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PROTOCOLO DE TRABAJO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
PRO YEC TO D E INVESTIGAC IÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
TÍTULO DEL TRABAJO:
EFECTO DEL FACTOR DE CRECIMIENTOEPIDÉRMICO SOBRE EL
PROCESO DE MIGRACIÓN DE CÉLULAS GH4C1
Leishmania mexicana mexicana
MAYO DE 2006
Asesor Externo:Dr. Ma. Eugenia Memdoza Garrido. Asesor interno: Yolanda Gómez y Gómez
PRESENTA:
Ortiz Lara Elizabeth
CONTENIDO CONTENIDO ...................................................................................................... ii ÍNDICE DE FIGURAS........................................................................................ iii ÍNDICE DE TABLAS.......................................................................................... iv
Título de tabla ......................................................................................... iv INTRODUCCION................................................................................................1
1.1. ANATOMIA DE LA HIPOFISIS.................................................................1 1.2. CONSTITUYENTES ANATOMICOS........................................................2
1.2.1. LA ADENOHIPOFISIS. ......................................................................3 1.2.1.1. Hormonas Adenohipofisiarias. ....................................................3
1.2.2. LA NEUROHIPOFISIS.......................................................................5 1.3. SECRECION DE LAS HORMONAS ADENOHIPOFISIARIAS. ............6
1.4. MATRIZ EXTRACELULAR. .....................................................................8 1.4.1. COLAGENA.......................................................................................9
1.4.2. PROTEOGLICANOS. ..................................................................11 1.4.3. FIBRONECTINA, LAMININA, Y OTRAS PROTEINAS DE LA MEC. ......................................................................................................11 1.4.3.2. Lámina. .....................................................................................11
1.5. ADHESION CELULAR ...........................................................................12 1.5.1. ADHERENSIA DE LAS CELULAS AL SUSTRATO.........................12 1.5.2. INTEGRINAS...................................................................................13
1.6. ADHERENCIA DE CÉLULAS A OTRAS CÉLULAS...............................15 1.6.1. SELECTINAS. .................................................................................15
1.6.2. INMUNOGLOBULINAS E INTEGRINAS. ................................16 1.6.3. CADHERINAS: ........................................................................17
1.7. MIGRACIÓN...........................................................................................18 1.8. FACTORES DE CRECIMIENTO............................................................19
1.8.1. EL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO (EGF). ................20 1.9. LA LÍNEA CELULAR TUMORAL GH4C1 y GH3..................................21
2. OBJETIVOS..................................................................................................23 2.1. OBJETIVO GENERAL. ..........................................................................23 2.2. OBJETIVOS PARTICULARES...............................................................23
3. METODOS....................................................................................................24 3.1. CONTEO CELULAR Y RELACIÓN DE VIABILIDAD CELULAR. .......24 3.2. TRATAMIENTO DE LOS CUBREOBJETOS......................................25
3.3. PREPARACIÓN DE MULTIPOZOS. ......................................................26 3.4 SEMBRADO CELULAR Y ESTIMULACIÓN CON EGF..........................26 3.5 FIJACIÓN Y TINCIÓN.............................................................................27 3.6. MONTAJE Y CONTEO. .........................................................................27
4. RESULTADOS. ............................................................................................28 4.1. RESULTADOS DE LA MIGRACIÓN DE LOS INSERTOS DE LA LÍNEA CELULAR GH3. ............................................................................................28 4.2. RESULTADOS DE LA MIGRACIÓN EN LOS INSERTOS DEL CULTIVO PRIMARIO DE ADENOHIPÓFISIS DE RATA INFANTIL..............................31 4.3. RESULTADOS DE LA CURVA DE PROLIFERACION DE LAS CELULAS GH4C1. ........................................................................................33
5. DISCUSIÓN..................................................................................................34 6.- CONCLUSIONES........................................................................................36 7. BIBLIOGRAFIA.............................................................................................37
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Título de figura Pág.
FIGURA 1. Anatomía de la hipófisis de mamífero adulto. 1 FIGURA.2. Hormonas secretadas por la hipófisis anterior.
4
FIGURA.3. Esquema de la relación entre el hipotálamo y la hipófisis posterior, o neurohipófisis, donde se secretan la hormona antidiurética (ADH) y la oxitocina.
5
FIGURA. 4. Esquema simplificado de la matriz celular, que muestra una de las relaciones entrecomponentes de la matriz y componentes del citoesqueleto.
12
FIGURA.5. Distintos tipos de uniones en los que participan las integrinas; las características de cada una depende de la clase de proteína transmembranal comprometida y la naturaleza del sustrato.
14
FIGURA.6. Esquema de los tres tipos de selectinas y del carbohidrato ligando al cual se enlaza.
15
FIGURA.7. Moléculas de adherencia de células de la superfamilia de Ig. Representación esquemática de la adherencia de las célula a célula resultantes de interacciones especificas entre dominio Ig de dos moléculas de adherencia a células neurales que se proyectan desde la superficie de células vecinas.
16
FIGURA.8.Cadherinas y adherencia celular. Representación esquemática de dos células adheridas entre si como resultado de las interacciones entre tipos similares de cadherinas proyectadas desde la membrana plasmática de cada célula.
17
FIGURA.9. Migración vertical de cámara de Boyden de las células GH3.
29
FIGURA.10. Migración vertical de cámara de Boyden de las células de células adenohipofisiarias de rata infantil.
31
FIGURA.11.Curva de proliferación de las células GH4C1 33 FIGURA. 12Imagen de las células GH3 que migraron en el sistema vertical cámara de Borden
30
FIGURA. 13Imagen de las células GH3 que migraron en el sistema vertical cámara de Borden.
