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TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS José Luis Pech-Pacheco

IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddee ppaarrttííccuullaass

bbiiooggéénniiccaass

C E N T R O D E I N V E S T I G A C I Ó N C I E N T I F I C A Y E D U C A C I Ó N S U P E R I O R D E E N S E N A D A

Identificación de partículas biogénicas

CICESE Km 107 carretera Ensenada-Tijuana, Baja California, México

Email: [email protected]

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS

Resumen

Resumen de la tesis de JOSÉ LUIS PECH PACHECO, presentada como requisito parcial, para la obtención del grado de DOCTOR EN CIENCIAS en ECOLOGÍA MARINA, Ensenada, Baja California, México Diciembre de 1998.

IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddee PPaarrttííccuullaass BBiiooggéénniiccaass

Resumen aprobado por:

Dr. Josué Álvarez Borrego

Director de Tesis

Se describe el desarrollo e implementación de la técnica híbrida óptico-digital para la identificación automatizada de partículas biogénicas. Se menciona la importancia del uso de las partículas biogénicas, las cuales son usadas para caracterizar una condición ecológica. Se describen las técnicas que son principalmente usadas para la identificación de las especies de fitoplancton siendo éstas el conteo indirecto y el conteo directo que es el más confiable. Se dan los fundamentos teóricos de la transformada de Fourier, Mellin, la conversión de las coordenadas cartesianas a polares, la implementación del filtro holográfico tipo Vander Lugt y la correlación, los cuales son los pasos del sistema óptico-digital. Se describe detalladamente la realización experimental tanto del proceso digital (algoritmos computacionales) como del proceso óptico. Se dan a conocer los resultados obtenidos en el desarrollo de esta técnica en donde se observa su aplicación en la identificación de especies fitoplanctónicas. Se concluye que los logros alcanzados tanto en la parte digital como en la parte óptica son satisfactorios para implementar un sistema de identificación automatizada de partículas biogénicas. Los problemas de ruido de fondo (detritus, burbujas, intensidad luminosa del microscopio y fragmentos de organismos de otra especie), posición de sedimentación, variación morfológica natural, fragmentación de las células, posición, rotación y escala de la célula en la imagen; no modifican los resultados de una correcta identificación de la especie de interés, por lo tanto el sistema desarrollado presenta ventajas sobre los sistemas de identificación que actualmente se usan que no son invariantes a estos problemas.

Palabras claves: Partículas, Identificación. Automatizada, Digital, Óptico.


Abstract of the thesis of JOSÉ LUIS PECH PACHECO, presented as partial requirement to obtain the DOCTOR IN SCIENCES grade in MARINE ECOLOGY, Ensenada, Baja California, México December 1998.

BBiiooggeenniicc PPaarrttiicclleess iiddeennttiiffiiccaattiioonn

Abstract

The development and implementation of the optical-digital hybrid technique for the automated biogenic particles identification is described. The importance of the use of the biogenic particles, those which are used to characterize an ecological condition is mentioned. The techniques that they are mainly used for the identification of the species of phytoplankton being these the indirect count and the direct count that it is the most reliable are described. The theoretical bases of the transformed of Fourier-Mellin, the conversion of the cartesian coordinates to polar, the implementation of the holographic filter Vander Lugt type and the correlation are given, those which are the steps of the optical-digital system. In detail the experimental accomplishment so much of the digital process (algorithms) as of the optical process is described. The results obtained in the development from this technique in which is observed its application in the identification of species of the phytoplankton are given. It is concluded that the reached achievements in the digital part as well as in the optical part are satisfactory to implement an automated identification system of biogenic particles. The background noise problems (detritus, bubbles, luminous intensity of the microscope and fragments of other species), sedimentation position, variation morphologic natural, fragmentation of the cells, position, rotation and scale of the cell in the image; they do not modify the results of a correct identification of the kind of interest, therefore the developed system presents advantages on the identification systems that currently are used that they are not invariant to these problems. Key words: Particles, Identification. Automated, Digital, Optic.


Dedicatoria

A Dios

Padre, Hijo y Espíritu Santo

Los cuales guían mis pasos.

A mi Padre Don Luis Pech Canché

Gracias por tu tiempo y tu paciencia papá.

A mi Familia

Francisco, Noemí, Raquel, Cynthia, Noemí y Francisco

Por su amor incondicional y su apoyo en las caídas.

A mi Padre Científico Josué Álvarez Borrego

Por enseñarme la palabra “FE”

A mis hermanos Cristianos

Por el apoyo incondicional.

Todo lo puedo en Cristo que me fortalece


Agradecimientos

Se agradece al Conacyt por el apoyo económico durante el doctorado.

Se agradece al CICESE por el apoyo a la realización de esta tesis doctoral, además por la ayuda económica de la beca de asistente de investigador.

Se agradece a la Dra. Elizabeth Orellana-Cepeda por la educación científica que me dió.

Se agradece al Ocean. Octavio Meillon Menchaca por el apoyo en los trabajos de fotografía.

Se agradece a Ocean. Miguel Farfán, por la asesoría en la parte de holografía.

Se agradece al Lic. Carlos Famozo por la ayuda en la programación.

Se agradece al M. en C. Roberto Cortés Altamirano por facilitar muestras de mareas rojas de la colección de mareas rojas del Instituto de Ciencias del Mar y Limnología de la Universidad Nacional Autónoma de México, estación Mazatlán, Sinaloa.

Se agradece al Dr. Oscar Sosa, al Dr. Jorge Rosales y al Dr. Jorge Casares por facilitar el sistema de captura digital de imágenes.

Se agradece al Téc. Bach. Noemí Salas García y al Ing. José María Domínguez por la ayuda en los dibujos.

Se agradece a la Téc. en Comp. Raquel Salas García por la ayuda en la elaboración de algunas partes de este manuscrito.

Se agradece a Gustavo Peinemann L., Jorge Avalos Álvarez, Antonio Mulina Lucero, Ádrian Vargas y Calor Aguiñaga por su colaboración en el proceso de imprenta.

Lic. Juan Antonio Peralta y Pedro Antonio Lereé Acevedo, por su apoyo en la computación.

Se agradece a todas las personas que de una forma motivaron la realización de esta tesis.

Al grupo COMPA UABC.


TABLA DE CONTENIDO

Capítulo I ...........................................................................................................................1

PARTÍCULAS BIOGÉNICAS .................................................................................... 1 I.1. Importancia del fitoplancton como partícula biogénica..............................................................................2 I.2. Usos de los organismos del fitoplancton ....................................................................................................3

I.2.1. Ecología y Biogeografía.................................................................................................................................3 I.2.2. Cambio climático global ................................................................................................................................3 I.2.3. Contaminación ..............................................................................................................................................3 I.2.4. Paleoecología.................................................................................................................................................4 I.2.5. Acuacultura...................................................................................................................................................4

I.3. Marea roja ..........................................................................................................................................................5

Capítulo II ..........................................................................................................................8

IDENTIFICACIÓN Y CONTEO DE ORGANISMOS DEL FITOPLANCTON........................................................................................................................................8

II.1. Métodos para caracterizar una muestra de fitoplancton.........................................................................9 II.2. Sistemas analizadores de imágenes aplicados a los organismos del plancton......................................9 II.3. Procesado óptico coherente. .......................................................................................................................10 II.4. Cálculo y significación estadística en el conteo de fitoplancton...........................................................12

Capítulo III.......................................................................................................................13

APLICACIÓN Y VENTAJAS DE LOS PATRONES DE DIFRACCIÓN EN LA IDENTIFICACIÓN AUTOMATIZADA DE ESPECIES FITOPLANCTÓNICAS............................................................................................ 13

III. 1. Introducción ................................................................................................................................................14 III.2. Metodología .................................................................................................................................................15

III.2.1 Especies analizadas del género Ceratium ..................................................................................................15 III.2.2. Digitalización de las imágenes ..................................................................................................................17 III.2.3. Procesado de imágenes .............................................................................................................................17 III.2.3.1. Problema de ruido de fondo...................................................................................................................17 III.2.3.2. Problemas intra-específicos...................................................................................................................17 III.2.3.3. Problemas inter-específicos...................................................................................................................18 III.2.3.4. Identificación de las especies usando células fragmentadas...................................................................18 III.2.3.5. Comparación de los fragmentos de las seis especies intra e inter-específicamente...............................18 III.2.3.6. Algoritmos usados y prueba estadística................................................................................................19

III.3. Resultados y discusiones...........................................................................................................................19 III.3.1. Problema del ruido de fondo.....................................................................................................................19 III.3.2. Problemas intra-específicos......................................................................................................................21 III.3.1. Problema en la posición de sedimentación de los organismos..................................................................21 III.3.2.2. Problemas de la variación natural morfológica.......................................................................................22 III.3.3. Problemas inter-específicos......................................................................................................................23 III.3.3.1. Discriminación de dos especies con 200 organismos de C. furca y C. dens .........................................23 III.3.3.2. Discriminación de seis especies del género Ceratium............................................................................25


III.3.4. Problemas con organismos fragmentados de las seis especies del género Ceratium.................................26 III.3.4.1. Condiciones de fragmentacion de las especies......................................................................................26 III.3.4.3. Problemas con las seis especies fragmentadas.......................................................................................29 III.3.4.3.1. Correlación de los seis casos de fragmentación ..................................................................................29 III.3.4.3.2. Fragmentos de las especies con significado biológico.........................................................................31

III.4. Conclusiones ................................................................................................................................................32

Capítulo IV.......................................................................................................................34

SISTEMA ÓPTICO-DIGITAL APLICADO A LA IDENTIFICACIÓN DE CINCO ESPECIES DE FITOPLANCTON ...........................................................34

IV.1. Introducción .................................................................................................................................................35 IV.2. Materiales y métodos..................................................................................................................................35 IV.3. Resultados ....................................................................................................................................................42 IV.4. Discusiones ..................................................................................................................................................48 IV.5. Conclusiones ................................................................................................................................................48

Capítulo V........................................................................................................................50

IDENTIFICACIÓN DE UNA ESPECIE FORMADORA DE MAREA ROJA EN UN SISTEMA ÓPTICO-DIGITAL AUTOMÁTICO .....................................50

V.1. Introducción...................................................................................................................................................51 V.2. Materiales y métodos ...................................................................................................................................51

V.2.1. Especies fitoplanctónicas ..........................................................................................................................51 V.2.2. Preparación de la muestra..........................................................................................................................52 V.2.3. Observación de la muestra en el microscopio...........................................................................................53 V.2.4. Captura de la imagen del organismo...........................................................................................................53 V.2.5. Procesamiento de identificación................................................................................................................54

V.3. Resultados y discusiones ............................................................................................................................57 V.3.1. Problema de rotación .................................................................................................................................58 V.3.2. Problema de variación de tamaño de la especie..........................................................................................59 V.3.3. Comparación del sistema de identificación de C. dens con otras especies de fitoplancton.......................59

V.4. Discusiones....................................................................................................................................................60 V.5. Conclusiones .................................................................................................................................................61

Capítulo VI.......................................................................................................................62

MONITOREO DE CERATIUM FURCA EN LA BAHÍA DE TODOS SANTOS, ENSENADA, B. C. ..................................................................................62

VI.1. Introducción .................................................................................................................................................63 VI.2. Justificación..................................................................................................................................................63 VI.3. Antecedentes ...............................................................................................................................................64 VI.4. Hipótesis .......................................................................................................................................................65 VI.5. Objetivo.........................................................................................................................................................66 VI.6. Método..........................................................................................................................................................66

VI.6.1. Área de estudio.........................................................................................................................................66 VI.6.2. Diseño del muestreo.................................................................................................................................67 VI.6.3. Muestreo de especies fitoplanctónicas ....................................................................................................68 VI.6.4. Análisis cualitativo y cuantitativo............................................................................................................68 VI.6.5. Interpretación Ecológica...........................................................................................................................68

VI.7. Resultados ....................................................................................................................................................68 VI.7.1. Datos analizados ......................................................................................................................................68 VI.7.2. Densidades encontradas ...........................................................................................................................70


VI.7.3. Comportamiento de la densidad con respecto a la marea.........................................................................70 VI.7.4. Comportamiento de la densidad con respecto a la temperatura...............................................................73 VI.7.5. Análisis del tiempo usado para la identificación y conteo .......................................................................74

VI.8. Discusiones ..................................................................................................................................................75 VI.9. Conclusiones ...............................................................................................................................................76

CAPÍTULO VII CONCLUSIONES GENERALES..............................................77 BIBLIOGRAFÍA.........................................................................................................78

Apéndice A ......................................................................................................................88

FILTROS HOLOGRÁFICOS ...................................................................................88 A.1. Material para grabar hologramas ..................................................................................................................88 A.2. Tipos del material de grabación del filtro .....................................................................................................89 A.3. Método de grabado para el filtro tipo Vander Lugt ......................................................................................90 A.4. Método de revelado......................................................................................................................................91 A.5. Técnicas de blanqueamiento de filtros..........................................................................................................91

Apéndice B.......................................................................................................................94

CATALOGO DE ESPECIES ESTUDIADAS .........................................................94 B.1 Especies fitoplanctonicas contempladas en este estudio.......................................................................95

B.2.1. Especies del género Ceratium ....................................................................................................................95 División: Dinophyta..............................................................................................................................................96 División: Dinophyta..............................................................................................................................................97 División: Dinophyta..............................................................................................................................................99 División: Dinophyta............................................................................................................................................101 División: Dinophyta............................................................................................................................................103 División: Dinophyta............................................................................................................................................105 B.2.1. Especies del género Prorocentrum ..........................................................................................................107 División: Dinophyta............................................................................................................................................107 División: Dinophyta............................................................................................................................................109 Familia:Prorocentracae .......................................................................................................................................109 División: Dinophyta............................................................................................................................................111 Familia:Prorocentracae .......................................................................................................................................112 B.2.1. Especies del género Dinophysis ...............................................................................................................113 División: Dinophyta............................................................................................................................................113 División: Dinophyta............................................................................................................................................115 División: Dinophyta............................................................................................................................................117


LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1.- Especies del subgénero Ceratium..................................................................15

Figura 3.2.- Especies del subgénero Tripoceratium..........................................................16

Figura 3.3.- Especie del subgénero Amphiceratium. ........................................................16

Figura 3.4.- Resultados del análisis con respecto al problema de fondo de la imagen. (a) condiciones de fondo, (b) dendrograma de imágenes y (c) dendrograma de patrones de difracción. ........................................................................................................................20

Figura 3.5.- Resultados del análisis del problema de sedimentación de los organismos. (a) condiciones de sedimentación de los organismos, (b) dendrograma de imágenes y (c) dendrograma de patrones de difracción. ...........................................................................21

Figura 3.6.- Resultados del análisis del problema de la variación natural de la morfología de las especies. Para C. furca : (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción; para C. dens: (c) dendrograma de imágenes y (d) dendrograma de patrones de difracción.....................................................................................................................22

Figura 3.7.- Resultados del análisis del problema inter-específicos de dos especies: C. furca y C. dens. (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción. ........................................................................................................................24

Figura 3.8.- Resultados del análisis del problema inter-específicos de seis especies. (a) especies contempladas y su nomenclatura, (b) dendrograma de imágenes y (c) dendrograma de patrones de difracción. ...........................................................................26

Figura 3.9.- Imágenes de cada fragmentación, según el caso. ...........................................26

Figura 3.10.- Resultados de la comparación intra-específicas de los cinco casos vs el original. (a) caso I, (b) caso II, (c) caso III, (d) casos IV y V. ..........................................28

Figura 3.11.- Resultados de la comparación intra e inter-específicas de los fragmentos de las seis especies. (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción. ........................................................................................................................30

Figura 3.12.- Resultados de la comparación intra e inter-específicas de los fragmentos de las seis especies que presentan un significado biológico. (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción. .....................................................................32

Figura 4.1.- Diagrama de flujo que presenta los ocho pasos para la correlación invariante a ubicación, rotación y escala. ..........................................................................................38

Página


Figura 4.2.- Especies del género Ceratium. Procesamiento de cada filtro óptico para cada especie. (i) imagen binaria, (ii) módulo de la transformada de Fourier correspondiente a la imagen binaria; (iii) transformada polar de las coordenada del módulo (ii); (iv) similar como en (iii), pero con theta vs ln(r). (v) transformada de Mellin de las imágenes (a-e).41

Figura 4.3.- Sistema interferómetro modificado por Rayleigh para generar filtros holográficos. La luz es un láser Helio-Neón (He-Ne) [ Lentes: L1, L2, L3; longitud focal f ; x1, y1, x2, y2, representan las coordenadas del plano de entrada y plano del filtro respectivamente]. .............................................................................................................41

Figura 4.4.- Sistema de correlación óptico coherente (CCD “charger coupled divice”; las demás simbologías son similares a la figura 4.3)..............................................................42

Figura 4.5.- Dendrogramas de imágenes de Ceratium furca (a) y de los patrones de difracción (b)....................................................................................................................43

Figura 4.6.- Resultado de la identificación de Ceratium furca . a) primera imagen problema b) su correspondiente pico de correlación, c) segunda imagen problema y d) sus correspondientes picos de correlación. .............................................................................44

Figura 4.7.- Resultado de la identificación de Ceratium pentagonum. a) primera imagen problema b) su correspondiente pico de correlación, c) cuarta imagen problema y d) sus correspondientes picos de correlación. .............................................................................45

Figura 4.8.- Resultado de la identificación de Ceratium tripos y C. macroceros. a) tercera imagen problema b) su correspondiente pico de correlación, c) quinta imagen problema y d) sus correspondientes picos de correlación....................................................................45

Figura 4.9.- Resultado de la identificación de Ceratium fusus. a) sexta imagen problema b) su correspondiente pico de correlación. ...........................................................................46

Figura 4.10.- Resultado de la prueba de caracterización de la técnica, empleando el filtro de Ceratium furca . a) autocorrelación de C. furca, b) la correlación de C. pentagonum y el filtro de C. furca , c) la correlación de C. macroceros vs C. furca, d) la correlación de C. tripos vs C. furca y en e) la correlación de C. fusus vs C. furca . .....................................................46

Figura 4.11.- Ceratium furca. Valores de correlación de 100 individuos. a) resultados numéricos y b) media ± desviación estandar (D. E.) ......................................................47

Figura 4.12.- Ceratium furca . Imágenes con detritus, burbujas y fragmentos de varias especies. ...........................................................................................................................48

Figura 5.1.-Ceratium dens. Fotografía tomada por Roberto Cortés Altamirano. ...............51

Figura 5.2.- Imágenes de las especies usadas en el análisis. La especie Heterocapsa rotundatum, fue colectada e identificada por la Dra. Elizabeth Orellana-Cepeda en 1996 y reportada en el informe FCM-UABC-CONACyT 431100-5-1984PT..............................52


Figura 5.3.- Cámara de conteo Sedgwick-Rafter. Las flechas indican el movimiento de barrido de la muestra........................................................................................................53

Figura 5.4.- Sistema digital para capturar imágenes de los organismos del fitoplancton. A) microscopio en donde se observa la muestra de agua de mar, B) CCD y C) Computadora en donde se encuentra instalada la tarjeta grabadora de imágenes y los programas de procesado de imágenes...............................................................................54

Figura 5.5.- Sistema óptico-digital para la identificación automatizada de partículas biogénicas en tiempo real. Detalles del sistema y descripción del mismo se encuentran en el texto.........................................................................................................................55

Figura 5.6.- Imagen de la especie en el campo de espacio. La especie es Ceratium tripos.56

Figura 5.7.- Imagen en el campo de frecuencia. Modulo de la transformada de Fourier del organismos Ceratium tripos. ..........................................................................................56

Figura 5.8.- Imagen del monitor de la computadora de la transformación del modulo de la transformada de Fourier de la especie Ceratium tripos de coordenadas cartesianas a coordenadas polares escalada en r con el ln. ....................................................................56

Figura 5.9.- Filtro holográfico de la especie Ceratium tripos. El filtro esta grabado en una placa holográfica PFG-01 con una resolución de 5000 líneas por milímetro....................57

Figura 5.10.- Muestra los resultados de la correlación. Cada pico representa a un individuo de la especie Ceratium tripos que se encuentra en el filtro..................................57

Figura 5.11.- Respuesta del sistema a los cambios de rotación de la especie C. dens. .......58

Figura 5.12.- Respuesta del sistema en la variación de la escala de la especie C. dens. .....59

Figura 5.13.- Respuesta del sistema cuando se correlaciona la especie de interés con otras especies del fitoplancton. .................................................................................................60

Figura 6.1.- Ceratium furca . Fotagrafía tomada por Cortés-Altamirano Roberto. .............64

Figura 6.2.- Densidad de Ceratium furca en Punta Morro Ensenada, B. C. México. Ciclo anual tomado de Orellana-Cepeda, et al., 1992. ...............................................................64

Figura 6.3.- Densidades de Ceratium furca en la localidad de Rincón de Ballenas Ensenada, B. C. México del 13 de abril al 10 de julio de 1998. Datos proporcionados por la Dra. Elizabeth Orellana-Cepeda (1998), comunicación personal. ...........................................65

Figura 6.3.- Fotografía de la zona de estudio. La flecha roja indica el lugar exacto de muestreo (fotografía de Octavio Meillon). .......................................................................67


Figura 6.4.- Mosaico de campos capturados de una muestra de fitoplancton colectada en Punta Morro, Ensenada, México. En esta imagen se observan diversas especies fitoplanctónicas, dominando la presencia de C. furca. Cada campo es numerado para su posterior análisis de identificación. ..................................................................................69

Figura 6.5.- Densidades encontradas de Ceratium furca (línea roja) y de organismos fitoplanctónicos totales (línea verde) en el período de muestreo......................................70

Figura 6.6.- Densidad de Ceratium furca y de organismos fitoplanctónicos totales en marea baja y marea alta...............................................................................................................71

Figura 6.7.- Comparación de las densidades encontradas en marea baja y alta de Ceratium furca y de células fitoplanctónicas totales. ........................................................................72

Figura 6.8.- Comparación de las densidades de células con respecto a dos ciclos de mareas vivas y muertas en Punta Morro Ensenada, B. C. México. La línea azul representa a la marea, línea verde a la densidad del fitoplancton y la línea roja a la densidad de Ceratium furca .................................................................................................72

Figura 6.9.- Comparación de las densidades de células con respecto a temperatura en Punta Morro Ensenada, B. C. México. La línea azul representa a la marea, línea verde a la densidad del fitoplancton y la línea roja a la densidad de Ceratium furca . ......................73

Figura 6.10.- Comparación de los tiempos usados en la identificación y conteo de muestras de fitoplancton. .................................................................................................74


LISTA DE TABLAS

Tabla I.- Datos de los organismos que forman a las imágenes problemas. .......................43

Tabla II.- Ceratium spp. Valores de la autocorrelación y correlación cruzada de cada filtro holográfico probado.................................................................................................47

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS CAPÍTULO I [PARTÍCULAS BIOGÉNICAS]

1

C A P Í T U L O I

PPaarrttííccuullaass bbiiooggéénniiccaass ¿Cuál es la importancia de estudiar partículas biogénicas?

as partículas biogénicas son indicadores de cómo se encuentra un ecosistema, ya que estas muestran cualquier desequilibrio provocado por cualquier agente extraño al sistema. El material biológico puede ser usado para indicar los efectos de cualquier compuesto estresante químico en un ecosistema. Existen muchos

organismos bioindicadores que son usados actualmente para diagnosticar ciertas áreas de interés como son: contaminación natural o antropogénica, productividad de zonas, regiones biogeográficas, cambios climáticos, sanidad, paleoclimas, paleoecología, etc. Un grupo importante de partículas biogénicas es el fitoplancton, el fitoplancton es la base de la cadena alimenticia, se ha usado como un buen bioindicador para describir ciertos comportamientos de los ecosistemas, entre otras cosas. En este capítulo estudiaremos la importancia de estos organismos, sus usos en la ecología, biogeografía, cambio climático global, contaminación, acuicultura y por último veremos cómo afectan estas células cuando existe marea roja, que es una respuesta de algunas especies de fitoplancton a los cambios climáticos que actualmente se están presentando.

