tesis doctoral: regulación de la transcripción de
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PROGRAMA DE DOCTORADO
EN INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA
TESIS DOCTORAL:
Regulación de la transcripción de citoquinas por la
modulación del metabolismo energético y el estrés del
retículo endoplasmático en células dendríticas
Presentada por Saioa Márquez Piñeiro
para optar al grado de Doctora por la Universidad de Valladolid
Dirigida por:
Dr. Mariano Sánchez Crespo
Dra. Mª Nieves Fernández García
Secretaría Administrativa. Escuela de Doctorado. Casa del Estudiante. C/ Real de Burgos s/n. 47011-Valladolid. ESPAÑA
Tfno.: + 34 983 184343; + 34 983 423908; + 34 983 186471 - Fax 983 186397 - E-mail: [email protected]
Impreso 1T
AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/A DE TESIS
(Art. 7.2 de la Normativa para la presentación y defensa de la Tesis Doctoral en la UVa)
D. Mariano Sánchez Crespo, con D.N.I. 10777731T, Profesor de Investigación del
CSIC en el Instituto de Biología y Genética Molecular, Dirección a efecto de
notificaciones Calle Sanz y Fores, 3, 47003 Valladolid, e-mail [email protected]
y Dª María Nieves Fernández García, con D.NI. 13914426R, Profesora del
departamento de Bioquímica y Biología Molecular, y Fisiología en la Facultad de
Medicina de la Universidad de Valladolid, como Directores de la Tesis Doctoral
titulada Regulación de la transcripción de citoquinas por la modulación del
metabolismo energético y el estrés del retículo endoplasmático en células
dendríticas realizada por Dª Saioa Márquez Piñeiro alumna del Programa de
Doctorado en Investigación Biomédica autorizan su presentación, considerando
que reúne los criterios de calidad científica suficientes para ser defendida
públicamente en esta Universidad.
Valladolid,...... de........................................ de...............
Los Directores de la Tesis,
Fdo.: Mariano Sánchez Crespo Fdo.: Mª Nieves Fernández García
SR/SRA. PRESIDENTE/A DE LA COMISIÓN DE DOCTORADO
A la memoria de amatxu
y a mis chicos
“Necesitamos enseñar a que la duda no sea temida,
sino bienvenida y debatida.
No hay problema en decir:`No lo sé´”
Richard Feynman
AGRADECIMIENTOS
Había pensado saltarme este apartado, no porque no tenga nada que agradecer, sino
porque padezco una extraña aversión a las ñoñerías y además mis dotes prosaicas
dejan bastante que desear. Pero, me han comentado que los agradecimientos es lo
único que se lee todo el mundo y que queda muy feo no ponerlos, así que he decidido
hacer un esfuerzo y ahí van:
A L@S que me abrieron la puerta de su laboratorio y no me han dado más que
facilidades para que consiga terminar esta tesis
A L@S que han compartido poyata y campana y han trabajado mano a mano
conmigo
A L@S que han tomado “el café”, me han amenizado los días y han pasado
ratos de ocio, llamémoslo así, fuera del IBGM
A L@S que me han entretenido en los pasillos, también de otras plantas, y
durante las comidas
A L@S que han coincidido en el laboratorio conmigo y han seguido su camino
A L@S que han contribuido realizando algunas de las técnicas
A L@S que me han sufrido fuera del laboratorio, sobre todo en casa
¡¡ MILLONES DE GRACIAS !!
Esta Tesis no hubiera podido ser sin vosotros.
Ah, y una mención de honor para LA que con esta lleva su enésima tesis
Bueno, pues ya está, no ha sido tan difícil, sólo espero no haberme dejado a nadie
gggg.
Índice
ÍNDICE
3
Abreviaturas 7
Resumen 11
Introducción 15
1. El sistema inmune 17
1.1 Las células dendríticas 20
1.2 Citoquinas implicadas en la polarización de la respuesta inmune 22
La interleuquina 10 22
La interleuquina 23 24
La interleuquina 1β 26
2. Reprogramación metabólica en el sistema inmune 26
2.1 La ruta glucolítica 28
La hexoquinasa 30
La piruvato quinasa 32
2.2 El factor de transcripción HIF1α 33
3. El estrés de retículo endoplasmático 35
3.1 La respuesta a proteínas mal plegadas 36
La rama ATF6α 38
La rama PERK 38
La rama IRE 39
Objetivos 41
Materiales y métodos 45
1. Reactivos 47
2. Cultivos celulares 48
2.1 Obtención de células dendríticas humanas 48
2.2 Obtención de células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón 49
3. Análisis de la expresión génica 50
3.1 Extracción del ARN total 50
3.2 Síntesis del ADN complementario 50
3.3 PCR cuantitativa en tiempo real 50
3.4 Análisis del splicing de XBP1 52
3.5 Análisis de las isoformas de la piruvato quinasa 52
3.6 Inmunoprecipitación de la cromatina 52
ÍNDICE
4
4. Análisis de proteínas 54
4.1 Obtención de extractos celulares para inmunodetecciones (Western Blot) 54
Extractos celulares totales 54
Extractos nucleares y citosólicos 54
Electroforesis en condiciones desnaturalizantes, transferencia a
membranas de nitrocelulosa e inmunodetección 55
4.2 Cross linking de PKM2 56
4.3 ELISA 57
4.4 Microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser 57
5. Estudios bioenergéticos 58
6. Medida de lactato 59
6.1 Medida de lactato extracelular 59
6.2 Medida de lactato intracelular 59
7. Medida de la corriente de Ca2+ intracelular 60
8. Análisis estadístico 61
Resultados 63
1. Reprogramación metabólica tras la estimulación de las células
dendríticas 65
1.1 Análisis del mecanismo implicado en la reprogramación metabólica 67
2. Modulación del metabolismo de la glucosa y regulación transcripcional
de la producción de citoquinas en células dendríticas 71
2.1 Efectos de la privación de glucosa 72
Expresión de citoquinas 72
Producción de lactato 73
Efecto del lactato de sodio y de la modulación del flujo de piruvato 75
Implicación de la respuesta a proteínas mal plegadas: el papel de la
rama IRE 77
El papel de las ramas ATF6 y PERK 85
2.2 Efectos de la regulación de la actividad de la PKM2 90
Expresión de citoquinas 91
Producción de lactato 91
Estudios bioenergéticos 92
Conformación y actividad quinasa de la PKM2 94
ÍNDICE
5
Discusión 97
1. Caracterización de la reprogramación metabólica en células dendríticas 99
2. Modulación del metabolismo de la glucosa y regulación transcripcional
de la producción de citoquinas en células dendríticas 101
2.1 Efectos de la privación de glucosa 101
Implicación de la respuesta a proteínas mal plegadas 105
2.2 Efectos de la regulación de la actividad de la PKM2 109
Conclusiones 113
Bibliografía 117
Anexo I 133
Abreviaturas
ABREVIATURAS
9
ADN: Ácido desoxirribonucleico
ADNc: ADN complementario
ARN: Ácido ribonucleico
ARNm: ARN mensajero
Asn: Asparagina
ATF: Factor activador de la transcripción
BCR: Receptor de linfocitos B
BMDC: Célula dendrítica derivada de médula ósea
BiP: Proteína de unión a la inmunoglobulina
BSA: Albúmina sérica bovina
CBP: Proteína de unión a CREB
CD: Célula dendrítica
C/EBP: CCAAT/enhancer-binding protein
CHOP/DDIT3: DNA damage-inducible transcript 3
COX2: Ciclooxigenasa 2
CPA: Célula presentadora de antígeno
CRTC/TORC: cAMP regulated transcriptional transducers of regulated CREB activity
CREB: cyclic AMP response element-binding protein
Ct: Ciclo umbral
DAMP: Patrón molecular asociado a daño
DAPI: 4’,6-diamidin-2-fenilindol dihidroclorhídrico
DCA: Dicloroacetato
DEPC: Dietil-pirocarbonato
DSS: Disuccinimidil suberato
DTT: Ditiotreitol
dNTP: Desoxinucleótido trifosfato
ECAR: Tasa de acidificación extracelular
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético
EEM: Error estándar de la media
EGTA: Ácido etilenebis(oxonitrilo)tetraacético
ERAD: Degradación asociada al retículo endoplasmático
ERSE: Elemento de respuesta a estrés de RE
eIF2α: Factor iniciador de la traducción eucariótica 2α
FADH2: Flavín adenín dinucleótido
FBSi: Suero bovino fetal inactivado
GAPDH: Gliceraldehído fosfato deshidrogenasa
GM-CSF: Factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos
GSK3β: Glicógeno sintasa quinasa 3β
G-6-P: Glucosa-6-fosfato
HBS: Tampón HEPES salino
HEPES: Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-etansulfónico
HIF: Factor inducible por hipoxia
HK: Hexoquinasa
HRE: Elemento de respuesta a hipoxia
IFN: Interferón
IKK: Quinasa de IB
IL: Interleuquina
IRE: Enzima que requiere inositol
IRF3: IFN regulatory factor 3
JAK: Janus kinase
kDa: KiloDalton
LDH: Lactato deshidrogenasa
LPS: Lipopolisacárido bacteriano
MAPK: Mitogen-activated protein kinase
MCT: Transportador de ácidos monocarboxílicos
MHC: Complejo mayor de histocompatibilidad
MPC: Transportador mitocondrial de piruvato
ABREVIATURAS
10
MSK1: Mitogen and stress activated protein kinase-1
NAD: Nicotin adenin dinucleótido
NF-κB: Nuclear factor -light-chain-enhancer of activated B cells
NK: Célula Natural Killer
NLRP3: NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3
OCR: Tasa de consumo de oxígeno
OXPHOS: Fosforilación oxidativa
PAMP: Patrón molecular asociado a patógeno
PBS: Tampón fosfato salino
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
PDH: Piruvato deshidrogenasa
PDK: Piruvato deshidrogenasa quinasa
PHD: Prolil-hidroxilasa
PERK: Protein kinase RNA-like endoplasmatic reticulum kinase
PK: Protein quinasa
PKM: Piruvato quinasa
PPP: Ruta de las pentosas fosfato
PRR: Receptor de reconocimiento de patrones
pb: Pares de bases
qPCR: PCR cuantitativa en tiempo real
RE: Retículo endoplasmático
RIDD: Decaimiento regulado dependiente de IRE1
RIP: Proteolisis intra-membrana regulada
RPMI: Medio Roswell Park Memorial Institute
TCA: Ciclo de los ácidos tricarboxílicos
TCR: Receptor de linfocitos T
Th: Linfocito T colaborador
TLR: Receptor tipo Toll
TRIF: Domain-containing adaptor-inducing interferon β
TRAF2: TNF receptor-associated factor 2
UPR: Respuesta a proteínas mal plegadas
SERCA: ATPasa de calcio del retículo endoplasmático
STAT: Signal transducer and activator of transcription
sXBP1: Proteína de unión a Caja-X
2-DG: 2-desoxi-D-glucosa
Resumen
RESUMEN
13
Las células dendríticas (CD) responden a señales procedentes del micro-entorno y
desarrollan funciones fundamentales para la defensa del individuo y la homeostasis
de los tejidos, pero que pueden ser nocivas si no se controlan adecuadamente. Sus
funciones efectoras están íntimamente ligadas a cambios en el metabolismo celular
por lo que la estimulación de las CD por patrones moleculares asociados a patógenos
(PAMP) conduce a una reprogramación metabólica cuya característica más
significativa es el aumento de la glucólisis aerobia que se refleja en la acumulación de
lactato y la acidificación extracelular.
En consonancia con estos cambios, la modulación farmacológica de la glucólisis
influye sobre el patrón transcripcional de manera dependiente del estímulo. Las
investigaciones realizadas hasta la fecha han correlacionado los cambios en la
expresión de citoquinas con las variaciones en los flujos de lactato, pero no se ha
podido explicar suficientemente la magnitud de los cambios transcripcionales
producidos lo que deja abierta la vía a nuevas investigaciones.
La inhibición de la hexoquinasa (HK) con 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) aumenta la
transcripción del gen IL23A en respuesta al patrón fúngico zymosan y al
lipopolisacárido bacteriano (LPS), y de forma paralela disminuye la transcripción del
gen IL10 en respuesta al LPS. Además de reducir los niveles de lactato, la 2-DG activa
la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) asociada al estrés de retículo
endoplasmático. La forma en la que las distintas ramas de la UPR influyen en la trans-
activación de IL23A es estímulo-dependiente: La rama IRE1α/sXBP1 está implicada
en respuesta al zymosan, y la rama PERK y el factor de transcripción C/EBPβ en el
caso del LPS. Asimismo, la disminución de la transcripción de IL10 observada en
presencia de 2-DG en respuesta al LPS depende de la activación de PERK.
La modulación de la actividad de la piruvato quinasa (PKM2) con el compuesto ML-
265 disminuye la transcripción de las citoquinas IL-23, IL-10 e IL-1β en respuesta al
zymosan. Dado que no hemos podido caracterizar un patrón metabólico inducido por
el ML-265, estos efectos pueden explicarse por la interferencia del ML-265 con la
actividad proteína quinasa asociada a la PKM2.
Introducción
INTRODUCCIÓN
17
1. El sistema inmune
La función principal del sistema inmune es el mantenimiento de la homeostasis de los
tejidos y la integridad del organismo. Para ello posee una serie de elementos
humorales y celulares que intervienen en procesos fisiológicos fundamentales como
el desarrollo, la reproducción y la reparación de los tejidos, y que además son los
encargados de la defensa del organismo frente a diversos agentes (Sattler, 2017).
La respuesta defensiva depende de la capacidad que tienen las células del sistema
inmune para diferenciar “lo infeccioso no propio de lo propio no infeccioso”
(Janeway, 1992). En los mamíferos se distinguen dos modalidades de esta respuesta:
la respuesta innata y la respuesta adaptativa, aunque ambas están estrechamente
relacionadas. La respuesta inmune adaptativa incluye elementos humorales, como los
anticuerpos, y se organiza alrededor de dos clases de células especializadas, los
linfocitos T y los linfocitos B, que exhiben un amplio repertorio de receptores, TCR
(receptor de linfocitos T) y BCR (receptor de linfocitos B), cuya especificidad depende
de reordenamientos génicos que permiten un reconocimiento específico del antígeno
y la eliminación selectiva del patógeno, además de permitir la construcción de una
memoria inmunológica que protege de posibles reinfecciones.
Por el contrario, la inmunidad innata proporciona una respuesta más inmediata y no
específica, que constituye la primera línea de defensa del huésped. Está formada
también por elementos celulares (células epiteliales, monocitos, células dendríticas,
macrófagos, neutrófilos y células Natural Killer [NK]) y sistemas de activación
humorales como los sistemas del complemento, de la coagulación y de la fibrinólisis.
El componente celular está mayoritariamente compuesto por células fagocitarias y
presentadoras de antígenos (CPA). Las CPA, en especial las células dendríticas y los
macrófagos, tienen un papel fundamental en la conexión entre la inmunidad innata y
la adaptativa, ya que son las responsables de procesar y presentar antígenos a los
linfocitos T en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Figura
1). En consecuencia, la inmunidad innata tiene la función de iniciar, estimular y
polarizar la respuesta inmune adaptativa con objeto de eliminar el patógeno y
minimizar los daños causados al huésped (Medzhitov, 2007). Para ello, las células
fagocíticas, poseen receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que
INTRODUCCIÓN
18
interaccionan con los patrones moleculares asociados a patógenos expresados en los
microorganismos (Janeway, 1989) y con señales endógenas asociadas al daño tisular
(DAMP) (Matzinger, 1994). Estas moléculas activan distintas vías de señalización
intracelular que conducen a la liberación de citoquinas, quemoquinas, y otros
mediadores, que promueven la eliminación del patógeno y la activación y
polarización de la respuesta inmune adaptativa.
Figura 1. Interconexión entre la inmunidad innata y la adaptativa. Las células presentadoras de
antígenos tienen la capacidad de detectar y reconocer diferentes patógenos a través de sus receptores
de reconocimiento de patrones. Los PRR captan el antígeno para iniciar su procesamiento en pequeños
péptidos que unen a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II expresadas
en su superficie. La respuesta inmune adaptativa comienza con el reconocimiento del antígeno por los
receptores específicos de membrana de las células T. El linfocito T se activa tras reconocer el antígeno
procesado asociado con las moléculas MHC de clase II en la superficie de la CPA con dos consecuencias:
la activación de los linfocitos B por su receptor y su propia diferenciación que dependerá del patrón de
citoquinas secretado por la CPA. Figura adaptada de Cambronero et al., 2017.
Los microorganismos presentan gran cantidad de patrones moleculares asociados a
patógenos que son estructuras muy diversas altamente conservadas a lo largo de la
evolución. Ejemplo de ellos son el lipopolisacárido bacteriano y el zymosan. El LPS
presente en la membrana exterior de las bacterias Gram negativas, está formado por
dos dominios hidrofílicos y un dominio hidrofóbico. Los dominios hidrofílicos son el
núcleo central, que se compone de motivos repetidos de polisacáridos, y el antígeno
O, que es un glucano que se expone al exterior. El dominio hidrofóbico, denominado
lípido A, se compone de seis cadenas de ácidos grasos que lo anclan a la membrana y
INTRODUCCIÓN
19
es el componente biológicamente activo del LPS. El zymosan es una preparación
insoluble y particulada de la pared celular de la levadura Saccharomyces cerevisiae
que se utiliza desde hace más de 50 años como arquetipo de estímulo fagocítico e
inflamatorio. Se compone de β(1-3) y β(1-6) glucanos, α-mananos, quitinas, proteínas
y lípidos (Figura 2).
Figura 2. Composición del zymosan y del lipopolisacárido bacteriano. El zymosan está compuesto
por un 73% de polisacáridos (de fuera hacia adentro α-mananos, β-glucanos y quitina), un 15% de
proteínas frecuentemente manosiladas y un 7% de lípidos que permanecen en el interior como resto
de la membrana plasmática (Fitzpatrick y DiCarlo, 1964). El LPS está compuesto por un polisacárido
que se expone al exterior (Antígeno O), el oligosacárido nuclear y el Lípido A que contiene
fosfoglucosilmiristamida y ácidos grasos que lo anclan a la membrana.
En la denominada sinapsis fagocítica, varios componentes de la pared celular
interaccionan con distintos PRR, inician el proceso fagocitario y el material englobado
se degrada en los fagolisosomas. Ello permite la liberación de nuevos PAMP (ADN o
ARN), que a su vez pueden activar PRR intracelulares. La integración de las señales de
diferentes PRR durante la fagocitosis induce la liberación de citoquinas y mediadores
lipídicos y la regulación de genes implicados en la respuesta inmune (Blander y
Sander, 2012). De los PRR expresados en las células dendríticas, el LPS es reconocido
por el receptor tipo Toll 4 (TLR4) (Lu, Yeh y Ohashi, 2008), mientras que los
encargados del reconocimiento de los patrones fúngicos son, principalmente, los
receptores lectina tipo C, Dectin-1 que reconoce el componente β-glucano, y Dectin-2
INTRODUCCIÓN
20
y TLR2 que reconocen el componente constituido por las manosas de la pared
(Brown et al., 2003; Gantner et al., 2003; Dillon et al., 2006).
1.1 Las células dendríticas
Las células dendríticas se identificaron en 1973 por Steinman y Cohn, por su
morfología característica con pseudópodos de gran envergadura que las distinguía de
los macrófagos (Steinman y Cohn, 1973). Las CD se encuentran en los órganos
linfoides secundarios, en la mayoría de los tejidos periféricos y también en órganos
no linfoides, como la piel, los músculos, los pulmones, los riñones, los intestinos o el
hígado. Por ser células presentadoras de antígeno están equipadas con la maquinaria
para capturar y procesar antígenos, presentarlos a los linfocitos T y proporcionar
señales co-estimuladoras (moléculas de membrana y citoquinas) que polarizan la
respuesta inmunitaria (Steinman, 1991).
Las CD son una población heterogénea compuesta de varios subconjuntos distintos:
CD convencionales (cDC), células de Langerhans, células dendríticas plasmocitoides
(pDC) y células dendríticas derivadas de monocitos (moDC). Estos grupos se
separaron inicialmente de acuerdo con su fenotipo de superficie, pero se ha
demostrado que los subconjuntos de CD se pueden distinguir aún más por su
ontogenia y firma transcriptómica (Merad et al., 2013). Cuando se produce una
infección, aparecen en el foco inflamatorio las denominadas células dendríticas
inflamatorias, que se producen a partir de la diferenciación de los monocitos
reclutados al foco inflamatorio (León, López-Bravo y Ardavín, 2007). Estas células
dendríticas inflamatorias aparecen en respuesta a patógenos (Domínguez y Ardavín,
2010) y en enfermedades de base inflamatoria como el asma (Hammad et al., 2010) o
la artritis reumatoide (Campbell et al., 2011). La firma genética de las células
dendríticas inflamatorias es similar a la de las células dendríticas derivadas de
monocitos generadas in vitro (moDC), por lo que éstas serían sus homólogos (Segura
et al., 2013). El proceso de diferenciación de monocitos a células dendríticas se
controla por citoquinas que actúan como factores de crecimiento y diferenciación por
lo que en presencia del factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos
(GM-CSF) e interleuquina-4 (IL-4) se pueden generar moDC in vitro. Estas células
poseen la capacidad de capturar y procesar antígenos, y presentan en su superficie
INTRODUCCIÓN
21
altos niveles de MHC, CD1, FcγRII, CD40, complejo B7 (CD80/CD86), CD44, ICAM-1 y
CD11c y escasa expresión de CD14 (Sallusto y Lanzavecchia, 1994).
Cuando entran en contacto con el patógeno, las CD se someten a un programa de
cambios fenotípicos y moleculares denominado "maduración". El proceso de
maduración produce la disminución de la capacidad fagocitaria, la translocación a la
membrana plasmática de moléculas MHC de clase II, la secreción de citoquinas y la
migración hacia los ganglios linfáticos (Banchereau et al., 2000). La presentación de
los péptidos antigénicos en el MHC II a los linfocitos T vírgenes o naive junto con el
patrón de citoquinas liberado por la CD, en función del patógeno detectado, polarizan
la respuesta inmune adaptativa pudiendo diferenciar los linfocitos T colaboradores
(Th) a linfocitos Th1 (León, López-Bravo y Ardavín, 2007; Nakano et al., 2009),
linfocitos Th2 (Kool et al., 2008; Hammad et al., 2010), linfocitos Th17 (Segura et al.,
2013) o linfocitos Treg (Figura 3).
Figura 3. Polarización de la respuesta inmune adaptativa. La activación de las células dendríticas a
través de la mayoría de los TLR induce una robusta producción de IL-12p70 y la inducción de
respuestas Th1. En contraste, algunos ligandos de TLR2 inducen escasa producción de IL-12p70 y
abundante IL-10 por lo que inclinan el equilibrio hacia las respuestas Th2 o Treg. La señalización a
través de Dectin-1 induce la producción de IL-23 que se asocia con la inducción de una respuesta de
tipo Th17. Figura tomada de Pulendran, 2015.