30
iv
ÍNDICE DE TABLAS
Título de tabla Pág.
TABLA 1. Hormonas de lóbulo anterior (adenohipofisis). 7
TABLA.2. Tipos de colágenas.
10
1
INTRODUCCION.
1.1. ANATOMIA DE LA HIPOFISIS.
La hipófisis o glándula pituitaria es una glándula endocrina situada en la base
del cerebro y parece una prolongación del hipotálamo al que esta unida por un
tallo delgado, el tallo hipofisiario. Se encuentra alojada en la fosa del hueso
esfenoides, llamada silla turca (Figura 1.).
FIGURA 1. Anatomía de la hipófisis de mamífero adulto.
Mide aproximadamente 1 cm de largo, de 1 a 1.5 cm de ancho y 0.5 cm. de
altura. Pesa alrededor de 0.5 g en el hombre y un poco más de la mujer. A
pesar de su pequeño tamaño es uno de los órganos más importantes del
cuerpo: producen al menos siete hormonas, y mantiene muchas relaciones
recíprocas con otras glándulas endocrinas. Se encuentra alojada en una fosa
del hueso esfenoides, llamada silla turca.
2
1.2. CONSTITUYENTES ANATOMICOS.
La hipófisis es una glándula compleja compuesta por varios tipos celulares los
cuales son responsables de la producción de varias hormonas, se compone por
lóbulos, los cuales tienen un origen embriológico diferente.
Lóbulo anterior o adenohipófisis.
Lóbulo posterior o neurohipófisis.
El lóbulo anterior o adenohipófisis (parst distalis), es el lugar en donde se
produce la síntesis y secreción hormonal y se compone principalmente de 5
tipos celulares productores de hormonas y un tipo no secretor, además de
células endoteriales y macrófagos. Los papeles más importantes del lóbulo
intermedio son de sintetizar la hormona estimulante de los melanocitos y
endorfinas. El lóbulo posterior de la hipófisis es una extensión del sistema
nervioso central, las principales hormonas liberadoras por el lóbulo posterior
son lo oxitocina y la vasopresina (Histología 2000).
3
1.2.1. LA ADENOHIPOFISIS.
La adenohipófisis o lóbulo anterior de la hipófisis secretan hormonas que
regulan una amplia gama de actividades corporales, desde el crecimiento hasta
la reproducción. Su liberación la estimulan hormonas liberadoras y la inhiben
hormonas inhibidoras, de origen hipotálamico.
1.2.1.1. Hormonas Adenohipofisiarias.
Las seis principales hormonas principales que secretan la adenohipófisis o
lóbulo anterior de la hipófisis son las siguientes (Figura.2.), (Tortora y
Anagnostakos, 2001):
• La hormona de crecimiento humana o samatotropina, que secretan
las células somatotrofas del lóbulo anterior de la hipófisis. Esta hormona
estimula diversos tejidos para la secreción de factores de crecimiento,
los cuales son hormonas que estimulan el crecimiento corporal general y
regulan ciertos aspectos del metabolismo.
• La hormona estimulante a la tiroides (TSH) o tirotropina, que regulan
las secreciones y otras actividades de la tiroides, se sintetizan en las
células tirotrofas de adenohipofisis.
• Las hormonas foliculoestimulante (FSH) y luteinizante (LH), que
secretan las células gonadotrofas. Ambas tienen efectos en las gónadas:
estimulan la secreción de estrógenos y progesterona.
4
• La prolactina (PRL), que inicia la producción de leche en las glándulas
mamarias tras su liberación por las células lactotrofas.
• La hormona adrecorticotrópina (ACTH), o corticoprina la cual
sintetiza las células corticotrofas y estimula la secreción de
glucocorticoides para la corteza suprarrenal. Algunas de estas células,
que son restos del lóbulo mediano, también secretan la hormona
estimulante de los melanocitos.
FIGURA.2. Hormonas secretadas por la hipófisis anterior.
5
1.2.2. LA NEUROHIPOFISIS.
El lóbulo posterior o neurohipofisis, no sintetizan hormonas; pero si almacena y
libera dos hormonas, consta de pituicitos y terminales axónicas de las células
neurosecretadoras hipotalámicas, (Figura.3)
Distintos tipos de células neurosecretadoras producen dos hormonas que son:
La oxitocina (OT).
La hormona antidiurética (ADH) o vasopresina.
FIGURA.3. Esquema de la relación entre el hipotálamo y la hipófisis posterior, o neurohipófisis, donde se
secretan la hormona antidiurética (ADH) y la oxitocina.
6
1.3. SECRECION DE LAS HORMONAS ADENOHIPOFISIARIAS.
Las hormonas hipotalámicas llegan al lóbulo anterior de la hipófisis por medio
de un sistema portal. En este sistema, la sangre fluye de la eminencia media
del hipotálamo al infundíbulo y lóbulo anterior de la hipófisis principalmente por
varias arterias hipofisarias superiores. Las arterias hipofisarias superiores
forman el plexo primario del sistema portal hipofisario, que es una red de
capilares en la base del hipotálamo
La secreción de las hormonas adenohipofisiarias se regulan de dos maneras:
La primera consiste en que las células neurosecretadoras del hipotálamo
secreten 5 hormonas liberadoras que estimulan la secreción del lóbulo anterior
de la hipófisis (tabla 1)
En la segunda, señales de retroalimentación negativa en forma de hormonas
que liberan las glándulas blancas, ajustan las secreciones de las células
adenohipofisaria.
7
TABLA 1. Hormonas de lóbulo anterior (adenohipofisis).