Capítulo

1

L


2

I.1. IMPORTANCIA DEL FITOPLANCTON COMO PARTÍCULA BIOGÉNICA La población de plantas microscópicas marinas que se encuentran flotando en el océano, conocidas como fitoplancton, presenta una gran distribución global y estas poblaciones contribuyen en el 25% del total de la vegetación del planeta (Jeffrey y Hallegraeff, 1990).

La importancia primordial del fitoplancton radica en que son los productores primarios de la cadena trófica alimenticia del océano, su biomasa determina directamente la productividad del agua, por lo tanto el fitoplancton marino representa una de las más importantes fuentes de alimentación para todos los organismos filtradores (almejas, ostiones, ballenas, etc.) y para un gran número de larvas, crustáceos y peces de importancia comercial. En aguas someras se considera como uno de los principales alimentadores de la comunidad bentónica (Zeitzschel, 1978).

Una ventaja de trabajar el fitoplancton, es su rápida respuesta a los cambios en el ambiente, debido a que multiplican sus poblaciones en cuestión de horas pues tienen tasas de división celular hasta de 1.0 día-1 (Roberts, 1979; Epley, 1986 y Tomas et al.; 1993) de tal forma que cualquiera alteración se ve reflejada en la comunidad del fitoplancton (Odum, 1978 y Smayda y Shimizu, 1993).

Debido a que las células presentan adaptaciones según las condiciones de su ambiente (Steeman-Nielsen, 1975; Morris, 1980; Bidigare et al., 1990; y Sathyendranath et al., 1996) es interesante relacionar el contenido total de biomasa con la abundancia y estructuras taxonómicas, así como con la variabilidad espacio-temporal de la población para poder interpretar de mejor forma las fluctuaciones de la comunidad (Harris, 1986).

La principal diferencia de la producción primaria en los océanos y en la tierra es que en el mar, frecuentemente todo el fitoplancton es consumido por el zooplancton, mientras que en la tierra los vegetales solo son consumidos en un 10 % por los herbívoros. Además los tiempos de generación en los vegetales terrestres son grandes comparados con los tiempos de crecimiento del fitoplancton en el mar (se regeneran cada día) Smayda (1974).

Las especies fitoplanctónicas y sus características biológicas han sido estudiados desde diferentes puntos de vista: su índice de refracción (Carder et al., 1972); su crecimiento en sistemas de cultivo (de Pauw et al., 1984); análisis de sus pigmentos (Faust y Norris, 1982); relación de crecimiento con respecto a la luz y temperatura (Hitchcock, 1980); prueba de ecotoxicología (Jensen, 1984); ecofisiología del fitoplancton costero (Orellana et al., 1993). De estos trabajos se demuestra que las características del medio pueden verse reflejadas en la composición específica del fitoplancton.


3

I.2. USOS DE LOS ORGANISMOS DEL FITOPLANCTON

I.2.1. Ecología y Biogeografía Las regiones pueden ser caracterizadas por una especie típica o por un conjunto de especies endémicas. El trabajo de biogeografía de las comunidades del plancton ha concluido que los organismos del fitoplancton son buenos indicadores de regiones naturales, las cuales están definidas por la latitud y por los procesos dinámicos de los océanos (Braarud et al., 1953 y Smayda, 1958). De tal manera que estos organismos son utilizados para encontrar la relación existente entre las condiciones particulares de cada región y para conocer los cambios que generan las alteraciones globales atmosféricas que está experimentando nuestro planeta en un tiempo geológico, utilizando información de la micropaleontología de un cierto lugar (Funnell y Riedel, 1971).

I.2.2. Cambio climático global El fitoplancton contribuye significativamente en los cambios climáticos globales (Jeffrey y Mantoura, 1996). Los organismos fitoplanctónicos presentan una influencia en los procesos químicos globales y por ende provoca modificaciones climáticas globales por diversos mecanismos. Existen tres áreas en donde se puede observar estos mecanismos provocados por el fitoplancton: a).- la utilización del dióxido de carbono a través de la fotosíntesis, esto afecta al ciclo del dióxido de carbono global (Williamson y Gribbin, 1991); b).- contribuyen al calentamiento de la superficie de los océanos (Sathyendranath et al., 1991) por medio de la absorción y dispersión de la luz del sol y c).- producción de cantidades de compuestos volátiles (ejemplo: dimetil sulfato) el cual es liberado a la atmósfera y actúa como un efecto de nubes (Cloud-seeding nuclei ) particularmente en el Atlántico norte (Malin et al., 1992).

I.2.3. Contaminación El fitoplancton es una información muy útil para entender el funcionamiento de ecosistemas con cierto grado de contaminación (Bodeanu 1933; Segovia-Zavala et al., 1988 y Escalada-Fleites y Millán-Núñez, 1990).

Las aguas residuales domésticas tienen alto contenido de detergentes (Devik, 1976 y Cacho-López, 1992), éstos compuestos orgánicos están formados esencialmente de polifosfato que posteriormente son degradados a ortofosfato (Snóyeink, 1990) convirtiéndose en uno de los nutrientes primordiales para el desarrollo de poblaciones fitoplanctónicas (Raymont, 1980 y Berger et al., 1989). Se tienen registros de que excesos de ostofosfatos generan un crecimiento acelerado del fitoplancton en la zona donde son vertidos (Pesson, 1979), motivo por el cual los fosfatos se han usado como indicador para monitorear la contaminación doméstica (Friligos, 1981).

En las últimas dos décadas, investigadores de diversos países han intentado interpretar los patrones de fluctuaciones bióticas ocasionados por alteraciones ambientales del hombre y encontrar alguna relación entre las características físico-químicas del agua y las estructuras fitoplanctónicas (Alasaarela, 1979; Thompson y Ho, 1981; y Raman y Phani,


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1989). Estos autores encontraron que las altas concentraciones de materia orgánica y fosfatos incrementaron los pigmentos fotosintéticos del fitoplancton y presentaron cambios en la estructura taxonómica del fitoplancton (con una mayor dominancia y abundancia) en las zonas afectadas por descargas residuales.

Autores como Friligos y Koussouris (1984) y Friligos (1989) han detectado en el mar mediterráneo algunos géneros dominantes de microalgas asociadas a descargas de origen doméstico. Específicamente señalan a los dinoflagelados (Gymnodinium sp., Prorocentrum micans, Peridinium sp., Ceratium sp.) como indicadores de contaminación, mientras que la abundancia y la diversidad de diatomeas (Chaetoceros sp., Leptocylindrus sp., Nitzschia seriata y Skeletonema costatum) son más variables según las condiciones hidrográficas (Vilic et al., 1995).

Existen diversos trabajos en donde se han monitoreado a los organismos del fitoplancton como indicadores de desequilibrio ecológico provocado por contaminante orgánicos e inorgánicos.

I.2.4. Paleoecología Los microfósiles son considerados de gran importancia como herramientas para realizar reconstrucciones paleoecológicas debido a que estos presentan una distribución espacial definida por las características físico-químicas del ambiente en el que se desarrollaron, además de que se preservan fácilmente (Dodd y Stanton, 1981).

Las diatomeas son uno de los grupos de microfósiles más importantes en los estudios paleoecológicos. Muchas especies presentan rangos específicos de temperatura y salinidad. Dado a esto se pueden realizar interpretaciones paleoclimáticas y en forma más general interpretaciones paleoambientales (Hajós, 1976 y Koizumi y Tanimura, 1985).

I.2.5. Acuacultura Las microalgas son un componente fundamental de las dietas de los moluscos bivalvos (ejemplos: ostiones, almejas, etc.), larvas de algunos gastrópodos (abulón), larvas de crustáceos (camarones y langostinos), algunas especies de peces (tilapia, sardina, anchoveta). Las microalgas incrementan la supervivencia de las larvas de cultivo, son un factor de mejor crecimiento de la larva en el cultivo o actuar como un agente bacteriocidal (Fujimura y Okamoto, 1972; Bernabé, 1976; Cohen, et al.,1976; Manzi et al., 1977; y Malecha, 1983).

Otros usos de los cultivos de microalgas son: como medicamento en problemas de corazón (Durand-Chastel, 1980), uso de las propiedades de fijación de nitrógeno de las algas verde-azúles para inocular los campos de arroz en la India (Venkataraman, 1980) y la utilización de las microalgas como complemento alimenticio humano, especialmente en el este de Asia (Soeder, 1980).


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I.3. MAREA ROJA Los florecimientos algales masivos de tipo tóxico o mareas rojas tóxicas constituyen fenómenos naturales que se han manifestado a lo largo de la historia (Cortés-Altamirano, 1998).

Actualmente, este mismo impacto o similar se ha dado por florecimientos masivos de microalgas tóxicas en la acuacultura, pesquerías y salud humana, en ciertas regiones del planeta. Hasta la fecha se han registrado aproximadamente 20,000 casos de intoxicación por ficotóxinas, con un porcentaje de mortalidad de 15% (Hallegraeff, 1993).

En la actualidad, los resultados de las investigaciones sobre fitoplancton tóxico, así como de las variables biológicas y ambientales que propician los florecimientos masivos y los estudios de las toxinas, han permitido establecer que de las 5,000 especies de dinoflagelados que componen la diversidad fitoplanctónica en los océanos, 300 son especies formadores de marea roja, 40 de las cuales tienen la capacidad de producir ficotóxinas (Hallegraeff, 1993). La mayoría de estas especies están asociadas al grupo de dinoflagelados, especialmente a los géneros Prorocentrum, Dinophysis, Amphidinium, Gymnodinium, Ptychodiscus, Protogonyaulas, Alexandrum, Ostreopsis, Gambierdiscus y Pyrodinium (Steidinger, 1993). Sin embargo, recientemente se ha comprobado que diatomeas como Pseudnitzschia pungens f. multseries (Bates et al., 1989 y Bates et al., 1991), P. australis (Buck et al., 1992), Rhizosolenia c. f. chunii (Landgdon y Huisman, 1989); flagelados como Prymnesium parvum, P. patelliforum, Chrysochromulina polylepis, C. leadbeateri (Meldahl et al., 1993 y Meldahl et al., 1995); cianobacterias como Oscillatoria erythraea (Han y Capra, 1992) y bacterias asociadas a dinoflagelados, entre otros grupos, participan en la producción de tóxinas (Silva, 1990; Kodama et al., 1990; y Rausch y Lassus, 1991).

Entre los elementos desencadenados de los florecimientos algales nocivos, Shumway (1989 y 1990) propone el enriquecimiento de nutrientes en el ambiente marino, el decremento de la presión de pastoreo de la especie en cuestión, los cambios meteorológicos a gran escala (disminución de la capa de ozono, efecto invernadero, el fenómeno del niño, entre otros), las surgencias, el aporte de aguas continentales y la incursión al ambiente marino de contaminantes (desechos industriales, domésticos y de la agricultura).

En el ámbito mundial las mareas rojas representan un reto a la salud humana y a las pesquerías, puesto que es evidente su extensión geográfica y el aumento en la toxicidad de los organismos que la forman (Anraku, 1984; Hallegraeff, 1993; Vega, 1989; y Cortés-Altamirano, 1995). Internacionalmente se ha escrito mucho sobre las mareas rojas. Lo que antes era un fenómeno raro e impredecible, hoy es en determinadas áreas muy común y de cierta temporalidad. La información de mareas rojas desde el principio de este siglo es muy basta y abarca diferentes temáticas, desde descripciones taxonómicas de los microorganismos, efectos del fenómeno hasta el desarrollo y distribución de los eventos con la mayoría de los aportes al medio. En 1957 Brongersma-Sanders reúne la mayoría de los casos catastróficos ocurridos mundialmente haciendo una relación con las zonas de


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surgencias y diferenciando la “agua roja” con y sin mortalidad masiva, y observa que no son únicamente rojas sino que hay otras coloraciones e incluye casos reportados en el siglo pasado.

Otro trabajo que reúne información global es el de Halstead (1978) (citado en Cortés-Altamirano (1998)) en un escrito dedicado a los animales ponzoñosos y venenosos, en el cual ya se habla del síndrome paralítico por mariscos.

En 1990 Shumway describe los efectos producidos por los florecimientos masivos de microalgas en la acuicultura de moluscos bivalvos, estos efectos han causado que zonas en donde se explotaba a la almeja desaparezcan y por lo tanto afecten a la economía de la industria del marisco, la magnitud de este efecto económico en Nueva Jersey (E.U.A.) fue de 430 millones de dólares.

En 1993 los estudios reportados por Hallegraeff han permitido conocer el aumento en la frecuencia, intensidad y duración de las mareas rojas. Él menciona que las mareas rojas han aumentado debido a que los organismos formadores de mareas rojas son transportados por medio del agua de lastre de los barcos de un lugar a otro. Es decir, que la descarga de esta agua en lugares en donde las condiciones son óptimas para que los organismos florezcan ha propiciado el aumento en las frecuencias y distribución geográfica de las mareas rojas. Concluye que no hay duda que el deterioro ambiental que ha causado el aumento de la población humana en las costas, que son afectadas por medio de descargas de aguas negras y la proliferación de la acuicultura, cuyas aguas de desecho son altamente fertilizadas están, por lo menos en parte, desequilibrando el medio estuarino, ayudado por las desforestaciones de mangles.

Cortés-Altamirano (1998) menciona que posiblemente, existe una relación actual en el cambio climático global provocado por el fenómeno de “El Niño”, “Efecto invernadero” y la “Depleción del Ozono” como responsables de alguna influencia en los eventos de marea roja en las diferentes costas del mundo. México no ha estado al margen de esto. El amplio desarrollo turístico y la constante proliferación de granjas acuículas han ocasionado que las zonas costeras sean presas de la eutrificación, favoreciendo un medio propicio para el desarrollo de las mareas rojas. Dado la importancia del estudio de las mareas rojas, se requiere tener un sistema de monitoreo continuo para determinar cuál es la frecuencia de este fenómeno en las costas mexicanas y su grado de toxicidad de la misma, así como su impacto en el ecosistema.

Los registros de marea roja en México se han presentado en su mayoría en zonas turísticas y en donde se ha dado el desarrollo potencial de la acuicultura. Una buena revisión sobre estos registros lo ha presentado Cortés-Altamirano, et al. (1993).

El principal problema para tener un mejor control y poder prevenir catástrofes como mortandades humanas o pérdidas económicas en las pesquerías provocada por los efectos de la marea roja es un constante monitoreo en zonas claves. Para poder sostener proyectos de investigación en donde el monitoreo sea continuo, es de suma importancia


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el desarrollo de técnicas de cuantificación y cualificación automatizadas de estas especies.

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS CAPÍTULO II [IDENTIFICACIÓN Y CONTEO DE ORGANISMOS DEL FITOPLANCTON]

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C A P Í T U L O I I

IIddeennttiiffiiccaacciióónn yy ccoonntteeoo ddee oorrggaanniissmmooss ddeell ffiittooppllaannccttoonn ¿Por qué es importante el monitoreo y el desarrollo de nuevas técnicas para cuantificación y cualificación del fitoplancton?

ctualmente el principal tema de los programas internacionales como son GLOBEC (Global Ocean Biological Ecosystems), JGOFS (Joint Global Ocean Flux Study), LOICZ (Land Ocean Interaction Continental Zone) y GOOS (Global Ocean Observing System) abarca el cómo los ecosistemas pelágicos marinos de nuestro planeta

pueden ser afectados por impactos antropogénicos y cómo este efecto puede contribuir al cambio climático global. Los cambios espaciales y temporales en la estructura de una comunidad, población biológica y la diversidad, presentan cambios que afectan a gran escala a la biosfera. En el centro de estos problemas está uno de las más grandes “dificultades” de la investigación biológica que es la taxonomía. Durante este siglo se ha invertido tiempo y esfuerzo para la elaboración de claves taxonómicas que faciliten el laborioso trabajo en la identificación. También se han desarrollado nuevas técnicas de caracterización de estos organismos. El desarrollo de nuevas tecnologías son contempladas en todos los programas internacionales como un camino importante para cumplir con los objetivos de estos programas. El desarrollo de técnicas ópticas, acústicas y sistemas foto-ópticos que son calibradas con mediciones in situ de perfiles de distribución de fitoplancton y monitoreo cualitativos y cuantitativos por medio de muestras de red o de botellas hidrológicas, demandan la creación de sistemas de identificación y conteo automatizados, para así poder tener una buena base de datos que servirá en el futuro para la estimación de propiedades biológicas del fitoplancton por medio de sensores remotos y poder tener un panorama global de estos fenómenos. En este capítulo veremos cómo son los métodos para caracterizar una muestra de fitoplancton, cómo han evolucionado y cual es el método que se propone como una solución al problema del análisis de grandes cantidades de muestras de fitoplancton.

CAPÍTULO

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A


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II.1. MÉTODOS PARA CARACTERIZAR UNA MUESTRA DE FITOPLANCTON Las poblaciones de fitoplancton pueden ser caracterizadas por medio de varios métodos, los cuales son: a) los métodos indirectos que involucran analizar las poblaciones por medio de análisis espectrales fluorescentes, que pueden determinar aspectos muy propios para cada grupo de organismos planctónicos involucrando los diferentes pigmentos que los constituyen (Yentsch e Yentsch, 1979); otro método indirecto es la aplicación de los contadores de partículas para la determinación del número de células y frecuencias de tamaños de las mismas, como es el contador de partículas "Coulter Counter" (Sheldon y Parsons, 1976), que es una técnica rápida de análisis, pero tiene el problema de que no identifica a la partícula que se está midiendo o contando (Gorsky et al., 1989); esta misma desventaja presenta el análisis por bloqueo de luz (Pough, 1976) que convierte a la señal producida en una esfera del tamaño de la partícula (Gorsky et al., 1989) y b) los métodos directos que se basan en analizar la muestra con un microscopio (conteo e identificación directa). La identificación de organismos del fitoplancton por medio del microscopio sigue siendo un método tedioso para el taxónomo, ya que el tiempo que se utiliza para su evaluación va a depender de su experiencia. Además, el error de identificación va a ser diferente para cada persona, ya que se involucra el criterio para reconocer una especie (Simpson et al., 1992).

Con adelantos en las ciencias como la óptica, electrónica y computación, podemos implementar técnicas que realicen identificaciones de organismos marinos de una forma automatizada, en donde los errores y lo tedioso sean superado de manera estándar. Implementar un sistema automatizado resulta ser la solución de este problema de conteo y de identificación. Ya que aunque los costos del sistema sean un poco elevados, el tiempo de análisis de muestra se reduciría; además en un sistema automatizado se obtendrán mínimos gastos de mantenimiento y operación.

II.2. SISTEMAS ANALIZADORES DE IMÁGENES APLICADOS A LOS ORGANISMOS DEL PLANCTON Los sistemas analizadores de imágenes aplicados a organismos de plancton son: el realizado por Uhlmann et al., (1978) que utiliza las mediciones de las formas de los organismos, es decir, el área, ancho, largo y la proporción largo-ancho. Estos análisis se llevaron a cabo con cinco géneros de fitoplancton (Asterionella, Melosira, Fragilaria, Ceratium y Peridinium).

Furuya (1981, 1982) realizó una estimación de los diferentes tamaños de fitoplancton por medio de un analizador de imágenes, las especies que trabajó fueron: Fibrocapsa japonica , Ptychodiscus brevis, Prorocentrum dentatum y Chaetoceros debile.


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Tsuji y Nishikawa (1981) determinaron la especie de fitoplancton Prorocentrum triestium por medio de un analizador de imágenes fluorescentes.

Dietrich y Uhlig (1984) llevaron a cabo cuantificaciones de Artemia salina y diferentes estadios de copépodos por medio de mediciones de longitud, ancho, área y la relación ancho-longitud.

Cynar et al. (1985) llevaron a cabo estimaciones del fitoplancton por medio de una técnica que realizaba mediciones morfológicas de los organismos.

Gorsky et al. (1989) realizaron un método en el cual se pueden estimar los organismos del fitoplancton mediante un analizador de formas, los organismos que estimaron fueron Prorocentrum micas, Nitzschia closterium y Hymenomonas elongata .

