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Universidad de Granada
Facultad de Medicina
Departamento de Antropología Física
Estudios sobre ADN antiguo.
Posibilidades desde
una Perspectiva Histórica:
El caso de las Islas Canarias
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
ALEJANDRA CALDERÓN ORDÓÑEZ
MÁSTER EN ANTROPOLOGÍA FÍSICA Y FORENSE
EVOLUCIÓN HUMANA, PALEOANTROPOLOGÍA Y PALEOECOLOGÍA
TUTOR:Dr. Juan Carlos Álvarez Merino
DIRECTORES:Dra. Matilde Arnay de La RosaDra. Rosa Irene Fregel Lorenzo
GRANADA, 2010
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Facultad de Medicina
Departamento de Antropología Física
Estudios sobre ADN antiguo.
Posibilidades desde
una Perspectiva Histórica:
El caso de las Islas Canarias
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
MÁSTER EN ANTROPOLOGÍA FÍSICA Y FORENSE
EVOLUCIÓN HUMANA, PALEOANTROPOLOGÍA Y PALEOECOLOGÍA
Vº Bº del TutorTrabajo de investigación que presentala Lcda. Alejandra Calderón Ordóñez,tutelado por el Doctor Juan CarlosÁlvarez Merino, Departamento deMedicina Legal, Toxicología yPsiquiatría (UGR); y dirigido por la Dra.Matilde Arnay de La Rosa,Departamento de PrehistoriaAntropología e Historia Antigua (ULL);y la Dra. Rosa Irene Fregel Lorenzo,Departamento de Genética (ULL).
Septiembre de 2010
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ÍNDICE
............................................................................................CAPÍTULO 1 - Introducción 2
CAPÍTULO 2 - .......Estado de la cuestión en los estudios de ADN antiguo 3
.............................................2.1. Historia de los estudios de ADN antiguo 3
................................................................................2.2. ADN mitocondrial 4
......................................................................2.3. Fuentes de ADN antiguo 5
CAPÍTULO 3 - ......................Particularidades del ADN antiguo y su estudio 7
........................................................................3.1. La molécula del ADN 7
..................................................................................3.2. La degradación 7.............................................................................3.3. La Contaminación 12
3.4. Los inhibidores................................................................................. 14
CAPÍTULO 4 - ........Posibles soluciones a las dificultades metodológicas 16
.............................4.1. Determinación de la presencia de ADN endógeno 16
............................4.2. Solventando las consecuencias de la degradación 17
......................................................4.3. La lucha contra la contaminación 19
..................................................4.4. Cómo contrarrestar los inhibidores 20
.......CAPÍTULO 5 -Métodos de extracción, amplificación y secuenciación 24
5.1. Métodos de extracción .............................................………………….. 24
................5.2. Métodos para aumentar el éxito de la PCR ………………….. 26
...........................5.3. Métodos de secuenciación de segunda generación 28
5.4. Criterios de autentificación .............................................................. 29
.......................CAPÍTULO 6 - Algunas áreas de aplicación del ADN antiguo 34
...........................CAPÍTULO 7 -Estudios de ADN sobre la población canaria 38
7.1. Fundamentación de los estudios genéticos...............………………….. 38
7.2. Los Primeros estudios genéticos en la población canaria: Grupos
sanguíneos y polimorfismos enzimáticos……………………………………….. 39
7.3. Marcadores uniparentales…………………………………………………….. 42
7.3.1. Linajes maternos: el ADN mitocondrial……………………………. 42
7.3.2. Linajes paternos: el cromosoma Y………………………………….. 45
7.4. Los marcadores autosómicos: el sistema CD4/Alu……………………… 47
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7.5. Estudios de ADN antiguo en Canarias……………………………………… 48
CAPÍTULO 8 -Métodos para determinar el sexo genético en restos
................................................................................................................................humanos . 51
8.1. La amelogenina........................................................…………………... 51
8.2. El cromosoma Y para confirmar el sexo……………………………………. 56
8.3. El papel de los SNPs y las inserciones Alu…………………………………. 58
CAPÍTULO 9 - Importancia histórica de los estudios genéticos para la.................................................................................................determinación del sexo 61
...............................CAPÍTULO 10 - Posibilidades en el archipiélago Canario 68
CAPÍTULO 11 - Propuesta metodológica: Posibles enfoques de los.....................................................................estudios de ADN antiguo en Canarias 72
.......................................................................................CAPÍTULO 12 - Conclusiones 75
..........................................................................................CAPÍTULO 13 - Bibliografía 77
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Agradecimientos
En primer lugar quisiera agradecer a mi familia, y especialmente a mis padres y a José
Pablo, por creer en mi y en este loco sueño, sin ustedes me habría rendido hace tiempo.
A Matilde por apoyarme, por ayudarme a solucionar problemas, por ser un modelo aseguir y por estar ahí a lo largo de este camino, espero seguir recorriéndolo con ella a mi
lado.
Al grupo de bioantropología de la Universidad de La Laguna, Aioze, Guacimara, Alejandro
y Nuria, gracias por compartir este sueño y por mantener la ilusión en nuestro proyecto de
futuro, espero que sigamos trabajando juntos mucho tiempo.
A Vicente por haberme abierto las puertas del laboratorio y haberme ayudado en mis
primeros pasos dentro de un universo nuevo para mi, como lo era la genética.A Rosi, la mejor profesora de biología molecular que uno puede tener, gracias por todos
los buenos consejos y correcciones, espero estar a la altura de todo lo que he recibido.
A Bertila y a Cristo, por ser un apoyo incondicional a pesar de seguir caminos diferentes.
Gracias por todas las oportunidades que me han dado, espero seguir siendo infiel a mis
muertos muchos veranos más.
A toda la gente de El Salt, tanto a los que llevan muchos años como a los que acaban de
llegar, por hacer de cada verano una experiencia única en la que recargar energías paraseguir trabajando. A Jorge, Diana, Caro, Richard, Leo y Efra gracias por ser grandes
compañeros de laboratorio, por crear un ambiente de trabajo estupendo y hacerme
partícipe de grandes conversaciones.
A J. Carlos Alvarez, por su apoyo durante mi estancia en Granada, gracias por ayudarme
a saber por donde empezar.
A todos mis amigos de El Puerto y de Bogotá, por estar ahí cuando los he necesitado y
por escucharme aunque no siempre supieran de lo que les estaba hablando.
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1. Introducción
El presente trabajo se inserta dentro de una de las vías de investigación del grupo
de bioantropología de la Universidad de La Laguna. Con él se pretende dar continuidad auna disciplina, la del ADN antiguo, que hasta el momento ha dado muy buenos
resultados. Se lleva a cabo con el convencimiento de que una profundización en este tipo
de investigaciones, desde el punto de vista histórico, puede resultar de gran interés dentro
de la vocación multidisciplinar del equipo de investigación.
Teniendo en cuenta que el objetivo principal de este trabajo es la interpretación
histórica, resulta fundamental la participación en los estudios de ADN antiguo deinvestigadores con una formación en Historia, que les permita plantear determinadas
preguntas, así como interpretar los resultados desde una perspectiva que realmente
contribuya a la construcción de las explicaciones históricas. Como consecuencia resulta
necesario una formación multidisciplinar, para que los historiadores cuenten con
herramientas técnicas y metodológicas dentro del campo de la biología molecular que les
permitan resolver algunos de los problemas planteados.
Este trabajo es una consecuencia directa de esa necesidad de formación en el
campo del ADN antiguo. Será la base metodológica que servirá de fundamento para el
desarrollo de trabajos posteriores encaminados hacia una tesis doctoral. Por ello, se
plantearon unos objetivos que constituyan, al finalizar esta fase de la investigación, la
base teórico-metodológica de las investigaciones posteriores, tanto en cuestiones de
biología molecular como en posibles vías de trabajo en el archipiélago canario.
Dentro de esos objetivos se encuentra un acercamiento a la conformación de los
estudios de ADN antiguo como disciplina, para entender el contexto en el que se inserta
esta línea de investigación.
Resulta fundamental conocer y entender las principales características de las
muestras utilizadas en los estudios de ADN antiguo, para poder comprender las
dificultades metodológicas de éstas y las posibles soluciones que se han propuesto parasubsanar estos problemas.
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Teniendo en cuenta la perspectiva histórica de este trabajo, es fundamental realizar
un repaso sobre algunos de los principales estudios históricos que han utilizado los
análisis de ADN antiguo como parte de su metodología, sobre todo aquellos en los que
éstos fuesen fundamentales para sustentar las conclusiones obtenidas. Dentro de estalínea, otro objetivo será intentar determinar algunas de las aportaciones que puede dar la
determinación genética del sexo dentro del campo de la historia, y las problemáticas
particulares de estos enfoques. Todo lo anterior permitirá plantear posibles objetos de
estudio y vías de investigación con los estudios de ADN antiguo para una futura tesis
doctoral.
2. Estado de la cuestión en los estudios de ADN antiguo
2.1. Historia de los estudios de ADN antiguo
La historia del ADN antiguo se remonta poco en el tiempo, pero desde sus inicios
ha tenido un gran impacto mediático que condujo a especulaciones, tanto en la prensa
como en las películas, que hicieron creer que era posible devolver la vida a criaturas
antiguas (Wayne et al., 1999). Cada nuevo descubrimiento servía para confirmarle alpúblico la impresión de que los científicos se estaban acercando rápidamente hacia esa
meta.
Los primeros trabajos sobre ADN antiguo aparecieron a mediados de los ochenta
cuando Higuchi (1984) obtuvo fragmentos del ADN mitocondrial de la extinta quagga,
usando un espécimen conservado en un museo. Poco tiempo después, Pääbo (1985)
publicó una secuencia parcial del ADN mitocondrial de un momia egipcia de 2430 años.Ninguno de estos dos análisis pudo ser reproducido, y en la actualidad las secuencias
obtenidas son vistas con cierta cautela. Lo anterior no significa que, en su momento, estos
estudios no tuvieran un gran impacto, porque implicaban la posibilidad de que las
moléculas de ADN sobrevivieran largos periodos de tiempo. La investigación en ADN
antiguo presenció un avance substancial con el advenimiento de la PCR, reacción en
cadena de la polimerasa, que permitió la amplificación de cantidades muy pequeñas de
ADN (Mullis et al., 1986). La aplicación de esta técnica pronto revelaría los dos grandesproblemas del ADN antiguo, la degradación y las grandes posibilidades de contaminación
(Paabo et al., 1989).
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En los últimos años se ha ido confirmando el límite teorético de supervivencia del
ADN alrededor de 100.000 años, con algunas excepciones en el permafrost que tampoco
superan el millón de años. Por ello, los primeros estudios que se publicaron con
secuencias de una antigüedad cercana al millón de años, son cada vez vistos con mayor escepticismo (Cooper and Wayne, 1998). Algunas de estas investigaciones iniciales
serían las realizadas sobre fósiles de magnolia con una antigüedad de entre 17 y 20
millones de años. Su publicación alentó a muchos investigadores a buscar ADN de
animales como los dinosaurios o insectos preservados en ámbar; uno a uno estos
resultados fueron cuestionados mostrando que en su gran mayoría eran consecuencia de
la contaminación (Wayne et al., 1999). Incluso se demostró que insectos mucho más
recientes preservados en copal, un estado anterior al ámbar de las mismas resinas, eraninservibles como fuente de ADN antiguo, con lo que se evidenciaba la diferencia entre una
preservación morfológica y la conservación de moléculas de ADN (Lindahl, 1997).
2.2. ADN mitocondrial
Dentro del campo del ADN antiguo el ADN mitocondrial ha jugado un papel
fundamental debido a sus peculiares características (Pakendorf and Stoneking, 2005,Álvarez JC, 2001). En la especie humana, éste consiste en una molécula circular
bicatenaria, compuesta por 16.569 ± 20 pares de bases. La primera característica que
hace al ADN mitocondrial especialmente útil para los estudios de muestras antiguas es el
gran número de copias que hay en cada célula, desde cientos hasta miles de ellas, en
comparación con la dos copias por célula del ADN nuclear; lo que le da una mayor
probabilidad per-locus de ser recuperado usando las técnicas comunes de laboratorio. La
segunda característica es la herencia por vía materna exclusivamente, lo que permite alos investigadores trazar los linajes maternos de las poblaciones a lo largo del tiempo. La
última de estas características es la mayor tasa de mutación del ADN mitocondrial en
comparación con el nuclear, lo que resulta ventajoso al estudiar los cambios que se han
producido a lo largo del tiempo. El ADN mitocondrial está compuesto principalmente por
ADN codificante, con la excepción de una fragmento largo de aproximadamente 1100
pares de bases conocido como la región control. Dentro de esta zona se encuentra la
región hipervariable, que por su alta tasa de sustitución (la más alta de todo el ADNmitocondrial), se ha convertido en el centro de las investigaciones de ADN antiguo.
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Los estudios iniciales sobre la variación del ADN mitocondrial se basaron en el
análisis de RFLPs. Con la llegada de la PCR y de los métodos de secuenciación, se
empezaron a hacer RFLPs de los productos de la PCR, así como análisis de las
secuencias del primer sector hipervariable (HVR1), que se encuentra dentro de la regióncontrol (Pakendorf and Stoneking, 2005). Será en 2001 cuando se secuenciará el primer
genoma mitocondrial antiguo en su totalidad (Ho and Gilbert, 2010), cuando dos equipos
presentaron el genoma del moa (Cooper et al., 2001, Haddrath and Baker, 2001). Pasaron
cinco años hasta que en 2006 se presentaron dos secuencias independientes del mamuth
lanudo (Krause et al., 2006, Rogaev et al., 2006). La realización de estos genomas ha
sido posible gracias a mejoras técnicas y metodológicas en la secuenciación, como la
PCR de emulsión y la pirosecuenciación.
2.3. Fuentes de ADN antiguo
Una de las primeras cuestiones que se deben explicar son las posibles fuentes de
ADN antiguo. Se debe partir de la base de que cualquier substancia de origen biológico
es candidato potencial para proporcionar ADN antiguo, aunque algunas de ellas suelen
dar mejores resultados (O'Rourke et al., 2000).
El hueso suele considerarse como una fuente óptima de ADN antiguo ya que la
unión del ADN con la hidroxiapatita suele ayudar a disminuir su degradación. Se ha
demostrado la relación entre la preservación morfológica a nivel microscópico y la
posibilidad de obtener ADN antiguo, aunque no hay necesariamente una relación directa
entre éstas y la antigüedad de la muestra. La mala preservación a nivel macro, no
siempre implica una mala preservación a nivel micro, por lo que en principio cualquier muestra es potencialmente portadora de ADN. En la medida de lo posible deben tomarse
muestras de huesos sin lesiones, ya que éstas son una fuente potencial de
contaminación; también se debe intentar que se obtengan de regiones anatómicas con la
menor importancia antropológica y morfológica posible.
El uso de dientes como fuente de ADN antiguo tiene múltiples ventajas. Entre ellas
la de poder disponer de muestras independientes y múltiples de cada individuo. Se debenelegir dientes sin caries porque éstas permiten la entrada de ADN contaminante dentro de
la cavidad pulpar. El ADN puede ser extraído bien triturando el diente hasta convertirlo en
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polvo, o seccionando el diente para extraer el material del interior de la cavidad pulpar.
Este último método es especialmente útil en las muestras arqueológicas ya que no se
altera la morfología del diente.
En el caso de utilizar tejidos blandos como fuente de ADN, se debe intentar escoger tejidos que no se encuentren en la superficie, para disminuir el riesgo de
contaminación por manipulación. Parece ser que el tejido blando disecado es una de las
mejores fuentes de ADN, porque la deshidratación protege al ADN de procesos de
descomposición como la hidrólisis, de la que se hablará más adelante. Este tipo de tejidos
también presentan una mayor cantidad de inhibidores, que como se hablará en apartados
posteriores, dificultan la amplificación del ADN.
Además de estas fuentes principales, existen otros lugares de donde es posible
obtener ADN. Uno de estos son los pelos, aunque es bastante difícil obtener ADN cuando
estos no tienen raíz, como suele suceder en los casos arqueológicos, autores como
Gilbert (2007b) opinan que pueden ser una buena fuente de ADN . Los coprolitos son otra
fuente potencial de ácidos nucleicos, aunque su utilización implica algunos problemas
específicos que se discutirán posteriormente. Se han realizado algunos intentos con
plantas de hasta 500 años de antigüedad, de los que de momento se han obtenidoalgunos resultados prometedores. También se ha logrado obtener ADN antiguo a partir del
estudio de sedimentos (Hofreiter et al., 2003, Willerslev et al., 2003).
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3. Particularidades del ADN antiguo y su estudio
3.1. La molécula de ADN
Para la realización de los estudios de ADN antiguo es necesario considerar algunas
de las características particulares de las muestras con las que se trabaja. Éstas hacen
necesario una aproximación un poco diferente a la que es usual en los estudios de ADN
moderno.
En primer lugar se deben aclarar algunas de las características básicas del ADN
que permitan entender las particularidades descritas en los siguientes apartados. Lamolécula de ADN es un polímero compuesto de unidades de azúcar desoxirribosa 2’
unidas entre sí a través de enlaces fosfodiéster. A cada azúcar se une una purina
(adenina o guanina) o una pirimidina (citosina o timina) en la posición 1’ gracias a un
enlace glucosídico. En los organismos vivos la molécula de ADN está constantemente
hidratada, por lo que nunca está realmente seca. Además el ADN nuclear se encuentra
unido fuertemente alrededor de proteínas histonas que al parecer absorben algunos de
los daños producidos por el ambiente alrededor de las moléculas (Poinar, 2002).
El ADN antiguo presenta tres principales problemas que se producen a raíz de
algunas de las características de las moléculas, de los procesos postdeposicionales de
los restos tras la muerte de los individuos y de los métodos de laboratorio necesarios para
su análisis. Estos problemas son la degradación, la contaminación y la presencia de
inhibidores.
3.2. La degradación
Durante la vida de cualquier organismo, su ADN está siendo constantemente
sometido a diferentes procesos de degradación. Sin embargo, los seres vivos cuentan con
mecanismos enzimáticos de reparación del ADN. Estos mecanismos dejan de funcionar
en el momento de la muerte, haciendo que los daños ejercidos en el ADN se vayan
acumulando con el paso del tiempo. A continuación se explicarán los principales procesosde degradación y sus consecuencias en los estudios de ADN antiguo.
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Dentro de los tipos de degradación más comunes encontramos la ruptura de las
cadenas de ADN, las lesiones por oxidación, los “crosslinks” de ADN y las lesiones
hidrolíticas. Estos procesos se van acumulando progresivamente hasta que el ADN pierde
su integridad y se descompone con una pérdida irreversible de la información contenidaen la secuencia de nucleótidos. (Paabo et al., 2004). Ahora se procederá a explicar las
principales características de este tipo de lesiones.
Una de las consecuencias de la degradación es la disminución del tamaño en las
cadenas de ADN, quedando reducidas a entre 100 y 500 pb en promedio. Este descenso
se debe tanto a procesos enzimáticos que suceden poco tiempo después de la muerte
como a la fragmentación hidrolítica no enzimática, de los enlaces fosfodiester, en laestructura del fosfato y el azúcar, que generan cadenas simples. Los enlaces glucosídicos
entre las bases nitrogenadas y los azúcares también son sujetos de fragmentación
hidrolítica dando como resultado posiciones sin base. (Paabo et al., 2004).
Además de las lesiones ya mencionadas hay otras que también afectan a la
longitud de las secuencias que es posible amplificar con la PCR. Este segundo tipo de
lesiones bloquean la elongación de las hebras de ADN por la Taq polimerasa. Muchas deestas lesiones son inducidas por radicales libres, como los radicales de peróxido (O₂), los
de peróxido de hidrógeno (H₂O₂) y los radicales hidroxilo (OH), que se generan, entre
otras causas, como consecuencia de la radicación de fondo.
Existen algunos lugares dentro de las cadenas de ADN que son más susceptibles
al ataque de la oxidación; entre estos están los enlaces dobles, tanto de las pirimidinas
como de las purinas. (Paabo et al., 2004). El ADN extraído de restos fósiles es susceptiblea ser fragmentado por la enzima endonucleasa III, que es específica de las pirimidinas
oxidadas y que bloquea la acción de la Taq polimerasa.
Otro tipo de lesión son los “cross-links” que también bloquean la acción de la Taq
polimerasa, uno de estos casos serían los productos de Maillard. Identificados
principalmente en coprolitos, estos son formados por la reacción de los grupos carbonilo,
que reducen los azúcares con los aminos primarios de los aminoácidos (Poinar, 2002).
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También existen otro tipo de daños, muchos de ellos desconocidos, comunes en el
ADN antiguo y que generan problemas porque, a pesar de que la amplificación es posible,
generan la incorporación de bases equivocadas durante la PCR. La forma más común de
estas modificaciones es la pérdida hidrolítica de los grupos amino de las bases adenina,citosina, 5-metilcitosina y guanina, dando como resultado hipoxantina, uracilo, timina y
xantina, respectivamente. Los productos de la desaminización de la citosina (uracilo), del
5-metilcitosina (timina) y de la adenina (hipoxantina) tienen una especial relevancia en la
amplificación del ADN antiguo porque generan la inserción incorrecta de bases (A en lugar
de G y C en lugar de T) en el momento de las síntesis de nuevas hebras por parte de la
polimerasa. (Paabo et al., 2004). Actualmente también se ha llegado a la conclusión de
que las modificaciones son mayoritariamente de C a U (Brotherton et al., 2007, Gilbert etal., 2007a, Stiller et al., 2006). Esto traerá como consecuencia que los productos
amplificados tengan un sesgo hacia transiciones de CG a TA y una menor cantidad de AT
en GC. Sin embargo, estas reacciones bioquímicas pueden ser lo suficientemente
limitadas como para que el evento de mutación original pueda ser identificado(Mulligan,
2005).
