tesis dinÁmica anual de la estrategia, …biblio.uabcs.mx/tesis/te3209.pdf · instalaciones,...

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA

TESIS

DINÁMICA ANUAL DE LA ESTRATEGIA, ESFUERZO

REPRODUCTIVO Y CALIDAD OVOCITARIA DEL MEJILLÓN

Modiolus capax (Bivalvia: Mytilidae; Conrad, 1837)

EN LA BAHÍA DE LA PAZ, B.C.S. MÉXICO

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

BIÓLÓGO MARINO

PRESENTA:

JOSÉ LUIS GARCÍA CORONA

DIRECTOR(A):

Dra. CARMEN RODRÍGUEZ JARAMILLO

LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, DICIEMBRE 2014.

A mi familia

Por creer en mí, por apoyarme siempre de manera incondicional,

por estar conmigo en los buenos y malos ratos, pero sobre todo, por

dejarme ir hasta donde mis sueños me permitieron… por todo su

amor.

A mis padres

Blas García Castañeda y Gloria Corona Espinosa, por su inmenso amor, apoyo

incondicional, y valores firmes, por dejarme dedicarme a lo que siempre fue

mi sueño, gracias a ustedes he logrado llegar hasta aquí y convertirme en lo

que ahora soy, ustedes han sido mi mejor ejemplo a seguir y por ello es un

privilegio ser su hijo.

A mis hermanos

Osvaldo y Francis, por ser mis dos personas favoritas, por compartir

conmigo del amor y sacrificio de nuestros padres, pero lo más valioso para

mí, por quererme cada uno a su manera con mis defectos y virtudes.

Que cada logro… sea motivado por nuestros sueños, coraje y perseverancia, y que cada triunfo sea

considerado la meta de lo que nos hemos planeado y el principio de un nuevo éxito…

Porque todo logro comienza con la decisión de intentarlo.

AGRADECIMIENTOS

De manera especial dedico el primer agradecimiento de esta que es mi mayor obra académica hasta el momento a una gran investigadora, virtuosa y tenaz mujer, pero sobre todo, gran ser humano y amiga… Gracias por siempre Dra. Carmen Rodríguez Jaramillo, por ser un ejemplo a seguir, por dirigir mi trabajo de tesis, por compartir conmigo de toda esa sabiduría y conocimientos suyos, por su paciencia ante mi inexperiencia, pero lo más valioso para mí, gracias por brindarme su gran amistad y cariño, algo que tenga por seguro, atesoro muy dentro de mi ser. Ha sido un honor ser su tesista y amigo, esta es solo una meta, vamos por muchos éxitos más.

No soñemos nuestra vida, vivamos nuestros sueños porque todo logro es un triunfo compartido.

A la Universidad Autónoma de Baja California Sur (UABCS) que a través del Departamento Académico de Biología Marina hizó posible mi formación profesional como Biólogo Marino.

Al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR, S.C.) por brindar las instalaciones, equipos, laboratorios y facilidades para realizar mi trabajo de tesis.

Un agradecimiento muy especial al Dr. José Manuel Mazón Suástegui por haber co-

dirigido este trabajo, por su apoyo económico con becas de entrenamiento técnico,

contrato para trabajar en su proyecto “CIBNOR R&D projects (SEP-

CONACyT/CB2009129025 and PROINNOVA-CONACyT/C0003-2012-01-185797)”, pero

sobre todo por confiar en mí como estudiante.

Un agradecimiento especial a mis profesores e integrantes del comité tutorial de esta tesis, B.M. Marco A. Medina López y Dra. Liliana Hernández Olalde, por sus valiosos comentarios y sugerencias, por ser dos de los mejores ejemplos que tuve durante mi formación profesional como Biólogo Marino, gracias por la confianza que siempre depositaron en mí, por sus ánimos mientras fui estudiante y por su valiosa amistad.

Al Dr. Cesar Ruiz Verdugo del Departamento de Pesquerías de la UABCS por formar parte del comité tutorial de esta tesis, por sus acertados comentarios y sugerencias para enriquecer y mejorar este trabajo.

A la Sra. Eulalia Meza Chávez por todo su apoyo técnico en el laboratorio de Histología e Histoquímica del CIBNOR y por sus muestras de afecto y cariño para conmigo, es usted una gran mujer y se ha ganado un lugar especial en mi corazón.

A mis roomates y grandes amigos Israel (Dooki), Chrsthian y Perla, gracias por su apoyo moral en mis desmadrugadas, por tantas horas de diversión (el huracán Odile también nos dejó gratos recuerdos) por no dejarme morir de hambre durante la elaboración de mi tesis pero sobre todo por ser mi familia en La Paz.

A mis compañeros y amigos de la generación Biología Marina 2010-2014, Dulce

(Wanda), Christhian (Comadre), Cynthia (Le Perre), Amayraní (Marraní), Maritza

(Caderas), Maritza (Chaom), Raúl (Primo), Majo (Pequeña), Daleth (Postrecito),

Andrés (Nalgón), Salwa (Zorrita bebé), Pete, Karen, José, Rebeca (Olanes), Carlos

(Rumpelstinski), Tanaíri (Tangairi), Luis, Mafer, Heidi (Oh! Haidi) y Carolina (Ñoñis)

por compartir tantas experiencias inolvidables, fiestas épicas, salidas de campo,

buenos y malos momentos, porque desde el inicio fuimos una familia al llegar a La

Paz, B.C.S. en busca de cumplir nuestros sueños, porque sin duda hemos logrado

trascender en cada una de nuestras mentes y corazones y ¡Porque sin bullying no

hay amistad!

A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Histología e Histoquímica del

CIBNOR Doña Eulalia (Sra. de las Navajas), Maritza, Ricardo, Andrés, Angélica,

Grecia, Fanny, Tony, Samanta, Antonia, Armando, Amada, Anngy y Alice porque

cada uno de ustedes puso su granito de arena apoyándome moral o físicamente con

el trabajo de laboratorio de mi tesis.

A mi compañero del CIBNOR y amigo Jesús Antonio López Carvallo por su valioso

apoyo con la colecta del material biológico en la Bahía de La Paz para llevar a cabo

esta tesis (créeme que después del último muestreo valoro infinitamente tu ayuda).

Muchas gracias a Eva Elizabet Nolasco (Betty) del Depto. de Biología Marina de la

UABCS por todo su apoyo, paciencia y atenciones, sin su ayuda la culminación de

este enorme esfuerzo no hubiese sido posible Betty, pero sobre todo, gracias por su

amabilidad y amistad, su labor, dedicación y carisma la han llevado a ganarse mi

reconocimiento y afecto.

A carolina Villaseñor Cibrían, amorsin, gracias por siempre estar a mi lado

echándome porras y animándome a seguir adelante durante la persecución de este

sueño, por tu amistad y amor incondicionales, todas son cosas que valoro tanto

como el amor de mi familia.

A los familiares y amigos que durante estos cuatro últimos años me han acompañado

en la búsqueda de alcanzar lo que hoy la culminación de mi más grande sueño y no

me dejaron llegar solo hasta aquí, espero seguir teniendo el honor de compartir con

todos ustedes muchos éxitos y logros más.

En la vida no hay nada imposible, porque los sueños de ayer son los triunfos de hoy, y

las esperanzas del presente pueden convertirse en realidad mañana.

ÍNDICE GENERAL

LISTA DE FIGURAS………………………………………………………………. I

LISTA DE TABLAS................................................................................ IX

RESUMEN………………………………………………………………………….. X

ABSTRACT…………………………………………………………………………. XII

1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………... 1

2. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………… 7

3. HIPOTESIS………………………………………………………………………. 9

4. OBJETIVOS……………………………………………………………………... 10

4.1. General……………………………………………………………………... 10

4.2. Específicos………………………………………………………………… 10

5. ÁREA DE ESTUDIO……………………………………………………………. 11

6. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………... 12

6.1. Muestreos y colecta de organismos………………………………….. 12

6.2. Biometrías y disección………………………………………………….. 13

6.3. Análisis histológico e histoquímico………………………………….. 13

6.4. Estimación de índices morfofisiológicos……………………………. 16

6.4.1. Índice de condición (IC)……………………………………………. 16

6.4.2. Área de cobertura gonádica (ACG) y área de cobertura de

tejido somático (ACS)…………………………………………….. 16

6.5. Análisis histológicos cualitativos…………………………………….. 17

6.5.1. Ciclo reproductivo, desarrollo gonádico y ovocitario…………… 17

6.6. Análisis histológicos cuantitativos…………………………………… 18

6.6.1. Indicadores morfométricos de calidad ovocitaria……………….. 18

6.6.1.1. Diámetro teórico (DT)……………………………………. 18

6.6.1.2. Diámetro máximo (DM)…………………………………. 19

6.6.1.3. Relación núcleo/citoplasma (N/C)……………………… 19

6.6.2. Indicadores histoquímicos de calidad ovocitaria………………… 19

6.6.2.1. Índice lipídico (IL)…………………………………………. 19

6.6.2.2. Índice de carbohidratos (ICH)………………………….. 20

6.7. Obtención de datos de variables ambientales (temperatura

superficial y clorofila-a………………………………………………… 20

6.8. Análisis estadístico de datos………………………………………….. 20

7. RESULTADOS…………………………………………………………………. 22

7.1. Muestreos y rangos de talla-peso de organismos…………………. 22

7.2. Estimación de índices morfofisiológicos…………………………… 23

7.2.1. Índice de condición (IC)……………………………………………. 23

7.2.2. Área de cobertura gonádica (ACG) y área de cobertura de

tejido somático (ACS)………………………………………………

24

7.3. Ciclo reproductivo……………………………………………………….. 30

7.3.1. Descripción de estadios de desarrollo gonádico………………… 30

7.3.2. Frecuencias de estadios de desarrollo gonádico……………….. 35

7.3.3. Proporción de sexos……………………………………………….. 38

7.3.4. Frecuencias de categorías de desarrollo ovocitario……………. 39

7.3.5. Atresia y degeneración ovocitaria…………………………………. 40

7.4. Análisis histológicos cuantitativos…………………………………… 41

7.4.1. Indicadores morfométricos de calidad ovocitaria……………….. 41

7.4.1.1. Área de ovocitos y sus núcleos……………………….. 42

7.4.1.2. Diámetro teórico (DT) y diámetro máximo (DM) de los

Ovocitos…………………………………………………… 45

7.4.1.3. Relación núcleo/citoplasma (R/C)……………………… 49

7.4.1.4. Índice de redondez (IR) de los ovocitos y núcleos……. 52

7.4.2. Indicadores histoquímicos de calidad ovocitaria……………….. 55

7.4.2.1. Índice lipídico (IL)………………………………………… 55

7.4.2.2. Índice de carbohidratos (ICH)………………………….. 63

7.4.2.3. Índice de reservas energéticas totales en forma de

lípidos y carbohidratos………………………………….. 71

7.5. Variación de la temperatura superficial y clorofila-a……………… 77

8. DISCUSIÓN……………………………………………………………………… 80

9. CONCLUSIONES……………………………………………………………….. 105

10. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA…………………………………………….. 107

11. ANEXOS.................................................................................................... 127

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Morfología externa de la concha del mejillon o choro (Modiolus capax)

(Tomado de: Femorale 2012)……………………………………………………………….2

Figura 2. Sitio de colecta de organismos y de extracción de datos de los sensores

remotos-satelitales de las variables ambientales de temperatura superficial del mar y

Clorofila a, en la Bahía de La Paz, B.C.S. en el Noroeste de México……………...…12

Figura 3. Anatomía del mejillón Modiolus capax. a) Anatomía completa del animal; b)

sección sagital de la porción media del animal. Las líneas muestran la localización de

cada órgano/ tejido (Tomado de: Howard y Smith, 1983)………………………...……13

Figura 4. Crecimiento en talla y peso para Modiolus capax (media±error estándar).

Los datos fueron analizados usando el mes como factor y la longitud (F9,290=2.6702;

P=0.00543); peso total fresco con concha (F9,920=5.7144; P<0.0001) y peso de la

carne (F9,920=17.552, P<0.0001) como variables dependientes en un ANOVA

unifactorial. El asterisco es el post hoc e indica diferencias estadísticamente

significativas (P<0.05) n=300………………………………………………...……………23

Figura 5. Variación del índice morfofisiológico de condición (IC; F9,290=133.72,

P<0.0001) de Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S.

Los datos fueron analizados usando el mes como variable independiente en un

ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias

estadísticamente significativas (P<0.05) n=300…………………………………………24

Figura 6. Área de cobertura de la gónada (ACG; F9,241=30.908, P<0.0001, n=251) vs

Área de cobertura del tejido somático (ACS; F9,241=30.908, P<0.0001, n=251) del

mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los

datos fueron analizados usando el mes como variable independiente en un ANOVA

unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente

significativas (P<0.05)...…………………………………………………………...……….25

Figura 7. Área de cobertura de la gónada (ACG) vs Área de cobertura del tejido

somático (ACS) de las hembras del mejillón Modiolus capax (media±error estándar)

en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (ACG:

F9,107=30.274, P<0.0001, n=127; ACS: F9,107=30.277, P<0.0001, n=127) y (b) el

estadio de desarrollo ovárico (ACG: F4,112=43.394, P<0.0001, n=117; ACS:

F4,112=43.397, P<0.0001, n=117) como variable independiente en un ANOVA


significativas…………………………………………………………………………………27

Figura 8. Área de cobertura de la gónada (ACG) vs Área de cobertura del tejido

somático (ACS) de los machos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar)

en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (ACG:

F9,114=18.977, P<0.0001, n=124; ACS: F9,114=18.976, P<0.0001, n=124) y (b) el

estadio de desarrollo ovárico (ACG: F4,100=27.458, P<0.0001, n=105; ACS:



significativas…………………………………………………………………………………29

Figura 9. Estadios de desarrollo gonádico en hembras de mejillón Modiolus capax

descritos en este estudio durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz,

B.C.S. E0. Indiferenciado, EI. Previtelogénesis, EII. Vitelogénesis, EIII.

Posvitelogénesis, EIV. Desove parcial, EV. Posdesove, descritos en este estudio. tc,

tejido conjuntivo; fl, folículos ováricos; td, tubo digestivo; cg y ovg, ovogonias; gd,

gonoducto; op, ovocitos previtelogénicos; ov, ovocitos vitelogénicos; opv, ovocitos

posvitelogénicos; oat, ovocitos atrésicos; n, núcleo; un, núcleolo; clf, células

foliculares; ovp, ovoplásma; np, nucleoplasma; he, hemocitos. Tinción Hematoxilina-

Eosina (H&E) (10X Barra=60µm; 20X Barra=100µm y 100X Barra=10µm)…….……34

Figura 10. Estadios de desarrollo gonádico en machos de mejillón Modiolus capax

descritos en este estudio durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz,

B.C.S. E0. Indiferenciado, EI. Espermatogénesis temprana, EII. Espermatogénesis

avanzada, EIII. Espermiogénesis, EIV. Desove parcial, EV. Posdesove. tc, tejido

conjuntivo; cfl, células foliculares; eg, espermatogonias; a, acinos testiculares; spz,

espermatozoos; spd, espermátidas; gd, gonoducto; he, hemocitos. Tinción

Hematoxilina-Eosina (H&E) (10X Barra=60µm; 20X Barra=100µm y 100X

Barra=10µm)…………………………………………………………………………………35

Figura 11. Frecuencia acumulada (%) de los estadios de desarrollo gonádico de las

hembras de mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La

Paz, B.C.S. n=300………………………………………………………………………..…37

Figura 12. Frecuencia acumulada (%) de los estadios de desarrollo gonádico de los

machos de mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La

Paz, B.C.S……………………………………………………………………………………38

Figura 13. Proporción sexual (%) del mejillón Modiolus capax en un ciclo

reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. n=300………………………………39

Figura 14. Número total de ovocitos por hembra (a 10X) del mejillón Modiolus capax

distribuidos en cada uno de los estadios de desarrollo ovárico en un ciclo

reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S………………………………………41

Figura 15. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas

(ovarios) del mejillón Modiolus capax que muestran el fenómeno de atresia y

degeneración ovocitaria. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos posvitelogénicos

(opv), ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo (tc), núcleo (n),

núcleolo (nu), carbohidratos ácidos (cha), material citoplásmico (mc). Tinción Azul

Alciano-PAS (AAPAS) (20X Barra=100µm)………………………………………...……42

Figura 16. Área de los ovocitos y los núcleos (µm2) del mejillón Modiolus capax

(media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados

usando (a) el mes (AO: F9,1401=28.302, P<0.0001, n=1410; AN: F9,1401=17.244,

P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (AO: F4,1406=56.240,

P<0.0001, n=1410; AN: F4,1406=53.485, P<0.0001, n=1410) como variable

independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican

diferencias estadísticamente significativas n=1,410……………………………………44

Figura 17. Área de los ovocitos (F2,86=0.40962, P=0.66519, n=89) y de los núcleos

(F2,86=8.1449, P=0.00058, n=89) (µm2) del mejillón Modiolus capax (media±error

estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo

de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras

indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas……………45

Figura 18. Diámetro teórico y máximo de los ovocitos (µm) del mejillón Modiolus

capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron

analizados usando (a) el mes (Diámetro teórico: F9,1401=31.477, P<0.0001, n=1410;

Diámetro máximo: F9,58=90.4020, P<0.0001, n=68) y (b) el estadio de desarrollo

ovárico (Diámetro teórico: F4,1406=81.876, P<0.0001, n=1410; Diámetro máximo:



significativas…………………………………………………………………………………48

Figura 19. Diámetro Teórico (F2,86=0.65245, P=0.52333, n=89) y Máximo

(F4,46=7.098, P<0.0194, n=51) de los ovocitos (µm) del mejillón Modiolus capax


usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las

letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas……49

Figura 20. Relación Núcleo/ Citoplasma de los ovocitos del mejillón Modiolus capax


usando (a) el mes (F9,1401=13.445, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo

ovárico (F4,1406=7.0865, P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un


estadísticamente significativas……………………………………………………………51

Figura 21. Relación Núcleo/ Citoplasma (F2,86=6.8880, P=0.00168, n=89) de los

ovocitos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz,

B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable


diferencias estadísticamente significativas………………………………………………52

Figura 22. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos y los núcleos del mejillón

Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos

fueron analizados usando (a) el mes (IR ovocitos: F9,1401=8.3374, P<0.0001, n=1410;

IR núcleos: F9,1401=18.163, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico

(IR ovocitos: F4,1406=11.781, P<0.0001, n=1410; IR núcleos: F4,1406=17.356,

P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las


Figura 23. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos (F2,86=105.49, P<0.0001, n=89) y

de los núcleos (F2,86=21.768, P<0.0001, n=89) del mejillón Modiolus capax


usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las



(ovarios) del mejillón Modiolus capax. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos

posvitelogénicos (opv), ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo

(tc), núcleo (n), núcleolo (nu), triglicéridos (tgl). Tinción Sudán Negro para grasas

(SN) (20X Barra=100µm)……………………………………………………………..……57

Figura 25. Índice Lípidico (IL) del ovario del mejillón Modiolus capax (media±error

estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el

mes durante un ciclo anual (F8,253=40.046, P<0.0001, n=262) y (b) el estadio de

desarrollo ovárico (F4,256=23.792, P<0.0001, n=261) como variables independientes

en ANOVAS unifactoriales. Las letras indexadas diferentes indican diferencias

estadísticamente significativas………………………………………………………….…59

Figura 26. Índice Lipídico (IL) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F8,253=2.3843,

P=0.01712, n=262), (b) ovocitos posvitelogénicos (F8,253=3.0486, P=0.00272, n=262)

y (c) ovocitos atrésicos (F8,253=2.1731, P=0.03, n=262) para el mejillón Modiolus

capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron

analizados usando el mes durante un ciclo anual como variable independiente en un


estadísticamente significativas…………………………………………………….………61

Figura 27. Índice Lipídico (IL) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F4,256=1.4531,

P=0.021702, n=261), (b) ovocitos posvitelogénicos (F4,256=3.8992, P=0.011104,

n=261) y (c) ovocitos atrésicos (F4,256=3.5070, P=0.00828, n=261) para el mejillón

Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos

fueron analizados usando el estadio de desarrollo ovárico como variable



Figura 28. Índice total de Lípidos (IL) por categoría de tipo de ovocito (F2,769=6.7917,

P=0.03194, n=772) para el mejillón Modiolus capax (media±error estándar) durante

un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el

tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras

indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas……….……64


(ovarios) del mejillón Modiolus capax. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos

posvitelogénicos (opv), ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo

(tc), núcleo (n), núcleolo (nu), carbohidratos neutros (chn). Tinción Azul Alciano-PAS

(AAPAS) (20X Barra=100µm)……………………………………………..………………65

Figura 30. Índice de Carbohidratos (ICH) para el mejillón Modiolus capax


usando (a) el mes durante un ciclo anual (F8,167=16.819, P<0.0001, n=176) y (b) el

estadio de desarrollo ovárico (F4,172=1.7208, P=1.4751, n=177) como variables

independientes en ANOVAS unifactoriales. Las letras indexadas diferentes indican


Figura 31. Índice de Carbohidratos (ICH) de (a) los ovocitos vitelogénicos

(F8,167=12.675, P<0.0001, n=176), (b) ovocitos posvitelogénicos (F8,167=10.113,

P<0.0001, n=176) y (c) ovocitos atrésicos (F8,167=15.623, P<0.0001, n=176) para el


datos fueron analizados usando el mes durante un ciclo anual como variable



Figura 32. Índice de Carbohidratos (ICH) de (a) los ovocitos vitelogénicos

(F4,172=9.5175, P<0.0001, n=177), (b) ovocitos posvitelogénicos (F4,172=3.2764,

P=0.01282, n=177) y (c) ovocitos atrésicos (F4,172=5.2682, P=0.0005, n=177) para el


datos fueron analizados usando el estadio de desarrollo ovárico como variable



Figura 33. Índice total de Carbohidratos (ICH) por categoría de tipo de ovocito

(F2,511=2.1826, P=0.030731, n=514 para el mejillón Modiolus capax (media±error

estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron

analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA


significativas…………………………………………………………………………………72

Figura 34. Índice total acumulado de Lípidos (IL) y Carbohidratos (ICH) por (a) mes y

(b) estadio de desarrollo ovárico para el mejillón Modiolus capax durante un ciclo

anual en la Bahía de La Paz, B.C.S………………………………………………………73

Figura 35. Índice total acumulado de Lípidos (IL) y Carbohidratos (ICH) por categoría

de tipo de ovocito para el mejillón Modiolus capax durante un ciclo anual en la Bahía

de La Paz, B.C.S……………………………………………………………………………75

Figura 36. Índice total acumulado de reservas energéticas en ovario (F1,436=1036.4,

P<0.0001, n=438) en forma de lípidos (IL) y carbohidratos (ICH) para el mejillón

Modiolus capax (media±error estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz,

B.C.S. Los datos fueron analizados usando el índice como variable independiente en

un ANOVA unifactorial. El asterisco es el pos hoc e indica diferencias

estadísticamente significativas……………………………………………………………76

Figura 37. Índice total acumulado de reservas energéticas en los ovocitos

(F1,1315=2408.4, P<0.0001, n=1,317) en forma de lípidos (IL) y carbohidratos (ICH)

para el mejillón Modiolus capax (media±error estándar) durante un ciclo anual en la

Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el índice como variable

independiente en un ANOVA unifactorial. El asterisco es el pos hoc e indica


Figura 38. Variación temporal de la temperatura superficial del agua y concentración

de clorofila-a (los datos son la media) en la Bahía de La Paz, B.C.S. entre enero de

2013 y enero de 2014. El área sombreada indica el periodo en el que se observaron

las mayores proporciones de individuos sexualmente maduros. Las líneas verticales

continuas indican los meses en los que se observaron los valores más altos en el

área de cobertura de las gónadas. Las líneas verticales discontinuas indican los

meses en los que se observaron las mayores proporciones de individuos con

gónadas indiferenciadas o en reposo, los meses en los que se observaron los

valores más bajos en el área de cobertura de las gónadas, y los meses en los que se

reportan las mayores áreas de cobertura de tejidos somáticos de Modiolus

capax…………………………………………………………………………………………79

Figura 39. Estructuras subcelulares que participan en la captación y almacenamiento

de nutrientes por los ovocitos de invertebrados. Los nutrientes lipídicos y del vitelo

atraviesan la membrana basal del folículo ovárico y llegan a la superficie de los

ovocitos a través del espacio extracelular que separa las células epiteliales

foliculares (flechas). Al llegar a la superficie del ovocito, los nutrientes son tomados

por endocitosis mediada por el receptor específico (lípidos o proteínas). Después de

pasar por las vesículas de endocitosis (endosomas), las proteínas se acumulan en

los compartimentos de almacenamiento de proteínas esféricas, llamadas cuerpos de

yema (parte del vitelo). Mientras que los triglicéridos y ácidos grasos son

almacenados en gotitas lipídicas. Anteriormente no se había identificado ningún otro

tipo de estructuras especializadas para la transferencia de lípidos extracelulares a las

gotitas de almacenamiento de lípidos en los ovocitos (Tomado de: Ziegler y Van

Antwerpen, 2010)………………………………………………………………...…………98

LISTA DE TABLAS

Tabla I. Descripción de los estadios de desarrollo gonádico de las hembras del

mejillón Modiolus capax……………………………………………………………………30

Tabla II. Descripción de los estadios de desarrollo gonádico de los machos del

mejillón Modiolus capax……………………………………………………………………32

RESUMEN

La mitilicultura es una actividad productiva y rentable en diversos países del mundo,

ente los que sobresale España. El mejillón Modiolus capax se distribuye

naturalmente en la Bahía de La Paz, B.C.S., México, y como otros mitilidos, tiene

potencial para ser cultivado. Sin embargo, los estudios enfocados al conocimiento de

su biología reproductiva son escasos para la región, lo cual limita el desarrollo de las

tecnologías acuícolas aplicables. En el presente estudio se analizó mediante técnicas

histológicas e histoquímicas, cualitativas y cuantitativas, la estrategia, dinámica y

esfuerzo reproductivo anual de la especie en la Bahía de La Paz, durante el periodo

comprendido entre febrero/2013 y enero/2014. Se determinaron las variables

biométricas de los organismos, tales como: longitud de la concha, peso total fresco y

peso fresco de la carne; y los índices morfofisiológicos como: el índice de

Ccondición, área de cobertura de la gónada y área de cobertura de tejidos

somáticos. El ciclo gonádico de M. capax se categorizó en cinco estadios de

desarrollo para hembras y machos identificando cinco categorías de desarrollo

ovocitario. La proporción de sexos se determinó en razón de 1:0.88 M:H. Los

resultados de esta investigación muestran que el mejillón M. capax se reproduce

durante todo el año con una máxima actividad gametogénica en primavera-verano,

con desoves parciales y totales principalmente a finales del verano e inicio del otoño.