INTRODUCCIÓN
22
1.2 Citoquinas implicadas en la polarización de la respuesta inmune
Las citoquinas son pequeñas proteínas secretadas por las células del sistema
inmunitario que se unen a receptores de membrana de las células diana y
desencadenan cambios en la expresión génica y en el fenotipo que determinan las
características de la respuesta inmune (Blanco et al., 2008). Las citoquinas se pueden
clasificar por sus propiedades estructurales o funcionales. Se ha descrito que la
estimulación del TLR2 y de los receptores de lectina tipo C con zymosan induce una
fuerte producción de IL-23 e IL-10, mientras que estas citoquinas se producen en
menor medida tras la estimulación del TLR4 por LPS (Gerosa et al., 2008; Dennehy et
al., 2009). Asimismo, los glucanos favorecen la producción de IL-1β (Kankkunen et al.,
2010).
La interleuquina 10
La interleuquina 10 es un modulador negativo de la respuesta inmune. Su
importancia en el control de la respuesta inflamatoria se descubrió tras observarse
que ratones deficientes en IL-10 sufrían colitis no remitente en respuesta a la
microbiota intestinal (Kühn et al., 1993). La IL-10 puede regular directamente la
inmunidad innata y adaptativa a través de varios mecanismos, entre los que se
incluyen: la limitación de la activación y diferenciación de las células T en los ganglios
linfáticos, la supresión de la respuesta pro-inflamatoria en los tejidos, el control de la
eliminación de patógenos y la reducción del daño tisular (Couper, Blount y Riley,
2008). La IL-10 se produce por numerosos tipos celulares del sistema inmune, entre
los que se incluyen las células dendríticas, los macrófagos y los linfocitos T y B. Entre
sus efectos, típicamente anti-inflamatorios, se destaca su capacidad para reprimir la
producción de citoquinas pro-inflamatorias por las células del sistema inmune
bloqueando la respuesta Th1 (Fiorentino, Bond y Mosmann, 1989) y promoviendo
una respuesta Th2 o Treg.
El estudio de la regulación de la producción de IL-10 se ha centrado en el análisis de
mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales. El papel de la regulación
post-transcripcional se ha destacado porque el ARNm de la IL-10 contiene un alto
número de elementos ricos en AU en la zona 3´-UTR (3’-untranslated region) que
pueden unir la proteína desestabilizadora tristetraprolina, implicada en la
INTRODUCCIÓN
23
degradación del ARNm (Powell et al., 2000; Stoecklin et al., 2008). En cuanto a los
mecanismos transcripcionales, actualmente se acepta el papel central del factor de
transcripción CREB y sus co-activadores (Alvarez et al., 2009; Kelly, Wang e Ivashkiv,
2010; Mellett et al., 2011). La actividad de CREB depende de sus co-activadores CBP y
CRTC/TORC2 y puede regularse por varias quinasas incluyendo la glicógeno sintasa
quinasa 3β (GSK3β). Esta serina-treonina quinasa regula negativamente la actividad
de CREB al disminuir su capacidad de unión al ADN (Grimes y Jope, 2001). La
actividad de GSK3β se relaciona también con la retención de CRTC/TORC en el
citoplasma de las células al favorecer la actividad de quinasas activadas por AMP
como SIK2 (Katoh et al., 2006). En consecuencia, la inhibición de GSK3β favorece la
unión de CREB al sitio CRE presente en el promotor de IL10, el reclutamiento de CBP
y la translocación de CRTC/TORC2 al núcleo para la formación del complejo nuclear
P-CREB/TORC2/CBP que es necesario para la trans-activación de IL10 (Alvarez et al.,
2009). En el caso del LPS se ha descrito también la participación de STAT3 y un ciclo
autocrino dependiente de interferón β (IFN-β) e IRF3 (IFN regulatory factor 3)
(Chang et al., 2007) mientras que en respuesta al zymosan la activación por
fosforilación de STAT3 depende de otros mediadores secundarios y no se relacionaría
con la producción de IL-10 (Rodríguez et al., 2017).
El estudio de los mecanismos de regulación de la transcripción de IL10 puede tener
importancia clínica porque el descontrol de la producción de IL-10 es una estrategia
utilizada por algunos microorganismos patógenos, como los hongos, para evadir el
sistema inmune. Actualmente se está produciendo un aumento de la incidencia de
micosis invasivas como consecuencia del extendido uso de antibióticos, el elevado
número de pacientes inmunosuprimidos y la aplicación de técnicas de diagnóstico
intervencionistas. El hongo que más frecuentemente se aísla en los pacientes es
Candida, aunque Aspergillus, Cryptococcus y Pneumocystis, son también patógenos
oportunistas de relevancia en pacientes inmunodeprimidos. La candidiasis es una de
las principales causas de las infecciones sistémicas adquiridas en el hospital y, a pesar
de la terapia anti fúngica, al menos el 30% de los individuos afectados fallecen por
esta causa (Horn et al., 2009).
INTRODUCCIÓN
24
La interleuquina 23
La IL-23 es una citoquina pro-inflamatoria que favorece la proliferación y
diferenciación de células Th17. Forma parte de la familia de citoquinas de IL-12 como
la IL-12p70, con la que comparte la subunidad p40 (codificada por el gen IL12B). La
dimerización de p40 con una subunidad de 19 kDa (gen IL23A) da lugar a la IL-23. Al
igual que la sub-unidad específica de la IL-12 p70, p35 (gen IL12A), p19 no se secreta
si no está asociada a la cadena p40 (Oppmann et al., 2000). La modulación de la
transcripción de las subunidades específicas (p35 y p19) es el principal mecanismo
de regulación del balance entre IL-12p70 e IL-23 y es de suma importancia en la
polarización de la respuesta inmune a los tipos Th1 y Th17 (Figura 4).
Figura 4. Esquema de la estructura de IL-23 e IL-12p70, receptores y vías de señalización. La IL-
12 se compone de las subunidades IL-12/23p40 e IL-12p35. La IL-23 incluye IL-23p19 e IL-12/23p40.
La IL-12 señaliza a través de las subunidades IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2 y la IL-23 a través de las
subunidades IL-12Rβ1 e IL-23R. La estimulación de los receptores de IL-12 conduce a la fosforilación
de STAT4 a través de la actividad de las quinasas JAK2 y TYK2. La IL-23 también activa la vía JAK-STAT
pero actúa principalmente sobre STAT3. La IL-12 induce la producción de IFN-γ, que se requiere para
el desarrollo de la respuesta inmune Th1 mientras que IL-23 induce IL-17A, IL-17F y/o IL-22 y
estabiliza las células Th17. Figura tomada de Teng et al., 2015.
El estudio de los factores de transcripción implicados en la regulación transcripcional
de IL23A ha demostrado que el zymosan aumenta la unión del miembro de la familia
NF-B, c-Rel al promotor de IL23A junto a la quinasa MSK1 y al co-activador CBP. Esto
permite la fosforilación temprana de la serina 10 de la histona H3, lo que genera
condiciones óptimas para la activación de la transcripción. Por el contrario, el LPS
INTRODUCCIÓN
25
tiene un efecto más débil sobre la unión de c-Rel al promotor de IL23A y produce su
unión al promotor de IL12A. Estas diferencias en la intensidad de ocupación de los
promotores por c-Rel explican la especificidad de la respuesta a los distintos
estímulos, de forma que el LPS produce principalmente IL-12p70 y el zymosan IL-23
(Alvarez et al., 2012). Además de la implicación de c-Rel, la activación de la
transcripción de IL23A con zymosan requiere la participación de otros factores como
ATF2, que se regula mediante dos fosforilaciones complementarias que dependen de
las proteínas quinasas C y A (PKC y PKA). La cascada Ras/Raf/MEK/ERK fosforila la
treonina 71 y la MAPK p38 fosforila la treonina 69 (Rodríguez et al., 2014). En
experimentos en células murinas estimuladas con LPS, se ha descrito el reclutamiento
de otros factores de transcripción al promotor de Il23a como CREB y C/EBP (Kocieda
et al., 2012), XBP1 (Wang et al., 2013) o CHOP/DDIT3 (Goodall et al., 2010). La
posible implicación XBP1 y CHOP tiene especial interés ya que son factores de
transcripción que participan en la respuesta a proteínas mal plegadas que se produce
en condiciones que implican estrés de retículo endoplasmático.
La hiperactivación de linfocitos T con fenotipo Th17 es un factor patogénico de varias
enfermedades autoinmunes (McGeachy y Cua, 2007), entre las que se incluyen la
esclerosis múltiple (Cua et al., 2003), la psoriasis (Lee et al., 2004) y la artritis
reumatoide (Singh, Aggarwal y Misra, 2007). La inhibición de citoquinas con
anticuerpos monoclonales se ha convertido en una buena terapia para el tratamiento
de enfermedades autoinmunes, lo que explica el desarrollo de tratamientos con los
anticuerpos humanizados frente a IL-12 p40, ustekinumab y briakinumab, aprobados
para el tratamiento de la psoriasis y de la artritis psoriásica (Teng et al., 2015) y que
se estén llevando a cabo numerosos ensayos clínicos con anticuerpos frente a la
cadena p19, como el LY2525623, para el tratamiento general de otras enfermedades
autoinmunes. Dado que la susceptibilidad genética a la enfermedad muchas veces no
está directamente asociada con las citoquinas o sus receptores sino con elementos
claves en las rutas de señalización, incidir directamente en el mecanismo patogénico
efector podría ser más beneficioso (Liu et al., 2013). Del mismo modo, conocer estas
cascadas de señalización puede ser importante para potenciar la producción de IL-23
en los casos en que la respuesta Th 17 sea deficiente, como ocurre en algunos
procesos cancerosos (Zou y Restifo, 2010) e infecciones fúngicas como las producidas
por Candida albicans. Además, algunos autores relacionan el fenotipo Th17 con el
INTRODUCCIÓN
26
crecimiento tumoral (Grivennikov et al., 2012) aunque es un tema controvertido ya
que también se ha descrito que los linfocitos Th17 pueden potenciar una respuesta
antitumoral (Martin-Orozco et al., 2009). Estos datos justifican la relevancia clínica
del estudio de los mecanismos de regulación de la producción de IL-23.
La interleuquina 1β
De forma opuesta a la IL-10, y al igual que la IL-12 p70 y la IL-23, la interleuquina 1β
(IL-1β) es una citoquina pro-inflamatoria producida predominantemente por
monocitos y macrófagos que se ha relacionado con la polarización de los linfocitos al
tipo Th17 en el micro-entorno tumoral (Kryczek et al., 2009). Esta citoquina es una
diana para el tratamiento de enfermedades inflamatorias con anticuerpos como el
canakinumab (anti-IL-1β) y el receptor soluble anakinra. La IL-1β se produce en
forma de precursor inactivo (pro-IL-1β) que debe sufrir un procesamiento enzimático
para producir la proteína activa. Este proceso está regulado por unas plataformas
proteicas denominadas inflamasomas. Las caspasas intracelulares son unas de las
principales enzimas encargadas de este procesamiento. En respuesta a distintas
señales, los inflamasomas se ensamblan mediante interacciones proteína/proteína y
la formación del complejo desencadena la activación de las caspasas. El estrés de
retículo también se ha relacionado con la producción de la IL-1β a través de la
activación del inflamasoma NLRP3 en la ateroesclerosis (Hoseini et al., 2018), o por la
activación de TRIF y la caspasa-8 en macrófagos estimulados con LPS (Shenderov et
al., 2014).
2. Reprogramación metabólica en el sistema inmune
La conexión entre el metabolismo y las funciones de las células del sistema inmune se
describió a principios de los años 60 al observarse que el bloqueo de rutas
metabólicas utilizadas para obtener energía generaba cambios en las funciones de las
células inmunitarias (Oren et al., 1963). En los últimos años, el papel fundamental del
metabolismo energético en la determinación de la función de las células inmunitarias
ha alcanzado gran relevancia, lo que ha conducido a la definición del
"Inmunometabolismo" como un nuevo campo de investigación (Pearce y Pearce,
INTRODUCCIÓN
27
2013). El metabolismo celular se considera actualmente un elemento fundamental de
la respuesta inmune que puede conducir al desarrollo de pequeñas moléculas que por
su participación en distintas rutas metabólicas pueden tener aplicaciones
terapéuticas (O'Neill, Kishton y Rathmell, 2016).
Las rutas metabólicas cumplen generalmente tres funciones principales: i)
generación de energía, ii) producción de “bloques de construcción” necesarios para el
mantenimiento y la proliferación celular, y iii) modulación de la respuesta celular.
Tras la activación por los PAMP, las células inmunes aumentan notablemente su
demanda de nutrientes para iniciar una respuesta inmune efectiva. El tipo y el destino
de los nutrientes utilizados por las células inmunitarias son muy diferentes y
dependen de los requisitos funcionales de la célula. Por ejemplo, la presentación de
antígenos por las células mieloides precisa la producción de lípidos y ácidos nucleicos
obtenidos a través de la reutilización de intermediarios de las rutas metabólicas
(O'Neill y Pearce, 2016). Además, algunos metabolitos funcionan como moléculas de
señalización durante la estimulación celular (Haas et al., 2016).
La reprogramación metabólica de las células dendríticas y los macrófagos se ha
estudiado detalladamente en respuesta al LPS. En este caso se produce un cambio
caracterizado por la caída de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y el aumento de la
producción de lactato a partir del piruvato generado en la glucólisis, a pesar de la
presencia de oxígeno en cantidad suficiente (Kelly y O'Neill, 2015). Este cambio es
similar a la firma metabólica descrita en las células tumorales denominada efecto
Warburg (Warburg, 1956) (Figura 5). Estas observaciones han permitido elaborar la
hipótesis de que el efecto Warburg es una característica general de las células
mieloides activadas en la respuesta inmune innata. Sin embargo, pruebas recientes
sugieren una reprogramación metabólica mucho más compleja, con la activación de
diferentes vías metabólicas en las células mieloides en función del tipo de estímulo y
del contexto inmunológico (Lachmandas et al., 2016).
INTRODUCCIÓN
28
Figura 5. Efecto Warburg. En las células diferenciadas, en reposo, la glucosa se metaboliza a piruvato.
Parte del piruvato se convierte en lactato, pero la mayoría se utiliza en el ciclo de Krebs tras su
conversión en acetil-CoA. El ciclo de Krebs genera NADH y FADH2, que donan electrones a la cadena
mitocondrial de transporte de electrones para que la fosforilación oxidativa pueda progresar,
rindiendo hasta 36 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa. En células altamente proliferativas
o tumorales, el perfil metabólico cambia de la OXPHOS a la glucólisis aerobia para la obtención de ATP,
donde la mayoría del piruvato se utiliza para la producción de lactato, incluso en presencia de oxígeno,
rindiendo sólo 2 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa. A cambio de este menor rendimiento
energético, la acumulación de intermediarios glucolíticos proporciona los sustratos necesarios para la
biosíntesis de otras moléculas, por ejemplo ribosa-5-P para la síntesis de nucleótidos a través de la
ruta de las pentosas fosfato. Figura adaptada de Martínez-Costa, 2015.
2.1 La ruta glucolítica
La naturaleza del estímulo tiene un efecto importante sobre la reprogramación
metabólica de las células mieloides. Esto se explica por la diversidad de patrones
presentes en los distintos microorganismos y el reclutamiento selectivo de rutas de
señalización específicas. No obstante, el aumento del flujo glucolítico en células
dendríticas tras su estimulación es una constante (Kelly y O'Neill, 2015). La glucólisis
comienza con la captación de glucosa y su procesamiento en el citosol hasta la
formación de piruvato. La vía glucolítica es relativamente ineficaz desde el punto de
vista energético, puesto que produce dos moléculas de ATP por cada glucosa
incorporada. Sin embargo, es beneficiosa para las células ya que en ella se produce la
reducción de NAD+ a NADH y pueden desviarse numerosos intermediarios
metabólicos a rutas anabólicas, tales como la síntesis de ácidos grasos, de
aminoácidos y de nucleótidos. El piruvato tiene dos destinos principales: la
INTRODUCCIÓN
29
conversión en lactato en una reacción catalizada por la enzima lactato
deshidrogenasa (LDH) o, alternativamente, entrar en la mitocondria a través del
transportador de piruvato mitocondrial 1 (MPC1) para su conversión en acetil-CoA
por el complejo piruvato deshidrogenasa (PDH) (Figura 6).
Figura 6. Principales rutas metabólicas en células dendríticas. La vía de la glucólisis permite la
importación de glucosa y su conversión a piruvato en el citosol. El piruvato tiene dos posibles destinos.
El primero es la conversión en lactato por la LDH, que produce NAD+ que puede reutilizarse para la
producción de ATP en la glucólisis (flecha punteada). Alternativamente, el piruvato entra en la
mitocondria a través del transportador MPC1, donde el complejo piruvato deshidrogenasa lo convierte
en acetil-CoA. En la mitocondria, el acetil-CoA se incorpora al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y
conduce a la producción de NADH y FADH2, que sirven como sustratos para la cadena de transporte de
electrones (ETC), y por lo tanto mantienen la fosforilación oxidativa y la producción de ATP. Las células
inmunes utilizan, además, tres vías adicionales para satisfacer sus demandas metabólicas y
funcionales: la ruta de las pentosas fosfato (PPP), la glutaminólisis y la oxidación de ácidos grasos. La
G-6-P es el punto de entrada para la PPP, que genera ribosas para la síntesis de nucleótidos. Durante la
glutaminólisis, la glutamina se metaboliza a glutamato y posteriormente a α-cetoglutarato, que puede
incorporarse al TCA. El destino de la glutamina depende del estado de activación de la célula inmune.
Puede oxidarse completamente para generar ATP o usarse “in reverse” para reponer los intermedios
metabólicos del TCA, puesto que el citrato en estas células se exporta de la mitocondria para generar
acetil-CoA en el compartimento citoplasma/núcleo que se utiliza en reacciones biosintéticas. La β-
oxidación de los ácidos grasos produce acetil-CoA, que ingresa en el TCA para generar ATP. Figura
tomada de Pearce y Everts, 2015.
INTRODUCCIÓN
30
Los datos disponibles indican que las células no mejoran la actividad glucolítica
simplemente regulando la expresión de las enzimas de la ruta para acelerar las
reacciones y los mecanismos moleculares que explican este cambio aún no han sido
completamente establecidos. La mayoría de la investigación dedicada a explicar estos
mecanismos se ha llevado a cabo en células tumorales, las cuales muestran una
reprogramación metabólica similar a la descrita en las células del sistema inmune,
como son el aumento de la glucólisis y la glutaminólisis y la disminución de la
OXPHOS. En la terapia anti-tumoral se están probando numerosos compuestos que
actúan sobre enzimas claves de la vía glucolítica, como la hexoquinasa y la piruvato
quinasa por su implicación en el cambio metabólico requerido para la proliferación
de estas células (Akins, Nielson y Le, 2018). A pesar de que este tema ha sido menos
estudiado en células dendríticas, el consenso actual es que ambas enzimas están
implicadas en el cambio metabólico que se observa en las células del sistema inmune
(Everts y Pearce, 2014; Pearce y Everts, 2015).
La hexoquinasa
La hexoquinasa es una enzima específica de tejido que fosforila la glucosa a glucosa-6-
fosfato (G-6-P). La formación de G-6-P es la primera reacción de la glucólisis y
también el punto de partida de la vía de las pentosas fosfato, una vía metabólica
paralela a la glucólisis, que genera NADPH, pentosas y ribosa-5-fosfato, un precursor
para la síntesis de nucleótidos. Se han descrito cuatro isoformas de HK en mamíferos.
Las hexoquinasas I, II y III tienen un tamaño de aproximadamente 100 kDa y
comprenden dos dominios hexoquinasa (N y C-terminal), con una secuencia
altamente homóloga. Además, comparten varias propiedades incluida una alta
afinidad por la glucosa, incluso en bajas concentraciones (por debajo de 1 mM), y la
inhibición por el producto de reacción glucosa-6-fosfato. La hexoquinasa IV o
glucoquinasa tiene un tamaño aproximado de 50 kDa, posee un único dominio
hexoquinasa y se caracteriza por su baja afinidad por la glucosa (Li et al., 2014). La
mayoría de las hexoquinasas se expresan ampliamente aunque las distintas isoformas
predominan en algunos tejidos. La HK-I se expresa de forma ubicua y es más
abundante en el cerebro y el riñón. La HK-II se expresa en niveles altos sólo en un
número limitado de tejidos adultos como el adiposo (Wilson, 2003). La HK-III se
expresa en principalmente en el bazo y los linfocitos y la HK-IV es la isoforma
INTRODUCCIÓN
31
predominante en el hígado y el páncreas. La HK-II se considera la forma de HK
inducible, ya que su expresión puede aumentar aproximadamente 100 veces en las
células Th17 y además se ha observado que su inhibición con 2-desoxi-D-glucosa
mejora la inflamación en ratones en un modelo de encefalomielitis autoinmune
experimental al facilitar la formación de células Treg y suprimir la diferenciación de
células Th17 (Shi et al., 2011). También se ha descrito que la 2-DG suprime la
activación de las células dendríticas inducida por la ocupación del receptor TLR4 que
provoca la translocación de la HK-II a la mitocondria, siendo esta translocación el
mecanismo implicado en el aumento de la glucólisis (Everts et al., 2014).
La 2-DG es un mimético de la glucosa que tiene el grupo hidroxilo de la posición 2
reemplazado por hidrógeno y que actúa como un inhibidor competitivo del
metabolismo de la glucosa (Grossbard y Schimke, 1966). En la mayoría de las células,
la HK fosforila la 2-desoxi-D-glucosa para transformarla en 2-desoxi-D-glucosa-6-
fosfato que no puede metabolizarse y se acumula inhibiendo la fosfoglucosa
isomerasa y la HK (Ralser et al., 2008) . Asimismo, por su similitud estructural con la
manosa, la 2-DG ejerce un mayor efecto competitivo con ésta que con la glucosa al
encontrarse la manosa en los tejidos en concentraciones mucho menores (Kurtoglu,
Maher y Lampidis, 2007). Este hecho tiene gran repercusión en todas las reacciones
que requieren manosa como sustrato además de glucosa, incluidas las N-
glicosilaciones de proteínas. La N-glicosilación consiste en la incorporación de un
precursor glicano formado por N-acetilglucosamina, manosa y glucosa a residuos de
asparagina (Asn) presentes en las proteínas. Por este motivo la 2-DG puede
desencadenar el estrés del retículo endoplasmático y la respuesta a proteínas mal
plegadas (Andresen et al., 2012) (Figura 7).