Otra consideración importante es que este tipo de lesiones al parecer no ocurrende una forma aleatoria sino que se concentran en unos puntos calientes o “hot spots”,
existiendo al parecer una relación entre estos puntos y los lugares de sustituciones
evolutivas, por lo que a la hora de analizarlos pueden llevar a errores, al ser confundidos
con cambios evolutivos esperados. (Willerslev and Cooper, 2005)
Estos procesos de degradación son similares a algunos procesos químicos que
pueden ser reproducidos y estudiados en el laboratorio. Los resultados de este tipo deinvestigaciones sugieren que bajo las condiciones ambientales de la mayoría de los
depósitos arqueológicos y geológicos, la información genética relevante no se conserva
por más de 10⁵ años. (Chelomina, 2006).
También debe tenerse en cuenta que, organismos como las bacterias, los hongos y
los insectos, pueden afectar la integridad del ADN. (Poinar, 2002). Algunos autores
recogen estudios en los que se plantea que el rompimiento de las moléculas de ADN seda principalmente en los momentos cercanos a la muerte de un ser vivo, sobre todo en el
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hueso porque después las moléculas de ADN se unirían a la hidroxiapatita ralentizando
las lesiones hidrolíticas ya mencionadas. (O'Rourke et al., 2000).
Aunque no todos los científicos están de acuerdo sobre cuál es el límite temporal
para la conservación del ADN, se suele dar un límite general en torno a los 100.000 años.Lo que si está bastante claro es que la conservación depende más de las condiciones
ambientales específicas de los diferentes lugares de deposición de los restos que del
tiempo transcurrido. Es así como Smith (2003) plantea la importancia de conocer lo que él
denomina como la “historia térmica” de unos restos para poder evaluar la posible
conservación del ADN.
Es necesario resaltar que el índice de degradación del ADN no es lineal (Yang,1997), al parecer la degradación se reduce de manera importante después de un
decaimiento rápido que sucedería a la muerte de un ser vivo. Como ya se ha mencionado
la degradación de ADN depende de factores como la temperatura, el pH y la fuerza iónica
de la solución acuosa. También se ha detectado que la presencia de ciertos químicos
orgánicos, como los tocoferoles y los flavonoides, que son liberados por el propio
organismo o que son producidos por microorganismos en el sedimento, pueden inhibir la
función de algunas de las enzimas que destruyen el ADN.
Basándose en la manera como actúan los procesos de degradación descritos
anteriormente, se podría pensar que las bajas temperaturas y los ambientes secos son
algunas de las condiciones ideales para la preservación del ADN (Willerslev and Cooper,
2005). Es por esto que los hielos glaciares y el permafrost (tierras permanentemente
congeladas), con sus bajas temperaturas constantes, parecen ser apropiados para la
conservación a largo plazo de microorganismos y biomoléculas, como explicandetalladamente Willerslev et al (2004). Los ADNs antiguos con una cronología más lejana
que han sido autentificados vienen todos del permafrost. Entre ellos se incluye el ADN
mitocondrial de un mamut de más de 50.000 años, el ADN mitocondrial de un bisonte de
65.000 años, así como el ADN proveniente de cloroplastos de plantas de entre 300 y
400.000 años. Además de las bajas temperaturas, otras características de este tipo de
ambientes como la rápida deshidratación y las altas concentraciones salinas también
pueden haber contribuido a la conservación de las moléculas de ADN, pero incluso aquíhabría un límite de conservación que no superaría el millón de años (Willerslev and
Cooper, 2005).
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Además de los factores medio ambientales de los lugares de deposición, el
almacenamiento posterior a la excavación también puede ser un factor determinante para
la conservación del ADN. Como explica Geigl (2008) cuando se compara la cantidad de
ADN preservado en huesos fósiles que han sido sometidos a procedimientosarqueológicos normales, como lavado, secado y almacenamiento en lugares sin aire
acondicionado, y aquella encontrada en restos recién excavados se ha podido determinar
que es mucho mayor la degradación del ADN durante el almacenamiento que mientras los
restos están enterrados. De hecho el índice de éxito de las amplificaciones por PCR de
huesos excavados recientemente fue de más del doble (46%) sobre aquellos que fueron
almacenados siguiendo los procedimientos tradicionales (18%). Incluso la cantidad de
fragmentos de ADN con una longitud promedio de 150 pb puede llegar a ser seis vecessuperior en los huesos excavados hace poco que en aquellos sometidos a procedimientos
“estándar”. El autor concluye que el índice de degradación del ADN en fósiles
conservados en regiones con un clima moderado, como el norte de Francia, puede llegar
a ser 70 veces más rápido que en aquellos restos que se encuentren directamente en el
sedimento. Una de las posibles explicaciones para este fenómeno es que la temperatura
de almacenamiento estaría por encima de la temperatura de preservación, a lo que se
uniría a un descenso del pH y a una desalinización de los huesos como consecuencia dellavado de los mismos.
Una vez explicados algunos de los principales procesos de degradación de las
moléculas de ADN, es fundamental repasar brevemente las consecuencias de estos
fenómenos, sobre todo las incorporaciones erróneas de nucleótidos. Como explica Pääbo
(2004) la existencia de estas bases modificadas suele ser evidente cuando se clonan los
productos de la PCR provenientes de restos antiguos y el número de diferencias entre losdistintos clones es bastante superior a la observada en las amplificaciones de ADN
moderno. Hay dos tipos de evidencias para detectar la desaminización como la principal
causa de las incorporaciones equivocadas. La primera es que el ADN antiguo es sensible
a la ADN-uracilo-glicocilasa, una enzima que retira el uracilo del ADN. En segundo lugar
se producen un gran número de cambios de C a T y de G a A que se observan en los
clones de los productos amplificados. Estos cambios serían consistentes con la presencia
de residuos de C desaminizados que son idénticos a los residuos de uracilo (U) y quecausan la incorporación de residuos de A en lugar de los de G por la Taq polimerasa.
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Otros de los posibles efectos de la degradación para los estudios de ADN antiguo
son los presentados por Mulligan (2005). Entre ellos se encuentran la limitación en la
longitud de los productos de amplificación como consecuencia de la fragmentación del
ADN. Los bajos o casi indetectables niveles de ADN antiguo que permiten la amplificaciónpreferencial de ADN contaminante, de lo que se hablará en detalle en el apartado
siguiente. Marlmström (2007) encontró una relación proporcional entre el incremento de
moléculas endógenas amplificadas y la reducción del tamaño del amplicon. La inserción
aleatoria de nucleotidos por la polimerasa en las posiciones sin base y la denominada
“Jumping PCR” en la que fragmentos discontinuos de ADN se terminan uniendo a lo largo
de la reacción de amplificación.
3.3. La contaminación
El segundo problema al que se enfrentan los investigadores de ADN antiguo es la
posibilidad de contaminación con ADN moderno. Este peligro se debe a que la técnica
principal que permite la recuperación de ADN tan degradado como es habitual en las
muestras antiguas, la PCR, necesita una gran sensibilidad para lograr este objetivo. Esto
puede ser contraproducente porque será igualmente sensible a contaminacionesmodernas mínimas y al estar este ADN en mejores condiciones, será preferentemente
amplificado sobre las muestras en peor estado.
Teniendo en cuenta este factor, Geigl (2008) hace una clasificación de los
diferentes momentos en que las muestras pueden ser contaminadas y de qué manera
esto ocurriría.
El primer caso sería la contaminación post-excavación en la que, como
consecuencia de la rápida degradación del ADN endógeno una vez que los huesos fósiles
son desenterrados y sometidos a procesos como el lavado, el secado y el
almacenamiento, se incrementa la posibilidad de obtener falsos positivos provenientes de
ADN moderno, sobre todo si se compara con otro tipo de muestras como aquellas
provenientes del permafrost. Esto sucede porque entre menor sea la cantidad de ADN
endógeno presente en un hueso, mayor será el riesgo de que el ADN modernocontaminante, proveniente del ambiente, sea finalmente analizado. Existen algunas
investigaciones donde se ha intentado rastrear el ADN aportado por los excavadores,
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como sería el caso de un estudio hecho sobre dientes humanos provenientes de
contextos neolíticos (Sampietro et al., 2006) o el de huesos con antigüedades entre 200 y
3300 años que fueron manipulados de forma indebida intencionalmente (Bouwman et al.,
2006). Otro estudio que confirmaría este resultado fue el realizado en huesos de perro
almacenados en museos en los que se detecto la presencia de ADN humano (Malmstromet al., 2005). Un último ejemplo sería el trabajo realizado sobre muestras de la Isla
Canaria de La Palma, en el que se recuperó el ADN externo de dientes y se encontró que,
en la mayoría de los casos, aunque se podía recuperar el ADN de los antropólogos, éste
no coincidía con el ADN endógeno (Fregel et al., 2009b).
Algunas fuentes de contaminación pueden provenir del sudor de los excavadores e
investigadores, así como del agua utilizada en el lavado que se suele realizar de loshuesos. En cuanto a la profundidad de esta contaminación se han presentado resultados
contradictorios. Mientras que algunos estudios muestran que la contaminación se
mantiene en la superficie del hueso, no penetrando más allá de 1 o 2 mm, otros
evidencian como la manipulación de huesos humanos, en este caso provenientes de un
contexto medieval y que habían sido excavados en los años setenta, no mostraban
coincidencias con el ADN de los investigadores, por lo que se infirió que los perfiles
contaminantes encontrados pertenecían a los excavadores iniciales (Gilbert et al., 2006).La explicación que se da a este fenómeno es que los huesos y dientes fosilizados pueden
ser muy susceptibles a la contaminación con ADN moderno durante el proceso de
excavación, ya que los poros de los tejidos calcificados aún estarían abiertos, cerrándose
en el posterior proceso de secado.
El problema es que el ADN exógeno puede mostrar las mismas sustituciones en las
bases de los nucleotidos que el ADN antiguo, en éste último como consecuencia del dañode las bases, pudiéndose interpretar entonces el moderno como antiguo con lo que se
producirían unos resultados falsos (Sampietro et al., 2006).
El segundo momento en el que se puede producir la contaminación es en los
procesos de extracción del ADN y de la PCR. Podemos encontrar moléculas de ADN en el
ambiente, en este caso aportadas por los investigadores, siendo inevitable su presencia
en los laboratorios y en los reactivos. Partiendo de la base de que el ADN humano y delos microbios está de forma ubicua en todos los laboratorios (Willerslev and Cooper,
2005), resulta prudente asumir que todos los reactivos y herramientas están
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contaminados con ADN humano y microbiano cuando los envía el proveedor. Una
limpieza de los reactivos, por ejemplo con ultrafiltración, y de las distintas herramientas
resulta esencial. Los reactivos y el equipo comercial marcado como estéril no están
garantizados como libres de células viables o de ácidos nucleicos.
El último tipo de contaminación es la de arrastre o “carry over”; ésta se produce
como resultado de la presencia de miles de millones de copias de ADN procedentes de
amplificaciones y clonaciones anteriores que se encuentran muy concentradas, por lo que
es relativamente fácil que se dispersen por el ambiente. Esto tiene una gran relevancia ya
que estas moléculas son idénticas a la que se utilizaron en primer lugar, pudiendo llegar a
distorsionar las replicaciones que se hagan en un mismo laboratorio. Las cifras
presentadas por Willerslev (2005), permiten hacerse una idea de la magnitud delproblema. Una reacción de PCR exitosa puede contener entre 10¹² - 10¹⁵ moléculas
amplificadas en un volumen inferior a los 50 µl. Por ello el movimiento del aire cuando se
abren los tubos o la transferencia de líquidos crea y dispersa gotas de un tamaño mínimo,
que pueden contener más de un millón de copias de la molécula origina por cada 0.005
µl. Esto hace que los productos de la PCR se puedan dispersar rápidamente a través de
las superficies del laboratorio, de los corredores e incluso expandirse a edificios enteros
por medio del movimiento del personal o de los sistemas de ventilación. Teniendoentonces en cuenta que una gota ínfima puede contener fácilmente mil veces más ADN
amplificable que el contenido de un gr de muestra de especímenes antiguos (10⁵ - 10⁶
copias), se hace indispensable que los laboratorios de ADN antiguo estén aislados tanto
física como logísticamente de otros estudios de biología molecular. Hay otro tipo de
medidas para reducir la contaminación que serán discutidas en apartados posteriores.
3.4. Los inhibidores
Un tercer problema que se presenta en los estudios de ADN antiguo son los
denominados inhibidores de la PCR. Son sustancias que se encuentran junto al ADN
antiguo, sobre todo provenientes del medio ambiente, y cuyo problema es que evitan que
la Taq Polimerasa realice su trabajo durante la reacción en cadena. La mayor parte de
estos según O’Rourke (2000) son taninos, ácidos húmicos y ácidos fúlvicos, todos ellos
comunes en los procesos de degradación del suelo. Junto con los productos de Maillard,que ya fueron mencionados con anterioridad, los inhibidores de este tipo suelen dar una
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coloración marrón a los extractos de ADN. Kemp (2006) hace referencia a otros
inhibidores, además de los ya mencionados, y a sustancias como los productos de la
porfirina, hematinas y el colágeno tipo I que actúan como inhibidores; junto a ellos
menciona a los productos de Maillard que, aunque no desactivan a la polimerasa, pueden
ser considerados inhibidores ya que el ADN atrapado en estos productos, derivados de lacondensación de algunos azúcares, no puede ser alcanzado por la polimerasa.
Además de la coloración, los extractos con inhibidores al ser sometidos a
electroforesis suelen aparecer como una “nube” borrosa, entre azul y verde cuando se les
ilumina con luz UV. Cuando no se amplifica ADN, la presencia de inhibidores puede
sospecharse si no se producen dímeros de primer durante la PCR.
Estos tres son los principales problemas de los estudios de ADN antiguo y por lo
que muchos de los resultados resultan cuestionables. Sin embargo, desde las primeras
publicaciones se ha producido un gran avance en la búsqueda de técnicas que aumenten
la fiabilidad de los estudios que se realizan.
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4. Posibles soluciones a las dificultades metodológicas
Desde que se realizaron los primeros estudios sobre ADN antiguo se empezaron a
buscar estrategias para superar algunos de los problemas que plantean las característicasde este tipo de moléculas. En este apartado se explican algunas de las propuestas que se
han publicado en los últimos años para los distintos retos metodológicos que plantean los
estudios de ADN antiguo.
4.1. Determinación de la presencia de ADN endógeno
Teniendo en cuenta que la mayoría de las muestras son ejemplares únicos con unalto valor arqueológico y el carácter destructivo, en muchos casos, de este tipo de
análisis, es necesario buscar medidas que nos ayuden a seleccionar aquellas muestras
con más posibilidades de dar resultados positivos. Existen varias técnicas denominadas
“screening methods” o métodos de rastreo que intentan determinar las posibilidades de
que una muestra contenga ADN endógeno.
Así Hofreiter (2001) plantea que los métodos de rastreo rápidos son cruciales paraidentificar las muestras que están tan mal preservadas que no vale la pena intentar
amplificarlas. Resalta los análisis de aminoácidos como un método que ha demostrado
ser muy útil para evaluar la conservación del ADN. Destacan aquellos procedimientos que
tienen en cuenta la cantidad total de aminoácidos preservados en un espécimen, su
composición y la extensión de la racemización de varios de ellos. Esta última consiste en
el cambio de la estructura tridimensional de los aminoácidos con el paso del tiempo.
Este tipo de análisis pueden ayudar a sustentar la autenticidad de las secuencias
de ADN obtenidas de un espécimen, ya que demuestran que las condiciones de
preservación son tales que la obtención de macromoléculas es posible. Otro método
posible, aunque menos extendido y estudiado, para intentar ver la presencia de ADN
antiguo es el de la pirólisis unida con una cromatografía de gases y espectrometría de
masas (GC/MS). Consiste en un análisis en el que las macromoléculas son
descompuestas con calor y los productos de esta reacción son luego analizados.
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Existen otros métodos para medir el nivel de degradación de los huesos, muchos
de ellos basados en distintas aplicaciones de los rayos X, en los que no se entrará en
excesivo detalle pero que es necesario por lo menos mencionar. Hiller (2006) hace
referencia a algunos de ellos como el uso del espectro de transformación de infrarrojos deFourier (FTIR) para calcular los índices de cambio en los cristales del hueso, la difracción
de rayos X (XRD) para determinar la composición de los cristales y la densidad del hueso,
así como la emisión de rayos X de partículas inducidas (PIXE) que examina las
substituciones químicas diagenéticas en la estructura mineral. Sin embargo, Hiller (2006)
se centra en la propuesta de otro método, la dispersión de rayos X en ángulos pequeños
(small-angle X-ray scattering o SAXS) que se considera de utilidad porque permite
examinar los cristales de hueso en función de su distribución por tamaños,proporcionando un indicador directo de la preservación o alteración de los propios
cristales biogénicos. El estudio de Hiller (2006), profundiza en la aplicación de este
método y su importancia para determinar la buena conservación de los tejidos óseos,
además de la relación entre la alteración de la fase mineral del hueso y la posible
conservación de biomoléculas como el ADN.
4.2. Solventando las consecuencias de la degradación
Aunque a través de los métodos de rastreo se considere que una muestra está lo
suficientemente bien preservada como para realizar estudios de ADN antiguo, esto no
significa que ésta no se encuentre degradada de una u otra manera. Es por eso que se
han realizado importantes esfuerzos para solventar algunos de los efectos de la
degradación. En el caso de los “cross-links” Reiss (2006) recoge algunas de laspropuestas que se han planteado para contrarrestarlos. Entre ellas está un protocolo que
busca reparar los “cross-links” entre las distintas hebras antes de la PCR, sometiendo a
las muestras a un tratamiento con ligasa y ADN polimerasa, que son las enzimas
responsables de la reparación del ADN en la célula viva; los primeros experimentos de
este tipo fueron realizados con muestras de Homo, aunque también se han probado en
especímenes antiguos del grupo Equidae. Como complemento se menciona el
tratamiento con N- bromuro de phenacylithiazolium (PTB) para eliminar algunos “cross-links” como los productos de Maillard, procedimiento que será explicado más adelante.
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Otra de las consecuencias de la degradación son las incorporaciones erróneas que
se han mencionado en apartados anteriores. Una aproximación a su tratamiento de cara a
los estudios de ADN antiguo es la planteada por Pääbo et al. (2004). En ella se evidencia
la necesidad de distinguir entre las incorporaciones erróneas inducidas por los daños quetiene el ADN antiguo y los errores de la Taq polimerasa que ocurren en cualquier PCR sin
importar las condiciones del ADN de la muestra. Una manera de conseguirlo es realizando
múltiples amplificaciones de los extractos de ADN y clonar los productos de esas PCR. La
comparación entre las secuencias de múltiples clones de esas amplificaciones, revelará
las diferencias en los nucleótidos que ocurren en todos los clones de una amplificación,
pero no en las demás amplificaciones que han usado la misma muestra. La mayor parte
de esas substituciones, que pueden considerarse consistentes, se deberán a erroresocurridos durante los primeros ciclos de la PCR. Por el contrario, las substituciones
adicionales que se observen en clones individuales, se podrán deber a incorporaciones
erróneas ocurridas en ciclos posteriores de la PCR. Por ello si las frecuencias entre estos
dos tipos de incorporaciones son comparadas, se podrá establecer la diferencia entre las
substituciones inducidas por daños en el molde original de ADN y aquellas que se dan
como consecuencia de las tasas de error inherentes a la PCR. Esto permitirá afinar la
fiabilidad de las secuencias, al poder corregir algunos errores de éstas.
Algunas incorporaciones específicas, como las debidas a la desaminización de los
residuos de citosina en residuos de deoxiuridina o la desaminización unida a una
oxidación que resulta en residuos de 5-hidroxiuridina, pueden ser solventadas tratando el
ADN molde con glicocilasa de uracilo-ADN. (Paabo et al., 2004).
Para valorar el nivel de degradación de una muestra se recomienda utilizar la PCRen tiempo real. Como explica Pruvost (2004) este tipo de PCR permite determinar la
cantidad de moléculas de ADN con las que se inicia la reacción en cadena. Entre mayor
sea la cantidad inicial menor será el riesgo de incorporaciones que den una secuencia
equivocada. Se puede llegar incluso a establecer un mínimo de moléculas como barrera
inferior para considerar válidos los estudios de este tipo. Esta metodología es una de las
más utilizadas actualmente, como lo evidencia la existencia de artículos muy recientes
que, con algunas modificaciones, la siguen empleando para la cuantificación demoléculas de ADN (Vural, 2009).
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Como complemento de lo anterior, en los últimos años se han empezado a utilizar
nuevos tipos de polimerasas ‘premium’, que tienen unos índices de incorporaciones
erróneas inferiores a los de la Taq, así como una mayor sensibilidad. Entre éstas se
encuentran la ‘Platinum Taq Hifidelity’ de Invitrogen (Carlsbad, CA) y la ‘Amplitaq Gold’ de
Applied Biosystems (Foster City, Ca) (Gilbert and Willerslev, 2007).