La calidad ovocitaria se determinó mediante análisis digital de imágenes para

tomando como referencia parámetros morfométricos tales como el área (AO),

diámetro teórico (DT), diámetro máximo (DM), relación núcleo/citoplasma (N/C) e

índice de redondez (IR) de los ovocitos. Igualmente se evaluaron indicadores

histoquímicos tales como índice de lípidos (IL) y de carbohidratos (ICH), tanto en los

ovocitos como en el tejido ovárico del mejillón. Con base en lo anterior se concluye

que M. capax aplica una estrategia reproductiva “conservadora”, ya que la

gametogénesis se realiza a partir de la energía almacenada en sus tejidos

somáticos. Se concluye también, que el mayor esfuerzo reproductivo de la especie

se lleva a cabo entre abril y agosto con la mayor transferencia de reservas de los

compartimentos somáticos al tejido gonádico. Lo anterior, considerando que la

temperatura superficial promedio de la Bahía de La Paz fue de 23.95±0.98°C y la

concentración de Clorofila-a de 2.01±0.33 mg/m3 en promedio durante el ciclo anual

que comprende este estudio.

Palabras clave: Mejillones, ciclo reproductivo, desarrollo gonádico, reservas

energéticas, calidad de desoves.

ABSTRACT

Mitiliculture is a productive and profitable activity in several countries of the world,

among which stands out Spain. The mussel Modiolus capax is distributed naturally in

Bahía de La Paz, B.C.S., Mexico, and as other mussels, has potential to be

cultivated. However, studies focused on the knowledge of its reproductive biology are

scarce for the region, which limits the development of aquaculture applicable

technologies. In this study was analyzed by histological and histochemical,

quantitative and qualitative techniques, the strategy and reproductive effort annual

dynamics of this species in Bahía de La Paz, during the period February/2013

January/2014. Biometric variables of organisms, such as shell length, total fresh

weight and fresh meat weight were determined; and morpho-physiological indexes

such as condition index, gonad coverage area and somatic coverage area tissues.

The gonadic cicle of M. capax was categorized into five stages of development for

male and female, identifying five categories of oocyte development. The sex ratio was

determined in a 1:0.88 M:F. The results of this research show that the mussel M.

capax reproduces throughout the year with a maximum gametogenic activity in

spring-summer, partial and total spawning was observed mainly late summer and

early autumn. The oocyte morphometric quality was determined by digital image

analysis using as reference parameters such as Area (AO;) Theoretical Diameter

(TD), Maximum Diameter (MD), Nucleus/Cytoplasm relation (N/C) and Roundness

Index (IR) of oocytes. Also histochemical indicators such as Lipid Index (LI) and

carbohydrates (CHI) were evaluated in oocytes and mussel ovarian tissue. Based on

the above is concluded that M. capax applies a "conservative" reproductive strategy

because gametogenesis is made from the energy stored in their somatic tissues. It

was also concluded that the greater reproductive effort of the species takes place

between April and August with the largest transfer of reserves to gonadal somatic

tissue compartments. This, considering that the average temperature was 23.95±0.98

°C and the concentration of chlorophyll-a was 2.01±0.33 mg/m3 at Bahia de La Paz

surface temperature was 23.95 ± 0.98 ° C and the concentration of chlorophyll-a of

2.01 ± 0.33 mg/m3 averaged over the annual cycle comprising this study.

Keywords: Mussels, reproductive cycle, gonadal development, energy reserves,

quality of spawning.

1

1. INTRODUCCIÓN

En el filo de los moluscos se incluyen los invertebrados más y mejor

estudiados a nivel mundial, y entre ellos, la clase Bivalvia constituye el grupo de

mayor importancia ecológica y económica, ya que comprende recursos pesqueros y

acuícolas de alto valor comercial y nutricional (Cruz et al. 2000; Cáceres-Puig, 2007;

Maeda-Martínez, 2011). Los mejillones son moluscos bivalvos conuna importante

demanda como recurso alimentario en algunas regiones del mundo, principalmente

en países europeos como Francia, Dinamarca, Países Bajos, España e Italia

(Bardach et al.1972; Korringa, 1976; Ochoa-Báez, 1985; Bückle y Garza, 1989;

Cabrera-Peña y Solano-López, 1995; Uriarte, 2008; Oyarzún et al., 2011). En la

actualidad, la pesca y la producción acuícola de mejillón a nivel mundial generan en

promedio cerca de 0.25 millones de toneladas anuales (FAO, 2012).

Entre los mitílidos presentes en el Pacífico Americano se incluye el mejillón

Modiolus capax (Conrad, 1837), conocido regionalmente como “choro” (Fig. 1). La

explotación de la especie se ha basado tradicionalmente en la extracción pesquera

de sus bancos naturales, aunque ya comienzan a desarrollarse cultivos extensivos

que proporcionan cosechas modestas en algunos países. En Chile, el cultivo

comercial de mitílidos o choros se centra principalmente en especies nativas cuya

biología reproductiva ha sido recientemente descrita y a pesar de ello, la producción

alcanza un buen impacto comercial y social (Cabrera-Peña y Solano-López, 1995;

Uriarte, 2008; Oyarzún et al., 2011). Como contraparte, la especie no tiene demanda

comercial en México, por lo que no se ha generado suficientemente la necesidad de

generar nuevo conocimiento científico aplicable al desarrollo de técnicas de

producción. Sin embargo, considerando el desarrollo que van teniendo especies

afines de mejillón, es necesario y pertinente desarrollar estudios en ciencia aplicada,

enfocados al conocimiento de los aspectos biológicos de M. capax para desarrollar

nuevas opciones de producción acuícola.

M. capax se distribuye en la franja tropical y subtropical, a temperaturas que

fluctúan entre 16 y 32°C en límites extremos invierno/verano. Habita en la zona

rocosa intermareal y sublitoral hasta 46m de profundidad, desde el sur de Santa

Cruz, California, E.U.A., hasta Paita, Perú eislas Galápagos (Keen 1971; Brusca,

2

1980; Rehder, 1981; Ochoa-Báez, 1987; Cabrera-Peña y Solano-López, 1995). En el

litoral Mexicano, la especie se distribuye en la costa occidental del Golfo de California

(Ochoa-Baez, 1985; Ochoa-Baez, 1987) incluyendo Bahía de los Ángeles, B.C.

(Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre, 1989) y Bahía de La Paz, B.C.S. (Ochoa-Baez,

1985; Ochoa-Baez, 1987) siendo más abundante en Bahía Concepción, y al Norte de

Santa Rosalía, B.C.S. (Olguín, 1976).

Figura 1. Morfología externa del mejillon o choro (Modiolus capax) (Femorale 2012).

En México, el consumo de mejillones es limitado, ya que se restringe a

determinados sectores sociales gourmet de la población (Ochoa-Báez, 1985; Ochoa-

Báez, 1987; Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre, 1989). A nivel nacional el recurso se

explota mínimamente por pescadores artesanales y para auto-consumo, debido a

que existen otros bivalvos con mayor valor comercial y mayor demanda en el

mercado nacional y de exportación. Sin embargo, existen posibilidades para la

especie, ya que es bien sabido que el mejillón tiene un sabor agradable y que su

contenido proteico es elevado, estimándose en un 69.5% aproximadamente (Mateus

y Scott, 1986).

Los estudios enfocados a conocer la biología reproductiva de diferentes

especies de moluscos bivalvos proveen de información valiosa y útil para efectuar

predicciones su reclutamiento y ciclos de maduración gonádica (Hernández-Olalde,

2003; Rodríguez-Jaramillo, 2004). Esta información es necesaria para el manejo

controlado de reproductores en y obtención de semilla, pero tambien resulta aplicable

para el aprovechamiento sostenible del recursoa partir de la extracción pesquera de

sus poblaciones naturales (Seed, 1976; Arsenault y Himmelman, 1998; Oyarzún et

3

al., 2011). En este contexto, la nueva información acerca de los ciclos de desarrollo

gonádico, estrategia y esfuerzo reproductivo del mejillón M. capax en la Bahía de La

Paz es fundamental para desarrollar técnicas de producción acuícola que pudieran

llegar a ser interesantes a escala comercial.

La reproducción de los moluscos bivalvos en su medio natural puede ser

cíclica (anual, semianual) o continua (Sastry, 1979; Alfaro et al., 2001). La estrategia

reproductiva de los moluscos bivalvos está relacionada con una combinación

compleja de factores exógenos (ambientales), como temperatura, fotoperiodo, ciclo

lunar, ciclos de mareas, profundidad, salinidad, disponibilidad y calidad de alimento.

Sin embargo, existen factores endógenos propios que son determinantes para cada

especie, como nutrientes almacenados (reservas energéticas), carga genética y

neurosecreción hormonal (Galtsoff, 1964; Sastry, 1979; Mackie, 1984; Barber y

Blake, 1991; Thompson et al., 1996; Avellanal et al., 2002; Quiñones-Arreola, 2003;

Hernández-Olalde, 2003; Thorarinsdóttir y Gunnarsson, 2003; Cáceres-Puig, 2007).

Diversos estudios sugieren que la temperatura la disponibilidad de alimento y

la calidad del agua (Barber y Blake, 1991; Hernández-Olalde, 2003; Cáceres-Puig,

2007; Ortiz-Zarragoitia y Cajaraville, 2010), son los principales factores que regulan

el ciclo gametogénico y el movimiento de reservas energéticas como lípidos y

carbohidratos durante la reproducción de los bivalvos marinos (Seed, 1976;

Macdonald y Thompson, 1986; Malachowsky, 1988; Jaramillo et al., 1993; Jaramillo y

Navarro, 1995). Los bivalvos presentan una gran plasticidad para adaptarse a

diferentes condiciones ambientales que modulan sus ciclos y estrategias

reproductivas. Esta capacidad de adaptación les permite tener una muy amplia

distribución geográfica, que incluye diferentes latitudes, profundidades y hábitats

(Bayne, 1976; Gease y Pearse, 1974, 1979; Lubet, 1981; Baber y Blake, 1991;

Lucas, 1992; Chávez-Villalba, 2001).

El mejillón M. capax es una especie gonocórica con fecundación externa y con

dimorfismo sexual. El macho presenta una gónada de color crema amarillento y la

hembra se distingue por su color crema anaranjado (Ochoa-Báez, 1987; Bahamodes

y Muñoz, 1998; Clasing et al., 1998; Uriarte, 2008; Oyarzún et al., 2011). Sin

embargo, existe un registro exclusivo para la Bahía de La Paz (Ochoa-Báez, 1987)

4

en donde se reportaron eventos muy escasos de hermafroditismo y bisexualidad

funcional y no funcional en una población de M. capax en el año de 1983.

Los estudios de la biología reproductiva en moluscos bivalvos se abordan a

partir de aproximaciones histológicas. Sin embargo, son pocos los estudios que

involucran análisis de condición morfofisiológica, calidad ovocitaria y cuantificación

de reservas energéticas por medio de técnicas histoquímicas, a pesar de que estos

indicadores ofrecen una mejor aproximación del ciclo reproductivo. En los moluscos,

se define como esfuerzo reproductivo a la cantidad de energía que se destina de los

tejidos somáticos a la reproducción (gónada), en determinadas condiciones (Lucas,

1992; Thompson y MacDonald, 1991; Gangnery, 1997; Cáceres-Puig, 2007). Los

bivalvos tienen la capacidad de almacenar reservas en sus tejidos durante periodos

de alta disponibilidad de alimento, las cuales son canalizadas en momentos de

escases alimenticia y/o de alta demanda de energía, como puede ser, durante la

reproducción (Cáceres-Puig, 2007). La estrategia reproductiva de cada especie se

define en función de su capacidad para acumular y movilizar sus reservas

energéticas. (Baber y Blake, 1991; Lucas, 1992; Mathieu y Lubet, 1992; Gangnery,

1997; Villalejo-Fuerte y García-Domínguez, 1998; Villalejo-Fuerte y Muñeton-Gómez,

2002; Rodríguez-Astudillo et al., 2002). En virtud de que dichas reservas energéticas

son limitadas en tiempo y espacio, deben repartirse estratégicamente y de manera

diferencial para su uso en el crecimiento de los tejidos somáticos y/o para la

reproducción (Ziolko y Kozlowski, 1983; MacDonald y Thompson, 1986; Paulet y

Boucher, 1991; Duinker, 2002; Cáceres-Puig, 2007).

El tipo y la cantidad de reservas energéticas son muy importantes para

asegurar la calidad de los gametos y el éxito de un evento reproductivo.Las larvas de

la mayoría de los moluscos bivalvos son inicialmente lecitotróficas y su desarrollo

temprano depende de las reservas bioquímicas que son transferidas a los ovocitos

durante la vitelogénesis (Holland, 1978; Bayne y Newel, 1983; Marty et al., 1992;

Rodríguez-Jaramillo, 2004).

Se ha demostrado que durante la vitelogénesis, embriogénesis y desarrollo

larvario, los lípidos, y particularmente, los triglicéridos (Racotta et al., 2003;

Rodríguez-Jaramillo, 2004) y los carbohidratos en forma de glucógeno (Puente-

5

Carreón, 2000; Guerra et al. 2012), juegan un papel importante como reserva

energética, mientras que los fosfolípidos participan en la formación de membranas

celulares (Rodríguez-Jaramillo, 2004).

Las adaptaciones del metabolismo energético durante la reproduccion juegan

un papel clave en el conjunto de rasgos adaptativos que le permiten a moluscos

bivalvos prosperar en ambientes muy variados como lo son las zonas intermareales,

estuarios y aguas costeras con alto impacto antropogénico (Ortiz-Zarragoitia y

Cajaraville, 2010; Hinnzman et al., 2013;). El suministro de energía suficiente es un

requisito muy importante no sólo para la supervivencia inmediata de los organismos,

sino para todas las demás funciones demandantes de energía que aseguran el éxito

de la especie, tales como el crecimiento y la reproducción (Sokolova et al., 2011). La

cantidad y tipo de reservas energéticas esta ligada a los cambios fisiológicos durante

períodos de intenso crecimiento y de reproducción (Constantini, 2010), lo cual

constituye un factor importante durante la historia de vida reproductiva del mejillón.

En el presente trabajo se estudió una población natural de mejillon M. capax

durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Se identificaron los estadios de

desarrollo gonádico de la especie durante un ciclo anual, se determinaron cambios

morfofisiológicos, principalmente en talla y peso, variación de los índices de

condición y de área de cobertura de la gónada/ tejido somático, del movimiento y uso

de reservas energéticas (carbohidratos y lípidos). Igualmente, se estimaron algunas

variables morfométricas (área total, diámetro teórico y máximo, relación

núcleo/citoplasma e índice de redondez de los ovocitos) e histoquímicas de calidad

(índice lípidico y de carbohidratos) que tienen utilidad como indicadores de la calidad

ovocitaria durante la gametogénesis de Modiolus capax.

Un requerimiento básico para aplicar normas de explotación de especies

marinas comerciales como M. capax es el conocimiento detallado del proceso de

maduración gonádica y ciclo reproductivo, el cual puede deducirse con base en la

descripción histológica e histoquímica como la que se ha realizado con esta

investigación.

6

Su posición taxonómica, según Coan y Valentich-Scott (2012) es:

Filo: Mollusca (Linnaeus, 1758)

Clase: Bivalvia (Linnaeus, 1758)

Subclase: Pteriomorphia (Beurlen, 1944)

Orden: Mytiloida (Férussac, 1822)

Superfamilia: Mytiloidea (Rafinesque, 1815)

Familia: Mytilidae (Rafinesque, 1815)

Género: Modiolus (Linnaeus, 1758)

Especie: Modiolus capax (Conrad, 1837)

http://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=491766

http://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=491766

7

2. JUSTIFICACIÓN

El consumo del mejillón Modiolus capax en la Bahía de La Paz, B.C.S. se

restringe a la extracción ribereña artesanal, recreativa y turística pues hasta el

momento, no existe ninguna regulación para la captura y aprovechamiento de este

molusco. La producción natural es limitada, pero al igual que otras especies de

mejillón, M. capax podría ser objeto de cultivo masivo si se desarrollan estudios en

materia de ciencia básica, y ciencia aplicada al desarrollo y/o adecuación de

tecnologías ad-hoc para la acuacultura de esta especie. Los bancos naturales de la

especie son muy accesibles a la pesca sin control, lo cual podría propiciar un

agotamiento de las poblaciones silvestres tal y como ha ocurrido con otras especies

de bivalvos de la zona como es el caso de la “almeja catarina” Argopecten

ventricosus (Avilés-Quevedo y Muciño-Díaz, 1990; Cáceres-Martínez et al. 1990;

Mazón-Suástegui, 2005), “hacha china” Atrina maura y “hacha larga” Pinna rugosa

(Robles-Mungaray, 2004), “almeja chocolata” Megapitaria aurantiaca, M. squialida

(Arellano-Martínez et al., 2006; López-Rocha et al., 2010), “almeja mano de león”

Nodipecten subnodosus (Arellano-Martínez et al., 2004; Maeda-Martínez, 2011);

“almeja voladora” Pecten vogdesi; “madre perla” Pinctada mazatlanica (Baqueiro-

Cárdenas et al., 1981; Baqueiro-Cárdenas et al., 1982) y “concha nácar” Pteria

sterna (Hernández–Olalde, 2003; Cáceres-Puig, 2007).

El choro o mejillón M. capax representa hasta el momento un recurso

potencial a ser explotado en la Bahía de La Paz, B.C.S. en vista de que las

poblaciones naturales de otros bivalvos de interés comercial en la región se

encuentran sobreexplotados o agotados (Luna-González, 1997; Arias-León, 2002).

Sin embargo, en México y sobre todo en la región noroeste del país, existe un

desconocimiento de ese potencial y carencia de información relacionada con su

biología reproductiva y los cambios morfofisiológicos asociados, tales como su ciclo

gametogénico, movimiento y uso de reservas energéticas y calidad ovocitaria

durante la temporada reproductiva. Son escasos los estudios que abordan a partir de

aproximaciones histológicas e histoquímicas cualitativas y cuantitativas, el análisis de

la condición morfofisiológica y energética, así como de la calidad ovocitaria de

moluscos bivalvos marinos durante su ciclo reproductivo en condiciones naturales.

8

No obstante, estos indicadores representan una aproximación más directa para

estudiar el evento reproductivo (Cáceres-Puig, 2007; Rodríguez-Jaramillo et al.,

2008). Es indispensable conocer los indicadores de calidad morfométricos, así como

el tipo, contenido y movimiento de reservas energéticas de los ovocitos de M. capax

durante un ciclo reproductivo anual en el medio natural permitirá identificar los

momentos de mayor fortaleza y vulnerabilidad reproductiva de la especie, así como

su estrategia y esfuerzo reproductivo en relación con los cambios en ciertos

parámetros ambientales, como la temperatura del agua y el alimento disponible

(clorofila-a).

El agotamiento de los bancos naturales de otras especies de moluscos

bivalvos en la Bahía de La Paz, B.C.S. ha obligado a buscar alternativas sobre

recursos potenciales a su aprovechamiento como el mejillón, que, además, puedan

proporcionar buenos resultados en su reproducción, crecimiento y supervivencia

durante su cultivo.

9

3. HIPÓTESIS

Resulta fundamental conocer la dinámica del crecimiento, ciclo reproductivo y

calidad ovocitaria, así como la movilización de reservas energéticas de los tejidos

somáticos y germinales del mejillón Modiolus capax durante un ciclo anual en el

medio natural en la Bahía de La Paz, ya que el conocimiento de su ciclo, estrategia y

esfuerzo reproductivo permitirá identificar las temporadas de mayor vulnerabilidad

para la explotación y aprovechamiento del recurso.

Los índices morfofisiológicos (de condición y de área de cobertura gonádica/

tejido somático), la estrategia y el esfuerzo reproductivo (cantidad, tipo y movimiento

de reservas energéticas), y los indicadores de la calidad ovocitaria (área de los

ovocitos, diámetro teórico, diámero máximo, relación núcleo/citoplasma, índice de

redondez o de forma e índices lípidico y de carbohidratos) del mejillón M. capax

varían de acuerdo a las diferentes etapas de su ciclo reproductivo y tienen relación

con la variación de los parámetros ambientales (temperatura superficial del agua y

productividad primaria ) durante el periodo de estudio, en la Bahía de La Paz, B.C.S.

México.

10

4. OBJETIVOS

4.1. General

Estudiar la estrategia y esfuerzo reproductivo de una población natural del

mejillón nativo Modiolus capax durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.

México.

4.2. Específicos

Determinar la proporción de sexos de Modiolus capax durante un ciclo anual

en la Bahía de La Paz, B.C.S.

Describir el ciclo reproductivo y el desarrollo gonádico en hembras y machos

durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. clasificando los estadios

de desarrollo gonádico mediante la evaluación histológica cualitativa.

Estimar y comparar los índices morfofisiológicos de condición, área de

cobertura gonádica y de tejido somático para M. capax en un ciclo

reproductivo anual en condiciones naturales.

Determinar la frecuencia de las categorías ovocitarias durante el ciclo

reproductivo anual, clasificando y cuantificando los ovocitos de las hembras en

gametogénesis en cinco categorías (ovogonias, ovocitos previtelogénicos,

vitelogénicos, posvitelogénicos y atrésicos) mediante la evaluación histológica

cualitativa.

Determinar las variables morfométricas (área, diámetro teórico y máximo,

índice de redondez y relación núcleo/citoplasma) e histoquímicas (índice de

lípidos y carbohidratos) de calidad de los ovocitos de M. capax durante un

ciclo anual mediante la evaluación histológica e histoquímica cuantitativa y el

análisis digital de microfotografías.

Describir las variaciones en el esfuerzo y estrategia reproductiva de la especie

durante un ciclo anual, identificando los momentos de mayor vulnerabilidad y

susceptibilidad energética y fisiológica.

Analizar las variaciones de temperatura superficial y concentración de

clorofila-a en la Bahía de La Paz, B.C.S. para relacionarlas con el patrón

reproductivo de la especie.

11

5. ÁREA DE ESTUDIO

La Bahía de La Paz, B.C.S. está localizada en la costa occidental del Golfo de

California entre los 24°06’ y 24°47’ latitud norte y los 110°18’ y 110°45’ longitud oeste

(Fig. 2). Tiene forma de ovalo, su eje mayor (81km) está orientado de noroeste a

suroeste, mientras que su eje menor mide aproximadamente 33km (Martínez-López

et al., 2001). La zona norte de la bahía es la más profunda, llega hasta los 400m. En

la parte media la profundidad varía entre 180 y 270m y en la parte sur es menor a

50m (Cruz-Orozco et al., 1996). La temperatura mínima superficial en la bahía es de

20°C en invierno-primavera y la máxima entre 31 y 32°C en verano (Espinoza y

Rodríguez, 1987, Martínez-López et al., 2001). La masa continental que delimita a la

bahía presenta un clima muy seco y semicálido (Cruz-Ayala, 1996). La precipitación

promedio anual es menor a 200mm, siendo septiembre el mes más lluvioso (Robles

Gil-Mestre, 1998) (<100 mm). Los vientos predominantes del noroeste durante el

invierno tienen velocidades medias de 2 a 3 m.s-1, en ocasiones alcanzan

intensidades medias de 4 m.s-1 y rachas de 10m.s-1 (Robles Gil-Mestre, 1998). En

verano lo vientos tienen una componente sur, con intensidades medias de 2 a 3 m.s-1

(Robles Gil-Mestre, 1998). La temperatura promedio ambiental mínima en la capa de

aire superficial a la bahía es de 8°C en invierno y la máxima de 37°C en verano

(Cruz-Ayala, 1996).

La clorofila-a presenta un comportamiento estacional inverso a la temperatura

y a la transparencia del agua en la bahía, ya que las menores concentraciones

(<10mg/m2) ocurren en los meses más cálidos como resultado de la fuerte

estratificación de la columna de agua, que no permite el transporte de material

asimilable por el fitoplancton de la capa profunda a la capa superficial (Martínez-

López et al., 2001). Las mayores concentraciones (142.8 mg/m2) se presentan en la

época fría, asociadas con los procesos de mezcla de la columna de agua por la alta

disponibilidad de nutrientes en la zona eufótica (Martínez-López et al., 2001).

12

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Muestreos y colecta de organismos

Los organismos empleados para llevar a cabo la presente investigación fueron

colectados durante un ciclo anual comprendido entre los meses de Febrero de 2013

a Enero de 2014. Mensualmente se colectaron 30 ejemplares mediante buceo libre

en la Bahía de La Paz, B.C.S. (24°18'6.68"N; 110°20'8.79"O) (Fig. 2) a una

profundidad de 1.5 a 4 m. Los mejillones colectados se limpiaron exteriormente para

retirar de las valvas epibiontes e incrustantes así como el biso y las proyecciones del

periostraco características de la especie. Los organismos limpios fueron fijados in

situ en solución Davidson (Shaw y Blatle, 1957) por 72 hrs (Anexo I) y trasladados al

laboratorio de Histología e Histoquímica del CIBNOR-La Paz.

Figura 2. Sitio de colecta de organismos y de extracción de datos de los sensores remotos-satelitales de las variables ambientales de temperatura superficial del mar y Clorofila a, en Bahía de La Paz, B.C.S. al Noroeste de México (Tomado de: García-Corona et al., 2014a).

13

6.2. Biometrías y disección

En el laboratorio, se realizaron biometrías de cada ejemplar colectado,

determinando longitud total de la concha (distancia anteroposterior del umbo al

margen exterior de las valvas), utilizando un Vernier de precisión (±0.01mm).

Adicionalmente se determinó y se registró el peso fresco de los animales enteros

(peso con concha) y el peso fresco de la carne (peso sin concha) con una balanza

analítica de precisión (±0.0001 g) modelo OHAUS TS4000®. Posteriormente se

realizaron por disección dos cortes transversales de toda la región media de cada

organismo para obtener una sección sagital que incluyera los tejidos

correspondientes al manto, gónada, glándula digestiva y músculo aductor (Fig. 3), lo

anterior de acuerdo al protocolo descrito por Howard y Smith (1983). Los tejidos

disectados se colocaron en histocasettes para su posterior procesamiento histológico

e histoquímico.

Figura 3. Anatomía del mejillón Modiolus capax. a) Anatomía completa del animal; b) sección

sagital de la porción media del animal. Las líneas muestran la localización de cada órgano/ tejido (Tomado de: Howard y Smith, 1983).