Brown et al. (1989) cuantificaron fitoplancton con un intervalo de tamaño de 1 a 20 µm en monocultivos de especies como Nannochloris bacillaris, Chrysochromulina breviturrita y Euglena gracilis, con un analizador de imágenes que uso las formas de estas especies, tomando el número de pixeles ocupados por la imagen.

Un grupo de investigadores en Plymouth, Reino Unido, proponen el uso de los sistemas de redes neurales, con el fin de realizar un análisis de patrones de reconocimiento biológico (Simpson et al., 1992; Culverhouse et al., 1994; Culverhouse et al., 1996). Este método ha analizado dibujos de siluetas de dinoflagelados y tintínidos, además de 23 fotografías de organismos fitoplanctónicos. Estas pruebas han servido para observar dos parámetros, uno es la variación natural de la morfología de las especies y la otra es el efecto del ruido provocado por el detritus. La inteligencia artificial que involucran estas técnicas pueden ser un camino para resolver el problema del monitoreo a gran escala o de una manera más rápida la identificación y conteo de estas especies (Culverhouse et al., 1996). Sin embargo hasta la fecha no existe el sistema completo de identificación que proponen.

II.3. PROCESADO ÓPTICO COHERENTE. Durante las últimas dos décadas se han realizado investigaciones en este sentido, como es la técnica de procesado óptico coherente en el reconocimiento y caracterización de especies de microalgas, específicamente diatomeas, microorganismos que presentan simetría en sus dos ejes de forma estriada y compuestos principalmente de dióxido de silicio (Almeida et al., 1972).

Cairns et al. (1972) utilizaron la técnica de filtrado espacial óptico coherente en el reconocimiento de patrones de las diatomeas: Navicula sp. y Cyclotella sp. con filtros espaciales complejos del tipo Vander Lugt construidos con un interferómetro de Rayleigh modificado.


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Almeida y Eu (1976) presentaron resultados en la identificación de diatomeas, aplicando la técnica de correlación óptica convencional con filtros espaciales acoplados u hologramas con la transformada de Fourier. También presentaron resultados en el monitoreo de la contaminación del agua, la cual está relacionada con el número de diatomeas contenidas y contadas en función de las especies en un cierto período de tiempo.

Almeida et al. (1978) realizaron análisis de algas en transparencias fotográficas de 35 mm utilizando un procesador óptico híbrido, en el cual el procesamiento de la información se realiza óptica y digitalmente por medio de una computadora. Las señales de correlación grabadas mediante una Vidicón fueron digitalizadas y almacenadas en cintas magnéticas. Seleccionaron 25 especies de diatomeas diferentes con el propósito principal de compararlas consigo mismas y formar una matriz de 25 x 25 valores de correlación para probar la habilidad de discriminación del sistema.

Fujii y Almeida (1979a) elaboraron filtros espaciales acoplando patrones simulados y obteniendo correlaciones parciales ópticas entre el patrón simulado (contornos, contornos con estrías y características morfológicas de importancia taxonómica) y los microorganismos. Mostrando que este filtro es menos sensible a las variaciones de tamaño del objeto, lo cual reduce el número de filtros requeridos para el análisis. En este caso sólo estuvieron considerando el contorno de las diatomeas. El problema consiste en que un taxónomo no solamente reconoce el contorno del objeto, sino también su estructura interna, como son la densidad de estrías, la dirección y formas de éstos. Generalmente éstos organismos nunca son iguales, por ejemplo, las diatomeas que pertenecen a una misma especie son muy similares en forma pero pueden ser diferentes en tamaño y en el patrón de estrías. Por lo que es más importante muchas veces encontrar parecidos o similitudes en vez de diferencias para la identificación o clasificación de dichos organismos.

Posteriormente, Fujii et al. (1980) desarrollaron un método para el reconocimiento de formas microbiológicas, rotando el filtro espacial acoplado mediante un prisma de cuña motorizado y controlado por una computadora. Este análisis se basa en el conteo de los pixeles de los picos de correlación con un programa de computación sencillo. El filtro constaba de patrones de difracción de varias diatomeas de diferentes tamaños, de tal manera que pudiera cubrir un amplio rango en cambios de escala para la identificación de estos microorganismos. Los filtros generados fueron tomando ciertas características de una especie de diatomea modelo, es decir, realizaron filtros en donde se contemplara al organismo con todas sus características morfológicas (contornos, rasgos morfológicos que caracterizan a la especie taxonómicamente y tamaños de los organismos). En las correlaciones de estos filtros con una serie de 29 diatomeas diferentes en tamaño con una misma orientación, encontraron que cuando se quería identificar organismos de un tamaño grande, presentaba problemas el conteo de pixeles, ya que este filtro se confundía con la mayoría de los tamaños de los organismos que contenía la imagen problema (existía mas ruido), caso contrario cuando se usó un organismo de tamaño pequeño que pudo identificar a los organismos del mismo tamaño sin presentar problemas en el conteo


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de pixeles. Respecto a la rotación tuvieron problemas, ya que algunas diatomeas si se pudieron discriminar y otras no, rotando el filtro entre 0° y 180°, lo que indicó una fuerte deficiencia del método; sin embargo lo importante de este trabajo es el análisis de las correlaciones por medio de un contador de pixeles que de una manera disminuye el tiempo de identificación de estos organismos; en este trabajo no se presentan el porcentaje de diferencia en las correlaciones para cada especie.

Cairns et al. (1982) presentaron un trabajo sobre un sistema de identificación automatizado basado en los patrones de difracción de diatomeas, generados por medio de un sistema micro-óptico controlado por computadoras; una de las principales aportaciones de este trabajo es la interface del microscopio al sistema óptico que se usó, de esta forma se superan algunos errores que se tiene en la calibración cuando se utilizan negativos fotográficos como interface de la imagen al sistema, aunque también encontraron problemas en escala y rotación de los organismos comparados pero fueron menores que los encontrados por Fujii et al. (1979b).

Coronel-Beltrán (1988) utilizó un sistema óptico coherente invariable a rotación y ubicación del organismos en una diapositiva, aplicado a las diatomeas.

II.4. CÁLCULO Y SIGNIFICACIÓN ESTADÍSTICA EN EL CONTEO DE FITOPLANCTON Lund et al. (1958) llegó a la siguiente fórmula matemática para la estimación de la significación estadística de los resultados del recurso:

%100

2max

±=

nf

Esto significa que si se tiene un recuento de 25 células, el error es de ±40%, para n = 100 baja a ±20% y para n = 10 000 a ±2%.

Es costumbre calcular el número de células por mililitro o litro de agua, a partir del valor del recuento. Si de una cámara de 2.5 mm de diámetro = 500 mm2 de superficie de fondo, se han contado 10 mm2 , con el resultado de Z, entonces Z x 50 es el resultado total para la cámara, siendo Z el número de recuento de una especie. El resultado dividido por el volumen de la cámara da el número de células de cada especie por mililitro. La suma de todos los resultados da el número total de células por mililitro de agua o si se multiplica por 1 000 los resultados serán por litros (Cortés-Altamirano et al., 1998).

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS CAPÍTULO III [APLICACIÓN Y VENTAJAS DE LOS PATRONES DE DIFRACCIÓN EN LA IDENTIFICACIÓN

AUTOMATIZADA DE ESPECIES FITOPLANCTÓNICAS]

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C A P Í T U L O I I I

AApplliiccaacciióónn yy vveennttaajjaass ddee llooss ppaattrroonneess ddee ddiiffrraacccciióónn eenn llaa iiddeennttiiffiiccaacciióónn aauuttoommaattiizzaaddaa ddee eessppeecciieess ffiittooppllaannccttóónniiccaass ¿Cuales son las ventajas del usos de los patrones de difracción en los sistemas de identificación automatizados?

ctualmente un tema de gran interés para la comunidad científica es obtener un sistema de monitoreo automático de organismos formadores de mareas rojas. Los avances en los sistemas para realizar el monitoreo automatizado han demostrado que sí se puede lograr esta automatización. Sin embargo, existen problemas claves que afectan

los resultados en la correcta identificación y cuantificación de los organismos como son: fondo de la imagen (detritus, burbujas, intensidad de iluminación del microscopio), variación de sedimentación de la célula en el campo de observación, variación morfológica natural de la especie en una muestra, problema de similitud inter-específicos entre dos especies, organismos fragmentados comparados con organismos enteros. Estos problemas son cuantificados en este capítulo dentro de un sistema digital de identificación automática. La cuantificación se realizó mediante las correlaciones de los patrones de difracción de las imágenes de los organismos y las correlaciones de las imágenes de los organismos. Tanto las correlaciones de los patrones de difracción y las correlaciones de las imágenes se agruparon en forma estadística por medio de la técnica del vecino más cercano. Los resultados obtenidos demuestran que el uso de los patrones de difracción para la identificación automatizada de seis especies de Ceratium, superan los problemas mencionados anteriormente. Se concluye que el sistema basado en el patrón de difracción de los organismos, presentan ventajas sobre los sistemas que utilizan sólo imágenes de los organismos.

CAPÍTULO

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III. 1. INTRODUCCIÓN El problema de identificar el fitoplancton con mayor eficiencia, velocidad y con el mismo error de identificación es difícilmente solucionado, debido a la experiencia que deben poseer los especialistas para esta práctica. Así, los investigadores que estudian al fitoplancton se han preocupado en realizar nuevas técnicas que permitan identificar a estos organismos con una mayor facilidad.

El presente capítulo retoma la técnica de los patrones de difracción para identificar cinco especies de fitoplancton del género Ceratium, con la finalidad de realizar una análisis mucho más profundo en la aplicabilidad de la técnica. El objetivo de este capítulo es cuantificar mediante la correlación de los patrones de difracción de las imágenes, cada uno de los problemas que se presentan en el reconocimiento de las especies como son: iluminación, detritus, posición de sedimentación de la célula, variación natural de los organismos de una especie en una muestra de agua de mar de una localidad, y la variación en la identificación cuando el organismo viene segmentado.

El primer objetivo particular es determinar los índices de correlación entre los patrones de difracción de las imágenes ( )2

1R y entre las imágenes directamente ( )22R . La hipótesis

es que 22

21 RR > . El cumplimiento de esta hipótesis dará como fundamento el usar o no

usar los patrones de difracción en un sistema de identificación automática de especies fitoplanctónicas.

El segundo objetivo particular es determinar la asociación de las especies entre un mismo subgénero mediante los patrones de difracción ( )1A y entre las imágenes directamente ( )2A . La hipótesis es que 21 AA > .

El tercer objetivo particular es determinar los índices de correlación de los patrones de difracción entre las especies de un mismo subgénero ( )2

...1abcpdR y entre otro subgénero

( )2...2 abcpdR . La hipótesis es que ( ) ( )2

...22

...1 abcpdabcpd RR > cuando un subgénero ( )1pd en particular es analizado.

Por otra parte, las especies del fitoplancton que están compuestas de placas, cuando son colectadas por red o filtradas, pueden fragmentarse debido a su fragilidad. Ya que estos organismos estaban vivos al momento de la colecta deben ser cuantificados. Así, el cuarto objetivo particular es determinar los índices de correlación entre los patrones de difracción de las imágenes ( )2

1FR y entre las imágenes directamente ( )22FR , cuando estas

especies están fragmentadas. La hipótesis es que ( ) ( )22

21 FF RR < . El cumplimiento de

esta hipótesis dará a conocer qué fracción de la célula caracteriza mejor la especie.



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III.2. METODOLOGÍA

III.2.1 Especies analizadas del género Ceratium Se analizaron seis especies del género Ceratium comprendidos en tres subgéneros Ceratium, Tripoceratium y Amphiceratium (Balech 1988, Sournia 1986).

Las especies del subgénero Ceratium son Ceratium furca ( Ehrenberg ) Balech, 1988:131, placa 59, Figs. 4-6 y Ceratium pentagonum (Gourret) Balech, 1988: 129, placa 56 Figs. 15 y 16.

Ceratium furca Ceratium pentagonum Figura 3.1.- Especies del subgénero Ceratium.

Estas especies se caracterizan por tener la epiteca con un cuerno apical.; ambos cuernos antapicales son rectos y dirigidos hacia atrás, paralelos o poco divergentes; uno de estos cuernos es menor que el otro. La diferencia entre estas dos especies es que en C. furca la epiteca disminuye gradualmente, prolongándose con la parte apical del organismo. Los bordes de la epiteca son rectos o ligeramente cóncavos y los cuernos antapicales están bien desarrollados. En cambio en C. pentagonum, existe una diferenciación entre la epiteca y el cuerno apical y el cuerpo presenta una forma pentagonal.

Las especies del subgénero Tripoceratium son: Ceratium macroceros (Ehrenberg) Balech, 1988: placa 5, Fig. 10, Ceratium tripos (O.F. Muller) Balech, 1988:138, placa 58, Figs. 1-6 y Ceratium dens (Ostenfeld y Schmidt) Balech, 1988: 197, placa 69, Figs. 3, 4 y 5.

Ceratium tripos Ceratium macroceros Ceratium dens



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Figura 3.2.- Especies del subgénero Tripoceratium.

Este subgénero se caracteriza por una célula con epiteca con cuerno apical, células no fusiformes, los cuernos antapicales de igual o diferente longitud, la base de estos es recta y si forma con la parte posterior de la hipoteca una superficie cóncava y los cuernos antapicales dirigidos hacia atrás y hacia afuera entonces es la especie C. macroceros. C. tripos, en cambio tiene base convexa, los cuernos antapicales no sigue el contorno del cuerpo, el cuerno apical sin apéndices o con estos muy pequeños, los antapicales en forma curvada y después rectos y generalmente terminan paralelamente con el cuerpo apical o divergiendo de éste. Y C. dens, que muestra un cuerpo de forma y proporciones variadas, a veces netamente más alto que ancho pero en ocasiones el ancho es igual o excede el alto. Esta especie está caracterizada por sus cuernos antapicales que se dirigen hacia afuera, sin curvarse sensiblemente hacia adelante como en tripos y en otras especies del subgénero Tripoceratium. Generalmente el desarrollo de esos cuernos es netamente diferente de uno respecto al otro aunque en ocasiones la diferencia es muy pequeña: ambos, sobre todo el derecho, pueden reducirse extremadamente hasta hacerse rudimentarios.

El tercer subgénero analizado fue Amphiceratium y la especie representante fue Ceratium fusus (Ehrenberg) Balech, 1988:132, placa 54, Figs. 5, 6 y 8.

Ceratium fusus

Figura 3.3.- Especie del subgénero Amphiceratium.

Caracterizado por organismos con epiteca con cuerno apical, células largas y estrechas, de aspecto fusiforme, sólo uno de los cuernos antapicales desarrollado, C. fusus presenta el cuerno apical recto o ligeramente curvado hacia un lado, la epiteca no dilatada y uno de los antapicales ausente o rudimentario.

Cinco especies fueron colectadas mediante una red cónica de la bahía Todos Santos, Ensenada, B.C., México; entre 31°41’ y 31°56’ de latitud norte, y 116°34’ y 116°51’ de longitud oeste (C. furca , C. pentagonum, C. macroceros, C. tripos y C. fusus) y la especie C. dens fue colectada en Mazatlán Sin. México entre 23°11’ y 23°15’ de latitud norte, y 106°25’ y 106°29’ de longitud oeste. Estas muestras de red fueron preservadas al 4% formaldehído y neutralizado con borato de sodio (Throndsen, 1978). Una sub-muestra de 0.30 ml fue tomada de la muestra de red y colocada en 0.70 ml de agua limpia en una



17

cámara Sedgwick-Rafter (Guillard, 1978). La cámara fue colocada en el microscopio de luz, para obtener las imágenes.

III.2.2. Digitalización de las imágenes Las imágenes que se analizan en este capítulo fueron tomadas con un sistema digital Photometrics Star I . El cual consiste de una cámara CCD (charge-coupled device) con resolución de 384x576 pixel y grabada y digitalizada en una computadora Mc Intosh IIcx usando el sistema Star I, con una interface IEEE-488 de la National Instruments NB-GPIB NuBus board y el programa IPlab Spetrum™. Todas las imágenes fueron de una tamaño de 256 x 256 pixeles para su edición y procesamiento.

III.2.3. Procesado de imágenes III.2.3.1. Problema de ruido de fondo De 30 imágenes de 10 organismos de C. furca se procedió a realizar tres condiciones de fondo. Diez de intensidad normal (tomada automáticamente por medio de un dispositivo de la cámara de vídeo) y con presencia de detritus (condición original, O); diez imágenes en donde se quitó el detritus y se varió la intensidad luminosa hasta encontrar una imagen clara (condición A) y diez imágenes en donde se varió la intensidad hasta encontrar una imagen obscura y contrastada (condición B). Las imágenes y sus patrones de difracción fueron correlacionados y estadísticamente agrupados.

III.2.3.2. Problemas intra-específicos El estudio de los problemas intra-específicos analizados para las dos especies (C. furca y C. dens) dorsal versus ventral, fueron:

a) Si había diferencia significativa. Fueron comparados los resultados obtenidos de las correlaciones de las imágenes y de las correlaciones de los patrones de difracción de los organismos que presentan una cara ventral versus dorsal. Sólo se eligieron los organismos que fueron encontrados en estas dos posiciones, ya que cuando se sedimenta una columna de agua el 98% de estos organismos caen en cualquiera de estas dos posiciones (este resultado está basado en la observación realizada previamente antes del experimento de 1000 organismos tomados de diferentes muestras de agua de mar, datos no publicados). En este análisis se procesaron 16 imágenes de organismos en vista dorsal y 24 imágenes de organismos en vista ventral.

b) Se analizó el grado de variación natural de cada especie usando las correlaciones de las imágenes de los organismos y las correlaciones de los patrones de difracción de las imágenes. En este proceso se analizó una muestra de agua de mar, en donde se seleccionaron un conjunto de 200 campos del microscopio en forma aleatoria. En cada campo se obtuvo la imagen del organismo presente. En total se obtuvieron 100 organismos de C. furca y 100 organismos de C. dens. Se calculó el patrón de difracción de



18

cada imagen. Posteriormente se correlacionaron por separado las imágenes y los patrones de difracción y fueron agrupados por el método del vecino más cercano.

III.2.3.3. Problemas inter-específicos Con doscientos organismos, 100 de cada una de las dos especies, se procedieron a correlacionar las imágenes y por separado sus patrones de difracción. Posteriormente se agrupó cada uno de los resultados en dendrogramas.

De las seis especies se seleccionó una imagen de un organismo de cada especie para observar la discriminación inter-específica de las imágenes y de los patrones de difracción. Posteriormente se obtuvo la correlación de las imágenes y la de los patrones de difracción, estos dos fueron agrupados por separado.

III.2.3.4. Identificación de las especies usando células fragmentadas Para observar el efecto de especímenes fragmentados se procedió a seleccionar seis organismos, uno de cada especie. Estos organismos se binarizaron de tal forma que solamente fuera 255 el valor del pixel dentro de cada imagen del organismo y 0 para el pixel fuera de ella. Cada imagen representante de cada especie se le procedió a fragmentar de la siguiente manera:

Caso 0.- Imagen completa (imagen original).

Caso I. – A la imagen original se le segmentó el cuerno antapical derecho. .

Caso II. - A la imagen original se le segmentó el cuerno antapical izquierdo.

Caso III. – A la imagen original se le segmentó el cuerno apical.

Caso IV. A la imagen original se le segmentó la hipoteca.

Caso V. - A. la imagen original se le segmentó la epiteca.

Caso VII.- De la imagen original se eliminaron los dos cuernos antapicales.

III.2.3.5. Comparación de los fragmentos de las seis especies intra e inter-específicamente Para observar la variación intra e inter-específica de cada fragmento de las especies, se realizaron las correlaciones de las imágenes y de los patrones de difracción. Con el fin de que por medio del análisis estadístico se puedan comparar los casos del I al V con el caso O. Se realizó la comparación de los seis casos de las seis especies todos contra todos. La última comparación fue seleccionando sólo los casos que tienen una importancia



19

biológica, es decir, que pueden ser contados como un individuo, estos casos fueron: caso 0, caso I, caso II, caso III y caso VI.

III.2.3.6. Algoritmos usados y prueba estadística La transformada rápida de Fourier de cada imagen se realizó en una computadora Origin 2000 de la Silicon Graphic con 10 procesadores R10000 de 195 Mhz y una memoria principal de 1280 Mbytes con sistema operativo IRIS 6.4. El tiempo de procesamiento para una matriz de 256 x 256 datos fue de 100 ms.

Las correlaciones fueron realizadas en la misma computadora por medio del algoritmo computacional descrito por Peón y Álvarez-Borrego (1990). El tiempo de procesamiento de cada correlación fue de 500 ms.

A cada grupo de correlaciones (imágenes y patrones de difracción) se le aplicó un análisis estadístico multivariado de agrupación. Este análisis agrupa correlaciones que tengan ciertas similitudes en sus valores y los separa de las correlaciones que no las tienen. Los resultados de las agrupaciones son las distancias entre cada grupo de correlaciones similares. A esto se le llama distancia de unión. La distancia usada fue la Euclidiana que matemáticamente es expresada de la siguiente manera

jHIHJHHIKH DDDDD ,,,, 5.05.05.0 −−+= , donde D es la distancia existente entre dos

agrupaciones, H y K son los grupos de datos y J e I son los datos. La técnica usada para unir los grupos de valores de correlación fue la del vecino más cercano, que es la distancia más pequeña entre dos elementos de grupos diferentes. Está técnica se empleo en este estudio, ya que es la forma más simple de realizar dendrogramas de agrupaciones, sin manipular de una manera más compleja las agrupaciones de los datos.

Este proceso se realizó en una computadora PC Pentium MMX de 233 Mhz con 32 Mbytes de memoria principal y con un programa comercial de nombre STATISTICA para WINDOWS, los resultados se presentan en forma de dendrograma, los cuales, presentan a los grupos de correlaciones en el eje de las x y en el eje de las y las distancias de unión existentes entre cada grupo. Para un mejor entendimiento de la técnica estadística ver Zupan (1982).