INTRODUCCIÓN
32
Figura 7. Esquema del mecanismo de acción de la 2-desoxi-D-glucosa. Al ser el compuesto
resultante de la pérdida del grupo hidroxilo del carbono 2 de la manosa y de la glucosa, la 2-DG
produce una disminución de los niveles de glucosa-6-P y de manosa-6-P necesarios para la formación
de UDP-N-acetilglucosamina y GDP-manosa, respectivamente. La carencia de estas moléculas puede
alterar la N-glicosilación de proteínas afectando a su plegamiento y desencadenar el estrés de retículo
endoplasmático y la respuesta a proteínas mal plegadas.
La piruvato quinasa
La piruvato quinasa cataliza el último e irreversible paso de la glucólisis: la
conversión de fosfoenolpiruvato a piruvato mediante la transferencia de un grupo
fosfato al ADP. En los mamíferos hay cuatro isoformas de la piruvato quinasa (Harada
et al., 1978) codificadas por dos genes, PKLR y PKM cuya expresión se regula por
factores específicos de tejido (Noguchi et al., 1987) y por splicing alternativo
(Noguchi, Inoue y Tanaka, 1986). El gen PKLR codifica la PKL expresada en hígado,
intestino y riñón, y la PKR, expresada en eritrocitos. El gen PKM codifica las isoformas
PKM1, que es un tetrámero constitutivamente activo (Ikeda, Tanaka y Noguchi, 1997)
expresado en muchos tejidos diferenciados, y PKM2 que se expresa universalmente
durante la embriogénesis y mayoritariamente en células en proliferación, aunque
también se ha demostrado que se expresa en tejidos diferenciados y células que no
proliferan, y se sobre-expresa en tumores (Altenberg y Greulich, 2004; Clower et al.,
INTRODUCCIÓN
33
2010). Durante la reprogramación metabólica, que tiene lugar en células inmunes
activadas y en células tumorales, la expresión de la PKM1 disminuye en favor de la
PKM2.
De las isoformas de PKM presentes en las células humanas sólo la conformación y
actividad de la PKM2 puede modificarse alostéricamente (Ikeda y Noguchi, 1998;
Ashizawa et al., 1991; Christofk et al., 2008) y se le atribuyen distintas funciones
dependiendo de su conformación y localización (Gao et al., 2012; Matsuda et al.,
2016). Sin embargo, el mecanismo molecular por el cual esta isoforma aumenta el
flujo glucolítico aún no se ha esclarecido. Mientras la forma tetramérica de PKM2 es
altamente glucolítica (Tamada, Suematsu y Saya, 2012), la forma dimérica presente
en el núcleo de las células tumorales sería responsable del efecto Warburg por su
interacción con el factor de transcripción HIF1α (Luo et al., 2011; Tennant, 2011;
Wang et al., 2014a). La interacción HIF1α/PKM2 y su influencia en el aumento de la
glucólisis se ha descrito también en macrófagos murinos (Palsson-McDermott et al.,
2015).
2.2 El factor de transcripción HIF1α
HIF es un miembro altamente conservado de la subfamilia PER-ARNT-SIM (PAS)
perteneciente a la familia de factores de transcripción hélice-bucle-hélice básica
(bHLH) (Wang et al., 1995). Para el desarrollo de su función, HIF forma un complejo
heterodimérico consistente en una subunidad α y una β. La subunidad α tiene dos
isoformas, HIF1α o HIF2α. La subunidad β es el translocador nuclear del receptor de
hidrocarburos arílicos (ARNT) y se expresa de forma constitutiva. Tras la
dimerización, el complejo HIFα/HIFβ se traslada al núcleo donde se une a los
promotores de genes diana que contienen elementos de respuesta a la hipoxia (HRE).
Esta unión inicia la transcripción de una batería de genes involucrados en la
adaptación celular a la hipoxia, el metabolismo y la función celular (Semenza, 2001).
La señalización de HIF se regula principalmente por la estabilidad de su subunidad α.
En células en reposo, HIF1α se hidroxila en residuos de prolina por las prolil-
hidroxilasas (PHD). Esta hidroxilación permite la ubiquitinación de HIF1α por la
ubiquitina ligasa de von Hippel-Lindau (VHL) E3, y el consiguiente marcaje para una
rápida degradación proteasomal. Las PHD son dependientes de oxígeno, por lo tanto,
INTRODUCCIÓN
34
en condiciones normóxicas, HIF1α se degrada continuamente, lo que explica los bajos
niveles de HIF1α detectados en condiciones basales. Por el contrario, la hipoxia inhibe
la actividad de la PHD y atenúa la hidroxilación de HIF1α, por lo que en ausencia de
degradación proteasomal, se acumula, se traslada al núcleo y aumenta la
transcripción de los genes que contienen secuencias HRE. Entre estos genes se
encuentran los de las enzimas glucolíticas hexoquinasa II y fosfofructoquinasa (Riddle
et al., 2000; Obach et al., 2004) y el de la lactato deshidrogenasa (Firth, Ebert y
Ratcliffe, 1995).
En las células inmunes la estabilización de HIF1α puede ocurrir de manera
independiente del oxígeno ya que se ha demostrado la inducción de la expresión de
HIF1α en macrófagos cultivados en condiciones normóxicas en presencia de
diferentes patógenos (Peyssonnaux et al., 2005). Del mismo modo, el LPS induce la
acumulación de la proteína HIF1α en macrófagos a través de la activación
transcripcional y traduccional, actuando independientemente de la estabilización de
HIF1α inducida por hipoxia (Blouin et al., 2004) y se ha determinado que el factor
nuclear NF-κB, que desempeña un papel central en la regulación de la respuesta
inmune a la infección, también es necesario para la respuesta transcripcional del
ARNm de HIF1α inducida por bacterias (Rius et al., 2008). Al igual que los
macrófagos, tras la estimulación de los TLR, las células dendríticas estabilizan HIF1α
(Jantsch et al., 2011) y experimentan un cambio metabólico similar al observado en
otras células inmunes activadas, lo que les permite utilizar la glucólisis aerobia para
inducir su maduración y desarrollar su función (Jantsch et al., 2008; Krawczyk et al.,
2010).
INTRODUCCIÓN
35
Figura 8. Regulación y activación de HIF1α en células del sistema inmune. Durante la hipoxia y en
repuesta a los receptores de reconocimiento de patrones, HIF1α se estabiliza y forma complejos con
HIF1β. El complejo HIF1 completo se traslada al núcleo donde se une a los elementos sensibles a
hipoxia con sus co-activadores, CBP/p300 y PKM2. Los genes con HRE en sus promotores incluyen
enzimas metabólicos y mediadores pro-inflamatorios. Bajo una tensión normal de oxígeno, y en
ausencia de estimulación, las enzimas prolil-hidroxilasas (PHD) oxidan los residuos de prolina de
HIF1α lo que conlleva el reclutamiento de la ubiquitina ligasa de von Hippel-Lindau E3 (pVHL), que
ubiquitina a HIF1α para su degradación por el proteasoma. Figura adaptada de Stothers et al., 2018.
3. El estrés de retículo endoplasmático
Los cambios en la composición del medio celular que ocurren durante la respuesta
inmune pueden perturbar gravemente la función del retículo endoplasmático (RE). El
retículo endoplasmático es una extensa red tubular-reticular separada del citosol
circundante por una bicapa lipídica: la membrana del RE. Es un orgánulo crucial para
el mantenimiento de la homeostasis del calcio y su función principal es la síntesis y el
plegamiento de proteínas secretadas y transmembrana, que constituyen
aproximadamente un tercio de todas las proteínas que se producen en la célula
(Anelli y Sitia, 2008). Tras ser traducidas por los ribosomas asociados a la membrana
del RE, las proteínas ingresan en el lumen del RE donde se produce su plegamiento,
gracias a las chaperonas. En el lumen se producen también otras modificaciones
complejas de las proteínas que incluyen, por ejemplo, la N-glicosilación y la formación
de enlaces disulfuro (Saibil, 2013; Sevier y Kaiser, 2002). Debido a que las proteínas
INTRODUCCIÓN
36
de la vía secretora a menudo median funciones de señalización cruciales, las formas
que no están correctamente plegadas se eliminan a través de un proceso de
degradación denominado degradación asociada al retículo endoplásmico (ERAD). De
esta forma las proteínas mal plegadas se trasladan al citosol para su posterior
ubiquitinación y degradación por el proteasoma 26S (Smith, Ploegh y Weissman,
2011).
Cuando la capacidad de plegamiento de las proteínas por el RE se ve superada, se dice
que las células experimentan estrés de retículo (Tabas y Ron, 2011). La respuesta a
proteínas mal plegadas es un mecanismo altamente conservado que permite a la
célula manejar el estrés del retículo endoplásmico que se produce, por ejemplo, por la
demanda secretora asociada con los cambios efectores sufridos por los fagocitos tras
su activación por los PAMP. En este sentido, se ha demostrado que la UPR tiene
funciones cruciales en la inmunidad y la inflamación habiéndose descrito su
implicación en la diferenciación, maduración, supervivencia, y presentación
antigénica de las células dendríticas (Martins et al., 2016).
3.1 La respuesta a proteínas mal plegadas
La comunicación entre el retículo endoplasmático y el núcleo en células que
experimentaban estrés por la acumulación de proteínas mal plegadas, se describió en
mamíferos por primera vez en 1988 (Kozutsumi et al., 1988). Este fenómeno se
caracterizó genéticamente en S. cerevisiae. En esta levadura, el estrés del RE regula
positivamente un conjunto de genes involucrados en el plegamiento de proteínas, y el
control de calidad y la secreción de las mismas (Cox y Walter, 1996). En vertebrados,
la UPR ha evolucionado hacia el establecimiento de una red compleja de vías de
señalización interconectadas iniciada por la estimulación de tres transductores de
señal ubicados en la membrana del RE: ATF6α, PERK e IRE1α. En condiciones
homeostáticas, los dominios luminales de estos sensores se mantienen en un estado
inactivo mediante su asociación con la proteína de unión a la inmunoglobulina (BiP;
también conocida como GRP78). Sin embargo, debido a la mayor afinidad de BiP por
las proteínas mal plegadas, cuando éstas se acumulan en el lumen del RE, BiP se
disocia de los transductores iniciándose así la señalización (Bertolotti et al., 2000; Ye
et al., 2000) (Figura 9). De este modo, la activación de la UPR desencadena dos
eventos celulares temporalmente distintos para mitigar el plegamiento incorrecto de
INTRODUCCIÓN
37
proteínas: una reacción inicial para reducir la síntesis de proteínas y mejorar la
degradación de proteínas mal plegadas y una segunda ola de regulación de la
transcripción de cientos de genes diana implicados en el control de proteostasis
global.
Figura 9. Esquema de la activación de las tres ramas de la respuesta a proteínas mal plegadas.
La visión clásica de la activación de la UPR sugiere que GRP78 se une de manera constitutiva a los
dominios luminales de ATF6, IRE1α y PERK, para secuestrarlos en forma inactiva. Cuando las proteínas
mal plegadas se acumulan en el lumen del RE, se unen a GRP78, lo que permite la liberación de los
sensores UPR y que estos activen sus vías de señalización. PERK dimeriza y se autofosforila.
Posteriormente fosforila a eIF2α, se inhibe la traducción general dependiente de Cap y permite la
traducción de ciertas proteínas como ATF4 que activa la transcripción de CHOP. Al liberarse de GRP78,
ATF6 se moviliza al aparato de Golgi para su procesamiento por las proteasas S1P y S2P y la liberación
de un fragmento citosólico que se traslada al núcleo para inducir la expresión de sus genes diana como
XBP1. IRE1 activo también oligomeriza y actúa como quinasa y endonucleasa. Uno de sus objetivos es
el ARNm de XBP1 que sufre un procesamiento para producir un factor de transcripción activo, XBP1s.
Figura adaptada de Gorman et al., 2012.
INTRODUCCIÓN
38
La rama ATF6α
ATF6α es una proteína transmembrana tipo II con un extremo N-citoplásmico que
contiene un motivo básico de cremallera de leucina. En células sometidas a estrés de
RE actúa como un factor de transcripción tras sufrir una proteólisis intra-membrana
regulada (RIP). La forma presente en el RE es de 90 kDa y tiene dos secuencias de
localización en Golgi que están enmascaradas por la unión a BiP (Shen et al., 2002).
Cuando se genera estrés en el RE, ATF6α se disocia de BiP, se traslada al Golgi y su
mitad C-terminal se escinde por la proteasa del sitio 1 (S1P). El extremo N-terminal
anclado a la membrana se escinde por la proteasa del sitio 2 (S2P) y se libera una
proteína de 50 kDa en el citosol. La proteína de 50 kDa se traslada al núcleo para
activar la expresión de genes diana de la UPR como XBP1, CHOP o GRP78 junto con
los elementos de respuesta a estrés de RE (ERSE). ATF6α también puede activar
transcripcionalmente componentes de la ERAD por heterodimerización con sXBP1
(Malhi y Kaufman, 2011).
La rama PERK
PERK es una quinasa transmembrana de tipo I que en condiciones de estrés
oligomeriza y se trans-autofosforila en el residuo treonina 981. Una vez activa inhibe
la traducción general de proteínas al interferir con el ensamblaje 5'-cap a través de la
fosforilación en la serina 51 del factor iniciador de la traducción eucariótica 2 (eIF2α)
(Harding, Zhang y Ron, 1999). Este hecho reduce la sobrecarga de proteínas que
entran en el RE de una célula estresada, pero también permite la traducción selectiva
del ARNm que codifica el factor activador de la transcripción 4 (Vattem y Wek, 2004).
ATF4 se traslada al núcleo, donde activa los genes UPR que codifican las proteínas
que son necesarias para la respuesta antioxidante y la biosíntesis y transporte de
aminoácidos. ATF4 también activa la transcripción de la proteína homóloga a C/EBP
(CHOP/DDIT3), que forma heterodímeros con ATF4 para regular los genes con
funciones en la UPR, la autofagia y la traducción del ARNm (Han et al., 2013). Además,
la fosforilación de eIF2α representa un punto de convergencia de diferentes vías de
estrés, conocidas como la "respuesta integrada al estrés", que se rige por quinasas
específicas que se activan por inflamación, infecciones virales, privación de nutrientes
y deficiencia de hemo (Pakos-Zebrucka et al., 2016).
INTRODUCCIÓN
39
La rama IRE
La rama IRE es la más arcaica y conservada de la UPR. En mamíferos se identificaron
dos genes, Ire1α e Ire1β. Ire1α se expresa ampliamente mientras que la expresión de
Ire1β se limita al epitelio intestinal aunque también podría estar presente en otros
tipos celulares (Bertolotti et al., 2001). IRE1α es una proteína transmembrana de tipo
I con doble función ya que posee actividades serina/treonina quinasa y
endoribonucleasa. En respuesta a la acumulación de proteínas mal plegadas en el RE,
el dominio luminal de IRE1α se autoasocia, permitiendo que IRE1α dimerice y se
trans-autofosforile, induciendo así un cambio conformacional que activa su dominio
RNAsa para catalizar la escisión de un intrón de 26 nucleotidos del interior del ARNm
de XBP1 (Calfon et al., 2002). Este evento de splicing no convencional es completado
por la liagasa RtcB que une los dos fragmentos del ARNm de XBP1 (Jurkin et al., 2014)
y cambia el marco de lectura abierto del ARNm para generar un factor de
transcripción estable y activo conocido como sXBP1. El dominio RNasa de IRE1α
también regula la estabilidad de múltiples ARN a través de una reacción de escisión
endonucleolítica directa que involucra secuencias específicas en un proceso conocido
como decaimiento regulado dependiente de IRE1 o RIDD (Hollien y Weissman, 2006).
Aunque XBP1 es el sustrato de IRE1α preferido, bajo condiciones profundas de estrés,
el RIDD puede ser impulsado por la formación de oligómeros de IRE1α de orden
superior que dotan de una mayor avidez por los sustratos de ARNm no XBP1 al
dominio RNasa de IRE1α (Han et al., 2009) (Figura 10).
INTRODUCCIÓN
40
Figura 10. Esquema de la vía de señalización de la rama IRE. En células sometidas a estrés, BiP se
asocia a las proteínas mal plegadas e Ire1 se activa debido a los cambios conformacionales inducidos
por la dimerización de monómeros y la trans-autofosforilación. Los oligómeros de orden superior, que
podrían formarse con estímulos de estrés adicionales, refuerzan la actividad RNasa de Ire1. Ire1
activado media el splicing del ARNm de XBP1 en eucariotas superiores. Ire1 también puede actuar por
vías alternativas. Ire1 fosforilado se asocia con TRAF2 y activa la ruta JNK a través de ASK1. Además
mediante el RIDD, Ire1 degrada los ARNm localizados en la membrana del RE a través de su actividad
RNasa, lo que conduce a una reducción en la cantidad de proteínas en el lumen del RE. Figura tomada
de Coelho y Domingos, 2014.
Los genes diana de sXBP1 pueden variar según el tipo de tejido y los estímulos, ya
que, sXBP1 tiene la capacidad de interactuar con otros factores de transcripción
formando heterodímeros (Hetz, 2012). El eje de señalización IRE1α/XBP1, por lo
tanto, influye en muchas vías de señalización que anteriormente se creía que estaban
fuera del alcance del programa tradicional de UPR. Además, la aplicación más reciente
de las técnicas globales de creación de perfiles de ARNm ha expandido enormemente
las dianas transcripcionales directas de XBP1 conocidas que abarcan, entre otras, el
metabolismo de los lípidos (Lee et al., 2008), las citoquinas pro-inflamatorias
(Martinon et al., 2010), la vía de respuesta a la hipoxia HIF1α (Chen et al., 2014), o la
ruta de síntesis de hexosaminas (Wang et al., 2014b). Esta extensión funcional se ha
asignado también a otros factores de transcripción activados por la UPR como CHOP,
aunque el número de estudios es más escaso.
Objetivos
OBJETIVOS
43
El objetivo general ha sido caracterizar la reprogramación metabólica que sufren las
células dendríticas estimuladas por patrones moleculares asociados a patógenos y
determinar los efectos que la modulación del metabolismo de la glucosa tiene sobre la
regulación transcripcional de la producción de citoquinas. Para ello se establecieron
los siguientes objetivos específicos:
1. Caracterizar la reprogramación metabólica en células dendríticas
estimuladas con zymosan y con LPS:
1.1 Determinar el perfil metabólico inducido por la estimulación de las CD.
1.2 Estudiar los posibles mecanismos implicados en la reprogramación metabólica
de las CD.
2. Analizar los efectos de la modulación del metabolismo de la glucosa sobre la
expresión de citoquinas en células dendríticas estimuladas con zymosan y
con LPS:
2.1 Determinar el efecto de la privación de glucosa sobre la transcripción de IL-23,
IL-10 e IL-1β e identificar los mecanismos moleculares involucrados en el
cambio transcripcional observado, lo que incluye:
Estudiar el efecto de la modulación farmacológica del metabolismo energético
sobre los niveles de lactato y la producción de citoquinas.
Estudiar la implicación de la respuesta a proteínas mal plegadas.
2.2 Determinar el efecto de la regulación farmacológica de la actividad de la enzima
PKM2 sobre la transcripción de IL-23, IL-10 e IL-1β y analizar si dicho efecto es
consecuencia de cambios en su función glucolítica y/o quinasa.
Materiales y métodos
MATERIALES Y MÉTODOS
47
1. Reactivos
El MKC8866 fue donado por el Dr. John Patterson, MannKind Corporation, Valencia,
CA. El resto de reactivos fueron adquiridos a las siguientes casas comerciales:
Active Motive: Nuclear Extract Kit
Bio-Rad: Poliacrilamida
Biotium: GelRed nucleic acid stain
Calbiochem: tunicamicina
Cayman Chemical Company: ML-265
Fluca: Nonidet-P-40
GE Healthcare: Ficoll Paque
Gibco: Suero bovino fetal (FBS)
Invitrogen: TRIzol, transcriptasa inversa, oligos N6
Lonza: L-glutamina, penicilina/estreptomicina, RPMI 1640
Merck: Tris-HCl, KCl, Tris, KH2PO4, MgCl2
Miltenyi Biotec: GM-CSF murino, GM-CSF humano, IL-4
NEB: StuI
Promega: RNAsin
R&D Systems: kit ELISA IL-23
Santa Cruz: Reactivos para los estudios de inmunoprecipitación de cromatina
Scharlab: Cloroformo, isopropanol, metanol, etanol, acetonitrilo, glicina, NaCl,
Na2HPO4
Sellenckchem: GSK2606414
Sigma: albúmina de suero bovina (BSA), SyBr Green I Master Mix, Lactate assay kit
II, zymosan de Saccharomyces cerevisiae, LPS de Escherichia coli, formaldehido, 2-
desoxi-D-glucosa, tapsigargina, D-manosa, lactato de sodio, dicloroacetato (DCA),
EDTA, EGTA, dodecilsulfato sódico (SDS), ortovanadato, Tween-20, HEPES, poli-L-
lisina, Tritón, ditiotreitol (DTT), citrato sódico, β-glicerofosfato, acetato sódico
Stemcell: Optiprep
Thermo Scientific: ECL, dNTPs, disuccinimidil suberato (DSS), marcadores de peso
molecular, Hoechst 33342
Tocris: 4µ8C
MATERIALES Y MÉTODOS
48
2. Cultivos celulares
2.1 Obtención de células dendríticas humanas
Las células dendríticas se obtuvieron de células mononucleares aisladas de la capa
leuco-plaquetaria que aparece entre el plasma y los glóbulos rojos tras la
centrifugación de la sangre total, y que se denomina habitualmente según el término
inglés de buffy coat. Los concentrados sanguíneos de donantes sanos del grupo 0
fueron proporcionados por el Centro de Hemoterapia y Hemodonación de Castilla y
León, y se diluyeron en proporción 1:1 (v:v) con tampón fosfato salino (PBS) (136
mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4 pH 7,4). Se añadieron 30 ml
de esta mezcla sobre 15 ml de una solución de Ficoll Paque y se centrifugaron a 700 x
g durante 30 minutos sin freno de desaceleración para obtener en la parte superior la
fase acuosa con la mezcla de plasma y PBS, y en capas inferiores en forma sucesiva, un
anillo en el que se encuentran las células mononucleares, el Ficoll Paque y por último
los eritrocitos y los polimorfonucleares. Se recogieron 2 anillos de células
mononucleares con pipeta Pasteur en tubos Falcon y se lavaron por centrifugación a
440 x g durante 10 minutos en 50 ml de PBS. El precipitado celular se resuspendió en
3 ml de Optiprep (Iodixanol 60%) y se creó un gradiente de densidades al añadir, sin
mezclar, las fases de 7 ml de Ficoll Paque, 20 ml de una solución 1 mM EDTA, 0,5%
BSA y 33% Optiprep en tampón HEPES salino (HBS) (10 mM HEPES y 0,8% NaCl pH
7,4) y 1 ml de HBS. Se centrifugó a 700 x g durante 25 minutos sin freno de
desaceleración para obtener dos anillos celulares entre las distintas fases: en la parte
superior uno formado por monocitos y otro en la parte inferior que contiene los
linfocitos. Se recuperó el anillo de monocitos, se lavó en PBS y se repitió el proceso de
separación por gradiente de densidad para obtener una población de monocitos de
mayor pureza.
