the effect of occlusion on epidermal penetration of parabens from a commercial allergy test...

5
The Effect of Occlusion on Epidermal Penetration of Parabens from a Commercial Allergy Test Ointment, Acetone and Ethanol Vehicles Sheree E. Cross and Michael S. Roberts Therapeutics Research Unit, Department of Medicine, University of Queensland, Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Queensland, Australia The ef®cacy of topical allergy screening systems relies on the ability of test agents to effectively pene- trate the stratum corneum from applied vehicles and reach the viable cells involved in the cutaneous immune response system. There is very little evid- ence in the dermatologic literature to justify the choice and suitability of vehicles used in many allergy test systems and the effectiveness of occlu- sion, reported to have variable effects on solute penetration, often employed in combination with these systems. In this study we evaluated the in vitro human epidermal penetration of a mixture of para- ben ester preservatives from a commercially available test ointment and two commonly employed solvent vehicles (acetone and ethanol), together with the effect of occlusion on the rate of delivery from these systems. Parabens were applied as ®nite doses (5 mg per cm 2 ) to epidermal membranes mounted in hori- zontal Franz-type diffusion cells. At intervals of 2 h for a total of 10 h the receptor phase (20% ethanol in distilled water) was completely removed and replaced. Occlusion was effected by the placement of a piece of high density polyethylene (20 mm) over the application site immediately after dosing. Concen- trations of parabens in receptor ¯uid and remaining in the epidermis at the end of the study were deter- mined by high-performance liquid chromatography. There was a signi®cant change in the epidermal ¯ux of parabens from each of the vehicles following occlusion. Whereas increases were observed for the acetone and ethanol vehicles a decrease was seen following occlusion of the ointment formulation. Changes in ¯ux appeared to result from a signi®cant decrease in the epidermal partitioning of the esters following occlusion of the ointment and primarily by an increase in paraben epidermal diffusivity (estim- ated from changes in ¯ux/retention) following occlusion of the solvent vehicles. These studies show that the effects of occlusion are strongly vehicle dependent, having wide implications for optimiz- ation of this technique with a range of topically applied solutes. Key words: vehicle occlusion. J Invest Dermatol 115:914±918, 2000 E f®cacy of topical allergy screening systems relies on the penetration of allergens from the applied vehicle through the stratum corneum (SC). Within the viable cells of the upper epidermis allergens come into contact with Langerhans cells and other mediators of the cutaneous immune response system (Bos, 1997). The ideal vehicle for patch test systems is far from optimized, being traditionally based on ease of use involving ointment or emulsion formulations incorporating empiric doses of allergens. Test site occlusion has also been suggested to provide better penetration of topical agents (Bucks et al, 1988; Qiao and Riviere, 1995). The predominant effect of occlusion is hydration, increasing the water content of SC from 5 to 15% to 50% (Potts, 1986). Occlusion was ®rst suggested to increase the clinical ef®cacy of topical steroids (Garb, 1960; Scholtz, 1961; Sulzberger and Witten, 1961; McKenzie, 1962). Work in the 1980s with perfumes showed that, although increased penetration was observed for many structures, hydration enhance- ment of permeability was independent of solute lipophilicity; however, if hydration was merely decreasing the viscosity of the SC intercellular domain by increasing bilayer ¯uidity (Alonso et al, 1996), then penetration of all solutes should be equally enhanced, which is not the case. As enhancement appears to be compound speci®c, the most likely contribution of occlusion has been suggested to be the alteration in the partitioning of solutes between the SC and viable epidermis (Guy et al, 1987; Treffel et al, 1992). These authors, in ®nding that occlusion did not necessarily increase percutaneous penetration, also highlighted the need for further studies into the compound-speci®c effects of occlusion. In this study we chose to examine the in vitro human epidermal penetration and retention of paraben esters (methyl, ethyl, propyl, and butyl), used widely as preservatives in cosmetics and topical formulations and to which approximately 1% of eczema sufferers demonstrate sensitivity. We compared a standard commercial test ointment with application of parabens in either acetone or ethanol, previously shown better than petrolatum in the elicitation of steroid hypersensitivity (Wilkinson and Beck, 1996), under open and occluded conditions. Manuscript received May 22, 2000; revised August 8, 2000; accepted for publication August 17, 2000. Reprint requests to: Dr. Michael S. Roberts, Therapeutics Research Unit, Department of Medicine, University of Queensland, Princess Alexandra Hospital, Brisbane QLD 4102, Australia. Email: M.Roberts@ mailbox.uq.edu.au 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 914