III.3. RESULTADOS Y DISCUSIONES De un total de 718 organismos pertenecientes a las seis especies del género Ceratium, se obtuvieron: 718 imágenes y sus respectivos patrones de difracción. Los problemas que se analizaron fueron los siguientes:

III.3.1. Problema del ruido de fondo En la figura 3.4, mostramos en (a) las diferentes condiciones de fondo que fueron examinadas y descritas en la metodología como (O) la condición original, (A) imagen clara y (B) imagen contrastada.



20

En el tratamiento de las imágenes (Fig. 3.4b) observamos que la condición original (O) y la condición (A), son iguales a un 0.78 de distancia de unión. Sin embargo las tres condiciones de fondo son agrupadas a una distancia de 2.98. Lo que indica que el fondo es una variable importante cuando se correlacionan las imágenes. Podemos notar que la cantidad de detritus afecta en la unión de las condiciones de fondo.

O A B

(a)

(b)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

BBBBBBBBBBAOAOAOAOAOOAOAAOAOAO (c) Figura 3.4.- Resultados del análisis con respecto al problema de fondo de la imagen. (a) condiciones de fondo, (b) dendrograma de imágenes y (c) dendrograma de patrones de difracción.

En el caso de este análisis la cantidad de detritus encontrada en las imágenes fue de menor al 50% de la cobertura del total de la imagen. Sin embargo, el mayor efecto en las diferentes condiciones de fondo fue la intensidad de iluminación. En la condición (B), en la cual, las condiciones de luz y contraste fueron extremas, podemos notar que la distancia de unión aumenta 4.5 veces más que el efecto de detritus y la poca intensidad de fondo que es la condición (A) comparada con la condición original (O).



21

En cambio en donde agrupamos a las correlaciones de los patrones de difracción (Fig. 3.4c), observamos que el efecto de las tres condiciones de fondo tratadas en este trabajo, presentaron una distancia de unión máxima de 0.48. Siendo sólo 16% de la máxima distancia de unión encontrada en las imágenes. También observamos que el detritus y la condición de iluminación clara (condición A) sólo afectó en una distancia máxima de 0.26 (menos del 50% de lo encontrado en las imágenes).

Por lo tanto podemos decir que sí existe una diferencia significativa entre los dos resultados, siendo 84% menor el efecto del ruido de fondo en los patrones de difracción que en las imágenes.

III.3.2. Problemas intra-específicos III.3.1. Problema en la posición de sedimentación de los organismos

Vista dorsal (D) Vista ventral (V)

(a)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

VVVVVVVVVVDVVDDDDDDVVVVD

VVVDDDDDDDD

VVVVV

(b)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

VVDDDDVDDVDDVD

VD

VVDDD

VVVVDD

VVVVVVVVVVVVV

(c)

Figura 3.5.- Resultados del análisis del problema de sedimentación de los organismos. (a) condiciones de sedimentación de los organismos, (b) dendrograma de imágenes y (c) dendrograma de patrones de difracción.



22

En la figura 3.5 observamos el efecto de la posición de sedimentación en 40 organismo de C. dens, es decir vista ventral o dorsal (fig. 3.5a). En la figura 3.5b presentamos un dendrograma de agrupamiento de las correlaciones de las imágenes. A 0.41 de distancia de unión observamos que no existe una diferencia entre las diferentes vistas de sedimentación en un grupo de 27 organismos. Sin embargo, observamos que 13 organismos que presentaron una vista ventral difieren del grupo anteriormente mencionado en una distancia de unión igual a 0.74. Lo que indica que existe una fuerte variación en las correlaciones debido a los siguientes factores: a) sedimentación, b) iluminación, c) variación morfológica y d) detritus. En este caso, del total de organismos analizados el 60% (24 organismos) presentaron la vista ventral en la imagen y el 40% (16 organismos) la vista dorsal en las imágenes.

En cambio en los patrones de difracción los efectos antes mencionados no causó un efecto significativo en las agrupaciones (Fig. 3.5c), ya que sólo presenta una distancia de unión de 0.23 (que es igual al 27% del error que fue encontrado en las imágenes) y la diferencia encontrada entre el valor máximo y mínimo en la distancia de unión fue de 0.02% el cual es despreciable. Por lo tanto observamos que existe una diferencia significativa entre los dos resultados.

Además, por medio de los patrones de difracción es posible identificar una especie usando cualquiera de las dos posiciones de sedimentación.

III.3.2.2. Problemas de la variación natural morfológica

Cien imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Cien patrones de difración 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(a) (b)

Cien Imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Cien patrones de difracción 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(c) (d) Figura 3.6.- Resultados del análisis del problema de la variación natural de la morfología de las especies. Para C. furca : (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones



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de difracción; para C. dens: (c) dendrograma de imágenes y (d) dendrograma de patrones de difracción.

Con el fin de evaluar la variación natural de la morfología de cada especie que se presenta en diferentes muestras de agua de mar, la figura 3.6 muestra los resultados de las diferentes agrupaciones de imágenes y de patrones de difracción de 100 organismos de C. furca (Fig. 3.6a y b) y 100 organismos de C. dens (Fig.3.6c y d). Para las dos especies los resultados fueron similares.

En las agrupaciones de las correlaciones de las imágenes (Fig. 3.6a y Fig. 3.6c) podemos observar que si existe un efecto en la distancia de unión en las correlaciones. Lo que indica que existen diferentes formas morfológicas que pueden ser agrupadas como variación tipo morfológica natural ( de 4 a 5 formas en una distancia de unión de 0.3) y una marcada variación de formas a una distancia de 0.98 para C. furca (Fig. 3.6a) y 0.96 para C. dens (Fig. 3.6c).

En las agrupaciones de las correlaciones de los patrones de difracción podemos observar que a una distancia de unión de 0.23 no existe variación morfológica en los organismos de C. furca (Fig. 3.6b) y C. dens (Fig. 3.6d). Por lo tanto, podemos decir que cualquier organismo de los 100 analizados que usemos como organismo tipo de estas dos especies puede identificar a los cien organismos de cada especie si usamos los patrones de difracción. En cambio, si usamos las imágenes tendríamos que usar de 4 a 5 organismos tipos para identificar a estos cien organismos de la misma especie, esto para las dos especies.

Las variaciones de la morfología es uno de los problemas que presentan más grande ruido en un sistema de procesamiento automático. Podemos concluir que las variaciones morfológicas de los organismos los cuales son importantes en las correlaciones de imágenes, no son del mismo impacto en las correlaciones de los patrones de difracción, dando así una identificación más precisa con los resultados utilizando los patrones de difracción que con los resultados utilizando las correlaciones de imágenes.

III.3.3. Problemas inter-específicos III.3.3.1. Discriminación de dos especies con 200 organismos de C. furca y C. dens En la figura 3.7 observamos los resultados obtenidos en las agrupaciones de las correlaciones de doscientos organismos, 100 de C. furca y 100 de C. dens. Esto con el fin de observar el poder de discriminación de estos dos procedimientos (imágenes y patrones de difracción) cuando se trata de comparar 200 imágenes de dos especies diferentes.



24

En la figura 3.7a observamos el procedimiento cuando se usan las correlaciones de las imágenes. Existen varios grupos de imágenes que se asocian a un mismo valor de unión y también existen grupos de imágenes que están asociados a diferentes distancias de unión, siendo la máxima de un valor de 2.52. Estas combinaciones pueden ser un factor de confusión en los resultados.

En cambio, en los patrones de difracción (Fig. 3.7b) cuando se agrupan sus correlaciones observamos solamente dos grupos que presentan una distancia de unión de 0.43, cada grupo representa a 100 organismos de cada especie. Además en esta misma gráfica observamos que la variación intra-específica de cada especie es de 0.2 a 0.3 como máximo. Lo que indica que en los patrones de difracción podemos observar una fuerte discriminación entre organismos de especies diferentes y una fuerte asociación entre organismos de la misma especie que facilita una identificación correcta del organismo de interés. Contrario a lo obtenido en los resultados basados en las imágenes.

C. dens C. furca 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

(a)

C. dens C.furca 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

(b)

Figura 3.7.- Resultados del análisis del problema inter-específicos de dos especies: C. furca y C. dens. (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción.



25

III.3.3.2. Discriminación de seis especies del género Ceratium En la figura 3.8a observamos las imágenes de las seis especies del género Ceratium. Cada imagen esta representada por tres letras. La primera letra esta representada por el subgénero que pertenece la especie (C = Ceratium, T = Tripoceratium y A = Amphiceratium), la segunda letra representa a la letra inicial de la especie (F = furca, P = pentagonum, M = macroceros, T = tripos, D = dens y F = fusus) y la tercera letra representa a la imagen de la especie entera (0 = especie entera).

En la figura 3.8b observamos las agrupaciones de las correlaciones de las imágenes y en la figura 3.8c las agrupaciones de las correlaciones de los patrones de difracción. En la figura 3.8b observamos que la máxima distancia de unión alcanzada es de 0.55 y además existe una confusión en la agrupación de cada subgénero que se muestra con barras horizontales colocadas en la parte superior de cada gráfica.

CF0 CP0 TM0 TT0 TD0 AF0

(a)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

TMO AFO

TTO CPO

TDO CFO

(b)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

TTO TMO

TDO AFO

CPO CFO

(c)



26

Figura 3.8.- Resultados del análisis del problema inter-específicos de seis especies. (a) especies contempladas y su nomenclatura, (b) dendrograma de imágenes y (c) dendrograma de patrones de difracción.

La barra con líneas verticales representa al subgénero Ceratium (CFO = C. furca y CPO = C. pentagonum), las de líneas horizontales representa al subgénero Tripoceratium (TMO = C. macroceros, TTO = C. tripos y TDO = C. dens) y las de líneas cruzadas representan al subgénero Amphiceratium (C. fusus (AFO)). Observamos que la barra de Tripoceratium abarca el 83.33% de las especies analizadas, confundiéndose en la agrupación dos especies ajenas a este subgénero, de la misma forma el subgénero Ceratium abarca tres especies, confundiéndose una especie de otro subgénero; también observamos que el subgénero Amphiceratium se encuentra agrupado dentro del subgénero Tripoceratium.

En cambio en la figura 3.8c observamos una distancia de unión de 0.77 que es un 40% más grande que las imágenes, dando así una mejor discriminación entre las especies, además observamos de acuerdo a las barras horizontales de que no existe ningún problema de traslape en los tres subgéneros, por lo tanto podemos decir, que los patrones de difracción presentan una buena discriminación inter-específica con respecto a los subgéneros y una fuerte asociación intra-específica entre las especies del mismo subgénero.

La diferencia entre el poder de discriminación de las seis especies del género Ceratium de los dos resultados es significante en un 60% de diferencia, lo que da un poder de discriminación a los patrones de difracción 40% mayor que en las imágenes. Siendo esta cualidad un factor importante en el sistema de identificación de estas especies.

III.3.4. Problemas con organismos fragmentados de las seis especies del género Ceratium III.3.4.1. Condiciones de fragmentacion de las especies En la figura 3.9 se presentan los diferentes casos que se usaron para analizar los problemas con organismos fragmentados. Los casos son: imagen original o entera (0), caso I sin el cuerno antapical derecho (1), caso II sin el cuerno antapical izquierdo (2), caso III sin el cuerno apical (3), caso IV solamente la parte apical (4), caso V solamente la parte antapical (5) y el caso VI que presenta a la especie pero sin los dos cuernos antapicales (6). Cada caso fue analizado con respecto a la imagen original y también se observó la variación intra-específica y inter-específica de cada fragmento analizado.

Original Caso I Caso II Caso III Caso IV Caso V Caso VI (O) (1) (2) (3) (4) (5) (6)

Figura 3.9.- Imágenes de cada fragmentación, según el caso.



27

En la figura 3.10 (a, b, c y d), observamos cuatro condiciones de comparación de especies fragmentadas con respecto a los organismos enteros de cada especie. La nomenclatura usada fue similar a la descrita anteriormente en la figura 3.8a, sólo que para representar cada caso la tercera letra se varió dependiendo del número del caso correspondiente (0, 1, 2, 3, 4, 5, y 6, ver fig. 3.9).

En la figura 3.10a se presenta la comparación del caso I con respecto a la imagen original de cada especie. En la gráfica de la izquierda mostramos las agrupaciones de las correlaciones de las imágenes y en la gráfica derecha las dadas por los patrones de difracción. Observamos que las imágenes presentan una mejor asociación entre el caso I y la imagen original de cada especie, pero una menor discriminación entre las especies y además existe problemas en las agrupaciones en las especies de cada subgénero. En el caso de los patrones de difracción aunque presentan una mejor asociación entre el caso I y la imagen original de cada especie, ésta es buena ya que presentan un 0.2 de distancia de unión, además podemos observar que existe una mayor discriminación entre las especies de 0.28 y una excelente asociación de 0.11 de distancia de unión entre las especies de cada subgénero.

Imágenes Patrones de difracción

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M1

T

MO

A

F1

A

FO

T

T1

T

TO

C

P1

C

PO

T

D1

T

DO

C

F1

C

FO

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

TM

1

T

MO

A

F1

A

FO

T

T1

T

TO

T

D1

T

DO

C

P1

C

PO

C

F1

C

FO

(a)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M2

T

MO

A

F2

A

FO

T

T2

T

TO

C

P2

C

PO

T

D2

T

DO

C

F2

C

FO

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M2

T

MO

A

F2

A

FO

T

T2

T

TO

C

P2

C

PO

T

D2

T

DO

C

F2

C

FO

(b)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M3

T

MO

A

F3

A

FO

T

T3

T

TO

T

D3

C

P3

C

PO

T

DO

C

F3

C

FO

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M3

T

MO

A

F3

A

FO

T

T3

T

TO

T

D3

T

DO

C

P3

C

PO

C

F3

C

FO



28

(c)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M5

T

M4

T

MO

A

F5

A

F4

A

FO

T

T4

T

T5

T

D5

C

P5

T

TO

C

P4

C

F5

T

D4

C

F4

T

DO

C

PO

C

FO

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

T

M5

T

M4

T

MO

A

F5

A

F4

A

FO

CF

5

CP

4

TT

4

TD

5

TT

5

CP

5

CF

4

TD

O

TD

4

TT

O

CP

O

CF

O

(d)

Figura 3.10.- Resultados de la comparación intra-específicas de los cinco casos vs el original. (a) caso I, (b) caso II, (c) caso III, (d) casos IV y V.

En la figura 3.10b tenemos representadas estas agrupaciones de correlación para el caso II y la imagen original de cada especie. Se presenta un comportamiento similar al descrito para el caso I. Sin embargo, los patrones de difracción (derecha) presentan una discriminación entre las especies mayor de 0.3 de distancia de unión, comparada con las imágenes (izquierda) que presentan una discriminación menor de 0.3 de distancia de unión para la mayoría de las especies.

En la figura 3.10c observamos el comportamiento para el caso III y la imagen original. En esta comparación, las imágenes (izquierda) no presentan una fuerte asociación entre las imágenes de caso III y las imágenes originales de cada especie. Además no existe una buena asociación entre las imágenes de las especies del mismo subgénero, confundiendo la imagen original de la especie C. dens (TDO) perteneciente al subgénero Tripoceratium con las especies del subgénero Ceratium (CF3 = C. furca , caso III y CP3 = C. pentagonum, caso III). En cambio en los patrones de difracción (derecha) si existe un incremento en la distancia de unión entre el caso III y la especie entera, pero no difiere mucho de las asociaciones de los casos anteriores. Además en este caso sí presentan una fuerte asociación entre las especies de cada subgénero (distancia de unión < 0.4) y una discriminación mayor que 0.28 entre los subgéneros.

En la figura 3.10d se presentan las comparaciones de los casos IV y V, que son cuando el organismo presenta la parte apical (caso IV, (4)) y la parte antapical (caso V, (5)) de la especie comparada con la imagen entera de la especie. En las imágenes (izquierda) se observa una menor discriminación que en los patrones de difracción. Esta es de 0.59, en cambio para los patrones de difracción (derecha) el valor es de 0.73 de distancia de unión. En las imágenes se presenta confusión en el agrupamiento de los casos con respecto a cada imagen entera de la mayoría de las especies. También en los patrones de difracción observamos este comportamiento, lo que indica que cuando la especie viene fragmentada en estos casos es muy difícil su identificación; sin embargo cuando en una muestra vienen las especies a este grado de segmentación, biológicamente no se cuentan



29

como un individuo vivo. Los patrones de difracción muestran que cuando el individuo viene en estos caso los asocia a una distancia mayor a 0.3 de distancia de unión y no existe una discriminación entre ellos, dando así, un resultado de no-identificación de estas partes de la especie.

De esta sección podemos concluir que los patrones de difracción no podrán asociar fragmentos de otras especies con la de interés, dado a su alto poder discriminatorio. En cambio, los fragmentos que son del caso I y caso II, presentan una importante característica en la identificación de estas especie, ya que ellos no son fácilmente reconocidos por los otros fragmentos. Se observó que los cuernos antapicales es la principal característica para reconocer a estas especies.

III.3.4.3. Problemas con las seis especies fragmentadas III.3.4.3.1. Correlación de los seis casos de fragmentación En la figura 3.11 observamos las agrupaciones cuando se correlacionan los seis casos de segmentación de las seis especies. La nomenclatura de este análisis para cada especie fue la siguiente: una letra que identifica a la especie y numerada del 0 al 6 que identifica a los casos, la letra (A) fue para la especie C. furca , la letra (B) para C. pentagonum, la letra (C) para C. macroceros, la letra (D) para C. tripos, la (E) para C. dens y (F) para C. fusus.

En la figura 3.11a representamos a las imágenes y en la figura 3.11b a los patrones de difracción. En ambos tratamientos la distancia máxima de unión fue casi la misma (0.76 para las imágenes (Fig. 3.11a) y 0.77 para los patrones de difracción (Fig. 3.11b). En los dos tratamientos no existió problemas en la asociación de los fragmentos de la especie de C. macroceros (C0…C6) y en los fragmentos de la especie C. fusus (F0…F6). De la misma manera se asociaron los mismos fragmentos de la especie C. furca , estos fueron A0, A1, A2, A6 y A3, teniendo el mismo problema de no asociar correctamente los casos en donde la especie viene fragmentada a la mitad (caso 4 y 5).

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

4

C5

C

3

C6

C

2

C1

C

O

F5

F

3

F4

F

6

F2

F

1

FO

D

4

D5

E

5

D3

B

5

E3

B

3

B6

B

2

B1

B

O

A5

B

4

D6

D

2

D1

D

O

E4

A

4

E6

E

2

E1

E

O

A3

A

6

A2

A

1

AO

(a)



30

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

5

C3

C

4

C6

C

2

C1

C

O

F5

F

3

F4

F

6

F2

F

1

FO

D

4

B4

A

5

E5

B

5

A4

E

3

B3

B

6

B2

B

1

BO

D

5

E4

D

3

D6

D

2

D1

D

O

E1

E

6

E2

E

O

A3

A

6

A2

A

1

AO

(b)

Figura 3.11.- Resultados de la comparación intra e inter-específicas de los fragmentos de las seis especies. (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción.

Además los patrones de difracción presentaron mejor discriminación de estos fragmentos de esta especie que con los demás fragmentos de las otras especies. Para la especie B (C. pentagonum) en los dos tratamientos se agruparon los mismos fragmentos (B0, B1, B2 y B6). En esta especie se tuvo problemas con el fragmento B3 que representa a la especie sin el cuerno antapical que se confundió con el mismo caso (E3) de la especie E (C. dens).

También podemos observar la consistencia en tener una mayor discriminación entre estos fragmentos con respecto a los demás fragmentos en los patrones de difracción; en el caso de la especie D (C. tripos) si existió una mejor asociación entre sus fragmentos en los patrones de difracción que en las imágenes, ya que los patrones de difracción asociaron a los fragmentos de los casos 0, 1, 2, 3, y 6. En cambio las imágenes sólo asociaron a los fragmentos 0, 1, 2, y 6 de esta especie. Además podemos notar nuevamente la consistencia de la discriminación de los fragmentos de esta especie con las demás. Cosa que no sucede en las imágenes donde la asociación de los fragmentos están entre fragmentos de otras especies como son las B4 (C. pentagonum, caso IV) y E4 (C. dens, caso IV) respectivamente. En la especie E (C. dens), los mismos fragmentos fueron asociados en los dos tratamientos (E1, E2, E6 y E0) la única diferencia fue el grado de discriminación de estos fragmentos con respectos a los demás de las otras especies, siendo mayor en los patrones de difracción.

Los resultados obtenidos en esta comparación se debe posiblemente al efecto que tiene los fragmentos de los casos IV y V que no tiene un significado biológico y que presentan un factor de confusión grande como se observó en la figura 7.10d.



31

III.3.4.3.2. Fragmentos de las especies con significado biológico En la figura 3.12 observamos los casos en que sí se tiene un significado biológico como especímenes y no tener la incertidumbre de que estamos contando dos veces al mismo organismo. Estos casos son: I, II, III y el VI, usando la misma nomenclatura que la figura anterior (Fig. 3.12). La figura 3.12a representa a las imágenes y la figura 3.12b a los patrones de difracción. En general, los patrones de difracción presentaron una mejor asociación entre los fragmentos de cada especie y una mayor unión entre las especies. Es decir, cuando vemos el análisis con los fragmentos que presentan un significado biológico en los dos tratamientos sólo se confunden una sola vez, que es la comparación del fragmento E3 (C. dens, caso III) con B3 ( C. pentagonum, caso III).

Sin embargo, consistentemente presentan las mismas propiedades en los resultados basados en los patrones de difracción que es la fuerte asociación intra-específica y la fuerte discriminación inter-específica de estos fragmentos de estas especies.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

3

C6

C

2

C1

C

O

F3

F

6

F2

F

1

FO

D

3

D6

D

2

D1

D

O

E3

B

3

B6

B

2

B1

B

O

E6

E

2

E1

E

O

A3

A

6

A2

A

1

AO

(a)



32

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

3

C6

C

2

C1

C

O

F3

F

6

F2

F

1

FO

E

6

E2

E

1

EO

D

3

D6

D

2

D1

D

O

E3

B

3

B6

B

1

B2

B

O

A3

A

6

A2

A

1

AO

(b)

Figura 3.12.- Resultados de la comparación intra e inter-específicas de los fragmentos de las seis especies que presentan un significado biológico. (a) dendrograma de imágenes y (b) dendrograma de patrones de difracción.