6.3. Análisis histológico e histoquímico

Las secciones transversales fueron colocadas individualmente en

histocasettes y preservadas en alcohol etílico al 70% durante 24 hr. El procesamiento

histológico (deshidratación y aclaramiento) de las muestras se llevó a cabo

empleando un procesador automático de tejidos LEICA ASP200S®. La

deshidratación se realizó en series de alcohol etílico de concentración ascendente

a) b)

14

(70%; 80%; 90%; 96%; 100%). El aclarado de las muestras se hizo con xilol absoluto

(100%) pasando antes los tejidos por una solución de alcohol etílico absoluto:xilol

(1:1) y después por xilol al 100%. La infiltración de las muestras en parafina se

realizó introduciendo los tejidos en un recipiente con una solución 1:1 de

parafina:xilol para después colocarlas en cuatro recipientes más con parafina líquida

caliente a 60°C. La inclusión de las muestras se llevó a cabo en Paraplast X-Tra con

punto de fusión de 54-56 °C en un centro de inclusión LEICA EG1150H y EG1150C®.

Los moldes se dejaron enfriar en una placa fría (-5 °C).

Empleando un micrótomo de rotación LEICA RM2155® se realizaron cortes de

los tejidos a 4µm de grosor a y para extenderlos, se colocaron en un baño de

flotación con agua y grenetina al 1%, durante 5min a 43°C. Enseguida se tomaron los

cortes del baño de flotación con portaobjetos previamente etiquetados y se dejaron

secar a temperatura ambiente durante 24 hr.

Los tejidos se desparafinaron en tres recipientes con Xilol I, II y III durante

10min en cada uno, luego pasaron a una solución 50:50 alcohol etílico 100%-xilol

durante 5 min, posteriormente las muestras se hidrataron haciéndolas pasar por un

tren de alcohol etílico en concentración decreciente (96%; 70%; 70%) durante 2min

en c/u, finalmente, pasaron por agua destilada durante 5min. Después de estos

procedimientos, las laminillas con los cortes de tejido gonádico se tiñeron en el

teñidor automático de tejidos LEICA ST5020®.

Para el estudio histológico de las gónadas (ciclo reproductivo y desarrollo

gonádico) de los mejillones se empleó la técnica histológica convencional de

Hematoxilina-Eosina (H&E). Los cortes teñidos con esta técnica se emplearon para

llevar a cabo la clasificación de los estadios de desarrollo de las gónadas de M.

capax, así como para la clasificación de los ovocitos en cinco categorías ovocitarias

de desarrollo. La técnica Hematoxilina-eosina (H&E) (Anexo II) supone que la

aplicación de la tinción con hematoxilina de Harris por ser catiónica o básica, tiñe

estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul y púrpura, como por ejemplo los núcleos

celulares; mientras que el uso de eosina-floxina (12 min) tiñe componentes básicos

(acidófilos) en tonos naranja-rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el

citoplasma (Sheehan y Hrapchak, 1973; Montalvo-Arenas, 2010).

15

Para los análisis histoquímicos de calidad de los ovocitos (tipo y cantidad de

reservas energéticas) se emplearon las técnicas de tinción histoquímicas Azul

Alciano PAS (para carbohidratos) y Sudan Negro (para lípidos). Por una parte, con la

técnica de tinción histoquímica Azul Alciano PAS (AAPAS) (Anexo III) se puede

diferenciar fácilmente la presencia de carbohidratos (glicoconjugados ácidos y

neutros) en la misma preparación (Bancroft y Stevens, 1990). Consiste en una

primera tinción con azul alcián seguida del reactivo o Ácido Peryódico Schiff. El uso

en primer lugar del azul alciano permite colorear los glicoconjugados,

glicosaminoglicanos y mucopolisacáridos ácidos en tono azules. Por lo tanto, la

posterior utilización del PAS sólo reaccionará con los gliconjugados neutros

(carbohidratos de reserva energética) coloreándolos en tonalidades púrpura-magenta

(Sheehan y Hrapchak, 1980; Bancroft y Stevens, 1990). La presencia de mucinas

ácidas en las células globosas secretoras de mucosidad en los epitelios de los

conductos primarios de la gónada se interpreta como evidencia de transporte de

gametos hacia el exterior durante el desove (Lora-Vilchis et al., 2003), mientras que

la presencia de estas mismas mucinas ácidas en otros epitelios germinales se

considera evidencia de la respuesta inmune de los organismos ante un proceso

infeccioso (bacteriano, fúngico o viral) o de la captura, transporte de agentes

partículados exógenos, lubricación y señalización celular (Cannuel y Beninger, 2007).

Para el propósito de coloración de los componentes grasos de los tejidos se usó la

técnica histoquímica Sudán Negro (SN) (AnexoIV). El colorante Negro Sudán es un

reactivo de auxocrómo azul-negro en etanol acuoso y por solubilidad tiene

preferencia por los componentes lipídicos de los tejidos, tiñéndolos de color negro

azulado (Junqueira, 1988; Sobbota, 1988; Rodríguez-Jaramillo et al., 2008). El

colorante sudán negro tiñe una amplia variedad de lípidos que comprende

principalmente fosfolípidos (tonos grises), así como esteres de colesterol y

triglicéridos en tonalidades que van del azul oscuro a negro (Genneer, 1989;

Rodríguez-Moscozo y Arnaiz, 1998).

Para el montaje, las laminillas correspondientes a las técnicas de tinción con

Hematoxilina-Eosina y Azul Alciano PAS se colocaron en medio permanente de

resina sintética o Entellan, mientras que las laminillas de la técnica Sudán Negro se

16

montaron en medio de gelatina glicerinada. Las laminillas montadas se dejaron

secando por 24 hr y transcurrido ese tiempo se removió el exceso de resina para,

finalmente, realizar las observaciones al microscopio, de las estructuras histológicas

de cada tejido.

6.4. Estimación de índices morfofisiológicos

Se realizó la estimación del índice de condición (IC) e índice gonádico (IG) de

los mejillones colectados durante un ciclo anual, mediante los procedimientos que se

describen con detalle a continuación:

6.4.1. Índice de Condición (IC)

El índice de condición (IC) se estimó como el porcentaje del peso húmedo de

la carne (partes blandas) respecto al peso húmedo total (con concha). Este índice

permite observar la variación mensual del peso total de las partes blandas respecto

al peso total del cuerpo (Villalejo-Fuerte y Ceballos-Vázquez 1996). La fórmula

utilizada para el cálculo fue la siguiente:

IC= [(pt-pco)/pc]*100

Donde:

pt = peso total

pco = peso de la concha

pc = peso de la carne

6.4.2. Área de cobertura gonádica (ACG) y Área de cobertura de tejido somático

(ACS)

El área de cobertura gonádica (ACG) y área del cobertura de tejido somático

(ACS) se calcularon determinando el área promedio ocupada por la gónada y la

masa visceral de tres imágenes a 4X (7.9mm2) de cada especimen, usando el

sistema de análisis digital de imágenes Image Pro Premier (versión 9.0) Olympus-

Media Cybernetics®. El análisis de las imágenes se basó en la segmentación de los

pixeles con la intensidad del color específico del tejido gonádico y somático. El

software utilizado calculó automáticamente el área ocupada por la gónada y la masa

visceral en pixeles y la expresó en µm2. El ACG y el ACS se calcularon a partir del

17

área de cobertura de la gónada y de la masa visceral versus el área de cobertura

total de los tejidos, expresando el resultado en términos de porcentaje (Rodríguez-

Jaramillo et al., 2008) mediante la aplicación de las siguientes formulas:

ACG =Área de cobertura de la gónada

Área total de los tejidos X 100

ACS =Área de cobertura del tejido somático

Área total de los tejidos X 100

6.5. Análisis histológicos cualitativos

Los cortes de tejidos teñidos con las técnicas antes descritas fueron

observados mediante microscopia de luz en un microscopio óptico compuesto de

contraste de fases y campo claro Olympus BX41 y una cámara digital para

microscopio marca Nikon Digital Sight DS-Ri1® conectada a una computadora. Las

imágenes (microfotografías) de los tejidos fueron digitalizadas con los objetivos 4X y

10X y analizadas digitalmente con el software Image Pro Premier (versión 9.0)

Olympus-Media Cybernetics®.

6.5.1. Ciclo reproductivo, desarrollo gonádico y ovocitario

A partir de las preparaciones histológicas con la técnica de tinción H&E, se

realizó la descripción de los estadios de desarrollo de las gónadas tanto de hembras

(Tabla I) como de machos (Tabla II), tomando referencia en la clasificación

propuesta por Rodríguez-Jaramillo et al. (2008). Los ovocitos fueron clasificados en

cinco categorías ovocitarias de acuerdo con su estadio de desarrollo gametogénico

durante el ciclo reproductivo anual en condiciones naturales en la Bahía de La Paz,

considerando para ello la descripción morfológica de Rodríguez-Jaramillo et al.

(2001): ovogonias, ovocitos previtelogénicos, vitelogénicos, posvitelogénicos y

atrésicos. Lo anterior, para llevar a cabo el análisis particular de sus variables

morfométricas y de calidad ovocitaria (Rodríguez-Jaramillo, 2004).

18

La frecuencia de estas categorías ovocitarias fue estimada en varias regiones

del ovario, contando el número de ovocitos de cada estadio de maduración presentes

en un área predeterminada de 2.88 mm2 con el aumento 10X (Rodríguez-Jaramillo,

2004; Rodríguez-Jaramillo et al. 2008).

6.6. Análisis histológicos cuantitativos

6.6.1. Indicadores morfométricos de calidad ovocitaria

El área total del ovocito (AT) y las áreas del nucleoplasma y ovoplasma fueron

determinados en tres diferentes regiones de cada ovario usando el software de

análisis digital de imágenes SigmaScan Automated Image Analysis (versión 5.0).

Para realizar estos análisis, solamente fueron considerados los ovocitos cortados en

el plano ecuatorial que mostraron nucleoplasma, (Rodríguez-Jaramillo et al. 2001).

La calibración del sistema de análisis digital se hizo mediante una reglilla

micrométrica para el objetivo 20X. De las 3 imágenes de cada ovario se

seleccionaron 30 ovocitos con nucleoplasma bien definido, delimitando el perímetro

de cada ovocito y de su nucleoplasma de forma manual con el cursor. El software

calculó automáticamente el área total (AT) y el área del nucleoplasma, así como el

índice de redondez (IR) de los ovocitos. Las mediciones del diámetro teórico (DT),

diámetro máximo (DM), área de los ovocitos (AT) y relación núcleo/citoplasma (N/C)

se realizaron siguiendo los criterios descritos por Rodríguez-Jaramillo et al. (2001) y

Rodríguez-Jaramillo (2004). Dado que los ovocitos presentan formas irregulares

durante la ovogénesis, se calculó el diámetro teórico (DT) y el diámetro máximo (DM)

de los ovocitos a partir del área (A) de cada ovocito, para evitar errores al establecer

el diámetro de forma arbitraria usando las siguientes formulas:

6.6.1.1. Diámetro Teórico (DT)

DT= √4𝐴/π (Briarty, 1975; Saout et al. 1999).

6.6.1.2. Diámetro Máximo (DM)

19

Se seleccionó el valor de diámetro máximo de los ovocitos de cada hembra

por mes, estadio de desarrollo gonádico y por categoría de desarrollo

ovocitario.

6.6.1.3. Relación núcleo/citoplasma (N/C)

N/C= área del núcleo/ área del citoplasma (Rodríguez-Jaramillo et al. 2001).

6.6.2. Indicadores histoquímicos de calidad ovocitaria

Se evaluaron siguiendo el procedimiento descrito por Rodríguez-Jaramillo

(2004) y Rodríguez-Jaramillo et al., (2008). Para delimitar el perímetro de cada

ovocito y de su núcleo de forma manual se utilizó el cursor y el programa de análisis

digital de imágenes Image Pro Premier (versión 9.0) Olympus-Media Cybernetics®

Para ello se seleccionaron previamente 3 imágenes de cada gónada femenina a un

aumento de 20X y se seleccionaron 20 ovocitos con núcleo bien definido de cada

una de ellas. Una vez que el ovocito quedó definido se utilizó la herramienta

segmentadora del programa, que identifica solo los colores azul oscuro-negro

(lípidos) y magenta (carbohidratos) y que además cuantifica, mediante la suma de

pixeles del área ocupada por estos tonos de color, correspondientes a las reservas

energéticas de los ovocitos. Las áreas de cada ovocito ocupadas por píxeles azul

oscuro-negro (triglicéridos) y magenta (carbohidratos neutros) quedaron registradas

en una hoja de cálculo en Excel, para llevar a cabo la posterior estimación de los

índices lipídico (IL) y de carbohidratos (ICB) mediante las siguientes formulas:

6.6.2.1 Índice Lipídico (IL)

El índice lipídico (IL) se calculó dividiendo la sumatoria de las áreas ocupadas

por los gránulos de lípidos (triglicéridos) entre la superficie total del ovoplasma

(Rodríguez-Jaramillo, 2004; Rodríguez-Jaramillo et al., 2008), expresada en

porcentaje:

20

IL =Área de cobertura de lípidos

Área del ovoplasma X 100

6.6.2.2. Índice de Carbohidratos (ICH)

El índice de carbohidratos (ICH) se calculó dividiendo la sumatoria de las

áreas ocupadas por los carbohidratos (glicoconjugados neutros) entre la superficie

total del ovoplasma (Rodríguez-Jaramillo, 2004; Rodríguez-Jaramillo et al., 2008),

expresada en porcentaje:

ICH =Área de cobertura de carbohidratos

Área del ovoplasma X 100

6.7. Obtención de datos de variables ambientales (temperatura superficial y

clorofila a)

La información correspondiente a las variables fisicoquímicas en elsitiode

estudio fue obtenida a partir del sensor remoto satelital NOAAPOESAVHRR para la

temperatura superficial, y del sensor remoto AquaMODIS para la medición de la

concentración de clorofila-a de la Bahía de La Paz. Los datos de ambas variables

oceanográficas fueron extraídos de una base de datos del servidor BloomWatch de

la NOAA empleando para ello un código de programación en el software matemático

MATLAB® con resolución de 5x7km para el periodo comprendido entre los meses de

enero de 2013 a enero de 2014, La información obtenida fue ordenada en una base

de datos y procesada con el paquete estadístico Excel® para su análisis e

interpretación.

6.8. Análisis estadístico de datos

Los valores obtenidos de las variables morfométricas del mejillón M. capax

durante un ciclo reproductivo anual (longitud de la concha, peso de la carne y peso

total con concha), índice de condición (IC), área de cobertura gonádica (ACG) y área

de cobertura de tejidos somáticos (ACS), así como de todos los indicadores de la

calidad ovocitaria (DT, AT, relación N/C, IR, IL e ICH) fueron revisados y analizados

21

con el paquete estadístico STATISTICA® (versión 8.0 StatSoft Inc.). Se aplicaron las

pruebas a priori Kolmogorov-Smirnoff para determinar la existencia de normalidad, y

de Levene para homocedasticidad de los datos (Zar 1999). Posteriormente se

aplicaron análisis de varianza unifactoriales (Zar 1999), utilizando como factores

cada mes de muestreo respecto a las variables morfométricas (longitud de la concha,

peso de la carne y peso total con concha), el mes de muestreo y el estadio de

desarrollo ovárico respecto al ACG y ACS, y cada mes de muestreo, los estadios de

desarrollo ovárico y las categorías de tipo de ovocito respecto a los indicadores de

calidad ovocitaria evaluados (DT, DM, AT, relación N/C, IR, IL e ICH). El nivel de

significancia estadística fue establecido en α=0.05.

Los valores expresados en porcentaje fueron transformados a arco-seno

(arco-seno√𝑃) a fin de normalizar los datos y realizar los análisis estadísticos

correspondientes (Zar, 1993).

Cuando se encontraron diferencias significativas en las variables

morfométricas, índices de condición e indicadores de la calidad de los ovocitos, se

realizaron pruebas a posteriori de comparación de medias de Tukey (α=0.05) (Day y

Quinn, 1989) para grupos homogéneos.

22

7. RESULTADOS

7.1. Muestreos y rangos de talla-peso de organismos

Para realizar la presente investigación se colectaron 300 organismos en total,

en la zona oriental de la Bahía de La Paz, B.C.S. durante los meses de febrero,

marzo, abril, mayo, julio, agosto, septiembre, octubre y noviembre de 2013 y enero

de 2014. El intervalo de tallas (longitud de la concha) obtenido durante la colecta

anual de M. capax fue de 5.5 a 9.9 cm, con un promedio de 7.7±0.05 cm.

La talla (longitud) y el peso promedio total (con concha y sin concha) de los

organismos colectados en febrero al inicio de la presente investigación fue de

7.51±0.13cm, 35.04±2.15g y 10.48±0.59g, respectivamente. En marzo se observó un

decremento brusco en las tres variables pero durante los diez meses siguientes se

observaron incrementos y decrementos paulatinos tanto en talla como en peso de los

organismos. El máximo significativo de la longitud de la concha de los mejillones se

registró en el mes de octubre, con un promedio de 7.93±0.18cm y el mínimo se

observó en marzo con un valor promedio de 7.15±0.1cm. Mientras que el peso de la

carne alcanzó su máximo significativo en el mes de julio, con un promedio de

16.96±0.94g, y el mínimo en enero (8.90±0.45g); En el último mes de muestreo

(enero) se registraron valores promedio de 3.73±0.096, 2.29±0.1 y 2.09±0.064cm de

longitud, ancho y alto de la concha respectivamente, mientras que, el peso total se

disminuyó significativamente a un valor aproximado de 2.80±0.1g (Fig. 4).

23

Figura 4. Variación en talla y peso para Modiolus capax (media±error estándar). Los datos fueron analizados usando el mes como factor, y la longitud (F9, 290=2.6702; P=0.00543); peso total fresco con concha (F9,920=5.7144; P<0.0001) y peso de la carne (F9,920=17.552, P<0.0001) como variables dependientes en un ANOVA unifactorial. El asterisco es el post hoc e indica diferencias estadísticamente significativas (n=300).

7.2. Estimación de índices morfofisiológicos

7.2.1. Índice de Condición (IC)

El índice de condición de M. capax (Fig. 5) presentó importantes variaciones durante

el ciclo anual que se describe, fluctuando entre 16.98 y 91.40 %, con un promedio

anual de 39.72±0.83%. El análisis de varianza unifactorial aplicado a los datos del IC

indicó que existen diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) entre los

meses de muestreo, conformándose cuatro grupos homogéneos. El valor promedio

mínimo del IC se registró durante los meses de febrero, agosto, septiembre, octubre,

noviembre y enero forman el grupo, correspondiendo el valor mínimo al mes de

enero (29±0.64%). Por otro lado, durante el periodo febrero-julio se observó una

tendencia creciente en el IC, con el valor promedio significativamente más alto en

julio (65±2.10%).

24

Figura 5. Variación del índice morfofisiológico de condición (IC; F9,290=133.72, P<0.0001) de Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el mes como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (n=300).

7.2.2. Área de cobertura gonádica (ACG) y Área de cobertura de tejido somático

(ACS)

En general, el área de cobertura de la gónada (ACG) y el área de cobertura

del tejido visceral o somático (ACS) del mejillón M. capax mostraron tendencias

inversamente proporcionales, ya sea discriminando por sexo (machos o hembras),

por mes o por estadio de desarrollo gonádico.

Las variaciones en el ACG respecto al ACS durante el estudio variaron

significativamente a lo largo de los meses (ACG, 37.61±1.73%, F9,241=30.908,

P<0.05; ACS, 62.39±1.73%, F9,241=30.908, P<0.05), como se aprecia en la Figura 6.

Se observan cambios en ambos indicadores de condición morfofisiológica de los

organismos, comenzando por el ACG que presentó valores mínimos al inicio y al final

del ciclo reproductivo en los meses de febrero y enero (10.47±2.53% y 8.81±3.41%,

respectivamente), seguidos de un paulatino aumento hasta alcanzar un máximo

significativo (P<0.05) en los meses de mayo y julio (71.9±1.94% y 69.16±2.92%,

respectivamente), un nuevo descenso en los meses de agosto y septiembre y un

25

último incremento en el mes de octubre (36.21±4.26%, respectivamente). Por otro

lado, el ACS muestra un patrón de variación temporal inverso al del ACG (Fig. 6). Los

valores máximos del ACS se observaron durante los meses de enero (91.19±3.41%)

y febrero (89.53±2.53%), seguidos de un progresivo descenso durante los meses de

abril y mayo hasta alcanzar los mínimos significativos (P<0.05) en los meses de

mayo y julio (28.12±1.94% y 30.84±2.92%, respectivamente), es a partir de este

lapso en el que se observa una continua recuperación en el ACS hasta el mes de

octubre en el que se observó un ligero decremento (63.79±4.26%) para continuar a

partir del mes de noviembre con tendencia a incrementarse (Fig. 6).

Figura 6. Área de cobertura de la gónada (ACG; F9,241=30.908, P<0.0001, n=251) vs Área de cobertura del tejido somático (ACS; F9,241=30.908, P<0.0001, n=251) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el mes como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

Las variaciones en el ACG de las hembras fueron significativas en relación

con el tiempo en meses (F9,107=30.274, P<0.05) y además, se observó un

comportamiento opuesto al del ACS (F9,107=30.277, P<0.05) a lo largo del estudio

(Fig. 7a), en donde el ACG presenta los valores más bajos en los meses de enero

(17.39±11.34%), febrero (10.16±2.57%) y marzo (17.91±3.27%), en los meses el mes

26

de abril se observa un significativo aumento (P<0.05) hasta que el ACG alcanza sus

valores más altos en los meses de mayo y julio (71±2.23% y 74.15±2.09%,

respectivamente), luego disminuye gradualmente en los meses de agosto y

septiembre para incrementar significativamente (P<0.05) en los meses de octubre y

noviembre (60.04±6.51% y 62.63±4.61%, respectivamente). Mientras que el ACS

varia inversamente en el tiempo respecto al ACG, ya que los valores

significativamente más altos (P<0.05) de este indicador se observan en los meses de

enero (82.61±11.34%), febrero (89.84±2.57%) y marzo (82.1±3.27%), disminuyen

continua y significativamente (P<0.05) en el mes de abril hasta llegar a los valores

más bajos de ACS en los meses de mayo y julio (29±2.23% y 25.85±2.1%,

respectivamente), posteriormente aumentan en agosto y septiembre, y disminuyen

nuevamente en octubre y noviembre hasta valores de 39.96± 6.5% y 37.36± 4.61%,

respectivamente (Fig. 7a).

La variación del ACG (F4,112=43.394, P<0.05) respecto a la del ACS

(F4,112=43.397, P<0.05) empleando como factor de análisis el estadio de desarrollo

ovárico también muestra un patrón inverso (Fig. 7b). En dicho análisis se puede

observar que el ACG tiene un valor significativamente mínimo (9.16±4.05%; P<0.05)

en el estadio posterior al desove (EV), este incrementa constantemente en el estadio

previtelogénico (EI) y vitelogénico (EII) hasta que alcanza un valor significativamente

más alto (P<0.05) en el estadio posvitelogénico de máxima madurez (EIII,

64.13±2.39%), posteriormente el ACG promedio disminuye en el estadio

correspondiente a los desoves parciales (EIV) a un valor promedio de 56.5±3.02%.

Por otro lado, el ACS tiene sus máximos en los estadios de mínima actividad

reproductiva (EI y EV) con valores estimados en 80.47±4.05% y 90.84±3.72%,

respectivamente, dichos valores disminuyen significativamente (ANOVA, P<0.05) al

aumentar la maduración gonadal en el EII (66.01±2.89%) y llegan valores promedio

significativamente menores (ANOVA, P<0.05) estimados en 35.87±2.4% en el EIII

posvitelogénico de máxima madurez ovárica (Fig. 7b).

27

Figura 7. Área de cobertura de la gónada (ACG) vs Área de cobertura del tejido somático (ACS) de las hembras del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La

Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (ACG: F9,107=30.274, P<0.0001, n=127; ACS: F9,107=30.277, P<0.0001, n=127) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (ACG: F4,112=43.394, P<0.0001, n=117; ACS: F4,112=43.397, P<0.0001, n=117) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

28

El patrón de variación mensual del ACG (F9,114=18.977, P<0.0001) y ACS

(F9,114=18.976, P<0.0001) de los machos del mejillón M. capax es muy similar al que

se observó en las hembras en un análisis similar, ya que en la Figura 8a se puede

observar que los valores de ACG mínimos para los machos en el presente estudio se

presentaron en los meses de noviembre (12.23±2.62%), enero (6.47±3.11%) y

febrero (12.87±6.45%), dichos valores aumentan progresivamente en los meses de

marzo y abril hasta que llegan a máximos significativos (P<0.05)en los meses de

mayo y julio (73.62±3.87% y 64.94±4.88%, respectivamente), luego decrecen

continua y pronunciadamente hasta que se observó un pequeño aumento en el mes

de octubre a un valor promedio de 24.92±2.78%. Mientras que el ACS refleja

máximos significativos en noviembre (87.77±2.62%), enero (93.53±3.11%) y febrero

(87.13±6.45%), estos valores disminuyen entre marzo y abril hasta los mínimos en

los meses de mayo y julio con valores promedio que van del 26.37±3.87% al

35.1±4.88%, respectivamente; posteriormente aumentan de manera continua entre

agosto y septiembre y disminuyen ligeramente en octubre a un valor promedio de

75.1±2.78% (Fig. 8a).

Los cambios del ACG (F4,100=27.458, P<0.0001) y del ACS (F4,100=27.458,

P<0.0001) en relación con el estadio de desarrollo gonádico de los machos

presentaron diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) y se describen en la

Fig. 8b. Se aprecia un patrón de variación inverso entre el ACG y el ACS similar al

que se observó en las hembras, ya que el valor significativamente más bajo (P<0.05)

del ACG (15.2±6.63%) se observa en el estadio posdesove (EV), el ACG

incrementa progresivamente al iniciarse la gametogénesis en el EI

(espermatogénesis temprana) y el EII (espermatogénesis avanzada) e incrementa

repentinamente hasta alcanzar el valor significativamente más alto (P<0.05) de

aproximadamente 68.68±3.54% en el estadio de máxima madurez testicular (EIII,

espermogénesis), posteriormente el ACG disminuye significativamente (P<0.05) en el

estadio de desoves parciales (EIV) a un valor de 30.38±3%. Mientras que el ACS se

comportó de manera totalmente inversa al ACG por estadio de desarrollo gonádico,

ya que fue en el EIII en el que se observó el valor promedio significativamente más

bajo estimado en 31.32±3.54%, y fue en los estadios de baja actividad gametogénica

29

(EV y EI) en los que se obtuvieron los valores promedio significativamente más altos,

calculados en 84.8±6.63% y 75.82±3.84%, respectivamente (Fig. 8b).