HORMONA
FUENTE DE
SECRECION
HORMONAS
LIBERADORAS
(HORMONA QUE LIBERA)
HORMONAS
INHIBIDORAS
La hormona de
crecimiento
humano (GH)
Células
somatotrofas
Hormona liberadora de la
hormona del crecimiento
(GHRH), también llamada
somatocrinina.
Hormona inhibidora
del la hormona de
crecimiento (GHIH) y
somatostatina.
Hormona
estimulante a la
tiroides (TSH)
Células
tirotrofas
Hormona liberadora de
tirotropina (TRH)
--------
Hormonas
foliculoestimulante
(FSH)
Células
gonadotrofas
Hormona liberadora de
ganodotropinas (GnRH)
--------
Luteinizante (LH) Células
gonadotrofas
Hormona liberadora de
ganodotropinas (GnRH)
-------
Prolactina (PRL), Células
lactotrofas
Hormona liberadora de
tirotropina THR y CRH
Hormona inhibidora de
la prolactina (PIH), o
sea, dopamina.
Hormona
adrecorticotrópina
(ACTH)
Células
corticotrofas
Hormona liberadora de
corticotripina (CRH)
-------
Hormona
estimulante de los
melanocitos.
Células
corticotrofas
Hormona liberadora de
corticotripina (CRH)
Dopamina
8
1.4. MATRIZ EXTRACELULAR.
La matriz extracelular es una red compleja de macromoléculas que se
encuentra en el espacio extracelular de los tejidos. La evidencia de los estudios
realizados indica que esta matriz no tan solo tiene un papel estructural para
mantener las células unidas entre si, dándole rigidez a los tejidos, sino que
juegan un papel importante en muchos procesos biológicos tales como el
desarrollo, proliferación celular y metabolismo.
Esta compuesta por proteoglicanos y glicoproteínas; principalmente
fibronectina, colágena laminina nidogen, heparina, heparan sulfato y pertecan;
sin embargo, la composición de la matriz que secretan todas las células varía
dependiendo del tipo celular grado de diferenciación y estado metabólico en
que se encuentra. La célula tiene en su membrana receptores que interactúan
específicamente con cada componente de la matriz; el extremo citoplásmico de
esos receptores, se conecta con los componentes del citoesqueleto activando
muchas vías de señalización que participan en la regulación de la adhesión y
crecimiento celular, y en cultivo la agregación y extensión (Erika, 2005).
Una de las matrices extracelulares mejor definida es la membrana basal (o
lámina basal), capa engrosada de unos 50 a 200 nm que rodea a la superficie
de las células musculares. La membrana basal también sirve como barrera
contra la invasión de tejidos por células cancerosas errantes (Biología
Molecular, 2001).
9
1.4.1. COLAGENA.
Las colágenas son una familia de glucoproteínas fibrosas que forman parte
exclusivamente de matrices extracelulares a las que les confieren sus
propiedades fundamentales, estas constituyen la proteína simple más
abundante en el cuerpo (más de 25% de toda la proteína), hecho que refleja la
importancia y amplia distribución de las matrices extracelulares
La colágena se produce principalmente en los fibroblastos, células presentes
en diferentes en diferentes tipos de tejidos conectivos, y en células epiteliales.
Hasta ahora se han identificado más de 15 tipos distintos de colágena, algunos
descritos en la (tabla2). Son el principal componente de la matriz extracelular;
estas moléculas forman fibrillas por la interacción entra cadenas de diferentes
tipos de colágenas (I; II; III; V o X) de manera que forman una estructura similar
a una trenza.
No todas las colágenas formas fibrillas. Una de las colágenas no fibrilares es
de tipo IV cuya distribución se restringe a las membranas básales. Las
membranas son láminas de apoyo muy delgadas y las moléculas de colágena
tipo IV se organizan formando una red aplanada que sirve como estructura
para el depósito de otros materiales de la matriz extracelular.
10
TABLA.2. Tipos de colágenas.
TIPO
FORMULA
MOLECULAR
FORMULA
POLIMERAZA
DISTRIBUCION EN
TEJIDOS
I
[α• (I)]2 α2(I)
Fibrilla
hueso, piel, tendón,
ligamentos, etc.
II
[α• (II)]3
Fibrilla
cartílago, disco intervertebral,
notocorda
III
[α• (III)]3
Fibrilla
Piel, vasos
sanguíneos, órganos internos
V
[α• (V)]2 α2(V)
fibrilla (tipo I)
Como para el tipo I
XI
α• (XI) α2(XI)•α3(XI)
fibrilla (tipo II)
Como para el tipo II
IX
α• (IX) α2(IX)•α3(IX)
asociación
lateral
Cartílago
IV [α• (IV)]2 α2(IV)
red laminar
lámina basal
FORMADORAS DE FIBRILLAS (FIBRILARES)
ASOCIADAS FIBRILLAS
FORMADORAS DE REDES
VII [α• (VII)]3
fibras de anclaje
Epitelio escamoso
estratificado inferior
11
1.4.2. PROTEOGLICANOS.
Además de la colágena, las matrices extracelulares típicamente contienen una
gran cantidad de un tipo distintivo de complejo proteinicopolisacárido
denominado proteoglicano. Un proteoglicano consta de una molécula proteínica
central a la cual se unen cadenas de glucosaminglicanos (GAG). El papel de la
colágena y de los proteoglicanos en la estructura y función de la matriz
extracelular se puede ilustrar en el tejido cartilaginoso
1.4.3. FIBRONECTINA, LAMININA, Y OTRAS PROTEINAS DE LA MEC.
1.4.3.1. Fibronectina.
La fibronectina es una familia de glicoproteínas de bajo peso molecular (45
kDa) que se encuentran en el plasma y en la matriz extracelular, es una de las
proteínas extracelulares mejor estudiadas, la cual consta de una subunidad α• y
una β unidas por puentes disulfuro. La fibronectina es empleada en cultivo de
células para proporcionar a éstas una superficie donde adherirse y crecer.