III.4. CONCLUSIONES Las cuatro hipótesis que fueron presentadas en el comienzo de este capítulo fueron probadas.

Los resultados del análisis de las correlaciones de los patrones de difracción de las imágenes y las correlaciones de las imágenes presentaron que:

El ruido ocasionado por los problemas de fondo de la imagen, por la variación en la sedimentación de la célula, por la variación natural de la morfología de la especie y además los problemas intra-específicos es menor en los patrones de difracción.

Los patrones de difracción presentaron una mejor asociación y un mayor valor de correlación entre las especies de un subgénero que con especies de otro subgénero del género Ceratium.

Los patrones de difracción presentaron una mejor asociación y una mayor correlación entre los fragmentos que tienen un significado biológico en cada especie del género Ceratium.

Estas ventajas en los patrones de difracción pueden ser de gran uso cuando se pretende realizar un sistema automatizado de identificación de especies fitoplanctónicas.



33

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS CAPÍTULO IV [SISTEMA ÓPTICO-DIGITAL APLICADO A LA IDENTIFICACIÓN DE CINCO ESPECIES DE

FITOPLANCTON]

34

C A P Í T U L O I V

SSiisstteemmaa óóppttiiccoo--ddiiggiittaall aapplliiccaaddoo aa llaa iiddeennttiiffiiccaacciióónn ddee cciinnccoo eessppeecciieess ddee ffiittooppllaannccttoonn ¿Cuales son los resultados obtenidos en la identificación de especies fitoplanctónicas en el sistema óptico-digital ?

n sistema óptico-digital fue aplicado a la identificación de cinco especies de fitoplancton del género Ceratium colectados en la bahía de Todos Santos, Ensenada, B. C. México. Este sistema puede reconocer estas especies con un porcentaje de confiabilidad de un 90%, no importando la escala, rotación y

ubicación de los organismos en la imagen analizada. Un filtro holográfico para cada especie fue construido con el fin de correlacionarlos con seis imágenes problemas que contienen a organismos de esta especie. Para evaluar la efectividad de este sistema de correlación, imágenes de un gran número de organismos de una especie fue usada como entrada al sistema. Con un sólo filtro holográfico se identificaron a cien organismos de esta especie. Las especies de fitoplancton del género Ceratium que fueron analizadas son importantes como indicadores ya que algunas de estas especies son responsables del florecimiento de las mareas rojas en el área de la bahía de Todos Santos de Ensenada Baja California.

CAPÍTULO

4

U


FITOPLANCTON]

35

IV.1. INTRODUCCIÓN Las especies del fitoplancton son de gran importancia en la ecología ya que ellas constituyen una gran porción de productores primarios en el océano (Zeitzschel, 1978).

La técnica del microscopio es usada para identificar y contar especies de fitoplancton de una muestra de agua de mar. Estos conteos son usados para escribir comunidades planctónicas y patrones de distribución en el espacio y tiempo, al igual también son usados para convertir la cantidad de fitoplancton en número en biomasa o energía (ejemplo: en términos de carbono orgánico o calorías respectivamente). Estos datos de carbono son importantes ya que son usados para realizar modelos de dinámica trófica de los ecosistemas marinos (Zeitzschel, 1978). Sin embargo, la observación al microscopio de estos organismos que se realiza manualmente por un observador especialista es tardado y laborioso, cuando es analizado un gran número de muestras (Furuya, 1982); además, es muy fácil confundirse en la identificación. Un método que realice una rápida identificación y cuantificación de organismos fitoplanctónicos de una muestra de agua de mar es necesaria. Algunos métodos automatizados para identificar y contar plancton y microorganismos han sido reportados (ejemplo: Balfoort et al., 1992; Simpson et al., 1992; Culverhouse et al., 1996), los cuales estandarizaron las observaciones al microscopio y emplearon análisis computarizados de los resultados, usando técnicas avanzadas de estadística multivariada y redes neuronales.

En este capítulo, aplicamos la técnica descrita por Casasent y Psaltis (1976 a,b,c,), que presenta un sistema de patrones de reconocimiento para convertir un objeto invariable a rotación y escala. La técnica es aplicada por primera vez en un sistema híbrido óptico-digital para la identificación de cinco especies de fitoplancton del género Ceratium (familia Ceratiidae).

IV.2. MATERIALES Y MÉTODOS Se seleccionó al género Ceratium porque existen problemas en su discriminación taxonomía, ya que existen muchas variaciones en su morfología natural de sus especies (López, 1966; Bravo et al., 1995 a, b; Subba, 1995; Mc Call et al., 1996). Las especies estudiadas son: C. Furca y C. Pentagonum (subgénero Ceratium), C. macroceros y C. tripos (subgénero Tripoceratium) y C. fusus (subgénero Amphiceratium) (Sournia (1986) y Balech (1988) )

Los organismos del fitoplancton fueron colectados mediante una red cónica de la bahía de Todos Santos de Ensenada B.C., entre 31°41’ y 31°56’ de latitud norte y 116°34’y 116°51’ latitud oeste y fueron preservadas en formaldehído al 4% neutralizado con borato de sodio (Throndsen, 1978). Una sub-muestra de 0.3 ml fue tomada de esta muestra y con 0.7 ml de agua limpia fue adicionado en una cámara de conteo Sedgwick-Rafter para su dilución ( Guillard, 1978 ). Cada sub-muestra fue directamente colocada en el microscopio y obtenida su imagen para el análisis de las cinco especies.


FITOPLANCTON]

36

Las fotografías fueron tomadas en un microscopio compuesto “Wild Heerbrugg” M20 EB con un dispositivo adaptador para cámara de 35 mm de la marca Canon. La película usada fue Technical-Pan 2415 de alto contraste con un ASA de 250. El intervalo de tiempo de exposición para cada imagen fue 10 (± 2 segundos). El rollo fotográfico fue revelado según la técnica desarrollada por Álvarez-Borrego (1987). Se seleccionaron las fotografías que presentaron un mejor contraste y limpias de detritus. Se usó un digitalizador (scanner) HP Scanjet IIP de la Hewlett-Packard, para obtener las matrices de datos de las fotografías (256 x 256 pixeles) y se definió la función ),( yxf para cada pixel de la imagen en las coordenadas x e y .

La figura 4.1 muestra los ocho pasos de la correlación invariante a escala, rotación y ubicación. Los primeros cuatro pasos son realizados digitalmente y los demás en una forma óptica. La ventaja de usar un sistema híbrido (óptico-digital) sobre un sistema digital es que el tiempo de procesamiento se reduce considerablemente.

La transformada de Mellin, ( )jvjuM , es usada en este proceso de correlación porque es invariante a escala. En dos dimensiones se define según Casasent y Psaltis (1976b), como:

( ) ( ) dxdyyxyxfjvjuM jvju∫ ∫∞

−−−−=0

11,, ,

(1)

donde ( )vu, son las nuevas coordenadas de la imagen obtenidas por esta ecuación y j es

el número imaginario 1− ; además en una dimensión es:

( ) ( ) dxxxfjwM jw∫∞

−−=0

1 ,

(2)

donde ( )w es la nueva coordenada de la imagen. Por simplicidad M(jw) puede ser escrita como M(w). Ya que la operación básica realizada por una lente en un sistema óptico es la transformada de Fourier (Goodman, 1996), tenemos que realizar la transformada de Mellin ópticamente vía transformada de Fourier (la cual es invariante a posición). Esto es posible ya que una operación matemática lineal puede ser escrita en la forma general como:

( ) ( ) ( )dxxKxfgx

x

,2

1

∫= αα ,

(3)


FITOPLANCTON]

37

donde g(α) es la integración de el producto de la función ( )xf con el núcleo ( )xK ,α (Arfken 1981) y α es cualquier variable. La única diferencia entre una transformada es su núcleo ( )xK ,α . Por ejemplo la transformada de Fourier es

( ) ( ) [ ]dxxjxfg exp αα −= ∫+∞

∞−

,

(4)

(1) (2) (3) (5) (4) (6)

f (x,y) | F(wx , wy ) | F(r,θ)

F(exp(ρ),θ)

ρ = ln (r)

M(wρ , wθ )

Transformada óptica de Fourier

Interferómetro modificado de

Rayleigh

M*(wρ , wθ )

Correlación óptica

invariante

Procedimiento para construir un filtro


FITOPLANCTON]

38

(7) (8) Procedimiento para una imagen normal Procedimiento de correlación Figura 4.1.- Diagrama de flujo que presenta los ocho pasos para la correlación invariante a ubicación, rotación y escala.

donde exp[-jαx] es el núcleo de la transformación y la transformada de Mellin es:

( ) ( ) dxxxfg 1

0

−∞

∫= αα , (5)

donde 1−αx es el núcleo de la transformación.

Así, podemos usar lo anterior para escribir la transformada de Mellin mediante la transformada de Fourier, haciendo un cambio de variable de la forma x = exp[q] en la ecuación (2):

( ) [ ]( ) [ ]dqjwqqfwM exp exp −= ∫+∞

∞−

,

(6)

donde q es cualquier variable.

La transformada de Mellin de la función ( )xf puede ser escrita semejante a la transformada de Fourier de la función [ ]( )qf exp y esto nos permite realizar ópticamente la transformada de Mellin. Con la combinación de las transformadas de Fourier-Mellin, obtenemos la correlación invariante a escala y rotación de la función de entrada.

De acuerdo con Casasent y Psaltis (1976a) es más fácil hacer un correlacionador invariante a escala por medio de la manipulación de la transformada de Fourier que cambiando directamente la función de entrada (Fig. 4.1). Inicialmente en el paso 1 (Fig. 4.1) tenemos una función de entrada f(x,y), a la cual se le calcúla el módulo de la rápida transformada de Fourier |F(wx,wy)| (paso 2), de esta manera cualquier desplazamiento de la función de entrada, f(x,y) es evitada. Un ángulo θ de rotación en f(x,y) afecta en la misma forma a |F(wx,wy)|, al igual que un cambio de escala “a” en f(x,y) se refleja en |F(wx,wy)| por un factor de |a|-1.


FITOPLANCTON]

39

Los efectos de la rotación y la escala pueden ser separados por medio de una transformación polar de |F(wx,wy)|, de las coordenadas (wx,wy) a las coordenadas (r, θ ). Si

= −

x

y

w

w1tanθ ,

(7)

y

r w wx y= +2 2 , (8)

un cambio de escala en |F(wx,wy)| por “a”, afectaría a la coordenada r en r’ = ar, sin afectar este cambio a la coordenada θ. Así, cualquier cambio de escala en la función de entrada bidimensional solamente afectaría en una dimensión la función F(r,θ ) (paso 3 de la Fig. 3.1).

La transformada de Mellin en r de la función F(r,θ ) daría una transformación invariante a escala en la forma de:

( ) ( ) drrrFwM jw 1

0

,, −−∞

∫= θθρ ,

(9)

donde ρ = ln (r). Por lo tanto la transformada de Mellin de la función escalada F(ar,θ ) es

( ) ( )θθ ρρ ,, wMawM jw=′ , (10)

siendo los módulos de estas dos transformaciones los mismos y por lo tanto invariantes a escala. La ecuación (9) puede ser reescrita como

( ) ( )[ ] [ ] ρρθρθρ djwFwM −= ∫∞

∞−

exp,exp, ,

(11)

y esta ecuación puede ser realizada ópticamente.


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40

En el paso 4 de la figura 4.1, un cambio de variable fue realizado con respecto a r: F(exp(ρ),θ), donde ρ es el ln (r). Esta transformación (paso 4) fue colocada en un sistema óptico coherente para producir la transformada de Mellin (paso 5) vía transformada de Fourier. En el paso 6, la imagen digital obtenida en el paso 4 fue colocada en un sistema interferométrico modificado de Rayleigh (Goodman, 1996) para sí obtener filtro óptico de Mellin (paso 7). La correlación del filtro óptico (paso 8) con la transformada de Mellin de la imagen a identificar, produce valores muy bajos para organismos geométricamente diferentes y valores muy altos de correlación para organismos geométricamente similares.

Cinco filtros holográficos fueron realizados (paso 7) uno para cada especie de Ceratium: C. furca (Fig. 4.2a), 81 micras (tamaño real), con un aumento de 400x, C. pentagonum (Fig. 4.2b), 100 micras, con 350x de aumento; C. macroceros (Fig. 4.2c), 186 micras, con un aumento de 225x, C. tripos (Fig. 4.2d), 110 micras, con 285x de aumento; C. fusus (Fig. 4.2e), 106 micras, con 270x de aumento. Un sistema interferométrico modificado de Rayleigh (Goodman, 1996) fue usado para generar los filtros ópticos de estas imágenes (Fig. 4.3).

Por medio de un sistema computacional cada imagen de la especie digitalizada fue convertida en valores binarios. Seis imágenes problemas fueron fabricadas aleatoriamente y se repitieron los pasos 2, 3, 4,. y 5 (Fig. 4.1). La función F(exp(ρ),θ), de cada imagen problema fue fotografiada y almacenada en un negativo fotográfico. Este negativo fue correlacionado ópticamente (paso 8) con cada filtro holográfico de cada especie a identificar.


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41

Figura 4.2.- Especies del género Ceratium. Procesamiento de cada filtro óptico para cada especie. (i) imagen binaria, (ii) módulo de la transformada de Fourier correspondiente a la imagen binaria; (iii) transformada polar de las coordenada del módulo (ii); (iv) similar como en (iii), pero con theta vs ln(r). (v) transformada de Mellin de las imágenes (a-e).

Figura 4.3.- Sistema interferómetro modificado por Rayleigh para generar filtros holográficos. La luz es un láser Helio-Neón (He-Ne) [ Lentes: L1, L2, L3; longitud focal f ; x1, y1, x2, y2, representan las coordenadas del plano de entrada y plano del filtro respectivamente].


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El filtro óptico fue puesto en una montura con movimiento x, y, y z del plano P2, (Fig. 4.4).

Computadora

Figura 4.4.- Sistema de correlación óptico coherente (CCD “charger coupled divice”; las demás simbologías son similares a la figura 4.3).

Una cámara (CCD) fue colocada en el plano P3 con el fin de medir los valores de correlación de las imágenes problema y su correspondiente filtro holográfico de la especie de interés. La información fue guardada y graficada en tres dimensiones.

IV.3. RESULTADOS Usando imágenes binarias de (a) C. furca , (b) C. pentagonum, (c) C. macroceros, (d) C. tripos y (e) C. fusus, obtuvimos las imágenes de los contornos de cada especie (de la a a la e Fig. 4.2.) La Fig. 4.2i muestra las imágenes binarias de cada especie; la Fig. 4.2ii muestra el módulo de la transformada de Fourier de cada una de las imágenes binarias, la Fig. 4.2iii muestra las coordenadas polares del módulo (Fig. 4.2ii), donde theta presenta valores de 0 a 360° y r de 0 a 181.02; en la Fig. 4.2iv observamos esta misma transformación pero graficando ln (r) vs. teta, los valores de ln (r) son de 0 a 5.20 y teta de 0 a 360° y Fig.4.2v muestra la transformada de Mellin de cada imagen.


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43

La figura 4.5 muestra los dendrogramas de las correlaciones de las imágenes de Ceratium furca y las correlaciones de los patrones de difracción. En el eje x se muestran 100 individuos y en el eje y la distancia de unión (Euclidiana).

Cien imágenes 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Cien patrones de difración 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(a) (b)

Figura 4.5.- Dendrogramas de imágenes de Ceratium furca (a) y de los patrones de difracción (b).

El siguiente paso fue identificar una especie en particular en imágenes en donde existen varias especies de Ceratium. Seis imágenes problemas fueron creadas aleatoriamente (tabla 4.I).

Tabla I.- Datos de los organismos que forman a las imágenes problemas.

Organismo Tamaño en micras Diferencia de tamaño con respecto al organismo del

filtro

Diferencia en rotación con respecto al organismo del

filtro Primera imagen

Ceratium furca 81 250% 0° Ceratium pentagonum 100 250% 0° Ceratium macroceros 186 190% 0°

Ceratium tripos 110 215% 0° Ceratium fusus 106 190% 0°

Segunda imagen Ceratium furca 88 160% 3° Ceratium furca 76 188% 30° Ceratium furca 81 177% 120°

Tercera imagen Ceratium furca 95 152% 2°

Ceratium macroceros 169 112% 2° Ceratium furca 99 145% 123°

Cuarta imagen Ceratium pentagonum 104 147% 2°

Ceratium tripos 111 131% 3° Ceratium pentagonum 95 161% 121°

Quinta imagen Ceratium macroceros 165 115 3°

Ceratium tripos 106 134 0° Sexta imagen Ceratium tripos 104 137% 0° Ceratium tripos 107 131% 126° Ceratium fusus 103 121% 0°


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44

La correlación de la primera imagen problema (Fig. 4.6a) con el filtro óptico de Ceratium furca (Fig. 4.2a), muestra un pico que indica la presencia de un individuo de C. furca en esta imagen problema. La correlación de la segunda imagen problema (Fig. 4.6c) con el mismo filtro holográfico (Fig. 4.6d); muestra tres picos de correlación, indicando tres individuos de esta especie en la imagen. La localización de los picos depende del tamaño y rotación de cada individuo en la imagen.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.6.- Resultado de la identificación de Ceratium furca . a) primera imagen problema b) su correspondiente pico de correlación, c) segunda imagen problema y d) sus correspondientes picos de correlación.

(a) (b)

(c) (d )


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Figura 4.7.- Resultado de la identificación de Ceratium pentagonum. a) primera imagen problema b) su correspondiente pico de correlación, c) cuarta imagen problema y d) sus correspondientes picos de correlación.

En la figura 4.7 se observan los resultados de la identificación de C. pentagonum en la primera imagen y en la cuarta imagen problema. En (a) se presenta a la primera imagen problema y en (b) la gráfica del correlación en estas se observa un pico de correlación que indica la presencia de C. pentagonum en la imagen en donde las cinco especies están representadas. En (c) se observan a la cuarta imagen y en (d) los resultados de la correlación de la cuarta imagen problema, en esta gráfica se observan dos picos, lo que indica la identificación de dos organismos en la imagen de C. pentagonum.

En la figura 4.8 se observan la identificaciones de las especies C. macroceros y la especie C. tripos. En (a) se observa a la cuarta imagen problema, en (b) los resultados de la identificación de C. macroceros, en este resultado se puede observar un pico de correlación que indica la presencia de un organismo de la especie Ceratium macroceros en la imagen problema. En (c) observamos a la quinta imagen problema y en (d) la gráfica de correlación de la identificación de C. tripos, en esta podemos observar un pico de correlación lo que indica la presencia de un organismo de esta especie.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.8.- Resultado de la identificación de Ceratium tripos y C. macroceros. a) tercera imagen problema b) su correspondiente pico de correlación, c) quinta imagen problema y d) sus correspondientes picos de correlación.

En la figura 4.9 se observan los resultados de la identificación de la especie C. fusus. En (a) se observa la sexta imagen problema y en (b) la gráfica de correlación donde se


FITOPLANCTON]

46

observa un pico de correlación, lo que indica la presencia de un organismo de la especie de Ceratium fusus en la sexta imagen.

(a) (b)

Figura 4.9.- Resultado de la identificación de Ceratium fusus. a) sexta imagen problema b) su correspondiente pico de correlación.

Para determinar la sensibilidad de la técnica, se realizaron correlaciones cruzadas entre cada especie (Figs. 2a hasta 2e) y el filtro holográfico de la especie Ceratium furca .

La figura 4.10 muestra la autocorrelación de la especie Ceratium furca (Fig. 4.10a), y las correlaciones cruzadas de C. furca con C. pentagonum (Fig. 4.10b), C. macroceros (Fig. 4.10c), C. tripos (Fig. 4.10d), y C. fusus (Fig. 4.10e). Los valores de estas correlaciones son presentados en la tabla 4.2.

Figura 4.10.- Resultado de la prueba de caracterización de la técnica, empleando el filtro de Ceratium furca . a) autocorrelación de C. furca, b) la correlación de C. pentagonum y el filtro de C. furca , c) la correlación de C. macroceros vs C. furca, d) la correlación de C. tripos vs C. furca y en e) la correlación de C. fusus vs C. furca .


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Tabla II.- Ceratium spp. Valores de la autocorrelación y correlación cruzada de cada filtro holográfico probado.

C. furca C. pentagonum C. macroceros C. tripos C. fusus C. furca 1.00 0.10 0.01 0.01 0.10 C. pentagonum 0.10 1.00 0.01 0.01 0.10 C. macroceros 0.01 0.01 1.00 0.10 0.10 C. tripos 0.01 0.01 0.10 1.00 0.10 C. fusus 0.10 0.10 0.10 0.10 1.00

La figura 4.11 presenta los valores de correlación de 100 individuos de C. furca , tomados directamente del microscopio (no limpias), con el filtro holográfico de la misma especie limpia de detritus y burbujas y fragmentos de especies diferentes o similares, y la figura 12 presenta seis imágenes representativas de estos 100 individuos.

Organismos

Val

or

de

corr

elac

ión

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

05

1015

2025

3035

4045

5055

6065

7075

8085

9095

100

Autocorrelación

(a) (b)

Figura 4.11.- Ceratium furca. Valores de correlación de 100 individuos. a) resultados numéricos y b) media ± desviación estandar (D. E.)

(a) (b) (c) (d) ( e) (f)

One hundred organism

Val

or d

e co

rrel

ació

n

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

±1.96*D.E. ±1.00*D.E. D. E. = .019Media = .85

Cien individuos


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Figura 4.12.- Ceratium furca . Imágenes con detritus, burbujas y fragmentos de varias especies.

IV.4. DISCUSIONES Las cinco especies de Ceratium examinadas siempre presentaron las vistas dorsales o ventrales, dado a esto, estas especies son ideales para este tipo de análisis (ya que son dorso-ventralmente aplanados). Sin embargo, su morfología varía mucho intra-espécificamente y por lo tanto es muy difícil diferenciar entre las especies, especialmente cuando existen más de 20 especies en la muestra de fitoplancton analizada.