Tras realizar el recuento del número total de células, se distribuyeron 30 millones de
las mismas en placas de cultivo de 100 mm de diámetro con 5 ml de medio RPMI
1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado (FBSi), 2 mM de L-
glutamina y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Las células se dejaron adherir
durante al menos 60 minutos a 37°C en atmósfera con 5% de CO2. Transcurrido este
tiempo, se retiró por aspiración el medio con las células no adheridas y se inició el
MATERIALES Y MÉTODOS
49
proceso de diferenciación a células dendríticas inmaduras (CDi), añadiendo a 7 ml
finales del medio anterior, 800 U/ml de GM-CSF y 500 U/ml de IL-4 (Valera et al.,
2008). La incubación se mantuvo durante 5 días a 37°C en atmósfera con un
contenido de CO2 del 5% (Figura 11). El FBSi se mantuvo al 10% durante el proceso
de diferenciación y se redujo al 2% para la realización de los experimentos.
Figura 11. Esquema del proceso de obtención de células dendríticas humanas.
2.2 Obtención de células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón
Para obtener células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón (BMDC), se
diseccionaron los fémures y las tibias de ratones con fondo genético C57BL6, se
cortaron las epífisis y se extrajo la médula ósea mediante inyección de PBS frío
(Figura 12). La suspensión de células se filtró y se centrifugó 10 minutos a 400 x g.
Las células se resuspendieron en RPMI suplementado con 10% de FBSi, 2mM de L-
glutamina, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina y 10 ng/ml de GM-CSF murino y se
mantuvieron en cultivo durante 5 días a 37°C en atmósfera con 5% de CO2. Para la
realización de los experimentos el FBSi se redujo al 2%.
Los ratones Ern1f/fVav1-Cre fueron obtenidos por el Dr. Cubillos-Ruiz (Medical
College, NY, Estados Unidos) a través de una colaboración con el profesor Takao
Iwawaki (Kazanawa Medical University, Ishikawa, Japón).
Figura 12. Imágenes del
proceso de obtención de la
médula ósea de un ratón.
MATERIALES Y MÉTODOS
50
3. Análisis de la expresión génica
3.1 Extracción del ARN total
La extracción de ARN total se llevó a cabo mediante la adición de 1 ml de TRIzol a 107
CD. Tras la resuspensión en TRIzol, las células se centrifugaron a 12000 x g durante
10 minutos a 4°C para obtener el sobrenadante y eliminar los restos celulares. Para
separar la fase acuosa, que contiene el ARN, de la orgánica, que contiene el ADN y las
proteínas, se añadieron 200 µl de cloroformo, se agitó vigorosamente, y tras
mantener la mezcla 3 minutos a temperatura ambiente, se centrifugó a 12000 x g
durante 15 minutos a 4°C. La fase acuosa se suplementó con 250 µl de isopropanol y
250 µl de una disolución 0,8 M citrato sódico y 1,2 M NaCl en H2O-DEPC. La mezcla se
mantuvo 10 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional y se centrifugó
a 12000 x g a 4°C durante 10 minutos para precipitar el ARN. El precipitado se lavó
con etanol al 75% en H2O-DEPC dos veces y se dejó secar al aire. Finalmente se
resuspendió en 15 µl de H2O-DEPC. La cantidad de ARN presente en la muestra se
valoró con un NANO DROP (ratio A260/A280).
3.2 Síntesis del ADN complementario
Para la síntesis del ADN complementario (ADNc) se partió de 3 µg de ARN que se
diluyeron a un volumen final de 11,1 µl con H2O-DEPC. Tras el calentamiento durante
10 minutos a 68°C, se añadieron a cada muestra 8,9 µl de un tampón de
retrotranscripción formado por 50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3mM MgCl2, 10 mM DTT,
1 mM desoxinucleotidos trifosfato (dNTP), 15 ng/µl oligos N6, 1U/µl RNAsin y 10
U/µl de transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina (RT M-MLV). La
incubación se mantuvo a 37°C durante 1 hora.
3.3 PCR cuantitativa en tiempo real
La amplificación del ADNc se llevó a cabo con esta técnica basada en la detección
continua del producto de amplificación durante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) con un reactivo que aumenta su fluorescencia tras su unión al ADN
de doble cadena. La reacción de PCR se llevó a cabo con el equipo LightCycler® 480
empleando SyBr Green I Master, 1,5 µl de ADNc y 0,2 nM de cada cebador en placas de
96 pocillos. Las condiciones del termociclador fueron una desnaturalización inicial
MATERIALES Y MÉTODOS
51
(hot start) durante 5 minutos a 95°C seguida de 45 ciclos de tres pasos: 95°C durante
15 segundos (desnaturalización del ADN), 60°C durante 20 segundos (hibridación del
ADN) y 72°C durante 5 segundos (elongación del ADN). La curva de fusión se realizó
con el cambio paulatino de temperatura de 60°C a 95°C a razón de 0,2°C/segundo. Se
utilizó la enzima gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como gen
constitutivo para valorar la abundancia relativa de los diferentes ARNm usando el
método comparativo del 2 -ΔΔCt (Fold Increase): se determina el ciclo umbral (Ct) que
es aquél en el que la fluorescencia supera el umbral que marca que la amplificación
comienza a ser exponencial. Los resultados se expresan como la media de los Ct del
gen que se analiza con respecto a los Ct de la GAPDH (ΔCt condición x = Ct gen diana –
Ct GAPDH) y a este valor se le resta el ΔCt del control (ΔΔCt = ΔCt condición x - ΔCt
control). En las Tablas 1 y 2 se muestran las secuencias de los cebadores utilizados
para la detección de los tránscritos de humanos y de múridos.
Humanos
Nombre Secuencias (5′-3′) Sentido Antisentido
DDIT3/CHOP GCAGAGATGGCAGCTGAGTC AGCCAAGCCAGAGAAGCAGGGT
GAPDH GTCAGTGGTGGACCTGACCT AGGGGAGATTCAGTGTGGTG
HIF1α AGTGTACCCTAACTAGCCGA GTGCAGTGCAATACCTTCC
IL1B ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA GTCGGAGATTCGTAGCTGGA
IL10 GAGAACAGCTGCACCCACTT GGCCTTGCTCTTGTTTTCAC
IL12B CATGGGCCTTCATGCTATTT TTTGCATTGTCAGGTTTCCA
IL23A CATGGGCCTTCATGCTATTT TTTGCATTGTCAGGTTTCCA
PKM1 GCATCATGCTGTCTGGAGAA AACTATCAAAGCTGCTGCTA
PKM2 CTATCCTCTGGAGGCTGTGC ACGATTATGGCCCCACTGCA
XBP1 TAAGACAGCGCTTGGGGATGGA ATACCGCCAGAATCCATGGGGA
Tabla 1. Cebadores utilizados para la detección de transcritos de humanos.
Múridos
Nombre Secuencias (5′-3′) Sentido Antisentido
Gapdh GTCAGTGGTGGACCTGACCT AGGGGAGATTCAGTGGTG
Il23a AGGGAACAAGATGCTGGATT AGTAGATTCATATGTCCCGCT
sXbp AAGAACACGCTTGGGAATGG CTGCACCTGCTGCGGAC
Tabla 2. Cebadores utilizados para la detección de transcritos de múridos.
MATERIALES Y MÉTODOS
52
3.4 Análisis del splicing de XBP1
Tras realizar la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) con cebadores que abarcan las
regiones sin splicing en las condiciones anteriormente señaladas, se llevó a cabo una
electroforesis en gel de agarosa al 3%, con marcadores de peso molecular de ADN, en
la que se corrió el producto de amplificación a 100 V durante 20 minutos. Para
visualizar las bandas con y sin splicing que difieren en 26 pares de bases (pb) se tiñó
el gel con GelRed nucleic acid stain. Se usó la expresión de GAPDH como control de
carga.
3.5 Análisis de las isoformas de la piruvato quinasa
Las isoformas de la PKM se generan por el splicing alternativo de exones mutuamente
excluyentes y se diferencian en que el ARNm de PKM1 contiene el exón 9 y carece del
exón 10, mientras que el ARNm de PKM2 incluye el exón 10 y carece del exón 9. Las
qPCR se llevaron a cabo con cebadores diseñados en los exones 8 y 11 que dan un
producto de amplificación de 218 pb para la PKM1 y de 183 pb para la PKM2. Esto
permite el análisis cuantitativo de cada isoforma y la confirmación de su
identificación mediante el tratamiento del amplicón de PCR con la enzima de
restricción StuI que reconoce la secuencia AGGCT en el exón 10 y digiere el fragmento
de ARNm de PKM2 en dos productos de 149 pb y 34 pb. Para la digestión, se llevaron
5 µl del producto de PCR a un volumen final de 9 µl con un tampón 10 mM Tris-HCl
pH 7,5, 10 mM MgCl2 y 0,1 mg/ml BSA, al que se añadieron 10 U (1 µl) de StuI. La
incubación se mantuvo durante 1 hora a 37°C. Las diferentes bandas se visualizaron
tras realizar una electroforesis en un gel de agarosa al 3%, con marcadores de ADN,
teñido con GelRed nucleic acid stain.
3.6 Inmunoprecipitación de la cromatina
Con el fin de estudiar los mecanismos de regulación transcripcional, se llevaron a
cabo experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) para analizar la
unión directa de los factores de transcripción. Se utilizaron 2x107 células dendríticas
por condición a las que tras la estimulación se les añadió formaldehido (1 % final).
Las CD se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos para fijar las
uniones entre las proteínas y el ADN, y la reacción de entrecruzamiento se paró con
MATERIALES Y MÉTODOS
53
glicina 0,125 M. Tras 5 minutos de incubación se lavaron las células con PBS y se
resuspendieron en un tampón de lisis en el que se mantuvieron durante 30 minutos a
4°C. Tras la centrifugación a 400 x g durante 5 minutos, el precipitado se lavó con PBS
frío, se congeló en nitrógeno líquido y se mantuvo a -80°C durante toda la noche. A las
muestras descongeladas a temperatura ambiente se les añadieron 300 μl de un
tampón de lisis con alta salinidad y para fragmentar la cromatina se procedió a su
sonicación en un Bioruptor (Diagenode) para generar fragmentos de ADN de entre
100 y 1000 pares de bases. Tras la centrifugación a 9300 x g durante 15 minutos, se
recuperó el sobrenadante que contiene la cromatina y parte de este se utilizó como
control (input). La solución de cromatina se incubó a 4°C durante 1 hora en un
rotador orbital en presencia de 50 μl de proteína A/G Plus Agarosa para disminuir las
uniones inespecíficas. Tras eliminar las bolas por centrifugación, se añadieron 10 μg
de anticuerpo frente al factor de transcripción de interés y se incubó a 4°C en un
rotador orbital durante toda la noche. Al día siguiente se añadieron otros 50 μl de
proteína A/G Plus Agarosa, se incubó durante 2 horas a 4°C en el rotador orbital, se
centrifugó a 13400 x g durante 1 minuto y se desechó el sobrenadante. Las bolas de
agarosa se lavaron 2 veces con un tampón de alta salinidad y 4 veces con un tampón
de lavado comercial. Para romper los entrecruzamientos y liberar el ADN, se
añadieron 400 μl de un tampón de elución y se incubó a 68°C durante 2 horas. Las
muestras se centrifugaron para eliminar las partículas de agarosa y el ADN se purificó
añadiendo 400 μl de fenol/cloroformo/isoamilalcohol, se centrifugó durante 3
minutos a 14000 x g y se recuperó la fase acuosa a la que se añadió 1 ml de etanol al
100% y 40 μl de acetato sódico 3 M. Tras mantenerlo a -20°C toda la noche, se
centrifugó durante 25 minutos a 14000 x g y el ADN precipitado se lavó con etanol al
70% para ser resuspendido, finalmente, en 30 μl de H2O grado Milli-Q.
Una vez purificado el ADN, se llevó a cabo la amplificación por qPCR con cebadores
diseñados frente a distintas zonas del promotor de IL23A y de IL10 (Tabla 3). Para la
cuantificación relativa se utilizaron los Ct del input (ΔCt = Ct condición X - Ct input) y
los resultados se expresan como % del mismo aplicando la ecuación 2 -ΔCt X 100/36
en la que 36 es el factor de dilución.
MATERIALES Y MÉTODOS
54
Nombre Secuencias (5′-3′) Sentido Antisentido
IL23A Caja-X2 Proximal CTCTAGCCACAGCAACCACA GCCCGCCCTTTATACCAGCA
IL23A Caja-X2 Medial CTTAGCTGTTTCATCGATGTT CAGGAGTTCTGGGTAGTCG
IL23A Caja-X2 Distal TTCCATTGGTGTCCACCTTA CTTTAGATTAAACATTTCCAGCA
IL23A CHOP-C/EBP Proximal AGAACTCCTGGGCTTCCTAGCCAT GGCCTCATTCTGACGTCATCCA
IL23A CHOP-C/EBP Distal TAACGGTTTAGGCCCAGCTGAC TGTTGCGTGGCAGGAACTACA
IL10 Sitio CRE GGCAATTTGTCCACGTCACT TGATTTCCTGGGGAGAACAG
Tabla 3. Cebadores utilizados en los estudios de ChIP.
4. Análisis de proteínas
4.1 Obtención de extractos celulares para inmunodetecciones (Western Blot)
Extractos celulares totales
Tras ser lavadas con PBS por centrifugación, las CD se lisaron por la adición, para
5x106 células, de 50 µl de un medio compuesto por 20 mM HEPES, 40 mM β-
glicerofosfato, 2 mM ortovanadato, 10 mM EGTA, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT y 1%
Nonidet P-40 suplementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas (1 mg/ml
leupeptina, 5 mg/ml aprotinina, 0,1 M PMSF, 1 M NaF, 0,1 M pNPP, 0,1 M DTT y 200
mM ortovanadato). Tras la incubación en hielo durante 30 minutos, el lisado se
centrifugó a 4°C durante 10 minutos a 10200 x g para obtener el sobrenadante con
los extractos proteicos. La cuantificación de las proteínas se realizó mediante el
método colorimétrico descrito por Bradford (Bradford, 1976) que se basa en un
desplazamiento del máximo de absorción (entre 465-595 nm) del colorante azul de
Coomassie G-250 unido a las proteínas. La concentración de las proteínas se
determinó midiendo la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro con la ayuda
de una curva patrón construida usando BSA como estándar.
Extractos nucleares y citosólicos
La obtención de los extractos nucleares se realizó empleando el Nuclear Extract Kit de
Active Motif siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras lavar 107 células
dendríticas en 1 ml de PBS con inhibidores de fosfatasas se añadieron 300 µl de
MATERIALES Y MÉTODOS
55
tampón hipotónico y se incubaron durante 15 minutos en hielo. A continuación se
añadieron 15 µl de detergente y, tras la agitación en vortex, se centrifugó a 14000 x g
durante 30 segundos para recuperar el sobrenadante (extractos citosólicos) y el
precipitado con la fracción nuclear. Al precipitado se le añadieron 50 µl del tampón de
lisis AM1 suplementado con DTT e inhibidores de proteasas (PIC), se mantuvo 30
minutos en hielo, se centrifugó a 14000 x g durante 10 minutos y se recuperó el
sobrenadante en el que se encuentra el extracto nuclear. La cantidad de proteína se
valoró según el método Bradford.
Electroforesis en condiciones desnaturalizantes, transferencia a
membranas de nitrocelulosa e inmunodetección.
Las muestras se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes y reductoras según el procedimiento descrito por Laemmli
(Laemmli, 1970). Se cargaron de 50 a 100 µg de los correspondientes extractos,
previamente mezclados con tampón de Laemmli (60 mM Tris pH 6.8, 10 % glicerol
(v/v), 2 % SDS (p/v), 0.002 % azul de bromofenol (p/v)) suplementado con 20 mM
DTT, en geles de poliacrilamida (SDS/PAGE) a concentraciones finales de
poliacrilamida de 8, 10 o 12% en función del peso molecular de la proteína de interés.
El tampón de electroforesis estaba compuesto por 25 mM Tris, 0,2 M glicina y 1 g/l
SDS.
Tras la electroforesis a 25 mA, el contenido del gel se transfirió a una membrana de
nitrocelulosa mediante el sistema de transferencia de Bio-Rad en condiciones
húmedas a 100 V, durante 90 min, utilizando un tampón de transferencia compuesto
por 25 mM Tris, 0,2 M glicina, 20% metanol, 1 g/l SDS. Las membranas transferidas
se bloquearon por incubación con agitación suave, durante 1 hora a temperatura
ambiente en una solución compuesta por TTBS (0,05 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05%
Tween-20) y 5% BSA o 5% de leche desnatada, en función de las especificaciones del
anticuerpo primario. Tras el bloqueo se añadió el anticuerpo primario resuspendido
en su correspondiente solución de bloqueo y las muestras se mantuvieron durante
toda la noche en agitación suave a 4°C. Tras 3 lavados de 10 minutos con TTBS, se
añadió a las membranas el anticuerpo secundario, frente al anticuerpo primario,
conjugado con peroxidasa de rábano y se mantuvieron en agitación suave durante 1
hora a temperatura ambiente. Tras un nuevo lavado, se incubaron con el reactivo
MATERIALES Y MÉTODOS
56
comercial ECL que permite la detección de los anticuerpos conjugados con peroxidasa
de rábano al originar un producto quimioluminiscente. Finalmente se expusieron a
películas auto-radiográficas que se revelaron con un equipo Curix-60 de AGFA. Los
anticuerpos primarios utilizados se muestran en la Tabla 4.
Anticuerpo Casa Comercial Dilución
ATF6 Abcam 1:500
β-actina Sigma 1:5000
CHOP Santa Cruz 1:500
COX-2 Santa Cruz 1:500
eIF2α Cell Signaling 1:1000
HIF1α Novus Biologicals 1:500
Histona H3 Abcam 1:1000
PKM2 Cell Signaling 1:1000
Pro-IL1β Cell Signaling 1:1000
P-S52-eIF2α Invitrogen 1:1000
P-Ser-9-GSK3β Cell Signaling 1:1000
P-Y705-STAT3 Cell Signaling 1:1000
STAT3 Cell Signaling 1:1000
sXBP1 BioLegend 1:500
TBP Diagenode 1:30000
Tabla 4. Anticuerpos empleados en Western Blot, casas comerciales y concentraciones
utilizadas.
4.2 Cross linking de PKM2
Se sembraron 107 células dendríticas por condición y se lavaron 3 veces con PBS a pH
8. El cross linking se realizó incubando las células durante 30 minutos a temperatura
ambiente, con disuccinimidil suberato 650 µM según describió Palsson-McDermott et
al., 2015. La reacción se paró mediante la adición de 100 mM Tris-HCl pH 7,4,
manteniendo las células durante 15 minutos a temperatura ambiente. La lisis celular
se realizó en las condiciones anteriormente descritas, pero omitiendo el DTT. La
electroforesis se realizó en gel de poliacrilamida al 8% para visualizar proteínas en el
rango de 60-240 KDa.
MATERIALES Y MÉTODOS
57
4.3 ELISA
La IL-23 presente en los sobrenadantes provenientes de 106 células/ml se cuantificó
mediante un kit comercial de ELISA de la marca R&D Systems siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las células en suspensión se centrifugaron a 6000 x g
durante 30 segundos y el sobrenadante se volvió a centrifugar a 16000 x g durante 1
minuto para eliminar los restos celulares. Se añadieron 100 µl del reactivo RD1-22 a
cada pocillo y 100 µl del estándar, control o la muestra y se incubó durante 2 horas
en agitación a temperatura ambiente. Se lavó la placa 4 veces, se añadieron 200 µl del
conjugado a cada pocillo y se volvió a incubar durante 2 horas. Tras lavar de nuevo se
añadieron 200 µl de la solución sustrato y se incubó durante 30 minutos a
temperatura ambiente protegido de la luz. Por último se añadieron 50 µl de la
solución de stop y se leyó la absorbancia a 450 nm.
4.4 Microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser
Se añadieron 500 µl de una suspensión de células a una concentración de 4x105
células/ml sobre cristales de 12 mm de diámetro cubiertos con poli-L-lisina y se
dejaron adherir durante al menos 12 horas. Tras la estimulación, se lavaron con una
solución de BSA al 0,2% en PBS y se fijaron con formaldehido al 10% en PBS durante
30 minutos. Los cristales se volvieron a lavar 2 veces y se añadió Tritón al 0,3% para
permeabilizar las células. Después de incubar durante 10 minutos se realizó el
bloqueó con 10% de FBS en PBS durante 20 minutos. Los cristales se lavaron durante
5 minutos con PBS/BSA y se incubaron con los anticuerpos anti-HIF1α o anti-PKM2
(dilución 1:200 en PBS suplementado con el 1% de BSA) durante 1 hora.
Transcurrido este tiempo y tras 3 lavados de 5 minutos, se añadieron el anticuerpo
secundario (IgG anti-conejo generado en cabra marcado con Alexa-Fluor 480, dilución
1:100) y el DAPI (dilución 1:1000), para teñir los núcleos. Se lavaron por última vez
las preparaciones, se montaron sobre una gota de Gelvatol en porta-objetos de un
tamaño de 26x76 mm y se sellaron con esmalte. Los cristales se observaron usando
un microscopio Leica TCS SP5 con un láser de luz blanca y un objetivo de aceite de
inmersión Leica 63PL APO NA 1.40. El análisis de las imágenes y los fluorogramas de
co-localización subcelular se realizaron usando el paquete de software LAS AF Lite del
confocal Leica y el software Adobe Photoshop CS5.1.
MATERIALES Y MÉTODOS
58
5. Estudios bioenergéticos
El análisis bioenergético de las CD se llevó a cabo utilizando los analizadores de flujo
extracelular Seahorse Bioscience XFe24 o Seahorse Bioscience XFe96 en los
experimentos en los que las células se pre-incubaron con el compuesto ML-265. En el
primer caso, las células se estimularon con distintas concentraciones de zymosan o
LPS durante 30 minutos y 4 horas. A continuación se adhirieron 2x105 CD a placas de
Seahorse cubiertas de poli-ornitina y se analizaron la tasa de acidificación extracelular
(ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de acuerdo con el protocolo XF Cell
Mito Stress Test en medio XF (medio RPMI 1640 con 11,1 mM de glucosa, 4 mM de
glutamina y 2% de FBSi). El equipo mide las variaciones en el pH y la presión de O2
bajo condiciones basales y en respuesta a distintos compuestos que se van
adicionando secuencialmente: 1 µM oligomicina (OM) que inhibe el complejo V
mitocondrial o ATP sintasa, 1,5 µM carbonilcianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona
(FCCP) agente desacoplante que permite el paso de protones a través de la
membrana, y 100 nM rotenona /1 µM antimicina A (Rot/AA) que bloquean los
complejos I y III de la cadena de transporte de electrones mitocondrial (Figura 13).