4.3. La lucha contra la contaminación
Como se explicó en el apartado anterior, la contaminación es uno de los mayores
problemas en los estudios de ADN antiguo, siendo quizás el tema sobre el que más se ha
escrito. A continuación se hará una pequeña revisión de algunas de las propuestas que se
han planteado para intentar llevar al mínimo los niveles de contaminación (Malmstrom etal., 2007).
Para evitar la contaminación en el proceso de excavación y de análisis
antropológico de los huesos, se recomienda la utilización de guantes así como, en la
medida de lo posible, tener un control de las personas que han tenido acceso a los restos
y sus perfiles genéticos para poder contrastarlos con las secuencias obtenidas de los
restos antiguos y descartarlos como fuentes de éstas. También se aconseja no lavar loshuesos por las diversas razones que se han ido mencionando (Geigl, 2008).
Los métodos seguidos una vez en el laboratorio de biología molecular deben ser
igualmente cuidadosos. Geigl (2008) plantea que la QPCR (PCR cuantitativa) ha
demostrado ser uno de los mejores métodos para la cuantificación tanto de la
contaminación en los reactivos como de la cantidad de ADN encontrada en un fósil. En
primer lugar se hace una QPCR con varias tandas de reactivos; una vez obtenida lamedia de ADN en los mismos, ésta se utiliza como baremo. Lo anterior implica que, sólo
se considera fiable un resultado cuando la frecuencia de amplificaciones positivas del total
de PCRs realizadas está muy por encima de los niveles de los reactivos solos. Este tipo
de estudios se hacen sobre todo en las investigaciones sobre animales de las familias de
las vacas y los cerdos, porque algunos de los reactivos, como la BSA, tienen un origen
bovino o porcino.
En cuanto a la contaminación por arrastre o “carry-over”, las medidas mínimas
recomendadas son la separación física, tanto de los espacios donde se realiza la
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extracción, como del laboratorio de pre-PCR y el de post-PCR. A esto se deberían unir
infraestructuras de presión positiva y de irradiación ultra violeta como medidas que
pueden ayudar a disminuir los riesgos de contaminación. Otra cuestión es que la
circulación de personal a lo largo de las jornadas debe ser en un sólo sentido, desde los
lugares de extracción hacia los de pre-PCR y por último a los de post-PCR, evitando almáximo la circulación inversa. (Geigl, 2008).
4.4. Cómo contrarrestar los inhibidores
Para otra de las grandes dificultades que se dan en los estudios de ADN antiguo,
los inhibidores, se han buscado múltiples soluciones. Esto se debe en parte a que la
manera como actúan los inhibidores y su naturaleza no son aún plenamentecomprendidas por los científicos.
En Kemp (2006) podemos encontrar, dentro de su propuesta de la extracción con
columnas de sílica, un repaso por los principales métodos para intentar combatir los
inhibidores, que se podrían dividir en dos grupos. En primer lugar aquellos que
contrarrestan los efectos de los inhibidores mediante la manipulación del ADN molde, los
reactivos de la PCR o las condiciones de los ciclos en la PCR. El segundo grupo estaríacompuesto por aquellos métodos que eliminan los inhibidores durante la extracción del
ADN antes de la amplificación por PCR.
Dentro del primer grupo de técnicas estaría el diluir los extractos de ADN con agua
libre de éste, siendo una de las más utilizadas. En este caso los inhibidores estarían
disueltos lo suficiente como para permitir la amplificación. La explicación sobre el por qué
de la efectividad de esta técnica no está aún del todo clara, teniendo en cuenta que larelación entre la cantidad de inhibidores y de ADN se mantiene constante. Sin embargo,
es posible que exista un umbral para los inhibidores en donde la concentración de estos
sea la clave, independientemente de la cantidad de ADN. La contrapartida de esta técnica
es que puede influir en la efectividad de la amplificación en casos donde ya de por sí el
ADN está degradado y en bajas concentraciones. Una de las soluciones planteadas para
este problema es lo que se ha denominado ‘Booster PCR’. Este protocolo consiste en tres
rondas de doce ciclos de amplificación a una baja temperatura de anillamiento, en la queen cada uno se utiliza como molde el ADN proveniente de la ronda anterior, siendo el
resultante de estas tres rondas, el ADN molde para la PCR definitiva. Lo que se consigue
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con esto es diluir los inhibidores mientras se mantiene una alta concentración del ADN
molde.
En los casos en que la inhibición se da por una inactivación de la polimerasa,
aumentar el número de unidades de la Taq en las reacciones de PCR puede contrarrestar dicho efecto. A pesar de ello, en estudios realizados con muestras degradadas, que
suelen tener un menor número de moléculas para amplificar, el aumento en la cantidad de
Taq puede ser contraproducente ya que, al incrementar la sensibilidad de ésta también
aumenta el riesgo de contaminación. La utilización de la BSA (Bovine serum albumin), que
bloquea algunos inhibidores de PCR, estaría promoviendo indirectamente la actividad de
la polimerasa.
Dentro de la segunda categoría de técnicas, las que eliminan los inhibidores
durante la extracción, se encuentra el uso de CTBA (cetyltrimethylammonium bromide)
para incrementar el ADN obtenido de huesos quemados. Éste también se puede utilizar
acompañado con PVP (polyvinyl pyrrolidone) ya que ambos se unen a los polifenoles y a
los polisacáridos, que son inhibidores, aislándolos del ADN.
Para eliminar ácidos húmicos, así como polisacáridos, se han desarrolladoprocedimientos para unir el ADN a bloques de agarosa, para luego lavarlos con una
solución de lisis seguida de un tampón de TE. Esta técnica se aprovecha de la diferencia
de tamaños entre las macromoléculas de ADN y el menor tamaño de las moléculas de los
distintos inhibidores, que se deslizan fuera de la agarosa. Otra de las ventajas de esta
técnica es que el ADN que se une a la agarosa, que se derrite a bajas temperaturas,
puede ser utilizado directamente como molde de la PCR.
También se ha demostrado que las muestras precipitadas con isopropanol durante
la extracción presentan unos niveles inferiores de inhibidores que aquellas muestras
precipitadas con etanol o las concentradas con las columnas Centricon 30. Además la
precipitación con isopropanol parece contribuir a la remoción de la coloración marrón de
los extractos de ADN, así como a una reducción en la intensidad de la fluorescencia azul
presente durante la electroforesis, siendo éstas dos muestras indirectas de la eliminación
de al menos una fracción de los inhibidores.
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Partiendo de la hipótesis de que los inhibidores más problemáticos se unen a la
doble hebra de ADN, autores como Kemp (2006) han propuesto un procedimiento para
liberar los inhibidores en solución mediante la desnaturalización del ADN con 0.4mM
NaOH. Cuando la solución se pasa por columnas como las Microcon-100, la membranaretiene el ADN mientras que los inhibidores de menor tamaño pasan a través de ésta.
Luego el ADN vuelve a ser naturalizado para ser utilizado como molde de la PCR. Algunos
críticos de este proceso consideran que no es el más adecuado para extractos con poca
cantidad de ADN.
Otro método es el uso de una gran variedad de columnas de geles y cuentas para
remover los inhibidores. Algunos de estos forman parte de kits comerciales como lascolumnas Sephadex G-50 o G-200, o las Bio-gel P-6 y P-30, entre muchas otras. La
efectividad de éstas en la eliminación de los inhibidores es bastante variable. Dentro de
este grupo estarían también las columnas de silica (Qiaquick) que han demostrado ser
más efectivas que la extracción tradicional con fenol-cloroformo para eliminar los
inhibidores (Kemp et al., 2006).
Las técnicas presentadas hasta ahora varían en su efectividad, dependiendo decuáles sean los inhibidores de cada muestra. Como su determinación no siempre es fácil,
se pueden cometer errores a la hora de escoger qué métodos aplicar a cada muestra,
haciendo que las amplificaciones no resulten por causa de inhibidores que no se han
tenido en consideración. Partiendo de este problema Kemp et al. (2006) proponen la
aplicación de una técnica, la ‘repeat silica extraction’, que al ser menos específica ayuda a
eliminar un mayor número de inhibidores. Ellos demuestran que es una técnica lo
suficientemente amplia como para funcionar con muestras de hueso y coprolitos de lasque se sabe que contienen una gran cantidad de inhibidores y de las que no habría sido
posible obtener resultados positivos con otras técnicas, como la dilución o la incorporación
de BSA. Este proceso se basa en el principio de que en unas determinadas condiciones
de temperatura y pH, el ADN se une a la sílica permitiendo lavar el resto de productos que
haya en el extracto, incluidos los inhibidores. Una vez lavados, se cambian las
condiciones para que la sílica libere el ADN, que se encontrará purificado y podrá ser
utilizado como molde de la PCR. En casos donde fuese necesario este proceso se puederealizar dos veces sobre la misma muestra para así aumentar su efectividad.
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Otros autores (Audic and BeraudColomb, 1997, O'Rourke et al., 2000, Handt et al.,
1994, Kim et al., 2008) también mencionan las ventajas de la extracción con sílica en lo
que respecta a los inhibidores. Algunos como O’Rourke (2000) apuntan que, en
comparación con varias combinaciones de extracciones con fenol-cloroformo, aquellasrealizadas con kits de gel de sílica (Qiagen Qiaquick preps) son mucho más eficientes. En
estos casos las columnas actúan como concentradores, removiendo la pigmentación que
suele quedar después de la extracción con fenol-cloroformo. Sin embargo, también tienen
inconvenientes porque la cantidad de solución que puede ser cargada cada vez en las
columnas es limitada; esto implica una mayor manipulación de las muestras lo que
aumenta las posibilidades de contaminación o de pérdida de la muestra. A pesar de esto,
los índices de amplificación siguen siendo bastante altos en estos protocolos, debido a lamenor presencia de inhibidores.
Aunque no funciona exactamente como un inhibidor, los productos de Maillard
también afectan los resultados de la PCR como se ha explicado anteriormente. En los
últimos años se ha visto que el añadir Bromuro de N-phenacylthiazolium (PTB) puede
contrarrestar los efectos de estos productos, que se encuentran sobre todo en los
coprolitos. Fue utilizado por primera vez en la extracción de ADN de coprolitos delPleistoceno tardío (Poinar et al., 1998). Al parecer el PTB mejora el rendimiento de las
amplificaciones mediante su unión a las proteínas derivadas del azúcar que pueden
atrapar al ADN. Independientemente de su efectividad, parece ser que el PTB no causa
ningún daño a la extracción de ADN y se puede incorporar de manera sencilla a los
protocolos de extracción (Mulligan, 2005), añadiendose en el mismo momento en que se
incorpora la proteinasa K, por lo que su utilización no suele estar de más. En un principio
se añadieron concentraciones de 1mM, aunque se han llegado a añadir concentracionesde incluso 200mM en la extracción de ADN de dientes (Gilbert et al., 2003). El
descubrimiento de este producto químico no tuvo relación con los estudios de ADN
antiguo, sino con un estudio en pacientes diabéticos con diversos problemas debido a un
exceso de azúcares reductoras (glucosa) en la sangre. Estos azúcares producen “cross-
links” que pueden derivar en cataratas y en un endurecimiento de las arterias. Fue en la
búsqueda de una solución para este problema cuando se descubrió que el PTB podía
restaurar el colágeno afectado por los ‘cross-links’ a su estado natural, viéndose así suutilidad para tratar el ADN antiguo.(Poinar, 2002)
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5. Métodos de extracción, amplificación y secuenciación
5.1. Métodos de extracción
Una vez conocidas algunas de las técnicas más exitosas para combatir los
problemas del el ADN antiguo, resulta necesario un breve repaso por los principales
métodos de extracción del ADN . El propósito de esta explicación es clarificar cómo la
mayoría de los elementos mencionados se van incorporando en unos protocolos cada vez
más estandarizados que permiten una optimización de este tipo de estudios. Además,
conocer los protocolos de extracción básicos resulta fundamental para entender las
propuestas metodológicas de apartados posteriores. Por último, su conocimiento permiteentender el estado actual de las investigaciones de ADN antiguo, en lo que respecta a
estandarizaciones metodológicas.
El protocolo propuesto por Maca-Meyer (2002), explicado a continuación, incluye
los pasos que se encuentran en la gran mayoría de publicaciones, aunque pueden existir
pequeñas variaciones. En este caso se habla de la extracción en piezas dentarias, por ser
de las más usuales en este tipo de estudios, pero las características generales delproceso son las mismas que en otro tipo de tejidos. Este protocolo se basa en el uso de la
sílica propuesto por Höss y Pääbo (1993). Se eligió porque al tener un número reducido
de pasos resulta mejor a la hora de combatir la contaminación.
1. Limpieza de las muestras: Antes de proceder a la extracción de ADN se debe realizar
una limpieza de las piezas dentarias para descontaminar la superficie de éstas. Este es
un proceso muy importante para intentar eliminar el ADN exógeno proveniente de laspersonas que han manipulado las muestras. Para ello se lavan con una solución de alto
poder depurinizante (15% ácido clorhídrico), la cual inactiva el ADN superficial
(Izaguirre, 1998). A continuación se enjuaga repetidas veces la superficie del diente con
agua estéril y se deja secar bajo la luz UV durante cinco minutos por cada cara (Sarkar
and Sommer, 1990). Una vez secos los dientes se colocan entre dos placas metálicas y
se pulverizan golpeando con un martillo. Estos restos se introducen en un tubo de 15
ml de polipropileno (Costar), porque se vio que el uso de los de poliestireno daba comoresultado amplificaciones fallidas.
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2. Al diente pulverizado se le añade aproximadamente 1 ml de una solución comercial de
tiocianato de guanidina (DNAzol® (MRC, Cincinnati, OH) (Chomczynski et al., 1997) y
se deja a temperatura ambiente entre 3 y 4 días agitando esporádicamente. Pasado
este tiempo, se purifica el ADN mediante el uso de unas columnas comerciales de sílica
(QIAquick, Qiagen), según el siguiente protocolo:a. Los tubos con las extracciones se centrifugan durante 5 minutos a 4.000 r.p.m. y se
recogen alícuotas de 300 µl de la fase acuosa que se introducen en un eppendorf
de rosca de 1,5 ml.
b. A cada eppendorf se le añade 1 ml de tampón de unión (suministrado por Qiagen) y
45 µl de acetato sódico 3M pH 5,2.
c. Se pasa el extracto por las columnas centrifugando durante 1 minuto a 4.000 r.p.m.
d. Se añade a cada columna 500 µl de solución de lavado (suministrado por Qiagen) yse centrifuga 1 minuto a 4.000 r.p.m.
e. Se añade a cada columna 750 µl de acetona (Merck) y se centrifuga durante 1
minuto a 4.000 r.p.m.
f. Se añaden nuevamente 400 µl de solución de lavado y se centrifuga durante 1
minuto a 4.000 r.p.m.
g. A cada muestra se le añade 30 µl de agua estéril y 30 µl de TE (Tris-EDTA pH 8) y
se dejan durante 15 minutos en un baño a 50ºC.h. Se centrifugan las muestras durante 2 minutos a 13.000 r.p.m., se pasan los
extractos de ADN a tubos eppendorf de rosca de 0,5 ml y se guardan a -20ºC
Como complemento, Mulligan (2005) nos plantea algunas de las diversas
modificaciones que se pueden efectuar al protocolo anteriormente expuesto, así como
algunas precauciones que se deben seguir cuando se utiliza el EDTA para la
descalcificación de tejidos óseos.
i. Si el material del que se obtendrá el ADN se encuentra en buenas condiciones y se
presume la presencia de ADN endógeno, cantidades menores de hueso o diente
pueden ser utilizadas permitiendo el uso de tubos más pequeños que suelen facilitar el
trabajo.
ii. Es posible que distintas cantidades de ADN y de inhibidores sean extraídas durante la
descalcificación con EDTA. Por ello se recomienda que durante el proceso dedescalcificación el EDTA sea cambiado después de unos pocos días, reemplazándose
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por EDTA fresco, para luego procesar por separado los dos extractos de EDTA como si
fueran muestras distintas.
iii. El uso del PTB en las investigaciones recientes parece ayudar a eliminar los productos
del Maillard, como ya se explicó en apartados anteriores.
iv. La Silica-GuSCN también suele ser utilizada con frecuencia en los primeros pasos dela extracción de ADN, combinada con niveles bajos de EDTA (en lugar de confiar
únicamente en las altas concentraciones de EDTA). Muchos de los kits de purificación
de ADN se basan en un protocolo de Silica-GuSCN, como por ejemplo el “Wizard Plus
Megaprep DNA Purification System” (Promega, Madison, WI). En este tipo de
protocolos , el GuSCN ayuda a unir el ADN a la silica para que las impurezas que no se
han unido puedan ser lavadas. Sin embargo, los métodos basados en la Silica deben
ser usados con precaución porque en algunos casos el ADN antiguo puede estar unidoa proteínas causando que éste no interactue de la manera de debiera con las resinas a
las que debería unirse, trayendo como consecuencia la pérdida de ADN.
v. La completa descalcificación de los huesos bien preservados puede requerir varias
semanas si la extracción se realiza a 4ºC, aunque normalmente ésta es llevada a cabo
en 3 o 4 días cuando se realiza a temperatura ambiente. El nivel de descalcificación
puede ser monitorizado tocando el material que se encuentra dentro del EDTA,
evidentemente utilizando guantes, comprobando la existencia de fragmentos sin acabar de descalcificar.
5.2. Métodos para aumentar el éxito de la PCR
El segundo proceso en el análisis del ADN antiguo es la PCR (Polymerase Chain
Reaction), o amplificación, en el que se realizan copias del ADN molde con el fin de poder
analizarlas correctamente, como ya se ha explicado.
Durante este procedimiento también se han investigado ciertas técnicas que
ayudan a combatir algunos de los problemas presentados por el ADN antiguo. Mulligan
(2005), nos explica las técnicas que han demostrado ser más productivas. Muchas de
ellas también son mencionadas por otros autores como Chelomina (2006):
a. Mayor cantidad de Taq polimerasa y mayor número de ciclos de amplificación: Unamayor cantidad de Taq polimerasa y un mayor número de ciclos de amplificación
suelen ser usados en los casos donde se trabaja con ADN antiguo. Las cantidades
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típicas son de entre 1 y dos unidades de polimerasa y entre 40 y 50 ciclos. La
reamplificación de una alícuota de un producto de PCR o de una banda purificada de
ADN no es recomendable porque aumenta las posibilidades de introducir
contaminación.
b. PCR de “Hot-start”: Consiste en retener un componente esencia de la PCR hasta que lareacción haya alcanzado una temperatura que inhiba la unión de primers de manera
inespecífica o la oligomerización de los primers. Se utiliza para optimizar el campo de
los productos de PCR deseados y evitar amplificaciones inespecíficas. La PCR de “Hot-
start” puede conseguirse, bien usando complejos de anticuerpos de la polimerasa en el
que las enzimas se encuentran inactivas hasta que alcanzan los 95ºC por 5-10 minutos
(por ejemplo Amplitaq Gold; Applied Biosystems, Foster City, CA) o utilizando cuentas
de cera en las que el Mg²⁺ sólo es liberado luego de un calentamiento prolongado (por ejemplo Hot Wax Beads; Invitrogen, Carlsbad,CA).
c. Espermidina: Los bajos niveles de espermidina pueden facilitar la amplificación de
algunas muestras de ADN. Sin embargo, el exceso de espermidina puede inhibir la
amplificación por lo que primero se debe intentar la amplificación sin espermidina. En
algunos estudios se ha determinado que la concentración de espermidina debe estar
entre 400 y 800 µM.
d. El Bovine serum albumin (BSA), el glicerol, el dimetilsulfoxido (DMSO) y la formamida:El BSA y el glicerol son usados para estabilizar la interacción entre las proteínas y el
ADN, mientras que reactivos como el DMSO y la formamida, facilitan la separación de
las hebras de ADN al dificultar el emparejamiento de bases. A pesar de ello, el
mecanismo de estas interacciones no está bien estudiado y la determinación del aditivo
más conveniente debe ser seleccionado por medio de ensayo y error. Las
concentraciones típicas de estos aditivos son: 10-100µg/ml BSA, 10% glicerol, 5-10%
DMSO y 2,5-10% de formamida. La BSA y el DMSO son los aditivos más utilizados,sobre todo porque suelen ser los que dan más resultados positivos en la amplificación.
e. PCR anidada: Es la amplificación de un único producto de PCR a través del uso de dos
pares de primers en una amplificación en secuencia en la que el blanco de la segunda
PCR está contenido dentro del producto de la primera PCR. Esta estrategia permite
que productos de PCR débiles (o invisibles) puedan ser reamplificados aunque
aumenta la especificidad de la reacción al usar dos pares de primers.
f. Betaína: Se ha sugerido que la betaína ayuda a estabilizar las proteínas contra ladesnaturalización térmica facilitando la separación de las hebras de ADN mediante la
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isoestabilización de las mismas. La betaína en concentraciones de entre 0,5 y 2,2 M,
tanto en la presencia como en la ausencia del DMSO, ha demostrado que aumenta la
amplificación del ADN y mejora la consistencia de la amplificación. También se ha
demostrado que la betaína inhibe algunas de las ADN polimerasas, por lo que su
incorporación puede hacer necesaria la modificación de los protocolos de PCR.g. PTB: Como ya se ha mencionado, parece que la incorporación del PTB puede ayudar a
contrarrestar los productos de Maillard.
h. Mayor cantidad de Mg²⁺: Si existe un residuo de EDTA en el extracto de ADN
proveniente de la descalcificación, ésta puede reducir la concentración de Mg²⁺ en la
PCR por debajo de los niveles óptimos.
i. “Touchdown” PCR: Consiste en reducir la temperatura de anillamiento entre 5 y 10ºC
durante los primeros diez ciclos de la PCR. Es un método utilizado cuando no se sabecon certeza la temperatura de anillamiento de los primers con el ADN. Aunque esta
incertidumbre no debería existir en los casos de ADN antiguo, puede que este método
facilite la amplificación de un extracto de ADN complejo caracterizado por moléculas
fragmentadas y la posible presencia de químicos desconocidos, como los inhibidores.