Para poder evaluar la eficiencia de la técnica de correlación satisfactoriamente, un gran número de imágenes de organismos de diferentes muestras se usaron para medir la variación morfológica natural de la especie. Los filtros ópticos que no son invariantes comúnmente fallan en dar resultados buenos, ya que en diferentes muestras la misma especie presenta distintos ángulos de vista, condición de luz, etc. En este capítulo se usaron 100 muestras para determinar si es posible identificar a esta especie usando solamente un filtro.

Los resultados indican que existe muy poca variación cuando los patrones de difracción son correlacionados con las imágenes problemas (Fig. 4.5); en este resultado solo fue usado un filtro holográfico. La asociación entre estas 100 muestras fue claramente buena, indicando que la técnica trabajo satisfactoriamente en la identificación (Figs. 4.6 a la 4.9).

En la figura 4.10 se muestra la sensibilidad de la técnica. Cuando las especies comparadas no corresponden a la especie que se encuentra en el filtro óptico el pico de correlación es ausente o mínimo (Fig. 4.10 b, e), representando el 10% del valor encontrado cuando la especie si es la misma que la del filtro (normalizado a 1.0).

Los resultados han demostrado la sensibilidad y confiabilidad del método propuesto de Casasent y Psaltis (1976a, b, c). Los resultados demuestran que el sistema es altamente discriminante (>90%). Solamente se presenta un pico de correlación cuando los organismos de la misma especie que se encuentra en el filtro se encuentran en las muestras analizadas (Fig. 4.10). Cuando el filtro óptico es comparado con imágenes de organismos de la misma especie que la del filtro, pero estas imágenes presentan contaminación de detritus, burbujas de aire y fragmentos de otras especies, la sensibilidad del método es del 0.85±0.019 (Fig. 4.11).

IV.5. CONCLUSIONES Se concluye que el sistema híbrido óptico-digital, presentó una eficiencia en la identificación de estas cinco especies del género Ceratium de un 90%.


FITOPLANCTON]

49

Las especies fueron identificadas correctamente no importando la rotación, escala y ubicación de los organismos de cada especie de la imagen problema analizado.

Se observó que sólo se requiere un filtro holográfico de cada especie para realizar una correcta identificación en el sistema óptico-digital, aún existiendo variación morfológica en las especies.

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS CAPÍTULO V [IDENTIFICACIÓN DE UNA ESPECIE FORMADORA DE MAREA ROJA EN UN SISTEMA ÓPTICO-DIGITAL

AUTOMÁTICO]

50

C A P Í T U L O V

IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddee uunnaa eessppeecciiee ffoorrmmaaddoorraa ddee mmaarreeaa rroojjaa eenn uunn ssiisstteemmaa óóppttiiccoo--ddiiggiittaall aauuttoommááttiiccoo ¿Cuáles son los problemas que se solucionan en una identificación automática?

ctualmente un tema de gran interés para la comunidad científica es obtener un sistema de monitoreo automático de organismos formadores de mareas rojas. Los avances en los sistemas para realizar el monitoreo automatizado han demostrado que sí se puede lograr esta automatización. En este capítulo se presenta un análisis de los problemas en la identificación

automatizada de fitoplancton responsables de las mareas rojas usando un sistema óptico-digital automático. Estos problemas son: diferencias de tamaño de los organismos de una especie, diferentes rotación y ubicación de los organismos en un campo de microscopio y comparación con estas mismas propiedades pero con organismos de especies diferentes. El análisis fue realizado automáticamente usando una pantalla de cristal líquido como interface de la parte digital con la parte óptica. Por primera vez se realiza este análisis en un sistema híbrido en tiempo real.

CAPÍTULO

5

A


AUTOMÁTICO]

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V.1. INTRODUCCIÓN Diversos grupos de investigadores internacionales han tratado de diseñar un sistema de monitoreo automatizado para conocer de una manera más rápida y confiable la identificación y cuantificación de las especies de marea roja para prevenir grandes catástrofes. Sin embargo los problemas de fondo de la imagen, posición de sedimentación del organismo en el campo de observación, distorsión natural de la morfología de la especie, problemas inter-específicos con dos especies, además de los problemas importantes y críticos de los sistemas de patrones de reconocimiento que son: la ubicación, escala y rotación de los organismos (PUERO), a causado que ningún sistema funcione correctamente automáticamente en la actualidad ( Levkovitz et. al., 1997).

EL desarrollo de un sistema automático óptico-digital que supera el PUERO se analiza en este capítulo.

V.2. MATERIALES Y MÉTODOS

V.2.1. Especies fitoplanctónicas Se procesaron un total de 300 imágenes de individuos de 9 especies de fitoplancton. La especie fitoplanctónica formadora de marea roja seleccionada en este estudio fue Ceratium dens (figura 5.1). Esta especie es importante ya que se le atribuye una gran mortandad de larvas de camarón en las granjas de este crustáceo en las costas de Sinaloa, México (Cortés-Altamirano y Alonso-Rodríguez, 1997).

Figura 5.1.-Ceratium dens. Fotografía tomada por Roberto Cortés Altamirano.

Para evaluar la funcionalidad del sistema se realizaron identificaciones de individuos de C. dens rotados de 0° hasta 360° en intervalos de 5°, individuos de 60% hasta 100% de su


AUTOMÁTICO]

52

tamaño promedio y comparaciones con individuos de otras ocho especies de fitoplancton (Fig. 5.2).

Ceratium dens

Ceratium furca

Ceratium pentagonum

Ceratium tripos

Actinocyclus ingens

Thalassiosira domifacta

Nitzschia reinholdii

Pseudotripoceratoium

cinamomeum

Heterocapsa rotundatum

Figura 5.2.- Imágenes de las especies usadas en el análisis. La especie Heterocapsa rotundatum, fue colectada e identificada por la Dra. Elizabeth Orellana-Cepeda en 1996 y reportada en el informe FCM-UABC-CONACyT 431100-5-1984PT.

V.2.2. Preparación de la muestra La muestra de agua de mar fue colectada con una botella de un galón de volumen. Inmediatamente se vierte parte de esta muestra a un frasco de volumen conocido y se le adiciona lugol para su fijación. En el laboratorio se homogeniza la muestra por espacio de tiempo de un minuto y se toma una sub-muestra de un mililitro con una pipeta


AUTOMÁTICO]

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Pasteur, esta sub-muestra se vierte en una cámara de conteo de células tipo Sedgwick-Rafter (Cortés-Altamirano, 1998).

V.2.3. Observación de la muestra en el microscopio La cámara de conteo fue montada en un microscopio compuesto, primero, se selecciona el aumento correcto que depende del tamaño de la célula que se quiere identificar, es decir, el aumento seleccionado debe de ser capaz de mostrar a la célula completa y con un detalle de resolución donde se puedan apreciar las características morfológicas distintivas de la especie. Se recomienda que la célula ocupe toda el área de observación o la máxima cantidad del área de observación con el fin de obtener una buena resolución de la imagen de la célula. Por ejemplo: si la célula es de un tamaño de 150 micras el aumento usado sería 25x en el objetivo y 10x en el ocular en un área de 350x350 pixeles de observación. Una vez seleccionado el aumento correcto se procedió a obtener la imagen de cada célula encontrada con el sistema digital. La cámara de conteo es barrida moviendo el carro horizontalmente y desplazando un campo de área verticalmente, hasta cubrir toda el área de la cámara (Fig. 5.3).

Figura 5.3.- Cámara de conteo Sedgwick-Rafter. Las flechas indican el movimiento de barrido de la muestra.

V.2.4. Captura de la imagen del organismo Una vez observada la imagen del organismo en el campo del microscopio por medio de un sistema digital (ver Fig. 5.4) se realiza la captura de la imagen.

A

B

C


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Figura 5.4.- Sistema digital para capturar imágenes de los organismos del fitoplancton. A) microscopio en donde se observa la muestra de agua de mar, B) CCD y C) Computadora en donde se encuentra instalada la tarjeta grabadora de imágenes y los programas de procesado de imágenes.

En el sistema digital el detector es un sensor de imagen sólido llamado "charge coupled device" (CCD). Sobre el área del CCD una matriz de microscópicas fotoceldas, crea pixeles para medir la intensidad de luz de porciones de la imagen en el campo de observación, así nuestra imagen es capturada digitalmente a través de una cámara CCD. Esta imagen es capturada por medio de una tarjeta grabadora de imágenes, que es controlada por un programa procesador de imágenes.

El modelo de cámara utilizada es un CCD-C72E de DAGE-MTI, Inc., controlada desde la PC por medio de una tarjeta capturadora modelo LG-3 de la Scion Co. En la misma se puede ver como por medio de un programa de procesado de imágenes llamado “ImagePC” se despliegan continuamente los cuadros capturadas por la tarjeta y la cámara, uno detiene en el momento que la imagen deseada es vista en el monitor, el sistema permite también a través del software hacer ajustes para mejorar la señal, como es por ejemplo el “gain” y el “Offset”, funciones bajo el menú “special” de la caja de dialogo “Video Control”. Una vez que el proceso de captura es detenido, el cuadro capturado esta listo para su archivo o análisis.

V.2.5. Procesamiento de identificación Usando los algoritmos de la transformada de FOURIER-MELLIN, se realizó la invariancia al PUERO, para una descripción detallada de las matemáticas ver Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego (1997).

La identificación de la especie fue realizada en un sistema óptico-digital automático (Fig. 5.5). El uso de la pantalla de cristal líquido como interface del sistema digital al óptico dio como resultado la identificación automática de la especie.


AUTOMÁTICO]

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Figura 5.5.- Sistema óptico-digital para la identificación automatizada de partículas biogénicas en tiempo real. Detalles del sistema y descripción del mismo se encuentran en el texto.

En la figura 5.5 observamos el sistema completo para la identificación automatizada en tiempo real de partículas biogénicas. Con números representamos la partes del sistema óptico de correlación. Estas partes son: la fuente de luz Láser (1), el filtro espacial (2), la lente colimadora (3), la pantalla de cristal líquido (4), la lenta transformadora de Fourier (5), el carrusel de filtros holográficos (6) que es una estructura que contiene varios filtros que son movidos manualmente, la lente correlacionadora (7) y el plano de salida de la correlación en donde se encuentra el CCD-C72E (8).

En esta misma figura observamos los diferentes pasos que se realizan y los diferentes componentes que se cuenta para realizar la identificación automatizada en tiempo real. El paso A, es en donde se colecta la muestra, esta debe de ser evaluada con respecto a su volumen para conocer la densidad de las especies en la muestra; el paso B muestra el sistema de captura de la imagen, esta se realiza por medio de un microscopio compuesto de transmisión de luz en el cual se selecciona el objetivo y el ocular adecuado para tener una imagen clara y de alta calidad de la especie que se quiere procesar, la imagen es capturada digitalmente por un sistema digital (CCD) que manda la información a una computadora; con la letra C representamos el paso en el cual la información de la especie es cambiada del campo espacial (imagen de la especie, Fig. 5.6) a un campo de frecuencia (Fig. 5.7) por medio de un algoritmo de la transformada de Fourier, a esta información se le aplica en esta misma computadora, un cambio de coordenadas de cartesianas a polares donde en el eje de las x representa el ln r y en el eje de la y representa a θ (Fig. 5.8) por medio de un algoritmo de cambio de coordenada; esta imagen es desplegada en el monitor de la computadora y además es mandada automáticamente en tiempo real a la pantalla de cristal líquido que es el paso D, la pantalla de cristal líquido despliega la información que se va ha correlacionar con los diferentes filtros holográficos de cada especie paso E (Fig. 5.9). En este paso E es en donde manualmente se coloca el filtro holográfico que tiene la información de la especie que se quiere identificar, además se dispone de un catálogo de filtros para así poder identificar varias especies en el análisis de una muestra de agua de mar; en el paso F se obtiene el resultado de la identificación automatizada en tiempo real de partículas biogénicas. Estos resultados se muestran en forma de picos de correlación que indican la presencia de organismos de la especie que se está identificando (Fig. 5.10).


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Figura 5.6.- Imagen de la especie en el campo de espacio. La especie es Ceratium tripos.

Figura 5.7.- Imagen en el campo de frecuencia. Modulo de la transformada de Fourier del organismos Ceratium tripos.

Figura 5.8.- Imagen del monitor de la computadora de la transformación del modulo de la transformada de Fourier de la especie Ceratium tripos de coordenadas cartesianas a coordenadas polares escalada en r con el ln.


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Figura 5.9.- Filtro holográfico de la especie Ceratium tripos. El filtro esta grabado en una placa holográfica PFG-01 con una resolución de 5000 líneas por milímetro.

Los picos de correlación son capturados por medio de un CCD-C72E (ver sus detalles técnicos del CCD en Álvarez-Borrego, 1997). Estos picos indican cuantos organismos existe de la especie que se está identificando. Cada pico de correlación ofrece la información de cada organismo en la imagen problema. Por medio de un algoritmo se cualifican (presencia de picos de correlación) y cuantifican (conteo de los picos de correlación) los organismos de la especie que se identifica. En la figura 5.10 observamos en dos dimensiones la imagen de los picos de correlación en la cual, se muestran dos picos de correlación que indican en este caso particular la identificación de dos individuos de la especie Ceratium tripos que se encuentra en el filtro holográfico.

Figura 5.10.- Muestra los resultados de la correlación. Cada pico representa a un individuo de la especie Ceratium tripos que se encuentra en el filtro.

V.3. RESULTADOS Y DISCUSIONES En el sistema óptico-digital automático de identificación (Fig. 5.5), se analizaron pruebas de identificación de la especie C. dens a diferentes rotaciones, tamaños y ubicación de


AUTOMÁTICO]

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individuos de esta especie. Además se presentan los resultados cuando el sistema de identificación de C. dens es probado con imágenes de otras especies fitoplanctónicas.

V.3.1. Problema de rotación Se analizaron un total de 72 individuos de la especie C. dens rotados en intervalos de 5° cada uno de ellos. En la figura 5.11 observamos los resultados de la identificación automática. En el eje de las x de la gráfica en una forma ascendente representa los grados de rotación de cada individuo de esta especie, en el eje de las y se muestra el valor de la correlación de la identificación del sistema. En la figura observamos que no existe variación en el valor de correlación con respecto al grado de rotación de la especie. Lo que indica que el sistema identifica de una manera correcta a individuos de la especie no importando su rotación, lo que hace un análisis de identificación invariable a rotación.

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

Grados de rotación

Val

or d

e co

rrel

ació

n

Figura 5.11.- Respuesta del sistema a los cambios de rotación de la especie C. dens.


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V.3.2. Problema de variación de tamaño de la especie

1.00

0.83

1.00 1.00

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

50 60 70 80 90 100Porcentaje de escala

Figura 5.12.- Respuesta del sistema en la variación de la escala de la especie C. dens.

En la figura 5.12 observamos que no existe variación de tamaño de los individuos entre un porcentaje de 70% a 90%, sin embargo existe una disminución en el pico de correlación cuando presenta un porcentaje del 60% en un 10% de intensidad del pico de correlación. Esto no es problema ya que la variación de tamaños de los organismos de esta especie es de un 15%, de acuerdo a una serie de mediciones realizada por Cortés-Altamirano y Alonso-Rodríguez (1997).

V.3.3. Comparación del sistema de identificación de C. dens con otras especies de fitoplancton En la figura 5.13 se presentan los resultados del sistema automático de identificación de C. dens cuando se analiza un conjunto de imágenes de 9 especies fitoplanctónicas. En el eje de las x observamos las diferentes especies que se analizaron en el sistema, de izquierda a derecha se presentan a C. dens, C. furca , C. pentagonum, C. tripos, A. ingens, T. kozlovii, N. reinholdii, P. cinamomeum y Heterocapsa rotundatum. Cada especie esta representada por individuos que presentan de 0° a 180° de rotación y porcentajes de tamaño de 70% , 80% y 90%. En el eje de las y observamos los valores de correlación. Observamos que los valores de correlación cuando el sistema identifica a C. dens son mayores de 0.80 no importando la rotación ni la diferencia de escalas de los individuos de esta especie y cuando procesa a los individuos de otras especies es el valor de correlación menor a 0.20. Lo que demuestra que el sistema automático de identificación de C. dens funciona correctamente y no se confunde en sus resultados cuando existen en el análisis otros individuos de otras especies.

Val

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AUTOMÁTICO]

60

-0.2

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Especies

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ació

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Figura 5.13.- Respuesta del sistema cuando se correlaciona la especie de interés con otras especies del fitoplancton.

En esta misma figura se muestra la variación del valor de correlación para cada especie identificada. La variación de los valores de correlación para cada especie esta representada con mas menos una desviación estándar. En estos resultados podemos observar que sí existen diferencias significativas entre la identificación de estas especies, es decir, que el sistema puede identificar correctamente a los individuos de C. dens y no confundirlos con los individuos de las otras especies. De esta manera podemos decir que si el valor de identificación del sistema es mayor a 0.20 el resultado puede ser considerado como un individuo de la especie C. dens. Lo que nos da que el sistema puede ser usado para monitoriar esta especie y de esta manera estar observando la presencia o ausencia de esta especie en una determinada localidad o a través del tiempo en una zona de importancia económica o ecológica.

V.4. DISCUSIONES Por primera vez se realizó un sistema de identificación automática de C. dens. Las diferentes pruebas que se realizaron para ver la eficiencia de identificación del sistema presentaron resultados favorables. La prueba de la invariacia a rotación y escala de los individuos de esta especie demuestra que el sistema puede identificar correctamente a esta especie (Figs. 5.11 y 5.12). Cuando el sistema fue evaluado con otras especies los valores de correlación fueron significativamente diferentes a los valores de correlación cuando se identifico a individuos de la especie de C. dens (Fig. 5.13). Los sistemas existentes de identificación presentan problemas de equivocación de resultados cuando existen la combinación de los tres efectos de la rotación, escala y ubicación de los individuos a identificar. La variación del valor de correlación en la figura 5.11 se debe a


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la variación aleatoria de la luz láser del sistema, sin embargo esta variación no afecta al sistema ya que sólo varia en un 5% de la intensidad.

V.5. CONCLUSIONES Se concluye que la utilidad de tener un sistema que de información de una especie que presente propiedades de bioindicador ecológica o económica es importante, ya que se puede prevenir una catástrofe o se puede usar como un indicador de beneficios.

Con los análisis realizado en este capítulo se demuestra las ventajas que se presentan en el sistema óptico-digital automático y el uso de las pantallas de cristal líquido como interface entre lo digital y óptico.

El uso de estos sistemas reducirán considerablemente el tiempo de procesamiento de identificación y cuantificación de muestras de fitoplancton de mareas rojas, que es actualmente estimado de dos horas por un especialista (Culverhouse et al., 1996).

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS CAPÍTULO VI [MONITOREO DE CERATIUM FURCA EN LA BAHÍA DE TODOS SANTOS, ENSENADA, B. C.]

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C A P Í T U L O V I

MMoonniittoorreeoo ddee CCeerraattiiuumm ffuurrccaa eenn llaa bbaahhííaa ddee TTooddooss SSaannttooss,, EEnnsseennaaddaa,, BB.. CC.. ¿Cuáles son los problemas que se pueden resolver teniendo un sistema automatizado de identificación y conteo de especies fitoplanctónicas?

os problemas analizados hasta el presente en la identificación de partículas biogénicas han demostrado que el sistema puede ser aplicado al monitoreo de especies bioindicadoras. El monitoreo continuo de estas especies en un área de importancia es fundamental. En este capítulo se describe la aplicación del

sistema de identificación desarrollado en el período doctoral a un problema de prevención de la utilización del agua de mar en la toma de agua del CICESE, cuando exista una abundancia considerable de la especie Ceratium furca . Los resultados de este monitoreo motivan a contar con sistemas de identificación similares en otras localidades de nuestro país, en donde existan problemas provocados por especies de marea roja o especies que afecten de una manera a otra especie que se está cultivando.

CAPÍTULO

6

L


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VI.1.-INTRODUCCIÓN Actualmente el principal tema de los programas internacionales como son GLOBEC (Global Ocean Biological Ecosystems), JGOFS (Joint Global Ocean Flux Study), LOICZ (Land Ocean Interaction Continental Zone) y GOOS (Global Ocean Observing System) abarca el cómo los ecosistemas pelágicos marinos de nuestro planeta pueden ser afectados por los impáctos antropogénicos y cómo este efecto puede contribuir al cambio climático global (Culverhouse, Williams y Reguera, 1996).

Los diversos cambios climáticos globales han provocado que especies de fitoplancton formen grandes masas de materia orgánica llamada marea roja. Esta gran masa a provocado fatales pérdidas económicas en la industria de la acuicultura, grandes impactos negativos en la ecología del ambiente y hasta muertes humanas (Cortés-Altamirano, 1998).

La aplicación de un sistema automático para la identificación de la especie Ceratium furca , se contempla en este capítulo.

VI.2. JUSTIFICACIÓN Realizar sistemas de monitoreo para prevenir catástrofes severas de fenómenos naturales que provocan el florecimiento de una especie que puede ser peligrosa para el desarrollo de organismos de importancia comercial es de vital importancia.

Actualmente en el CICESE, se cuenta con un sistema de bombeo de agua de mar para su completo abastecimiento en los diversos proyectos de investigación.

El lugar en donde se tiene la toma de agua ha presentado eventos de marea roja (Observación directa en los años 1995, 1996, 1997 y 1998).

Aunque no existe ningún “daño” aparente por estos fenómenos, en la localidad no deja de ser una preocupación, ya que los cambios climáticos pueden hacer que estos fenómenos se presenten con más continuidad y por lo tanto pueden ser causantes de algún efecto en los sistemas acuiculturales que se desarrollan en este centro de investigación.

Posiblemente la escasa frecuencia de muestreo de estos fenómenos anteriormente realizados en la zona de estudio, no ha reflejado el impacto ecológico que presentan estos eventos de marea roja en la localidad. Con un sistema de monitoreo continuo, resolveremos esta incógnita, además de observar con una mejor resolución el desarrollo de estos fenómenos en nuestra entidad.