Upload: michael-s

Post on 06-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

��� ������ �� ���� �� �� �� ����� �������� �� ���������� ���� � ������� � ����� ���� �������������� ��� ������ ��� ���

������ �� ��� �� ����� �� ���������������� ������ ����� ��������� �� �������� ��������� �� ��������� ������ ��!��� "������ #������ ��������� �����

��� ������� �� ��� �� ����� ������ �� ��������� �� �� ��� �� �� �� ���� ������ �� ������ ��� ���������� ��� ������� ������� ���� ��� �� ��� ��� �������� ��� � ��� ��� ������ � ��� ��������� ����� �������� ������� ����� � ���� ��� �� ������ � ��� ��������� � �������� �� ��� �� ������ �� ��� �� ��� �� �� ��� ��� ���� � ��������� ���� ������� ��� ��� ������ ������ �� ������ ��� �������� �� ���� ��� ��� ������� �� ������������� ��� ����� ������� � ���� ��� �� ! ������� �������� "� �� � ����� !� �������� ��� �� ���������� �� ����� �������� �� �� � � #���� �� �������� ����� ��������� ��� ���� � ������� �� ��� ������� � ������ ��� �!� ������� ������� ��������� ��� $������� ��� ������%� �������� ! �� ��������� �� ����� �� �� ��� ���� �� �� ���� ���� ������������� �������� !��� ��� �� �� �� �� ����� $& ����� ��'% �� �� ����� ��������� ������� � ��� �(���� )���(����� � ���� �� ���� �� ������� �� ' ���� � ���� �� *+ � ��� �������� ����� $'+, ������ �� �� �� !����% !�� �������� ������� ����������� ���� �� !�� �������� �� ��� �������� ��

� � ��� �� � �� ���� �� ���������� $'+��% ���� ������ ��� �� � �� ���� ���� ����� ��� ��� ����������� ��� �� �������� � �������� -� � ��� ���� � �� � ��� �� ���� � �� ��� ��� �� ��� ����� !��� ������� ��� �� � �������������� .� � �������������������� !�� � � �� ����� ������ � ��� �� ����� -�#�� �������� ���� ���� �� ��� ��� ��� ���! ������� ��� /������ �������� !��� �������� ��� ���������� ��� ������ ��� ��� � �������� !�� �������! �� ����� �� �� ��� � ������ ������� ���������� � -�# �������� �� ����� ���� � � �� ������������� � ��� �� ����� ���� � �� �� �� ��� ���������! �� ����� �� �� ��� � ������ ��� �� ��� � ���� ������� � ������� �� ����� � ���� � �� $��� ������ ���� ������� � -�#0������ ��% ���! ������� �� �� ��� ������ ��� ���� ����� ���� �� ���!���� ��� ������� �� ����� �� ��� ������� ��� ������������ ��� �� ! �� �� ��� ��� ��� ��� � (��� �� �� �� � ����� .�� ! �� � ����� �� ��� ������ �� ������� �� ���� ������� ���������� � �������������� ��� �������� �

��$��� �� ������ ����%� �������% ���� ����� �� ������������� �� ����%�� ���� ��� ������ ������������%� ��� ����� ������� &��'� (����� ��� ��������� �� ��� ����� �������� ����%�� ���� ���� ������)��� *�%���� ���� �� ����� ������� �� ���

������� ������ ������ ���� &#�� +,,-'� ��� ���� ���������� ���� ��� ���� � �� ���� ������.��� ����% �������������� �� �� �� �� ��������% �������� �� ������� ���������������������% ������� ��� �� ����%��� ��� ��� �������� � ������ �%%���� �� ������� ������ ���������� �� ������ %���&#��/ �� ��� +,001 ��� �� �������� +,,2'� ��� ���������������� �� �������� � ��������� �������% ��� )��� ������� �� ������ 2 �� +23 �� 243 &����� +,05'� 6������� ) $�� �%%������ ������ ��� ������� ��$��� �� ������ ������ &7��� +,541������.� +,5+1 ���.���%�� �� (������ +,5+1 �8��.��� +,59'�

(��/ �� ��� +,04 )��� ������� ��)�� ���� �����%� ����������������� ) ������� ��� ��� ��������� �������� ������:���� �� ����������� ) ����������� �� ����� �������������1��)����� �� �������� ) ������ �������% ��� ������� �� ��� �������������� ����� �� �������% ������ ;������ & ���� �� ���+,,5'� ���� ���������� �� �� ����� ����� �� �<���� ��������)���� � ��� ��� ��� ���������� ���� �� �� ������������$�� ��� ��� ��/��� ������������ �� �������� � �����%%���� �� �� ��� �������� �� ��� ����������% �� ����� ���)������ �� �� ����� �������� &7�� �� ��� +,0-1 ������� �� ��� +,,9'����� ������ �� $����% ��� �������� ��� ��� �������� ���������������� ����������� �� ��%���%���� ��� ���� ��� ������������ ���� ��� ��������:����$� ������ �� ���������=� ��� ���� )� ���� �� �!���� ��� �� ���� ���� ��������

���������� �� ��������� �� ����� ���� &������� ������ ��������� �����'� ��� )����� ���������� �� ������� �� ���������������� �� �� )���� ����!������ +3 �� ��.�� ���������������� ���������� (� ������� ����� ��������� ����������� )��� ��������� �� ����� �� ������ ������ �� ���������������� ��)� ������ ��� ��������� �� ��� ���������� �� �������������������� &(��/���� �� #��/� +,,5'� ����� ���� ���������� ����������

������� �������� � 99� 94441 ������ �%�� 0� 94441 ������� ������������� �%�� +-� 9444�������� ��<��� ��> ��� ����� �� ������� ���������� ������

����� ��������� �� �������� ��������� �� ��������� ������ ��!��� "������ #����� �*� ?+49� ������ ����> �������@�����!��<������

4499:949AB44BC+2�44 D ������%�� � 9444 �� ��� ������� ��� =�����%���� ��������%�� =���

1*2

���= *� E� ��"6��

3���� �� ����� ������� ��� ���� ��� +-� ��������% F3 �� �������� �� � �������� �� ) ������� ���� ��. &������ �����'� ������ �� ������ )��� ������� ���� ��%� &������� �����'� ������� ��%��� )��� �� ������� %����

�� ����� �� ����� � ���� �� ���� �� "��� �������� �������)��� ������� ���� ����� ������� /�� ���% ��� ��� �������������<�� &8��%�� �� ����������� +,5F'� ������ )��� ���������� ��� ��������� �� ����.���� G��.:���� �������� ���� &����� ��+�F ��9' �� ��� �������� ������ &F�2��' $���� )��� ��%�� 943������ �� �������� )���� )���� ) ����������� ������ )��� �%�����;�� �������� ���� )��� ��������%�� �� )��� ��� &F2� 4�+��'�G����� ��� &2�% ��� ��9' �� ����� �� ��� ����� ������� &�������� �������� ������� �� ������ �� ������' )��� ���� �� ��� ����� �������� %����� ���� ���� ��� /�� ������ =� �������� ����� ����� �� ��%�:������ ������������ &"���� 94��' ) ���������� ����� ���� ���������� �� ������ �� ����� � ������� �� 9 � &��� +4 �' ��� ����������� ) ���������� ������� �� ������� )��� ���� ������������� ������������ �� ��� �������� ��� )��� ���������� �� ��%�:

���������� ��<��� �������%����� � ��� ��� �� ��� ���� �� �������%����� �������B�������� ) )���� ���� ��� ����� �� ��� /�� �� ����������� ������� ��� ������� ���� �� ������ �� ������ ���������/�� �!���� �� ��� ����� ������� ) �!���� )��� ����� �������)��%��� ���� 4�2�� ������ ) ���� �� ��� ���� ������ )�������� �����!��� �� ��������%��� ��� �������� ) ���� ��� �������� �������������

��� ���� �� ��� ������ �� ����� �� �� �� ����� �������������� ��

����� �������� �� ������� ����� (��� ������� ������ )����������� ) ������� ���% �������� ����� ������<��� #���;�� ������/� �� F":)��� & ����� ������ ������� �����' ���� ����������� ��� &4�2��� �����' ���� �������� ������� ) �������������� +4 �� ��� ��%��� �� �������� ) �!����� ������� �� ������������������ ��������

�������������� ����� ��� ������ 6��������� �� "��� �� ���������������� ) <�������� �� ��� ������ /�� �� ����� ���� ������������� ������� ���%� �� ��(* ������ �� F4��� ���� ��������� �������� ��� "��� ������� �� �������� &2�% ��� ��9' �� �������)��� �������� ���� ��(* ��������� )��� �/�� �� ��������� �9� 9 �� ��/�� ��� ���% ��� ������ ���% ��)����� 9+4 &����%��� 8�./� 8�H��� 7�����'� ������� ���%� �� ��(* )��� ���������� �������% ��� ��������� F4��� ���� �������� �� ����������������

4��� ����� � ��� ;�! �� ����� &I��% ��� ��9 ��� �' �����%� ������� � ��$��� > I J &8�����'B� )���� 8 � ��� �������B�������������� ����$������ �� � ��� ������������ �� ����� �� ��� �������� � ���� �������� ����$����� �� ��� ����� �� ��� ������� �� � � ������������ ��� ���%��� =� ��� ����� �������� �� ����� ;�! )��� ������% ��� ������ ����� ������� �� ��� �������� ������������ �� ���� ������� ����� ��%������ ���������� &�� � K +'� ) ����!����� IB���)���� �� � ��� �������� ������� ��������� �� ��� ������ ����������� ��� ��9�

����*��

)�# ����� ) �%��$��� ���%� �� ������ ;�! �� ��������� �� ��� ����� ���������% ��� �������� ������������)��% �������� &���� "'� =����� )��� ������� �����)��%�������� �� ��� ������� ������ �������� ������ �� ������� ��� �%��$��� ������ �� ���������� �����)�� �������� �� ������������

5����� �� �� �� ����� ���� ��� ��������� �������� )�%��$����� ������� �� �������� &) � *!'� ��� ������ �� ��)� ��)����� ��� ������ E� �%��$��� ���%� �� ����� ��) ������� �����)��% �������� �� ��� ������ �� ������������� &) � *"� #'�

4 ���� � �� ��%��$��� ������ �� ����� ���������� )���������� �����)��% �������� �� ��� ������ �� ������ �������&) � '"� #'� ��� ��� ��� �������� &) � '!'� ��� ������ ������������ �� ���� ����� ��� )��� �������� )��� ����� ������!������ 0: �� +5:����� ������������ ��� ������ �� ������&) � 6'�

7����� �� �����%� �� ������� ���������� ����� �� ��������)��� ��� ���� F":)��� ���/� ���� ������� �������� )���"���� ���� )��� �������� �� ���� )��� �������� �� ��������)��� "��� ������� �� ���������� ��������� ) � 2&!' ��) �������� ) ����� ��)�� %����� �������� ����� ��� ���������������� ��� ��(* ����� �� ���������� ��)����� ��)�� ��������� �%��$��� �������� & E6L � �M 4�4+' ��� ���� ����������� �� "���:������ ��� ������� �� �������� �������&) � 2"'�

�=�����=6E

��� ���� ���% ��� ����� ���� ���� ��)�� ���� )��� �����������:����$� ������� �������� ���������� �������:

���� "� ��� ������ �� ����� �� �� ��� ������� ��� .���� ����� �� � � � -�# ��� ���� ������ �������� �� �� �������������� ��� �� ��� *+ � ����� ��� ��� �� ���� ������� ���! �� ��� �� ��� ��� �� �� � #����� � � ���� ��� ������� �

� ������ ������� ��� ������� �� ������� 3����8�� � 9 6:*+

����� �� ���������� 6��������������

=����� ;�! ���� ���������% =����� ;�! �� ���� ���������% �&�% ��� ��9 ��� �' �� +4 � &�%' &�% ��� ��9 ��� �' �� +4 � &�%'