5.3. Métodos de secuenciación de segunda generación
En los últimos años, se han desarrollado nuevos métodos de secuenciación, que
poco a poco se irán imponiendo. Estos son los llamados métodos de segunda generación,
y ya empiezan a utilizarse en los estudios de ADN antiguo (Mardis, 2008). Este tipo de
métodos harán cada vez más viable la secuenciación de genomas completos (WGS),
ampliando así, de manera radical, el tipo de resultados que se pueden obtener de las
muestras antiguas. Este tipo de tecnología se basa en la construcción de librerías de
secuencias que luego se utilizan para leer una secuencia desconocida. En el campoespecífico del ADN antiguo este tipo de tecnología ha permitido obtener muestras
directamente de los genomas nucleares de osos de las cavernas, de mamuts o de
Neanderthales. Aunque no se entrará en detalle sobre este tipo de técnicas, es necesario
mencionarlas, ya que seguramente serán de uso común en un futuro no muy lejano.
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5.4. Criterios de autentificación
Una vez comprendidas las principales particularidades de los estudios de ADN
antiguo resulta evidente la necesidad de establecer unos criterios de autentificación de losresultados. A continuación se explicaran los propuestos por Pääbo (2004), ya que suelen
ser utilizados como referente. Sin embargo, es necesario mencionar que otros autores,
como Cooper y Poinar (2000), también han propuestos una lista de criterios que, aunque
con algunas pequeñas diferencias, Pääbo ha complementado siguiendo la misma línea.
La existencia de estos criterios, por otra parte, no significa que sean respetados en todas
las investigaciones. Roberts (2008) nos da algunos ejemplos de ello en su repaso sobre
los artículos que hacen referencia a los estudios de ADN antiguo en el campo de lapaleopatología, mostrando que en una gran cantidad de casos estos criterios no son
respetados ni presentados en los resultados de las investigaciones.
Lista de criterios
1. Los productos amplificados deben ser clonados rutinariamente y múltiples clones deben
ser secuenciados. Esto permite que cualquier heterogeneidad en el producto
amplificado pueda ser detectada sin ambigüedades. También permite estimar elespectro de errores.
2. Controles negativos de extracción deben realizarse a la vez que las extracciones de
materiales antiguos. De manera similar, siempre deben realizarse controles negativos
de PCR cuando se amplifica ADN antiguo. De hecho, teniendo en cuenta que la
contaminación de los reactivos de laboratorio puede encontrarse en cantidades tan
pequeñas que sólo se detecte esporádicamente en los controles negativos, se deben
realizar varias amplificaciones sin ningún ADN molde por cada experimento. Se hademostrado útil la utilización de tres controles.
3. Repetir las amplificaciones de una misma extracción o de diferentes extracciones de un
mismo espécimen es necesario por al menos tres razones. La primera, porque es útil
para detectar la contaminación de una extracción o amplificación en particular. La
segunda razón es porque se podrían obtener resultados en los casos donde hay muy
pocas moléculas en la muestra y donde sólo de manera esporádica se encuentren
moléculas de ADN molde en los distintos extractos o en las alicuotas de estos. Tresextractos puede ser un número razonable de intentos de extracción antes de descartar
un espécimen de interés como carente de ADN útil. La tercera razón es que las
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repeticiones posibilitan la detección de las incorporaciones erróneas de nucleótidos que
conllevan cambios consistentes.
4. La cuantificación del número de moléculas de ADN amplificables presentes en un
extracto permite determinar si la cantidad de moléculas con las que se inicia la PCR es
muy poca, lo que aumenta la posibilidad de que ocurran cambios consistentes. Se deberesaltar que la cuantificación basada en la PCR debe hacerse de manera independiente
para cada pareja de primers utilizados, porque diferentes primers pueden tener una
eficiencia variable al inicio de la amplificación. Si hay un gran número de moléculas
presentes (más de 1000 puede servir como baremo), y sólo se espera un tipo de
secuencia de ADN, no hace falta realizar más de dos amplificaciones ya que es muy
poco probable que ocurran cambios consistentes. Si el número de moléculas presentes
es inferior, es necesario realizar varias amplificaciones. La manera más económica deproceder en estos casos es realizar primero dos amplificaciones y secuenciar varios
clones de cada una. Si se observa una diferencia consistente entre los dos grupos de
secuencias se debe plantear la realización de más amplificaciones. En el caso de que
se estudie el ADN mitocondrial, o secuencias de las que el individuo sólo debería tener
un tipo de ADN, una tercera amplificación suele ser suficiente para determinar cual de
las dos variantes presentes es reproducible. Si se está estudiando una secuencia
autosómica para la que pueden existir dos alelos, cuando se empiece con un númeroelevado de moléculas, las dos amplificaciones deben presentar aproximadamente un
número igual de los dos alelos. En el caso de que se empiece con pocas moléculas, se
hacen necesarias múltiples amplificaciones sucesivas para distinguir los individuos
homocigotos de los heterocigotos. Sin embargo, si el genotipo de los individuos no es
de interés, dos o tres amplificaciones serán suficientes.
5. Debe darse una correlación inversa entre la eficiencia de la amplificación y la longitud
del fragmento amplificado. Este criterio es un indicador muy simple de la extensión dela degradación y de las lesiones bloqueantes presentes en el molde de ADN antiguo.
Existe una gran variedad en la longitud de las amplificaciones que pueden conseguirse
de distintos especímenes; aunque la mayoría de restos antiguos no permiten
amplificaciones de más de 100 o 200 pares de bases de ADN mitocondrial, algunos
pocos restos de pájaros no voladores de Nueva Zelanda con unos cuantos miles de
años de antigüedad permitieron recuperar fragmentos de unas 500 pb en una sola
amplificación y se han reportado fragmentos de hasta 1,6 kb en restos provenientes delpermafrost. En general se puede afirmar que si los fragmentos más cortos no se
amplifican mejor que los fragmentos largos, en comparación con secuencias de ADN
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moderno, podemos estar frente a una fuente de ADN contaminante. Si las secuencias
más largas se determinan mediante el solapamiento de segmentos más pequeños, las
posiciones variables en los lugares de los primers o de las zonas que se solapan deben
confirmar que las dos secuencias están unidas.
6. Las pruebas bioquímicas de preservación macromolecular sirven para dos propósitos.En primer lugar apoyan la afirmación de que un espécimen está lo bastante bien
conservado como para que en él se encuentren moléculas de ADN. En segunda
instancia pueden ser usados como un método rápido de rastreo para identificar
especímenes que, basándose en su estado general de conservación, puedan contener
ADN como ya se ha expuesto con anterioridad. Para esto se han sugerido varias
técnicas; siendo la más utilizada el análisis de los amino ácidos presentes en los
especímenes, y la medición de la preservación de los mismos. Estos métodos hanevolucionado bastante en los últimos tiempos, aunque parece ser que la combinación
de la cantidad total de amino ácidos, su composición y su grado de racemización son
una aproximación útil para valorar la preservación del ADN en huesos y dientes. A
pesar de que la cinética de la racemización depende de la posición de los ácidos
aspárticos en la cadena de proteína, los especímenes que contienen muy pocos
aminoácidos poseen una composición de éstos que indica que sus macromoléculas
han sido reemplazadas por microorganismos o se han racemizado extensamente,haciendo poco factible que contengan ADN endógeno. Otros métodos alternativos para
este tipo de valoraciones incluyen la estimación de la relación entre fragmentos
péptidos y aminoácidos sencillos, por medio del espectómetro de masas o la histología
directa del hueso; la determinación de los daños del ADN con cromatografía de gases y
espectrometría de masas; la medición de la porosidad y densidad del hueso y el
microscopio de transmisión de electrones. De momento no se han realizado estudios a
gran escala sobre la correlación directa de cada una de estas técnicas con lapreservación de ADN antiguo, a pesar de la gran aportación que representarían.
7. Algunas secuencias de ADN derivados de organelos como las mitocondrias, se
encuentran frecuentemente en el genoma nuclear. Como el ADN mitocondrial es el de
mayor interés en la mayoría de los proyectos de ADN antiguo, estas integraciones
nucleares pueden, en ocasiones, ser amplificadas en la PCR y ser confundidas con las
secuencias del ADN de los organelos. Es más probable que esto suceda cuando los
primers usados difieren de la secuencia de los organelos de ADN de un espécimenindividual pero no de la versión de esta misma secuencia que existe como una
inserción nuclear. El resultado de ello serían conclusiones erróneas con respecto a
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variaciones intraespecíficas así como a la filogenia de las especies. Para evitar este
problema se pueden usar diferentes grupos de primers solapados y variables para
amplificar la misma secuencia, porque es muy poco probable que dos grupos de
primers distintos amplifiquen preferentemente la misma inserción nuclear. En cualquier
caso, en especies en las que exista un gran número de copias nucleares del ADNmitocondrial, se pueden obtener varias secuencias de todos los pares de primers, por lo
que la determinación de las secuencias de ADN mitocondrial resulta imposible.
8. Los resultados cruciales deben ser reproducidos en un segundo laboratorio. Este
criterio se ha sugerido al asimilarse la seriedad de la amenaza de la contaminación
para la autenticidad de los resultados. Éste cumple la misma función que los controles
negativos en la extracción y en la PCR en el laboratorio. Sería una precaución adicional
para excluir la existencia, poco probable, de un contaminante que no apareciera en loscontroles negativos. Se debería realizar sobre todo cuando se produzca un resultado
novedoso e inesperado con grandes consecuencias. En estos caso, las muestras
deben enviarse directamente, y de manera independiente, desde el museo o la
excavación a los dos laboratorios para que los potenciales contaminantes no puedan
ser transferidos entre los laboratorios.
9. Como criterio complementario se puede obtener el ADN externo, en el caso de
muestras dentales, para poder compararlo con el ADN endógeno (Fregel et al., 2009b).
Como explica Fregel (2010), se ha destacado que, además de seguir los criterios
de autentificación, hay que realizar un control a posteriori de los resultados (Bandelt,
2005). Para el estudio de secuencias de ADN, existen tres indicadores que pueden
cuestionar la autenticidad de los datos obtenidos:
1. Principio de expectación filogenética: si los resultados reflejan los marcadorespresentes en el equipo de excavación o en el personal de laboratorio, y no lo que se
podía esperar a partir del origen geográfico de las muestras antiguas, es muy probable
éstos estén afectados por contaminación. Por ello es necesario disponer de un panel
de secuencias de cada uno de los investigadores que han manipulado las muestras,
desde el momento de la excavación hasta su análisis molecular.
2. Estructura en mosaico: esto ocurre cuando la secuencia obtenida se compone de
varios fragmentos solapantes, que por separado tienen diferentes sentidosfilogenéticos, y en conjunto, no pertenecen a ningún haplotipo conocido. Esta estructura
en mosaico puede ser debida a contaminación o a la mezcla de muestras.
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3. Espectro anormal de mutación: cuando existe una aglomeración de mutaciones poco
comunes a lo largo de una molécula antigua, dicho resultado debe descartarse, ya que
posiblemente las modificaciones postmortem hayan transformado el material genético
inicial, de forma que ya es imposible conocer su haplotipo real.
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6. Algunas áreas de aplicación del ADN antiguo
Una vez comprendidas las limitaciones y las posibilidades de los estudios de ADN
antiguo, se plantean algunas de las áreas de investigación posibles con este tipo deestudios. Para ello se recurrirá una vez más a Pääbo (2004) que hace un somero
recorrido por las principales áreas de aplicación y las posibilidades de cada una. Antes
resulta necesario mencionar algunas de las disciplinas involucradas en este tipo de
investigaciones (Cipollaro et al., 2005); entre ellas está la arqueología, la geología, la
vulcanología, la antropología, la paleopatología, la histología, la química, la biología
molecular, la genética, la microbiología, la botánica, la zoología y la bioinformática .
Ya dentro de las áreas de aplicación, la primera sería la filogenia de las especies
(Debruyne and Barriel, 2006). Las secuencias de ADN antiguo permiten relacionar
especies que se ha extinguido con especies vivas a través de la filogenia molecular.
Algunos ejemplos de las más de 50 especies extintas estudiadas serían las
investigaciones realizadas sobre los lobos marsupiales australianos (Krajewski et al.,
1997, Krajewski et al., 1992, Thomas et al., 1989), los moas de Nueva Zelanda (Cooper et
al., 2001, Cooper et al., 1992, Haddrath and Baker, 2001) o los gansos endémicoshawaianos (Paxinos et al., 2002). Este trabajo se ha desarrollado sobre todo dentro de los
museos de historia natural, ya que cuentan con grandes colecciones con las que realizar
diversos análisis moleculares. En estos casos es más común recurrir al estudio de
secuencias de ADN mitocondrial o de cloroplastos ya que al haber más copias de estos
por célula existe una mayor probabilidad de que se conserven. Esto implica algunas
limitaciones porque al tener unas tasas de mutación menores, es más difícil resolver la
filogenia de algunas especies que, o bien se han separado recientemente, o de forma tanrápida que las diferentes partes del genoma tienen una filogenia diferente (Paabo et al.,
2004). En algunos casos como el de los moas, esto se ha superado al haber sido posible
la amplificación de algunas secuencias de ADN nuclear.
Una segunda área seria la de la historia de las poblaciones y la filogeografía, que
estudiarían los cambios de las poblaciones a través del tiempo. Esto se puede hacer
gracias a la conservación de muchos individuos de una misma localidad, bien sea en losmuseos, que en este campo cobran gran importancia (Wandeler et al., 2007), o como
consecuencia de excavaciones arqueológicas. Un ejemplo de esto serían los estudios
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realizados en tres poblaciones de ratas canguro en California, en donde se compararon
los especímenes de los museos con las poblaciones actuales. Se puede demostrar que
las poblaciones han tenido una continuidad a lo largo del tiempo, o por el contrario han
sido remplazadas por otras como consecuencia muchas veces de procesos antrópicos
(Ramakrishnan and Hadly, 2009, Garrigan and Hammer, 2006).
Un área de gran importancia para la comprensión de nuestra historia más remota
sería el estudio de los homínidos. De momento el impacto de los estudios de ADN antiguo
ha sido bastante limitado, por los límites temporales de la conservación, además de los
grandes problemas de contaminación con ADN humano moderno. Sin embargo, se han
podido vislumbrar algunas pistas sobre la relación entre los humanos anatómicamente
modernos y los neanderthales, que habitaron Europa desde hace unos 300,000 añoshasta hace poco menos de 30.000 años, aunque teniendo que hacer frente a una
compleja problemática (Green et al., 2009, Millar et al., 2008, Goldstein and Chikhi, 2002).
Se han generado intensos debates sobre la posibilidad de una contribución genética de
estas poblaciones a las poblaciones actuales; los primeros resultados que se han
obtenido parecen demostrar que ésta contribución no tuvo lugar. Sin embargo,
publicaciones recientes parecen haber encontrado evidencias de lo contrario (Dalton,
2010), por lo que el debate sigue abierto. Dentro de este campo también han cobradoimportancia los análisis que intentan responder cuestiones sobre el origen de los
humanos modernos (Harpending and Rogers, 2000). Se puede hablar principalmente de
dos corrientes, aquellas que defienden un origen en África con una posterior expansión
por los demás continentes (teoría del OOA), y la segunda que defiende un origen
multiregional de los humanos anatómicamente modernos. En este caso también el debate
sigue abierto, aunque la primera teoría ha cobrado fuerza a la vez que ha ido matizando
algunos de sus planteamientos iniciales.
Otro de los posibles campos de investigación hace referencia al estudio de
coprolitos. El análisis de ADN de este tipo de muestras puede proporcionar información no
sólo sobre el individuo que ha dejado la muestra sino también sobre los alimentos,
animales o vegetales, que haya ingerido. Este tipo de estudios también se realizan en
animales salvajes en peligro, o de los que es difícil obtener una muestra de tejido.
Un paso más en la arqueología de la genética molecular fue la demostración de
que los sedimentos del permafrost, así como algunos contenidos en cuevas, conservan
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en ocasiones restos de ADN amplificable. Además, el ADN en este tipo de condiciones se
conserva durante periodos de tiempo más largos, habiéndose llegado a obtener
resultados con muestras de casi medio millón de años. Esto abre la posibilidad de
detectar la presencia de organismos incluso cuando no haya restos macroscópicamente
identificables. Sin embargo, esto plantea un inesperado nivel de complejidad a los análisistanto de los coprolitos como de los sedimentos, básicamente porque es imposible saber
hasta que punto se han desplazado hacia arriba o hacia abajo las partículas y las
moléculas, lo que dificulta la adscripción cronológica certera de las muestras. Otra de las
limitaciones sería la imposibilidad de obtener secuencias más largas por medio del
solapamiento de fragmentos más cortos mediante “Jumping PCR”, porque los segmentos
podrían provenir de diversos individuos, o incluso de especies relacionadas, lo que implica
una limitación en la resolución taxonómica.
Dentro del campo de la arqueología, existen numerosas preguntas y áreas para las
cuales los estudios de ADN antiguo pueden ser de gran ayuda. Kemp (2007) y Larsen
(2002) nos plantean sólo algunos de los múltiples temas en los que se pueden aplicar
este tipo de análisis. Entre ellos encontramos la determinación del sexo molecular como
herramienta para comprender distintos comportamientos humanos en los que el sexo de
los individuos juega un rol fundamental, como por ejemplo los sacrificios humanos en losaztecas (De La Cruz et al., 2008). Otros de estos ejemplos serían los análisis de
movimientos poblacionales así como de migraciones; también se pueden determinar
relaciones biológicas entre individuos de un mismo enterramiento, lo que permitiría una
mejor comprensión de las relaciones familiares. Por otro lado se pueden hacer
reconstrucciones de la dieta o de estratificaciones económicas basándose en el acceso a
determinados recursos.
Centrándose en investigaciones con un caracter más histórico, vale la pena resaltar
los estudios de patógenos como virus y bacterias. Diversos artículos hablan sobre la
recuperación de ADN de la Mycobacterium tuberculosis o de la Yersinia pestis, así como
del virus de influenza de la gran epidemia de 1918 (Larsen, 2002). Es un campo
potencialmente muy interesante porque la evolución de algunos patógenos parece ser lo
suficientemente rápida como para permitir seguir el cambio genético a través de décadas
o de siglos. En contrapartida, existen diversas fuentes potenciales de contaminación; por ejemplo, las bacterias en la tierra pueden tener secuencias similares las de la bacteria de
la tuberculosis, por lo que algunos de los estudios han sido cuestionados. Esto hace
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necesario el desarrollo de estudios rigurosos sobre cuestiones técnicas que den como
resultado unos criterios de fiabilidad (Roberts and Ingham, 2008).
Otro campo de estudio de gran relevancia para la historia es la investigación
centrada en los orígenes de la domesticación. En estos, diferentes loci que no seseleccionaron durante la domesticación, como los del ADN mitocondrial, puede ser
utilizados para examinar si diferentes poblaciones contribuyeron al pool genético de las
especies domésticas o si este proceso se originó en una única región. También se pueden
identificar los genes seleccionados durante la domesticación, ya que estos tendrán una
variación más baja en comparación con la de sus ancestros salvajes. Una vez que estos
genes hayan sido identificados se podría, en principio, determinar el momento en el que
los diferentes rasgos fueron seleccionados mediante el análisis de la variación en lasmuestras antiguas. Ejemplos de este tipo de estudios serían los realizados en especies
animales como los caballos, las vacas o en especies vegetales como el maíz
(Schlumbaum et al., 2008).
Aunque no se trata directamente de un campo del ADN antiguo, es necesario
resaltar la similitud de este tipo de estudios con algunos de los realizados en el campo de
la genética forense. Como resalta Vural (2009) las modificaciones moleculares y ladegradación de las muestras forenses son similares a las experimentadas por las
muestras arqueológicas. Esto significa que la aproximación técnica a su tratamiento
puede ser similar. Las muestras arqueológicas se podrían asimilar a lo que se suele
denominar muestras mínimas en el ámbito forense. Esto abre la posibilidad de aprovechar
la tecnología desarrollada y los laboratorios acondicionados para cuestiones forenses, en
el estudio de ADN antiguo, como ya se hace en diversos centros.
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7. Estudios de ADN sobre la población canaria.
