human severe therapy of human severe
imunodeficiency disease. imunodeficiency disease.
Science :288:669, 2000Science :288:669, 2000
Cavazzana-Calvo et al.Cavazzana-Calvo et al. Gene Gene
therapy of human severe therapy of human severe
imunodeficiency disease. imunodeficiency disease.
Science :288:669, 2000Science :288:669, 2000
2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação da cadeia gama do receptor comum para citocinada cadeia gama do receptor comum para citocina
– colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+)colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+)
– introdução do gene alvo + retrovírusintrodução do gene alvo + retrovírus
– reinfusão das células modificadas na corrente circulatória reinfusão das células modificadas na corrente circulatória
Resultado Resultado
– expressão do receptor nas células do sangue periférico e expressão do receptor nas células do sangue periférico e nos linfócitosnos linfócitos
– os linfócitos passaram a funcionaros linfócitos passaram a funcionar
– redução das infecçõesredução das infecções
2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação da cadeia gama do receptor comum para citocinada cadeia gama do receptor comum para citocina
– colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+)colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+)
– introdução do gene alvo + retrovírusintrodução do gene alvo + retrovírus
– reinfusão das células modificadas na corrente circulatória reinfusão das células modificadas na corrente circulatória
Resultado Resultado
– expressão do receptor nas células do sangue periférico e expressão do receptor nas células do sangue periférico e nos linfócitosnos linfócitos
– os linfócitos passaram a funcionaros linfócitos passaram a funcionar
– redução das infecçõesredução das infecções
Terapia gênica para tratamento de Terapia gênica para tratamento de imunodeficiência grave imunodeficiência grave
Terapia gênica para tratamento de Terapia gênica para tratamento de imunodeficiência grave imunodeficiência grave
Terapia gênica para tratamento de Terapia gênica para tratamento de deficiência de adenosina deaminase (ADA)deficiência de adenosina deaminase (ADA)
Terapia gênica para tratamento de Terapia gênica para tratamento de deficiência de adenosina deaminase (ADA)deficiência de adenosina deaminase (ADA)
Também causa imunodeficiência graveTambém causa imunodeficiência grave
3 crianças com diagnóstico pré-natal3 crianças com diagnóstico pré-natal
colhido sangue de cordão umbilical e separadas colhido sangue de cordão umbilical e separadas células precursoras (CD34+)células precursoras (CD34+)
introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ retrovírus retrovírus
transplante autólogotransplante autólogo
Resultado: melhora das infecçõesResultado: melhora das infecções
Também causa imunodeficiência graveTambém causa imunodeficiência grave
3 crianças com diagnóstico pré-natal3 crianças com diagnóstico pré-natal
colhido sangue de cordão umbilical e separadas colhido sangue de cordão umbilical e separadas células precursoras (CD34+)células precursoras (CD34+)
introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ retrovírus retrovírus
transplante autólogotransplante autólogo
Resultado: melhora das infecçõesResultado: melhora das infecções
LTRLTRLTRLTR LTRLTRLTRLTR
c DNA Adenosina deaminasec DNA Adenosina deaminasec DNA Adenosina deaminasec DNA Adenosina deaminase
Detecção de vetor ADA por PCR Detecção de vetor ADA por PCR semiquantitativosemiquantitativo
Detecção de vetor ADA por PCR Detecção de vetor ADA por PCR semiquantitativosemiquantitativo
Kohn et al, 1995, Nature MedicineKohn et al, 1995, Nature Medicine
Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancerto tumors of patients with lung cancer
Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancerto tumors of patients with lung cancer
J.A. Roth, et alJ.A. Roth, et al
Nature Medicine, Volume 2, Number 9, September 1996Nature Medicine, Volume 2, Number 9, September 1996
Pretreatment (a and c) and Pretreatment (a and c) and
30 day posttreatment (b and 30 day posttreatment (b and
d) bronchoscopic imagesd) bronchoscopic images
Pretreatment (a and c) and Pretreatment (a and c) and
30 day posttreatment (b and 30 day posttreatment (b and
d) bronchoscopic imagesd) bronchoscopic images
Terapia Anti-senseTerapia Anti-senseTerapia Anti-senseTerapia Anti-sense
DNA alvoDNA alvoDNA alvoDNA alvo DNA anti-senseDNA anti-senseDNA anti-senseDNA anti-sense
TranscriçãoTranscriçãoTranscriçãoTranscrição
RNAm senseRNAm senseRNAm senseRNAm sense RNAm anti-senseRNAm anti-senseRNAm anti-senseRNAm anti-sense
Bloqueio da Tradução para proteínaBloqueio da Tradução para proteínaBloqueio da Tradução para proteínaBloqueio da Tradução para proteína
Terapia Anti-senseTerapia Anti-senseTerapia Anti-senseTerapia Anti-sense
Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb
et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996))
– Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam
bcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapiabcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapia
– 6 injeções parenterais do antisense 6 injeções parenterais do antisense
– Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4 Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4
pacientes com resposta parcialpacientes com resposta parcial
Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)
Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb
et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996))
– Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam
bcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapiabcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapia
– 6 injeções parenterais do antisense 6 injeções parenterais do antisense
– Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4 Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4
pacientes com resposta parcialpacientes com resposta parcial
Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)
Produção de vacinas de tumor Produção de vacinas de tumor autólogoautólogo
Produção de vacinas de tumor Produção de vacinas de tumor autólogoautólogo
Ressecção ecultivo de
células tumorais gene
Imunoestimulaçãodas células modificadas
Testar expressãogênica
Injetar células
sc
Gene SuicidaGene SuicidaGene SuicidaGene SuicidaEx: HSV - TKEx: HSV - TKEx: HSV - TKEx: HSV - TK
Herpes simplesHerpes simplesHerpes simplesHerpes simples Timidina QuinaseTimidina Quinase
GanciclovirGanciclovirGanciclovirGanciclovir
Fosforilação do GanciclovirFosforilação do GanciclovirFosforilação do GanciclovirFosforilação do Ganciclovir
Morte celularMorte celularMorte celularMorte celular
Células xenogênicas para terapia Células xenogênicas para terapia gênicagênica
Células xenogênicas para terapia Células xenogênicas para terapia gênicagênica
Exemplo:Exemplo: Linhagem murina produtora de vetor Linhagem murina produtora de vetor
contendo o gene suicida timidina quinase + regiões contendo o gene suicida timidina quinase + regiões
do vírus herpes simples para tratamento de Tumor do vírus herpes simples para tratamento de Tumor
cerebralcerebral
Objetivo:Objetivo: induzir a transformação de uma pró-droga induzir a transformação de uma pró-droga
em droga. O herpes simples tem afinidade pelo em droga. O herpes simples tem afinidade pelo
sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o
ganciclovir . O ganciclovir fosforilado destrói a ganciclovir . O ganciclovir fosforilado destrói a
celulacelula
Exemplo:Exemplo: Linhagem murina produtora de vetor Linhagem murina produtora de vetor
contendo o gene suicida timidina quinase + regiões contendo o gene suicida timidina quinase + regiões
do vírus herpes simples para tratamento de Tumor do vírus herpes simples para tratamento de Tumor
cerebralcerebral
Objetivo:Objetivo: induzir a transformação de uma pró-droga induzir a transformação de uma pró-droga
em droga. O herpes simples tem afinidade pelo em droga. O herpes simples tem afinidade pelo
sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o
ganciclovir . O ganciclovir fosforilado destrói a ganciclovir . O ganciclovir fosforilado destrói a
celulacelula
Transferência de células produtoras de Transferência de células produtoras de HSV-tk em Tumor Cerebral HSV-tk em Tumor Cerebral
Transferência de células produtoras de Transferência de células produtoras de HSV-tk em Tumor Cerebral HSV-tk em Tumor Cerebral
Ram et al, 1997 - Nature Medicine 3:1354Ram et al, 1997 - Nature Medicine 3:1354
Ram et al, 1997 - Nature Medicine 3:1354Ram et al, 1997 - Nature Medicine 3:1354
Segurança em Terapia GênicaSegurança em Terapia GênicaSegurança em Terapia GênicaSegurança em Terapia Gênica
Vetor adenoviral expressando gene Ornitina Vetor adenoviral expressando gene Ornitina
Carboxilase (OTC)Carboxilase (OTC)
Infusão em artéria hepática em adultos com doença Infusão em artéria hepática em adultos com doença
leve ou heterozigotos leve ou heterozigotos
Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu
altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg)altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg)
Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãosDesenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos
Vetor adenoviral expressando gene Ornitina Vetor adenoviral expressando gene Ornitina
Carboxilase (OTC)Carboxilase (OTC)
Infusão em artéria hepática em adultos com doença Infusão em artéria hepática em adultos com doença
leve ou heterozigotos leve ou heterozigotos
Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu
altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg)altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg)
Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãosDesenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos
Em 2002Em 2002
11 pacientes em tratamento com boa resposta: 11 pacientes em tratamento com boa resposta:
melhora da imunodeficiênciamelhora da imunodeficiência
– 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide
aguda (2002 , 2003, 2004)aguda (2002 , 2003, 2004)
– Interrupção do protocoloInterrupção do protocolo
Pacientes com imunodeficiência teriam menos Pacientes com imunodeficiência teriam menos
chance de rejeitar células neoplásicas??chance de rejeitar células neoplásicas??