����������6������� +�,� 4�+ 9-�4� +�F 4�,� 4�+ 4�2 ++�,� 4�5 4�? ������ -�9� +�9 05�?� +2�- ?,�4� 5�? 5�0 2F+�5� 50�5 5�9������ 0�4� 9�0 ,4�F� 90�F 2+�2� 9�4 5�2 2,F�9� ?F�4 5�5

����������6������� -�F� 4�? 0-�+� 5�4 9�9� 4�F 4�F 90�?� F�+ 4�F ������ ?�0� 4�, 2-�5� +9�F 0-�0� 4�2 +0�? ,-5�-� 9+�9 +-�4������ 0�9� F�4 ,F�+� F4�2 0+�,� ?�? +4�4 0,?�-� ?5�+ ,�5

�����������6������� 5�-� 4�? -0�4� 2�0 +�,� 4�F 4�F 9?�?� F�+ 4�F ������ F�+� 4�0 F5�0� ,�2 ?9�+� 4�- +F�5 ?,?�5� +5�4 +F�2������ ?�2� +�0 24�9� +,�4 ?4�5� 9�4 ,�+ ?24�+� 99�+ ,�4

#���������6������� 5�5� 4�? -2�-� 5�9 +�,� 4�F 4�F 92�+� 9�0 4�F ������ 5�,� +�5 0?�0� 99�- 2?�,� F�2 -�, 524�+� F0�5 -�-������ +4�9� ?�0 +++�F� ?,�4 54�5� 9�5 5�4 50?�F� F,�+ 5�+

��� ���������� �����

L6*� ++2� E6� 2 E6L� #�� 9444 6��*��=6E 6E ��=��� * ��E��� �=6E 6G � � #�E� 1*&

��������� ������� �� ������� �������� ���������� �� ���������� �� �������� ������ )��� ��� �������� �� � ������������������ ���� ����% �%��$��� ��������� �� ����������� �/���N� �� �� &+,,?' �������� �� ������ �� ��� ������������

�� 9��F�:�����!�������� ��������� ���%� ������� )������������� ������� �����)��% �������� �� ��� ��� ��% �������B)��� �� 9��F�:�����!������� � ����!������ K+�9��������� ��������� ���� ��������� �������% �� ��� ��:������������� ����������% ������� ��� ���)�� �� ������� �� �� &+,,9'

�� %��� ���������� )��� �������� )���� ��� ���� �!���������� ����� ��)����� �� ���� ����������� ��% �:���� +�,5KF�2-� �� ����� ���������� )���� ��� ���� �!������ �� �������$��� ���� ��� ���%� �� ����������% ���)��� ��� �� ������� ��������� ���� ����� �%%�� ��� �������� ��� �� ���������% ��� /������ �� ����� �� ��� ����� ���� ��� ��������������� ���� ��� ��� ���%� �� ����� ���������� ����� ���������� ������ ����� �� ����������� ������ �������� ���)������ �������� �� ��� "��� ��� �� ������� ��� ��� �� ��� �������� �� ��� ������� ���� ���)��� ��� �������� �� ��� �������������� ������% � �!�� ����������� ���� ���� )���� �������� ��� �������� ������ �������% ��� ��� ��� F":)��� ����(* ����� ��) ��� ��� �������� �� � �������� ���������&) � 2!� "' ��� ������� )��� ���������� �������� ���$����%

) ���� *� �� ����� ������ �� �� ��������� ��� ������ �� �������� ����� ��:����� �������� ��������� &����% ��� �% ����' �� ����� ����& �� ������ �����1 ��� ����������1 ��� �����������1 �� #������������' �����)��% ������ ��������� �� $���� ��� ��> &�' ��������� �������� ����������1 &�' ������ ������� �� ������1 ��&�' ������ ������� �� ������� ��� ��� �J FK+4�

) ���� '� ��� ����� �� ����� � ���� � �� �� ��������� ��� ������ ���������� �� ��� �� ���� �������� ���������� &I ��� ��' �� ����� ����& �� ������ �����1 ��� ����������1 ��� �����������1 �� #������������' �����)��% ������ ��������� �� $���� ��� ��> &�' ��������� �������� ����������1 &�' ������ ������� �� ������1 ��&�' ������ ������� �� ������� ��� ��� � J FK+4�

1*; ��6�� E� �6#���� �"� I6��E * 6G =EL���=7 �=L� ��� �6*67O

��� ������� ��� ��� ������ � �����%� ��� �������� ���� ����� �������� )����� ��� /�� �� �� ��� /�� ���������������� �� ����%�� ���������� ���)��� ������� )

���������� ���������� ���)��� ��� ������� �� ��� /�� ����� �� ������� �� ��� ������������ �� ������������ ������� ����� ����� ����� ��� ) � �������� =� ����� �� ������������ �� �������� ����������� � ������ �� ������ ��� ������� ������ ����������% ���� ��� �������� �� ���������� )����� ����������� ������� � ��<������ =� ��� ����� )� ) ����������� �� �%��$����� ��������� ������ �� ���� �����������������% �� ���������� �����)��% ��������� ��������% �� ���������� �� )���� ���� �� ������� =� ��� �� �� ��� ��������� ������ �� ���������� �����)��% �������� ������ �� ������� �%��$��� ������ �� ��� �������� ��������� &) � *!'� )�������� ������ ���%� �� ����� ���������� )����� ��� ��������&) � '!'� (����� ��� ������� ���������� ������� )����������� �� ���� ��� ������ �� ������ ������� ��� ��� ������� �%��$��� ���%� �� �������� ���������� �� �������������������%� ��� ) ������ )��� ��%� ������ �� ����������)����� ��� ��������� ���������� �� ��� ������ �� �������� �� ����)� ���� �� �������� �������� �� ������� ������� ��� �� ��������� �� ��� ������ ������� �� ����� ��� �������� �������� #���������% ���� ������� ��� ���� � �������� �������� ��/��� �������� ��� ��� ����� �� ������ �������% ���� ��� �� )��� ����������� ������� �� ��������� � �%��$����� �������������� ) ��� �� ��� %����� ������ �� ������ �����

�������� ���������� �� ��� ����� ����� �������� �������)��� ������� ��� ���� �� ��� ���������� ��������������������� �� �������� ��������� &) � 6' )��� +5�F �� 0�0 ������ ������ �� ������ �������� ������������ ��� �������� �� ������������� �� �������� ���������� ���� ��� ��� ������ �� ������������� &) � 6' �� ��) ��� ��� �������� �� ��� �� ��� �����) �<���� ������� �� ��� ������ �� ��� ������ �� ��� ����������� $����% �%%�� ��� � ������ ���%� �� ��� �� �������������� )���� ) ��� �������� ����$�� ��� � �������� )������ ������� ��� ���� ������ )��� ����% �� �!������% ��������� )����� ��� �� &7������ �� ��� +,0,1 7��� �� 8������+,,?' ������% ����� �������� ��� ���)�� %����� ������������� )����� ��� �������� ��� ����� �� ������� ������ ������� ;����.��% ������ �� ������ � �)��� ��� �� ������ ������ �%� �� ���� �������� �������� �����%� ��� ������������ ������ �� ���������� )��� ���� ��)����� ��;����� �� ���

� �!���� �� ��� ������ �������� ;�!� �� ��� ����� ������ ��

��� �)� ������ )��� �� )������ ��������� ���������� �� ��� ���� ��� ������� ��� ������ ������ �� ;�! �� ��� ����� ���� )����% ����������� �� �� ���� ��� ������ ����������% �� ��%� ���%� �� �����������

�6E�*��=6E�

��� ���� � ��)� ��� �%��$��� ���%� �� ��� �������� ;�!�� ����%�� ���� �������� �� ������ ������� ����� �����)��%��������� ���%� �� ;�! ������ �� ����� ���� �%��$��������� �� ��� �������� ����������% �� ��� ���� �����)��%�������� �� ��� �������� �� �������� �� � ������ �� ������������� ���������� &������� ���� ���%� �� ;�!B���������'�����)��% �������� �� ��� ������ �������� ��� ����������� ������ ������ �� �������� �� ����%�� ������� ��������� � )������������� ��� ������.���� �� ��� �� �� �������� ������<��)��� ��%� �� �������� ��������� ������

��� � ���� ���� � ��������!� ��� ��������� ���������� "� ����� �������#

��� ��� $������� � ���� ��� %������ ������ ��� "������ &������� � ����

� �������'

) ���� 6� 5��� �� � ���� � �� �� ������ � ����� ��� ��� ����������� ������� �� ��� ���������� �� ����� ���� )����� ��� �������������)��% �������� �� ������ &�' �� ������ &�' ������ �������� ��� ��� �J FK2�

) ���� 2� ��� ������ �� ����� ��� ��� ������ �� �� �� ����������� �� ��� ��/<� &�' ��� �������� �� �������� �������������� �� ���������� �������� ������� ���� F":)��� ������� ���� +4 ��� �������� �� �������� )��� "���� �������� ���������� �� ����������������� �� �������� &���� ��� �J 2'� &�' ��� ������� ���%� ����(* ������� �� ������ ��� �� ����� ��������� ������ )��� �������������� �� "��� ������� )��� ������� &���� �� '�

L6*� ++2� E6� 2 E6L� #�� 9444 6��*��=6E 6E ��=��� * ��E��� �=6E 6G � � #�E� 1*=

��G���E���

���� � ������� E�� O������ L�� ��/ > (��� ������ ��� ;������ �������������� ������� �� ����� �������> ���������� )��� )��������������� ����� �� ��������� ������� ���������� ( )����� *������+45>+420K+45F� +,,5

#� I�> ��� /�� � ��%� �� ��������� ���� �+� )�� �� +4->FK2� +,,-#��/ � (� � ��� I�� ���� "=� 7�� �"> #����������� �� ��������

���������� ������> PP� �����QQ ������<��� ( )����� *������ ,4>9,KFF�+,00

7�� I> E��� �������� ��������� ����� )��� ����������� ��������� ���� *������0+>545K54,� +,54

7��� �O� 8����� 8> ������� ��������� �� ���� �������� �����%� ������������� =� ����������� �� ������� �������� ���%� �� ��� ������� ������ ���� ������� ������ ����,� ���� ++,2>+5,K+-,� +,,?

7������ 7� G���%��� 8�� "��� � � ��� � > *���� ������� �� ����� ���� ���������� �� ��� �������� ����������� ������� ( ����� &�� F4>0,K,5� +,0,

7�� �"� "�%��� I� #��/ � (> �������� ���% �������� �� ���������������� -��.����� +->F92KF?F� +,0-

8��%�� � ���������� �> ��������� �� ������ ���� �� ���� ������������� ���� *������ 00>-49K-42� +,5F

�8��.�� (> ���������� �������� �� ������� ���� *������ 05>00K,4� +,59 �/���N� �� �������%� EI� � I*�> ���������� �������� �� 9��F�:

�����!������� �� ��� /���� &�� ++>04,K0+2� +,,?���� �6> ������ ������� ��������> �!��������� ������<�� �� �������������

�� ������ ( 0� ����� ���� F->,KFF� +,05��� 7*� ������� I> ��%��$��� ������ �� ��������� ��� �� �������� �� ���

������/������ �� ������� ���������� �� �������������� �� ���������:���� �� )���� ( /���� 0�� 0?>?92K?F9� +,,2

������. I�> ������ ������ �� ����� )��� ;���������� ��������� ���� *������0?>+49,K+4F4� +,5+

���.���%�� #� (����� L"> ���� ������ ����� $�� �� ������ ��������%���������� ���� *������ 0?>+49-K+490� +,5+

������� �� ���� �� ����:�RS ������ �� �����: �<��� �� %��� �> ������ ���������� �� �� ����� ���������� �������� �� �)� �������� )������������ ������������� ���������� 0��� /������� 2>+40K++F� +,,9

(��/���� �#� #��/ "> ������������� ������ ��������������> )�� ������� ��������������T ������ *��������� F?>F42K240� +,,5

1*> ��6�� E� �6#���� �"� I6��E * 6G =EL���=7 �=L� ��� �6*67O