7.1. Fundamentación de los estudios genéticos
Uno de los principales objetivos de los estudios genéticos en seres humanos es el
estudio de la variabilidad, que se da como reflejo de la historia evolutiva de nuestra
especie (Relethford, 1998). Esto implica la determinación del origen y evolución de las
distintas poblaciones mediante el estudio de las variantes genéticas, que suelen
producirse por fallos en el proceso replicativo, o como consecuencia de la recombinación
genética o de la pérdida de segmentos de ADN. La migración, el aislamiento o la
selección, por otro lado, contribuyen a la diferenciación genética de las poblaciones. Elestudio de dicha variabilidad también es un complemento de la investigación histórica,
porque plantea nuevas vías de interpretación, o confirma hipótesis ya planteadas.
En los inicios de las investigaciones sobre variabilidad no era posible el estudio
directo del material genético, por lo que se utilizaban ciertos caracteres morfológicos
como marcadores de variabilidad. Entre estos estarían el color de la piel o del cabello y
marcadores antropométricos como los índices craneales o la constitución corporal. Sinembargo, hay que tener en cuenta que estos marcadores no representan la diversidad
total del genoma, porque sólo tienen que ver con genes o grupos de genes relacionados
con dichos caracteres fenotípicos. A esto se le añaden las dificultades que plantean como
consecuencia de su herencia compleja, de la subjetividad a la hora de clasificar a los
individuos y de que pueden verse influenciados por el ambiente (Fregel, 2010).
En un segundo periodo, los estudios poblacionales se fundamentaron en dos tiposde marcadores. Por un lado se utilizaron técnicas inmunológicas para determinar
diferencias poblacionales en los antígenos eritrocitarios. Posteriormente, se realizaron
análisis de polimorfismos en proteínas, tanto estructurales como enzimáticas. A pesar de
los aportes de este tipo de estudios para la comprensión de la historia evolutiva del
hombre, se demostró una relativa homogeneidad entre poblaciones, lo que implica que al
no haber una variabilidad excesiva, resulta difícil determinar con exactitud la historia
evolutiva de las poblaciones (Jorde et al., 1998). Al igual que ocurre con el estudio demarcadores morfológicos, en este caso también nos centramos en una parte específica
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de la porción traducida del genoma que, por lo tanto, puede verse afectada por la
selección natural.
Finalmente, los avances técnicos permitieron el análisis directo de la variación a
nivel de ADN, empezando por las hibridaciones y terminando con la secuenciacióndirecta, pasando por el uso de enzimas de restricción. La PCR será, como ya se ha
mencionado, la principal responsable de estos avances, al permitir la amplificación de
fragmentos discretos de ADN en cantidades suficientes para un análisis más exhaustivo.
Este tipo de estudios se puede realizar desde diferentes enfoques de los que
Fregel (2010), nos presenta los principales. Entre ellos encontramos la utilización de
marcadores localizados en los autosomas (cromosomas no sexuales), en el ADNmitocondrial y en los cromosomas sexuales, X e Y. Estos análisis se pueden abordar
mediante procedimientos diferentes como la caracterización de determinadas mutaciones
puntuales o SNPs (Single nucleotide polimorphism) y la secuenciación no sesgada de
fragmentos de ADN. Aunque muchos de ellos se llevan a cabo con muestras modernas,
resultan fundamentales para poder interpretar los resultados obtenidos de las muestras
arqueológicas.
7.2. Los Primeros estudios genéticos en la población canaria: Grupos sanguíneos y
polimorfismos enzimáticos
Antes de entrar a describir los diversos tipos de estudios que han pretendido
explicar la variabilidad de la población canaria, tanto en el pasado como en el presente,
es fundamental hacer algunas aclaraciones sobre el proceso de conformación de la
sociedad canaria actual. Hasta la llegada de los europeos a finales de la Edad Media, lapoblación canaria tenía un substrato norteafricano, ya que los aborígenes estaban
relacionados con grupos beréberes. Luego de la incorporación del archipiélago a la
corona castellana a finales del siglo XV, se produciría una aportación de población desde
Europa, en especial desde la Península Ibérica. Además de estas dos poblaciones
parentales, también hay que tener en cuenta la llegada de esclavos subsaharianos
durante la edad moderna, aunque su aporte sea inferior al de las otras dos poblaciones
(Maca-Meyer et al., 2004b).
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El grupo sanguíneo del sistema ABO es fundamental para las transfusiones y
transplantes, ya que entre individuos de grupos incompatibles se produce una destrucción
y aglutinación de las células sanguíneas (Landsteiner, 1901), como consecuencia de una
reacción del sistema inmune ante unas células que reconoce como extrañas al
organismo. Las bases de este fenómeno son las diferencias antigénicas de cada uno delos grupos sanguíneos, determinadas a su vez, por la presencia o no de determinados
residuos de azúcares en las glicoproteínas y glicolípidos de las membranas de los
eritrocitos. Estos grupos carbohidrato se incorporan a la membrana gracias a la acción de
las glicotransferasas A y B. Las diferencias antigénicas de los eritrocitos responden a
mutaciones en el gen que codifica la glicosiltranferasa, que incorporará un tipo u otro de
oligosacárido, o ninguno en el caso del alelo O (Daniels, 1995).
En lo que respecta a los estudios en el archipiélago canario serían Schwarzfischer
y Liebrich (1963), quienes realizarían uno de los primeros análisis genéticos para
determinar el grupo sanguíneo ABO en restos aborígenes. Estos consistieron en el uso de
antígenos eritrocitarios, en los que se pudo observar una alta frecuencia del alelo O,
similar a a encontrada en tribus beréberes del Atlas (Gaud, 1942, Masserlin, 1951), lo que
estaría en consonancia con las evidencias arqueológicas y antropológicas que relacionan
a la población aborigen con pueblos beréberes.
Estos estudios se verían complementados por aquellos que caracterizaban a la
población canaria actual para el grupo ABO, así como para otros grupos sanguíneos
como Rh, MNSs, FY y P (Fregel, 2010). Las frecuencias alélicas de esta población se
encontrarían dentro del rango de las poblaciones europeas, aunque se detectó una
aportación africana minoritaria. Este sería el caso de La Gomera, donde se encontraron
unas frecuencias del alelo O similares a las encontradas en el Magreb y a las de losestudios realizadas en momias aborígenes canarias.
A finales del siglo XX se realizaron algunos avances importantes en la comprensión
del funcionamiento de los genes relacionados con los grupos sanguíneos. Yamamoto
(1990b) logró clonar y secuenciar el gen de la glicosiltranferasa, determinando las
mutaciones que caracterizan los grupos A, B y O. Las únicas diferencias entre la
glicosiltranferasa A y B son 7 mutaciones puntuales, de las cuales sólo 4 determinan uncambio de aminoácido. La principal diferencia entre la glicosiltranferasa A y O radica en la
deleción de una citosina en posición 261, que da lugar a un codón de parada prematuro y
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a la formación de una proteína enzimáticamente inactiva (Yamamoto et al., 1990a).
Complementando lo anterior, los avances de la biología molecular también han permitido
el estudio exhaustivo de la región codificante de la glicosiltranferasa, encontrándose una
gran cantidad de variantes alélicas, sobre todo dentro del grupo O (Yip, 2002). Algunos
alelos de este grupo son bastante abundantes, como el caso del O01 y el O02 , siendodetectados en todas las poblaciones estudiadas hasta el momento. Sin embargo, también
se han identificado otras variantes menos frecuentes, que evidencia una distribución
geográfica más restringida. Para las Islas Canarias son importantes los alelos O03 y O12 ,
ya que son bastante raros y se encuentran en los lugares de origen de dos de las
poblaciones parentales del archipiélago, los vascos y los beréberes (Roubinet et al.,
2001).
En los últimos años se han realizado nuevos estudios sobre los grupos sanguíneos
ABO (Fregel et al., 2005), en los que se ha confirmado la presencia de los alelos O03 y
O12 en Canarias; además se ha visto una correlación negativa entre las distancias
geográficas con el continente africano y las frecuencias insulares; esto sería congruente
con una colonización aborigen desde el este hacia el oeste, cuyas huellas serían visibles
todavía hoy. Estos complementan otros estudios autosómicos en la determinación de las
estimas de mezcla: siendo la Península Ibérica la que da un mayor aporte (82%), conalgunos matices ya que en islas como la Gomera la aportación norteafricana asciende
hasta un 62%.
El segundo tipo de estudios que se realizaron en los inicios de las investigaciones
genéticas en el archipiélago, son aquellos relacionados con los polimorfismos
enzimáticos. Su determinación está basada en la caracterización de isoenzimas, que son
aquellas que catalizan la misma reacción química pero que poseen diferencias en sussecuencias aminoacídicas. El análisis de polimorfismos enzimáticos fue utilizado por
primera vez para el estudio de las moscas Drosophila pseudoobscura (Hubby and
Lewontin, 1966); para ello se emplearon métodos electroforéticos y de tinción de
proteínas. Esta técnica fue luego aplicada a la caracterización de poblaciones humanas
(Harris, 1966), siendo muy usada hasta que se desarrollaron las técnicas que permitieron
el análisis directo del ADN.
En el caso de Canarias se analizaron ocho enzimas sanguíneas, tanto en la
población del archipiélago como en las parentales, la Península Ibérica y el noroeste
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africano (Cabrera et al., 1996, Pinto et al., 1996b). Al igual que ocurre con los grupos
sanguíneos, las frecuencias de estas alozimas en Canarias son similares a las típicas de
las poblaciones caucásicas, aunque la presencia de la variante alélica R en el locus ACP
(fosfatasa ácida) y del alelo G6PD A+ (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), que suelen
relacionarse con poblaciones negroides, podría interpretarse como evidencia de uncomponente africano, aunque no demasiado significativo, en la población canaria actual.
7.3. Marcadores uniparentales
7.3.1. Linajes maternos: el ADN mitocondrial
Se hace referencia a aquellos que son transmitidos exclusivamente por uno de losdos progenitores. Dentro de los linajes maternos estaría el ADN mitocondrial. Este es el
material genético que se encuentra presente en las mitocondrias, orgánulos donde se
genera la energía necesaria para el funcionamiento celular. Como ya se ha mencionado
nos encontramos ante una molécula bicatenaria, circular, cerrada y sin extremos. El
ADNmt contiene un pequeño número de genes que codifican dos ARN ribosómicos, 22
ARN de transferencia y 13 proteínas que participan en la fosforilación oxidativa.
Debido a algunas de las características particulares de este tipo de ADN, que se
han expuesto con anterioridad, como la ausencia de recombinación o la herencia por vía
materna, ha sido posible una reconstrucción de la historia evolutiva de nuestra especie. Al
no recombinar, las diferencias existentes entre dos secuencias de ADNmt se deberán
únicamente a nuevas mutaciones. Estas modificaciones se irán acumulando con el paso
del tiempo, dando lugar a secuencias cada vez más diferentes que serán el reflejo de
linajes cada vez más alejados. El conjunto de mutaciones acumulado en una molécula deADNmt es lo que se denomina haplotipo. Estos pueden relacionarse entre sí mediante el
uso de redes filogenéticas, que permiten clasificarlos en un orden jerárquico, en función
de las mutaciones compartidas. A un grupo de haplotipos que poseen mutaciones en
común, o mutaciones basales, se le denomina haplogrupo. Si se parte de la suposición de
que no existe retromutación, se puede deducir que las mutaciones basales relacionan a
los distintos linajes dándoles un origen común. Además, dada que la tasa de mutación es
conocida, se puede estimar el origen y el tiempo de las migraciones humanas.
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Esta clasificación parece sencilla, pero existen varios factores que pueden
complicar su realización. Entre estos encontramos la alta tasa de mutación de la HVR
(región hipervariable), que puede hacer que las relaciones filogenéticas se vean
emborronadas como consecuencia de la retromutación. Esto ocurre particularmente enciertas zonas con tasas de mutación particularmente altas, los llamados “hotspots”. Una
posible solución es la ampliación de la región estudiada, por ejemplo recurriendo a la
secuenciación completa del ADNmt, ya que fuera de la región hipervariable, el número de
retromutaciones y mutaciones recurrentes es mucho menor.
Cuando se empezó a analizar la variabilidad del ADNmt en distintas poblaciones,
se encontró una diferencia bastante acuciada entre los linajes del África subsahariana ylos demás (Cann et al., 1987). A esto se unía que uno de los haplogrupos más antiguos
aparecía exclusivamente en África, apoyando la teoría del Out of Africa (OOA), que como
ya se ha planteado, propone un origen reciente de los humanos anatómicamente
modernos en el continente africano, desde donde se habrían expandido. Esto implicaría
que todos los linajes actuales provendrían de un ancestro común africano, la “Eva
mitocondrial”. Los estudios de este tipo han ido avanzando, permitiendo un refinamiento
del árbol filogenético del ADNmt, que a su vez brinda la posibilidad de una clasificación enhaplogrupos y subhaplogrupos cada vez más detallada (Torroni et al., 2006).
Como resultado del estudio global de los haplogrupos del ADNmt, fue posible su
adscripción a regiones geográficas específicas (Richards et al., 2000). Tres de estos
haplogrupos, el L1, L2 y L3, aparecen en el África subsahariana. Nueve, H, I, J, K, T, U, V,
W, y X, comprenderían la mayoría de los linajes europeos, norteafricano y caucásicos del
sudeste asiático. Por último, tendríamos a los haplogrupos A, B, C, D, E, F, G, M y Q quese relacionarían con las poblaciones de Asia, Oceanía y los nativos americanos. Como
complemento de esto se encuentran los estudios sobre las edades de coalescencia de los
grandes macrohaplogrupos. Se detectó una primera expansión que partiría de África hace
59.000-69.000 años aproximadamente. Por un lado se colonizaría el oeste asiático y la
India y, de manera independiente, seguiría hacia el sur alcanzando el sudeste asiático. En
un momento posterior, hace alrededor de 39.000-52.000 años, la rama del oeste asiático
se dispersó de forma radial llevando linajes caucásicos al norte de África y Europa,alcanzando la India y expandiéndose al norte y el este de Asia. Las migraciones más
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recientes han desdibujado, aunque no las han eliminado completamente, las huellas de
las expansiones primitivas del hombre moderno (Maca-Meyer, 2001).
Las investigaciones sobre la población canaria, se inician con el estudio preliminar
de ADNmt que comparó la población de la isla de Tenerife con las poblaciones que seconsideraron más cercanas, tanto histórica como geográficamente, la Península Ibérica,
el norte de África y el África subsahariana (Pinto et al., 1996a). En este trabajo se estimó
que la población canaria estaría conformada por una aportación del 43% de linajes
norteafricanos, un 36% de peninsulares y un 21% de subsaharianos. Estos resultados
evidenciaban una diferencia importante con aquellos obtenidos del estudio de marcadores
autosómicos, que estimaron una contribución norteafricana de un 21%, peninsular de un
71% y subsahariana de un 8% (Pinto et al., 1994, Roberts, 1966). Una posibleinterpretación de estos datos sería la existencia de una fuerte asimetría sexual, en la que
los linajes maternos tendrían, comparativamente, una mayor aportación norteafricana y
subsahariana.
Con posterioridad se llevó a cabo un análisis del ADNmt de la población canaria
más amplio, que incluía a individuos de todas las islas (Rando et al., 1999). Se hizo la
secuenciación de la HVR del ADNmt, estudiándose también, varias posiciones diagnósticomediante RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) que refinaron la asignación
dentro de los haplogrupos. Además de los esperados linajes típicamente europeos, se
encontró un subtipo del haplogrupo beréber U6, el U6b1, que sólo ha sido detectado en el
archipiélago, y que permite hacer una relación directa entre la población aborigen de las
islas con el noroeste africano. De este haplogrupo se han realizado estudios detallados en
los que se ha podido rastrear su filogeografía, partiendo de un proto U6 en el Próximo
Oriente desde donde empezaría un proceso de expansión y diversificación, que incluiríala aparición de los subhaplogrupos canarios (Maca-Meyer et al., 2003). A pesar de ello, la
estima de la aportación norteafricana, con tan solo un 33%, fue inferior a la obtenida por
Pinto y col. (1996a) siendo mayoritaria la contribución europea con un 65%.
Esta caracterización de los linajes maternos también contribuyó a la explicación del
proceso de colonización del archipiélago por parte de los aborígenes. Basándose en la
composición haplotípica de las diferentes islas, es posible establecer una correlaciónnegativa entre la heterocigosidad insular y la distancia al continente africano; lo que
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apuntaría a una colonización con un único evento migratorio de este a oeste, procedente
del noroeste africano (Rando et al., 1999).
7.3.2. Linajes paternos: el cromosoma Y
La contrapartida del ADNmt está representada por la región no recombinante del
cromosoma Y, que constituye el 95% de su longitud (Jobling and Tyler-Smith, 1995).
Como consecuencia de su herencia por vía paterna y de que no se produce
recombinación, esta región se transmite, con la excepción de las mutaciones acumuladas,
de padres a hijos sin modificación. Tiene dos diferencias fundamentales con el ADNmt; la
primera es que es de mayor tamaño, 60x10⁶ pb en comparación con las 16x10³ pb del
ADNmt, y la segunda es que aparece en un menor número de copias, una por célula encomparación con las 3.000 copias aproximadas del ADNmt.
Otra de las problemáticas que presentan los estudios de la región no recombinante
del cromosoma Y, en comparación con el ADNmt, es su baja tasa de mutación, que es
entre 5 y 10 veces menor que la de éste. Lo anterior no ha influido para que en la
actualidad se hayan descrito más de 600 SNPs asociados al cromosoma Y (Karafet et al.,
2008). Además, como consecuencia de su baja tasa de mutación (Thomson et al., 2000),se producen una menor cantidad de retromutaciones y mutaciones recurrentes, lo que
aumenta la certeza de que la presencia compartida de un mutación defina a un grupo de
cromosomas relacionados por descendencia, facilitando la construcción de los árboles
filogenéticos (Karafet et al., 2008, Underhill et al., 2001, Ellis et al., 2002) .
Como contrapartida, esta baja tasa de mutación representa un problema cuando se
intenta una división en subhaplogrupos más refinada. En este tipo de casos, se recurre aluso de marcadores de evolución rápida como los microsatélites, que permiten identificar
grupos monofiléticos dentro de los haplogrupos (Cruciani et al., 2004, Semino et al., 2004)
El uso de microsatélites también resulta necesario para determinar las edades de
coalescencia de un determinado haplogrupo, ya que el número de variantes acumuladas
dentro de un determinado linaje, está directamente relacionado con su edad (Jobling and
Tyler-Smith, 2003).
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Los estudios basados en el cromosoma Y han demostrado, sobre todo
recientemente, ser bastante eficaces a la hora de intentar dilucidar el origen, evolución y
dispersión de las poblaciones humanas. De la misma manera que ocurrió con el ADNmt,
se pudo determinar que la distribución geográfica global de los haplogrupos, eraespecífica a determinadas regiones, y que su filogenia apoyaba la teoría del “Adán
Cromosómico Y”, análogo a la “Eva mitocondrial”, que habría vivido en África hace un
90.000-130.000 años (Underhill et al., 2000). En lo que respecta a su distribución, los
haplogrupos A y B estarían asociados al África subsahariana; los haplogrupos E,J y T se
distribuirían por África, Oriente Medio y el sur de Europa; los haplogrupos R, G, I lo harían
por el Oriente Medio, el Cáucaso y el Mediterráneo. Por último, los haplogrupos C, D, K, F,
H, L, M, O, Q y S aparecerían en Asia, Australia, Oceanía y América (Karafet et al., 2008,Underhill and Kivisild, 2007).
En el caso de Canarias, los estudios del cromosoma Y se realizaron una vez
determinada la composición genética de los linajes maternos. Para ello se analizaron 24
marcadores bialélicos y 5 microsatélites del cromosoma Y en poblaciones de las siete
islas (Flores et al., 2003), con el propósito de compararlas con aquellos del noroeste
africano y la Península Ibérica (Bosch et al., 2001, Flores, 2001, Flores et al., 2004, Hurleset al., 1999, Underhill et al., 2001). Los resultados mostraron que, al contrario de lo que
sucedía con el ADNmt, el pool genético paterno tiene un origen mayoritariamente europeo
(>90%), lo que vendría a confirmar una asimetría sexual, consecuencia de la colonización
europea. Sin embargo, la presencia de linajes africanos como el E-M81 apunta a una
pervivencia relativa de linajes aborígenes. Basándose en la distribución y la edad de estos
linajes africanos, se planteó un proceso de colonización en dos fases, lo que coincidiría
con algunos de los resultados obtenidos mediante estudios antropológicos, arqueológicosy lingüísticos (Navarro-Mederos, 1997, Springer, 2001), aunque sería contradictorio con el
único evento migratorio detectado para el ADNmt (Rando et al., 1999). Estudios similares
se han realizado en las islas atlánticas portuguesas, Madeira y Azores, lo que permite una
comparación con unas situaciones histórico-geográficas similares (Goncalves et al.,
2005).
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7.4. Los marcadores autosómicos: el sistema CD4/Alu.
Este tipo de marcadores son fundamentales si se pretender obtener una visión
conjunta de la evolución de las poblaciones, ya que son un complemento necesario a loslinajes exclusivamente maternos o paternos.
Entre los marcadores autosómicos usados en los estudios poblacionales, el
sistema de haplotipos CD4/Alu es bastante utilizado ya que es una herramienta efectiva si
se pretende trazar el origen y la expansión del hombre moderno (Tishkoff et al., 1996), así
como estimar la mezcla entre poblaciones (Destro-Bisol et al., 1999). Este sistema está
conformado por dos loci asociados, un locus bialélico cuyo estado ancestral es la pérdidaparcial de un elemento Alu y una repetición en tándem de un pentanucleótido (5’ TTTTC
3’).