1.4.3.2. Lámina.
La lámina es una glicoproteina que se localiza específicamente en células
epiteliales y en sus membranas básales, cuyos polipéptidos, igual que los de
fibronectina, contienen dominios distintos con sitios de enlaces específicos
además de enlazarse fuertemente a los receptores de la superficie celular. La
lámina tiene la capacidad para actuar de forma reguladora e influir en el
potencial de crecimiento y diferenciación de la célula.
12
1.5. ADHESION CELULAR
1.5.1. ADHERENSIA DE LAS CELULAS AL SUSTRATO.
La matriz, entre otras de sus funciones, cumple con las de organizar a las
células en tejidos, proporcionando el medio para que se propaguen señales
que pueden indicar a las células que crezcan y proliferen. (Figura. 4).La
interacción de la matriz extracelular es captada a través de receptores de
membrana. Además, estos permiten que las células se anclen a la matriz
extracelular, los receptores son de la familia de las integrinas inmonoglobulal.
FIGURA. 4. Esquema simplificado de la matriz celular, que muestra una de las relaciones
entrecomponentes de la matriz y componentes del citoesqueleto.
13
1.5.2. INTEGRINAS.
Las integrinas son heterodímeros transmembranales, compuestos por dos
cadenas polipeptídicas llamadas alfa (α) y beta (β), reunidas por enlaces no
covalentes. Se han identificado más de 15 tipos diferentes de la subunidad alfa
y 10 variantes de la cadena beta, ambas subunidades de integrina, alfa y beta
poseen gran porción extracelular donde se encuentran los sitios de enlaces
para ligandos específicos.
La función de las integrinas, radican en conectar la matriz con el citoesqueleto
de forma específica a través de uniones células sustrato, esto es posible
gracias a que son proteínas transmembranales cuyo dominio intracelular se
une a filamentos intermedios del citoesqueleto mientras que el otro extremo
reconoce las proteínas que componen la matriz.
La función primaria de las integrinas es mantener la adhesión entre las células
y de éstas con los componentes estructurales de los tejidos de sostén que las
rodean o sea la matriz extracelular. Dichas uniones se forman y refuerzan entre
sí, en una secuencia que se inicia con el contacto del receptor y con la
molécula específica de la MEC en el exterior de la célula. Al sumarse más de
estos puentes, se consolida una estructura compleja y firme, llamada placa de
adhesión focal Las uniones en las que intervienen las integrinas son de varios
tipos, gracias a la gran variedad que tienen dichas glicoproteínas (Figura.5).
14
FIGURA.5. Distintos tipos de uniones en los que participan las integrinas; las características de cada una
depende de la clase de proteína transmembranal comprometida y la naturaleza del sustrato.
Pero las células no sólo se asocian a la MEC y se unen gracias a las integrinas,
sino que éstas les permiten dialogar entre el medio externo y el interno celular,
intercambiando información y estímulos. La actividad de las integrinas como
traductores de señales es bidireccional, o sea que conducen información tanto
de afuera hacia adentro de la célula como a la inversa.
15
1.6. ADHERENCIA DE CÉLULAS A OTRAS CÉLULAS.
La adherencia de células a otras células es mediada por varias familias
distintas de proteínas integrales de membrana: selectinas, cadherinas y
miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas.
1.6.1. SELECTINAS.
Las selectinas son una familia de glucoproteínas integrales de membrana que
reconoce disposiciones específicas de grupos de carbohidratos que sobresalen
de la superficie de otras células y median interacciones transitorias
dependientes de calcio entre los leucocitos (Figura.6).
FIGURA.6. Esquema de los tres tipos de selectinas y del carbohidrato ligando al cual se enlaza.
16
1.6.2. INMUNOGLOBULINAS E INTEGRINAS.
Las moléculas de adherencia célula a la superfamilia Ig son medidoras de la
adherencia célula a célula independiente de calcio, como se ejemplifica con
moléculas de adherencia a células neurales, que desempeñan un papel
importante en el desarrollo del sistema nervioso. Una proteína IgSF sobre una
célula puede interactuar con una integrina o con la misma, o con otra proteína
IgSF de otra célula (Figura.7).
FIGURA.7. Moléculas de adherencia de células de la superfamilia de Ig. Representación esquemática de
la adherencia de las célula a célula resultantes de interacciones especificas entre dominio Ig de dos
moléculas de adherencia a células neurales que se proyectan desde la superficie de células vecinas.
17
1.6.3. CADHERINAS:
Las cadherinas son una familia de cuando menos 12 glucoproteínas
relacionadas que median la adherencia celular dependiente de Ca2+. Las
cadherinas se unen a células similares entre sí y de manera preferencial a las
mismas cadherinas presentes en la superficie de la célula vecina (FIGURA.8).
FIGURA.8.Cadherinas y adherencia celular. Representación esquemática de dos células adheridas entre
si como resultado de las interacciones entre tipos similares de cadherinas proyectadas desde la
membrana plasmática de cada célula.
18
Las cadherinas son particularmente importantes durante el desarrollo
embrionario, además de su papel en la adherencia celular, todas estas
proteínas tienen un potencial para actuar como intermediarias en las señales
transmembranales.