Los datos obtenidos se normalizaron en función de la cantidad de proteína. En los
experimentos en los que se utilizó el compuesto ML-265, las células se adhirieron con
Cell-Tak a las placas de Seahorse y se pre-trataron con 50 µM de ML-265 durante 30
minutos. Tras 30 minutos de estabilización en el equipo, se inyectaron los estímulos y
se analizaron la ECAR y la OCR aplicando el protocolo anterior. En este caso la
normalización, en función del número de células, se realizó mediante la medida de la
absorbancia utilizando la tinción con Hoechst 33342.
MATERIALES Y MÉTODOS
59
Figura 13. Representación de las gráficas de la tasa de consumo de oxígeno y de acidificación
extracelular obtenidas con el Seahorse. El protocolo XF Cell Mito Stress Test permite calcular
distintos parámetros del metabolismo celular adicionando secuencialmente distintos compuestos: OM,
FCCP y Rot/AA. Mediante las variaciones de la presión de O2 provocadas se pueden calcular la
respiración basal (basal), la respiración máxima (maximum), la capacidad respiratoria de reserva
(SRC), el consumo de oxígeno destinado a la producción de ATP (ATP production), la fuga de protones
(H+ leak) y el consumo de oxígeno no debido a la respiración mitocondrial (non-mitocondrial
respiration) y mediante las variaciones de pH la glucólisis basal (glycolysis), la capacidad glucolítica
máxima (maximum glycolytic capacity) y la reserva glucolítica (glycolytic reserve).
6. Medida de lactato
6.1 Lactato extracelular
Se recuperaron los sobrenadantes correspondientes a 106 células/ml. La suspensión
celular se centrifugó a 6000 x g durante 30 segundos para precipitar las células y el
sobrenadante se centrifugó posteriormente a 13000 x g durante 10 minutos a 4°C
para precipitar el material insoluble. Se desproteinizaron 500 µL de este
sobrenadante mediante su paso por columnas MWCO de 10 kDa cut-off para eliminar
la enzima lactato deshidrogenasa y la fracción soluble se analizó utilizando el test
colorimétrico Lactate Assay Kit II de Sigma siguiendo las instrucciones del fabricante.
Con este propósito se cargaron placas de 96 pocillos con de 0,5 a 10 µl de muestra en
un volumen final de 50 µl con una mezcla de reacción compuesta por tampón de
ensayo, enzima y sustrato. La placa se incubó durante 30 minutos a temperatura
ambiente protegida de la luz y se midió la absorbancia a 450 nm.
6.2 Lactato intracelular
El lactato intracelular se midió por cromatografía líquida de ultra-rendimiento de fase
reversa y espectrometría de masas (UPLC-MS). Se realizó una extracción de
MATERIALES Y MÉTODOS
60
metabolitos mediante la lisis de las células con una mezcla metanol:acetonitrilo:agua
(2:2:1, v/v/v). Se utilizaron 2x107 CD por condición, que se lavaron con PBS por
centrifugación, previamente a la adición de 1 ml de la mezcla anteriormente descrita.
La incubación se mantuvo a 4°C y el homogeneizado celular se traspasó a tubos
Eppendorf, se agitó en vortex durante 30 segundos y se congeló en nitrógeno líquido
durante 1 minuto. Tras la descongelación a temperatura ambiente, las muestras se
sonicaron durante 15 minutos a 4°C. Después de un segundo ciclo de congelación y
sonicación el lisado se mantuvo a -20°C durante 1 hora y se centrifugó a 16000 x g
durante 15 minutos a 4°C para su desproteinización. El sobrenadante se evaporó a
sequedad en un evaporador SpeedVac y el residuo sólido se solubilizó en una mezcla
de acetonitrilo:agua (1:1, v/v). Posteriormente se sonicó durante 10 minutos a 4°C y
se centrifugó a 16000 x g durante 15 minutos para eliminar el material insoluble.
Finalmente, para el análisis por UPLC-MS, las muestras se volvieron a evaporar a
sequedad y se resuspendieron en agua Milli-Q.
La separación cromatográfica se realizó con una columna Acquity CORTECS UPLC®
C18, 1.6 µm, 2.1x100 mm (Waters) conectada a una fuente de ionización por
electrospray de un espectrómetro de masas Q-TOF SYNAPT HDMS G2 (Waters). El
gradiente de elución se hizo con dos eluyentes agua:metanol:ácido fórmico (95:5:0,1,
v/v/v) con 5 mM de formato de amonio y 100% acetonitrilo con 0,1% de ácido
fórmico y 5 mM de formato de amonio.
El análisis de los espectros de masas se calculó en el modo ión negativo para los
ácidos carboxílicos, método que permite la detección de analitos tanto de alta
(escaneo completo) como de baja energía (energía de colisión) con una
fragmentación parcial del ión.
7. Medida de los niveles de Ca2+ intracelular
Se adhirieron 2x105 células a cristales de 12 mm de diámetro cubiertos de poli-
ornitina y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 4 µM fura 2-
acetoximetil ester (FURA-2) en un medio con la siguiente composición: 145 mM NaCl,
5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM glucosa, y 10 mM HEPES, pH 7,4.
MATERIALES Y MÉTODOS
61
Posteriormente los cristales se lavaron con medio fresco y se montaron en un
microscopio Nikon Diaphot. Las soluciones test se aplicaron por perfusión continua a
2-3 ml/minuto. Para las medidas de fluorescencia, las CD se epi-iluminaron
alternativamente a 340 y 380 nm y se analizó la luz emitida a 520 nm utilizando la
Cámara Digital Hamamatsu C4742-98 con el software Hamamatsu Simple PCI 6.6. Los
fotogramas consecutivos obtenidos se cuantificaron pixel por pixel usando el software
ImageJ.
8. Análisis estadístico
Los datos obtenidos en al menos tres experimentos independientes se analizaron con
el programa estadístico Prisma (GraphPad Software) y se representan como la media
± error estándar de la media (EEM). La comparación entre dos grupos
experimentales se llevó a cabo mediante el test Student t-test de dos colas. Las
diferencias se consideraron significativas para un valor de p˂0,05.
Resultados
RESULTADOS
65
1. Reprogramación metabólica tras la estimulación de las células
dendríticas
Con el fin de estudiar los cambios metabólicos, se realizaron mediciones en tiempo
real del consumo de oxígeno y del pH del medio tras la estimulación de las CD con
distintas concentraciones de zymosan y de LPS, utilizando el analizador de flujo
extracelular Seahorse XFe24. Como se muestra en la Figura 14 (paneles B y C) ambos
estímulos produjeron un incremento de la ECAR y, en el caso del zymosan, una
tendencia al aumento de la OCR, especialmente tras 4 horas de estimulación. Este
aumento fue similar con las distintas concentraciones de estímulo utilizadas (Figura
14 A) y se observó a partir de los 30 minutos de estimulación, lo que indica que el
cambio en el perfil bioenergético caracterizado por una baja razón OCR/ECAR se
produce rápidamente y en presencia de concentraciones reducidas de los estímulos
(Figura 14 D). En concordancia con el aumento de la OCR inducida por el zymosan, el
consumo de oxígeno destinado a la producción de ATP también tendió a aumentar a
las 4 horas (Figura 14 E).
RESULTADOS
66
Figura 14. Efecto del zymosan y del LPS sobre el metabolismo bioenergético de las células
dendríticas. (A) Registros del protocolo XF Mito Stress Test Kit obtenidos en CD estimuladas con
distintas concentraciones de zymosan y de LPS. (B-E) Análisis de la ECAR y la OCR. Las CD se incubaron
durante los tiempos indicados en presencia 1 mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS y se adhirieron a
placas revestidas de poli-ornitina. Los datos se normalizaron en función de la cantidad de proteína y se
representan como la media ± EEM de tres experimentos independientes.* Indica p˂0.05 con respecto
al control.
RESULTADOS
67
El fenotipo metabólico, definido por la relación entre la OCR y la ECAR, se clasifica
como quiescente, aeróbico, energético o glucolítico en función del predominio de la
glucólisis o de la respiración mitocondrial, los resultados obtenidos muestran un
fenotipo metabólico claramente desplazado hacia la zona glucolítica, asociado con
una ligera desviación a la zona energética en el caso del zymosan (Figura 15).
1.1 Análisis del mecanismo implicado en la reprogramación metabólica
Uno de los mecanismos que promueven el aumento de la glucólisis, incluso en
situaciones de normoxia, es la activación del factor de transcripción HIF1. Esto se
debe a la estabilización de su subunidad HIF1α y a la subsiguiente inducción de la
expresión de genes que codifican enzimas implicadas en la glucólisis. En macrófagos y
algunos tipos de células tumorales la actividad de HIF1α depende de la formación de
un complejo en el núcleo con la PKM2. Asimismo, la PKM2 puede actuar como
proteína quinasa y fosforilar STAT3 (Gao et al., 2012), por lo que genera un bucle de
retroalimentación positiva puesto que a su vez, P-Y705-STAT3 activa la transcripción
de HIF1α (Dang et al., 2011; Shehade et al., 2015). Sobre estas bases, se procedió a
estudiar la posible participación de estas proteínas en la inducción de los cambios
metabólicos.
Las distintas isoformas de la PKM catalizan el último paso de la glucólisis, consistente
en la conversión del fosfoenolpiruvato en piruvato. En las células inmunes en reposo
y en los tejidos diferenciados, esta reacción está mediada por PKM1. Sin embargo,
durante la reprogramación metabólica que se produce en células inmunes activadas,
la expresión de PKM1 puede disminuir en favor de PKM2. Con el fin de estudiar la
expresión de las isoformas de PKM generadas por splicing alternativo de exones
Figura 15. Fenotipo metabólico de las
células dendríticas. Representación del
fenotipo metabólico tras 30 minutos de
estimulación con 1 mg/ml de zymosan o
10 µg/ml de LPS. Los resultados se
representan como la media de tres
experimentos independientes.
RESULTADOS
68
mutuamente excluyentes, se analizó su ARNm mediante qPCR con dos pares de
cebadores que generan productos distinguibles por el número de pares de bases.
Además, sus amplicones difieren en la presencia en el transcrito de PKM2 de un sitio
de restricción StuI que permite su digestión en dos productos de 149 pb y 34 pb. La
normalización del ARNm de las isoformas de PKM con respecto a la GAPDH mostró
una expresión preferencial del ARNm de PKM2 frente a PKM1 (Figura 16 A). La
diferente migración de las dos isoformas y su distinta sensibilidad al tratamiento con
StuI se muestran en la Figura 16 B. El estudio de la expresión de la proteína mediante
microscopía confocal mostró una alta expresión de PKM2 en el núcleo y en el
citoplasma de las CD estimuladas con zymosan (Figura 16 C).
Figura 16. Expresión de las isoformas de PKM. (A y B) Tras 5 días de diferenciación en presencia de
GM-CSF e IL-4 se extrajo el ARNm de las CDi y se analizó mediante qPCR. (A) Expresión del ARNm de
las isoformas de PKM con respecto a la GAPDH. Los resultados se representan como la media ± EEM de
cuatro experimentos independientes. (B) Digestión por StuI del amplicon de PKM2. El resultado es
representativo de cuatro experimentos independientes. (C) Imagen de microscopía de fluorescencia
confocal de la enzima PKM2. Las células se estimularon con 1 mg/ml de zymosan durante 4 horas.
Con la intención de determinar los niveles de expresión de HIF1α y la activación de
STAT3, mediante la detección de la proteína fosforilada, se realizaron experimentos
de qPCR y Western Blot. El zymosan y el LPS activaron la fosforilación de la tirosina
705 de STAT3 (Figura 17 B) y aumentaron la expresión del ARNm de HIF1α y la
RESULTADOS
69
estabilización de la proteína (Figura 17 paneles A y B). El patrón temporal de
fosforilación de STAT3 y de expresión de HIF1α fue diferente para cada estímulo
(Figura 17 B). En el caso del zymosan se apreció una clara fosforilación de STAT3 a las
4 horas que coincidió con la detección de HIF1α a ese tiempo, aunque la expresión de
HIF1α alcanzó una mayor intensidad a las 7 horas, para disminuir posteriormente. En
el caso del LPS, la fosforilación de STAT3 a las 4 horas fue menos evidente, al igual
que la expresión de HIF1α que alcanzó su máximo nivel de expresión a las 24 horas.
La estabilización y translocación nuclear de HIF1α en respuesta al zymosan se
confirmó mediante estudios de inmunofluorescencia de microscopía confocal (Figura
17 C).
Figura 17. Expresión de HIF1α y fosforilación de STAT3. Las CD se estimularon con 1 mg/ml de
zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 4 horas (A y C) o los tiempos indicados (B). (A) Análisis de la
inducción del ARNm de HIF1α mediante qPCR. Los resultados se representan como la media ± EEM
de cinco experimentos independientes.* Indica p˂0,05 con respecto al control. (B) Expresión de
HIF1α y fosforilación de STAT3 en fracciones nucleares. Los extractos proteicos se analizaron
mediante Western Blot. Se utilizó la proteína de unión a la caja TATA (TBP) como control de carga. El
resultado es representativo de dos experimentos independientes. (C) Imagen de microscopía de
fluorescencia confocal del factor de transcripción HIF1α.
RESULTADOS
70
Tomados en conjunto, estos resultados muestran la presencia de estas proteínas en
los núcleos de las CD estimuladas con zymosan y LPS. A pesar de que el patrón
temporal de la estabilización de HIF1α no explicaría los cambios en el perfil
bioenergético que se observan a los 30 minutos, los resultados sugieren una posible
implicación en el mantenimiento del mismo.
RESULTADOS
71
2. Modulación del metabolismo de la glucosa y regulación
transcripcional de la producción de citoquinas en células
dendríticas
El cambio más significativo que se encontró en el metabolismo de las CD estimuladas
por PAMP fue el aumento de la ECAR que se explica por el incremento de la
concentración de lactato extracelular como consecuencia del aumento de la glucólisis
aerobia (Krawczyk et al., 2010; Everts et al., 2012; Kelly y O'Neill, 2015). Por este
motivo se decidió realizar experimentos de modulación del flujo glucolítico con el fin
de modificar los niveles de lactato y analizar su posible papel sobre la expresión de
citoquinas, prestando especial atención a la citoquina IL-23. En la Figura 18 se
muestra el esquema del mecanismo de actuación de algunos de los compuestos
utilizados con este fin.
Figura 18. Esquema del abordaje farmacológico empleado para modular el metabolismo de la
glucosa. Con el fin de inhibir el flujo glucolítico se utilizaron medio sin glucosa y el inhibidor de la
hexoquinasa, 2-DG. El compuesto ML-265 actúa reforzando la forma tetramérica de la enzima PKM y
aumentando su actividad glucolítica. El compuesto UK5099 inhibe el transportador mitocondrial de
piruvato y bloquea el flujo de piruvato a la mitocondria, mientras que el DCA inhibe la piruvato
deshidrogenasa quinasa, por lo que favorece la activación de la piruvato deshidrogenasa. El lactato de
sodio puede aumentar las concentraciones intracelulares de lactato a través del transportador de
monocarboxilatos y también puede activar el receptor GPR81.
RESULTADOS
72
2.1 Efectos de la privación de glucosa
Con este propósito se utilizaron medio sin glucosa y 2-DG, un inhibidor de la HK y de
la fosfoglucosa isomerasa ampliamente utilizado para simular las condiciones de
privación de glucosa en algunos procesos metabólicos.
Expresión de citoquinas
Se analizó la transcripción del ARNm de la cadena p19 de la citoquina IL-23 (gen
IL23A). La pre-incubación con 2-DG indujo un aumento significativo del transcrito
mientras que la ausencia de glucosa en el medio no mostró ningún efecto (Figura 19
A). Este incremento de los niveles de ARNm sólo coincidió con el aumento de la
cantidad de proteína, medida en los sobrenadantes, en respuesta al LPS (Figura 19 E).
Una explicación plausible de estos resultados es que la IL-23 es una citoquina
heterodimérica que incluye la cadena p40 (gen IL12B), por lo que la producción de la
proteína depende también de la expresión de la cadena p40. En este sentido, el
zymosan induce una escasa expresión de IL-12 p40 (Rodríguez et al., 2014), mientras
que el LPS es un potente inductor de la expresión de la cadena p40 (Figura 19 B). El
hecho de que la disponibilidad de la cadena común p40 es un factor limitante para la
secreción de la citoquina, junto a la elevada producción de IL-23 inducida por el
zymosan (alcanzando casi los 4 ng por millón de células), pueden explicar la
incapacidad de las CD para generar una mayor cantidad de IL-23 en respuesta al
zymosan y la discordancia observada entre los niveles de proteína y ARNm.
Ni la privación de glucosa, ni la adición de 2-DG influyeron sobre la inducción del
ARNm de las citoquinas IL-10 e IL-1β en respuesta al zymosan. Sin embargo, la 2-DG
en combinación con el LPS produjo una disminución de los transcritos de ambas
citoquinas, en especial de la IL-10 (Figura 19 paneles C y D). La IL-1β se produce en
forma de un precursor inactivo (pro-IL-1β) que debe sufrir un procesamiento
enzimático para producir la proteína activa. Como se muestra en la Figura 19 F, el
zymosan y el LPS indujeron la expresión de pro-IL-1β pero con patrones temporales
diferentes, siendo mucho más temprana la aparición de la proteína en respuesta al
LPS (4 horas) que al zymosan (24 horas). La pre-incubación de las CD con 2-DG abolió
la expresión de pro-IL-1β en ambos casos.
RESULTADOS
73
Figura 19. Efecto de la 2-DG y de la privación de glucosa sobre la expresión de citoquinas. Las CD
se pre-incubaron en presencia de glucosa (11,1 mM), ausencia de glucosa o en presencia de 2-DG (10
mM) y glucosa durante 1 hora. (A-D) Análisis de la inducción del ARNm de distintas citoquinas
mediante qPCR. Tras la pre-incubación las CD se estimularon con 1 mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de
LPS durante 4 horas. (E) Producción de IL-23. Tras la pre-incubación las CD se estimularon con
zymosan o LPS durante 24 horas a las concentraciones anteriormente indicadas y se midió por ELISA la
cantidad de IL-23 presente en los sobrenadantes. Los datos se normalizaron en función del número de
células. Los resultados se representan como la media ± EEM de tres a diez experimentos
independientes.* Indica p˂0.05 con respecto a la glucosa. (F) Expresión de pro-IL1β. Tras la pre-
incubación las CD se estimularon con zymosan o LPS durante los tiempos señalados a las
concentraciones anteriormente indicadas. Los extractos proteicos se analizaron mediante Western
Blot. Se utilizó la β-actina como control de carga. El resultado es representativo de dos experimentos
independientes.
Producción de lactato
A la vista del distinto efecto producido por la privación de glucosa y la incubación con
2-DG y con el fin de determinar el modo en que estas condiciones afectaban al flujo
glucolítico, se analizaron los niveles de lactato en los sobrenadantes. Como se
RESULTADOS
74
muestra en la Figura 20, el incremento de los niveles de lactato inducidos por el
zymosan y el LPS disminuyó intensamente en ausencia de glucosa y en menor medida
en presencia de 2-DG.
Figura 20. Efecto de la 2-DG y de la privación de glucosa sobre la producción de lactato. Las CD
se pre-incubaron en presencia de glucosa (11,1 mM), ausencia de glucosa o en presencia de 2-DG (10
mM) y glucosa durante 1 hora y posteriormente se estimularon con 1 mg/ml de zymosan o 10 µg/ml
de LPS durante 24 horas. La producción de lactato se midió en los sobrenadantes mediante un kit
comercial y se normalizó en función del número de células. Los resultados se representan como la
media ± EEM de tres experimentos independientes.* indica p˂0.05 con respecto a la glucosa.
Además de regular la expresión de enzimas de la glucólisis, HIF1α se ha relacionado
con la producción de citoquinas pro-inflamatorias en macrófagos (Tannahill et al.,
2013) y se ha descrito que su estabilización se regula por los niveles de lactato en
monocitos (Wei et al., 2015; Gupta et al., 2016). Por este motivo se estudió su
expresión en las distintas condiciones. La privación de glucosa y la presencia de 2-DG
disminuyeron la expresión de HIF1α inducida por el zymosan, siendo este efecto
revertido por el lactato de sodio (Figura 21).
Figura 21. Efecto de la 2-DG y de la
privación de glucosa sobre la expresión
de HIF1α. Las CD se pre-incubaron
durante 1 hora con las adiciones indicadas
a las siguientes concentraciones: glucosa
11,1 mM, 2-DG 10 mM y lactato de sodio
15 mM. Posteriormente se estimularon
con 1 mg/ml de zymosan durante 4 horas y
los extractos proteicos se analizaron
mediante Western Blot. Se utilizó la β-
actina como control de carga. El resultado
es representativo de dos experimentos
independientes.
RESULTADOS
75
Efecto del lactato de sodio y de la modulación del flujo de piruvato
Para analizar el efecto del lactato sobre la expresión de citoquinas se adicionó lactato
de sodio y se bloqueó la entrada de piruvato a la mitocondria con el inhibidor del
transportador mitocondrial de piruvato UK5099.
La adición de lactato de sodio tuvo efectos diferentes en función del estímulo
utilizado. Produjo el aumento del ARNm de IL23A e IL10 y una tendencia a disminuir
el ARNm de IL1B en respuesta al zymosan. En el caso del LPS se observó un aumento
de la transcripción de IL23A y no se observó efecto significativo sobre la inducción de
las otras citoquinas (Figura 22 A). De forma opuesta, el compuesto UK5099 redujo la
transcripción de todas las citoquinas, especialmente en respuesta al zymosan a pesar
de aumentar la concentración de lactato intracelular (Figura 22 B), lo que pone de
manifiesto la importancia de la entrada de piruvato a la mitocondria. De acuerdo con
este resultado, la pre-incubación de las células con DCA, un compuesto que favorece
la actividad de la piruvato deshidrogenasa al inhibir la actividad de la piruvato
deshidrogenasa quinasa (Patel y Korotchkina 2006) y que aumenta la actividad del
ciclo de Krebs y el flujo de piruvato a la mitocondria (Kaplon et al., 2013; Meiser et al.,
2016) indujo un aumento del ARNm de IL23A e IL10 (Figura 22 C).
RESULTADOS
76
Figura 22. Efecto del lactato de sodio, del UK5099 y del DCA sobre la transcripción de
citoquinas. Las CD se pre-incubaron en presencia de lactato de sodio (15 mM) durante 1 hora,
UK5099 (50 µM) o DCA (5 mM) durante 30 minutos y posteriormente se estimularon con 1 mg/ml de
zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 4 horas o 30 minutos (B panel inferior derecho). (A, B y C)
Análisis de la inducción del ARNm de distintas citoquinas mediante qPCR. (B panel inferior derecho)
Niveles de lactato intracelular medidos por UPLC-MS y normalizados en función de la cantidad de
proteína. Los resultados se representan como la media ± EEM de tres a cuatro experimentos
independientes.* Indica p˂0.05.