Figura 8. Área de cobertura de la gónada (ACG) vs Área de cobertura del tejido somático (ACS) de los machos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La

Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (ACG: F9,114=18.977, P<0.0001, n=124; ACS: F9,114=18.976, P<0.0001, n=124) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (ACG: F4,100=27.458, P<0.0001, n=105; ACS: F4,100=27.458, P<0.0001, n=105) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

30

7.3. Ciclo reproductivo y desarrollo gonádico

7.3.1. Descripción de estadios de desarrollo gonádico

La descripción de los diferentes estadios de desarrollo gonádico para hembras

(Tabla I) y machos (Tabla II) del mejillón M. capax esta basada en la clasificación de

desarrollo gonádico propuesta por Rodríguez-Jaramillo et al. (2008), se describe a

continuación. Además, se presentan microfotografías de cada estadio de desarrollo

de la gónada para hembras (Fig. 9) y para machos (Fig. 10).

Tabla I. Descripción de los estadios de desarrollo gonádico en las hembras de M. capax

Estadio de desarrollo

Cortes en Parafina (H&E) 20X Referencias

Estadio 0 (indiferenciado)

Se observan nidos de ovogonias, sobre todo cerca de los epitelios de los folículos ováricos que se encuentran rodeados por tejido conjuntivo. Esta fase puede representar un periodo de recuperación con algunos folículos destruidos y/o en reabsorción. La mayor parte del tejido que se observa en esta fase es conjuntivo laxo.

Equivalente al Estadio 0 (Ochoa-Báez, 1987); Fase 1 (Hinzmann et al.

2013).

Estadio I (Previtelogénesis)

Folículos alargados, los túbulos gonadales están rodeados de abundante tejido conjuntivo. Las ovogonias son redondas (6.2±0.82µm de diámetro). Los Ovocitos previtelogénicos (37.59±0.78µm de diámetro) tienen escaso citoplasma basófilo. Es común encontrar algunos ovocitos vitelogénicos en esta fase.

Equivalente al Estadio I (Ochoa-Báez, 1987);

Fase 2 (Hinzmann et al. 2013).

Estadio II Vitelogénesis

Los folículos ováricos son grandes y están llenos de ovocitos vitelogénicos (41.93±0.51µm de diámetro) poligonales o pedunculados adosados a los epitelios de los folículos, presentan citoplasma acidófilo; algunos ovocitos previtelogénicos todavía se pueden encontrar en este estadio de desarrollo.

Equivalente al Estadio II (Ochoa-Báez, 1987); Fase 2 (Hinzmann et al.

2013).

Estadio III Posvitelogénesis

Los folículos ováricos están llenos de ovocitos posvitelogénicos que ya no están unidos a los epitelios de los folículos y la mayoría son de tamaño homogéneo (44.1±0.26µm de diámetro); presentan morfologías ligeramente poligonales o redondas; tienen un citoplasma acidófilo. Algunos ovocitos vitelogénicos y

Equivalente al Estadio III y IV (Ochoa-Báez,

1987); Fase 3 y 4 (Hinzmann et al. 2013).

31

previtelogénicos que siguen adheridos a las paredes folículos pueden están presentes aún. Hay una reducción considerable del tejido conjuntivo que rodea los folículos.

Estadio IV Desove parcial

El desove puede ser parcial o total, con espacios en los folículos ováricos que dejan los ovocitos maduros desovados. Ovocitos previtelogénicos y vitelogénicos pueden encontrarse asociados a los epitelios de los folículos y hay abundantes hemocitos. Se puede observar el epitelio ciliado en los conductos de desove con algunos ovocitos postvitelogénicos y en degeneración (sobremadurados y atrésicos). El área ocupada por la gónada es generalmente más pequeña en comparación con la fase inicial. Es común encontrar algunos ovocitos posvitelogénicos residuales y/o en degeneración, separados de la pared del folículo que no fueron liberados.

Equivalente al Estadio IV, V y VI (Ochoa-Báez,

1987); Fase 5 (Hinzmann et al. 2013).

Estadio V Posdesove

Folículos ováricos vacíos con muy pocos o nulos ovocitos residuales, el tejido conjuntivo que rodea a los acinos es escaso y se observa una importante infiltración hemocitica.

Equivalente al Estadio VI (Ochoa-Báez, 1987); Fase 5 (Hinzmann et al.

2013).

32

Tabla II. Descripción de los estadios de desarrollo gonádico en los machos de M. capax

Estadio de desarrollo

Cortes en Parafina-H&E-20X Referencias

Estadio 0 (indiferenciado)

Se observan espermatogonias, sobre todo cerca de los epitelos de los acinos testiculares que se encuentran rodeados por tejido conjuntivo. Esta fase puede representar un periodo de recuperación con algunos folículos destruidos y/o en reabsorción. La mayor parte del tejido que se observa en esta fase es conjuntivo laxo.

Equivalente al Estadio 0 (Ochoa-Báez, 1987); Fase 1 (Hinzmann et al.

2013).

Estadio I (Espermatogénesis

temprana)

Las espermatogonias están fijas a las paredes epiteliales de los acinos del testículo. El tejido conjuntivo es abundante. Los espermatocitos se distribuyen en un patrón concéntrico de las paredes acino al lumen.

Equivalente al Estadio I (Ochoa-Báez, 1987); Fase 1 y 2 (Hinzmann

et al. 2013).

Estadio II (Espermatogénesis

avanzada)

Los acinos testiculares están llenos de todas las categorías de células sexuales incluyendo espermatozoos. El tejido conjuntivo se reduce respecto al estadio anterior.

Equivalente al Estadio II (Ochoa-Báez, 1987); Fase 2 y 3 (Hinzmann

et al. 2013).

Estadio III (Madurez)

Los acinos testiculares son más grandes y llenos de espermatozoos con las caudas orientadas hacia el lumen. Algunos espermatocitos todavía se pueden observar. Los acinos están rodeados por tejido conjuntivo que se reduce y los acinos se unen.

Equivalente al Estadio III y IV (Ochoa-Báez,

1987); Fase 3 y 4 (Hinzmann et al. 2013).

Estadio IV Desove parcial

Se pueden observar los acinos interconectados llenos de espermatozoos siendo liberados al gonoducto. Los espermatozoides residuales se pueden observar en el lumen de los acinos vacíos que también tienen abundantes hemocitos.

Equivalente al Estadio IV, V, VI y VII (Ochoa-Báez, 1987); Fase 5

(Hinzmann et al. 2013).

Estadio V Posdesove

Acinos testiculares vacíos con muy pocos o nulos espermatozoos residuales, el tejido conjuntivo que rodea a los acinos es escaso y se observa una importante infiltración hemocitica.

Equivalente al Estadio VI y VII (Ochoa-Báez,

1987); Fase 5 (Hinzmann et al. 2013).

33

Figura 9. Estadios de desarrollo gonádico en hembras de mejillón Modiolus capax descritos

en este estudio durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. E0. Indiferenciado, EI. Previtelogénesis, EII. Vitelogénesis, EIII. Posvitelogénesis, EIV. Desove parcial, EV. Posdesove, descritos en este estudio. tc, tejido conjuntivo; fl, folículos ováricos; td, tubo digestivo; cg y ovg, ovogonias; gd, gonoducto; op, ovocitos previtelogénicos; ov, ovocitos vitelogénicos; opv, ovocitos posvitelogénicos; oat, ovocitos atrésicos; n, núcleo; nu, núcleolo; clf, células foliculares; ovp, ovoplásma; np, nucleoplasma; he, hemocitos. Tinción Hematoxilina-Eosina (H&E) (10X Barra=60µm; 20X Barra=100µm y 100X Barra=10µm).

34

Figura 10. Estadios de desarrollo gonádico en machos de mejillón Modiolus capax descritos

en este estudio durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. E0. Indiferenciado, EI. Espermatogénesis temprana, EII. Espermatogénesis avanzada, EIII. Espermiogénesis, EIV. Desove parcial, EV. Posdesove. tc, tejido conjuntivo; cfl, células foliculares; eg, espermatogonias; a, acinos testiculares; spz, espermatozoos; spd, espermátidas; gd, gonoducto; he, hemocitos. Tinción Hematoxilina-Eosina (H&E) (10X Barra=60µm; 20X Barra=100µm y 100X Barra=10µm).

35

7.3.2. Frecuencias de estadios de desarrollo gonádico

Durante el ciclo reproductivo anual del mejillón, los máximos estadios de

madurez gonádica de las hembras (posvitelogénesis) se observaron en abril, mayo,

julio y agosto, registrando la máxima frecuencia de hembras previtelogénicas en julio

con un promedio de 84.62%, seguido de un 75% en abril y agosto (con un promedio

de 57.16%). Se encontró la presencia de hembras en previtelogénesis y

vitelogénesis en cinco (febrero, marzo, agosto, septiembre y octubre) de los diez

meses de muestreo que contempló la presente investigación, encontrando la mayor

proporción de hembras previtelogénicas en febrero (26.92%) y vitelogénicas en

septiembre con un promedio de 35.29%. La mayor proporción de hembras en desove

parcial se registró en los meses de octubre y noviembre (con promedios de 75 % y

70.59 % respectivamente) seguido del primer evento importante de desove parcial en

septiembre (64.71%), sin embargo, se encontraron hembras en desove parcial en

menores proporciones los meses de marzo, abril, mayo, julio y agosto. Durante los

meses de febrero y abril se observaron las mayores proporciones de hembras en

posdesove (23.08% y 12.5% respectivamente), mientras que las mayores

proporciones de organismos sexualmente indiferenciados se encontraron en enero

con un promedio de 95.24%, y febrero (con 50% aproximadamente) indicando un

periodo de reposo reproductivo en este periodo (Fig. 11).

36

Figura 11. Frecuencia acumulada (%) de los estadios de desarrollo gonádico de las hembras de mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.

n=300.

Respecto al ciclo reproductivo de los machos del mejillón M. capax en la Bahía

de La Paz, tal y como se puede apreciar en la figura 12, se observaron las mayores

proporciones de individuos en estadios de desarrollo gonádico III (espermiogénesis)

en los meses de mayo (62.5 %), abril (62.5 %) y un máximo de madurez reproductiva

en julio, con un promedio de 81.25 %. Al igual que en el caso del ciclo reproductivo

anual de las hembras (Fig. 11) en el caso de los machos se encontraron

proporciones importantes de individuos en estadios de espermatogénesis temprana y

avanzada en todos los meses de muestreo (excepto mayo y julio que corresponden

al pico reproductivo principal), observando las mayores proporciones de machos en

espermatogénesis temprana en marzo y enero (11.11% para ambos meses) y un

52.38% en espermatogénesis avanzada en octubre. Se observó una tendencia

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

FE

B-1

3

MA

R-1

3

AB

R-1

3

MA

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3

JU

L-1

3

AG

O-1

3

SE

P-1

3

OC

T-1

3

NO

V-1

3

EN

E-1

4

Fre

cu

en

cia

de

Esta

dio

s d

e D

esa

rro

llo G

on

ad

ico

de

H

em

bra

s (

%)

Tiempo (meses)

Indiferenciado (0) Previtelogénesis (I) Vitelogénesis (II)

Posvitelogénesis (III) Desove Parcial (IV) Posdesove (V)

37

marcada a los desoves parciales en 7 de los diez meses de muestreo comenzando

en abril y terminando en noviembre, siendo este último el mes con más desoves

parciales para los machos en la Bahía de La Paz con un 56.25% aprox. Los machos

en estadio posdesove fueron más abundantes en abril (12.5%), mientras que los

individuos sexualmente indiferenciados mostraron mayores proporciones en los

meses de enero (74.07%), febrero con un máximo de 76.47%, marzo (44.45 %) y

noviembre (con 31.25 %) indicando un periodo de reposo reproductivo durante estos

cuatro meses (Fig. 12).

Figura 12. Frecuencia acumulada (%) de los estadios de desarrollo gonádico de los machos de mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.

0

10

20

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100

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L-1

3

AG

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3

SE

P-1

3

OC

T-1

3

NO

V-1

3

EN

E-1

4

Fre

cu

en

cia

de

Esta

dio

s d

e D

esa

rro

llo G

on

ad

ico

en

Ma

ch

os (

%)

Tiempo (meses)

Indiferenciado (0) Espermatogénesis temprana (I)

Espermatogénesis Avanzada (II) Espermiogénesis (III)

Desove Parcial (IV) Posdesove (V)

38

7.3.3. Proporción de sexos

Respecto a la proporción de sexos (M:H) del mejillón M. capax (Fig. 13), esta

fue dominada por los machos durante todo el ciclo reproductivo (1: 0.88). Contrario a

lo que se esperaba, la proporción de machos superó la de las hembras durante los

meses de máxima actividad reproductiva, ya que durante julio y agosto (máxima

madurez gonádica de las hembras; Fig. 11) la proporción M:H fue de 1:0.81 y 1:0.37,

respectivamente. Mientras que en los meses de abril, mayo y septiembre (con

elevada actividad reproductiva) la proporción de hembras fue mayor que la de los

machos con el 53.33%, 60% y 62.96%, respectivamente. El mes de septiembre fue

en el que se registró la mayor proporción de hembras con un 62.96%, mientras que

la menor proporción se observó en el muestreo correspondiente a enero (con un

3.57%). Por otra parte, los machos mostraron mayores abundancias en agosto, con

un 73.08%, mientras que su mínimo se estimó en un 13.33% en febrero. La mayor

proporción de individuos sexualmente indiferenciados se encontró en enero, con un

71.43%, seguido de un 43.33% en febrero (Fig. 13), lo cual, coincide con los periodos

durante los cuales las gónadas se encuentran en reposo y reabsorción posdesove

(Fig. 12).

Figura 13. Proporción sexual (%) del mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual

en la Bahía de La Paz, B.C.S. n=300.

0

10

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Pro

po

rció

n d

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exo

s (

%)

Tiempo (meses)

Hembras Machos Indiferenciados

39

7.3.4. Frecuencia de categorías de desarrollo ovocitario

La frecuencia de las categorías de desarrollo ovocitarias (Fig. 14) obtenidas

durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. muestran que la

proporción de estadios de maduración tempranos (ovogonias) fue relativamente

elevada durante el primer mes de muestreo (febrero) con 176 células por unidad de

área, mientras que el resto de los meses de muestreo la cantidad de ovogonias y

ovocitos previtelogénicos fue mínima (menos de 34 y 32 células/ área,

respectivamente). Por otro lado, las máximas frecuencias de ovocitos vitelogénicos

se registraron durante los meses de abril, julio, agosto (máximo con 230 ovocitos

vitelogénicos/ área) y noviembre, sin embargo, la presencia constante de ovocitos en

esta categoría de desarrollo durante el resto de los meses muestreados proporciona

evidencias de que el mejillón M. capax se encuentra listo para reproducirse y

madurar gametos femeninos durante todo el año (a excepción de los meses de enero

y febrero, donde solo se observó la presencia de ovocitos atrésicos en reabsorción y

ovogonias, respectivamente). En el mes de julio se cuantificó la mayor cantidad de

ovocitos maduros posvitelogénicos (247 ovocitos/ área), seguido del mes de abril con

233 ovocitos/ área y de mayo (173 ovocitos/ área), mismos resultados que coinciden

con los estadios de máxima madurez gonádica de la especie durante ciclo de campo

descrito en este estudio (Fig. 11). Es importante señalar que durante todos los meses

contemplados en el ciclo reproductivo anual del mejillón se encontraron frecuencias

importantes de ovocitos atrésicos, a excepción de los meses de febrero y enero (Fig.

14) en los que las gónadas se encontraban principalmente en estadio indiferenciado

(Fig. 11), siendo el mes de noviembre en el que se registró la mayor cantidad de

ovocitos atrésicos con 112 ovocitos/ área, seguido por los meses de julio (76 células/

área), agosto (con 64 ovocitos atrésicos/ área) y septiembre con 61 ovocitos

atrésicos/área, sin embargo, la frecuencia de ovocitos dañados por atresias se

mantuvo por arriba de los 38 ovocitos/ área durante el resto del ciclo reproductivo

(Fig.14).

40

Figura 14. Número total de ovocitos por hembra (a 10X) del mejillón Modiolus capax

distribuidos en cada uno de los estadios de desarrollo ovárico en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.

7.3.5. Atresia y degeneración ovocitaria

Mediante el análisis histológico de las muestras de ovarios de mejillón a lo largo

del ciclo anual que comprende el presente estudio se observó un importante proceso

de atresia ovocitaria en los folículos ováricos de las gónadas femeninas,

principalmente durante el proceso de gametogénesis avanzada de M. capax en

donde se observa que la mayoría de los ovocitos vitelogénicos y postvitelogénicos

del ovario sufren el fenómeno de “lisis o degeneración ovocitaria” entrando en una

fase de muerte y reabsorción celular en las fases terminales de la vitelogénesis y que

se caracteriza por que los gametos femeninos pierden las propiedades basófilas del

núcleo, la disminución de la densidad del citoplasma y la deformación periférica

poliédrica de las células configurando la apariencia característica de una pieza de

rompecabezas, además de la importante producción de mucinas ácidas en la

periferia de los ovocitos, la abundante cantidad de material citoplásmico disperso en

el lumen de los folículos ováricos (Fig. 15).

0

100

200

300

400

500

FE

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3

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Nú

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cito

s/ á

rea

Tiempo (meses)

Ovocitos atrésicos

Ovocitos posvitelogénicos

Ovocitos vitelogénicos

Ovocitos previtelogénicos

Ovogonias

41

Figura 15. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas (ovarios) del mejillón Modiolus capax que muestran el fenómeno de atresia y degeneración ovocitaria.

Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos posvitelogénicos (opv), ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo (tc), núcleo (n), núcleolo (nu), carbohidratos ácidos (cha), material citoplásmico (mc). Tinción Azul Alciano-PAS (AAPAS) (20X Barra=100µm).

7.4. Análisis histológicos cuantitativos

7.4.1. Indicadores morfométricos de calidad ovocitaria

En total se emplearon 1,500 ovocitos para llevar a cabo los análisis y la

estimación de los parámetros morfométricos de calidad ovocitaria del mejillón M.

capax durante el ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz.

Los análisis morfométricos de calidad ovocitaria (área de ovocitos y sus

núcleos, DT, DM, relación N/C e IR) se llevaron a cabo discriminando por mes,

estadio de desarrollo ovárico y tipo de ovocito, considerando para este último tres

categorías de madurez de ovocito (vitelogénicos, posvitelogénicos y atrésicos).

42

7.4.1.1. Área de los ovocitos y sus núcleos

En la Fig. 16 se muestra la evolución durante un ciclo anual del área de los

ovocitos y sus respectivos núcleos en función del mes (a) y del estadio de desarrollo

gonádico (b). Se puede observar que ambas variables morfométricas se comportan

de manera similar en función del tiempo durante el ciclo anual (Fig. 16a), ya que

tanto el área del núcleo como el área del ovocito tienen mínimos significativos al en

el mes de enero (55.17±10.48 µm2 y 431.19±15.76µm2 respectivamente) y con forme

avanza el tiempo el área de ambos incrementa hasta alcanzar un máximo

significativo en el mes de julio que corresponde a un área promedio de

648.238.46µm2 para el núcleo y de 1597.54±25.73 µm2 para los ovocitos completos,

a partir de este máximo se observa una tendencia paulatina al decremento (a

excepción del incremento en el área de los ovocitos que se observa en el mes de

noviembre) hasta llegar al fin del ciclo reproductivo en los meses de enero y febrero.

Mientras que el análisis del área de los ovocitos y sus núcleos por estadio de

desarrollo ovárico (Fig. 16b) muestra que ambas variables morfométricas muestran

tendencias similares conforme avanza la madurez de la gónada. Tanto el área del

núcleo como el área del ovocito tienen mínimos significativos al en el estadio de

madurez I (126.44±9.42µm2 y 357.62±25.63µm2 respectivamente) aumentando

significativamente el área de ambos en el estadio II hasta alcanzar un máximo

significativo en el estadio posvitelogénico (E III) que corresponde a un área promedio

de 610.57±6.50µm2 para el núcleo y de 1558.24±17.56µm2 para los ovocitos, a partir

de este máximo se observa una tendencia paulatina al decremento (a excepción del

incremento en el área de los ovocitos que se observa en el estadio V) hasta llegar al

último estadio de desarrollo gonádico. El área promedio de los ovocitos durante el

desarrollo de la gónada que reporta en el presente estudio fue de

1,447.48±12.14µm2 y el de los núcleos en 563.94±5.21µm2 (Fig.16).

43

Figura 16. Área de los ovocitos y de los núcleos (µm2) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (área ovocitos: F9,1401=28.302, P<0.0001, n=1410; área núcleos: F9,1401=17.244, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (área ovocitos: F4,1406=56.240, P<0.0001, n=1410; área núcleos: F4,1406=53.485, P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas n=1,410.

44

La evolución del área de los ovocitos y los núcleos del mejillón M. capax por

categoría ovocitaria de madurez (Fig. 17). Se puede observar que el tamaño de los

ovocitos no muestra diferencias estadísticamente significativas (P>0.05) entre

categoría de madurez. Adicionalmente, en el análisis que se muestra en la Fig. 17,

se puede apreciar que el área de los núcleos aumenta ligeramente al madurar de

ovocitos vitelogénicos (146.46±6.36µm2) a posvitelogénicos (150.04±6.006µm2) y

que disminuye significativamente (P>0.05) cuando los ovocitos se degeneran, siendo

los núcleos de los ovocitos atrésicos los que muestran valores de área de núcleo

significativamente menores (11.15±6.59µm2) respecto a las otras dos categorías de

madurez ovocitaria (Fig. 17).

Figura 17. Área de los ovocitos (F2,86=0.40962, P=0.66519, n=89) y de los núcleos (F2,86=8.1449, P=0.00058, n=89) (µm2) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

45

7.4.1.2. Diámetro teórico (DT) y máximo (DM) de los ovocitos

Los resultados del cálculo del diámetro teórico de (DT) de los ovocitos durante

el ciclo reproductivo de M. capax se muestran en la Fig. 18. Los resultados del

cálculo del diámetro teórico (DT) y diámetro máximo (DM) de los ovocitos por mes

durante el ciclo reproductivo de M. capax se muestran en la Fig. 18a. Se puede

observar como las máximas tallas de los ovocitos medidas en DT coinciden con el

periodo de máxima madurez gonádica de los mejillones (abril, mayo, julio y agosto)

alcanzando un máximo DT de 44.82±0.35µm en el mes de mayo y un máximo DM

con un valor de 72.66±1.72µm en julio con diferencias estadísticamente

significativas (P<0.05) entre los meses que comprende el análisis; al igual que en el

caso del área (Fig. 16a), el DT de los ovocitos comienza a decrecer a partir del mes

de mayo (con un significativo incremento en el mes de noviembre) hasta su mínimo

DT en enero (24.43±0.43µm) para reanudar su tendencia a incrementar a partir del

mes de febrero. Sin embargo, los resultados a partir de los análisis del DM por mes

durante el ciclo reproductivo anual muestran una tendencia distinta y más clara que

los del DT de los ovocitos del mejillón, ya que en la Fig. 18a se puede observar que

valores del DM más altos (72.66±1.72µm, 63.67±1.68µm y 63.65±1.82µm)

correspondientes a los meses de julio, agosto y abril (respectivamente) coinciden con

los meses en los que se presentó la máxima actividad reproductiva con la mayor

proporción de hembras en estadios de madurez ovárica avanzados y la mayor

cantidad de ovocitos maduros por unidad de área (Fig. 11 y 14) mientras que los

valores de DM más bajos (23.855±0.43µm, 50.16±2.211µm y 54.23±3.15µm)

correspondientes a los meses de enero, febrero y marzo (respectivamente) coinciden

con los periodos en los que se observaron las mayores proporciones de gónadas en

reposo y organismos en estadios posteriores al desove (Fig. 18a).

Con base en el análisis por estadio de desarrollo ovárico (Fig. 18b) se puede

observar como las máximas tallas de los ovocitos coinciden con el estadio de

máxima madurez gonádica de los mejillones (E III) alcanzando un máximo DT de

44.1±0.26µm; al igual que en el caso del área (Fig. 16b), la talla de los ovocitos

comienza a decrecer a partir del estadio III (con un incremento no significativo en el

estadio posdesove; V) observando el DT mínimo en el estadio de desarrollo I

46

(20.95±0.82µm). Mientras que los valores de las máximas tallas de los ovocitos por

estadio de desarrollo de la gónada (DM; Fig. 18b) mostraron que, al igual que el DT,

la talla significativamente más alta de los ovocitos (72.7±0.26µm) se presenta

durante el estadio de madurez (E III) y que no hay diferencias significativas (P>0.05)

entre los valores de DM de los ovocitos de los estadios de vitelogénesis (E II) y de

desove parcial (E IV). El DM de los ovocitos disminuye significativamente durante el

estadio de desarrollo V (53.54±1.17µm), sin embargo, el valor de DM más bajo del

análisis (28.9±0.82µm) se observó durante el estadio I de previtelogénesis de los

ovocitos (Fig. 18b).

El DT promedio de los ovocitos durante el ciclo reproductivo anual se estimó

en 42.31±0.19µm y el DM promedio en 51.81±0.96µm, con diferencias

estadísticamente significativas (P<0.05) entre los meses de muestreo y los estadios

de desarrollo ovárico (Fig. 18).

47

Figura 18. Diámetro teórico y máximo de los ovocitos (µm) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (Diámetro teórico: F9,1401=31.477, P<0.0001, n=1410; Diámetro máximo: F9,58=90.4020, P<0.0001, n=68) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (Diámetro teórico: F4,1406=81.876, P<0.0001, n=1410; Diámetro máximo: F4,46=12.027, P<0.0001, n=51) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

48

Los resultados del cálculo del diámetro teórico (DT) y máximo (DM) por tipo de

ovocito se muestran en la Fig. 19. Se puede observar que no hay diferencias

significativas (P>0.05) entre los valores del DT de los tres estadios de madurez

ovocitario considerados en el análisis, siendo los ovocitos vitelogénicos los que

mostraron un DT ligeramente mayor al de los ovocitos posvitelogénicos

(23.26±0.40µm y 23.1±0.37µm, respectivamente) mientras que el valor de DT

promedio para los ovocitos atrésicos fue el menor de todos y se estimó en un

promedio de 22.54±0.6 µm. Sin embargo, los resultados del cálculo del DM de los

ovocitos muestran una tendencia diferente a la observada para el DT, ya que, si bien,

los ovocitos vitelogénicos poseen valores promedio de DM altos (28.64±2.24µm)

estos disminuyen pronunciadamente al avanzar a la categoría de ovocitos

posvitelogénicos (26.53±2.21µm) y posteriormente aumentan de talla hasta alcanzar

un máximo significativo (30.006±2.9µm) como ovocitos atrésicos y degenerados (Fig.