1.7. MIGRACIÓN.
La migración comienza con una protusión o extensión de la membrana
plasmática en el borde anterior de la célula. Las protusiones son impulsadas
por una red de filamentos de actina del citoesqueleto y son estabilizados a
través de la formación de complejos de adhesión. Los complejos de adhesión
son regiones de la membrana plasmática donde las integrinas, filamentos de
actina y las proteínas asociadas se congregan. Los complejos de adhesión
pequeños, que se están formando en el frente de la protusión, aumentan y se
refuerzan en estructuras de mayor tamaño, en complejos de adhesión más
organizados, que sirven como puntos de tracción por sobre los cuales el
cuerpo celular se mueve. Finalmente la liberación de la adhesión en la parte
posterior de la célula permite un desplazamiento neto del cuerpo celular.
19
1.8. FACTORES DE CRECIMIENTO.
Los factores de crecimiento comprenden una amplia familia de moléculas que
estimulan la proliferación celular mediante su interacción con un receptor
específico de membrana. Uno de los factores que son secretados por la
adenohipófisis, es el factor de crecimiento epidérmico (EGF) ya que es
preferencialmente expresado por las gonadotropas, las somatotropas y las
tirotropas. La hipófisis es el mayor productor del bEGF; sin embargo su
producción es raramente detectable y se encuentra sujeta a la inducción por
estrógenos en las gonadotropas. En el tejido hipófisiario el EGF presenta
receptores con actividad de tirosina cinasa, por el medio del cual se puede
inducir un aumento en la secreción de TSH y PRL estimulada por la TRH
hipotalámica. El bEGF no ejerce ningún efecto en la secreción basadle PRL en
la hipófisis de ratón, aun en concentraciones mayores de 100 pM, a diferencia
de lo observado es las líneas celulares GH4 y GH3 en las cuales si induce un
incremento en la secreción de PRL.
El TGFα es secretado en la hipófisis principalmente por las células lactotropas
aunque también puede encontrarse en las somatotropas y comparten receptor
con el EGF. El EGF es secretado por cualquiera de los tipos de células
secretadoras, y así mismo se encuentran receptores al EGF en los diferentes
tipos celulares que conforman a la glándula normal de la rata. Las condiciones
directas del EGF sobre las células secretadoras se la hipófisis anterior se
encuentran en un amplio rango de acciones que pueden ir desde la
estimulación secretadoras de varias hormonas por estimulación directa
influyendo hasta la diferenciación de las células secretadoras.
20
En líneas celulares derivadas de la hipófisis como GH3/D6 y GH4C1, el EGF a
concentraciones nanomolares inhibe la proliferación, efecto que se acompaña
de un aumento en la síntesis de PRL e inhibición de la secreción GH. Además
de estas acciones sobre las células secretadoras de PRL y GH, también se ha
demostrado que el EGF en dosis altas induce la secesión de ACTH. Una
observación aun mas interesante en la línea celular GH3, es el papel en la
diferenciación de dichas células que presenta el EGF, como la aplicación de los
receptores a dopamina así como los canales de calcio dependientes de voltaje
los cuales son características de las células lactotropas, (Balby. 2003).
1.8.1. EL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO (EGF).
Los conocimientos actuales indican que el EGF es una proteína globular de 6.4
KD, con efectos mitogénicos, morfogénicos e inductores de migración celular,
es un polipéptido consiste de 53 aminoácidos; el cual es secretado, de manera
muy importante. Los EGF de distintas especies animales tienen en común 6
cisteínas, ya que estos dominios de cisternas se han reportado como
esenciales
El EGF se ha localizado principalmente en la glándula submandibular y en
menor cantidad en pie, glándulas mamarias, pulmón, cerebro, bazo, ovario, ojo,
riñón, páncreas. Como otros factores de crecimiento el, EGF estimula la
proliferación y diferenciación celular. El EGF puede comportarse como una
hormona ejerciendo sus acciones de manera endocrina, autocrina, y/o
paracrina, acciones que efectúa a través de un receptor de membrana
plasmática en sus células blanco. De los estudios que reportan acciones del
EGF en la linea tumoral GH3, se ha encontrado que inducen cambios en la
producción de hormonas: incrementa la síntesis de PRL, inhibe la síntesis de
GH y reduce la proliferación celular.
21
El receptor para el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una
proteinquinasa de 170 KDa, el cual esta dividido en dos dominios, los cuales
están separados por una región hidrofóbica transmembranal de 23
animoácidos un dominio extracelular de 621 aminoácidos (que contiene el sitio
de unión al EGF) y un dominio citoplasmático carboxilo terminal de 542
aminoácidos con sitios específicos de fosforilación en residuos de tirosina,
fundamentalmente.
El EGFR no sólo es importante en la proliferación celular sino que interviene en
procesos que tienen que ver con la progresión del tumor, como la motilidad de
las células, adhesión celular, invasión y angiogénesis.
1.9. LA LÍNEA CELULAR TUMORAL GH4C1 y GH3.
En 1968, Tashjian y colaboradores establecieron varias líneas celulares a partir
de adenomas hipofisiarios de ratas Wistar adultas (7 meses de edad). La clona
GH3 se caracterizó por estar constituida por células redondas que crecen en
cúmulos y secretan grandes cantidades de hormona de crecimiento (5µg/día)
(Tashjian et al., 1968). Más adelante se continuó estudiando estas células y se
encontró que el citoesqueleto de actina de las células GH3 quiescentes se
arregla en anillos corticales (Yoneda et al., 2000).
Se ha documentado que la exposición de las células GH3 y sus subclonas a las
hormonas: insulina, hormona estimulante de los tirotropos (TRH), estradiol, así
como a los factores de crecimiento epidérmico y neural, resulta en la inhibición
parcial de la proliferación, aumento en la síntesis y secreción de prolactina,
incremento en el número de canales HVA, aparición de receptores a dopamina
22
y a TRH (Hapgood et al., 1983; Rhode & Gorski, 1991; Félix et al., 1995; Xie et
al., 1998; Kakeya et al., 2000; Czarnecki et al., 2003) que se asocia con la
activación de diferentes vías de señalización (Johnson et al., 1980; Picket &
Gutierrez-Hartmann, 1995; Watters et al., 2000). Asimismo, las células GH3
cambian su morfología, de una forma redonda a una alargada, cuando son
estimuladas con el EGF (Johnson et al., 1980; Hapgood et al., 1983).