Se ha descrito que las células del sistema inmune, además del transportador de
monocarboxilatos, que es el utilizado por el lactato, también poseen un receptor
acoplado a proteínas G, GPR81, que reconoce el lactato (Haas et al., 2016). La
activación de este receptor produce el aumento del inositoltrisfosfato e inhibe la
RESULTADOS
77
adenilato ciclasa a través de una ruta de señalización que incluye proteínas Gαi (Ge et
al., 2008). Con el fin de determinar si la adición de lactato de sodio conduce a la
activación de este receptor en células dendríticas, se realizaron experimentos con el
sensor ratiométrico de calcio intracelular FURA2. La adición de lactato aumentó la
razón de fluorescencia confirmando de esta forma la funcionalidad de este receptor y
la actividad de esta ruta en las CD (Figura 23).
Figura 23. Efecto del lactato de sodio sobre la concentración intracelular de calcio. Las CD se
adhirieron a placas de poli-ornitina y se marcaron con fura 2 acetoxi-metil-ester (4 µM) durante 1
hora. (A) Imagen tomada del microscopio Nikon Diaphot con las células epi-iluminadas a 380 nm. (B)
Razón de fluorescencia generada por la perfusión de las adiciones indicadas. Succinato (0,5 mM)
(Succ), fumarato (0,5mM) (Fum), lactato (15 mM) (Lac).
Estos resultados indican que existen receptores en las CD que reconocen como
ligandos a intermediarios metabólicos de la glucólisis y del ciclo de Krebs, aunque no
sea posible discriminar que parte del efecto pueda explicarse por la señalización de
los receptores, frente al efecto dependiente de la entrada de lactato por el
transportador de monocarboxilatos.
Implicación de la respuesta a proteínas mal plegadas: el papel de la
rama IRE
A la vista de que los resultados obtenidos no se podían explicar simplemente por las
variaciones en los niveles de lactato generadas por el bloqueo del metabolismo de la
glucosa, se estudiaron otros efectos de la 2-DG. La 2-DG, además de ser un mimético
de la glucosa, es el producto resultante de la pérdida del grupo hidroxilo anclado al
RESULTADOS
78
carbono-2 de la manosa por ello puede interferir en todas las reacciones que utilizan,
además de glucosa, manosa como sustrato incluidas las N-glicosilaciones de
proteínas, por lo que es razonable postular que este compuesto podría desencadenar
el estrés del retículo endoplasmático y activar la UPR.
La activación del factor de transcripción XBP1 de la rama IRE de la UPR depende de la
actividad endonucleasa de IRE1α, que tras ser activada por fosforilación en
condiciones de estrés, escinde 26 pb del ARNm inicial de XBP1 para que se traduzca
la proteína activa (Calfon et al., 2002). Para analizar la activación de la rama IRE, se
estudió el splicing del ARNm de XBP1 mediante una reacción de qPCR con cebadores
que amplifican la forma con splicing y la intacta. La Figura 24 A muestra como la pre-
incubación de las células con 2-DG aumentó el ARNm de XBP1 de manera más
significativa cuando las células se estimularon posteriormente con zymosan o LPS.
Para analizar el splicing de XBP1, se realizó una electroforesis en gel de agarosa con el
producto de amplificación de la qPCR que determinó que la pre-incubación de las
células con 2-DG sólo generó un splicing evidente de XBP1 cuando se utilizó en
combinación con los PAMP, como indica la aparición de la intensa banda sXBP1
(Figura 24 B). Por el contrario, la ausencia de glucosa en el medio no tuvo ningún
efecto ni sobre la transcripción, ni sobre el splicing de XBP1.
Figura 24. Efecto de la privación de glucosa y de la 2-DG sobre la transcripción y el splicing de
XBP1. Las CD se pre-incubaron en presencia de glucosa (11,1 mM), ausencia de glucosa o en presencia
de 2-DG (10 mM) y glucosa durante 1 hora y posteriormente se estimularon con 1 mg/ml de zymosan o
10 µg/ml de LPS durante 4 horas. (A) Análisis de la inducción del ARNm de XBP1 mediante qPCR. Los
resultados se representan como la media ± EEM de cuatro experimentos independientes.* Indica
p˂0.05 con respecto a la glucosa. (B) Análisis del splicing de XBP1. Tras realizar una qPCR con
cebadores que abarcan las regiones sin el splicing se realizó una electroforesis en gel de agarosa con
los productos de amplificación. uXBP1 indica la forma sin splicing, sXBP1 indica la forma con splicing.
Se utilizó la expresión de GAPDH como control de carga. El resultado es representativo de cuatro
experimentos independientes.
RESULTADOS
79
Con el fin de analizar estos resultados en el contexto de la UPR, se indujo estrés de
retículo con compuestos que inducen la UPR por distintos mecanismos: la
tunicamicina, un potente inhibidor de las N-glicosilaciones, y la tapsigargina que
inhibe la ATPasa de calcio del retículo endoplasmático (SERCA) y genera estrés al
modificar las concentraciones de calcio intracelular, pero que no influye en las
reacciones de N-glicosilación. Para determinar el efecto de estos compuestos sobre la
glicosilación de proteínas, se eligió la ciclooxigenasa 2 (COX2), como un representante
característico de las posibles alteraciones en la N-glicosilación. La COX2 es una
enzima que posee cuatro asparaginas glicosiladas, tres de las cuales se encuentran en
su centro activo y son necesarias para su correcto plegamiento y actividad catalítica
(Otto, DeWitt y Smith, 1993). La enzima completamente glicosilada posee una masa
de 76 kDa y la forma no glicosilada en los residuos Asn 68, Asn 144 y Asn 410,
presenta una masa molecular de 68 kDa. Como se observa en la Figura 25 A y en
concordancia con la bibliografía (Yu y Kim, 2010) el pre-tratamiento de la células
dendríticas con 2-DG y tunicamicina redujo la N-glicosilación de COX-2, produciendo
un cambio en la migración de esta proteína, detectable por Western Blot, mientras que
la tapsigargina no mostró ningún efecto. Sin embargo, los tres compuestos indujeron
un gran splicing de XBP1, especialmente en presencia de los PAMP, lo que confirma la
activación de la rama IRE de la UPR (Figura 25 B). Además, estos compuestos
ofrecieron resultados similares a los generados por la 2-DG en combinación con los
PAMP en cuanto a la transcripción de citoquinas, ya que tanto la pre-incubación de las
CD con tunicamicina como con tapsigargina aumentaron los niveles del ARNm de
IL23A cuando las células se estimularon con zymosan o LPS y redujeron los niveles de
ARNm de IL-10 en respuesta al LPS (Figura 25 C).
RESULTADOS
80
Figura 25. Efecto de la 2-DG, la tunicamicina y la tapsigargina sobre la glicosilación de COX2, el
splicing de XBP1 y la transcripción de citoquinas. Las CD se pre-incubaron en presencia de 2-DG
(10 mM), tunicamicina (10 µM) o tapsigargina (1 µM) durante 1 hora y posteriormente se estimularon
con 1 mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 4 horas. (A) Análisis de la glicosilación de COX2.
Los extractos proteicos se analizaron mediante Western Blot. Gli-COX2 indica la forma glicosilada. Se
utilizó la β-actina como control de carga. El resultado es representativo de dos experimentos
independientes. (B) Análisis del splicing de XBP1. Tras realizar una qPCR con cebadores que abarcan
las regiones sin el splicing se realizó una electroforesis en gel de agarosa con los productos de
amplificación. uXBP1 indica la forma sin splicing, sXBP1 indica la forma con splicing. Se utilizó la
expresión de la GAPDH como control de carga. El resultado es representativo de tres experimentos
independientes. (C) Análisis de la inducción del ARNm de IL23A e IL10 mediante qPCR. Los resultados
se representan como la media ± EEM de tres a cuatro experimentos independientes.* Indica p˂0.05 con
respecto al control.
Los resultados anteriores mostraban una posible relación entre la transcripción de
IL23A e IL10 y la forma procesada de XBP1, por ello se llevaron a cabo experimentos
de qPCR utilizando inhibidores de la actividad endonucleasa de IRE1α y suplementos
de manosa, con intención de revertir el impacto de la 2-DG sobre el splicing de XBP1 y
valorar los efectos sobre la transcripción de estas citoquinas. La adición de manosa y
el inhibidor de la actividad endonucleasa de IRE1α, MKC8866, bloquearon el splicing
del ARNm de XBP1 producido por la 2-DG en combinación con los PAMP, como indica
la desaparición de la banda de la forma con splicing de XBP1 (Figura 26 A). El pre-
RESULTADOS
81
tratamiento de las células con estos compuestos revirtió el efecto de la 2-DG sobre la
transcripción de IL23A en respuesta al zymosan, puesto que los niveles de ARNm
fueron similares a los inducidos por la estimulación de las CD con zymosan en
ausencia de 2-DG (Figura 26 B). El resultado con el LPS fue diferente, ya que dos
inhibidores de la actividad endonucleasa de IRE1α con distinta estructura química,
MKC8866 y 4µ8C no inhibieron el incremento del ARNm de IL23A causado por la 2-
DG (Figura 26 paneles B y C). Asimismo, se observó la ausencia de efecto del pre-
tratamiento con 2-DG sobre la transcripción de IL10 inducida por el zymosan, ya que
los niveles de ARNm de esta citoquina no se modificaron en estas condiciones.
Ninguno de los dos inhibidores de IRE1α tuvo efecto sobre la disminución de la
transcripción de IL10 observada en el sistema 2-DG-LPS (Figura 26 D). Estos
resultados sugieren la implicación de mecanismos diferentes para la modificación del
patrón de citoquinas generado por la 2-DG en función de la naturaleza del PAMP.
Figura 26. Efecto de los inhibidores de IRE1α y de la adición de manosa sobre el splicing de
XBP1 y la transcripción de citoquinas. Las CD se pre-incubaron durante 30 minutos en presencia de
MKC8866 (10 µM), manosa (1 mM) o 4µ8C (10 µM) antes de ser tratadas con 2-DG (10 mM) durante 1
hora y posteriormente se estimularon con 1 mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 4 horas. (A)
Análisis del splicing de XBP1. Tras realizar una qPCR con cebadores que abarcan las regiones sin el
splicing se realizó una electroforesis en gel de agarosa con los productos de amplificación. uXBP1
indica la forma sin splicing, sXBP1 indica la forma con splicing. Se utilizó la expresión de GAPDH como
control de carga. El resultado es representativo de tres experimentos independientes. (B, C y D)
Análisis de la inducción del ARNm de IL23A e IL10 mediante qPCR Los resultados se representan como
la media ± EEM de tres a cuatro experimentos independientes.* Indica p˂0.05 con respecto a la 2-DG.
RESULTADOS
82
Además de los estudios de expresión de ARNm, se analizó mediante Western Blot la
expresión de la proteína sXBP1. Esta se detectó en el núcleo de las CD sin estimular y,
aunque pareció aumentar en combinación con la 2-DG con respecto al LPS, no sufrió
grandes variaciones con los distintos pre-tratamientos (Figura 27 C). Teniendo en
cuenta que estudios bioinformáticos previos mostraban la presencia de Cajas-X2 en el
promotor de IL23A identificados con la base de datos TRANSFAC (Rodríguez et al.,
2014) (Figura 27 A), y que se ha descrito que XBP1 juega un papel en la regulación de
diversas dianas que exhiben estas secuencias (Acosta-Alvear et al., 2007), se
realizaron estudios de inmunoprecipitación de cromatina para valorar la unión
directa de sXBP1 a estas secuencias. La simple pre-incubación de las células con 2-DG
aumentó la unión de sXBP1 a las tres Cajas-X2 que se analizaron y esta unión fue
mayor cuando se estimularon las células con zymosan. Este efecto fue revertido por el
inhibidor de la actividad endonucleasa de IRE1α MKC8866 (Figura 27 B). El LPS
mostró una tendencia a aumentar la unión de sXBP1 a la Caja-X2 distal y el pre-
tratamiento de las CD con 2-DG no ofreció grandes variaciones al utilizar este
estímulo (datos no mostrados).
RESULTADOS
83
Figura 27. Implicación de sXBP1 en la
trans-activación de IL23A. (A) Estructura
del promotor de IL23A. Esquema de los sitios
de unión de los factores de transcripción más
relevantes identificados utilizando la base de
datos TRANSFAC. En color rojo se muestran
las Cajas-X2 (X2-Box) proximal (-259), medial
(-1181) y distal (-1848) a las que se puede
unir sXBP1. Figura adaptada de Rodríguez et
al. ,2014. (B y C) Las CD se pre-incubaron
durante 30 minutos en presencia de MKC8866
(10 µM) antes de ser tratadas con 2-DG (10
mM) durante 1 hora y posteriormente se
estimularon con 1mg/ml de zymosan o 10
µg/ml de LPS durante 4 horas (C) y con
1mg/ml de zymosan durante 1 hora (B). (B)
Análisis de la unión de sXBP1 a las Cajas-X2
del promotor de IL23A mediante ChIP. Los
resultados se representan como la media ±
EEM de tres experimentos independientes. *
Indica p˂0.05 con respecto al control. (C)
Expresión de la proteína sXBP1 en fracciones
nucleares. Los extractos proteicos se
analizaron mediante Western Blot. Se utilizó la
histona H3 como control de carga. El
resultado es representativo de dos
experimentos independientes.
RESULTADOS
84
Puesto que el abordaje farmacológico mostraba la implicación de sXBP1 en la trans-
activación de IL23A, se estudió el efecto de la deleción del gen que codifica IRE1α,
Ern1, en experimentos con ratones Ern1f/fVav1-Cre que tienen el gen delecionado
específicamente en el sistema hematopoyético. En estudios preliminares se comprobó
que las células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón respondían de forma
similar a las CD derivadas de monocitos humanos a los diferentes compuestos. Como
se muestra en la Figura 28 (paneles A y B), se observó un aumento de los niveles de
ARNm de Il23a al combinar la 2-DG con los PAMP y la inducción de la UPR como
demuestra la aparición de la banda de la forma con splicing de Xbp1 en el gel de
agarosa. Pero, a diferencia de las CD humanas, la inhibición de la actividad
endonucleasa de IRE1α con el compuesto 4µ8C revirtió parcialmente el efecto de la 2-
DG en respuesta al LPS ya que, aunque los niveles del ARNm de il23a no llegaron a ser
tan bajos como los inducidos por el estímulo en ausencia de 2-DG, sí se redujeron
significativamente con respecto al incremento generado por la combinación 2-DG-
LPS. Otra diferencia observada (Figura 28 C panel izquierdo), fue que la simple
adición de 2-DG generó el splicing del ARNm de Xbp1 en la misma medida que cuando
se combina con el zymosan y el LPS, aunque en ese caso no induce la transcripción de
Il23a. En concordancia con la respuesta a la inhibición farmacológica de la actividad
endonucleasa de IRE1α, la expresión del ARNm de IL-23 en respuesta a la 2-DG fue
drásticamente inferior en las células de los ratones con la deleción cuando se
estimularon con zymosan o con LPS (Figura 28 C panel derecho).
RESULTADOS
85
Figura 28. Efecto de la inhibición farmacológica y de la deleción de IRE1α sobre la transcripción
de Il23a en células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón. Las BMDC se pre-incubaron
durante 30 minutos en presencia de 4µ8C (10 µM) antes de ser tratadas con 2-DG (10 mM) durante 1
hora y posteriormente se estimularon con 1 mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 4 horas. (A)
Análisis de la inducción del ARNm de Il23a mediante qPCR. Los resultados se representan como la
media ± EEM de tres experimentos independientes. * Indica p˂0.05. (B) Análisis del splicing de XBP1.
Tras realizar una qPCR con cebadores que abarcan las regiones sin el splicing se realizó una
electroforesis en gel de agarosa con los productos de amplificación. uXBP1 indica la forma sin splicing,
sXBP1 indica la forma con splicing. El resultado es representativo de tres experimentos independientes.
(C) Análisis de la inducción del ARNm de sXbp1 e Il23a mediante qPCR en BMDC de ratones control
(Ern1f/f) y con el gen delecionado (Ern1f/fVav1-Cre). Las BMDC se pre-incubaron en presencia de 2-DG
(10 mM) durante 1 hora y posteriormente se estimularon con 1mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS
durante 4 horas. Los resultados se representan como la media ± EEM tres experimentos
independientes.* Indica p˂0.05.
El papel de las ramas ATF6 y PERK
Para abordar la implicación de las otras dos ramas de la UPR que se pueden activar
cuando hay estrés de retículo endoplasmático: ATF6 y PERK, se realizaron
experimentos de Western Blot con intención de detectar la fragmentación de ATF6,
que demostraría la activación de esta rama, y la fosforilación de eIF2α como indicador
de la activación de la ruta PERK. Como se muestra en la Figura 29 A, la 2-DG aumentó
la fragmentación de ATF6 en las células sin estimular pero no incrementó el efecto del
RESULTADOS
86
zymosan y el LPS que por sí solos también indujeron su fragmentación. Los niveles de
la proteína escindida fueron superiores tras la estimulación con zymosan que con el
pre-tratamiento de las CD con 2-DG. El zymosan produjo un cambio en la migración de
la proteína sin fraccionar probablemente debido a cambios en su glicosilación que se
producen previamente a su escisión por las proteasas de Sitio-1 (S1p) (Hong et al,
2004).
En cuanto a la fosforilación de eIF2α y de acuerdo con una reciente publicación que
muestra que el LPS no afecta la fosforilación de eIF2α (Shan et al., 2017), no hubo
variaciones en el nivel de fosforilación de eIF2α al pre-tratar las células con 2-DG,
incluso en presencia de los PAMP (Figura 29 B).
Figura 29. Efecto de la 2-DG sobre la escisión de ATF6 y la fosforilación de eIF2α. Las CD se pre-
incubaron en presencia de 2-DG (10 mM) durante 1 hora y posteriormente se estimularon con 1
mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 1 hora (A) o los tiempos indicados (B). Los extractos
proteicos se analizaron mediante Western Blot. Se utilizó la β-actina como control de carga. Los
resultados son representativos de al menos dos experimentos independientes.
Dado que la fosforilación de eIF2α no parecía la mejor forma de valorar la activación
la vía PERK/eIF2α/ATF4/CHOP y al existir publicaciones que relacionan
directamente a DDIT3/CHOP con la transcripción de IL23A (Goodall et al., 2010), se
decidió analizar la expresión de este factor de transcripción. La inducción del ARNm
de DDIT3/CHOP no sufrió cambios al incubar las células en medio sin glucosa, pero sí
se modificó con el pretratamiento con 2-DG, observándose un claro incremento
independiente de la estimulación con los PAMP (Figura 30 A) lo que confirma la
activación de la rama PERK de la UPR por la 2-DG. Al analizar la expresión de la
proteína en extractos nucleares, CHOP pudo detectarse en las células en reposo, de
RESULTADOS
87
acuerdo con un estudio previo en monocitos humanos (Riek et al., 2012). La 2-DG no
produjo cambios en sus niveles nucleares en las células en reposo ni tras la
estimulación con LPS (Figura 30 B). El pre-tratamiento de las CD con 2-DG tampoco
revirtió la desaparición nuclear de CHOP provocada por el zymosan. Estos datos
sugieren que en presencia de patrones fúngicos, las CD se protegen de los efectos
proapoptóticos atribuidos a CHOP, lo que permitiría el mantenimiento de la
capacidad fagocítica de las CD durante las infecciones por hongos (Rodríguez et al.,
2014) y permiten descartar la participación directa de CHOP/DDIT3 en la
transcripción de citoquinas en CD estimuladas con zymosan.
Figura 30. Efecto de la 2-DG sobre la expresión de CHOP. Las CD se pre-incubaron en presencia de
glucosa (11,1 mM), ausencia de glucosa o en presencia de 2-DG (10 mM) y glucosa durante 1 hora y
posteriormente se estimularon con 1 mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 4 horas. (A)
Análisis de la inducción del ARNm de DDIT3/CHOP mediante qPCR. Los resultados se representan
como la media ± EEM de tres experimentos independientes.* Indica p˂0.05 con respecto a la glucosa.
(B) Expresión de CHOP en fracciones nucleares. Los extractos proteicos se analizaron mediante
Western Blot. Se utilizó la histona H3 como control de carga. El resultado es representativo de tres
experimentos independientes.
Con el fin de abordar con más detalle la posible implicación de esta rama de la UPR se
hicieron experimentos con el inhibidor de PERK, GSK2606414. El GSK2606414
revirtió el incremento de los niveles del ARNm de CHOP/DDIT3 inducido por la 2-DG
(Figura 31 A) y en concordancia con la desaparición de CHOP producida por el
zymosan, no mostró ningún efecto sobre la transcripción de citoquinas en este
sistema. Sin embargo, la inhibición de PERK con GSK2606414, redujo
significativamente la inducción del ARNm de IL23A provocado por el LPS en
presencia de 2-DG (Figura 31 B) y generó también un aumento inesperado del ARNm
de IL10 cuando se estimularon las células con LPS. Asimismo, la combinación del
RESULTADOS
88
inhibidor de PERK con LPS, indujo la expresión del tránscrito de IL10 en niveles
similares a los producidos por el LPS, incluso cuando la estimulación se hizo en
presencia de 2-DG (Figura 31 C). Estos resultados indican que las distintas ramas de
la UPR modulan la expresión de citoquinas de forma dependiente del estímulo.
El hallazgo de que la inhibición farmacológica de PERK tuviera efectos sobre la
transcripción de citoquinas en las células dendríticas estimuladas con LPS junto al
hecho de que ATF4 se pudiera unir a los sitios ATF2 del promotor de IL23A
(Rodríguez et al., 2014) sugirieron la necesidad de realizar experimentos de
inmunoprecipitación de la cromatina para valorar la implicación directa de este
factor sobre la trans-activación de IL23A. Sin embargo, el análisis de la unión de ATF4
al promotor de IL23A no mostró ninguna variación en las distintas condiciones (datos
no mostrados), por ello se postuló la participación de otros factores de transcripción.
La trans-activación de IL23A en respuesta al LPS se ha relacionado con diversos
factores incluido C/EBPβ (Kocieda et al., 2012) que pertenece a la misma familia de
factores de transcripción que CHOP y tiene varios sitios de unión al promotor de la
IL23A (Figura 27 A). Estudios previos del laboratorio han demostrado una menor
Figura 31. Efecto de la inhibición de PERK
sobre la transcripción de distintos genes. Las
CD se pre-incubaron en presencia de
GSK2606414 (1 µM) durante 30 minutos antes
de ser tratadas con 2-DG (10 mM) durante 1
hora y posteriormente se estimularon con 1
mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 4
horas. La inducción del ARNm de DDIT3, IL23A
e IL10 se analizó mediante qPCR. Los resultados
se representan como la media ± EEM de tres a
cinco experimentos independientes.* Indica
p˂0.05.