Em 2002Em 2002
11 pacientes em tratamento com boa resposta: 11 pacientes em tratamento com boa resposta:
melhora da imunodeficiênciamelhora da imunodeficiência
– 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide
aguda (2002 , 2003, 2004)aguda (2002 , 2003, 2004)
– Interrupção do protocoloInterrupção do protocolo
Pacientes com imunodeficiência teriam menos Pacientes com imunodeficiência teriam menos
chance de rejeitar células neoplásicas??chance de rejeitar células neoplásicas??
Terapia gênica para tratamento de Terapia gênica para tratamento de imunodeficiência grave imunodeficiência grave
Terapia gênica para tratamento de Terapia gênica para tratamento de imunodeficiência grave imunodeficiência grave
Toxicidade potencial da terapia gênicaToxicidade potencial da terapia gênicaToxicidade potencial da terapia gênicaToxicidade potencial da terapia gênica
Relacionada ao vetorRelacionada ao vetor
- resposta imuneresposta imune
- integraçãointegração
Relacionada ao TransgeneRelacionada ao Transgene
- response imuneresponse imune
- superexpressionsuperexpression
Transmissão para células germinativasTransmissão para células germinativas
Relacionada ao vetorRelacionada ao vetor
- resposta imuneresposta imune
- integraçãointegração
Relacionada ao TransgeneRelacionada ao Transgene
- response imuneresponse imune
- superexpressionsuperexpression
Transmissão para células germinativasTransmissão para células germinativas
Segurança em terapia gênicaSegurança em terapia gênicaSegurança em terapia gênicaSegurança em terapia gênica
Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar
em genes ativos (exons) em genes ativos (exons)
– Schroder et al (Cell, 2002) Schroder et al (Cell, 2002)
– Nakai et al (Nature Genetics, 2003) Nakai et al (Nature Genetics, 2003)
Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar
em genes ativos (exons) em genes ativos (exons)
– Schroder et al (Cell, 2002) Schroder et al (Cell, 2002)
– Nakai et al (Nature Genetics, 2003) Nakai et al (Nature Genetics, 2003)
ConclusãoConclusãoConclusãoConclusão
Terapia gênica é uma realidadeTerapia gênica é uma realidade Terapia gênica é uma realidadeTerapia gênica é uma realidade
AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos
• Margareth Castro OzelloMargareth Castro Ozello
• Valder R.ArrudaValder R.Arruda
• Marcelo Agostinho SalomãoMarcelo Agostinho Salomão
• Denise Silvia SouzaDenise Silvia Souza
• Dilmara Lopes VicentimDilmara Lopes Vicentim
• Margareth Castro OzelloMargareth Castro Ozello
• Valder R.ArrudaValder R.Arruda
• Marcelo Agostinho SalomãoMarcelo Agostinho Salomão
• Denise Silvia SouzaDenise Silvia Souza
• Dilmara Lopes VicentimDilmara Lopes Vicentim