19).

Figura 19. Diámetro Teórico (F2,86=0.65245, P=0.52333, n=89) y Máximo (F4,46=7.098, P<0.0194, n=51) de los ovocitos (µm) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

49

7.4.1.3. Relación núcleo/citoplasma (N/C)

Por otra parte, el promedio de la relación núcleo/ citoplasma (N/C) de los

ovocitos del mejillón durante el ciclo reproductivo anual de M. capax en la Bahía de

La Paz se estimó en 0.68±0.01 (Fig. 20).

La relación N/C es un indicador de calidad ovocitaria que muestra importantes

variaciones temporales (por mes) a lo largo del estudio. Tal y como se aprecia en la

Fig. 20a, es en el mes de enero en el que se presenta la mínima cantidad de

reservas en los ovocitos de los mejillones, con la relación N/C más baja con un valor

de 0.14±0.03, y es a partir de este mínimo que se observan aumentos y decrementos

constantes en la relación del núcleo respecto a la cantidad de citoplasma que poseen

los ovocitos a lo largo de todo el año. La mayor cantidad de reservas en los ovocitos

se observaron en el mes de octubre por el máximo y significativo aumento (P<0.05)

hasta un valor de 0.81±0.02 en la relación N/C de los ovocitos, seguido de los meses

de julio, marzo y agosto (0.745±0.01, 0.7±0.02 y 0.68±0.02 respectivamente) mismos

meses en los que también se observaron las mayores cantidades de ovocitos

vitelogénicos y posvitelogénicos (Fig. 14). Mientras que febrero y enero fueron los

meses en los que se observó la relación N/C más baja y que además coincide con el

fin del ciclo gonádico y con las mayores frecuencias de hembras en estadios de

desove parcial y posdesove (Fig. 9) además de ser los meses en los que se

cuantificaron las mayores cantidades de ovogonias y ovocitos atrésicos en

reabosrción y/o en degeneración (Fig. 14).

Sin embargo, el análisis de dicha relación por estadio de desarrollo ovárico

muestra tres principales variaciones (tres grupos homogéneos; P<0.05) a lo largo del

proceso de madurez gonadal. Tal y como se aprecia en la Fig. 20b, es en el estadio I

(previtelogénesis) es en el que se presenta la mínima cantidad de reservas en los

ovocitos de los mejillones, con una relación N/C de 0.58±0.04, y es a partir de este

mínimo que se observan aumentos progresivos durante el estadio de maduración II

hasta alcanzar un máximo en el estadio posvitelogénico (E III) con un promedio

aproximado de 0.7±0.01; posteriormente se observan decrementos constantes en la

relación del núcleo respecto a la cantidad de citoplasma que poseen los ovocitos

hasta llegar a un valor mínimo posterior al desove (E V) con un valor de 0.48±0.03.

50

La mayor cantidad de reservas en el citoplasma de los ovocitos se denota por la

presencia de un grupo homogéneo (P<0.05) con los valores más altos en los

estadios de desarrollo gonádico II, III y IV (Fig. 20b) lo cual, coincide con los periodos

de más elevada actividad reproductiva de las hembras durante el ciclo reproductivo

anual (Fig. 9).

Figura 20. Relación Núcleo/ Citoplasma de los ovocitos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (F9,1401=13.445, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (F4,1406=7.0865, P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

51

La relación núcleo/citoplasma (N/C) de los tres tipos de ovocitos mostró un

patrón diferente al que se obtuvo a partir del cálculo del resto de los indicadores

morfométricos de calidad ovocitaria (Fig. 21). Tal y como se puede apreciar, la

relación N/C promedio de los ovocitos vitelogénicos se calculó en un valor

aproximado de 0.52±0.02 y ésta aumento considerablemente en el estadio

posvitelogénico hasta alcanzar su máximo significativo calculado en 0.56±0.022. En

la Fig. 21 también se puede apreciar que la relación N/C de los ovocitos atrésicos

disminuye significativamente hasta un valor promedio de 0.44±0.03.

Figura 21. Relación Núcleo/ Citoplasma (F2,86=6.8880, P=0.00168, n=89) de los ovocitos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos

fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

52

7.4.1.4. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos y sus núcleos

El índice de redondez (IR) de los ovocitos y sus respectivos núcleos (Fig. 22)

es quizá uno de los indicadores más importante de la calidad de los ovocitos, ya que

entre más cercano a 1 sea su valor la calidad de los gametos es mayor. Sin

embargo, este índice muestra un patrón diferente al que se encontró para el resto de

las variables morfométricas empleadas para evaluar la calidad de los ovocitos en el

presente estudio, ya que, al analizar los valores del IR por mes durante el ciclo anual

se observó que son significativamente menores (P<0.05) en el mes de febrero (tanto

de los ovocitos como de los núcleos; 0.63±0.03 y 0.69±0.02, respectivamente),

posteriormente el IR aumenta de manera significativa (P<0.05) en marzo para

mantenerse relativamente constante hasta noviembre, donde muestra un

pronunciado decremento, para finalmente, incrementar hasta los máximos valores

promedio de 0.94±0.01 para los núcleos, y de 0.82±0.04 para los ovocitos (Fig. 22a).

Por otra parte, en la Fig. 22b se puede observar que los valores del IR por

estadio de desarrollo ovárico tanto de los ovocitos como de los núcleos son

significativamente bajos (P<0.05) durante los máximos estadios de desarrollo

gonádico (E II, III y IV; 0.73±0.01, 0.74±0.004 y 0.71±0.004, respectivamente),

posteriormente se observa un ligero y no significativo aumento (P>0.05) en el estadio

gonádico posterior al desove (E V). Los valores máximos promedio en el IR para los

núcleos (0.94±0.01) y para los ovocitos (0.82±0.02) se observaron durante el estadio

de desarrollo previtelogénico (E I).

Es importante denotar que los núcleos mostraron un IR promedio mayor

(0.84±0.002) que el de los ovocitos (0.73±0.003) a lo largo de todo el ciclo

reproductivo y proceso de maduración gonádica del mejillón M. capax en la Bahía de

La Paz (Fig. 22).

53

Figura 22. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos y los núcleos del mejillón Modiolus capax

(media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (IR ovocitos: F9,1401=8.3374, P<0.0001, n=1410; IR núcleos: F9,1401=18.163, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (IR ovocitos: F4,1406=11.781, P<0.0001, n=1410; IR núcleos: F4,1406=17.356, P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

54

El índice de redondez (IR) de los ovocitos y sus núcleos muestra un patrón

muy similar entre si y respecto a los resultados obtenidos del cálculo de la relación

N/C por tipo de ovocito. En la Fig. 23 se puede observar tanto el IR de los ovocitos

como de sus núcleos disminuye significativamente (0.55±0.02 y 0.74±0.02

respectivamente) cuando los ovocitos se degeneran y son atrésicos. Es importante

resaltar que el IR de los núcleos es mayor que el de los ovocitos en todas las

categorías de madurez ovocitarias consideradas para realizar dicho análisis (Fig. 23).

Figura 23. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos (F2,86=105.49, P<0.0001, n=89) y de los núcleos (F2,86=21.768, P<0.0001, n=89) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar)

en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

55

7.4.2. Indicadores histoquímicos de calidad ovocitaria

En total se emplearon 1,317 ovocitos para llevar a cabo los análisis y la estimación

de los parámetros histoquímicos de calidad ovocitaria del mejillón M. capax durante

el ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz.

7.4.2.1. Índice Lipídico (IL)

El análisis de los cortes histológicos en parafina teñidos con SN reveló la

presencia y localización de lípidos neutros en forma de triglicéridos (que se tiñeron

de azul oscuro-negro), y los fosfolípidos estructurales (de color gris). Las

microfotografías que se analizaron digitalmente correspondientes a ésta técnica

histoquímica (Fig. 24) permitieron realizar análisis cualitativos y cuantitativos, ya que,

se llevó a cabo la cuantificación de la cantidad de lípidos de reserva (triglicéridos)

discriminando por mes, estadio de desarrollo ovárico y por tipo de ovocito, además

de que se observaron las características del proceso de incorporación de reservas

lípidicas en los ovocitos de las hembras de M. capax, cuantificando además la

cantidad de lípidos presentes en la totalidad del tejido gonádico (ovocitos y tejido

conjuntivo adyacente a los folículos ováricos). En la Fig. 24 se puede apreciar de

manera cualitativa que la cantidad de triglicéridos es escasa en el tejido conjuntivo de

reserva que se encuentra entre los folículos del ovario, mientras que la cantidad de

dichos lípidos en los ovocitos es mayor, ya que se observan granulos lipídicos bien

definidos y abundantes.

56

Figura 24. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas (ovarios) del mejillón Modiolus capax. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos posvitelogénicos (opv),

ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo (tc), núcleo (n), núcleolo (nu), triglicéridos (tgl). Tinción Sudán Negro para lípidos (SN) (20X Barra=100µm).

La cuantificación del Índice Lipídico (IL) en el tejido gonádico de hembras del

mejillón M. capax por el método de área de cobertura de los lípidos neutros o de

reserva (triglicéridos) del presente trabajo se llevó a cabo discriminando por mes, por

estadio de desarrollo ovárico y por tipo de ovocito.

En la Fig. 25a se puede observar que el IL de las gónadas femeninas de los

mejillones presenta diferencias temporales (por mes) estadísticamente significativas

(F8,253=40.046, p<0.0001), siendo los meses de febrero (3.6±0.73%) y marzo

(5.22±0.93%) en los que se observaron los valores promedio significativamente más

bajos (ANOVA, P<0.05) del IL, luego dichos valores aumentan significativamente

durante el mes de abril hasta llegar a los valores de IL más altos en los meses de

mayo, julio y agosto (18.25±0.53%, 17.32±0.48% y 15.5±1.3%, respectivamente), a

57

partir de agosto se observa una tendencia a la baja del IL hasta llegar a un valor

promedio de 7.70±0.75% en el mes de octubre, mismo que incrementa ligeramente

en el mes de noviembre a un IL de 9.56±0.37%.

Mientras que para el caso de la variación del IL por estadio de desarrollo

ovárico (Fig. 25b) el análisis de varianza unifactorial aplicado a los datos indicó que

existen diferencias estadísticamente significativas (F4,256=23.792, P<0.0001) entre los

estadios de desarrollo gonádico, conformándose tres grupos homogéneos (TUKEY,

P<0.05), el primero de ellos conformado por los estadios de baja actividad

reproductiva de previtelogénesis (EI) y posdesove (EV) en los que se observaron los

valores promedio más bajos del IL con (5.64±2.11% y 4.62±0.01%, respectivamente),

el segundo correspondiente a los estadios de vitelogénesis (EII) y desove parcial

(EIV) con valores de IL de 10.75±1.06% y 11.11±0.45% respectivamente; y por

último, el grupo homogéneo en el que se alcanzó el máximo valor promedio del IL

(16.17±0.5%) correspondiente al EIII posvitelogénico y de máxima madurez sexual

de las hembras. En general el análisis del IL por estadio de desarrollo ovárico

muestra una tendencia normal, ya que se observan valores muy bajos en el primer

estadio de desarrollo, aumenta al incrementar la vitelogénesis de los ovocitos,

alcanza su máximo en el estadio de madurez optima de las hembras, disminuye

durante los desoves parciales, para, finalmente, volver a denotar valores

significativamente bajos en el estadio posterior al desove (Fig. 25b).

58

Figura 25. Indice Lipídico (IL) del ovario del mejillón M. capax (media±error estándar) en la

Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes durante un ciclo anual (F8,253=40.046, P<0.0001, n=262) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (F4,256=23.792, P<0.0001, n=261) como variables independientes en ANOVAS unifactoriales. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

59

En general, los análisis del IL por tipo de ovocito en función del tiempo (Fig.

26) muestran importantes variaciones temporales a lo largo del ciclo anual que

comprende el presente trabajo.

Por un lado en la figura 26a se puede observar que la variación mensual

durante el ciclo anual del IL en los ovocitos vitelogénicos presenta diferencias

significativas (F8,253=2.3843, P=0.01712) a lo largo del estudio, se aprecia que es en

los meses de febrero, mayo y agosto es donde se obtuvieron los IL más altos

(56.07±6.97%, 43.16±12.57% y 62.20±22.93%, respectivamente) mientras que el

resto de los meses el IL conforma un solo grupo homogéneo (TUKEY, P<0.05) cuyos

valores promedio se mantienen dentro de un rango que fluctúa entre el 27.85±3.63%

y 24.17±2.84%.

La variación del IL de los ovocitos posvitelogénicos también fue

significativamente diferente (F8,253=3.0486, P=0.00272) entre los meses que

comprende el presente estudio, en la figura 26b se puede observar que los valores

significativamente más altos (P<0.05) del IL en esta categoría de madurez ovocitaria

se presentaron en los meses de agosto y febrero con valores de 33.37±2.84%

y34.18±4.56% (respectivamente), seguidos de marzo, mayo y septiembre

(28.23±4.49%, 28.26±3.2% y 27.74±2.34%, respectivamente), mientras que los

valores significativamente menores de este indicador de calidad ovocitaria fueron de

28.22±4.49%, 21.94±2.7% y 21.94±2.5, correspondientes a los meses de marzo,

octubre y noviembre.

De las tres categorías de madurez ovocitaria en las que se estimó el IL, la de

los ovocitos atrésicos (Fig. 26c) fue la que mostro la mayor variación mensual

(F8,253=2.1731, P=0.03) en el ciclo anual que comprende la presente investigación, ya

que se observan continuos altibajos en los valores del IL entre los meses. Sin

embargo, se puede apreciar que los valores promedio significativamente más altos

(P<0.05) del IL se presentan en el mes de febrero (44.83±0.73%), mientras que los

más bajos (23.83±2.42%) se observan en el mes de noviembre. En el resto de los

meses se puede observar que las variaciones en el IL de los ovocitos atrésicos y/o

en degeneración presentan ascensos y descensos que fluctúan entre el

37.08±6.21% y el 29.23±5.16% (Fig. 26c).

60

Figura 26. Índice Lipídico (IL) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F8,253=2.3843, P=0.01712, n=262), (b) ovocitos posvitelogénicos (F8,253=3.0486, P=0.00272, n=262) y (c) ovocitos atrésicos (F8,253=2.1731, P=0.03, n=262) para el mejillón M. capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el mes durante un ciclo anual como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

61

En la figura 27 se muestra la variación del IL de cada una de las categorías

ovocitarias (ovocitos vitelogénicos, posvitelogénicos y atrésicos) en función del

estadio de desarrollo ovárico. En general se puede observar que el IL de cada uno

de los tipos de ovocitos muestra un patrón de variación atípico respecto al estadio de

madurez ovárico de las hembras.

El análisis del IL de los ovocitos vitelogénicos (Fig. 27a) presentó diferencias

significativas (F4,256=1.4531, P=0.021702) entre estadios de madurez ováricos. En el

gráfico correspondiente a dicho análisis se puede observar que en los primeros

estadios de madurez de los ovarios, previtelogénesis (EI) y vitelogénesis (EII) los

valores promedio del IL son muy similares (46.48±21.29% y 45.41±16.24%,

respectivamente) y sin diferencias significativas entre sí, posteriormente los valores

promedio del IL de los ovocitos vitelogénicos caen hasta los mínimos obtenidos que

fueron de 31.21±4.73% en el estadio posvitelogénico (EIII) de máxima madurez

ovárica, y de 27.79±2.76% en el estadio posterior al desove (EIV), el IL aumenta

significativamente (P<0.05) hasta un valor máximo de 49.79±0.07% en el estadio

posterior al desove total (EV).

El IL de los ovocitos posvitelogénicos también varía significativamente

(F4,256=3.8992, P=0.011104) al analizar los valores de este indicador usando el

estadio de desarrollo ovárico como variable independiente (Fig. 27b). La prueba a

posteriori de Tukey demostró que existen diferencias estadísticamente significativas

(P<0.05) entre el valor promedio más alto (47.01±5.37%) del IL en los ovocitos

posvitelogénicos (correspondiente al EI de madurez de la gónada), respecto al resto

de los estadios ováricos que conformaron un solo grupo homogéneo cuyos valores

promedio de IL fluctuaron entre 27.55±0.04% y 23.81±1.63% (Fig. 27b).

Los valores promedio del IL de los ovocitos atrésicos por estadio de desarrollo

ovárico mostraron el patrón de variación más atípico de las tres categorías

ovocitarias (Fig. 27c), ya que, el valor más alto del IL para este tipo de ovocitos se

observa en el EV (posdesove) con un valor estimado en 49.99±0.1%, y los valores

más bajos comprenden un grupo homogéneo (P<0.05) de valores que van del

31.41±1.7% en el estadio de desove parcial (EIV) al 29.62±1.92% en el estadio de

máxima madurez ovárica (EIII).

62

Figura 27. Índice Lipídico (IL) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F4,256=1.4531, P=0.021702, n=261), (b) ovocitos posvitelogénicos (F4,256=3.8992, P=0.011104, n=261) y (c) ovocitos atrésicos (F4,256=3.5070, P=0.00828, n=261) para el mejillón Modiolus capax (media±error

estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el estadio de desarrollo ovárico como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

63

Por último, el análisis del IL por tipo de ovocito (F2,769=6.7917, P=0.03194)

muestra que tanto los ovocitos vitelogénicos como los ovocitos atrésicos y/o en

degeneración poseen valores promedio de IL similares y que además son los valores

significativamente más elevados (31.98±2.91% y 32.08±1.23% respectivamente), y,

peculiarmente, son los ovocitos maduros (posvitelogénicos) los que poseen el IL

significativamente más bajo, con un valor promedio de 25.73±0.95% (Fig. 28).

Figura 28. Índice total de Lípidos (IL) por categoría de tipo de ovocito (F2,769=6.7917, P=0.03194, n=772) para el mejillón M. capax (media±error estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

7.4.2.2. Índice de carbohidratos (ICH)

Por otra parte, y a la par de la cuantificación de lípidos neutros en el tejido

germinal de M. capax, el análisis de los cortes histológicos en parafina teñidos con la

técnica histoquímica Azul Alciano PAS reveló la presencia y localización de

carbohidratos neutros o de reserva (que se tiñeron en tonalidades magenta) y ácidos

(que se tiñeron de azul). Las microfotografías que se analizaron digitalmente

correspondientes a ésta técnica de tinción (Fig. 29) permitieron realizar análisis

64

cualitativos y cuantitativos, ya que, se llevó a cabo la cuantificación de la cantidad de

carbohidratos neutros de reserva discriminando por mes, estadio de desarrollo

ovárico y por tipo de ovocito, además de que se observaron las características del

proceso de incorporación de carbohidratos neutros a los ovocitos de las hembras de

M. capax y se cuantificó la cantidad de carbohidratos neutros presentes en la

totalidad del tejido gonádico (ovocitos y tejido conjuntivo adyacente a los folículos

ováricos) (Fig. 29).

Figura 29. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas (ovarios) del mejillón M. capax. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos posvitelogénicos (opv), ovocitos

atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo (tc), núcleo (n), núcleolo (nu), carbohidratos neutros (chn). Tinción Azul Alciano-PAS (AAPAS) (20X Barra=100µm).

65

La cuantificación del Índice de Carbohidratos (ICH) en el tejido gonádico de

hembras del mejillón M. capax por el método de área de cobertura de los

carbohidratos neutros (de reserva) del presente trabajo se llevó a cabo discriminando

por mes, por estadio de desarrollo ovárico y por tipo de ovocito.

En la Fig. 30a se puede observar que el ICH de las gónadas femeninas de los

mejillones presenta diferencias temporales (por mes) estadísticamente significativas

(F8,167=16.819, P<0.0001), siendo los meses de agosto (26.08±1.14%) y octubre

(26.66±1.71%) en los que se observaron los valores promedio significativamente más

altos (P<0.05) del ICH (a excepción de un brusco y significativo descenso en el ICH

en septiembre de 14.24±1.15%), luego dichos valores disminuyen significativamente

(P<0.05) durante el mes de noviembre hasta llegar a los valores de ICH más bajos

en dicho mes (11.1±0.89%), a partir de marzo se observa una tendencia del ICH a

mantenerse en valores más o menos constantes que no varían en gran medida

durante los siguientes tres meses (abril, mayo y julio) fluctuando entre valores

promedio que van del 11.76±1 al 14.28±1.23%.

Mientras que para el caso de la variación del ICH por estadio de desarrollo

ovárico (Fig. 30b) se observa un patrón poco claro de cómo fluctúa el ICH en función

del proceso de maduración de la gónada en las hembras de mejillón, sin embargo, el

análisis de varianza unifactorial aplicado a los datos indicó que no existen diferencias

estadísticamente significativas (F4,172=1.7208, P=1.4751) en el ICH por estadios de

desarrollo gonádico, conformándose un solo grupo homogéneo (P>0.05) donde los

dos valores promedio más bajos del ICH se observaron en un estadio de baja

actividad reproductiva de previtelogénesis (EI) y un estadio de actividad reproductiva

elevada de desoves parciales (EIV) con 15.57±3.5% y 14.57±0.88%

(respectivamente). Los valores más altos del ICH se observaron en los estadios de

vitelogénesis (II), posvitelogénesis (III) y posdesove (V) con promedios de

18.48±1.4%, 17±1.1% y 16.76±3.25% respectivamente.

66

Figura 30. Índice de Carbohidratos (ICH) para el mejillón M. capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes durante un ciclo anual (F8,167=16.819, P<0.0001, n=176) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (F4,172=1.7208, P=1.4751, n=177) como variables independientes en ANOVAS unifactoriales. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

67

En general, los análisis del ICH por tipo de ovocito en función del tiempo

muestran importantes variaciones temporales y el mismo patrón de cambios

mensuales a lo largo del ciclo anual que comprende el presente trabajo (Fig. 31).

Por un lado en la Fig. 31a se puede observar que la variación mensual durante

el ciclo anual del ICH en los ovocitos vitelogénicos presenta diferencias significativas

(F8,167=12.675, P<0.0001) a lo largo del estudio, se aprecia que del mes de febrero

(27.34±9.28%) a marzo (36.34±3.83%) se da un aumento en el ICH, que luego

disminuye significativamente para formar un grupo homogéneo (P<0.05) con los

valores más bajos del ICH en todo el ciclo anual desde abril a julio, incluyendo el mes

de mayo (16.10±2.26%, 17.48±1.9% y 16.55±1.73%, respectivamente). Sin embargo,

después se observa un brusco aumento en el ICH hasta el valor promedio

significativamente más alto (P<0.05) en el mes de agosto (43.11±1.6%), que

posteriormente disminuye pronunciadamente en el mes de septiembre

(24.31±1.78%) y vuelve a aumentar significativamente (P<0.05) en el mes de octubre

a un valor promedio de (39.36±4.11%) para decaer finalmente en el mes de

noviembre a un valor de 23.33±2.42% (Fig. 31a).

La variación del ICH de los ovocitos posvitelogénicos también fue

significativamente diferente (F8,167=10.113, P<0.0001) entre los meses que

comprende el presente estudio y mostró el mismo patrón de variación que en los

ovocitos vitelogénicos y atrésicos. En la Fig. 31b se puede observar que los valores

significativamente más altos (P<0.05) del ICH en esta categoría de madurez

ovocitaria se presentaron en los meses de agosto y octubre con valores de

38.34±1.77% y 36.94±3.13% (respectivamente), seguidos de febrero y marzo

(20.59±3.82% y 32.16±2.03%, respectivamente), mientras que los valores

significativamente menores de este indicador de calidad ovocitaria formaron un solo

grupo homogéneo (P<0.05) con valores de 15.8±2.86%, 15.78±1.96% y

18.16±4.24%, correspondientes a los meses de abril, mayo y julio (respectivamente).

De las tres categorías de madurez ovocitaria en las que se estimó el ICH, la

de los ovocitos atrésicos (Fig. 31c) fue la que mostro la mayor variación mensual

(F8,167=15.623, P<0.0001) pero con el mismo patrón de fluctuación que los otros dos

tipos de ovocitos. Ya que, como se puede observan en la Fig. 31c, los valores

68

promedio significativamente más altos (P<0.05) del ICH se presentan en marzo,

agosto y octubre (41.55±4.34%, 41.4±2.33% y 40.95±4.04%), mientras que los más

bajos se observan en los meses de abril (15.5±2.4%), mayo (14.3±1.95%) y julio

(19.64±3.1%).

Figura 31. Índice de Carbohidratos (ICH) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F8,167=12.675, P<0.0001, n=176), (b) ovocitos posvitelogénicos (F8,167=10.113, P<0.0001, n=176) y (c) ovocitos atrésicos (F8,167=15.623, P<0.0001, n=176) para el mejillón M. capax (media±error

estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el mes durante un ciclo anual como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

69

En la Fig. 32 se muestra la variación del ICH de cada una de las tres

categorías ovocitarias mencionadas anteriormente (ovocitos vitelogénicos,

posvitelogénicos y atrésicos) en función del estadio de desarrollo ovárico. En general

se puede observar que el IL de cada uno de los tipos de ovocitos muestra un patrón

de variación diferente y atípica respecto a lo que se esperaría que ocurriera en cada

estadio de madurez ovárico de las hembras, mismo patrón que se describe con

detalle a continuación.

El análisis del ICH de los ovocitos vitelogénicos (Fig. 32a) presentó diferencias

significativas (F4,172=9.5175, P<0.0001) entre estadios de madurez ováricos. En el

gráfico correspondiente a dicho análisis se puede observar que el valor promedio del

ICH disminuye significativamente (P<0.05) del estadio de previtelogénesis (EI,

54.6±12.70%) al estadio de vitelogénesis (EII) a un valor de 33.95±2.21%, y este

continúa disminuyendo hasta llegar a los mínimos valores promedio estimados en

23.61±1.92% y 22.65±1.45% en los estadios posvitelogénicos (EIII) y de desoves

parciales (EIV). Posteriormente se aprecia que el ICH aumenta significativamente

(P<0.05) cuando la gónada se encuentra en reposo en el estadio posterior al desove

(EV, 34.4±5.75%).