En un primer momento se aplicó este sistema a las poblaciones parentales de
Canarias (Península Ibérica, noroeste africano y África subsahariana) (Flores et al.,
2000). A continuación se utilizó este mismo marcador para caracterizar a las poblaciones
de las islas, para poder realizar una comparación. Aunque la distribución de los haplotiposCD4/Alu en Canarias no presentó una diferencia marcada con la de la Península Ibérica,
si se obtuvieron algunos resultados que apuntan a una influencia norteafricana (Flores et
al., 2001). Entre estos resultados estaría la presencia del haplotipo 110(-), que se
relaciona directamente con el noroeste africano, y que apareció en la mayoría de las islas
con una distribución que, en algunas de ellas, no se diferenciaba significativamente de las
del noroeste africano. Asimismo, se pudo determinar una correlación inversa entre la
heterocigosidad haplotípica de las islas y su distancia con la costa africana, lo queapoyaría los resultados obtenidos en el estudio de los linajes mitocondriales (Rando et al.,
1999).
También se han realizado estudios en las siete islas sobre diez inserciones
autosómicas Alu. Éstas se encuentran dispersas a lo largo del genoma humano, se dan
como eventos únicos en nuestra evolución y son aparentemente neutrales en la selección
natural (Maca-Meyer et al., 2004b). En estas investigaciones se han detectado alelosespecíficos de la Península Ibérica y del noroeste de África. La contribución ibérica se
situaría entre el 62 y el 78%, la norteafricana entre el 23 y el 38% y la del África
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subsahariana alrededor del 3%, lo que sigue sugiriendo un legado aborigen y esclavo en
la población actual del archipiélago.
7.5. Estudios de ADN antiguo en Canarias.
Los estudios de ADN en muestras antiguas presentan gran interés, tanto en el área
de genética de poblaciones, como en la de los estudios históricos. Para la primera
representan una vía de confirmar los resultados obtenidos en los estudios con la
población actual. Para los segundos pueden representar información fundamental en el
camino de reconstrucción de los modos de vida de las poblaciones del pasado.
Uno de los primeros estudios que se realizaron sobre muestras antiguas fueron losque se hicieron con los restos provenientes de la excavación de la Iglesia de La
Concepción, en Santa Cruz de Tenerife. Debido a la necesidad de realizar algunas
reparaciones arquitectónicas en el edificio, se realizó una excavación arqueológica que
permitió el acceso a restos pertenecientes a la población del siglo XVIII de esta ciudad.
En esos momentos, la colonización europea del Nuevo mundo se hallaba en su auge, y
Santa Cruz era uno de los puertos más importantes para la relación entre las Islas
Canarias y el continente americano. El análisis de la composición genética de estapoblación, así como su comparación con la población actual, resulta vital para entender la
magnitud del impacto de las poblaciones europeas y africanas sobre el sustrato aborigen
del archipiélago, además de desvelar relaciones con América no detectadas con
anterioridad (Maca-Meyer, 2005).
En este caso se procedió al estudio de la secuencia de la región hipervariable I
(HVRI) del ADN mitocondrial y de RFLPs (Region Fragment Length Polymorphisms)diagnósticos. Se estudiaron 208 dientes provenientes de 33 fosas y 5 dientes de la Ermita
de San Blas, a 15 Km de Santa Cruz. El 37% de las secuencias pertenecían al grupo H, el
1,56% eran de origen americano, el 15,63% eran de haplogrupos africanos. El subgrupo
U6a, de asignación norteafricana se encontró en una frecuencia del 1,56%, mientras que
el U6b1, el subgrupo específico canario se halló en el 8,59% de los casos. Se concluyó
que la contribución por vía materna a la población canaria de esta época sería de un 50%
norteafricana, 40% Europea y un 10% subsahariana (Maca-Meyer, 2005). También sehizo el análisis del gen de la amelogenina, del que se hablará más adelante, para
determinar el sexo genético de los individuos (Arnay de la Rosa, 2009, Maca-Meyer,
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2005). Sobre estos restos también se realizó un estudio que pretendía estudiar la
evolución de las frecuencias alélicas del sistema ABO y su relación con el impacto de la
colonización europea. Este estudio confirmaría la historia demográfica de las islas
propuesta por estudios previos desde la arqueología y la antropología. En este estudio las
frecuencias alélicas relacionan claramente a los aborígenes canarios con las poblacionesberéberes del norte de África (Fregel, 2009).
En lo que respecta a los estudios sobre restos aborígenes, habría que destacar el
realizado por Maca-Meyer y col. (2004a), en el que se detectaron los linajes U6 en una
proporción mayor a los presentados por la población canaria actual. Sin embargo, al no
encontrarse correspondencias exactas de los linajes U6b1 en el norte de África, no ha
sido posible establecer el origen exacto de los colonizadores prehispánicos.
Otro ejemplo de estudios sobre muestras antiguas en el archipiélago, sería el
realizado sobre material aborigen de la isla de La Palma (Fregel et al., 2009b). En este se
analizaron 38 dientes provenientes de contextos aborígenes. Se obtuvieron secuencias
informativas de 30 individuos (78,9%). El 93% de los linajes eran originarios del oeste de
Eurasia, y el 7% restantes tenían una adscripción del África subsahariana. La gran
mayoría de los haplotipos (70%) tenían sus correspondientes en el norte de África. Sinembargo, el subtipo U6b1, sigue sin encontrarse en el norte de África, a pesar de ser la
cuna de expansión del linaje U6. El grupo H1 resultó ser el más abundante en La Palma,
estando definido por la transición 16260, aunque es bastante raro en el norte del
continente africano. Esto se interpreta como que la región exacta de donde provienen los
ancestros de los aborígenes canarios no ha sido estudiada aún, o las poblaciones han
sido remplazadas por migraciones humanas posteriores. La gran diversidad genética
encontrada en La Palma (alrededor del 95%), se encuentra en unos niveles similares a losde Tenerife, a pesar de encontrarse más alejada del continente. Este descubrimiento iría
en contra de la suposición que se ha hecho sobre una colonización desde el continente
de isla en isla con un posterior aislamiento. Por otra parte, la gran similitud entre la
población aborigen de La Palma y de Tenerife también iría en contra la idea de una
colonización marítima independiente de cada una de las islas sin un contacto posterior
entre ellas. Los resultados de este estudio encajarían mejor dentro de un modelo de
migración frecuente entre las islas.
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Sobre el cromosoma Y también se han realizado investigaciones con restos
aborígenes y de la Edad Moderna. En éstas se consiguió entender mejor la manera como
la colonización europea afectó el pool genético femenino y masculino de los aborígenes,
desde el momento de la conquista hasta la actualidad. Se concluyó que la presencia de
linajes autóctonos del norte de África, como el E-M81, así como algunos marcadoresabundantes en esta región (E-M78 y J-M267) en las poblaciones aborígenes, apunta a
que éste sea el lugar de origen más probable para estos grupos. En comparación con las
poblaciones aborígenes, la muestra histórica del siglo XVIII muestra una disminución de
las frecuencias de los haplogrupos norteafricanos y un aumento de los europeos. Estos
estudios también ayudarían a demostrar una evolución sexual asimétrica en las
poblaciones más recientes, lo que podría explicarse como resultado de una discriminación
negativa hacia los hombres aborígenes en el momento de la reproducción en favor de loshombres europeos (Fregel et al., 2009a).
Por último, hay que mencionar los diversos casos en los que se han utilizado los
estudios de ADN antiguo para la determinación genética del sexo en restos aborígenes
(Arnay-De-La-Rosa et al., 2009, Arnay-De-La-Rosa et al., 2007). Sin embargo, estos
estudios serán explicados en detalle en otros apartados.
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8. Métodos para determinar el sexo genético en restos humanos
8.1. La amelogenina
El uso de la biología molecular para determinar el sexo de individuos provenientes
del registro arqueológico, ha significado un avance importante en el análisis de restos
infantiles, así como de adultos cuyos esqueletos se encuentran bastante incompletos
(Schmidt et al., 2003). Para la determinación molecular del sexo se ha ido imponiendo el
uso del gen de la amelogenina (Nakahori et al., 1991a, Nakahori et al., 1991b), que
codifica una de las proteínas fundamentales en el desarrollo de los brotes dentales, y que
exhibe un dimorfismo de longitud entre el cromosoma X y el cromosoma Y (106 y 112 pb).Si comparamos el gen de la amelogenina con los loci específicos del cromosoma Y que
se usaron en los intentos iniciales para determinar el sexo (Hummel and Herrmann, 1991),
la gran ventaja de la amelogenina radica en que al estar presente en los dos cromosomas
sexuales, actúa como un control positivo interno (Maca-Meyer, 2002).
El alelo del cromosoma Y contiene algunas variaciones en su primer intrón,
incluyendo una deleción de 189 pb (Nakahori et al., 1991b). El problema de utilizar estadiferencia para asignar el sexo es que implicaría la amplificación de un fragmento
demasiado grande para lo que se espera obtener de una muestra de ADN antiguo. Es por
eso que se está utilizando una región en la que existe una deleción de 6 pb en el intrón 1
del gen homólogo en el cromosoma X, región en la que se centra también Maca-Meyer
(2002). Para ello se usaron unos primers publicados por Sullivan y col (1993).que dan
productos de amplificación de 106 y 112 pb para los cromosomas X e Y, respectivamente.
Estos son:Amel-A 5’ CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG 3’
Amel-B 5’ ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG 3’
Sin embargo, al tener una experiencia negativa con estos primers, Maca-Mayer plantea
mantener el primer Amel-A y diseñar un tercer primer de tal forma que el producto de la
amplificación fuera más pequeño (60 y 66 pb para los cromosomas X e Y
respectivamente). La secuencia sería:
Amel-C 5’ AATRYGGACCACTTGAGAAAC 3’ Donde R=A/G, Y=C/T
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En los primeros momentos de aplicación de esta técnica, fueron necesarios
algunos estudios sobre la fiabilidad del mismo. Lo que se solía hacer era utilizar una
población bien caracterizada antropológicamente, es decir con el sexo de los individuos
bien determinado. Luego se realizaban los análisis genéticos a ciegas, para poder comparar ambos resultados. Éste sería el caso del estudio realizado por Matheson y Loy
con restos de cráneos humanos de unos 9400 años de antigüedad, provenientes de
Turquía (2001). En este caso se demostró que el gen de la amelogenina al tener
fragmentos bastante grandes podría presentar problemas de amplificación. Aquí, en lugar
de intentar utilizar fragmentos del gen más pequeño, como lo hace Maca-Meyer (2002),
se propone la alternativa del uso del método de repeticiones alfoides de los cromosomas
X e Y.
Podemos encontrar múltiples ejemplos de la utilización de este gen para la
determinación del sexo genético. Entre ellos estaría el estudio hecho por Faerman (1995),
en el que analiza esqueletos neolíticos provenientes de Israel. De este estudio es
necesario resaltar la importancia que se da al análisis de distintas concentraciones de
ADN, ya que debido a la degradación y a los inhibidores, si hay demasiado o muy poco el
resultado de la amplificación puede verse seriamente afectado. Aquí también se resalta lautilidad de la biología molecular para sexar individuos infantiles, o aquellos cuyos restos
se encuentren fragmentados de tal forma que los métodos antropológicos tradicionales
sean insuficientes. Una última cuestión a destacar es que, en este caso, el gen del
cromosoma Y produjo mejores resultados que el del cromosoma X, lo que es de gran
utilidad. En los casos en los que sólo amplifica el Y se puede afirmar que es un individuo
masculino, pero además en los que sólo se amplifica el gen del cromosoma X también se
puede asegurar que es una mujer, porque los resultados no serían consecuencia de unaamplificación preferencial de este gen sobre el del cromosoma Y. En este caso, además,
se utilizan tres primers diferentes en lugar de dos, como ocurre en otros estudios, uno
común y dos que son alelo-específicos. Esto permite realizar una identificación de los dos
cromosomas sin ambigüedad porque, a diferencia de los estudios en los que se utilizan
sólo dos primers, y en los que un individuo con la banda de hembra podría ser un macho
con poca cantidad de ADN, los primers alelo-específicos generan amplificaciones
independientes.
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Este tipo de estudios también se suelen complementar con el análisis de otras
cuestiones. Este sería el caso de los análisis realizados por Cipollaro y col. (1998), sobre
restos del yacimiento arqueológico de Pompeya, en el que utiliza el gen de la
amelogenina para comprobar la relación entre los buenos resultados de los análisishistológicos, y la posibilidad de recuperar ADN de muestras antiguas. En este caso la
amplificación de la amelogenina no sólo resuelve un problema antropológico e histórico,
sino también la posible conservación de macromoléculas en yacimientos conformados
como consecuencia de un determinado tipo de erupciones volcánicas.
La determinación del sexo utilizando el gen de la amelogenina también ha
representado un gran avance para la antropología física como lo evidencian Arnay y col.(2007). En un estudio con restos aborígenes de la isla de Gran Canaria se compararon los
resultados obtenidos mediante el análisis de la amelogenina, con aquellos producidos
utilizando funciones discriminantes de la mandíbula. El objetivo era afinar la precisión de
estas medidas, para el caso de una población específica. Éste sería un claro ejemplo de
la manera como la biología molecular puede contribuir a la contrastación de hipótesis
fundamentales dentro de los estudios de restos humanos. También se demuestra, una vez
más, que métodos como las funciones discriminantes deben ser usados con gran cautela,al estar su efectividad fuertemente condicionada por las características de cada población.
La misma metodología con ligeras variaciones se ha mantenido vigente y ha sido aplicada
en investigaciones recientes sobre restos aborígenes de la isla de la Gomera, para
intentar ver una posible relación entre el sexo de los individuos y los patrones dietéticos
de los mismos, aunque en principio parece no haber una diferencia notable (Arnay-De-La-
Rosa et al., 2009).
En los últimos años se han ido mejorando las técnicas para la identificación del
sexo en especímenes antiguos, aunque la fundamentación teórica sigue siendo la misma.
Schmidt (2003), por ejemplo, presentó un método de PCR multiplex que supone una
mejora en este tipo de análisis. En él, se coamplifica la amelogenina, dos STRs del
cromosoma X (DXS6789 y DXS9898) y dos STRs específicos del cromosoma Y (DYS391
y DYS392). Esta coamplificación aumenta de manera considerable la validez de los
resultados al obtener diferentes datos que los confirmen de manera simultánea. Estosnuevos planteamientos se producen, al menos en parte, para contrarrestar un posible
sesgo hacia la identificación de individuos como femeninos, como consecuencia de la
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pérdida de alelos que impidan la amplificación de la secuencia de la amelogenina en el
cromosoma Y (Santos et al., 1998). Esta técnica viene del mundo forense, siendo muy
apropiada para muestras muy degradadas, ya que la longitud de los productos
amplificados está entre 91 y 116 pb, con los primers que propone Schmidt (2003). La
técnica fue probada en material óseo de una caverna de la Edad del Bronce deLiechtenstein, con unos 3.000 años de antigüedad. Otra de las ventajas de los
marcadores utilizados es que los loci se encuentran cerca del centrómero de los
cromosomas, lo que hace que su degradación sea menos rápida, ya que esta comienza
por el final de los telómeros. Además los marcadores del cromosoma X utilizados tienen
altas tasas de heterocigocis, por lo que en muchos de los casos en los individuos
femeninos se ven dos alelos, lo que confirma su asignación. Como complemento a la
determinación del sexo, Schmidt (2003) también propone la utilización de estosmarcadores para determinar el parentesco, ya que son STRs con una estructura similar a
la de los STRs autosómicos. Además, los STRs del cromosoma Y se heredan como los
haplotipos y algunos STRs del cromosoma X de una manera similar que permite usarlos
en estudios de parentesco amplio.
Las nuevas técnicas para la visualización de los resultados también han entrado en
los estudios sobre el gen de la amelogenina. Así Zoledziewska y col. (2003) utilizan lahibridación con oligonucleótidos marcados con fluorescencia y la electroforesis capilar
para realizar un estudio sobre restos óseos de diversa antigüedad, desde 1 año hasta el
Neolítico, pasando por la Edad del Bronce. En este caso también se utilizan fragmentos
más cortos para aumentar la sensibilidad en el caso de muestras muy degradas. Una vez
más esto puede ser contraproducente porque también se aumentan las posibilidades de
contaminación, lo que hace necesario un control muy estricto para poder validar los
resultados.
La pirosecuenciación, un método de secuenciación relativamente nuevo, basado
en una reacción enzimática quimicoluminiscente, también ha sido utilizada en estudios
más recientes sobre este gen. Este método se fundamenta en la detección luminométrica
de los pirofosfatos liberados durante la incorporación de nucleótidos, en donde cada señal
luminosa es proporcional al número de nucleótidos incorporados. En este caso se
utilizaron primers que flanquean una inserción de 3 pares de bases (GAT) en elcromosoma Y, colocada en la posición 1499-1501 del nucleótido en el gen humano de la
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amelogenina. La posición respectiva del cromosoma X es la 1680 (Tschentscher et al.,
2008). En este caso se hicieron pruebas en muestras que, debido a la degradación, no
habían dado resultados en ensayos anteriores usando métodos convencionales. Sin
embargo, utilizando la pirosecuenciación, gran parte de ellas produjeron resultados
positivos. La escasa longitud de los fragmentos amplificados se muestra como una granventaja, y puede resultar de gran ayuda en muestras degradadas como las de ADN
antiguo.
Los métodos para la determinación del sexo genético se han ido puliendo,
subsanando algunos de los problemas de las primeras investigaciones. Este es el caso
del trabajo presentado por Codina (2009), en el que se propone una PCR multiplex para
determinar el sexo de muestras degradadas; aunque se centra en muestras forenses estametodología podría ser aplicada a restos antiguos, por la similares características que ya
se han comentado. La propuesta consiste en la co-amplificación de dos regiones
diferentes del gen de la amelogenina (55/58 y 106/112 bp para los alelos AMELX/AMELY
respectivamente), una ampliación de 93 pares de bases del gen SRY y cuatro loci mini X-
STR (DXS7424, DXS8378, DXS6803 and GATA 172D05 (cuyos productos de
amplificación máximos no superan las 140 pares de bases)). La elección de estos
marcadores tiene como criterios: el pequeño tamaño de los amplicones, altos niveles deheterocigocis, una distribución equilibrada de frecuencias, así como un alto polimorfismo.
Estas condiciones fueron probadas para su nivel de sensibilidad, midiendo su
especificidad con el ADN humano y su comportamiento en casos con mezclas de ADN,
obteniéndose resultados positivos. Este replanteamiento se da porque se ha visto que
pueden producirse resultados erróneos cuando se da una mutación en el sitio de
ligamiento de los primers, tanto en el gen AMELX como en el AMELY; además se suele
tener más problemas para amplificar el AMELY lo que puede dar como resultado falsosfemeninos (Codina et al., 2009).
En uno de los estudios más recientes publicados sobre restos antiguos, Gibbon
(2009) nos muestra una de las últimas propuestas para estudiar la amelogenina. En este
caso se complementan dos sistemas de identificación. El primero se basa en el análisis
de la secuencia de 10 SNPs específicos a cada sexo, para ver si ambos cromosomas
estaban representados (en los varones) o sólo el X (en las hembras). El segundo utilizaun “indel” de 6 pares de bases. En este caso se utilizó la estación automatizada de
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electroforesis Experion (Bio-Rad), que utiliza una tecnología de micro-separación de
fluidos, que transporta volúmenes muy pequeños de líquidos, lo que permite una
separación y detección rápida de las muestras. El uso de esta tecnología tiene como
ventaja, no sólo la poca cantidad de muestra que debe cargarse (1µl), sino también su
alto nivel de sensibilidad, con lo que se pueden detectar muestras que serían invisiblescon otros métodos. En este caso se utilizaron los materiales de la colección de esqueletos
humanos de Raymond Dart que, en su gran mayoría provienen de hallazgos fortuitos en
las cercanías de Johannesburgo, no siendo producto de excavaciones arqueológicas. La
combinación de ambos métodos produjo resultados positivos en un 46,66% de los
especímenes, un porcentaje muy aceptable dentro de los estudios de ADN antiguo
(Gibbon et al., 2009).
8.2 El cromosoma Y para confirmar el sexo
Los estudios sobre genes específicos del cromosoma Y también pueden ser
utilizados para determinar el sexo genético, incluso cuando éste no sea el objetivo
principal de una investigación. Este tipo de estudios se fundamentan en que estos
marcadores sólo serán amplificados en individuos masculinos. El problema es que su
ausencia no necesariamente implica que estemos frente a un individuo femenino, ya queésta puede ser también consecuencia de la degradación del ADN o la inhibición, que
impidan la amplificación de determinados fragmentos. Uno de los primeros estudios de
este tipo es el presentado por Hummel y Herrmann (1991), en el que se hizo un estudio
sobre restos que ya habían sido identificados como varones, según sus rasgos métricos y
morfológicos. Algunos pertenecen a los siglos XVII y XVIII y otros a la Edad Media, y
provienen de distintos enterramientos en Alemania. Los primers utilizados en este caso
amplificarían un fragmento de 154 pb inscrito dentro de una secuencia de repeticiónespecífica del cromosoma Y de 3.4- kb. Los amplicones serían luego sometidos a un
proceso de digestión con la enzima Eco RI dando como resultado 2 fragmentos, uno de
102 pb y otro de 52 pb.