Las células GH3 han sido utilizadas como modelo para estudiar el
comportamiento de las células hipofisiarias en las primeras etapas del
desarrollo postnatal por sus características morfológicas y de secreción
hormonal, que comparten con las células de cultivos primarios (Félix et al.,
1995).
23
2. OBJETIVOS.
2.1. OBJETIVO GENERAL.
Estudiar la capacidad de migrar de las células GH3 y proliferación de los
diferentes tipos de matriz extracelular y analizar la participación del EGF en
este proceso en un sistema horizontal de migración.
2.2. OBJETIVOS PARTICULARES.
Realizar curvas de proliferación de las células GH3 cultivadas en un medio
definido.
Estudiar el procesos de migración en un sistema vertical cámara de Borden de
las células GH3 sobre colágena tipo I/III, colágena I/III más fibronectina,
colágena tipo IV, colágena IV más laminina, laminina, y albúmina de suero de
bovino (como control).
Estudiar la participación del EGF en el proceso de migración en un sistema
vertical de cámara de Boyden de las células GH3 sobre colágena VIII, colágena
VIII más fibronectina, colágena tipo IV, colágena IV más lamina, lamina, y sin
matriz (como control).
24
3. METODOS.
3.1. CONTEO CELULAR Y RELACIÓN DE VIABILIDAD CELULAR.
Por el método de exclusión de azul de tripano se medio la viabilidad celular. Se
preparo una solución en una porción 1:5, de la manera siguiente:
A 20 µl de suspensión celular se le agregaron 30µl de medio definido y 50 µl
azul de tripano al 4%, el cual el azul de tripano este ultimo se dejos por espacio
de cinco minutos. Después de ese tiempo, se tomo una alícuota de la solución
preparada anteriormente con el fin de contar las células en los diez cuadros de
un hemocilometro. Las células que no son viables se tiñen de un color azul, ya
que el colorante penetra por las membranas rotas de las células muertas,
mientras que las células viables son aquellas que no son teñidas.
Para determinar él numero total de células por unidad de volumen; así como
para conocer la relación de células vivas y muertas se utilizara la siguiente
ecuación, la cual nos permite determinar él número total de células por unidad
de volumen:
Y= [(A/10) (5) (104)] Ecuación 1.
Donde:
Y= Células por mililitro
A= Total de las células contadas en el hemocitometro
5= Factor de dilución
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Mientras que la ecuación 2 nos permite calcular el % de viabilidad
W = V+M
S = [V/W] [100] Ecuación.2.
Donde:
W= Son las células totales
S = Porcentaje de viabilidad
V= Células vivas no viables (no teñidas)
M= Células muertas (teñidas)
3.2. TRATAMIENTO DE LOS CUBREOBJETOS.
Los cubre objetos redondos de 13mm de diámetro para los pozos que llevaron
los insertos Millicell), se sometieron a un tratamiento con una solución de ácido
sulfúrico al 20% durante 1 hora, solución de la cual se lavaron con agua
destilada. Se lavaron de 4-6 veces, se secaron succionando el líquido y se
sumergieron en hidróxido de sodio 1N durante 5 minutos. Al término de este
tratamiento se lavaron y secaron con vacío para dar a los cubreobjetos un
tratamiento con APTS (3-aminopropyltriethoxysilane ) el cual se une por medio
de cargas al vidrio así tratado y por el lado otro lado se une a la colágena
sirviendo de puente de unión entre el vidrio y la colágena. Después de un
periodo de 4min sumergidos en el ATPS, los cubre objetos se lavaron 6 veces
con agua destilada y fueron secados por succión.
26
3.3. PREPARACIÓN DE MULTIPOZOS.
Se utilizaron cajas de cuatro pozos, con un área de cultivo de 1.9 cm2/pozo.
Para observar la migración en este sistema se utilizaron insertos Millicell para
cultivo con membranas porosas de poliestireno con diámetro de poro de 12 µm.
En un primer ensayo se colocaron cubre objetos redondos por duplicado
recubiertos con colágena IV (250 µl/1ml) más laminina. Mientras en los pozos
se colocaron insertos recubiertos por encima de la membrana porosa con la
colágena tipo I y III (3mg/ml). Una vez que se hubieron secado las colágenas
durante 1 hora dentro de la campana. Los insertos y los pozos se esterilizaron
con luz U.V. no más de 15 minutos y se llenaron con 800ì l de medio definido.
3.4 SEMBRADO CELULAR Y ESTIMULACIÓN CON EGF.
Las células se sembraron en el centro de cada uno de los insertos. Desde el
primer día se le agregó EGF (50 ng/ml) ó el vehículo (medio de cultivo), en el
mismo lugar donde se sembraron las células así como también se le agregó en
el medio de cultivo del pozo. Después de un periodo de 48 hs de cultivo
durante el cual las células migraron a través de la membrana porosa se
procedió a fijar las células de los cubreobjetos localizados en los pozos de la
caja de cultivo del sistema de la cámara Boyden.
27
3.5 FIJACIÓN Y TINCIÓN.
Posteriormente al periodo de incubación, se retiró completamente el medio de
los pozos e inmediatamente se agregaron 2 ml de paraformaldehido al 4%.