El IL de los ovocitos posvitelogénicos también varía significativamente

(F4,172=3.2764, p=0.01282) al analizar los valores de este indicador usando el estadio

de desarrollo ovárico como variable independiente (Fig. 32b). La prueba a posteriori

de Tukey demostró que existen diferencias estadísticamente significativas (P<0.05)

entre los valores promedio más altos (28.37±2.07%, 29.33±1.69% y 34.75±7.73%)

correspondientes a los estadios de desarrollo ovárico I, II y V (respectivamente) y los

valores del ICH de los estadios III (23.19±2.41%) y IV (21.01±1.37%) que fueron

significativamente menores (P<0.05).

Los valores promedio del ICH de los ovocitos atrésicos por estadio de

desarrollo ovárico mostraron el patrón de variación significativo (F4,172=5.2682,

P=0.0005, n=177) más complicado que el de las otras tres categorías ovocitarias. Tal

y como se puede apreciar en la Fig. 32c, el valor significativamente más bajo del ICH

para este tipo de ovocitos se observa en el EI (previtelogénesis) con un valor

estimado en 21.4±1.37%, luego ese valor aumenta bruscamente hasta el ICH

70

promedio más alto en el estadio II (35.14±2.59%) para esta categoría ovocitaria, y

disminuye en los estadios III y IV a valores similares (23.16±2.15% y 22.12±1.59%

respectivamente), para finalmente, aumentar a un valor promedio de 31.68±7.47% en

el estadio posterior al desove (V).

Figura 32. Índice de Carbohidratos (ICH) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F4,172=9.5175, P<0.0001, n=177), (b) ovocitos posvitelogénicos (F4,172=3.2764, P=0.01282, n=177) y (c) ovocitos atrésicos (F4,172=5.2682, P=0.0005, n=177) para el mejillón M. capax (media±error

estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el estadio de desarrollo ovárico como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

71

Por último, el análisis del ICH por tipo de ovocito (F2,511=2.1826, P=0.030731)

realizado en la presente investigación reveló que los ovocitos vitelogénicos poseen

valores promedio de ICH significativamente más elevados (P<0.05; 26.23±1.14%)

seguido de los ovocitos atrésicos con un ICH de 25.23±1.19%, mientras que,

peculiarmente, son los ovocitos maduros (posvitelogénicos) los que poseen el ICH

significativamente más bajo, con un valor promedio de 23.88±1.1% (Fig. 33).

Figura 33. Índice total de Carbohidratos (ICH) por categoría de tipo de ovocito (F2,511=2.1826, P=0.030731, n=514 para el mejillón Modiolus capax (media±error estándar) durante un ciclo

anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.

7.4.2.3. Índices de reservas energéticas totales en forma de lípidos y carbohidratos

El análisis de lípidos y carbohidratos en el tejido del ovario de los mejillones

también se realizó en función del mes durante el ciclo anual que comprende la

presente investigación y en función del estadio de desarrollo gonádico de las

hembras (Fig. 34).

La mayor cantidad de reservas energéticas totales en las gónadas femeninas

de los mejillones se observaron en agosto (41.58±2.45%) y octubre (34.37±2.46%),

seguidos de los meses de mayo y julio con valores totales de 30.01±1.54% y

72

31.6±1.7% respectivamente. Mientras que las mínimas cantidades de reservas

totales se obtuvieron en los meses de febrero y noviembre con valores muy similares

(20.54±2.91% y 20.66±1.26%, respectivamente). Durante el resto de los meses los

valores totales de reservas en forma de lípidos y carbohidratos totales se

mantuvieron en niveles más o menos similares que fluctuaron ligeramente entre el

25.53±1.88% y el 24.83±2.75% (Fig. 34a). De manera general se puede observar en

la Fig. 34a que las reservas de carbohidratos por mes superan a las de lípidos, a

excepción de los meses de mayo y julio en donde las cantidades de lípidos en el

tejido gonádico (18.25±0.53% y 17.32±0.48%, respectivamente) fueron mayores a

las reservas energéticas en forma de carbohidratos (11.76±1.01% y 14.28±1.23%,

respectivamente). Las mayores cantidades de carbohidratos de reserva en la gónada

se observaron en agosto (26.1±1.14%) y octubre (26.66±1.71%), y los menores

porcentajes de lípidos de reserva se presentaron al principio del ciclo (febrero y

marzo con valores de 3.6±0.73% y 5.22±0.93%, respectivamente) y al final del ciclo

en los meses de octubre (7.7±0.75%) y noviembre (9.56±0.37%).

En la figura 34b se puede observar que la cantidad total de reservas

energéticas (lípidos y carbohidratos) muestra un patrón de distribución normal acorde

con el proceso de maduración ovárico, ya que inicialmente tiende a incrementar

constantemente, desde el estadio previtelogénico (EI) de un valor de 21.22±5.62% a

un 29.23±2.46% en el estadio de vitelogénesis (EII) hasta llegar a el valor más alto

de reservas de la gónada de 33.16±1.57% en el estadio posvitelogénico (E III) de

máxima madurez. Luego el porcentaje de lípidos y carbohidratos totales decrece

continuamente durante los desoves parciales (EIV, 25.68±1.32%) hasta un

21.38±3.26% en el estadio posterior al desove (EV). Al igual que en el caso de

análisis por mes (Fig. 34a), la comparación de la cantidad y tipo de reservas por

estadio de desarrollo ovárico (Fig. 34b) muestra que en todos los estadios de

madurez la cantidad de carbohidratos en la gónada es mayor que la de triglicéridos,

siendo los estadios II y III en los que se observó la mayor cantidad de carbohidratos

(18.48±1.39% y 17±1.1%, respectivamente), mientras que los valores más bajos de

este sustrato energético fueron de 15.57±3.5% y 14.57±0.88% para los estadios I y

IV, respectivamente. Por otro lado, el estadio III presentó el mayor porcentaje de

73

triglicéridos en ovario con un valor del 16.17±0.51%, siendo los estadios I y V los que

mostraron la menor cantidad de lípidos de reserva durante el proceso de maduración

gonádica de las hembras con valores de 5.64±2.11% y 4.62±0.01%, respectivamente

(Fig. 34b).

Figura 34. Índice total acumulado de Lípidos (IL) y Carbohidratos (ICH) por (a) mes y (b) estadio de desarrollo ovárico para el mejillón Modiolus capax durante un ciclo anual en la

Bahía de La Paz, B.C.S.

74

En la figura 35 se puede apreciar que los porcentajes más altos de reservas

energéticas totales se presentan en los ovocitos vitelogénicos (57.92±0.5%) y

atrésicos (57±0.45%), mientras que los ovocitos maduros posvitelogénicos son los

que tienen la menor cantidad de reservas con promedio del 49.23±1.07% de

reservas totales en forma de lípidos y carbohidratos.

Sin embargo, curiosa y contrariamente al caso de la comparación entre el tipo

y cantidad de reservas energéticas en forma de triglicéridos y carbohidratos neutros

en los ovarios de los mejillones, al realizar en análisis por tipo de ovocito se puede

observar en la figura 35 que la cantidad de lípidos es mayor que la de carbohidratos

en todas las categorías de madurez ovocitaria, donde los ovocitos vitelogénicos y

atrésicos fueron en los que se observaron los mayores porcentajes de triglicéridos

(31.98±2.91% y 32.1±1.23%, respectivamente), mientras que los ovocitos

posvitelogénicos tuvieron los niveles más bajos de lípidos de reserva con un

promedio del 25.73±0.95%. La cantidad de carbohidratos en los ovocitos para cada

categoría oscilo entre un promedio del 25.94±1.14% para los ovocitos vitelogénicos,

23.5±1.08% para los ovocitos posvitelogénicos y del 24.93±1.19% para los ovocitos

atrésicos (Fig. 35).

La cantidad total de reservas energéticas (tanto lípidos como carbohidratos)

por tipo de ovocito se estimó en cerca del 57.92% para los ovocitos vitelogénicos,

49.23% para los ovocitos posvitelogénicos y 57% para los ovocitos atrésicos (Fig.

35).

75

Figura 35. Índice total acumulado de Lípidos (IL) y Carbohidratos (ICH) por categoría de tipo de ovocito para el mejillón M. capax durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.

En la figura 36 se puede apreciar que en general la cantidad promedio de

reservas energéticas en forma de carbohidratos neutros (16.33±1.93%) en el tejido

gonádico de las hembras de mejillón es significativamente mayor (P<0.05) que la de

triglicéridos (12.33±2.2%).

76

Figura 36. Índice total acumulado de reservas energéticas en ovario (F1,436=1036.4, P<0.0001, n=438) en forma de lípidos (IL) y carbohidratos (ICH) para el mejillón M. capax (media±error estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el índice como variable independiente en un ANOVA unifactorial. El asterisco es el pos hoc e indica diferencias estadísticamente significativas.

Contrario a la cantidad de reservas energéticas en todo el tejido ovárico de los

mejillones (Fig. 36), en la figura 37 se puede apreciar que el porcentaje de

triglicéridos es significativamente (ANOVA, P<0.05) más elevado (30.35±0.7%) que

el de los carbohidratos de reserva (24.45±0.65%) al hacer el análisis tomando en

cuenta solo el tejido germinal que comprende los ovocitos maduros y atrésicos de la

gónada.

77

Figura 37. Índice total acumulado de reservas energéticas en los ovocitos (F1,1315=2408.4, p<0.0001, n=1,317) en forma de lípidos (IL) y carbohidratos (ICH) para el mejillón M. capax

(media±error estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el índice como variable independiente en un ANOVA unifactorial. El asterisco es el pos hoc e indica diferencias estadísticamente significativas.

7.5. Variación de temperatura superficial (TS°C) y clorofila-a (Chl-a)

La variación mensual de la temperatura superficial del agua (TS °C) y

concentración de clorofila-a (Chl-a) se presenta en la figura 38 La temperatura

presentó valor máximo (29 °C) en septiembre mínimo (20.11 °C) en febrero y un

valor promedio de 23.95±0.98°C durante el ciclo anual. Las concentración de Chl-a

en el área de estudio mostró una relación inversa con la temperatura, a excepción de

un “bloom” fitoplanctónico registrado al fin de la primavera e inicio del verano, con el

valor máximo (20.11 mg/m3 ) en febrero y el valor mínimo (0.58mg/m3) en diciembre,

con un valor promedio de 2.01±0.33 mg/m3 durante el periodo de estudio (Fig. 38).

Siguiendo con la descripción de la Fig. 38, se puede observar que la

temperatura se reporta con un valor promedio mínimo de 20.11°C en el mes de

febrero (invierno) que marcó el inicio del periodo de muestreo de los organismos,

78

posteriormente se observa un incremento continuo durante los meses que conforman

parte de la primavera (marzo y abril) hasta los meses de mayo y junio (primavera) en

los que la TS prácticamente no cambió (23°C) y luego se observa un repentino y

brusco incremento de la TS en los meses de verano hasta el máximo valor promedio

reportado para esta variable en septiembre (29°C), es justo después de este único

pico de aumento en la TS del agua que se observa un continuo y acelerado

descenso en la TS en los meses de otoño e invierno (octubre, noviembre y

diciembre) hasta una temperatura promedio de 21.25°C en enero de 2014, valor muy

similar al que se muestra para enero de 2013 (21,13°C).

La concentración de Chl-a en la Bahía de La Paz en el periodo que

comprende la investigación mostró una relación inversa con la temperatura (a

excepción de un “bloom” fitoplanctónico anómalo en el fin de la primavera y el inicio

del verano). Los valores más altos en la concentración de Chl-a se reportan en los

meses de invierno comenzando por enero de 2013 en donde el valor promedio

aumenta de 3.30mg/m3 a 20.11 mg/m3 en febrero, luego se observa una continua

tendencia a la disminución en la productividad del área de estudio en la primavera

conforme aumenta la TS hasta un promedio de 2.04 mg/m3 en mayo, y es justo en el

final de la primavera (entre mayo y junio) que se observa un repentino aumento en la

concentración de Chl-a hasta los 3.9 mg/m3 valor inclusive por arriba del reportado

para enero en el invierno de ese mismo año, luego de este repentino “bloom” se

observa un brusco descenso en la concentración de Chl-a durante el verano (julio y

agosto) hasta el periodo comprendido entre los meses de septiembre y noviembre en

los que la productividad fluctúa entre0.73 mg/m3 y 1.1 mg/m3 y es justo en el fin del

otoño y comienzo del invierno (entre noviembre y diciembre) que la concentración de

Chl-a vuelve a dispararse de 0.58 mg/m3 en diciembre a 2.55 mg/m3 en enero de

2014 (Fig. 38).

Las frecuencias más altas de mejillones sexualmente maduros de ambos

sexos y los valores mayores de ACG coinciden con el incremento de la TS durante

el periodo comprendido entre primavera (abril) y verano (agosto) y también coinciden

justo con el “Bloom” de fitoplancton que se presentó al final de la primavera e inicio

del verano. Contrariamente, las frecuencias más altas de individuos totalmente

79

desovados, indiferenciados y en reposo, así como los valores mas bajos en ACG se

observaron a fines de otoño (noviembre) con el descenso pronunciado de la TS,

durante el invierno (enero y febrero) y a inicios de la primavera (marzo), cuando se

registraron las temperaturas más bajas. Los valores máximos en ACS coincidieron

con los meses en los que se registraron aumentos súbitos en la concentración de

alimento (Chl-a) en la Bahía de La Paz, concretamente los meses de febrero y

noviembre de 2013 y enero de 2014 (Fig. 38).

Figura 38. Variación temporal de la temperatura superficial del agua y concentración de clorofila-a (los datos son la media) en la Bahía de La Paz, B.C.S. entre los meses de enero de 2013 y enero de 2014. El área sombreada indica el periodo en el que se observaron las mayores proporciones de individuos sexualmente maduros. Las líneas verticales continuas indican los meses en los que se observaron los valores más altos en el área de cobertura de las gónadas. Las líneas verticales discontinuas indican los meses en los que se observaron las mayores proporciones de individuos con gónadas indiferenciadas o en reposo, los meses en los que se observaron los valores más bajos en el área de cobertura de las gónadas, y los meses en los que se reportan las mayores áreas de cobertura de tejidos somáticos de Modiolus capax.

80

8. DISCUSIÓN

Los resultados de la presente investigación demuestran que Modiolus capax

es un molusco bivalvo desovador parcial que se reproduce prácticamente durante

todo el año en la Bahía de La Paz, B.C.S., con un periodo de actividad reproductiva

máxima que va de abril a agosto principalmente, con un segundo pico reproductivo

de menor intensidad en el mes de noviembre. M. capax presenta una máxima

madurez gonádica entre los meses de abril y agosto con altas frecuencias de

organismos en estadio posvitelogénico (Fig. 11 y 12), desoves máximos ocurridos

durante octubre y noviembre (Fig. 11 y 12) y las más altas áreas de cobertura

gonádica (ACG) (Fig.6), lo anterior respaldado por el descenso del índice de

condición (Fig. 5) en ese lapso de tiempo, así como las altas frecuencias

porcentuales de individuos en maduración avanzada, desove y posdesove (Fig. 11 y

12) y las altas cantidades de ovocitos en estadios de maduración avanzados

(vitelogénicos y posvitelogénicos) durante prácticamente todo el ciclo reproductivo

(Fig. 14) . Se logró identificar un periodo de reposo reproductivo durante el otoño-

invierno (noviembre, enero y febrero) e inicio de la primavera (marzo) ya que más del

80% de la población de mejillones se muestra inmadura y sus gónadas están en

reabsorción o indiferenciadas (Fig. 11 y 12), hecho que coincide temporalmente con

el descenso y las temperaturas más bajas (Fig. 38) durante el presente estudio.

Además, en el presente trabajo se encontró que la proporción de sexos está

dominada por los machos durante todo el ciclo reproductivo (tanto en las temporadas

de baja actividad reproductiva como en las de alta madurez gonádica y de

reproducción activa) (Fig. 13).

Para describir histológicamente del ciclo reproductivo y de desarrollo gonádico de M.

capax en la Bahía de La Paz se siguieron los criterios y escalas de desarrollo

propuestas por Rodríguez-Jaramillo et al., (2008), sin embargo, en la presente

investigación se observaron importantes características y procesos que no se habían

descrito previamente para esta especie de mejillón en la misma área de estudio por

Ochoa-Báez (1985), probablemente debido a que las condiciones ambientales de la

zona fueron distintas a las reportadas por dicho autor entre 1983 y 1984 y a la alta

periodicidad con la que se tomaron muestras en este trabajo.

81

Los resultados de esta investigación difieren de los reportados por (Ochoa-

Báez 1985; Ochoa-Báez, 1987) donde se proporcionó un amplio marco de

conocimientos y antecedentes respecto a la biología poblacional y reproductiva de M.

capax en la Bahía de La Paz, ya que en sus estudios comprendidos entre los años

de 1983 y 1984 encontró que el máximo periodo de actividad reproductora se

presenta en junio con desoves máximos en julio, y que la reproducción de esta

especie en la Bahía de La Paz se lleva a cabo desde finales de mayo hasta

principios de julio. Los resultados de Ochoa-Báez (1985); Ochoa-Báez, (1987)

también difieren de los reportados en el presente trabajo en el hecho de que sus

análisis muestran que si bien, la proporción de machos es mayor durante periodos de

baja actividad reproductiva, la de las hembras supera a la de los machos durante los

meses de máxima madurez gonádica y desove.

Sin embargo, los resultados de la presente investigación coinciden en gran

medida con los obtenidos por Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre (1989) al estudiar el

ciclo reproductivo de M. capax en la Bahía de los Ángeles, B.C. entre febrero de

1985 y enero de 1986, ya que dichos autores encontraron evidencias de liberación

de gametos durante todo el periodo de estudio, donde el ciclo reproductivo tuvo fases

bien definidas. Al igual que en el presente trabajo (como se observa en la Fig. 6, 7, y

8) Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre (1989) mencionan que de febrero a julio la

mayoría de los organismos se encontraron en etapas de crecimiento gonadal, en

agosto fue evidente un periodo de intensa liberación de gametos para ambos sexos,

reiniciándose rápidamente la gametogénesis entre agosto y septiembre, además de

que la liberación de gametos en un gran número de organismos continuó hasta el

final del ciclo (enero), como fue el caso de hembras y machos en este estudio (Fig.

11 y 12).

Los moluscos presentan formas diversas de reproducción sexual, que van

desde dioicos estrictos, la bisexualidad alternativa (hermafroditas secuenciales),

hasta el hermafrodistismo funcional (Coe, 1943; Guo y Allen, 1994; Rodríguez-

Jaramillo, 2014). Aunque los sexos separados (dioicos) suelen ser los casos mas

comunes en los moluscos, el 40% de los 5,600 géneros de este filo son

hermafroditas simultaneos o secuenciales (Rodríguez-Jaramillo, 2014).

82

En sus resultados, Ochoa-Báez (1987) aporta un registro exclusivo para la

Bahía de La Paz en donde se reportaron eventos muy escasos de hermafroditismo y

bisexualidad funcional y no funcional en la población de M. capax estudiada en los

años de 1983 y 1984 en la Bahía de La Paz, mientras que otros autores como

Cáceres-Martínez y Figueras (1998); Newell (1989) y Villalba (1995) han reportado

prevalencias de hermafroditismo funcional y no funcional en mejillones alrededor de

1/1000. Sin embargo, en la presente investigación realizada tres décadas después, y

que también abarca el estudio de un ciclo reproductivo anual en la misma área de

estudio que Ochoa-Báez (1987), no se encontraron organismos que presentaran

algún tipo de hermafroditismo o bisexualidad en esta especie.

En otras especies de bivalvos marinos como los ostiones del género

Crassostrea prevalece la hipótesis respecto a que estos organismos tienen

sexualidad alternativa protándrica, en los que el sexo está determinado por factores

ambientales como la disponibilidad de alimento y temperatura del agua (Coe, 1936;

Galtsoff, 1964; Quayle, 1988). Sin embargo, en especies mas y mejor estudiadas

como C. gigas ha sido demostrado que el sexo esta determinado genéticamente por

factores contenidos en los cromosomas, en este caso, un locus de macho dominante

con alelo (M), y un alelo para las hembras protándricas (F), y el genotipo MF son

machos verdaderos que no cambian de sexo, mientras que FF son hembras

protándricas que maduran como machos en la etapa juvenil y pueden cambiar de

sexo durante los últimos años (Rodríguez-Jaramillo, 2014). La tasa de cambio de

sexo en los individuos puede estar influenciada por genes secundarios y/o por la

influencia de factores ambientales (Guo et al., 1998). Lo anterior sirve como

referencia para explicar como es que en M. capax se han reportado escasos eventos

de hermafroditismo a pesar de que en el presente trabajo no se hayan observado

este tipo de eventos de cambio de sexo.

Los Índices de condición (IC) y gonadal son ampliamente utilizados en el

estudio del crecimiento y reproducción de invertebrados marinos (Grant y Tyler,

1983; Suárez et al., 2005), representan una manera sencilla y práctica de hacer una

aproximación inicial al estado del desarrollo sexual de los individuos. Al igual que el

caso del presente trabajo, la mayoría de los autores utilizan toda la carne (tejido

83

somático y gonadal) para el cálculo del índice de condición (Guillou et al., 1990) y de

partes de la masa visceral tales como la gónada para el cálculo del índice gonádico

bajo el mismo principio (Emmett et al., 1987; Jaramillo y Navarro, 1995). Sin

embargo, teniendo en cuenta que la gónada de M. capax es difusa y se caracteriza

por desarrollarse inmersa en parte de la masa visceral durante el ciclo reproductivo,

es por ello que en el presente trabajo se empleó el área de cobertura gonádica

(ACG) en lugar del índice gonádico que se determina convencionalmente en la

mayoría de los trabajos usando el peso de la gónada respecto al peso del resto de la

carne (Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre. 1989; Cáceres-Martínez et al., 1990;

Villalejo-Fuerte y Ceballos- Vázquez, 1996; Villalejo-Fuerte y Muñetón-Gómez, 2002;

Hernández-Olalde, 2003; Suárez et al., 2005; García-Corona et al., 2014) como un

indicador de la proporción real de la gónada respecto al resto de la carne de los

organismos. En esta investigación tanto el IC (Fig. 5) como el ACG (Fig. 6) muestran

una variación estacional bien definida (Fig.38) cuya diferencia, además, es

estadísticamente significativa debido a los distintos estadios de desarrollo gonádico y

estadios de madurez de los organismos a lo largo del ciclo reproductivo (Fig. 5 y 6).

Estacionalmente, tanto en hembras (Fig. 7) como en machos (Fig. 8), los valores

mínimos del ACG se presentan desde el invierno hasta el principio de la primavera,

después de los principales desoves y al final del ciclo gonadal (Fig. 11). Del verano al

final del otoño, los valores del IC (Fig. 5) y del ACG (Fig.6) aumentan

significativamente hasta alcanzar su valor máximo entre el verano y el otoño, justo

antes de los meses en los que se registró la máxima actividad reproductiva (Fig. 38).

En cuanto a las etapas del ciclo gonádico descrito, el ACG (Fig. 6) presenta

diferencias significativas entre meses (ANOVA, P<0.05). Alcanzando un máximo en

el final de la primavera y el principio del verano, y un mínimo después de los desoves

totales y cuando las gónadas se encuentran indiferenciadas y en reposo durante el

invierno (Fig. 38). Esto confirma la idoneidad del ACG como una herramienta

análoga al índice gonadal que se emplea tradicionalmente, porque en ambos casos

los resultados sugieren que puede variar más en función del número de gametos en

lugar de la cantidad de tejido de reserva.

84

El IC indica que se presenta una recuperación significativa de las partes

blandas (carne) de los mejillones (incluidos tejidos somáticos y germinales) entre los

meses de febrero a julio, lo cual se interpreta como un incremento en la condición

reproductiva y en la gametogénesis de M. capax en este periodo hasta su máximo

significativo en el mes de julio (Fig. 5), lo anterior respaldado por el análisis

específico de ACG (Fig.6) que además se realizó tanto en hembras (Fig. 7) como en

machos (Fig. 8). Mismo incremento en el IC que fue observado y reportado por

Ochoa-Báez (1985) pero entre los meses de octubre y noviembre junto con una

prolongación de la gametogénesis activa en las hembras hasta el invierno y

principios de la primavera que coincidió con un descenso de temperatura superficial

del agua en la Bahía a la entrada invernal, todo lo contrario al proceso observado en

este trabajo en el que, tanto el incremento en el IC como en el ACG coincidieron con

el incremento progresivo y continuo de la temperatura del agua ente la primavera y el

verano (Fig.38). El periodo en el incremento del IC que reporta Ochoa-Báez (1985)

entre octubre y noviembre representa en el presente estudio un periodo de descanso

reproductivo (posdesove), reabsorción gonadal e indiferenciación sexual (Fig. 5 y 6)

que coincidió con el descenso y los mínimos valores promedios de TS °C (Fig. 38).

Contrario a lo mencionado por Ochoa-Báez (1987) para el ciclo reproductivo

de M. capax en la Bahía de La Paz, B.C.S., Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre (1989)

mencionan que el periodo de crecimiento gonádico más acelerado y la liberación de

gametos más intensa estuvieron relacionados con las temperaturas más altas de la

Bahía de los Ángeles, B.C., al igual que el caso de la población de esta misma

especie en la Bahía de La Paz en el presente trabajo (Fig. 38).

Si bien los resultados obtenidos por Ochoa-Báez (1985); Ochoa-Báez (1987)

en la Bahía de La Paz, B.C.S. difieren de los reportados por Bückle-Ramírez y

Garza-Aguirre (1989) para Bahía de los Ángeles, B.C. y en mayor medida con los del

presente trabajo, los tres estudios coinciden entre sí respecto a otros trabajos

realizados para otras especies de mitílidos en el Océano Pacífico de América

(Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre, 1989; Jaramillo y Navarro, 1995; Toro et al. 2002;

Oyarzún et al. 2011), en que el ciclo gametogénico y de desarrollo gonádico en

principio es continuo durante todo el año, demostrándose que entre la primavera y el

85

verano cerca del 90% de los adultos (machos y hembras) se reproducen

simultáneamente con ciclos gaméticos asincrónicos que producen varios desoves

parciales durante gran parte de año (especialmente en machos como se puede

apreciar en la Fig. 12). Su número e intensidad pueden ser, tal y como lo mencionan

Galtsoff (1964); Sastry (1979); Mackie (1984); Barber y Blake (1991); Thompson et

al. (1996); Avellanal et al. (2002); Quiñones-Arreola (2003); Hernández-Olalde

(2003); Thorarinsdóttir y Gunnarsson (2003); Cáceres-Puig (2007), una característica

particular de la población (factores endógenos de condición fisiológica-reservas

energéticas, neurosecreción hormonal y carga genética) y a la vez depender de los

factores ambientales (factores exógenos como temperatura, salinidad, disponibilidad

de alimento, ciclos lunares y de mareas) predominantes en el área de estudio, o de

una combinación compleja de ambos. Puede ser que cambios temporales en dichos

factores (principalmente ambientales) determinan en conjunto el patrón de

reproducción de M. capax en la Bahía de La Paz y den lugar a las diferencias en el

desarrollo gonádico y ciclo reproductivo de esta especie en el tiempo.