Los estudios del cromosoma Y sirven además para establecer relaciones de
parentesco entre individuos masculinos. Tal es el caso del estudio de Gerstenberger y col.
(1999), en el que se estudian ocho individuos provenientes de un enterramiento de lafamilia de los Condes de Königsfield, utilizado entre 1546 y 1749, y que según la
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documentación fue utilizado sólo para enterrar varones. Sin embargo, los estudios
morfológicos así como los ajuares de algunos de los esqueletos llevaron a dudar sobre el
sexo de los mismos. Teniendo en cuenta las características de la muestra se realizaron,
combinados con el análisis de la amelogenina, estudios de STRs autosómicos y de
marcadores específicos del cromosoma Y, que confirmarían no sólo las relaciones deparentesco sino también el sexo de los individuos, ya que al ser tan polimórficos y cortos
como su contrapartida autosómica son igualmente adecuados en los estudios de ADN
antiguo. Se utilizaron los loci DYS19, DYS390, DYS389I/II en una amplificación de
cuadruplex, y los primers fueron modificados para que los productos no superaran las 94
pb. Finalmente se clasificaron dos individuos como femeninos y el resto como masculinos.
Dentro de los estudios de cromosoma Y, también se han utilizado SNPs (SingleNucleotide Polymorphisms). Tal es el caso de las investigaciones presentadas por
Bouakaze y col. (2007), en las que un grupo de 13 SNPs del cromosoma Y, fueron
utilizados para identificar los haplogrupos del cromosoma Y más frecuentes en Asia,
aunque como ya mencionamos un resultado paralelo es la confirmación del sexo de los
individuos estudiados. El análisis se hizo mediante la co-amplificación de 13 fragmentos
dentro de dos PCR de multiplex, que fueron luego detectados con una reacción de
minisecuenciación utilizando el SNaPshot Multiplex Kit y la electroforesis capilar. Seanalizaron 11 muestras antiguas provenientes del sur de Siberia y con unas dataciones de
entre 5.500 y 1.800 años BP. La importancia de este estudio es que permite demostrar la
aplicación y la utilidad de los SNPs en muestras degradadas. En este caso los primers
también fueron rediseñados para que los amplicones se encontraran entre las 81 y las
155 pb. Una vez más vemos que la longitud de los productos de amplificación es un
elemento fundamental cuando se trabaja con muestras degradadas. Además se tuvo en
consideración que la diferencia entre unos amplicones y otros fuera la suficiente para nogenerar confusiones durante la electroforesis capilar. También hubo que realizar una
adaptación respecto a los primeros intentos realizados con ADN moderno. En lugar de
una sola reacción con los 13 marcadores, se tuvo de diseñar una de 6 y otra de 7
marcadores por amplificación, lo que los autores argumentan es consecuencia de las
particularidades del ADN antiguo. De 11 muestras analizadas se obtuvieron resultados
positivos en 9, lo que implica un alto grado de eficiencia de este método (Bouakaze et al.,
2007).
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8.3. El papel de los SNPs y las inserciones Alu
Los SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), son mutaciones que afectan a un
único nucleótido. Aunque no presentan la hipervariabilidad característica de losmicrosatelites, representan una fuente casi inagotable de marcadores repartidos por todo
el genoma. Hay una estimación de un SNP por cada 1300 pares de bases y hasta el
momento se han identificado más de un millón de SNPs dentro del proyecto del genoma
humano; además son adaptables a genotipación automatizada a gran escala, mediante el
uso de técnicas basadas en, por ejemplo, la hibridación de oligonucleotidos, la extensión
de primers y la pirosecuenciación. Uno de las aplicaciones recientes más prominentes de
los SNPs son los estudios basados en el cromosoma Y. Estos suelen producirse dentro deestudios de evolución, pero como ya se ha mencionado, resultan igualmente útiles para la
confirmación del sexo genético de los individuos (Hellborg and Ellegren, 2003). También
se han realizado algunos estudios sobre los SNPs propios del cromosoma X que serían
complementarios a los primeros, y que podrían actuar como control interno, en la
determinación del sexo, al confirmar que los resultados negativos para los marcadores del
cromosoma Y no son consecuencia de la degradación general de la muestra (Vasques
and Pereira, 2001).
La principal ventaja para los estudios de ADN antiguo se encuentra en la longitud
de la región de ADN que se estudia. De hecho, siendo la secuencia necesaria mucho mas
corta, los perfiles de SNPs pueden tener una gran aplicación en estudios donde sólo se
dispone de muestras pequeñas y degradadas. Además, se ha demostrado que un grupo
relativamente pequeño, de aproximadamente 50 loci sería comparable con los multiplex
de STRs existentes (Petkovski et al., 2003).
A pesar de su utilización relativamente reciente, los SNPs han ido cobrando fuerza
rápidamente. Además en su estudio se han ido aplicando las técnicas más novedosas del
campo de la biología molecular. Un ejemplo de este es el estudio publicado por Vallone
(2004), en el que se construyeron nuevas extensiones de primers multiplex específicas de
determinados alelos (ASPE), además se utilizaron nuevos kits comerciales de hibridación
específica de alelos (ASH) para examinar 50 marcadores Y-SNP. Entre estas dos técnicashabía un solapamiento de 10 loci lo que permitiría comprobar la concordancia entre los
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resultados de los dos métodos. En el caso del cromosoma Y se han caracterizado
alrededor de 600 SNPs en la región no recombinante de éste (Karafet et al., 2008). En
este caso se utilizaron los SNPs para hacer una clasificación en haplogrupos, pero es
necesario insistir en su utilidad complementaria como confirmación del sexo.
Como ya se he mencionado en apartados anteriores uno de los posibles problemas
en la aplicación del método de la amelogenina es la posible deleción en el gen AMGY que
impida su amplificación y que de como resultado un falso femenino. Como lo explica
Cadenas y col. (2007) parece haber una relación entre estas deleciones y determinados
haplogrupos, proviniendo de unos linajes paternos determinados. Como solución a este
problema se propone la utilización del conocimiento actual de los SNPs del cromosoma Y,
para complementar y contrastar los resultados de los estudios más tradicionales como elde la amelogenina.
Otra propuesta para el problema de las deleciones viene del campo de las
investigaciones forenses. Njoroge y col. (2010), plantean la utilidad de las inserciones Alu.
Los elementos Alu son secuencias repetitivas de ADN, que constituyen una clase única de
marcadores moleculares que han atraído la atención en los últimos años como
consecuencia de su abundancia en el genoma humano, lo que permite obtener resultadosde PCRs incluso con pequeñas cantidades de ADN. Son secuencias diméricas de ADN de
aproximadamente 330 pb de longitud y son derivadas del gen de ARN 7SL. Este tipo de
inserciones polimórficas se han utilizado en estudios poblacionales, en determinaciones
de paternidad y en aplicaciones forenses. En particular, estos elementos pueden usarse
para la determinación del sexo así como para determinaciones étnicas, ambos elementos
no siempre sencillos utilizando únicamente STRs. En este caso se utilizó la electroforesis
basada en micro-chips, sobre todo por sus separaciones muy rápidas, además de supotencial para procesar muestras en paralelo, y la posibilidad de automatizar el proceso,
aunque su funcionamiento se basa en los mismos principios de la electroforesis
tradicional. En este caso se utilizaron los loci Alu STXa y Alu STYa, para la determinación
del sexo. La selección de las inserciones está condicionada porque la región homologa en
el cromosoma X e Y no puede ser un loci polimórfico, que es lo que permite usar el
tamaño del amplicon como criterio para diferenciar los femeninos de los masculinos,
también es importante asegurarse de que no hay interferencias con determinacionesétnicas. Las pruebas de este método se realizaron mezclando una cantidad determinada
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de ADN masculino, con diferentes concentraciones de ADN femenino, lo que también
muestra la utilidad de la metodología en el caso de mezclas, porque los resultados
mantenían el ratio entre X e Y correspondiente a la mezcla de ambos tipos de ADN. En
principio esto puede no ser de gran trascendencia en los estudios de ADN antiguo, pero si
lo es en casos forenses. Otra de las ventajas de este tipo de inserciones es que al serespecíficas de los primates no se amplifica ADN de otras especies (Njoroge et al., 2010).
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9. Importancia histórica de los estudios genéticos para la determinación del sexo
Una vez explicadas las cuestiones metodológicas relativas a la determinación del
sexo en restos antiguos, se hace necesario entender la gran trascendencia que este tipode estudios pueden tener en la búsqueda de comprensión de los diversos procesos
históricos. Quizás una manera más clara de explicar esta cuestión sea por medio de
ejemplos. Por ello a continuación se presentarán algunos casos de aplicaciones históricas
de los estudios genéticos, en especial aquellos relacionados con la determinación del
sexo. En algunos casos, la genética ayuda a confirmar hipótesis planteadas, pero en otros
presenta unos resultados contradictorios con las explicaciones de determinados
fenómenos, por lo que se hace imprescindible replantear diversas cuestiones,enriqueciendo así las interpretaciones históricas, herramienta fundamental para entender
determinados aspectos de las sociedades del pasado.
El primer ejemplo que se plantea es el estudio que se hizo sobre unos restos
infantiles de época romana. El conocimiento del género de los niños encontrados en
diferentes contextos arqueológicos tiene implicaciones, no sólo porque puede
relacionarse con el tipo de enterramiento, sino también porque puede establecerse unposible rol del género en relación con cuestiones de sacrificios infantiles o infanticidio. En
este caso se trata de más de 100 neonatos encontrados durante las excavaciones
arqueológicas del yacimiento de Ashkelon, con una antigüedad de más de cinco mil años;
los restos serían de época romana, ya que el yacimiento fue colonizado por este pueblo
en el siglo I d.C. . Los restos fueron encontrados debajo de una casa de baños, construida
en el siglo IV d.C. y utilizada hasta el siglo VI d.C. Los restos infantiles se hallaban en las
cañerías de una cloaca junto con restos de animales, trozos de cerámica y algunasmonedas aisladas; no se observaron signos de un enterramiento cuidadoso o de algún
tipo de ajuar. Este sistema casual de desecho de los restos, contrasta con las cuidadas
jarras de enterramientos infantiles pertenecientes al mismo periodo, encontrados a corta
distancia. A partir del tamaño de los huesos y del desarrollo dental se ha determinado que
todos eran neonatos, con entre uno y dos días de vida. La combinación de una muerte tan
temprana en una cantidad tan grande de niños y la manera en que fueron depositados,
plantea la posibilidad de infanticidio, más que la de muerte por causas naturales. Ninguno
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de los esqueletos mostraba malformaciones, planteándose entonces que serían otros
factores, como el género, los motivos para el infanticidio (Faerman et al., 1998).
El ADN para el estudio se extrajo de polvo de hueso, obtenido de 43 fémures
izquierdos, para evitar analizar al mismo individuo dos veces. Se utilizó el procedimientode extracción de purificación con chelex, así como el método basado en la sílica. La
determinación del sexo se hizo utilizando alelos de la amelogenina en el cromosoma X e
Y. La amplificación fue exitosa en 19 de los 43 especímenes estudiados. Catorce serían
varones y cinco hembras, dando como resultado una frecuencia significativamente más
alta de niños que de niñas (P<0.05). La razón inicial para decidir que los individuos
analizados eran víctimas de infanticidio, era la falta de niños de más de dos días de edad
así como su deposición casual en la cloaca. Si este sitio hubiera servido como lugar dedepósito de niños que hubieran fallecido de muerte natural pero que fueran considerados
tan poco importantes o demasiado jóvenes para ser merecedores de ritos funerarios
completos, se podría esperar encontrar individuos que por lo menos alcanzaran los tres
meses de edad. Esta idea se ve complementada por una variedad de fuentes escritas que
hablan sobre el tema. Lo que sorprende a Faerman y col. (1998), es que la mayoría de
estudios concuerdan en que en esta época era mucho más común el infanticidio femenino
que el masculino, por lo que los resultados obtenidos irían en contra de la idea inicial deque la mayoría de los restos pertenecerían a niñas. Existen varias referencias a la
utilización de los baños, como el excavados en este caso y que probablemente fueran
privados, como burdeles. Además en este caso parecen estar situados en lo que los
autores denominan “el barrio rojo” de Ashkelon, por lo que su doble propósito parece
confirmado. Todo lo anterior los lleva a concluir que probablemente los individuos
infantiles sean hijos no deseados de las cortesanas que servían en estos baños. Esta
explicación no sólo confirmaría el uso de este tipo de establecimientos como burdelessino que, a su vez, explicaría la predominancia de individuos infantiles masculinos. A
pesar de que ambos sexos eran reclutados para trabajar como prostitutos en el mundo
bisexual romano, las hembras tendrían mayor demanda. Por eso proponen que las
prostitutas de Ashkelon se quedaran selectivamente con algunos de sus hijos ilegítimos,
la mayoría niñas, para continuar con la profesión y que descartaran a otros (Faerman et
al., 1998).
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Existe un estudio similar a éste realizado en el Reino Unido (Mays and Faerman,
2001), cuyo objetivo inicial era confirmar la hipótesis sobre el infanticidio femenino, que se
basaba en las fuentes y en la diferencia de enterramientos femeninos y masculinos
adultos. Datos combinados de unos 2400 enterramientos adultos revelaban unaproporción de 1.46:1 a favor de los varones. Sin embargo, una vez más los resultados no
fueron los esperados por lo que se hizo necesario un replanteamiento de las
interpretaciones dadas. En el registro arqueológico se ha identificado el infanticidio
cuando se observa un pico importante en los individuos muertos muy cerca del final del
periodo de gestación, ya que si las muertes se debieran exclusivamente a causas
naturales, las edades de los individuos serían más variadas sin picos tan significativos
alrededor del nacimiento. En el caso de Gran Bretaña se dan estos picos durante laépoca romana, pero la curva de la edad de la muerte se dispersa en la época medieval,
por lo que se plantea el infanticidio como explicación a este cambio en la distribución.
Los restos que se utilizaron provenían de dos enterramientos romano-británicos,
Ancaster, Lincolnshire y Thistleton, Rutland. Los dos forman parte de un conjunto de
yacimientos que han sido estudiados y en los cuales la distribución de la edad de muerte
sugiere infanticidio. Se obtuvieron huesos de 31 individuos, 12 de Ancaster y 18 deThistleton, a los que en primera instancia se les midieron los huesos largos para estimar
la edad de la muerte. En este caso el estudio se hizo también mediante la amplificación
de los alelos de la amelogenina en el cromosoma X y del Y. De los 31 individuos
estudiados se obtuvieron resultados para 13, seis de Ancaster y siete de Thistleton, de los
cuales nueve especímenes fueron identificados como varones y cuatro como hembras.
Cabe resaltar que se detecto una preferencia para la amplificación del alelo del
cromosoma Y, por lo que se hizo necesario usar otros primers, que amplificaranfragmentos más pequeños, para que no se diera un sesgo hacia los individuos
masculinos y se pudiera amplificar el alelo X, incluso de muestras con un peor estado de
conservación, y no se quedaran fuera estos individuos femeninos. Las edades de los
individuos sobre los que se obtuvieron resultados, estaría alrededor de 38-41 semanas, lo
que corresponde con el final del periodo de gestación. La proporción de los sexos de este
estudio sería de 2.25:1 en favor de los varones. Como consecuencia del pequeño número
de individuos que fue posible sexar, esta proporción no difiere de manera significativa deaquella presente en las proporciones de neonatos naturales 1.05:1. Estos resultados, por
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tanto no respaldan la hipótesis de un exceso de muertes femeninas perinatales; pero los
resultados no son concluyentes debido al bajo éxito de las amplificaciones,
probablemente por una pobre conservación del ADN en las muestras (Mays and Faerman,
2001).
Otro ejemplo de aplicaciones históricas a los estudios del sexo genético de los
individuos es el presentado por De La Cruz y col. (2008) sobre los niños sacrificados a los
antiguos dioses aztecas de Tlatelolco. El ritual de sacrificio de niños a los antiguos dioses
aztecas de la lluvia está documentado por los cronistas españoles del siglo XVI. Sin
embargo, poca evidencia arqueológica al respecto había estado disponible hasta que se
realizaron las excavaciones del Templo Mayor de Tenochtitlán y en Tlatelolco, dos
ciudades fundadas en dos isletas vecinas en el Lago de Tezcoco, y cuyas ruinas seencuentran hoy en día en la mitad de Ciudad de México. En las excavaciones recientes
del templo R (1428-67 d.C.) se recuperaron los restos de 37 subadultos y seis adultos,
acompañados por diversos objetos de valor. En su conjunto representan evidencia de una
ofrenda de sacrificio en una sola ceremonia y cuyos restos fueron depositados con gran
cuidado y orden. Diecisiete individuos infantiles y un adulto fueron enterrados en urnas
cerámicas globulares, mientras que el resto fueron enterrados directamente en el suelo.
La identificación del sexo de las víctimas de los sacrificios puede contribuir a un mejorentendimientos de estas ceremonias.
La muestra estaba compuesta por 43 individuos, 37 subadultos y 6 adultos,
encontrados bajo la plataforma del templo R en el centro ceremonial de Tlatelolco. La
mayoría de los esqueletos subadultos se encontraban bastante bien conservados, sólo
encontrándose cuatro en estado fragmentario. Sin embargo, los esqueletos adultos se
encontraban bastante fragmentados quizás como consecuencia de un desmembramientode los cuerpos. Como controles positivos se utilizaron restos arqueológicos cuyo sexo
había podido ser determinado de manera fiable, mediante la utilización de criterios
morfológicos. La edad de los individuos se determinó con base en el desarrollo dental
según Ubelaker (1989). Las extracciones se hicieron a partir de las costillas, utilizando el
hueso completo, excepto en los casos en los que las costillas se encontraban rotas en los
que se hizo un corte a más o menos un centímetro de la fractura y descartando este
pedazo. En algunos casos también se realizaron extracciones a partir de los arcosneurales de las vértebras. La amplificación fue, una vez más, de los alelos del gen de la
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amelogenina. También se realizaron análisis de algunos SNPs del cromosoma Y, aquellos
que definían los haplogrupos del cromosoma Y Q-M242 y Q-M3 (De La Cruz et al., 2008).
Las edades de los individuos fue estimada utilizando análisis morfométricos
estándares, siendo la mayoría de los subadultos (66%) niños de hasta tres años. Seobtuvo ADN amplificable de 32 de los 37 subadultos y de los 6 adultos de Tlatelolco.
Inicialmente todos fueron identificados como masculinos por la presencia del amplicon del
cromosoma Y. Sin embargo, sólo se pudieron replicar los resultado en 26 individuos. En
las replicaciones que se hicieron en un segundo laboratorio sólo hubo una contradicción
en los resultados, que los autores atribuyen a la pérdida de un alelo en este caso
concreto. La alta proporción de éxito (60%) es atribuida a la buena preservación de los
restos esqueléticos de ese yacimiento arqueológico en particular y a los diversos métodosutilizados para la extracción del ADN (De La Cruz et al., 2008).
En la tradición azteca, Tlaloc era el principal dios de la lluvia y era ayudado por un
grupo de dioses con pequeños cuerpos, colectivamente conocidos como los Tlaloque. Se
creía que estos pequeños dioses vivían en las colinas y montañas y que controlaban la
lluvia (Román, 1990). Ehecatl-Quetzalcoatl, el dios azteca de la lluvia, era considerado
parte de los Tlaloque y servía como aquel que soplaba los obstáculos del camino parahacer camino para la lluvia. El culto dedicado a Ehecatl-Quetzalcoatl como un dios de la
lluvia y las características especiales de ofrenda masiva encontradas en este templo
llevaron a plantear la hipótesis de que este complejo ceremonial fuera el lugar de una
ceremonia extraordinaria llevada a cabo durante la gran hambruna de 1454-57 d.C., una
fecha consistente con la fundación de este templo (Guilliem, 1999). Considerando que los
Tlaloque también eran patrones de varias enfermedades, se ha propuesto que los aztecas
creían que los propios dioses elegían a estos niños para los sacrificios, siendo estaelección manifestada por los síntomas de las enfermedades que presentaban los niños.
Análisis osteopatológicos y de patologías dentales de los niños sacrificados en
Tenochtitlán y Tlatelolco muestran que muchos de ellos se encontraban en condiciones de
salud precarias. Sin embargo, no se han hecho comparaciones cuantitativas entre las
patologías encontradas en estos individuos y aquellas presentes en la población en
general (De La Cruz et al., 2008).
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Según Broda (1971), las víctimas escogidas para los sacrificios en los antiguos
rituales aztecas se convertían en la personificación viva del dios a quien eran ofrecidas.
En el caso de los Tlateloque, los niños eran frecuentemente seleccionados para
personificar estas pequeñas deidades. También se ha propuesto que los niños eranescogidos como víctimas de los sacrificios porque su juventud les daba una pureza
propicia para comunicarse con los dioses y obtener su favor (López Austin, 1984). Los
resultados de este estudio tienden a apoyar la postura de Broda porque, partiendo de que
Ehecatl-Quetzalcoatl era una deidad masculina, las víctimas masculinas personificarían
mejor al dios que las femeninas. Por ende, los resultados de los estudios morfológicos y
moleculares presentados en el trabajo de De La Cruz y col. (2008) apoyan la
interpretación arqueológica de la ceremonia llevada a cabo en el templo dedicado aEhecatl-Quetzalcoatl en Tlatelolco.