RESULTADOS
89
unión de CHOP y mayor unión de C/EBPβ a los sitios CHOP-C/EBP de este promotor
en respuesta al LPS (Rodríguez et al., 2014) y además se ha descrito la relación de
C/EBPβ con las ramas IRE y PERK de la UPR (Hayakawa et al., 2010) por lo que se
estudió la unión de este factor a los sitios CHOP-C/EBP del promotor de IL23A. Como
se muestra en la Figura 32, a diferencia de lo observado con el zymosan, la 2-DG
incrementó significativamente la unión de C/EBPβ al promotor de IL23A en respuesta
al LPS, lo que sugiere su asociación con el efecto de la 2-DG sobre la transcripción de
IL23A.
Figura 32. Análisis de la unión de C/EBPβ al promotor de IL23A mediante ChIP. Las CD se pre-
incubaron en presencia de 2-DG (10 mM) durante 1 hora y posteriormente se estimularon con 1
mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 1 hora. Los resultados se representan como la media ±
EEM de tres experimentos independientes.* Indica p˂0.05.
En lo que se refiere a la regulación transcripcional de IL10, se acepta ampliamente el
mecanismo dependiente de CREB y del co-activador CBP. La actividad de CREB se
regula negativamente por la glicógeno sintasa quinasa 3β. Por este motivo, la
inhibición de GSK3β favorece la unión de CREB al sitio CRE del promotor de IL10, el
reclutamiento de CBP y la translocación de CRTC/TORC2 al núcleo para la formación
del complejo nuclear P-CREB/TORC2/CBP que es necesario para la trans-activación
de IL10. Además, hay numerosos estudios que relacionan el estrés de retículo con la
activación, por variaciones en el estado de fosforilación, de GSK3β (Chang et al., 2011;
McAlpine et al., 2012; Kim et al., 2015). La fosforilación en la serina 9 de esta proteína
es inhibitoria mientras que la fosforilación de la tirosina 216 aumenta su actividad
(Beurel, Grieco y Jope, 2015).
RESULTADOS
90
Para valorar el estado de activación de GSK3β dependiente de su fosforilación, se
realizaron experimentos utilizando anticuerpos específicos frente a ambas
fosforilaciones. Las células dendríticas mostraron un aumento la fosforilación
inhibitoria de la serina 9 cuando se estimularon con LPS, efecto que fue en parte
contrarrestado por la pre-incubación de las CD con 2-DG (Figura 33 A) y no se
observaron variaciones en la fosforilación activadora de la tirosina 216 (datos no
mostrados). También se analizó la unión directa del co-activador CBP al sitio CRE del
promotor de IL10. Tanto el zymosan como el LPS aumentaron la unión de CBP con
respecto a las células sin estimular y la pre-incubación con 2-DG no tuvo efecto en las
CD estimuladas con zymosan, pero sí redujo la unión de CBP al promotor de IL-10 en
las células tratadas con LPS (Figura 33 B). Este resultado explicaría la disminución de
la transcripción de IL10 inducida por la 2-DG en respuesta al LPS.
Figura 33. Efecto de la 2-DG sobre la fosforilación de GSK3β y la unión de CBP al promotor de
IL10. Las CD se pre-incubaron en presencia de 2-DG (10 mM) durante 1 hora y posteriormente se
estimularon con 1 mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 1 hora. (A) Análisis de la fosforilación
de GSK3β. Los extractos proteicos se analizaron mediante Western Blot. Se utilizó la β-actina como
control de carga. El resultado es representativo de tres experimentos independientes. (B) Análisis de la
unión de CBP al sitio CRE del promotor de IL10 mediante ChIP. Los resultados se representan como la
media ± EEM de dos experimentos independientes.
2.2 Efectos de la regulación de la actividad de la PKM2
La piruvato quinasa cataliza el último paso de la glucólisis, la conversión de
fosfoenolpiruvato a piruvato a través de la transferencia de un grupo fosfato al ADP.
La conformación y actividad de la PKM2 pueden modificarse alostéricamente por
intermediarios metabólicos y por compuestos farmacológicos. Tras haber confirmado
la expresión preferencial de la isoforma PKM2 en las células dendríticas (Figura 16),
RESULTADOS
91
se utilizó el compuesto ML-265 (también denominado TEPP-46) con el fin de
aumentar el flujo glucolítico. Este compuesto refuerza la tetramerización de PKM2 y
la convierte en una enzima altamente glucolítica que incrementa la formación de
lactato y disminuye el flujo de piruvato a la mitocondria (Christofk et al., 2008;
Anastasiou et al., 2012).
Expresión de citoquinas
Las CD se pre-trataron con ML-265 previamente a la estimulación y se midió la
inducción de la transcripción de distintas citoquinas mediante qPCR. Como se
muestra en la Figura 34, los resultados difirieron según el estímulo utilizado. Los
niveles de los transcritos de IL23A, IL10 e IL1B disminuyeron de forma muy
significativa en presencia de ML-265 en respuesta al zymosan, mientras que no
experimentaron variación alguna en respuesta al LPS.
Producción de lactato
Con el fin de determinar si los cambios sobre la actividad glucolítica generados por el
compuesto ML-265 podían explicar las variaciones observadas sobre la transcripción
de citoquinas, se analizaron los niveles de lactato intracelular y en el medio de cultivo.
Figura 34. Efecto del compuesto ML-265
sobre la transcripción de citoquinas. Las
CD se pre-incubaron en presencia de ML-
265 (50 µM) durante 30 minutos y
posteriormente se estimularon con 1 mg/ml
de zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 4
horas. Los resultados se representan como
la media ± EEM de tres experimentos
independientes.* Indica p˂0.05.
RESULTADOS
92
De forma inesperada, no se observó ningún cambio en los niveles de este metabolito
en presencia de ML-265 (Figura 35). La producción de lactato aumentó en respuesta
al zymosan y al LPS, aunque el efecto de los estímulos mostró notables diferencias. A
las 24 horas el aumento de la concentración extracelular inducida por ambos
estímulos fue similar. Sin embargo, la medida de los niveles intracelulares de lactato
realizada tras 30 minutos de estimulación mostró niveles más elevados en el caso del
zymosan, lo que indicaría una mayor rapidez de acción de este estímulo.
Figura 35. Efecto del compuesto ML-265 sobre la producción de lactato. Las CD se pre-incubaron
en presencia de ML-265 (50 µM) durante 30 minutos y posteriormente se estimularon con 1 mg/ml de
zymosan o 10 µg/ml de LPS durante 24 horas (A) o 30 minutos (B). (A) Niveles de lactato extracelular
medidos mediante un kit comercial. La cantidad de lactato presente en los sobrenadantes se normalizó
en función del número de células. (B) Niveles de lactato intracelular medidos por UPLC-MS. La
cantidad de lactato presente en las células se normalizó en función de la cantidad de proteína. Los
resultados se representan como la media ± EEM de tres a cuatro experimentos independientes.
Estudios bioenergéticos
En un intento adicional para caracterizar el efecto global del ML-265, se realizaron
nuevos experimentos dirigidos a monitorizar la bioenergética de las CD en tiempo
real con el analizador de flujo extracelular Seahorse XFe96. La Figura 36 muestra
como el pre-tratamiento de las células con ML-265 no produjo cambios ni en la tasa
de acidificación extracelular ni en la de consumo de oxígeno distintos de los inducidos
por los estímulos. Sin embargo, estos experimentos permitieron mostrar, una vez
más, los distintos patrones de respuesta asociados con cada estímulo. Mientras que el
zymosan aumentó de forma notable la ECAR y la OCR, el LPS sólo aumentó
ligeramente la ECAR a lo largo del ensayo.
RESULTADOS
93
Figura 36. Efecto del compuesto ML-265 sobre la bioenergética de las células dendríticas. Registros
del equipo Seahorse Bioscience XFe96 tras la aplicación del protocolo XF Mito Stress Test Kit obtenidos
tras la pre-incubación de las CD con ML-265 (50 µM) durante 30 minutos y su posterior estimulación con
1 mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS, normalizados en función del número de células. (A) Tasa de
acidificación del medio. (B) Tasa de consumo de oxígeno.
RESULTADOS
94
Conformación y actividad quinasa de la PKM2
A la vista de la ausencia de cambios metabólicos inducidos por el ML-265 y puesto
que a la PKM2 se atribuyen distintas funciones y grado de actividad dependiendo de
su conformación, se llevó a cabo un ensayo de cross linking para estudiar su
ensamblaje. De acuerdo con los resultados obtenidos en otros tipos celulares como
los macrófagos y las células glomerulares de riñón (Shirai et al., 2016; Qi et al., 2017),
las CD mostraron una gran cantidad de la formas monomérica y tetramérica en
comparación con la forma dimérica. La distribución entre las tres conformaciones no
se modificó ni por el ML-265, ni por los estímulos, tanto cuando se utilizaron de forma
aislada como con la combinación de ambos (Figura 37).
Tanto la histona H3 como STAT3 se encuentran entre las proteínas mejor
caracterizadas susceptibles de ser fosforiladas por las formas
monoméricas/diméricas de la PKM2, por ello se estudió el efecto del ML-265 en la
fosforilación de la serina 10 de la histona H3 y la de la tirosina 705 de STAT3 a las 3 y
6 horas, en concordancia con el patrón temporal de fosforilación de STAT,
previamente descrito en células estimuladas. Si bien no hubo variaciones en la
fosforilación de la histona (datos no mostrados), el ML-265 inhibió fuertemente la
fosforilación de STAT3 inducida por los PAMP (Figura 38).
Figura 37. Efecto del zymosan, LPS y ML-
265 sobre la conformación de la enzima
PKM2. Las CD se pre-incubaron en
presencia de ML-265 (50 µM) durante 30
minutos y posteriormente se estimularon
con 1mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS
durante 1 hora. Pasado este tiempo se llevó
a cabo el cross-linking mediante la adición
de disuccinimidil suberato (650 µM). Los
extractos obtenidos, en condiciones no
reductoras, se analizaron en un gel de
poliacrilamida al 8% para visualizar
proteínas en el rango de 60-240 kDa. Se
utilizó la β-actina como control de carga. El
resultado es representativo de dos
experimentos independientes.
RESULTADOS
95
Tomados en conjunto estos resultados y dado que el único efecto que pudo atribuirse
al ML-265 fue la disminución de la fosforilación de STAT3, la caída de la transcripción
de citoquinas inducida por el zymosan en presencia de ML-265 podría explicarse por
la interferencia de este compuesto con la actividad proteína quinasa de la enzima
PKM2.
Figura 38. Efecto del compuesto ML-
265 sobre la fosforilación de STAT3.
Las CD se pre-incubaron en presencia
de ML-265 (50 µM) durante 30 minutos
y posteriormente se estimularon con 1
mg/ml de zymosan o 10 µg/ml de LPS
durante los tiempos indicados. Los
extractos proteicos se analizaron
mediante Western Blot. Se utilizó la β-
actina como control de carga. El
resultado es representativo de dos
experimentos independientes.
Discusión
DISCUSIÓN
99
1. Caracterización de la reprogramación metabólica en células
dendríticas
La activación de las células dendríticas por la interacción de los PAMP con sus
receptores, induce la adquisición de nuevas funciones como la producción de
citoquinas, de mediadores lipídicos y de otras moléculas de señalización, y la
migración a los ganglios linfáticos (Joffre et al., 2009). Este cambio de un estado
quiescente a otro activado coincide con una reprogramación metabólica que modula
la respuesta efectora y proporciona el soporte energético necesario para el cambio
funcional (Pearce y Pearce, 2013; Ganeshan y Chawla, 2014).
En concordancia con los resultados obtenidos, numerosos estudios previos ponen de
manifiesto que el cambio metabólico más prominente observado en las CD
estimuladas por los PAMP es el aumento de la glucólisis (Krawczyk et al., 2010; Everts
et al., 2012; O'Neill y Hardie, 2013). En estos estudios el patrón glucolítico se
acompaña de un descenso paralelo de la OXPHOS. Sin embargo, los experimentos
mostrados en el presente estudio indican que cuando las CD se activan con zymosan o
LPS, además de producirse un aumento temprano (30 minutos) de la glucólisis, la
OCR se mantiene o incluso se incrementa, al igual que el consumo de oxígeno
destinado a la producción de ATP en la OXPHOS. En este sentido, se ha descrito que
elevadas tasas glucolíticas y de respiración mitocondrial constituyen el fenotipo
metabólico característico de CD tolerogénicas que expresan de forma abundante
proteínas relacionadas con la OXPHOS y son resistentes a la maduración (Morelli y
Thomson, 2007; Ferreira et al., 2012; Malinarich et al., 2015) mientras que en la
maduración de las células dendríticas hay una regulación a la baja de los genes
implicados en la OXPHOS (Jin et al., 2010). En contraposición con estos estudios y en
concordancia con los resultados obtenidos, estudios recientes concluyen que los
macrófagos pro-inflamatorios mantienen la oxidación del piruvato para la producción
de citoquinas (Meiser et al., 2016) y que la activación de distintos TLR pueden inducir
el aumento de la glucólisis y de la OXPHOS en monocitos humanos (Lachmandas et al.,
2016).
Independientemente de la controversia sobre la actividad de la OXPHOS, que parece
depender del estado de maduración celular, del contexto inmune y del estímulo
DISCUSIÓN
100
utilizado, el aumento de la glucólisis es una constante. Numerosos estudios señalan al
factor de transcripción HIF1, bien de forma aislada o en colaboración con otras
proteínas como STAT3 y PKM2, como el principal activador de estos cambios. Los
resultados presentados en esta memoria confirman la inducción de HIF1α tras la
activación de los PRR en ausencia de hipoxia, mediante mecanismos tanto
transcripcionales como traduccionales, y muestran la presencia de estas proteínas en
los núcleos de las CD. Sin embargo, el patrón temporal de aparición de HIF1α no
permite explicar plenamente el aumento de la glucólisis observado claramente tras
30 minutos de estimulación. Una interpretación plausible es que aunque HIF1, PKM2
y STAT3 puedan estar implicados en el mantenimiento de una respuesta más tardía,
los cambios iniciales pueden explicarse más satisfactoriamente por la translocación
de la hexoquinasa II a la mitocondria, de forma similar a lo que ocurre en los
linfocitos T (van der Windt et al., 2013). En respuesta a agonistas de los TLR, Akt
fosforila la HK-II y promueve su unión a la membrana mitocondrial donde puede
interaccionar directamente con los canales de aniones dependientes de voltaje y
aumentar su actividad, gracias a que esa localización facilita el acceso a altas
concentraciones de ATP (Everts et al., 2014). Esta interpretación concuerda con la
abundante bibliografía mostrando que la vía PI3K/Akt está implicada en los cambios
metabólicos inducidos en células dendríticas y monocitos murinos por la ocupación
de los TLR (Krawczyk et al., 2010; Cheng et al., 2014; Arts et al., 2016). Además, un
estudio reciente en células dendríticas derivadas de monocitos humanos confirma
una mayor expresión y actividad de esta quinasa en respuesta a los TLR (Perrin-
Cocon et al., 2018).
DISCUSIÓN
101
2. Modulación del metabolismo de la glucosa y regulación
transcripcional de la producción de citoquinas en células
dendríticas
Los resultados obtenidos confirman el gran número de estudios señalando que el
aumento del flujo glucolítico es de vital importancia para una correcta función
efectora, en la que se incluye la producción de citoquinas. En el presente estudio
destaca la prominencia de la producción de IL-10 e IL-23 en respuesta a los
componentes β-glucano y α-manano del zymosan, frente a una menor producción de
estas citoquinas tras la estimulación del TLR4 por el LPS. La relevancia clínica de
estos resultados se justifica por el papel de estas citoquinas en distintos procesos
patológicos. Por ejemplo, la IL-23 promueve la diferenciación y proliferación de los
linfocitos Th17 (Kreymborg et al., 2007) y numerosos estudios confirman la
participación de estos linfocitos en la patogenia de enfermedades autoinmunes como
artropatía psoriásica, esclerosis múltiple y artritis reumatoide (McGeachy y Cua,
2007), y en el crecimiento tumoral (Grivennikov et al., 2012). En este sentido, en el
tratamiento de procesos como la psoriasis, la artritis psoriásica o la enfermedad de
Crohn se utilizan anticuerpos monoclonales para bloquear la actividad de esta
citoquina. Del mismo modo, la IL-10 está implicada en la polarización de los linfocitos
a un fenotipo Threg o regulador que suprime la respuesta pro-inflamatoria y controla
la producción de daño tisular por mecanismo inmune (Couper, Blount y Riley, 2008).
Debido a esto, una excesiva producción de IL-10 puede contribuir a la expansión de
micosis invasivas y a la infección por micobacterias.
2.1 Efectos de la privación de glucosa
A la vista de la importancia del metabolismo de la glucosa en la reprogramación
metabólica, es comprensible que la intervención sobre el mismo afecte a la
producción de citoquinas. La pre-incubación de las células dendríticas con 2-DG
aumenta la transcripción de IL23A durante la estimulación con zymosan y LPS y
genera una disminución de la transcripción de IL10 e IL-1B en el caso del LPS.
Sorprendentemente, la ausencia de glucosa en el medio no tiene consecuencias en
respuesta a ninguno de los dos estímulos. Esta diferencia de comportamiento entre la
privación de glucosa y el efecto de la 2-DG sobre la producción de citoquinas también
DISCUSIÓN
102
se ha descrito en linfocitos T humanos CD4+ y CD8+ aunque no se propuso ninguna
explicación sobre el posible mecanismo (Renner et al., 2015). Una interpretación
posible de este resultado es que las CD mantengan niveles intracelulares de glucosa
suficientes durante un periodo prolongado de tiempo o que utilicen metabolitos
alternativos como glutamina, ácidos grasos o aminoácidos de cadena ramificada. Sin
embargo, el hallazgo más llamativo en este sentido ha sido la descripción de que las
CD expresan la maquinaria necesaria para metabolizar el glucógeno, lo que permite la
utilización de sus depósitos intracelulares para desarrollar su función efectora (Thwe
et al., 2017).
La ausencia de glucosa en el medio genera una bajada más drástica de lactato en los
sobrenadantes de las CD estimuladas que la inhibición de la glucólisis con 2-DG. Esta
caída del lactato inhibe la estabilización de HIF1α, por lo que puede descartarse la
participación de HIF en el incremento de la expresión del ARNm de IL23A observado
en estas condiciones. Aunque algunos autores han demostrado una relación directa
con la transcripción de IL-1β en astrocitos (Zhang et al., 2006) y en macrófagos a
tiempos más tardíos (Tannahill et al., 2013), HIF1α desaparece por completo de los
extractos proteicos al utilizar un medio sin glucosa sin que ello se acompañe de
cambios en la transcripción de citoquinas a las 4 horas, por lo que no podría
explicarse por este mecanismo la disminución de la transcripción de IL1B observada
con la combinación 2-DG–LPS, que además se acompaña de la abolición de la
producción de pro-IL-1β inducida por la 2-DG. La ausencia de la actividad de HIF1α
tampoco explica el efecto de la 2-DG en la expresión de pro-IL-1β, dado que esta
expresión se observa a las 24 horas en respuesta al zymosan, periodo que coincide
con una menor expresión de HIF1α. El hecho de que la pro-IL-1β no se detecte hasta
las 24 horas en las células tratadas con zymosan indica una respuesta mucho más
tardía que la inducida por el LPS y estaría de acuerdo con la ausencia de efecto de la
2-DG sobre el ARNm de IL1B a tiempos más precoces.
La adición de lactato de sodio también genera respuestas diferentes en función del
estímulo. Con el zymosan se observa un aumento del ARNm de IL23A y de IL10,
mientras que el LPS sólo aumenta el de IL23A. Sin embargo, la transcripción de la IL-
1β muestra una tendencia a disminuir con ambos estímulos. Estos resultados
coinciden en parte con otros estudios en los que el lactato secretado por las células
DISCUSIÓN
103
tumorales incrementa la transcripción de IL23A en células del sistema inmune
estimuladas con ligandos de los TLR 2/4 (Shime et al., 2008). Pero, en este caso, sería
la entrada de lactato en la célula el responsable de los cambios del nivel de
producción de citoquinas (Colegio et al., 2014; Abebayehu et al., 2016). Esta entrada
se produciría a través de los transportadores MCT, que a su vez depende del pH,
puesto que el lactato entra acompañado por un protón (Halestrap, 2012) y el efecto
no se observa en presencia de lactato de sodio. Este hecho permite distinguir los
efectos propiamente debidos al ion lactato de los efectos causados por la bajada de
pH. A pesar de estos condicionantes, la bajada de pH que frecuentemente se observa
en el micro-entorno tumoral no ha sido tenida en cuenta en todos los estudios.
El lactato también puede actuar a través del receptor GPR81 cuya funcionalidad se ha
mostrado en este estudio. Este hecho añade complejidad a las contradictorias
interpretaciones existentes en cuanto a la función de este receptor. Mientras que la
deleción del gen Gpr81 en macrófagos murinos no induce cambios en la expresión de
algunas citoquinas inducida por el lactato (Errea et al., 2016), también se ha descrito
que el Gpr81 interviene en la producción de IL-1β inducida por la estimulación de los
TLR (Hoque et al., 2014).
La inhibición de la entrada de piruvato en la mitocondria con el compuesto UK5099,
que aumenta los niveles de lactato intracelular, mostró un efecto negativo sobre la
transcripción de IL23A, Il10 e IL1B, mientras que el aumento del flujo de piruvato con
el DCA indujo el efecto opuesto. Estos resultados confirman la importancia que tiene
la entrada de piruvato a la mitocondria para la inducción de algunas citoquinas, como
ya se había descrito para IL-1β, IL-6 y PD-L1 (Shirai et al., 2016; Watanabe et al.,
2017). Otro inhibidor del transportador de monocarboxilatos, el CHC, que se utiliza
para bloquear el paso de lactato por los MCT mostró un efecto similar en resultados
preliminares (no mostrados). Estos resultados son compatibles con la interpretación
de que el efecto del lactato se debe a su entrada en la célula por el transportador en
lugar de por la activación de su receptor (Colegio et al., 2014). Dado que se ha
descrito que el compuesto CHC también inhibe la entrada de piruvato a la
mitocondria (Nancolas et al., 2016), es difícil discriminar hasta qué punto alguno de
los efectos atribuidos al lactato no puedan deberse a cambios paralelos en el
metabolismo del piruvato.
DISCUSIÓN
104
Las diferencias observadas en la transcripción de IL10 inducida por cada estímulo
pueden explicarse por las distintas vías de señalización activadas por cada PAMP
(Rodríguez et al., 2017). El LPS actúa a través del receptor TLR4 y activa las vías de
MyD88 y TRIF que inducen los factores reguladores de interferón (IRF) y el sistema
JAK/STAT, mientras que los componentes del zymosan se reconocen por los
receptores TLR2 y de lectina tipo C como Dectin 1 y 2 que inducen también la
activación de Syk (Figura 39). Este distinto reclutamiento de vías de señalización es
un factor de la mayor relevancia para explicar los resultados obtenidos.