En la literatura existe una amplia variedad de sistemas de clasificación

propuestos para diferenciar los estadios de desarrollo gonádico tanto de hembras,

como de machos y hermafroditas no funcionales de bivalvos mitílidos (Pipe, 1987a;

Jaramillo y Navarro, 1995; Toro et al. 2002; Suárez et al., 2005; Ortiz-Zarragoitia y

Cajaraville, 2010; Oyarzún et al. 2011 Hinzmann et al., 2013), incluido Modiolus

capax en el Golfo de California (Ochoa-Báez, 1985; Ochoa-Báez, 1987; Bückle-

Ramírez y Garza-Aguirre, 1989). Sin embargo, en el presente estudio se propone

una adaptación del esquema específico para la población del mejillón M. capax de la

Bahía de La Paz durante un ciclo reproductivo anual basado en observaciones

morfológicas cualitativas y cuantitativas de los gametos y estructuras histológicas

específicas de la gónada que describe detalladamente el proceso de maduración

gonádica de esta especie en un compendio de cinco estadios de desarrollo para

hembras (Tabla I; Fig. 9) y machos (Tabla II; Fig. 10).

La alta frecuencia de organismos en resposo gonádico durante agosto,

septiembre, octubre y noviembre (Fig. 11 y 12) sugiere que la gametogénesis se

reinició rápidamente y que la mayoría de los organismos pasaron por una etapa de

86

reabsorción de los ovocitos reciduales que sucedió en un período de tiempo corto,

como se ha observado en otras especies de mejillones como Mytilus californianus y

Aulacomya maoriana (Kennedy, 1977), Mytilus edulis (Kelley et al., 1982), Mytilus

galloprovincialis (Suárez et al., 2005) y Modiolus metcalfei (López y Gómez, 1982).

Esta puede ser la causa de que en los meses siguientes se observaran bajas

proporciones de organismos con valores bajos en el IC (Fig. 5) y ACG (Fig. 6) como

consecuencia de una alta proporción de organismos maduros y en etapas de

liberación de gametos (Fig. 11 y 12).

En el ciclo gametogénico del mejillón M. capax en el presente estudio se ha

descrito la existencia de fenómenos atresia y degeneración ovocitaria muy elevados

(Fig. 14 y 15). Este proceso de observó principalmente en estadios de vitelogénesis,

desove y posdesove (IV y V; Fig. 9 y 15), durante los periodos que comprenden

desoves parciales (durante todo el ciclo reproductivo, Fig.11), también durante los

meses en los que la mayor proporción de las hembras se encuentran en periodos de

reposo gonádico (final del otoño-invierno y principios de la primavera, Fig. 11) y en el

final del ciclo de gametogénico (final del otoño-invierno) época en la que se

presentan las mayores frecuencias de ovocitos atrésicos (Fig. 14). Este fenómeno es

frecuente en los moluscos bivalvos (Pipe, 1987b; Dorange y Le Pennec, 1989;

Motavkine y Varaksine 1989; Beninger y Le Pennec, 1991). Según Motavkine y

Varaksine (1989), esto puede ser debido a la capacidad limitada del folículo a

mantener las células germinales ante condiciones ambientales adversas para llevar a

cabo los desoves, a los procesos de auto-limpieza al final del ciclo gametogénico

tales como la preparación para la siguiente temporada reproductiva y/o una

respuesta ante situaciones de estrés (contaminación ambiental, déficit nutricional,

restricción hormonal pero principalmente bajas y altas repentinas y bruscas en las

temperaturas).

Uno de los principales criterios que se utilizan para hablar de ovocitos

atrésicos es la pérdida de redondez y de afinidad a los colorantes, incluyendo otros

procesos y cambios a nivel de la membrana plasmática de los ovocitos y el vitelo de

éstos que son particularmente propensos a daño oxidativo debido a su alto contenido

de ácidos grasos, este proceso puede alterar la fluidez de la membrana y causar

87

ruptura y cambios morfológicos y citológicos que provocan el cambio de forma de los

ovocitos atrésicos de bivalvos marinos (Rodríguez-Jaramillo, 2014).

Se ha observado que en hembras de moluscos bivalvos las temperaturas

elevadas favorecen el procesos de reabsorción de la gónada así como altas

prevalencias de atresias y degeración ovocitaria (Maru, 1981; Paulet et al., 1988;

Beninger y Le Pennec, 1991; Arellano-Martínez et al., 2004; Chung et al., 2008;

Rodríguez-Jaramillo, 2014). La intensa atresia ovocitaria que se observó en M. capax

durante el invierno (con el descenso de la temperatura, Fig. 14 y 38) y su disminución

en la primavera de 2014 (ascenso de la temperatura, Fig. 38), en el presente trabajo

se infiere que el fenómeno de atresia y degeneración ovocitaria está más relacionada

con los descensos de temperatura que con otras variables como la disponibilidad de

alimento (concentración de Chl-a), ya que tal y como se aprecia en la Fig. 38, los

meses en los que se observaron las mayores frecuencias de ovocitos en proceso de

lisis y degeneración (Fig. 14) coincidieron con los súbitos descensos de temperatura

mas importantes y las mayores concentraciones de Chl-a en la Bahía de La Paz.

Este fenómeno de degeneración de los gametos femeninos puede estar relacionado

con una alta permanencia de ovocitos maduros en la luz folicular ante la falta de

condiciones ambientales favorables en el medio para estimular el desove. Este

fenómeno se ha relacionado a los ovocitos que presentan actividad lisosomal (Pipe y

Moore 1985), y los productos derivados de esta lisis podrían ser reabsorbidos por las

células auxiliares, hemocitos y células foliculares de los gonoductos del ovario, como

señalan diferentes autores (Pipe, 1987; Lubet et al. 1987; Dorange y Le Pennec,

1989; Le Pennec et al. 1991). En esta investigación se ha observado este fenómeno

tanto en el folículo como en los gonoductos de los ovarios (Fig. 9 y 15).

Aunque se ha comprobado en algunos bivalvos marinos que las condiciones

de estrés causadas por las fluctuaciones de temperatura y escases de alimento

pueden provocar importante fenómenos de lisis ovocitaria (atresias), degeneración,

regresión y reabsorción de los gametos femeninos en etapas vitelogénicas

avanzadas (Tang, 1941; Christiansen y Olivier, 1971; Ozanai, 1975; Sastry, 1978;

Bayne, 1978; Lubet et al., 1987; Gaulejac et al., 1995; Rodríguez-Jaramillo et al.,

2001; Rodríguez-Jaramillo, 2004; García-Corona et al., 2014; Rodríguez-Jaramillo,

88

2014), la causa de la atrofia parcial de los ovocitos de una gran cantidad de

organismos, y observada durante todo el ciclo reproductivo en M. capax (a excepción

de enero y febrero cuando las gónadas estaban indiferenciadas), no puede

dilucidarse de este estudio. Estos resultados demuestran que ante condiciones

ambientales adversas los ovocitos de M. capax son viables dentro de los folículos

ováricos por poco tiempo, entrando en degeneración celular en caso de que no sean

liberados. De esta forma, existiría un reaprovechamiento de los nutrientes existentes

en el vitelo de los ovocitos y consecuentemente una optimización del proceso

reproductivo cuando las condiciones de desove no son favorables (Beninger y Le

Pennec, 1991; Faveris y Lubet, 1991; Lubet et al., 1991). Esta reabsorción por parte

de las células del sistema inmune ocurriría tanto en los folículos como en los

conductos genitales (Lubet et al., 1995), mostrando que la presencia de ovocitos

atrésicos no necesariamente significaría la liberación de los mismos con el

consecuente desperdicio energético (Fig. 9 y 15).

Es de importante resaltar que la alta prevalencia de atresias y degeneración

de ovocitos maduros que se observó en los mejillones durante todo el ciclo

reproductivo, pero sobre todo entre el otoño y el principio del invierno (Fig. 14)

sugiere que la capacidad reproductiva y la viabilidad de los gametos de los mejillones

se puede ver afectada principalmente por condiciones ambientales adversas para

llevar a cabo desoves parciales o totales. Al igual que en esta investigación, otros

autores como Suárez et al. (2005) han descrito altas prevalencias de atresias

ovocitarias en mejillones de Galicia Mytilus galloprovincialis (en el noroeste de la

península Ibérica) durante los meses de invierno en los que se registran los mínimos

promedio en la TS°C del mar, como fue el caso del presente trabajo (Fig. 38).

Como se mencionó anteriormente, el fenómeno de atresias ovocitarias se

asocia normalmente a la falta de condiciones ambientales favorables para llevar a

cabo los desoves (Ortiz-Zaragoitia et al., 2010). Factores como un déficit nutricional

por la baja concentración de alimento disponible, bajas temperaturas y la

contaminación ambiental pueden incrementar el proceso de atresia y degeneración

de los ovocitos en algunas especies de mejillones como Mytilus galloprovincialis

(Ortiz-Zaragoitia et al., 2010). Es por lo anterior que las altas frecuencias de ovocitos

89

atrésicos (Fig. 14) en el presente trabajo se asocian más con las bajas temperaturas

en el otoño-invierno que con la disponibilidad de alimento (Chl-a), ya que, como se

puede observar en la Fig. 38, los meses en los que se reportan las mayores

cantidades de ovocitos atrésicos, si bien coinciden con las más bajas temperaturas

también coinciden con las máximas concentraciones de fitoplancton en la bahía.

Ortiz-Zaragoitia et al. (2010) llevaron a cabo experimentos en los que

sometieron a un stock de mejillones a una exposición prolongada de hidrocarburos

aromáticos policíclicos (PAH’s) y fenoles alcalinos, y, al igual que otros autores como

Aarab et al. (2004); Lowe (1988); Lowe y Pipe (1987); Ortiz-Zarragoitia y Cajaraville

(2006) demostraron que estos agentes químicos fungen como disruptores

hormonales que propician las altas prevalencias de atresias ovocitarias en algunas

especies de mejillón como Dreissena polymorpha (Binelli et al., 2001) en un lago

contaminado con Dicloro Difenil Tricloroetano (DDT), y en algunas especies de

almejas como Mizuhopecten yessoensis (Vaschenko et al., 1997) en una bahía

contaminada con tetracloruro de carbono (CCl4).

La población de mejillones estudiada se ubica cerca de las inmediaciones de

una planta de almacenamiento, refinación y distribución de combustibles

(hidrocarburos) de la empresa Petróleos Mexicanos S.A. de C.V. (PEMEX) y de una

central termoeléctrica de la Comisión Federal de Electricidad (CFE) en el Puerto de

Pichilingue dentro de la Bahía de La Paz. Ambas industrias están ubicadas en de la

Bahía de La Paz, a menos de 1km de distancia del sitio donde se colectaron las

muestras y se obtuvo el material biológico para llevar a cabo la presente

investigación (Fig. 2). A la vista de los resultados obtenidos, cabe la posibilidad de

que ahí se origine y descargue algún tipo de contaminante que pudiese propiciar

algún proceso de disrupción hormonal e inhibición estrogénica (Tran et al., 1996;

Navas y Segner, 2000; Gagne et al., 2002; Gauthier-Clerc et al., 2002; Ortiz-

Zarragoitia y Cajaraville, 2006; Tintos et al., 2007). Cabe también la posibilidad de

que lo anterior pudiese tener algun efecto negativo en el proceso de maduración de

los ovocitos durante la gametogénesis de M. capax en la Bahía de La Paz. De

acuerdo con los autores antes citados, han demostrado que la exposición

prolongada a hidrocarburos interrumpe la producción de algunas hormonas sexuales

90

esteroideas como los estrógenos en los ovarios (principalmente estrona y estradiol),

que cumplen una función primordial en la inducción a la proliferación de células

germinales. Así mismo, el exceso de estos contaminantes y la disrupción en la

producción de estas hormonas sexuales puede conducir a fenómenos de

sobremaduración de los ovocitos, con lo cual se inicia un proceso de degeneración

que puede alterar el metabolismo de los lípidos, principalmente en el tejido ovárico

(Cajaraville et al., 1991; Tran et al., 1996; Navas y Segner, 2000; Gagne et al. 2002;

Gauthier-Clerc et al. 2002; Ortiz-Zarragoitia y Cajaraville, 2006; Tintos et al. 2007) ya

que estos compuestos contaminantes son insolubles en agua pero altamente

lipofilicos.

Como evidencia de la influencia negativa a las poblaciones naturales de

moluscos bivalvos en la zona indutrial de la Bahía de La Paz, Robles-Mungaray

(comunicación personal) menciona que en el centro de producción acuícola

“Acuacultura Robles S.P.R. de R.I. de C.V.” (donde se produce y comercializa semilla

de diferentes especies de bivalvos marinos de importancia comercial a productores

de la región) se registran altas tasas de mortalidad en los cultivos (larvarios y de

semilla) de todas las especies con las que se trabaja cuando el abastecimiento de

agua del centro de producción coincide con las descargas de aguas tratadas a la

Bahía de La Paz tanto de la Central Termoeléctrica como de la planta de refinación

de hidrocarburos.Tales efectos en la población estudiada de M. capax, solo se

pueden considerar como una posibilidad y no como un hecho concluyente que

explique los fenómenos de degradación en ovocitos, que se encontraron durante el

presente estudio.

Durante el seguimiento del desarrollo gonádico de las hembras de M. capax

se observó que el proceso de emisión de gametos al medio (desove) es diferente al

reportado para otras especies de bivalvos. Por ejemplo, la almeja catarina (A.

ventricosus), la almeja mano de león (Nodipecten sp.) y el ostión japonés (C. gigas)

presentan glándulas unicelulares secretoras de mucinas ácidas que facilitan el

movimiento de los gametos a través de los conductos de desove en la gónada

durante su expulsión. Estas secreciones actúan también como una barrera de

defensa bioquímica ante el ingreso de posibles patógenos que puedan afectar la

91

calidad de los ovocitos desovados (Lora-Vilchis et al. 2003; Vázquez-Yeomans,

2006; Estrada et al., 2011; García-Corona et al. 2014a).

Con respecto a los parámetros de calidad ovocitaria del mejillón M. capax en

la Bahía de La Paz, es importante destacar que los conocimientos generados hasta

el momento para este y para otros mitílidos son muy escasos. La mayoría de los

estudios que abordan aspectos de la biología reproductiva de moluscos bivalvos se

basan solo en interpretaciones y evaluaciones histológicas meramente cualitativas,

dejando de lado análisis histológicos cuantitativos como los que se presentan en este

trabajo. En ese sentido, la presente investigación aporta información novedosa, ya

que la medición de variables morfométricas e histoquímicas de calidad ovocitaria,

como el área de los ovocitos y de sus núcleos, el diámetro teórico y diámetro

máximo, la relación núcleo/citoplasma de los ovocitos, el índice de forma o de

redondez de los gametos y sus núcleos, así como los índices de reservas

energéticas de los ovocitos (lípidos y carbohidratos), proporcionan mucha

información útil y valiosa para conocer y entender las estrategias y el esfuerzo

reproductivo que aplica M. capax en el área de estudio.

La cantidad de reservas en el citoplasma de los ovocitos es un factor muy

importante para asegurar una buena calidad ovocitaria y un adecuado desarrollo

larvario. Las larvas de la mayoría de los moluscos bivalvos son inicialmente

lecitotróficas y su desarrollo temprano depende de las reservas bioquímicas

acumuladas en el vitelo de los ovocitos, que son transferidas desde algunos tejidos

somáticos (Holland, 1978; Bayne y Newel, 1983; Marty et al., 1992; Rodríguez-

Jaramillo, 2004).

La tecnología de análisis digital de imágenes ha convertido a la histología en

una herramienta cuantitativa útil (Heffernan y Walker, 1989; Racotta et al., 2003;

Ceballos-Vázquez et al., 2003; Rodríguez-Jaramillo et al. 2008; García-Corona et al.

2014a; Rodríguez-Jaramillo, 2014; García-Corona et al. 2014b). Con esta

herramienta se pueden estimar algunas variables morfométricas como el área del

ovocito y su diámetro teórico (Saout et al., 1999), la relación núcleo/citoplasma (N/C)

y el índice de redondez (IR), así como indicadores de calidad energética de los

gametos como el índice lipídico (IL) y el de carbohidratos (ICH). Los dos últimos han

92

sido empleados como indicadores de calidad de ovocitos en Atrina maura

(Rodríguez-Jaramillo, 2004) en ostión de placer Crassostrea corteziensis

(Rodríguez-Jaramillo et al., 2008) el ostión C. gigas (Rodríguez-Jaramillo, 2014). La

relación N/C se fundamenta en que el núcleo alcanza su tamaño final al inicio de la

gametogénesis en la fase de ovogonia (Raven, 1966; Rodríguez-Jaramillo et al.

2001), y por lo tanto, puede tomarse como referencia para el crecimiento de otras

partes de la célula como el citoplasma, el cual continúa su crecimiento hasta la fase

posvitelogénica.

Los resultados de la presente investigación muestran que tanto el AO, como el

DT, DM, la relación N/C e IR son buenos indicadores de calidad ovocitaria en el

mejillón M. capax durante su ciclo reproductivo. Tal y como se puede observar en las

figuras 16 y 18, tanto el AO como el DT se comportaron de manera muy similar a los

estadios de desarrollo de las gónadas femeninas, lo cual corresponde directamente

al desarrollo ovocitario normal de los mejillones (Fig. 14) que se reporta en este

trabajo.

Sin embargo, la relación N/C se comportó de manera más variada e inestable.

En la mayoría de los estadios de desarrollo gonádico propuestos en el estudio el

valor de dicha relación se mantuvo por debajo de 0.68±0.01, que es muy bajo si se le

compara con lo reportado para otras especies de moluscos bivalvos por Rodríguez-

Jaramillo, et al. (2001) y Rodríguez-Jaramillo (2004) para el hacha china A. maura, o

por Rodríguez-Jaramillo et al. (2008) para el ostión de placer C. corteziensis.

Mediante el análisis con microscopia de luz de las preparaciones histológicas de las

gónadas femeninas, se pudo observar, que el área y DT de los núcleos de los

ovocitos guarda una relación desproporcional con respecto al área, DT y relación N/C

de los ovocitos (Fig. 16, 18 y 20). Igualmente, se registraron altas frecuencias de

ovocitos atrésicos en los folículos ováricos de la mayoría de las hembras en estadios

de desarrollo gonádico avanzado (Fig. 9 y 14). Esto podría explicar la fluctuante

relación N/C (Fig. 20) y el bajo promedio general en el IR (Fig. 22) de los ovocitos

durante todo el ciclo reproductivo, estimado en 0.73±0.003. El hecho de que el IR

promedio de los núcleos (0.84±0.002) haya sido más alto que el de los ovocitos

(0.73±0.003) (Fig. 22), aunado a la baja relación N/C (0.68±0.01) (Fig. 20), sugiere

93

que M. capax dispone de una escasa cantidad de reservas energéticas en el

citoplasma de los gametos maduros, que podría a su vez relacionarse con la alta

cantidad de atresias observada en los estadios de maduración tardíos de la especie

objetivo durante su evento reproductivo en la Bahía de La Paz.

Los análisis de indicadores de calidad morfométrica discriminando por tipo de

ovocito (vitelogénicos, posvitelogénicos y atrésicos), fueron muy útiles porque

aportaron información valiosa a cerca del potencial y viabilidad ovocitaria de los

mejillones durante el ciclo reproductivo que se estudió en el presente trabajo. En la

Fig. 17 se puede apreciar que el área de los ovocitos no mostró diferencias

significativas entre categorías de desarrollo, reportándose un promedio de

419.22±9.95µm2, y sin embargo, las tallas de los ovocitos no mostraron diferencias

significativas entre categorías de desarrollo para el DT pero si para el DM, ya que

este parámetro fue signigficativamente menor en los ovocitos maduros

posvitelogénicos que en los ovocitos atrésicos (Fig. 19).

Es importante mencionar que en el presente trabajo se esperaba obtener

resultados similares a los que se obtuvieron en otros estudios de evaluación de la

calidad ovocitaria de otros moluscos bivalvos con base en el análisis morfométrico de

sus ovocitos, como es el caso de los estudios realizados por Rodríguez-Jaramillo et

al. (2008), Rodríguez-Jaramillo (2004) y Oyarzún et al. (2011) para C. corteziensis,

A. maura y Mytilus chilensis respectivamente. Estos autores reportan que tanto el

área como el diámetro (ya sea teórico o máximo) de los ovocitos es

significativamente mayor cuando se encuentran maduros y por lo tanto, en estadio

posvitelogénico.

Es probable que el significativamente mayor DM de los ovocitos atrésicos

respecto a los ovocitos vitelogénicos y posvitelogénicos se deba a la deformación en

la morfología celular de este tipo de ovocitos durante su degeneración, debido a la

lisis de la célula, la actividad enzimática, la degradación de orgánulos celulares,

despolarización y perdida de fluidez de la membrana citoplásmica y a la distención

del retículo endoplásmico, procesos normales asociados a la autofagocitosis del

material que constituye al ovocito (Beninger y Le Pennec, 1991; Faveris y Lubet,

1991; Lubet et al., 1991; Tran et al., 1996; Rodríguez-Jaramillo, 2014).

94

Entre todos los indicadores de calidad morfométricos evaluados durante el

presente estudio, discriminando por tipo de ovocito, la relación N/C (Fig. 21) y el IR

(Fig. 23) fueron los que mostraron patrones de variación más normales. Los valores

mínimos para ambos indicadores se reportan para los ovocitos vitelogénicos y

aumentan en los ovocitos maduros (posvitelogénicos), mientras que los valores

promedio para ambas variables disminuyen significativamente cuando los ovocitos se

degeneran y entran en procesos de atresias, lo cual, según Beninger y Le Pennec

(1991); Cajaraville et al. (1991); Ortíz-Zarragoitia y Cajaraville (2010) puede deberse

principalmente a la perdida de la configuración poliédrica de las células (en el caso

de la diminución en el IR), y, a los cambios drásticos que sufren los ovocitos en su

composición citoplasmica y nuclear, para el caso de la disminución en la relación N/C

(Beninger y Le Pennec, 1991; Gagne et al., 2002).

Son pocos los estudios que se han realizado acerca de la biología

reproductiva de moluscos bivalvos desde el punto de vista de la dinámica de

sustratos energéticos aplicando métodos histoquímicos y métodos de análisis digital

de imágenes estandarizados. La mayoría de los trabajos abordan dichos análisis

aplicando estereología y análisis bioquímico como técnicas básicas. Los análisis

bioquímicos son importantes, pero generalmente impiden disponer de la precisión

cualitativa y cuantitativa simultánea en la que se basa la metodología aplicada en

este estudio, para M. capax. Las herramientas bioquímicas empleadas comúnmente

para llevar a cabo el estudio de la bioenergética durante la reproducción de moluscos

bivalvos proporcionan información fina sobre la utilización de reservas energéticas,

sin embargo, los métodos histoquímicos cuantitativos empleados en la presente

investigación reflejan con suficiente detalle la dinámica precisa de los fenómenos

metabólicos y los cambios fisiológicos que engloban los procesos de acopio,

transferencia y utilización de reservas energéticas en los tejidos somáticos y

reproductivos durante el desarrollo gonádico, el desove y el reposo post-desove de

los organismos. Por tal razón, en este trabajo se optó por emplear técnicas

histoquímicas cualitativas y cuantitativas, que permitieron estimar con suficiente nivel

de confianza la dinámica anual de la estrategia y esfuerzo reproductivo de M. capax,

obteniendo indicadores poco analizados hasta ahora en estudios de biología

95

reproductiva de bivalvos marinos, que son complementarios a las técnicas

bioquímicas tradicionales. A partir estas técnicas, se tuvo la posibilidad de disponer

de información suficiente para comprender de manera general los cambios

fisiológicos estacionales de la especie estudiada, que en su conjunto constituyen la

dinámica energética y la estrategia y esfuerzo reproductivo de M. Capax en la zona

de estudio.

La dinámica anual en los principales sustratos energéticos (lípidos y

carbohidratos) que se emplean metabólicamente durante la reproducción han sido

estudiados en mayor grado en almejas de la familia pectinidae (Sastry y Blake, 1971;

Ansell, 1974; Comely, 1974; Taylor y Venn, 1979; Barber y Blake, 1981, 1983, 1991;

Robinson et al., 1981; Epp et al., 1988; Couturier y Newkirk, 1991; Besnard, 1991;

Martínez, 1991; Martínez y Mettifogo, 1998; Pazos et al., 1997; Racotta et al., 1998;

Lodeiros et al., 2001; Racotta et al., 2003; Arellano-Martínez et al., 2004; Palacios et

al., 2004; Palacios et al., 2005; Palacios et al., 2007; Arjona et al., 2008; Kraffe et al.,

2010), ostras perleras (Desai et al., 1979; Saucedo et al., 2002; Vite-García, 2005;

Vite-García y Saucedo, 2007), ostiones (Kang et al., 2000; Rodríguez-Jaramillo et al.,

2008; Hurtado et al., 2009a; Hurtado et al., 2009b; Rodríguez-Jaramillo, 2014), callo

de hacha (Rodríguez-Jaramillo, 2004), y en menor grado en ciertas especies de

mejillones (Gabbott, 1975, 1976, 1983; Bayne, 1976; Zandee et al., 1980; Bayne et

al., 1982; Wendell, 2013). En la mayoría de estos estudios, como en el caso del

presente, se ha demostrado que las variaciones en el contenido energético de los

tejidos asociados a la reproducción permiten inferir la condición fisiológica del

organismo durante el evento reproductivo, y deducir a partir de los resultados,

algunas rutas metabólicas que conllevan los procesos de almacenamiento y

movilización de energía que además de asegurar el crecimiento de tejidos somáticos,

también aseguran la reproducción de los organismos.