El jefe del departamento de acuicultura, el Dr. Fernando Díaz, expresó su interés en el desarrollo de este proyecto, apoyándolo incondicionalmente ya que existe una gran preocupación en la calidad del agua que se tomará del mar y en la presencia de organismos que pueden dañar los experimentos que se vienen desarrollando en acuicultura (Díaz 1998, comunicación personal).


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La selección de la especie Ceratium furca, fue dada a la necesidad de monitorear la presencia de esta en las aguas que van a llegar al CICESE. Esta especie se tiene registrada como formadora de marea roja en la localidad, en un muestreo llevado el 25 de mayo 1998. Además tomando la opinión de la Dra. Pilar Sánchez, que es la encargada de la parte de fitoplancton del CICESE, nos indicó que dicha especie puede ser dañina ya que presenta características morfológicas que pueden atraparse en las branquias de las larvas y juveniles de algunas especies que se están cultivando en el centro (Sánchez 1998, comunicación personal). Esto es apoyado por las observaciones de Cortés-Altamirano (1998) que detectó que en los eventos de marea roja de algunos Ceratium existen gran mortandad de larvas de camarón en las granjas de Sinaloa México.

VI.3. ANTECEDENTES La presencia y permanencia de la especie Ceratium furca (Fig. 6.1) en la bahía de Todos Santos, Ensenada, B. C. México; se ha estudiado por más de 10 años. Esta especie se encuentra entre las seis especies de mayor permanencia y presencia de esta bahía (Comunicación personal de la Dra. Elizabeth Orellana-Cepeda).

Figura 6.1.- Ceratium furca . Fotagrafía tomada por Cortés-Altamirano Roberto.

CÉ

LULA

S/L

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O

0

500

1000

1500

2000

2500

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JunJul

AgoSep

OctNov

DicEne

FebMar

AbrMay

Jun

Figura 6.2.- Densidad de Ceratium furca en Punta Morro Ensenada, B. C. México. Ciclo anual tomado de Orellana-Cepeda, et al., 1992.


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Las densidades de esta especie en un ciclo anual se muestran en la figura 6.2 en donde se observa que esta especie presenta una permanencia anual y que su densidad varía con respecto al tiempo, presentando valores mínimos en los meses de agosto y octubre, y valores máximos para los meses de mayo y junio.

En un estudio más reciente realizado por el grupo de trabajo de la Dra. Orellana en una localidad dentro de la bahía de Todos Santos denominada Rincón de Ballenas en el período de tiempo de abril a julio de 1998, se detectó esta especie siendo dominante con respecto a otras especies catalogadas de inofensivas por la doctora (Orellana-Cepeda 1998, comunicación personal). En la figura 6.3 se observa las densidades de la especie obtenidas en este estudio.

Cél

ulas

/litr

o

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

16 Jul22 Jun

16 Jun11 Jun

18 May6 May

28 Abr23 Abr

13 Abr

Figura 6.3.- Densidades de Ceratium furca en la localidad de Rincón de Ballenas Ensenada, B. C. México del 13 de abril al 10 de julio de 1998. Datos proporcionados por la Dra. Elizabeth Orellana-Cepeda (1998), comunicación personal.

VI.4. HIPÓTESIS De acuerdo a la presencia y permanencia de la especie Ceratium furca en la bahía de Todos Santos, Ensenada, B. C. México, reportada con anterioridad las hipótesis de este estudio son:

Que las densidades de Ceratium furca en la toma de agua del CICESE, que se encuentra 1.45 metros de profundidad sobre el nivel medio del mar (a unos 8 metros de la línea de


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costa, siendo la línea de costa en este caso la medida media de un intervalo de marea vivas) varía con respecto a la marea baja y alta de cada día.

Que la especie Ceratium furca se encuentra siempre en la localidad de Punta Morro, Ensenada, B.C. y que su densidad depende de las condiciones óptimas para su desarrollo.

VI.5. OBJETIVO Determinar la variación de una especie formadora de marea roja en la bahía de Todos santos, Ensenada, B. C.

Para poder cumplir con el objetivo anterior se tienen los siguientes tres puntos:

1. Determinar la variación diurna de la densidad de la especie C. furca.

2. Determinar la variación de la densidad de la especie C. furca en el ciclo de mareas muertas y mareas vivas.

3. Se determinan la variación de la densidad de la especie C. furca con relación a la temperatura.

VI.6. MÉTODO

VI.6.1. Área de estudio El área de estudio se encuentra en un lugar denominado Punta Morro (31°51’22.50” latitud norte y 116°39’43.57” longitud oeste), este lugar se localiza enfrente de la Facultad de Ciencias Marinas de la Universidad Autónoma de Baja California (Fig.6.3). La toma de agua de mar se encuentra a una profundidad de 1.45 metros sobre el nivel medio del mar del rango más extremoso de marea presentada en la zona (comunicación personal con el técnico de bombeo del CICESE).


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Figura 6.3.- Fotografía de la zona de estudio. La flecha roja indica el lugar exacto de muestreo (fotografía de Octavio Meillon).

VI.6.2. Diseño del muestreo El diseño de muestreo se basa en lo sugerido por el Dr. Per Andersen en 1996.

El período de tiempo del muestreo fue de 46 días y la hora de muestreo fue de acuerdo a la marea baja y alta dentro del fotoperíodo diario.


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VI.6.3. Muestreo de especies fitoplanctónicas Las muestras se colectaron usando una botella de un galón de volumen. La profundidad fue a un metro del tubo en donde se toma el agua de mar. Se midió la temperatura usando un termómetro de cubeta El volumen de agua fue filtrado manualmente con una malla de 400 micras con el fin de quitar las partículas mayores a este tamaño y posteriormente se filtró con una luz de malla de 20 micras con el fin de quitar los organismos menores a este tamaño de la muestra que se analizó. Con la ayuda de una pizeta que contenía agua de mar filtrada por 0.5 micras y pasada por luz ultravioleta para matar cualquier tipo de organismos se concentró a los organismos filtrados en recipientes de 20 ml.

Inmediatamente después de concentrar la muestra se fijó con lugol según la técnica descrita por Throndsen (1978).

VI.6.4. Análisis cualitativo y cuantitativo El análisis identificación y conteo se realizó siguiendo los pasos descritos en el capítulo anterior en los subtemas V.2.2 al V.2.5. Se preparó una cámara Sedgwick-Rafter por muestra (dos muestras diarias) el tiempo de preparación fue de 15 minutos (Cortés-Altamirano, 1998).

VI.6.5. Interpretación Ecológica De acuerdo con las observaciones diarias de las muestras de fitoplancton y con las correlaciones de estas con los parámetros adicionales (marea, temperatura y densidad de organismos fitoplanctónicos totales) se realizó una interpretación ecológica, enfocada a la prevención de catástrofes sistemas acuiculturales del CICESE, provocadas por la variación en la densidad de la especie de Ceratium furca en el período de muestreo.

VI.7. RESULTADOS

VI.7.1. Datos analizados Se analizaron un total de 92 muestras de fitoplancton obtenidas en la toma de agua del CICESE.

El volumen analizado por muestra fue de un mililitro (una cámara de conteo), el área cuantificada fue de 1000 mm2 dando un total de 20661 campos de observación (imagen) de 220 micras2 por muestra.

Del total de campos observados sólo se seleccionaron los campos que contenían organismos fitoplanctónicos en la cámara analizada, tomando a estos como la densidad total de organismos fitoplanctónicos en la muestra (un organismo por campo).

En la figura 6.4 se muestran algunos campos capturados para la identificación y conteo de especies fitoplanctónicas. En el mosaico de campos se observa la dominancia de la


69

especie C. furca para esta muestra. Además se observan diversas especies fitoplanctónicas que se encuentran asociadas a C. furca .

Figura 6.4.- Mosaico de campos capturados de una muestra de fitoplancton colectada en Punta Morro, Ensenada, México. En esta imagen se observan diversas especies fitoplanctónicas, dominando la presencia de C. furca. Cada campo es numerado para su posterior análisis de identificación.

220 micras


70

VI.7.2. Densidades encontradas Las densidades de células registradas para cada muestra se presentan en la figura 6.5. En el eje de las x se muestran el número de muestras analizadas (dos por día) y en el eje de las y la densidades de células obtenidas para cada muestra. Con la línea de color rojo representamos las densidades de Ceratium furca y con la línea de color verde las densidades del total de células fitoplanctónicas cuantificadas. Se observa que la densidad máxima de C. furca (línea roja) corresponden a la densidad máxima del total de células fitoplanctónicas (línea verde) y que existen dos florecimientos de estas especies en el período de tiempo monitoreado.

MUESTRAS

CÉ

LULA

S/L

ITR

O

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Figura 6.5.- Densidades encontradas de Ceratium furca (línea roja) y de organismos fitoplanctónicos totales (línea verde) en el período de muestreo.

Las densidades máximas encontradas para la especie C. furca fueron de 1100 células por litro y las densidades máximas de células fitoplanctónicas totales fueron de 2410 células por litro. El valor de cero en la gráfica no significa que no exista la especie C. furca en el medio marino, lo que representa es que no fue detectado en el análisis ya que el número de células analizadas no fue lo suficientemente grande para detectar la presencia de esta especie.

Los valores de densidad encontrados son similares a los reportados por Orellana-Cepeda, et al., (1992).

VI.7.3. Comportamiento de la densidad con respecto a la marea En la figura 6.6 se muestran las densidades de células encontradas en la marea baja y marea alta en el período de muestreo. En el eje x se representan los días muestreados,


71

en el eje y se muestra la densidad de células por litro y en el eje z el nombre de cada serie representada. Con color verde se representan las densidades de C. furca en marea baja, en color rojo las densidades de C. furca en marea alta, en azul las densidades de células totales fitoplanctónicas en marea baja y en morado las densidades de células fitoplanctónicas en marea alta.

Figura 6.6.- Densidad de Ceratium furca y de organismos fitoplanctónicos totales en marea baja y marea alta.

±1.96*Err. Est.±1.00*Err. Est.

Media

CÉ

LULA

S/L

ITR

O

0

100

200

300

400

500

600

700

800

FURCBAJAFURCALTA

ORGABAJAORGAALTA


72

Figura 6.7.- Comparación de las densidades encontradas en marea baja y alta de Ceratium furca y de células fitoplanctónicas totales.

En la figura 6.7 se muestra el análisis estadístico de comparación de las densidades de C. furca y de células fitoplanctónicas totales en la marea baja y en la marea alta. Esta comparación se realizó por medio de intervalos de confianza compuesto por el error estándar y a un 95% de confianza. Como observamos no existe diferencia significativa en las densidades con respecto a las mareas, es decir, no hay diferencia entre las densidades de células de C. furca en marea baja y marea alta, también no existe diferencia significativa en las densidades totales de células fitoplanctónicas con respecto a la marea baja y alta.

Tomando en cuenta que no existe diferencia significativa de las densidades de células entre marea baja y marea alta, se suman las densidades de la marea baja y alta para las células de C. furca y totales dentro del período de muestreo.

MUESTRAS

MA

RE

A (

CE

NT

ÍME

TR

OS

)

CÉ

LULA

S/L

ITR

O0

500

1000

1500

2000

2500

3000

020406080

100120

140160180200

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Figura 6.8.- Comparación de las densidades de células con respecto a dos ciclos de mareas vivas y muertas en Punta Morro Ensenada, B. C. México. La línea azul representa a la marea, línea verde a la densidad del fitoplancton y la línea roja a la densidad de Ceratium furca .

La figura 6.8 muestra el comportamiento de las densidades de células con respecto a dos ciclos de marea viva y marea muertas. En el eje de las x representamos las muestras analizadas, en el eje y izquierdo se representa a la marea en centímetros y en el eje y derecho las densidades de las células de C. furca y totales. La línea de color azul


73

representa a la marea de la cual se extrajo la muestra en la zona de muestreo, con color rojo la densidad de C. furca y con color verde la densidad de células totales. Se observa que no existe una relación de las densidades de células con respecto al ciclo de marea, ni para la especie C. furca , ni para las células totales de fitoplancton encontradas.

VI.7.4. Comportamiento de la densidad con respecto a la temperatura La figura 6.9 muestra la serie de tiempo de la densidad de fitoplancton y la temperatura. En el eje de las x se representan las muestras analizadas, en el eje de la y (izquierdo) la temperatura y en el eje de la y (derecho) las densidades de células. Con color rojo se presenta la línea de la densidad de la especie C. furca , con color verde la línea de células fitoplanctónicas totales y en azul la temperatura. Como se puede observar no es muy clara la relación de las densidades con la temperatura en el período de muestreo. Sin embargo se puede notar a principio de la serie de tiempo que la densidad de organismos fitoplanctónicos en marea muertas se comporta inversamente a la temperatura, es decir, cuando existe poca energía la densidad de organismos fitoplanctónicos puede ser influenciada por la temperatura. Las temperaturas fluctuaron 18.5 °C a 24.5 °C.

MUESTRAS

TE

MP

ER

AT

UR

A (

°C)

CÉ

LULA

S/L

ITR

O0

500

1000

1500

2000

2500

3000

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Figura 6.9.- Comparación de las densidades de células con respecto a temperatura en Punta Morro Ensenada, B. C. México. La línea azul representa a la marea, línea verde a la densidad del fitoplancton y la línea roja a la densidad de Ceratium furca .


74

VI.7.5. Análisis del tiempo usado para la identificación y conteo La figura 6.10 muestra los tiempos empleados en cada paso de la identificación y conteo de organismos fitoplanctónicos. Se comparan cuatro casos: El tiempo que tarda un experto en taxonomía, una persona técnica, procesado óptico-digital y procesado digital. Como se observa en la figura, el sistema óptico-digital presenta el menor tiempo de análisis, seguido por el sistema digital, posteriormente el experto y por último el técnico. Los tiempos fueron calculados de la siguiente manera: el tiempo promedio del experto fue dado por la Dra. Elizabeth Orellana-Cepeda, la cual tiene una gran experiencia en la identificación y conteo de estas células; el tiempo del técnico se determinó según las experiencias de dos personas que son tesistas de la Dra. Orellana-Cepeda (comunicación personal); el tiempo del sistema óptico-digital fue evaluado de la siguiente manera: la captura promedio de las imágenes de 92 muestras fue de 30 minutos y la identificación y conteo por el analizador de partículas biogénicas (sistema óptico-digital) fue de 15 minutos promedio por muestra lo que da un total de 45 minutos de tiempo efectivo para cada muestra, es necesario comentar que el número de organismos en cada muestra es diferente, para nuestro caso particular el mínimo fue de nueve y el máximo de 445 organismos por muestra; el tiempo en el sistema digital en el cual la correlación se realiza digitalmente y no ópticamente como en el sistema óptico-digital, el tiempo total promedio para el análisis de una muestra fue de 55 minutos.

MIN

UT

OS

0

30

60

90

120

150

180

210

240

ExpertoTécnico

Óptico-digitalDigital

Figura 6.10.- Comparación de los tiempos usados en la identificación y conteo de muestras de fitoplancton.

Tomando el tiempo del técnico y comparándolo con el tiempo del sistema óptico-digital que se usó para este estudio, en donde el tiempo de captura de las imágenes fue de 46 horas (92 muestras multiplicadas por 30 minutos) y el tiempo de la identificación y


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conteo por el sistema fue de 6:52 horas (8246 imágenes multiplicadas por 3 segundos que emplea en analizar una imagen el sistema) dando un total de 52 horas con 52 minutos para el análisis de 92 muestras de fitoplancton, en cambio el técnico emplea 15.33 días para analizar estas 92 muestras ya que usa 4 horas por muestra de fitoplancton. Por lo tanto 85.8% del tiempo de análisis es ahorrado usando el sistema óptico-digital comparado con el tiempo del técnico. Una vez capturados los campos de observación en donde se encuentran las células fitoplanctónicas se requieren de 6 horas con 52 minutos para identificar a cada especie de interés y esto se realiza de una manera automática, en cambio un técnico o un experto sólo pueden analizar de una a dos muestras de fitoplancton diaria ya que el agotamiento físico impide el análisis de más muestras. Algunos expertos han comentado que una muestra puede ser analizada en diez minutos por especie ( comunicación personal de el Dr. E. Santamaria del Angel (1998)), y que por supuesto esto es más rápido que el sistema óptico-digital. Referente a esto, tenemos que comentar que en el sistema propuesto la información de los organismos se queda grabada quizás para futuros análisis y que la aplicación de este procedimiento óptico-digital no es tan sólo para una muestra sino para cientos o miles de muestras y es aquí donde podemos observar el potencial de este sistema.

VI.8. DISCUSIONES De acuerdo con los antecedentes, la especie fitoplanctónica de interés de este estudio C. furca, se presenta en el medio todo el año, incluso se encuentra entre las seis especies de mayor presencia y permanencia en la bahía de Todos santos, Ensenada, B. C. (comunicación personal de la Dra. Orellana-Cepeda). Por lo tanto, lo anterior apoya la hipótesis de encontrar a la especie en la zona de la toma de agua del CICESE.

Se observó que las densidades de esta especie no son influenciadas en el cambio de marea baja y alta diaria, ni en el ciclo de mareas vivas y muertas. Por lo tanto las densidades de esta especie no son influenciadas por el efecto de la marea, contrario a lo que se pensaba que sí existía ese efecto ya que en teoría la marea baja era representativa de masas de agua del puerto en donde se han detectado que existe la mayor presencia de mareas rojas durante este período de monitoreo, contrario a la marea alta que es representada por masas de agua que vienen del norte de la zona de estudio y que se supone que no existe presencia de marea roja en dicho lugar.

De la misma manera se observó que la temperatura no presenta una influencia en las densidades de esta especie en el período de monitoreo.

Las densidades encontradas durante el muestreo de la especie Ceratium furca no son altas como para provocar un daño a los organismos que se están cultivando en el centro de acuicultura del CICESE, ya que no se observó una marea roja en la zona de muestreo y además las densidades son bajas a las reportadas en otras zonas, esto es debido a que se realizó el muestreo en una zona muy cercana a la costa, siendo esta zona de alta energía, alterando el desarrollo de la especie de una forma negativa.


76

Los tiempos comparados de la identificación y conteo de organismos fitoplanctónicos a simple vista no muestra una ventaja muy grande al usar el sistema óptico-digital. Sin embargo las principales ventajas pueden ser: que no se requiere de una persona experta en la identificación de estos organismos, además se cuenta con un registro de las especies encontradas en la muestra en forma digital que puede ser usada para la consulta a futuro de las especies existentes en una zona, lo que no se tiene cuando se realiza la identificación tradicional que sólo se obtiene la información de la especie y el número de células de esta en la muestra, un punto importante es que mientras una persona sólo puede analizar una o tres muestras de fitoplancton por día dado lo laborioso y cansado que es la técnica tradicional de identificación; el sistema óptico-digital puede analizar de una manera automática continua un gran número de campos capturados, sin tener que suspender el tiempo de análisis por cansancio.

VI.9. CONCLUSIONES Las conclusiones de este estudio son:

La especie Ceratium furca se encuentra siempre en la columna de agua. La densidad de esta especie no es afectada ni por la marea, ni por la temperatura, por lo tanto se cree que la densidad depende de las condiciones óptimas para el desarrollo de la especie con respecto a nutrientes, luz, etc. que son parámetros que influyen en el desarrollo de un florecimiento fitoplanctónico normal.

El tiempo de análisis por medio del sistema óptico-digital reduce el tiempo hasta un 85% que el usado por el método tradicional.

Las ventajas de usar el sistema propuesto son: el ahorro de tiempo en el procesado de grandes cantidades de muestra; el almacenaje digital de los organismos existentes en la muestra analizada, esta ventaja es de gran importancia ya que actualmente no existe un registro de imágenes de los organismos que se analizan, ya que sólo se cuenta con el nombre de la especie y la densidad de esta por muestra en los análisis tradicionales de fitoplancton.

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS CAPÍTULO VII [CONCLUSIONES GENERALES]

77

C A P Í T U L O V I I

CCoonncclluussiioonneess ggeenneerraalleess Se concluye que el sistema implementado en este trabajo, el cual es la técnica descrita por Casasent y Psaltis (1976c) con modificaciones y adaptaciones para que funcione en un sistema híbrido (óptico-digital) automático, dió los resultados que se esperaban en la identificación correcta de especies de dinoflagelados. También se demuestra que la técnica puede identificar organismos no importando su escala, rotación y ubicación, que es lo elemental para realizar un sistema automatizado para el análisis de microalgas.

Los avances de la tecnología hasta ahora desarrollados permitió poder realizar este experimento en un sistema híbrido automatizado.

Se demostró cuál es el poder de discriminación y cuál es el intervalo de confianza en el cual se encuentra este método, la respuesta fue que el método es tan discriminativo (95%) que sólo presenta picos de correlación en donde existen organismos de la especie que se encuentra en el filtro, lo que nos indica que tiene una fuerte probabilidad de no errar en los resultados que proporcione.

Por lo anterior, podemos decir que este trabajo es el primero en aplicarlo en una manera completa mediante el sistema descrito anteriormente a organismos del fitoplancton, en especial a los del género Ceratium. También es el primer trabajo que realiza la técnica en un sistema híbrido automatizado, lo que difiere de los demás, que utilizan otras técnicas, ya sea en el aspecto óptico o en el aspecto digital, que de una forma u otra incrementan

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS [BIBLIOGRAFÍA]

78

el tiempo de procesamiento de los datos, dando así, sistemas poco usuales para fines de investigación.

Un aspecto que se tiene en cuenta en este trabajo es la amplia aplicabilidad de la técnica descrita en la oceanografía, donde requerimos tener un mejor control sobre aspectos bioecológicos, acuiculturales y algunos otros aspectos que involucren un largo tiempo de observación o de conocimientos necesarios para determinar cualificaciones y cuantificaciones de estructuras que se encuentran en el ambiente marino.

Para poder continuar con los avances en esta investigación los problemas de ruido, posición de sedimentación, variación morfológica, escala, rotación y ubicación de los organismos en la imagen han sido superadas.

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COMUNICACIONES PERSONALES

Cortés-Altamirano, Roberto (1998). Instituto de Ciencias del Mar y Limnología de la UNAM. Unidad Mazatlán.