Figura 39. Esquema de las vías de señalización utilizadas por el zymosan y el LPS. El zymosan
señaliza a través de TLR-2 y receptores de lectina tipo C para activar las vías de MyD88 y Syk. El LPS es
reconocido por el TLR4 y activa las rutas de los adaptadores TRIF/TRAM y MyD88.
Tomados en conjunto, los datos indican que las variaciones de los niveles de lactato
están implicadas en el cambio de patrón de expresión de algunas citoquinas bien sea
por sus efectos intracelulares o actuando a través de su receptor. Este resultado
refuerza el papel funcional que estos últimos años se está asignando al lactato como
molécula señalizadora, frente a la interpretación tradicional que lo consideraba un
producto de desecho del metabolismo. Estos efectos son particularmente notables en
el sistema inmune y en el micro-entorno tumoral, donde alcanza concentraciones
muy elevadas y constituye un punto de confluencia entre la respuesta inmune y la
proliferación cancerosa (Haas et al., 2016; Pucino et al., 2017). Aunque estos datos
sean relevantes para explicar los distintos resultados obtenidos con los tratamientos
de inmunoterapia anticancerosa (Nenu et al., 2017; Ippolito et al., 2018), los datos
obtenidos indican que la intervención sobre el metabolismo de la glucosa en la
DISCUSIÓN
105
transcripción de citoquinas como IL23A, IL10 e IL1B no se puede explicar
simplemente por la reducción de los niveles de lactato y deben tenerse en cuenta
otros mecanismos en los que interviene la glucosa, como es la glicosilación de
proteínas.
Implicación de la respuesta a proteínas mal plegadas
Algunos estudios han desvelado que la respuesta a proteínas mal plegadas forma
parte de un programa transcripcional controlado por los receptores de
reconocimiento de patógenos en las células del sistema inmune innato (Cláudio et al.,
2013) que conduce a la activación de los elementos de la UPR tras la interacción de
los PAMP con los fagocitos. Los resultados presentados muestran que aunque el
zymosan y el LPS pueden incidir ligeramente sobre estas vías, a la vista del leve
splicing de XBP1 y el fraccionamiento de ATF6 observados, la combinación con la 2-
DG potencia significativamente la activación de las ramas IRE Y PERK de la UPR. La 2-
DG genera estrés de retículo endoplasmático al interferir con las reacciones de N-
glicosilación de proteínas por un mecanismo similar a la tunicamicina, mientras que
la tapsigargina produce el estrés por inhibición de la SERCA. El hecho de que los tres
compuestos tengan efectos similares en la modificación del patrón de citoquinas, en
respuesta al zymosan y al LPS, indicaría que es la inducción de la UPR, más que la
inhibición de la glicosilación de proteínas, el mecanismo que explicaría el aumento de
la trans-activación de IL23A. En este sentido debe mencionarse que en un modelo de
espondiloartritis en ratas se ha podido correlacionar el estrés de retículo con la
producción de IL-23 (DeLay et al., 2009).
La participación de XBP1 en la producción de citoquinas pro-inflamatorias en
macrófagos (Martinon et al., 2010), su relación directa con la transcripción de IL23A
(Wang et al., 2013) y la presencia de Cajas-X2 a las que se puede unir en el promotor
de IL23A hacían indispensable valorar la posible implicación de este factor en el
aumento de transcripción de IL23A generado por la 2-DG. Los experimentos
realizados con los inhibidores de la actividad endonucleasa de IRE1α y la manosa, que
revierten el splicing de XBP1 generado por la 2-DG, demuestran la importancia de
sXBP1 en la regulación de IL23A en respuesta al zymosan. Asimismo, los resultados
obtenidos en los estudios de ChIP confirman el aumento de la unión directa de este
factor de transcripción al promotor de IL23A cuando las células se estimulan con
DISCUSIÓN
106
zymosan en presencia de 2-DG. Dado que sXBP1 puede encontrarse en el núcleo de
las células en reposo, es posible que sea necesario algún mecanismo adicional como
puede ser la interacción con otros factores de transcripción, como se ha descrito
durante la regulación de la homeostasis de la glucosa (Zhou et al., 2011; Park et al.,
2014), o alguna modificación post-traduccional como la fosforilación por distintas
quinasas para que pueda migrar al núcleo o ejercer su funcionalidad completa (Lee et
al., 2011; Liu et al., 2016).
Los experimentos realizados con las BMDC de los ratones Ern1f/fVav1-Cre, que
presentan la deleción selectiva en el sistema hematopoyético del gen que codifica
Ire1α, confirman que una parte del efecto sobre la trans-activación de il23a puede
asociarse de forma inequívoca con esta ruta de la UPR. Aunque el abordaje
farmacológico ha proporcionado resultados compatibles con esta interpretación, no
se pueden descartar otros mecanismos puesto que la activación de NF-B está
alterada bajo condiciones de estrés en líneas celulares con knockdown de Ire1α y
fibroblastos embrionarios de ratón Ern1-/-. El mecanismo propuesto tras estos
estudios sería la formación de un complejo entre Ire1α y la quinasa de IκB (IKK) a
través de la proteína adaptadora TRAF2 (Hu et al., 2006). Además, recientemente se
ha reforzado la relación directa entre ambas rutas ya que IKKβ puede fosforilar
sXBP1 en los residuos T48 y S148 (Liu et al., 2016).
En lo que respecta a la participación de PERK, el gran incremento en la inducción del
ARNm de CHOP generada por la 2-DG confirma la activación de esta vía. Los
resultados obtenidos con los inhibidores farmacológicos sobre la transcripción de
IL23A e IL10 en las células estimuladas con LPS indicarían su participación en
respuesta a ese estímulo, pero no en el caso del zymosan, lo que de nuevo indicaría
que las distintas ramas de la UPR pueden contribuir a la producción de citoquinas de
forma dependiente del estímulo. Pueden citarse como ejemplos en este sentido la
diferente regulación de la producción de CXCL10 y CCL2 en células foto-receptoras
(Zhu et al., 2017) y la producción de IL-1β en monocitos (Snodgrass et al., 2016).
La reversión del aumento de transcripción de IL23A y de la disminución de la de IL10
producidos por la inhibición farmacológica de la ruta PERK, concuerda con los
resultados que muestran que la inhibición de PERK disminuye la respuesta al LPS
mediante la reducción de la transcripción de genes pro-inflamatorios a través de la
DISCUSIÓN
107
represión traduccional (Guthrie et al., 2016). La activación de PERK se asocia con una
activación máxima de NF-κB durante la UPR por la disminución de los niveles de IKK
(Deng et al., 2004; Tam et al., 2012) y también a través de la competencia entre la
subunidad RelA/p65 y CREB por la unión a CBP, que se encuentra en cantidades
limitadas en el núcleo (Vo y Goodman, 2001). Además, en monocitos se ha
demostrado un aumento de la producción de IL-10 ligado a la inhibición de GSK3β. La
inhibición de esta quinasa aumenta la capacidad de unión de CREB fosforilado en la
serina 133 a CBP y al ADN, paralelamente a la disminución de la unión RelA/p65 a
CBP (Martin et al., 2005). Este mecanismo coincide con los resultados obtenidos, a la
vista de la reducción de la fosforilación inhibitoria de GSK3β y la menor unión de CBP
al promotor de IL10 en presencia de 2-DG que cuando las CD se estimulan sólo con
LPS. La competencia entre NF-κB y CREB por CBP explicaría la recuperación de los
niveles del ARNm de IL-10 tras la inhibición de PERK, ya que al existir menos
subunidades RelA/p65 libres se favorecería la unión CREB-CBP y, en consecuencia, la
trans-activación de IL10.
Los experimentos de ChIP confirman la participación directa de C/EBPβ en el
incremento de la transcripción de IL23A en respuesta a la combinación 2-DG-LPS. La
asociación de C/EBPβ con la UPR ha sido objeto de investigación detallada. Se ha
descrito que C/EBPβ induce la activación transcripcional de XBP1 en adipocitos (Guo,
Li y Tang, 2015) y, a su vez, XBP1 se induce por la ocupación de una Caja-X2 presente
en células humanas y ausente en roedores (Chen et al., 2004) y también por la ruta
PERK (Hayakawa et al., 2010). Además, su condición de factor pionero en macrófagos
y su participación en la apertura de la estructura de la cromatina, posiciona a C/EBPβ
como un elemento clave para la formar enhanceosomas con otros factores y estimular
la transcripción (Plevy et al., 1997; Bradley, Zhou y Smale, 2003).
Por otra parte, se ha descrito un nuevo mecanismo por el que la ruta
PERK/JAK1/STAT3 contribuiría a la inflamación inducida por el estrés de retículo. La
dimerización de PERK atraería a JAK a su entorno, lo que permitiría de forma
sucesiva su autofosforilación, la fosforilación del dominio intracitoplasmático de
PERK en las tirosinas 585 y 619, la activación de su actividad quinasa y la
fosforilación de la tirosina 705 de STAT3 (Meares et al., 2014). Datos recientes avalan
la interconexión entre las rutas IRE y PERK a través de STAT3 ya que éste tiene un
DISCUSIÓN
108
papel crítico en la activación no canónica de la UPR mediante un mecanismo en el que
intervienen IRE1α y XBP1 y se produce tras la estimulación con citoquinas (Yan et al.,
2016). Los resultados mostrados en esta memoria indican que el zymosan y el LPS
inducen la fosforilación de STAT3, bien a través de algún mediador secundario o por
activación de la rama TRIF/TRAM en el caso del LPS/TLR4 (Rodríguez et al., 2017).
Tomados colectivamente, los datos presentados indicarían que el mecanismo
actualmente aceptado de regulación transcripcional de IL23A, en las CD, que incluye
la activación de NF-κB, ATF2 y C/EBPβ (Brain et al., 2013; Deng et al., 2004; Al-
Salleeh y Petro, 2008) es potenciado por el reclutamiento de las ramas IRE y PERK,
como se muestra en el diagrama explicativo (Figura 40).
Figura 40. Esquema de las rutas implicadas en la regulación transcripcional de IL23A durante la
respuesta a proteínas mal plegadas. En la parte superior se muestra la estructura del promotor
proximal de IL23A con los elementos reguladores para la unión de XBP1, ATF2, NF-κB y C/EBPβ. La
formación de un enhanceosoma que contiene NF-κB, C/EBPβ y XBP1 parece ser el mecanismo más
probable, con una distinta combinación de elementos dependiendo de la naturaleza del estímulo. La
ruta IRE1α está involucrada en todos los casos y afecta a la activación de NF-κB y a la actividad de
XBP1, esta última en el caso del zymosan. STAT3 se activa por los patrones fúngicos a través de
mediadores secundarios, mientras que el LPS activa IRF3 e IFNβ de forma dependiente de los
adaptadores TRIF/TRAM acoplados a TLR4. La rama PERK de la UPR y C/EBPβ son más importantes
en respuesta a LPS. Las líneas discontinuas indican rutas avaladas por otros estudios y no exploradas
en los experimentos presentados.
DISCUSIÓN
109
La relevancia clínica de estos resultados se demuestra por el hecho que las CD
presentes en el ambiente tumoral muestran una activación de XBP1 que bloquea la
respuesta inmune anti-tumoral y favorece la proliferación de las células cancerosas
(Cubillos-Ruiz et al., 2015). El presente estudio muestra que la estimulación de
distintos PRR en condiciones de estrés de retículo induce un patrón transcripcional
de citoquinas favorable a la progresión tumoral. En este sentido, se ha demostrado
que la producción de IL-23 por las células mieloides asociadas a tumor en tejidos
accesibles a productos microbianos es un factor favorecedor de la carcinomatosis de
colon (Grivennikov et al., 2012). Además, en contextos en los que la reacción
inflamatoria se influye por la presencia de IL-23, como es el caso de la ateromatosis
(Subramanian, Thorp y Tabas, 2015), se ha observado que la inhibición de la rama
IRE frena su progresión (Tufanli et al., 2017).
2.2 Efectos de la regulación de la actividad de la PKM2
La regulación de la PKM2 ha sido objeto de especial interés desde que se demostró
que se sobre-expresa en células tumorales con alto consumo de glucosa y elevada
producción de lactato, aunque el mecanismo por el que puede influir en la demanda
energética y la actividad anabólica precisas para mantener la proliferación de las
células cancerosas no se ha definido satisfactoriamente. La PKM2 cataliza la
transformación de fosfoenolpiruvato a piruvato mediante la donación de un grupo
fosfato al ADP en el último paso de la glucólisis, pero además de llevar a cabo esta
reacción, se le atribuyen distintas actividades dependientes de su conformación y
localización (Boukouris, Zervopoulos y Michelakis, 2016). La semejanza del cambio
metabólico sufrido por las células del sistema inmune con el de las células tumorales
justifica el análisis de la función de PKM2 en la reprogramación metabólica y las
consecuencias de su modulación farmacológica sobre la función efectora de las CD.
A la vista de la confirmación de que la PKM2 es la isoforma predominante en las CD,
se decidió utilizar el compuesto ML-265 para reforzar su conformación tetramérica
(Tamada, Suematsu y Saya, 2012) con el fin de aumentar el flujo glucolítico. La pre-
incubación de las células con este compuesto produjo una disminución de la
transcripción de IL23A, IL10 e IL1B inducida por el zymosan, mientras que no se
observó ningún efecto sobre la respuesta al LPS. Se ha descrito que el refuerzo de la
conformación tetramérica de la PKM2 aumenta la producción de lactato y disminuye
DISCUSIÓN
110
el flujo de piruvato, probablemente por la formación de un complejo supramolecular
con la lactato deshidrogenasa (Mazurek et al., 2001; Christofk et al., 2008; Anastasiou
et al., 2012). De forma opuesta, se ha referido que la fosforilación de la tirosina 105 de
la PKM2, que previene la formación de tetrámeros, promueve el efecto Warburg en
células tumorales (Hitosugi et al., 2009) y la glucólisis en macrófagos de ratón, y
reduce la producción de IL-1B, por un mecanismo dependiente de su presencia en el
núcleo y su asociación con otras proteínas (Palsson-McDermott et al., 2015). En
nuestro sistema no hemos observado cambios apreciables en los niveles de
intermediarios metabólicos inducidos por el ML-265, ni variaciones en la
bioenergética estudiada a tiempo real. El hecho de que la actividad de la PKM2
también se pueda regular por modificaciones post-traduccionales, como se muestra
en la Figura 41 (Yang y Lu, 2013) dificulta la elaboración de una hipótesis definida
sobre el mecanismo de acción del ML-265.
Figura 41. Mecanismo de regulación de la actividad glucolítica de la PKM2 descrito por Yang y
Lu, 2013. La actividad de la PKM2 puede regularse por intermediarios metabólicos y por
modificaciones post-traduccionales inducidas por distintos estímulos. La presencia de fructosa
bisfosfato (FBP) favorece la conformación tetramérica. El factor de crecimiento de fibroblastos 1
(FGFR1), la presencia de elevados niveles de glucosa y de especies reactivas de O2 (ROS) ejercen un
efecto opuesto.
Los experimentos de cross-linking muestran una conformación de la PKM2 en la que a
pesar de la predominancia de la forma monomérica, existe una cantidad notable de
tetrámeros, tanto en las células en reposo como tras la estimulación. Estos resultados
coinciden en parte con los de Palsson-McDermont, quienes muestran que el ML-265
inhibe la translocación nuclear de la PKM2 inducida por el LPS, sin que se aprecien
cambios en los niveles de proteína en el citosol. La microscopia confocal confirmó la
presencia de PKM2 en los núcleos de las células estimuladas con zymosan, pero no se
DISCUSIÓN
111
pudo determinar sin ambigüedad la redistribución de la PKM2 entre el citoplasma y
el núcleo. La disminución de la conformación dimérica en el núcleo podría explicar
por qué el ML-265 disminuye la fosforilación de la tirosina 705 de STAT3 inducida
por los PAMP sin que se observe efecto sobre la fosforilación de la histona, ya que en
estudios in vitro se ha determinado que la forma dimérica fosforila preferentemente
STAT3 mientras que la forma tetramérica fosforila la histona H3 (Yang et al., 2012;
Gao et al., 2012), aunque los datos disponibles indican que la forma dimérica
predomina en el núcleo. También se ha descrito el papel de cambios post-
traduccionales en la PKM2 en la mediación de su translocación al núcleo. Alguno de
estos cambios son la fosforilación en la serina 37 por ERK2 (Yang et al., 2012) y la
sumoilación (Spoden et al., 2009). Otra posible explicación de la discrepancia entre
los efectos del ML-265 y la ausencia de cambios en la conformación de PKM2 es que la
transición entre las formas monomérica/dimérica y tetramérica tiene una gran
plasticidad y parece ser especie y célula-específica. Por ejemplo, la forma tetramérica
no se encuentra en monocitos y sí en macrófagos de pacientes con enfermedad
coronaria de los que desaparece tras la estimulación (Shirai et al., 2016).
Dado que no se pudo encontrar ningún cambio metabólico asociado al ML-265 pero sí
observamos la disminución de la fosforilación de STAT3, la explicación más plausible
para la reducción en la transcripción de citoquinas podría encontrarse en la
interferencia con la actividad quinasa de esta enzima sobre algún sustrato en las rutas
de señalización activadas por el zymosan. Teniendo en cuenta que se ha definido
como uno de los mecanismos de acción del ML-265 la resistencia de la forma
tetramérica a la disociación por proteínas con fosfotirosinas (Anastasiou et al., 2012)
y que la fosforilación de tirosinas es un mecanismo de señalización ampliamente
utilizado por los receptores de lectina tipo C, no se puede descartar un efecto a este
nivel.
En resumen, los resultados obtenidos indican que el compuesto ML-265 regula la
actividad quinasa de la PKM2 y tiene efectos sobre las funciones efectoras de las
células dendríticas estimuladas por patrones fúngicos. Esto podría tener relevancia
clínica a la vista de algunos estudios que demuestran una menor mortalidad por
sepsis en relación con una menor producción de citoquinas como la IL-1β o la IL-18,
en ratones con knockout condicional de la PKM2 en células mieloides (Xie et al.,
DISCUSIÓN
112
2016). Además, el intenso desarrollo que se está llevando a cabo de moléculas que
modulen la actividad de PKM2 en procesos cancerosos (Adem, Comakli y Uzun, 2018)
es un argumento importante para profundizar en el conocimiento de su función y su
regulación en las células del sistema inmune.
Conclusiones
CONCLUSIONES
115
1. Las células dendríticas experimentan un incremento rápido y sostenido de la
glucólisis cuando se estimulan con zymosan y con LPS. La fosforilación oxidativa se
mantiene en el caso del LPS y se incrementa en respuesta al zymosan.
2. La estimulación de las CD con zymosan y con LPS estabiliza el factor de
transcripción HIF1α con un patrón temporal compatible con su implicación en el
mantenimiento del cambio bioenergético producido tras la activación celular, pero
no en el inicio del mismo.
3. La 2-DG modula el patrón transcripcional de citoquinas de manera estímulo-
dependiente. En respuesta al zymosan aumenta la transcripción de IL23A y en
respuesta al LPS aumenta la transcripción de IL23A y reduce la transcripción de
IL10 e IL1B.
4. Los niveles de lactato influyen en la transcripción de citoquinas. El lactato de sodio
aumenta el ARNm de IL23A en respuesta al zymosan y al LPS, y el ARNm de IL10 en
respuesta al zymosan.
5. El flujo de piruvato a la mitocondria es necesario para la transcripción de IL10 e
IL23A en las CD estimuladas con zymosan y con LPS.
6. La 2-DG activa la respuesta a proteínas mal plegadas y aumenta la trans-activación
de IL23A en respuesta a los PAMP. La rama IRE1α/sXBP1 está implicada en el
aumento de la transcripción en respuesta al zymosan y la rama PERK y el factor de
transcripción C/EBPβ en el caso del LPS.
7. La activación de la rama PERK está implicada en la disminución de la transcripción
de IL10 en respuesta a la 2-DG en combinación con el LPS.
8. La 2-DG aumenta la unión del factor sXBP1 a las Cajas-X del promotor de IL23A en
respuesta al zymosan y la unión de C/EBPβ a los sitios CHOP-C/EBP en respuesta
al LPS. Asimismo, en combinación con el LPS, la 2-DG disminuye la unión de CBP al
sitio CRE del promotor de IL10.
9. La modulación de la actividad de la PKM2 con el compuesto ML-265 disminuye la
transcripción del ARNm de las citoquinas IL-23, IL-10 e IL-1β en respuesta al
zymosan. Ante la ausencia de un patrón metabólico característico inducido por el
CONCLUSIONES
116
ML-265, los efectos observados pueden explicarse por la interferencia del ML-265
con la actividad proteína quinasa asociada a la PKM2 ya que el ML-265 disminuye
la fosforilación de STAT3 inducida por los PAMP.
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Anexo I
PUBLICACIONES
135
Durante la realización de la tesis he participado en diferentes proyectos de
investigación que han dado lugar a las siguientes publicaciones:
*Márquez, S., J. J. Fernández, C. Mancebo, C. Herrero-Sánchez, S. Alonso, T. A.
Sandoval, M. Rodríguez Prados, J. R. Cubillos-Ruiz, O. Montero, N. Fernández, y M.
Sánchez Crespo. 2019. Tricarboxylic Acid Cycle Activity and Remodeling of
Glycerophosphocholine Lipids Support Cytokine Induction in Response to Fungal
Patterns. Cell Rep 27 (2):525-536.e4. doi: 10.1016/j.celrep.2019.03.033.
Herrero-Sánchez, M. C., E. B. Angomás, C. de Ramón, J. J. Tellería, L. A. Corchete, S.
Alonso, M. D. C. Ramos, M. J. Peñarrubia, S. Márquez, N. Fernández, L. J. García Frade,
y M. Sánchez Crespo. 2018. Polymorphisms in Receptors Involved in Opsonic and
Nonopsonic Phagocytosis, and Correlation with Risk of Infection in Oncohematology
Patients. Infect Immun 86 (12). doi: 10.1128/IAI.00709-18.
*Márquez, S., J. J. Fernández, E. Terán-Cabanillas, C. Herrero, S. Alonso, A. Azogil, O.
Montero, T. Iwawaki, J. R. Cubillos-Ruiz, N. Fernández, y M. S. Crespo. 2017.
Endoplasmic Reticulum Stress Sensor IRE1α Enhances IL-23 Expression by Human
Dendritic Cells. Front Immunol 8:639. doi: 10.3389/fimmu.2017.00639.
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factor signaling impairs zymosan-induced release of IL-23 by dendritic cells. Biochem
Pharmacol 102:78-96. doi: 10.1016/j.bcp.2015.12.001.
*Artículos en los que están publicados la mayoría de los resultados presentados en
esta tesis.