Después de un tiempo de 30 minutos se retiro el fijador y las células se fueron
lavardas tres veces con D-PBS 1X. En seguida, las células fueron teñidas con
azul de toluidina al 1% durante 7 a 10 min. El exceso de colorante se retiró y se
lavaron las células con agua corriente.
3.6. MONTAJE Y CONTEO.
Después de que se lavó el exceso del colorante los cubre objetos secos se
montaron con medio montaje acuoso. Dicha resina permite que las células
mantengan la forma que adquirieron ya que es compatible con preparaciones
con que contengan agua y por lo tanto no daña el estado de hidratación de las
células que hayan sido fijadas. Para realizar el conteo de las células se
contaron diez campo al azar barriendo el cubre objetos, utilizándose un
microscopio invertido Axiolab (Zeizz, Alemania) con un objetivo de 20X.
Los resultados se presentan como la media ± el error estándar de la media. Se
analizaron los datos por medio de la prueba estadística no-paramétrica de
Kruskal-Wallis seguido de una post-prueba de comparación múltiple de Dunn.
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4. RESULTADOS.
Se decidió utilizar un método de dos compartimentos, superior e inferior,
separados por una membrana porosa la cual permite el paso de las células
llamado cámara Borden, ya que las células GH3 proliferan en racimos,
observándose que las células llegan a flotar en el medio de cultivo. En una
cámara horizontal de migración este tipo de comportamiento celular hace
imposible tener un estimado certero de las células que migran ya que se puede
sobreestimar por el hecho que las células flotantes se dispersen en el área de
migración.
4.1. RESULTADOS DE LA MIGRACIÓN DE LOS INSERTOS DE LA LÍNEA CELULAR GH3.
En el sistema de migración vertical o cámara de Boyden (sistema de los
insertos), se observó que las células GH3 migran a través de los poros de la
membrana hacia el pozo de la caja de cultivo y se adhieren al sustrato de
colágena más laminina que se encuentra cubriendo los cubreobjetos de vidrio
presentes en el fondo del pozo. En la figura 9 se observa el número de células
totales que migraron hacia el compartimiento inferior. El comportamiento
migratorio se incrementó un 132 % en presencia del 30 ng/ml de EGF. Cuando
la membrana porosa se cubrió con colágena tipo I/III las células GH3 migraron
en un número relativamente mayor, 27 %, que aquellas células que no
estuvieron en contacto con la colágena I/III. Ahora bien, al estimular las células
que estuvieron en contacto con colágena I/III con EGF el incremento en el
número de células que migraron fue de 308 % con respecto al grupo control sin
29
estímulo de colágena I/III ni EGF, y de 76 % con respecto al grupo que sí
recibió el estímulo con EGF (Figura.9.).
Células GH3
0
100
200
300S in EGFSin Col
S in Col I / I I I Con Col I / I I I
Cél
ulas
/ C
ampo
FIGURA.9. Migración vertical de cámara de Boyden de las células GH3. Las células se sembraron sobre
colágena I/III en la membrana del inserto y se recibieron sobre colágena IV/Laminina, sin EGF o con
EGF 5nM pozo e inserto.
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FIGURA. 12.Imagen de las células GH3 que migraron en el sistema vertical cámara de Borden. En el
panel A se muestran a las células que migraron en presencia de la colágena I/III y sin recibir el estimulo
del EGF, el panel B corresponde a las células que migraron en presencia de la colágena I/III, recibiendo el
estimulo del EGF.
FIGURA. 13.Imagen de las células GH3 que migraron en el sistema vertical cámara de Borden. En el
panel A se muestran a las células que migraron en ausencia de la colágena I/III y sin recibir el estimulo
del EGF, el panel B corresponde a las células que migraron en ausencia de la colágena I/III y del EGF.
A B
B A
31
4.2. RESULTADOS DE LA MIGRACIÓN EN LOS INSERTOS DEL CULTIVO PRIMARIO DE ADENOHIPÓFISIS DE RATA INFANTIL.
En esta segunda parte del experimento también se utilizó el sistema vertical
cámara de Boyden (sistema de los insertos), y se sembraron células de la
adenohipófisis de rata infantil. A diferencia del experimento anterior, el
cubreobjetos presente en el fondo del pozo se encontraba cubierto con
colágena tipo I/III.
I nfant il
0
50
100
150
Sin EGF
Con EGFi
Sin EGF Con EGF i
célu
las
/ca
mpo
FIGURA.10. Migración vertical de cámara de Boyden de las células de células adenohipofisiarias de rata
infantil. Las células se sembraron sobre colágena I/III en la membrana del inserto y se recibieron sobre
colágena IV/Laminina, sin EGF o con EGF 5nM en el inserto. Luego de 48 horas de cultivo las
células que se encontraron en los pozos se fijaron, tiñeron y se contaron.
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Como se puede apreciar en la figura 10, el ensayo de migración de células
adenohipofisiarias infantiles muestra que el EGF favorece la migración celular.
En esta parte del experimento podemos observar que aún sin la presencia de
una matriz proteica, como es la colágena I/III, las células adenohipofisiarias
infantiles migran, así como las células GH3 (figura 9). En las células
adenohipofisiarias infantiles la estimulación con EGF incrementa este
fenómeno, 30 %, al igual que en las células GH3. Cabe hacer notar que el
aumento en el número de células que migran es menor en las células de
adenohipófisis que en las células tumorales GH3.
33
4.3. RESULTADOS DE LA CURVA DE PROLIFERACION DE LAS CELULAS GH4C1.
En la figura 11 se puede observar la curva de proliferación de las células
tumorales GH4C1. Durante las primeras 24 hs de cultivo se aprecia el periodo
“lag” seguido del crecimiento exponencial. La duplicación del número de células
sembrado se observa hasta los 5 días de cultivo.