Díaz, Fernando (1998). CICESE. Departamento de Acuicultura. Ensenada, B. C.

Sánchez, Pilar (1998). CICESE. Departamento de Acuicultura. Ensenada, B. C.

Santamaria del Angel, Eduardo (1998). Universidad Autónoma de Baja California. Facultad de Ciencias Marinas. Ensenada, B.C.

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS [FILTROS HOLOGRÁFICOS]

88

A P É N D I C E A

FFiillttrrooss hhoollooggrrááffiiccooss

A.1. Material para grabar hologramas Actualmente existen diferentes tipos de materiales para el grabado de hologramas, tales como las emulsiones fotográficas de haluros de plata, haluros alcalinos, fotorresinas, vidrios fotocrónicos y gelatinas dicromadas. Siendo los haluros de plata los más populares y fáciles de usar.

Tabla A.1. Diferentes placas de haluros

Sensibilidad (ergs/cm2 para una densidad de exposición de 1) Resolución Líneas/mm

HeCd (325)

HeCd (442)

Ar (488)

Ar (532)

Nd:YAG (532)

HeNe (633)

Kr (647)

Rubí (694)

Emulsión 3Deep FPR - 350 600 350 300 - - - 5000

PFG-01 - 400 - - 450 150 150 100 5000

Agfa-Gevaert 10E56

- 60 30 20 20 - - - 3000

10E75 - 60 - 120 60 20 20 20 3000

Kodak 649F - 500 800 800 1000 900 800 5000 2000

120/SO-173 - 500 - - - 400 400 400 2000 125 20 80 50 50 100 - - - 1250

131/SO-253 - 20-35 40-65 25-35 20-30 5-8 305-6 1000 1250 125 20 80 50 50 100 - - - 1250

En la tabla A.1. se muestran las placas de haluros de plata más frecuentemente usadas, indicando el poder de resolución expresado en líneas/mm para cada una de ellas y la sensibilidad expresada en ergs/cm2 para una densidad de exposición de 1. Las placas FPR , PFG-01, 10E56 y Kodak 125 no son sensibles a la longitud de onda de 633 nm, por lo tanto no son apropiados para usarse con láseres de He-Ne.

Apéndice

A

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS APÉNDICE A [FILTROS HOLOGRÁFICOS]

89

La selección del medio es uno de los factores más importantes que determina la calidad de la imagen en el holograma, ya que si la imagen no es grabada apropiadamente se pierden detalles importantes. De ahí la importancia de seleccionar la emulsión correcta. Para la fabricación de los filtros holográficos se usaron placas PFG-01 de la compañía 3Deep cuya emulsión funciona para el láser de He-Ne (633nm) proveyendo un buen balance entre su alto grado de resolución (5000 líneas/mm) y su alta sensibilidad (150 ergs/am2 ) para una densidad de exposición de 1. Ver Fig. 5.2.

Figura A.2. Comparación de los diferentes substratos holográficos, de acuerdo a la longitud de onda vs resolución. La nomenclatura 8E56 y 8E75, corresponden a la placas de la compañía Agfa-Gevaert que desapareció del mercado, actualmente la compañía 3Deep fabrica FPR y PFG-01 que son similares. A.2. Tipos del material de grabación del filtro Asimismo existe una gran variedad de substratos para cada tipo de combinación de emulsión, siendo los 3 substratos más comunes: las placas de vidrio, las placas de poliester y las placas de acetato. Las placas de vidrio son más rígidas permitiendo una mejor estabilidad durante la exposición y reposicionamiento más preciso en el arreglo experimental después del revelado. Es por esta razón que se usó la placa PFG-01 de la compañía 3Deep.


90

A.3. Método de grabado para el filtro tipo Vander Lugt Los filtros holográficos se graban a partir de las imágenes de la información del paso 4 de la figura 4.1 del capítulo IV. Esta información es desplegadas por la pantalla de cristal que se encuentran montados en el plano de entrada del sistema óptico para la fabricación de filtros holográficos (Fig. 4.3., del capítulo IV).

En el plano de entrada se despliega la imagen a la que queremos hacer su filtro y con una pantalla de papel blanco en el plano de Fourier observamos el espectro de la imagen. Al dejar pasar el haz de referencia se verifica si se superpone con el orden cero de difracción en el plano de Fourier, en caso necesario se hace un ajuste en la orientación del haz de referencia, para cumplir con esta condición.

Posteriormente se mide la intensidad de la parte más brillante del haz del objeto (Iob) sobre el plano de Fourier. Para realizar esta medida se obstruye el haz de referencia. Después se mide la intensidad del haz de referencia (Ir) sobre el plano de Fourier obstruyendo el haz del objeto. La intensidad del haz de referencia debe ser de 4 a 10 veces mayor que la de la parte más brillante del haz del objeto. Usando un divisor de haz o filtros de densidad neutra se ajusta la razón de intensidades. Esto es importante para obtener un holograma con una buena eficiencia de difracción.

El tiempo de exposición fue calculado de la siguiente manera: de la intensidad total (It), medida en el plano de salida, se aplicó la relación

(F/x) = T (seg)

donde F= 120 (un factor calculado), x = intensidad total en microwatt y entonces obtenemos a T en segundos que es el tiempo de exposición. Una vez calculado el tiempo de exposición óptimo se cierra el obturador, se quita del arreglo óptico la pantalla de papel blanco colocada en el plano de Fourier. Se coloca la placa holográfica en el plano de Fourier y se graba el holograma.

Una vez grabada la información, la placa es revelada con la técnica que más adelante se menciona.

Las placas holográficas usadas son de la marca 3Deep (PFG-01), la emulsión está colocada sobre un sustrato rígido (vidrio) por lo tanto presenta una mayor estabilidad durante el tiempo de grabado, además de tener una resolución de 5000 líneas/mm para la longitud de onda de 633nm (Láser He-Ne).

Después de secar la placa holográfica, se coloca en su posición anterior en el plano de Fourier, desplazándola se ajusta su ubicación hasta hacer coincidir el centro del holograma, con el centro del espectro del objeto. Obstruyendo el haz de referencia (Ir), se verifica si el holograma reconstruye el haz de referencia al iluminarlo con el haz del objeto. Se desplaza y se rota ligeramente el holograma hasta que la intensidad luminosa


91

del haz de referencia reconstruido sea máxima. La información en el holograma es el conjugado de la información de la especie.

A.4. Método de revelado Como cualquier otro material fotográfico sin revelar, hay que tener cierto cuidado al abrir y manejar el material holográfico, este se puede abrir en el cuarto obscuro y se sujeta solamente por los bordes, esto es con el fin de prevenir que se dañe la emulsión.

Revelado. - 4 a 7 minutos con revelador SM-6 a 20°C (68°)F.

Para asegurar un revelado consistente, agitar suavemente la placa holográfica dentro de la charola y mantener especial cuidado con el tiempo.

Enjuague. - 30 segundos. A 18° - 21°C (65°- 70°F).

Enjuague en agua corriendo o en una charola con agitación constante.

Fijado. - 3 a 5 minutos a 20°C (68° F.)

Agite suavemente durante el fijado. Después de 10 segundos en el baño de fijado, las luces del cuarto obscuro se pueden encender sin afectar la calidad de la imagen.

Photo-Flo ®. (opcional)

Use Photo-Flo ® para prevenir la formación de marcas por el agua.

Alcohol Metílico - (opcional)

Este paso remueve tintas en la emulsión y acorta el tiempo de secado. Aunque también puede afectar la calidad de la imagen (eficiencia de difracción).

Secado

Al aire a temperatura ambiente. Evite tocar la emulsión hasta que esté completamente seca para no dañarla.

Blanqueado - (opcional)

El blanqueado hace los hologramas claros y puede algunas veces usarse para salvar hologramas sobre expuestos.

A.5. Técnicas de blanqueamiento de filtros 1. Revelar la muestra en revelador Kodak HRP (1:2) durante 5 minutos a 20°C (68°F) con agitación continua.


92

2. Lavar en agua corriendo por 10 minutos a 18°-21°C (65°-70°F)

3. Blanquear en Baño de Blanqueado Kodak R-10 (1 parte de Solución A: 1 parte de Solución B: 10 partes de agua) por 2 minutos a 20°C (68°F)

4. Lavar por 4 minutos en agua corriendo a 18°-21°C (65°-70°F)

5. Fijar en "Kodak Rapid Fixer" por 8 minutos a 20°C (68°F)

6. Lavar por 18 minutos en agua corriendo a 18°-21°C (65°-70°F)

Secar dejándolo al aire a temperatura ambiente (esto es para evitar que se resquebraje la emulsión).

La fórmula para preparar el revelador SM-6 es :

Nombre del compuesto Cantidad

Ácido ascorbico 18 g

Hidróxido de sodio 12 g

Phenidona 6 g

Dibásico fosfato sódico 28.4 g

Agua destilada 1 litro

Baño de Blanqueado Kodak R-10 es:

Solución stock "A": Agua destilada 500 ml

Dicromato de Amonio 20 grs

Acido Sulfúrico concentrado 14 ml

Agua destilada hasta obtener 1 lt

Solución stock "B": Cloruro de sodio 45 grs.

Agua destilada hasta obtener 1 lt


93

Diluir como se menciona en el punto 3.

IDENTIFICACIÓN DE PARTÍCULAS BIOGÉNICAS APÉNDICE B [CATALOGO DE ESPECIES ESTUDIADAS]

94

A P É N D I C E B

CCaattaallooggoo ddee eessppeecciieess eessttuuddiiaaddaass ¿Cuáles son las especies de fitoplancton estudiadas, sus características taxonómicas y su importancia ecológica, ?

a presentación de un catálogo de las especies de dinoflagelados contempladas en los análisis, presenta una parte primordial en este estudio. El catálogo de especies está compuesto de la imagen de la especie, nombre científico, ubicación taxonómica y datos de colecta.

Apéndice

B

L


95

B.1 ESPECIES FITOPLANCTONICAS CONTEMPLADAS EN ESTE ESTUDIO Las especies contempladas en este trabajo son del grupo de los dinoflagelados. Estos organismos fueron colectados por Dra. Elizabeth Orellana-Cepeda, M. en C. Roberto Cortés-Altamirano y un servidor en diversas campañas de marea roja en diferentes tiempos y diferentes lugares del Pacífico Mexicano.

Los dinoflagelados están bien representados en ambientes marinos y son muy diversos en formas. Por lo general poseen dos flagelos y pueden ser tecados o atecados, la mayoría son fotosintéticos pero hay heterótrofos. Muchas especies producen toxinas que causas distintos envenenamientos por consumo de mariscos y pescados. En México, se han identificado cerca de 50 especies formadores de marea roja, de las cuales sólo 20 son tóxicas. La clasificación se basa en la obra the biology of the dinoflagellates, por Taylor (1987).

B.2.1. Especies del género Ceratium

Ceratium furca

Figura B.1.- Ceratium furca , especie formadora de marea roja. Fotografía tomada por Roberto Cortés-Altamirano.


96

Ceratium furca (Ehrenberg) Claparede y Lachmann, 1859 (lám. 2, fig. 10). Graham y Bronikovsky, 1944, figs. 7 A-H. Wood, 1954, p. 274-275, fig. 189a; Wood, 1968, p. 29, fig. 57. Klement, 1964, p. 354. Subrahmanyan, 1968, p. 20, figs. 21-29, pl. 2, figs. 7-12. Steidinger y Williams, 1970, pl. VIII, fig. 20. Taylor, 1976, p. 60-61, pl. 12, figs. 107-109.

Clasificación de Ceratium furca

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Gonyaulacales Familia: Ceratiaceae Género: Ceratium Especie: furca

Descripción

Cuerpo no más ancho que alto. La epiteca, ligeramente cónica y de bordes casi rectos, se prolonga en un cuerno apical. La hipoteca presenta dos cuernos antapicales bien desarrollados, rectos, dirigidos hacia atrás, paralelos o poco divergentes, siendo el derecho menor que el izquierdo (Orellana, 1971).

Distribución y lugar de colecta en México

Cosmopolita. Esta especie fue colectada en mayo de 1991, en la bahía de Todos Santos, Ensenada, B.C. México.


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Ceratium pentagonum

Figura B.2.- Ceratium pentagonum.

Ceratium pentagonum (Gourret, 1883). Wood, 1968, p. 37, fig. 82..

Clasificación de Ceratium pentagonum

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Gonyaulacales Familia: Ceratiaceae Género: Ceratium Especie: pentagonum


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Descripción

Cuerpo pentagonal, no más ancho que alto, de paredes gruesas, provista de placas, con alvéolos y estrías. El surco transversal es excavado y alveolado. La epiteca es ligeramente triangular, muy diferenciada del cuerno apical que es truncado. La hipoteca presenta dos cuernos antapicales cortos, rectos, ligeramente divergentes, dirigidos hacia atrás, siendo el derecho menor que el izquierdo.


Cosmopolita. Esta especie fue colectada en mayo de 1991, en la bahía de Todos Santos, Ensenada, B.C. México.


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Ceratium macroceros

Figura B.3.- Ceratium macroceros.

Ceratium macroceros (Ehrenberg) Cleve (lám. 2, fig. 15). Wood, 1954, p. 310-311, fig. 238; Wood, 1968, p. 37, fig. 77. Klement, 1964, p. 357-358, pl. 3, fig. 1. Subrahmanyan, 1968, p. 79-80, figs. 149-150, pl. 4, fig. 24. Taylor, 1976, p. 72-73, pl. 20, fig. 198.

Clasificación de Ceratium macroceros

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Gonyaulacales Familia: Ceratiaceae Género: Ceartium Especie: macroceros


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Descripción

Epiteca con los lados cóncavos. Los antapicales se dirigen hacia atrás y afuera presentándose dentados en la base.


Cosmopolita. Esta especie fue colectada en marzo de 1991, en la bahía de Todos Santos, Ensenada, B.C. México.


101

Ceratium tripos

Figura B.4.- Ceratium tripos.

Ceratium tripos (O. F. Müller) Nitzsch, 1817.

Clasificación de Ceratium tripos

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Gonyaulacales Familia: Ceratiaceae Género: Ceartium Especie: tripos


102

Descripción

Células de paredes alveoladas, con el surco transversal excavado. La epiteca presenta el cuerno apical inclinado hacia la derecha y más largo que los cuernos antapicales. La hipoteca está provista de dos cuernos antapicales curvados hacia adelante que terminan paralelos o divergentes al apical, curvados en su nacimiento y desprovistos de apéndice, el izquierdo es más largo que el derecho (Orellana, 1971).




103

Ceratium dens

Figura B.5.- Ceratium dens. Fotografia tomada por Roberto Cortés-Altamirano.

Ceratium dens Ostenfeld y Schmidt, 1901: 165, fig. 16.

Clasificación de Ceratium dens

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Gonyaulacales Familia: Ceratiaceae Género: Ceartium Especie: dens


104

Descripción

Cuerpo de forma y proporciones variadas, a veces netamente más alto que ancho pero en ocasiones el ancho igual o sobrepasa el largo (forma no encontrada). Esta especie está caracterizada por sus cuernos antapicales que se dirigen hacia afuera, sin curvarse sensiblemente hacia delante como en tripos y otras especies del subgénero Tripoceratium. Generalmente el desarrollo de esos cuernos es netamente diferente de uno respecto al otro aunque en ocasiones la diferencia es muy pequeña; ambos, sobre todo el derecho, puede reducirse bastante hasta hacerse rudimentario.


Cosmopolita Esta especie fue colectada en abril de 1991 en bahía Zihuatanejo, Guerrero, México. Especie proporcionada por M. en C. Roberto Cortés-Altamirano.


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Ceratium fusus

Figura B.6.- Ceratium fusus.

Ceratium fusus (Ehrenberg) Dujardin (lám. 2, fig. 11). Graham y Bronikovsky, 1944, fig. 11 EE, fig. 13 A-D. Subrahmanyan, 1968, p. 31-32, fig. 55, pl. 1, fig. 3-6. Wood, 1968, p. 29, fig. 58. Steidinger y Williams, 1970, pl. VIII, fig. 21. Taylor, 1976, p. 66, pl. 13, fig. 129-130, (figura 1 e).

Clasificación de Ceratium dens

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Gonyaulacales Familia: Ceratiaceae


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Género: Ceartium Especie: fusus

Descripción

Célula fusiforme, surco transversal excavado y muy corto. La epiteca es cónica y se prolonga para formar un cuerno apical muy fino, levemente inclinado hacia la izquierda, que es de mayor longitud que el cuerno antapical izquierdo; éste es ligeramente curvado hacia la izquierda, de paredes lisas y desprovisto de espinas; el cuerno antapical derecho muy pequeño o atrofiado (Orellana, 1971).




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B.2.1. Especies del género Prorocentrum

Prorocentrum mexicanum

Figura B.7.- Prorocentrum mexicanum. Fotografía tomada por Roberto Cortés-Altamirano.

Prorocentrum mexicanum Steidinger y Tangen, 1996, p.424, pl. 8.

Clasificación de Prorocentrum mexicanum

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Prorocentrales Familia: Prorocentraceae


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Género: Prorocentrum Especie: mexicanum

Descripción

Célula ovalada. La parte anterior presenta una espina con una aleta incipiente. Los poros de la teca muestran un arreglo de filas diagonales, conspicuas en el margen. Fotografía por M. en C. Roberto Cortés-Altamirano.


Especie colectada en mayo de 1993 en La Paz, Baja California, México.


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Prorocentrum micans

Figura B.8.- Prorocentrum micans

Prorocentrum micans Ehrenberg

Clasificación de Prorocentrum micans

División: Dinophyta Clase: Dinophycae Orden: Prorocentrales Familia:Prorocentracae Género: Prorocentrum Especie: micans


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Descripción

Células con el final anterior redondeado y el posterior aguzado, cuerpo ovalado, comprimidas lateralmente, asimétricas y un poco angulosas. La espina anterior es prominente con ala. Las placas tecales están perforadas por numerosos poros de tricosistos, principalmente arregladas en hileras radiales; los cloroplastos contienen un gran pirenoide; el núcleo es grande en forma de V está esta situado en la región posterior final de la célula. Mide de 35 a 70 micras de longitud y 20 a 50 micras de ancho.


Es muy común en aguas costeras del pacífico mexicano y el Golfo de México. No se ha encontrado como dominante formando mares rojas, pero si en asociación con ellas. Colectada en la bahía de Todos Santos Baja California; en el mes de Julio y Agosto de 1998.


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Prorocentrum lima

Figura- B.9.- Prorocentrum lima . Fotografiada por Yasuwo Fukuyo.

Prorocentrum lima (Ehrenderg) Dodge.

Clasificación de Prorocentrum lima.

División: Dinophyta Clase: Dinophycae Orden: Prorocentrales


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Familia:Prorocentracae Género: Prorocentrum Especie: lima

Descripción

Célula ovalada. La porción anterior es indentada, mientras que la porción posterior, es más redondeada, con la teca derecha excavada en forma triangular. Tecas con numeroso poros, especialmente en los márgenes; la región central de la teca carece de ellos. Mide 32 a 70 micras de largo y de 20 a 32 micras de transdiámetro de ancho.


En aguas del Caribe y Pacífico mexicano. Especie colectada en bahía Todos los Santos Ensenada Baja California los mese de Junio, Julio y Agosto de 1998.


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B.2.1. Especies del género Dinophysis

Dinophysis acuminata

Figura B.10.- Dinophysis acuminata . Fotografiada por Yasuwo Fukuyo.

Dinophysis acuminata Claparéde y Lachmann.

Clasificación de Dinophysis acuminata

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Dinophysiales


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Familia: Dinophysiaceae Género: Dinophysis Especie: acuminata

Descripción

Células ovaladas a elípticas en vista lateral, la parte posterior es más redondeada. La especie es muy variable. Las aletas cingulares son medianamente desarrolladas. La aleta sulcal izquierda es redonda y bien desarrollada, está sostenida por tres radios; la aleta sulcal derecha está reducida. Tecas esculpidas por poroides y perforadas por poros Mide 39-44 micras de largo y 25-29 micras de transdiámetro.


Esta especie se encuentra en aguas neríticas del Pacífico mexicano. Esta ampliamente distribuida en Golfo de California. Especie colectada en la bahía de Todos Santos, Ensenada B.C. en los meses Junio, Julio y Agosto de 1998.


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Dinophysis caudata

Figura B.11.- Dinophysis caudata. Fotografiada por Yasuwo Fukuyo.

Dinophysis caudata Saville-Kent.

Clasificación de Dinophysis caudata

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Dinophysiales Familia: Dinophysiaceae


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Género: Dinophysis Especie: caudata

Descripción

Célula de talla mayor a la especie Dinophysis acuminata , con un proceso posterior alargado. A menudo se encuentra en pares, unidas por el dorso. El contorno dorsal es curvado. Aletas singulares bien desarrolladas. La aleta sulcal izquierda es prominente y esta sostenida por tres radios. La teca con poroides y poros conspícuos . Mide 85-88 micras de largo y 37-39 micras de transdiámetro.


Es común en aguas costeras del Pacífico mexicano y el golfo de México. De amplia distribución en México y no se ha reportado como dominante en mareas rojas. Especie colectada en la bahía de Todos Santos Ensenada B.C. en los meses Junio, Julio y Agosto de 1998.


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Dinophysis tripos

Figura B.12.- Dinophysis tripos. Fotografiada por Yasuwo Fukuyo.

Dinophysis tripos Gourret.

Clasificación de Dinophysis tripos

División: Dinophyta Clase: Dinophyceae Orden: Dinophysiales Familia: Dinophysiaceae Género: Dinophysis


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Especie: tripos

Descripción

Células alargadas con dos procesos en la parte posterior, uno de ellos (cerca del margen ventral) más largo. Aletas cingulares bien desarrolladas. Aletas sulcal izquierda tiene un margen casi recto y ocupa cerca del 60% de la longitud total. Mide 95-105 micras de largo y 47-57 micras de transdiámetro.


Se distribuye ampliamente en los litorales de México. Especie colectada en bahía de Todos Santos de Ensenada, B.C. en los meses Junio, Julio y Agosto de 1998.


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tesis de doctorad o en ciencias josé luis...

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