En el presente trabajo se logró estimar como las variaciones en el tipo y

volumen de los tejidos somáticos de almacenamiento energético se relaciona con la

estrategia y esfuerzo reproductivo de los organismos (estudiado aquí a nivel de tejido

gonadal y somático) para regular la reproducción. Respecto a lo anterior, algunos

autores como Zandee et al. (1980); Gabbott (1983); Bayne et al. (1982); Wendell

96

(2013) mencionan que la mayor parte de la energía canalizada para llevar a cabo el

desarrollo y maduración gonádica en bivalvos de la familia mytilidae proviene de

reservas almacenadas en el tejido conjuntivo de la gónada (~30%), que en el

presente estudio, con la aplicación de técnicas histoquímicas se caracterizó como

tejido conjuntivo vesicular (Fig. 29). Este tejido almacena altas cantidades de

carbohidratos neutros de reserva (Fig. 30 y 34) y escasas cantidades de lípidos

neutros o triglicéridos (Fig. 25 y 34); es muy abundante entre los folículos ováricos

durante los estadios intermedios de maduración gonádica (E I, II y III) y durante

periodos de baja actividad reproductiva (noviembre, enero, febrero y principios de

marzo; Fig. 6) tanto de hembras (Fig. 7) como de machos (Fig. 8). El tejido conjuntivo

vesicular disminuye considerablemente durante los periodos de intensa actividad

reproductiva (abril a noviembre; Fig. 7 y 8) y durante los últimos estadios de

desarrollo gonadal (E IV y V de desove parcial y posdesove) como se puede apreciar

en la figura 6.

Estos resultados demuestran que el principal tejido de reserva durante el

desarrollo gonádico y proceso de maduración ovocitaria no es adipogranular como lo

afirma Ochoa-Báez (1987) para el mejillón M. capax en la Bahía de La Paz y Lobo-

da-Cunha y Serrao-Santos (2005) para Bathymodiolus azoricus, una especie de

mejillón que habita en ventilas hidrotermales del Océano Pacífico. Ambos autores

mencionan que la principal fuente de energía para la gametogénesis de estas y otras

especies de mejillón como Mitylus edulis, se encuentra almacenada en las células

adipogranulares del tejido conjuntivo que rodea a los folículos ováricos. Sin embargo,

los resultados obtenidos en el presente estudio, mediante técnicas histoquímicas

específicas para la tinción de lípidos (SN; Fig. 24 y 25) y carbohidratos de reserva

(AAPAS; Fig. 20 y 30), confirman que es el tejido conjuntivo vesicular de la gónada,

rico en carbohidratos neutros, el principal reservorio energético que sustenta el

desarrollo de la gónada y la gametogénesis durante el ciclo reproductivo de M. capax

en la Bahía de La Paz.

Al hacer una comparación entre la fracción de cobertura correspondiente al

contenido energético en forma de lípidos (Fig. 25) y carbohidratos (Fig. 30) en el

tejido conjuntivo de la gónada (discriminando por mes y por estadios de desarrollo

97

ovárico), se logró determinar que la participación de los carbohidratos para fines de

la estrategia aplicada por M. capax durante la reproducción, son mucho más

importantes que la de los lípidos en forma de triglicéridos (Fig. 34 y 36). Lo anterior

sugiere que el tejido conjuntivo vesicular de la gónada participa de manera activa

como un componente fundamental en la estrategia reproductiva de esta especie. En

apoyo a esta hipótesis, se observa un aumento en la cantidad de carbohidratos

almacenados en este tejido al inicio de la gametogénesis, así como una marcada

disminución al finalizar el desove (Fig. 34), lo cual sugiere una movilización de

nutrientes almacenados en dicho tejido hacia la gónada para contribuir al desarrollo

gonádico en su conjunto y a la maduración de los gametos.

Los triglicéridos son lípidos de reserva energética en los moluscos, que se

transfieren de los progenitores a la progenie (Holland, 1978) y han sido reportados

por varios autores como el principal sustrato de suministro de energía durante sus

primeros estadios de desarrollo (Galler y Mann, 1986; Frasser, 1995; Rodríguez-

Jaramillo, 2005; Rodríguez-Jaramillo et al. 2008). Racotta et al. (2003) afirman que

los triglicéridos son los lípidos más importantes para el almacenamiento de energía y

Besnard (1991) demostró que los lípidos en forma de triglicéridos presentes en los

ovocitos, aseguran la conversión energética indispensable para el adecuado

desarrollo de los embriones. La importancia de estimar el IL como indicador de

calidad ovocitaria es relevante porque al evaluar la cantidad individual de triglicéridos

por ovocito se puede estimar la viabilidad del embrión y de los primeros estadios

larvarios.

Existe poca información detallada sobre el proceso de acumulación de lípidos

en los ovocitos de invertebrados. En los insectos se lleva a cabo la síntesis de ácidos

grasos, principalmente triglicéridos, a partir de carbohidratos (Lubzens et al., 1981;

Ferenz, 1985). Sin embargo, la capacidad de los ovocitos para sintetizar ácidos

grasos es muy limitada. En otros organismos como Manduca sexta (Kawooya et al.,

1988) y Aedes aegypti (Ziegler, 1997), la cantidad de ácidos grasos sintetizados por

el ovocito en sí corresponden como máximo a 1% del lípido que se encuentra en el

huevo maduro. Esto significa que casi todos los lípidos deben ser importados y

pueden proceder directamente de la dieta o de los depósitos de almacenamiento en

98

la grasa corporal. El cuerpo almacena grasas incluidas en la dieta pero algunos

lípidos se sintetizan a partir de carbohidratos (Ziegler y Roth, 1985; Ziegler y Ibrahim,

2001). En el mosquito A. aegypti al menos el 80% de los lípidos que se encuentran

en los ovocitos se originan a partir de lípidos provenientes de grasa corporal, que son

sintetizados a partir de azúcares presentes en los tejidos de reserva (Ziegler y

Ibrahim, 2001).

Con base en lo anterior, es de suma importancia resaltar algunos resultados y

fenómenos que se observaron en la dinámica del tipo y cantidad de reservas

energéticas en forma de triglicéridos y carbohidratos de reserva tanto anual, como

durante el proceso de maduración ovárica de los mejillones objeto del presente

estudio. Como se mencionó anteriormente, y como se puede observar en las figuras

34 y 36, si bien la cantidad promedio de carbohidratos (17.12±1.96%) supera la de

los lípidos de reserva (11.12±1.73%), estacionalmente y por estadios de desarrollo

gonádico de las hembras, al realizar el análisis del tipo y la cantidad de dichas

sustancias de reserva discriminando solo por tipo de ovocito (Fig. 28 y 33), se pudo

observar que durante el proceso de maduración de los ovocitos las cantidades

promedio de lípidos (29.93±2.1 %; Fig. 26 y 27) son mayores que las de los

carbohidratos (24.79±0.71%; Fig. 31 y 32), mismo hecho que puede observarse

claramente al comparar los valores de ambos tipos de reservas en las figuras 35 y

37. Lo anterior podría explicarse con base en una ruta metabólica de lipogénesis en

la que los organismos por medio de reacciones bioquímicas en el citoplasma de las

células del tejido conjuntivo vesicular como fibroblastos y fibrocitos, llevan a cabo la

síntesis de ácidos grasos y esterificados de cadena larga que posteriormente son

unidos a moléculas de glicerol para formar triglicéridos o grasas de reserva (Lubzens

et al., 1981; Ferenz, 1985). Estas reacciones suceden específicamente en el retículo

endoplásmico de fibroblastos y fibrocitos, en donde el alargamiento de la cadena de

ácidos grasos se lleva a cabo por medio de los sistemas enzimáticos acetil-CoA

carboxilasa y la vía de la ácido-graso-sintetasa (Lubzens et al., 1981; Ferenz, 1985) y

los triglicéridos son posteriormente transportados (por endocitosis) a los ovocitos que

se encuentran madurando en los folículos ováricos (Ziegler, 1997) durante los

estadios de madurez ovárica intermedia (EI y EII) y de maduración máxima (EIII). En

99

estos estadios de madurez se observaron los mayores valores en el IL para M. capax

(Fig. 25). Las rutas metabólicas como la lipogénesis que se lleva a cabo durante la

vitelogénesis en invertebrados, han sido ampliamente estudiadas y descritas por

Ziegler y Van Antwerpen (2010). Estos autores mencionan que cuando los ovocitos

maduran en los folículos ováricos de los invertebrados, se llevan a cabo procesos de

endocitosis por medio de los cuales la célula introduce moléculas grandes de

triglicéridos y ácidos grasos englobándolas en una invaginación de la membrana

citoplasmática dando lugar a una vesícula denominada “fagosoma” o “endosoma”,

que posteriormente es digerida por los lisosomas (complejo “fagolisosoma” o

“fagoendosoma”) que son los orgánulos encargados de realizar la digestión celular y

dejar disponibles los triglicéridos para su utilización en el ovoplasma de los ovocitos

(Fig. 39).

Figura 39. Estructuras subcelulares que participan en la captación y almacenamiento de nutrientes por los ovocitos de invertebrados. Los nutrientes lipídicos y del vitelo atraviesan la membrana basal del folículo ovárico y llegan a la superficie de los ovocitos a través del espacio extracelular que separa las células epiteliales foliculares (flechas). Al llegar a la superficie del ovocito, los nutrientes son tomados por endocitosis mediada por el receptor específico (lípidos o proteínas). Después de pasar por las vesículas de endocitosis (endosomas), las proteínas se acumulan en los compartimentos de almacenamiento de proteínas esféricas, llamadas cuerpos de yema (parte del vitelo). Mientras que los triglicéridos y ácidos grasos son almacenados en gotitas lipídicas. Anteriormente no se había identificado ningún otro tipo de estructuras especializadas para la transferencia de lípidos extracelulares a las gotitas de almacenamiento de lípidos en los ovocitos (Tomado de: Ziegler y Van Antwerpen, 2010).

100

Los resultados obtenidos en esta investigación explican más a fondo la

estrategia reproductiva de M. capax en la Bahía de La Paz, no habían sido

reportados para esta especie (Ochoa-Báez, 1987; Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre,

1989), pero si para otras especies de moluscos con mayor valor e interés comercial

como ostreidos (Rodríguez-Jaramillo et al., 2008), pínnidos(Rodríguez-Jaramillo,

2004) y pectínidos (Racotta et al., 1998; Lodeiros et al., 2001; Racotta et al., 2003;

Arellano-Martínez et al., 2004; Palacios et al., 2004; Palacios et al., 2005; Palacios et

al., 2007; Arjona et al., 2008; Kraffe et al., 2010).

Es bien sabido que desarrollo gonádico y la gametogénesis representan

periodos de alta demanda de energía, misma que según Bayne (1976), Epp et al.

(1988), Barber y Blake (1991), Lobo-da-Cunha y Serrao-Santos (2006) y Ziegler y

Van Antwerpen (2010), puede provenir de una fuente exógena como el alimento

consumido, o de una fuente endógena asociada a reservas energéticas previamente

almacenadas en tejidos somáticos como el conjuntivo vesicular de la gónada

identificado en el presente estudio (Fig. 29). La utilización de la energía contenida en

el alimento ingerido supone la adopción por parte del organismo de una estrategia

oportunista, mientras que el empleo de energía almacenada en tejidos somáticos

indica que la estrategia es de tipo conservadora (Bayne, 1976). En el caso de M.

capax, se asume que la especie sigue una estrategia reproductiva conservadora, ya

que la movilización de energía (principalmente carbohidratos) del tejido conjuntivo

vesicular a la gónada es muy activa durante los periodos de intensa reproducción

(Fig. 7 y 8).

En su conjunto, los resultados del seguimiento del desarrollo gonádico y de la

evaluación de los parámetros de calidad ovocitaria (morfométricos e histoquímicos)

sugieren que M. capax tiene una reducida plasticidad para seleccionar la estrategia

que mejor convenga a su éxito reproductivo, ya que el esfuerzo en la movilización y

utilización de las reservas contenidas en dichos tejidos es intenso (Fig. 6), sobre todo

en las hembras (Fig. 7). Tendencias similares han sido observadas también para

otras especies de zonas templadas o subtropicales, como Pecten maximus en el

Noroeste de España (Pazos et al. 1997), A. ventricosus en Bahía de La Paz, México

(Luna-González et al., 2000; García-Corona et al. 2014), P. sterna en Bahía de La

101

Paz, México (Cáceres-Puig, 2007; Vite-García y Saucedo, 2007) A. maura

(Rodríguez-Jaramillo, 2004), C. gigas en Korea del norte (Kang et al., 2000) y C.

corteziensis Golfo de California (Rodríguez-Jaramillo et al. 2008).

Tal y como se infiere en el presente estudio, y en medida de lo propuesto por

autores como MacDonald y Thompson, (1985); MacDonald et al. (1987) y Chávez-

Villalba et al. (2002), la selección de la estrategia reproductiva que adoptan los

bivalvos marinos, incluido M. capax, tiene su origen en las variaciones en la

abundancia del alimento disponible y/o en los cambios de temperatura del agua, pero

sobre todo, la cantidad de alimento disponible, ya que como se aprecia en la figura

38, los meses en los que se registraron las mayores concentraciones de Chl-a en la

Bahía de La Paz coinciden con los valores máximos en el ACS (Fig. 7 y 8) y con la

mayor cantidad de carbohidratos neutros confinados en el tejido somático de la

gónada (Fig. 30a) lo cual confirma el patrón de estrategia conservadora que sigue

esta especie durante su reproducción. Sin embargo, no se puede dejar de lado el

hecho de que la temperatura sea un factor exógeno que actúa fuertemente como

control en la regulación de la dinámica energética entre los diferentes tejidos

relacionados con la reproducción.

El esfuerzo reproductivo en los moluscos bivalvos se define como la cantidad

de energía de los tejidos somáticos que se destina a la reproducción (gónada), bajo

determinadas condiciones (Lucas, 1992; Thompson y MacDonald, 1991; Gangnery,

1997; Cáceres-Puig, 2007). Los moluscos bivalvos tienen la capacidad de

almacenar reservas en sus tejidos durante periodos de elevado suministro de

alimento, las cuales son canalizadas en los momentos de escases alimenticia y/o de

alta demanda de energía, ya sea durante la reproducción o bajo condiciones de

estrés fisiológico (Cáceres-Puig, 2007).

Como se puede apreciar en la fgura 6, la mayor transferencia de reservas de

los tejidos somáticos a la gónada de M. capax se da al final del invierno y durante

toda la primavera (febrero a abril) y los mínimos en el ACS, es decir, la máxima

transferencia de reservas energéticas del tejido somático al gonádico se da entre los

meses de mayor actividad reproductiva que son mayo y julio, justo cuando el ACG

alcanza sus máximos en el ciclo anual. Este es el periodo de mayor esfuerzo

102

reproductivo que realiza la población de mejillón durante el ciclo reproductivo anual

que se estudia en el presente trabajo. Después del máximo en el ACG y el mínimo

en el ACS se puede observar una recuperación acelerada en el ACS lo cual se

puede interpretar como un lapso de recuperación de las reservas energéticas

durante la reproducción (Fig. 6). Esto coincide con el descenso de la temperatura y

los máximos en la disponibilidad de alimento (mayores concentraciones de Chl-a),

como se puede apreciar en la figura 38 Sin embargo, es importante hacer notar que

las hembras de M. capax realizan un mayor esfuerzo reproductivo durante el ciclo

anual, ya que, como se puede observar en la figura 7a, se presentan dos picos

principales de transferencia de reservas desde el tejido somático al tejido de la

gónada, uno principal entre mayo y julio y otro secundario y de menor intensidad en

el otoño entre octubre y noviembre. En cambio, los machos solo presentan un pico

máximo de transferencia de reservas a la gónada en el mes de mayo y en menor

medida en el mes de julio, donde el resto del tiempo representa periodos de

recuperación de reservas en el tejido somático (Fig. 8a). Tanto en hembras, como en

machos, los periodos de recuperación de las reservas en los tejidos somáticos

coincidieron con los descensos en la TS °C y con los máximos en la concentración

de Chl-a (Fig. 38).

Por último, tal y como se esperaba, y como se ha observado en otras especies

como Pteria sterna (Cáceres-Puig, 2008) y Atrina maura (Barrios-Ruíz, D. 2005), la

cantidad de reservas energéticas del mejillón M. capax (tanto en hembras como en

machos) varió de acuerdo a las diferentes etapas de madures y desarrollo ovárico,

observándose la mayor movilización de componentes lipídicos y de carbohidratos a

la gónada en los estadios de máxima madurez gonádica (EIII y IV), mientras que el

reposo y recuperación de las reservas en los compartimentos somáticos se observó

durante los estadios de indiferenciación sexual (E0) y baja actividad gametogénica

(EI) (Fig. 7b y 8b).

Con base en lo anterior, es claro que una aproximación para estimar la

cantidad de reservas energéticas trasladadas desde los tejidos somáticos a la

gónada durante la reproducción puede ser expresada en el presente estudio en

términos del esfuerzo reproductivo de la especie, y que coincide con la definición de

103

(Calow y Woolhead, 1997; Ziolko y Kozlowski, 1983; Ziegler y Ibrahim, 2001) como la

porción de recursos disponibles (alimento ingerido y reservas) que están

proporcionando energía para la reproducción.

Estudiar la dinámica de sustratos energéticos disponibles en tejidos asociados

a la reproducción, así como las variables de calidad morfometrías e histoquímicas de

los ovocitos estacionalmente y durante los periodos de reposo, activación y

reproducción durante el ciclo reproductivo de especies poco estudiadas como el

mejillón M. capax puede ser útiles para estudiar el efecto de las condiciones

ambientales sobre el estado reproductivo de los bancos naturales de esta y otras

especies de moluscos bivalvos susceptibles a explotación comercial, así como para

definir las condiciones apropiadas (temperatura y requerimientos nutricionales de la

especie, principalmente) para realizar experimentos de acondicionamiento y

maduración de reproductores en condiciones controladas de laboratorio, lo cual, se

espera se vea reflejado en desoves más exitosos y de mayor calidad, menor

mortalidad de organismos, mayor probabilidad de éxito en la supervivencia larvaria y

producción de semilla de calidad.

El patrón del ciclo, estrategia y esfuerzo reproductivo de Modiolus capax en la

Bahía de La Paz descrito en el presente trabajo parece ajustarse al de la mayoría de

las especies de origen meridional las cuales, al expandirse hacia el norte, tienden a

reproducirse principalmente en los meses de verano (Margalef, 1972; Bückle-

Ramírez y Garza-Aguirre, 1989).

Los estudios enfocados a la biología reproductiva de Modiolus capax proveen

de información valiosa y útil para efectuar predicciones actualizadas sobre el stock

de reclutamiento, ciclos de maduración gonádica y calidad de los desoves de esta

especie en la Bahía de La Paz, B.C.S., información necesaria para la obtención de

semilla, aprovechamiento del recurso a partir de sus bancos naturales y el desarrollo

de su cultivo en sistemas acuícolas a niveles experimentales y comerciales.

Un requerimiento básico para aplicar normas de conservación, explotación y/o

manejo y el desarrollo del cultivo acuícola de especies marinas comerciales como el

mejillón M. capax es el conocimiento detallado del proceso de maduración gonádica,

ciclo reproductivo y calidad ovocitaria, el cual puede describirse con base en un

104

análisis histológico (cualitativo y cuantitativo) detallado como el que se realizó en

esta investigación.

105

9. CONCLUSIONES

La proporción de sexos en la población del mejillón Modiolus capax estudiada en

el presente trabajo se vio dominada por los machos durante todo el ciclo

reproductivo y no se registró hermafroditismo o bisexualidad funcional o no

funcional en los organismos.

Las frecuencias más altas de individuos sexualmente maduros (hembras y

machos) y en estadios de reproducción activa se observaron entre los meses de

abril y agosto, mientras que la mayor proporción de organismos en reposo

gonádico e indiferenciados sexualmente, se registtró entre enero y febrero.

La estimación de frecuencias de categorías de madurez ovocitarias reveló que

entre los meses de abril a julio se presentan las mayores proporciones de

ovocitos maduros posvitelogénicos con potenciales de ser liberados al medio

durante los desoves, y también permitió observar la prevalencia de atresias y

degeneración ovocitaria durante prácticamente todo el ciclo reproductivo.

El análisis digital de imágenes permitió realizar un estudio detallado de la calidad

de los ovocitos durante el ciclo reproductivo anual discriminando por meses,

estadios de desarrollo ovárico y tipo de ovocito, identificando variaciones

estacionales y por estadio de desarrollo gonádico en los indicadores de calidad

morfométrica (área total, área del núcleo, diámetro teórico y diámetro máximo,

relación núcleo citoplasma, e índice de redondez de los ovocitos y sus núcleos),

e indicadores de calidad histoquímicos como los índices lipídico y de

carbohidratos.

El cálculo de los indicadores de calidad morfométricos e histoquímicos mostró

que los desoves de mayo, julio y agosto son los de mejor calidadya que los

ovocitos tienen una mayor cantidad de lípidos. Sin embargo los análisis por tipo

de ovocito demostraron que los ovocitos maduros (posvitelogénicos) y liberados

al medio durante los desoves son los que tienen la más baja calidad por su pobre

contenido de triglicéridos y carbohidratos de reserva.

La población de M. capax presentó una estrategia reproductiva conservadora por

la abundante cantidad de tejido conjuntivo vesicular (rico en carbohidratos

106

neutros) y por el incremento en el ACS durante los periodos en los que se

reportó la mayor cantidad de alimento disponible (Chl-a) en la Bahía de La Paz.

Con la aplicación de técnicas histoquímicas específicas para la tinción de

triglicéridos (SN) y carbohidratos de reserva (AAPAS) se pudo inferir que M.

capax probablemente utiliza una ruta metabólica de lipogénesis (síntesis de

triglicéridos a partir de los carbohidratos del tejido conjuntivo vesicular de la

gónada), para incluir una mayor cantidad de lípidos a los ovocitos durante el

proceso de maduración ovocitaria.

Con base en el conocimiento del contenido y distribución de sustratos

energéticos de los principales compartimentos somáticos (ACS) y germinales

(ACG), se logró identificar el periodo comprendido entre mayo y julio como el de

mayor esfuerzo reproductivo en la población de M. capax.

El análisis de área de cobertura gonádica (ACG) y somática (ACS) permitió

demostrar que las hembras realizan un mayor esfuerzo reproductivo que los

machos durante el ciclo reproductivo anual, ya que presentan dos picos máximos

en el ACG y transferencia de reservas desde los tejidos somáticos, uno principal

entre abril y agosto y uno secundario de menor intensidad entre octubre y

noviembre. Mientras que los machos solo presentan un periodo anual de máximo

esfuerzo reproductivo y de menor duración entre mayo y julio.

El estudio de las variaciones temporales en la temperatura superficial y

concentración de Chl-a, permitieron demostrar que la mayor actividad

reproductiva de los mejillones se da entre el final de la primavera y el inicio del

verano con el incremento de la temperatura y un “bloom” fitoplanctonico, y que

los periodos de reposo e indiferenciación sexual de los organismos coincide con

el descenso de la temperatura y la mayor disponibilidad de alimento entre el

otoño y el invierno.

107

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ANEXOS

Anexo I. Formulación de solución fijadora Davidson para cortes en parafina. Reactivo Cantidad (ml)

Glicerina 400 Formaldehído (37-40%) 800

Alcohol etílico (96%) 1200 Agua de mar filtrada 1200

-Tiempo óptimo de fijación 36-48 horas a temperatura ambiente, dependiendo del tamaño del

tejido, secciones mayores de 1 cm3 deberán dejarse mínimo 48 horas. -El volumen de solución fijadora debe triplicar el volumen de tejido a fijar.

Anexo II. Tinción con Hematoxilina-Eosina (H&E).

1.- Xilol 100% (3 cambios) (10 minutos c/u) 2.- Xilol:Alcohol etílico 100% (1:1) (5 minutos) 3.- Alcohol etílico 95% (5 minutos) 4.- Alcohol etílico 70% (2 cambios) (5 min c/u) 5.- Agua destilada (5 minutos) 6.- Hematoxilina de Harris (4 minutos) 7.- Agua corriente (5 minutos)

10.- Agua destilada (5 minutos) 11.- Agua amoniacal (10-15 segundos) 12.- Agua destilada (5 minutos) 13.- Alcohol etílico 50% (2 minutos) 14.- Alcohol etílico 70% (2 minutos) 15.- Eosina-Floxina alcohólica (3 minutos) 16.- Alcohol etílico 96% (2 cambios) (2 min c/u)

8.- Agua destilada (5 minutos) 17.- Alcohol 100% (3 cambios) (1 minutos c/u) 9.- Alcohol ácido (10- 15 segundos) 18.- Citrisolv (3 cambios) (5 minutos c/u) Resultados esperados

Núcleo Azul-morado Citoplasma Naranja-rosa Nucléolo Morado-azul Tejido conjuntivo Rosa

Anexo III. Tinción Azul Alciano PAS (AAPAS) para mucopolisacáridos neutros y ácidos.

1.- Xilol 100% (3 cambios) (10 minutos c/u) 2.- Xilol:Alcohol etílico 100% (1:1) (5 minutos) 3.- Alcohol etílico 95% (5 minutos) 4.- Alcohol etílico 70% (2 cambios) (5 min c/u) 5.- Agua destilada (5 minutos) 6.- Reactivo Azul Alcián (20 minutos)

11.- Reactivo de Schiff (30 minutos) 12.- Solución sulfurosa (3 cambios) (2 min c/u) 13.- Agua corriente (5 minutos) 14.- Hematoxilina férrica de Weigert (5 minutos) 15.- Agua destilada (2 minutos) 16.- Ácido pícrico (1 minuto)

7.- Agua destilada (2 minutos) 17.- Alcohol 96% (2 cambios) (5 minutos c/u) 8.- Ácido periódico al 0.5% (10 minutos) 18.- Alcohol 100% (2 cambios) (5 minutos c/u) 9.- Agua corriente (5 minutos) 19.- Citrosolv 100% (5 minutos) 10.- Agua destilada (2 minutos) Resultados esperados

Mucopolisacáridos ácidos Azul Sustancias cartilaginosas Púrpura Mucopolisacáridos neutros Magenta Mucina epitelial Azul oscuro

128

Anexo IV. Tinción Sudán Negro (SN) para lípidos.

1.- Xilol 100% (3 cambios) (10 minutos c/u) 7.- Solución Sudán Negro (15-30 minutos) 2.- Xilol:Alcohol etílico 100% (1:1) (5 minutos) 8.- Diferenciar en Alcohol etílico 70% (5 min) 3.- Alcohol etílico 95% (5 minutos) 9.- Carmalum o Hematoxilina de Harris 4.- Alcohol etílico 70% (2 cambios) (5 min c/u) 10.- Agua corriente (5 minutos) 5.- Agua destilada (5 minutos) 11.- Agua destilada (5 minutos) 6.- Alcohol etílico 70% Resultados esperados

Esteres de colesterol Azul-Negro Fosfolípidos Gris Triglicéridos Azul-Negro Mielina Bronce

tesis dinÁmica anual de la estrategia, …biblio.uabcs.mx/tesis/te3209.pdf · instalaciones,...

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