Un tercer caso de aplicación histórica de los estudios de ADN antiguo sería el
presentado por Dudar y col. (2003), en el que se recupero ADN de un cementerio de
pioneros canadienses del siglo XIX. Los genotipos obtenidos se usaron para inferir las
relaciones de parentesco. Estos resultados son relacionados con la información obtenida
de las prácticas mortuorias y los registros históricos para sustentar las conclusiones sobreesta sociedad en particular. Dentro de los estudios de ADN antiguo se encuentra el
potencial de establecer definitivamente genotipos individuales y, por tanto, determinar
posibles prácticas de enterramiento relacionadas con el parentesco, siendo un ejemplo de
esto el caso de los Romanov, la antigua familia imperial rusa. Sin embargo, si se pretende
hacer una contribución significativa a un entendimiento más amplio de la historia de las
poblaciones, las investigaciones sobre ADN antiguo deben ir más allá de las relaciones
biológicas individuales para incluir sistemas de parentesco de las poblaciones del pasado.El trabajo sobre los pioneros canadienses, es una investigación preliminar sobre la
eficacia de los análisis de ADN antiguo para determinar un sistema de parentesco dentro
del registro arqueológico. Para ello se utilizan aproximaciones estadísticas provenientes
de las teorías del parentesco convencionales y de las ciencias forenses (Wenk et al.,
1996, Allen et al., 1998). El ADN recuperado de las muestras de huesos y dientes fueron
sometidas al análisis del ADNmt y de distintos STRs para determinar los genotipos que
permitieran calcular la probabilidad de parentesco matrilineal por azar (PrMKBC por sussiglas en inglés) y un índice de parentesco (IK por sus siglas en inglés). El sistema de
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parentesco de esta sociedad se infiere mediante la integración de las relaciones
biológicas putativas con la cultura material arqueológica, los registros históricos y otras
fuentes etnohistóricas de información (Dudar et al., 2003).
Los restos provienen del cementerio de Harmony Road en Toronto y se componende 38 individuos: 27 adultos jóvenes, adultos y seniles (15 varones y 12 hembras, seis
sub-adultos de menos de 18 años y cinco infantiles que murieron antes del primer año.
Las fechas estimadas para la utilización de este cementerio, están entre 1827 y 1850,
para 7 individuos, 1850 y 1878, 16 individuos, y 1878 y 1900 (12 individuos). También se
consulto un inventario del cementerio que incluye 117 enterramientos con 38 apellidos, de
los cuales 11 representan familias multiregionales. Para establecer los haplotipos
mitocondriales y una base de datos de frecuencias alélicas de los STRs se utilizaronmuestras provenientes del cementerio de la iglesia anglicana de St. Thomas, Belleville,
Ontario, que estuvo en uso desde 1821 hasta 1874 (Dudar et al., 2003).
También se realizó la determinación del sexo genético para contribuir a la
identificación individual mediante la comparación con documentación histórica de los
enterramientos. Además se hizo la amplificación de la región hipervariable II del ADNmt,
así como el polimorfismo del gen de la tirosina hidroxilasa humana (HUMTH01), unarepetición en tándem de cuatro nucleotidos (AATG). También se aplicaron sistemas
comerciales de tipado multiplex para amplificar seis loci STR. Unificando los datos de
estos análisis fue posible generar 45 perfiles únicos de ADN antiguo, con coherencia
filogenética. Algunas de las conclusiones que se proponen es que el sistema de
parentesco tiene una residencia patrilocal, lo que explicaría el comportamiento de los
linajes mitocondriales, y aunque se intento apoyar esta hipótesis con los resultados
obtenidos de los STRs, estos eran demasiado escasos como para proponer cualquieropción de manera concluyente.
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10. Posibilidades en el Archipiélago Canario
Una vez planteados algunos ejemplos sobre la gran utilidad de los estudios de ADN
antiguo para la interpretación histórica, se propondrán algunas de las posibles vías deinvestigación en las Islas Canarias. Se trata de algunas cuestiones que se han ido
trabajando desde diversas perspectivas y disciplinas y en las cuales la biología molecular
puede hacer una aportación fundamental. Para ello se propondrán cuatros ejemplos de
cuestiones históricas del archipiélago, para las cuales la identificación del sexo genético
sería un gran avance en la comprensión de estos procesos.
El primero hace referencia a la cuestión del infanticidio en Gran Canaria, como unsistema de control de la natalidad. Sobre este asunto hay varias informaciones
etnohistóricas y algunos datos arqueológicos, en especial los encontrados en el
yacimiento de Cendro, Telde, un asentamiento troglodita del Guanartemato de Telde
(Cuenca Sanabria J., 1996). Las fuentes etnohistóricas hacen referencia a la práctica del
infanticidio por parte de los aborígenes canarios, como medida drástica para controlar la
natalidad en momentos de carestía alimenticia, que en ocasiones se ha justificado en la
insularidad y por ende en la limitación de los recursos. Las excavaciones del yacimientode cendro se iniciaron en 1983 y que se continuaron por varios años. El asentamiento de
Cendro haría parte junto con Tara y Caserones del complejo conocido como Telde en
fuentes históricas, como los escritos de Torriani y sus mapas.
A mediados del siglo XV la isla de Gran Canaria fue víctima de un periodo de gran
inestabilidad, en el que se sucedieron guerras, epidemias y una alta mortalidad, que
produciría casi 30 años de inestabilidad social y económica, agravada por una hambrunageneralizada, consecuencia de los años de luchas. Una de las soluciones que presentaría
el consejo de guerra aborigen, o Sabor, sería la adopción de la medida conocida como el
“Estatuto de matar niñas”. Algunos autores sitúan este hecho en torno a la segunda mitad
del siglo XV, aunque también puede haberse producido después de intensificarse la
guerra tras la caída de la colonia europea de Telde en 1473 (Cuenca Sanabria J., 1996).
Varias fuentes hacen referencia a este fenómeno, aunque no se ponen de acuerdo en
cuanto al tiempo en el que este tipo de medidas se mantuvieron vigentes, así como si sólose aplicaban a las hembras o a todos los niños por igual:
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“Había en esta isla muchos hombres, y muchas más mujeres, que se dice juntarse
catorce mil hombres. Y viendo cómo iban en crecimiento, y los mantenimientos les
faltaban y no se cogían frutos que bastasen a su sustento, por no vivir en estrechura,
entrando en consulta y congregación, que llamaban sabor, acordaron y hicieron un
estatuto que se matasen todas las hembras que de allí adelante naciesen, con tal que no
fuesen los primeros partos que las mujeres hacían (porque a tales vientres reservaban
para su conservación), y así supliesen los frutos que la tierra produjese, y no les faltasen,
como había sucedido años atrás. Este estatuto y ordenanza duró poco años, porque fue
Dios servido dar en esta isla una grave enfermedad, en que de tres partes de la gente
faltaron las dos” (Abreu Galindo, 1977).
“Pocos años antes de que la isla de Canaria fuese conquistada, bien por fecunda
influencia del cielo o por vivir la gente con salud por espacio de muchos años, seguían
naciendo sin que os acompañasen en igual cantidad las defunciones. De este modo,
creció la gente en tanta cantidad, que ya no bastaban las cosechas para su manutención,
y empezaron a padecer carestía, a tal punto, que, obligados por la necesidad, para que
no perecieran todos, hicieron una ley inhumana, que matasen todos los hijos después de
primer parto; en cuya crueldad sólo fueron iguales a sí mismo.” (Torriani, 1959).
Algunos de los materiales más relevantes de las excavaciones de Cendro serán los
restos antropológicos. En primer lugar porque se trata de huesos de recién nacidos y de
neonatos, que no son demasiado comunes en los yacimientos del archipiélago. En
segundo lugar porque parte de estos individuos se encontraban depositados en el interior
de vasijas cerámicas y rodeados de una gran cantidad de fragmentos óseos animales,
cerámicos y algunas piezas líticas. Para J. Cuenca y col (1996) estos restos seríanevidencias en favor de la hipótesis sobre el infanticidio. Los posibles análisis para la
determinación del sexo en restos de los que autores como Cuenca denominan
“Horizontes de infanticidio”(1996), pueden resultar claves para intentar comprender este
tipo de procesos históricos.
Los estudios de biología molecular también pueden significar una salto cualitativo
importante en el camino de reconstrucción de los modos de vida de las poblaciones delpasado, como los aborígenes canarios. Un ejemplo de esto es el estudio sobre restos de
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la Gomera que se ha mencionado en apartados anteriores (Arnay-De-La-Rosa et al.,
2009). En éste se ve como la determinación del sexo, entre otras aplicaciones de los
estudios genéticos, ayuda por un lado a confirmar los datos obtenidos de los análisis
antropológicos y por el otro permite responder a preguntas sobre las diferencias de
género en estas sociedades. En este estudio en particular parece no haber una diferenciamarcada entre la alimentación de hombres y mujeres. Sin embargo, al no contarse con
resultados de un gran número de individuos, estas conclusiones resultan de momento
provisionales. Es por ello que este sería un camino de estudio viable en el resto del
archipiélago; la comparación de las condiciones generales de vida, nutrición, patologías,
etc. con el sexo determinado con el ADN antiguo pueden dar una nueva posibilidad de
enfocar este tipo de estudios, teniendo en cuenta el componente de género en nuestra
comprensión de las sociedades pre-hispánicas canarias.
Las poblaciones aborígenes canarias resultan particulares en muchas cuestiones
con respecto a otras poblaciones, tanto del norte de África como de la Península Ibérica.
Es por ello, que en muchas ocasiones resulta difícil aplicar los mismos criterios sobre todo
en lo que respecta a cuestiones antropológicas. Las funciones discriminantes resultan
muy útiles para identificar el sexo de restos humanos incompletos, lo que permite estudios
de paleodemografía al contar con una muestra mucho mayor clasificada. El problema deesta metodología es que su efectividad depende de cada población, por lo que la
tendencia es a realizar y utilizar funciones construidas a partir de poblaciones lo más
cercanas posibles a la población estudiada. Por ello resulta fundamental dar continuidad a
estudios como los realizados por Arnay y col. (2007), en donde se utilizan los análisis de
ADN antiguo para poner a punto funciones discriminantes específicas de la población
canaria. En este ejemplo se utilizaron sólo las mandíbulas, pero los resultados positivos
obtenidos permiten pensar en que este sistema puede ser igualmente útil con funcionesde otras regiones anatómicas.
La incorporación de los análisis de genética molecular en el archipiélago canario,
no se restringen al estudio de los restos aborígenes. Dentro de la denominada
“arqueología histórica” también tienen un amplio rango de posibilidades, ya que en estos
casos los restos suelen aparecer en un mal estado de conservación, lo que dificulta la
observación macroscópica para la determinación del sexo. Esta aplicación se podríaplantear desde dos enfoques diferentes, pero complementarios. El primero se centraría en
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el estudio de la niñez. En investigaciones recientes sobre la infancia durante la Edad
Moderna en el archipiélago (Ramos Pérez, 2009), se han podido entrever particularidades
en los modos de vida de este grupo frente a los adultos. Sin embargo, debido a la
dificultad para determinar el sexo de los individuos infantiles, no se ha podido precisar si
estas diferencias tienen además un componente de género. Es en este tipo de preguntases donde la biología molecular puede resultar fundamental, ya que permitiría una
clasificación de los individuos según su género, lo que haría posible una comparación
entre ambos grupos.
El segundo enfoque se vincularía con los estudios que se han realizado sobre los
modos de vida de las poblaciones de la Edad Moderna, como el que se hizo con los
restos excavados en la Iglesia de La Concepción, en Santa Cruz de Tenerife (Arnay de laRosa, 2009). Este caso sería un ejemplo de como el estudio de cuestiones
paleonutricionales, mediante análisis de oligoelementos o de isótopos estables, puede
verse beneficiado de la aplicación de la determinación del sexo genético. En este caso
sirvió para corroborar que no hay diferencias significativas entre los resultados
paleonutricionales de hombres y mujeres. Aún si las hubiera, la relación entre los dos
resultados, lleva a plantearse preguntas que deben intentar responderse desde la
interpretación histórica. La importancia de los estudios de ADN antiguo en este tipo decasos es que llevan a plantear hipótesis que de otra manera quizás ni siquiera se tendrían
en consideración.
Aunque estos son algunos ejemplos puntuales, parece bastante claro que las
posibilidades de compaginar los estudios de ADN antiguo en general, y la determinación
del sexo genético en particular, a las investigaciones históricas en Canarias puede
significar un avance importante sobre las preguntas que se pueden llegar a plantear y,quizás, a responder.
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11. Propuesta Metodológica: Posibles enfoques de los estudios de ADN antiguo en
Canarias.
Una vez comprendido el estado de la cuestión de los estudios de ADN antiguo,tanto a nivel general como en el contexto del archipiélago canario, se plantean algunas de
las posibles opciones a seguir en esta disciplina.
Teniendo en cuenta los trabajos arqueológicos que se están realizando en la
actualidad, sobre todo en la isla de Gran Canaria, se puede llegar a pensar en la
posibilidad de analizar series más amplias. En el caso de restos aborígenes aquellos
provenientes de la necrópolis de Maspalomas resultan verdaderamente interesantes. Alser parte de un mismo yacimiento arqueológico se pueden proponer investigaciones que
pretendan establecer posibles relaciones genéticas entre los distintos individuos, así como
las similitudes y diferencias de los comportamientos y tratamientos, tanto antemortem
como postmortem, según el sexo de los individuos. También se están realizando
excavaciones de “arqueología histórica” que permitirían ampliar los datos obtenidos de
investigaciones anteriores, como los de la Iglesia de La Concepción, y compararlos entre
sí para estudiar las posibles similitudes y diferencias.
Una segunda propuesta, que podría llevarse a cabo con el material disponible en el
presente, es de carácter más metodológico. Se trataría de intentar comparar la
preservación del ADN en restos recién excavados con aquellos que llevan almacenados
varios años. Aunque ya existen algunos estudios de este tipo (Sampietro et al., 2006), en
este caso resultaría particularmente interesante porque serían restos provenientes del
mismo yacimiento, por lo que las demás condiciones serían las mismas y se podríaestablecer realmente una comparación entre muestras cuya única diferencia sería el
tiempo que ha transcurrido desde el momento de su excavación. La diferencia entre
ambas situaciones ha sido comentada en numerosas ocasiones, ya que parece ser un
factor determinante en la posibilidad de que se conserven moléculas de ADN endógeno
en restos antiguos. De llevarse a cabo, este estudio permitiría de alguna manera
cuantificar el peso específico de este factor y por tanto valorar mejor las posibilidades de
obtener resultados positivos en determinadas muestras.
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En cuanto al tipo de análisis sobre las muestras, las posibilidades son muy
diversas. Sin embargo, existen kits que permiten el análisis de varios marcadores a la vez
que posibilitarían obtener perfiles bastante amplios de los individuos estudiados. Se debe
enfatizar en que cuando se diseñen los experimentos se incluyan marcadores sexuales
como la amelogenina, porque aunque no siempre la determinación del sexo sea el centrode la investigación, se ha demostrado de manera bastante contundente a lo largo de este
trabajo, las ventajas que esta información puede tener para los historiadores. Teniendo en
cuenta que en la mayoría de las ocasiones incluir este marcador no implica un aumento
significativo en la dificultad de los análisis, parece ser que la relación coste beneficio
justifica el que se tenga en cuenta.
Como complemento a estos marcadores, y considerando los avances de losúltimos años, resultaría interesante intentar aplicar algunas de las técnicas más recientes.
Es por eso que se propone comprobar e incluso mejorar los resultados obtenidos con
marcadores como la amelogenina, en su aplicación más tradicional, con los obtenidos
mediante el uso de SNPs tanto de este gen como de otros relacionados con los
cromosomas sexuales. Esto permitiría que algunas muestras más degradadas puedan dar
resultados positivos, lo que ampliaría el tamaño la muestra, y por lo tanto la fiabilidad de
las relaciones y conclusiones obtenidas a partir de ésta. Esto también puede sercomplementado con la aplicación de marcadores específicos del cromosoma Y, que
sustenten y autentifiquen los resultados de otros marcadores. Partiendo de los grandes
problemas que presenta el ADN antiguo se hace patente que todas estas propuestas son
necesarias para verificar los resultados obtenidos, dando así mayor credibilidad a este
tipo de estudios.
Una última cuestión fundamental en el futuro de los estudios de ADN antiguo en elarchipiélago canario, es su integración dentro de un discurso histórico más amplio. Este
planteamiento supone que, más allá de los retos técnicos y metodológicos que suponen
este tipo de estudios, y cuya superación ya es un mérito en sí mismo, los resultados
obtenidos estarán incompletos si no se incorporan dentro de una interpretación histórica.
Antes de acometer estudios de este tipo, se deben plantear unas hipótesis y objetivos de
carácter histórico para los que la biología molecular pueda ayudar a dar respuesta. En
esa medida las posibilidades de futuro del ADN antiguo en Canarias son muy elevadas.Primero porque se están presentando oportunidades de estudios con materiales mejor
contextualizados que aquellos de los que se ha podido disponer hasta el momento. En
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segundo lugar, porque existe un banco de resultados que se han obtenido de diversos
análisis y que se encuentran a la espera de ser interpretados e introducidos dentro de una
discurso histórico que nos acerque a la comprensión de las sociedades que habitaron las
islas en el pasado. Sólo si se consigue este objetivo, se podrá realmente hablar de
interdisciplinariedad, porque si no se seguirá fallando en una verdadera articulación de lasdiferentes disciplinas y seguirá trabajando cada uno por su lado.
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12. Conclusiones
- Cuando se analizan las características de los estudios de ADN antiguo se pueden ver
claramente todas las dificultades que conllevan, pero a su vez es posible vislumbrarcomo, en multitud de casos, éstas son superadas por los investigadores. Siendo una
disciplina con múltiples complicaciones teóricas, técnicas y metodológicas, los intentos
que en estos estudios se emprenden no resultan inútiles ya que en el caso de obtener
resultados positivos, los datos obtenidos son de gran valor.
- Los resultados que pueden llegar a dar este tipo de estudios, permiten a los
investigadores plantearse preguntas que en otros momentos resultaban impensables.Sin embargo, como demuestra el camino recorrido desde las primeras publicaciones
sobre estos temas, la prudencia debe ser una máxima, ya que las posibilidades de
errores son muy altas. Las implicaciones de estas afirmaciones erróneas pueden ser de
gran envergadura por lo que se debe intentar utilizar todos los mecanismos de
verificación, para garantizar, en la medida de lo posible, la veracidad de los resultados.
- A pesar de las grandes dificultades planteadas por el análisis de muestras de lascaracterísticas aquí planteadas, un repaso por las últimas investigaciones pone de
manifiesto que muchas de ellas se han ido subsanando. Las posibilidades son muy
variadas y la elección de unas sobre otras debe determinarse de acuerdo a las
características específicas de cada investigación. A su vez podemos llegar a pensar que
los avances en los próximos años traerán solución a los problemas no resueltos o
perfeccionarán las ya existentes.
- Una vez analizados los estudios de ADN antiguo queda patente la necesidad de una
verdadera interdisciplinariedad. Ésta implica que los investigadores de las distintas áreas
implicadas establezcan verdaderos canales de comunicación. Se debe partir de la
construcción de un lenguaje común que permita a los investigadores establecer unos
canales de comunicación y unos objetivos conjuntos, para cuya consecución cada uno
aporte distintos enfoques desde sus propias áreas de conocimiento. Debe haber un
verdadero interés por los conocimientos aportados por otros, porque sólocomprendiéndolos es posible integrarlos dentro del propio trabajo. Para ello es
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indispensable una formación mínima en las distintas áreas que permita el entendimiento
mutuo.
- El trabajo conjunto y el diálogo constante entre los diferentes implicados en el proceso
de investigación, arqueólogos, antropólogos, biólogos, etc. resulta fundamental para
garantizar el éxito de los análisis. Problemas particulares de este tipo de muestras,pueden ser subsanados con relativa facilidad si realmente existe una colaboración por
parte de todos los investigadores. Esto ayudará a evitar problemas que puedan poner en
juego los resultados de las diferentes disciplinas implicadas.
- Siendo conscientes de la limitación del material disponible para el estudio de ADN
antiguo, se hace indispensable un uso responsable del mismo. Es por ello que este tipo
de investigaciones deberían estar guiadas por preguntas inmersas dentro de un discursohistórico. De otro modo se harán gran cantidad de análisis que agotaran las muestras
disponibles pero cuyos resultados no aportarán una información relevante para entender
los procesos históricos en los que estos individuos se vieron inmersos.
- Se puede decir que los estudios de ADN antiguo plantean una nueva perspectiva para
diversas preguntas históricas. En ocasiones como complemento y afirmación de
hipótesis existentes y, en otras, planteando dudas sobre interpretaciones que parecíanclaras, lo que puede conllevar al replanteamiento de las mismas.
- Por último, queda patente que son más las preguntas planteadas que las respuestas.
¿Hasta qué punto los estudios de ADN antiguo son fiables? y si lo son, ¿Hasta donde
pueden ser útiles para responder preguntas históricas? o ¿Qué tipo de respuestas nos
pueden dar?¿Son estas de interpretación unívoca a la hora de introducirlas dentro de un
discurso histórico?. Éstas son sólo algunas de las dudas que quedan expuestas y a lasque se debería intentar dar respuesta en investigaciones posteriores.
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