CU R V A D E P R O L I F E R A CI O N
0 1 2 3 4 50 .00
0 .25
0 .50
0 .75
1 .00
D í as d e cu l t i v o
Ab
sorb
an
cia
(A
55
0/A6
90)
FIGURA.11.Curva de proliferación de las células GH4C1
34
5. DISCUSIÓN.
Nuestros resultados muestran que las células GH3 presentan una conducta
migratoria cuando son cultivadas en un medio definido. Sabemos, además, que
estas células tumorales proliferan en forma de racimos y se mantienen vivas
con solo la adhesión de tipo célula-célula a diferencia de lo que hemos
observado con la línea celular Lβ4, de origen adenohipofisiario con fenotipo
gonadotrofo, las cuales proliferan en parte en racimo pero las células mueren si
no se encuentran adheridas a sustrato (Datos que no se muestran). Esto último
se observa con el cultivo primario de adenohipófisis. Estos datos nos muestran
el carácter tumoral que presentan las células GH3 y permite entender el
fenómeno de movilidad celular espontáneo que presentan estas células. Al
comparar el número de células adenohipofisiarias infantiles que migran con
respecto a las células GH3 observamos que las primeras presentan una tasa
de migración mayor. Lo anterior se puede explicar por la situación fisiológica
que tienen las células adenohipofisiarias infantiles durante las primeras etapas
de desarrollo postnatal, ya que se encuentran reacomodándose para adquirir la
citoarquitectura del adulto, lo cual implica un comportamiento migratorio activo
(Bello-Pineda; Balby). De acuerdo con el trabajo de González (2004) las células
adenohipofisiarias infantiles tienen una mayor capacidad de migrar que las
células de adenohipófisis de rata adulta.
Cuando las células estuvieron en contacto con una matriz extracelular de
colágena tipo I/III, el comportamiento migratorio de las células GH3 se observó
incrementado. Se sabe que la colágena tipo I/III es un inductor de la migración
celular, como ocurre con las células de la cresta neural cuya vía migratoria se
encuentra tapizada por una matriz de colágena tipo I/III así como de
fibronectina (Nosotros tenemos contemplado utilizar la mezcla de colágena I/III
más fibronectina en ensayos de migración). Nuestros resultados muestran que,
35
las células GH3 aumentan su actividad migratoria al interactuar con la colágena
I/III de manera semejante al comportamiento de las células de la cresta neural.
En relación al efecto del EGF, encontramos que estimula la migración de las
células GH3 y adenohipofisiarisa infantiles. Observándose que esta acción es
significativamente mayor en las células GH3. Tomando en cuenta los
antecedentes, el EGF es capaz de estimular la migración de diferentes tipos
epiteliales, por ejemplo células epidérmicas, en las que promueve la liberación
de la adhesión de puntos focales, el cual es un paso decisivo en el proceso de
la migración celular. En las células GH3 se sabe el EGF induce un cambio en la
morfología de estas células (Johnson; Schlesinger). Las células GH3
normalmente tienen una morfología redonda y al estimularlas con el EGF
adquieren una forma alongada, ocupando más área del sustrato (Erika 2005).
Además, se sabe que el EGF induce un cambio en el fenotipo celular de estas
células. Las células GH3 normalmente tienen el fenotipo somatotrofo, al ser
estimuladas con EGF sintetizan y secretan prolactina y se inhibe la síntesis y
secreción de hormona de crecimiento, pasando a un fenotipo lactotrofo
(Johnson). Nuestros resultados muestran que además el EGF estimula. La
migración de las células GH3 (Figura.12). Lo anterior lo explicamos como un
incremento en la movilidad que estas células tumorales presentan. De manera
interesante, se observa que la migración estimulada por la colágena I/III se
incrementa muy significativamente con el EGF (Figura.12). De estos resultados
podemos suponer una cooperación entre las vías de señalización intracelular
activadas por los receptores de adhesión celular a la colágena I/III y aquellos
encendidos por la activación de los receptores a EGF.
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6.- CONCLUSIONES.
1.- El sistema de la cámara Borden permite el estudio de la migración de las
células GH3.
2.- Las células GH3 presentan actividad migratoria en cultivos en medio
definido.
3.- La matriz extracelular, colágena I/III es un componente que estimula la
migración de las células GH3.
4.- El EGF es un estimulador de la migración de las células GH3 y de las
células adenohipofisiarias infantiles.
5.- Las células GH4C1 duplica su número al quinto día de cultivo.
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7. BIBLIOGRAFIA.
Gonzalez Nava Balby 2003.Participación del factor de crecimiento epidérmico
(EGF) sobre el proceso de migración de las células anterohipofisiarias de ratas
wistar. Tesis de Maestria en Ciencias con especialidad en Fisiología.
CINVESTAV-IPN. Depto. de Fisiología. Biofísica y Neurociencias.80p
Johnson, L.K; Baxter, J.D.; Vlodavsky, I. and Gospodarowicz,
D.1980.Epidermal growth factor and expression of specifc genes: efects on
cultured rat pituitary cells are dissociable from mitogenic response. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77(1):394-398
MartaServín y Carlos Arguello (2000). La matriz extracelular en los procesos
celulares del desarrollo. Octava Edición. México 111-133p.
Toral-Juárez, Claudia.2002.El EGF induce cambios en la morfología y en el
arreglo del citoesqueleto de actina en células anterohipofisiarias infantiles
pero no en adultas. Tesis de Doctor en Ciencias con especialidad en
Fisiología.CINVESTAV-IPN.Depto.de Fisiología. Biofísica y Neurociencias.80p
Tortora, G.J. y Anagnostakos, N.P.2000. Principios de anatomía y
fisiología.Novena Edición.Harla.México.611-612p