The genomic era: Past, Present and Future

:Μέλη ομάδας Βασιλόπουλος Βασίλειος

Καναβάρης Βασίλειος

:Υπεύθυνος καθηγητής. Λ Αλεξόπουλος

Εμβιομηχανική και Βιοϊατρική ΤεχνολογίαΑκαδημαϊκό Έτος 2013-2014

(1)Ιστορική Αναδρομή• ’ :Λήξη του Β Παγκοσμίου Πολέμου

o Χρήση ραδιοϊσοτόπων για την αποσαφήνιση της (μεταβολικής διεργασίας Roberts et al.)

o .Καθιέρωση Ε Coli – ως οργανισμού πρότυπο για βιολογικές μελέτες

o Αναγνώριση ενζύμων και διαδικασιών εμπλεκόμενων με την σύνθεση μεταβολιτών

• 1950:Γύρω στοo Πλήρης ορισμός βιοσυνθετικών διεργασιών για την

( . )ανάπτυξη βιολογικών μακρομορίων π χ πρωτεϊνεςo Ανακάλυψη μηχανισμών για την ρύθμιση του

( . μεταβολισμού π χ μελέτη της δραστηριότητας των)ενζύμων

(2)Ιστορική Αναδρομή• 1955:

o Περιγραφή της δομής της έλικας του DNA από τους

Watson και Crick o Ανακάλυψη μηχανισμών

αντιγραφής του DNA και σύνθεσης πρωτεϊνών

• 1961:o Θεμελίωση βασικών

μηχανισμών γονιδιακής (έκφρασης Jacob – Monod)

o Ανακάλυψη ενζύμων ικανών να κόβουν και να

συνδέουν DNA (Nathans καιSmith)

(Ιστορική Αναδρομή 3)• 1972:

o Ανάπτυξη του πρώτου εργαστηριακού ζωικού ιού από

τον Paul Berg στο Stanford U.

• 1972 – 1984:o Ανάπτυξη μεθόδων αλυσωτής αντίδρασης

(πολυμερισμού PCR – Polymerase Chain Reaction)o Εμφάνιση μεθοδολογιών DNA Sequencing: Χρήση

των τεχνολογιών PCR για την προσθήκη ποσοτήτων DNA σε αρχικές ποσότητες

γενετικού υλικού

(4)Ιστορική Αναδρομή• 1984 - 1986:

o Χαρτογράφηση γονιδιωμάτων διάφορων μικροβίων και

βακτηριοφάγωνo Πρωτοβουλία για την

υλοποίηση της χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος

(Santa Fe του New Mexico)• 1988 - 1989:

o Μελέτη με τίτλο« Χαρτογράφηση και

Αποτύπωση του Ανθρώπινου»Γονιδιώματος

o Ίδρυση Εθνικού Κέντρου Ερευνών Ανθρώπινου

Γονιδιώματος στην Αμερική

(5)Ιστορική Αναδρομή• 1991: Ανάπτυξη μεθόδου για

εύρεση γονιδίων χωρίς την απαίτηση μέτρησης

ολόκληρου του (γονιδιώματος Craig Venter):

Στήριξη στην έκφραση των γονιδίων μέσω του mRNA και

κατασκευή συμπληρωματικού DNA

(cDNA)• 1991-1995: Απομόνωση πάνω

170.000 από τμημάτων cDNA και αναγνώριση περίπου των

μισών γονιδίων του ανθρώπινου γονιδιώματος

(6)Ιστορική Αναδρομή• 1998:

o Human Genome Program: Ανακοίνωση πλάνου για ολοκλήρωση της αποτύπωσης

του ανθρώπινου DNA 2003ως τοo : ) Βασικοί στόχοι α Κάλυψη

90% , ) του γονιδιώματος β Ελεύθερη πρόσβαση στις

βάσεις δεδομένων από όλους• 26 2000:Ιουνίου

o Συνάντηση των Collins καιVenter με τον πρόεδρο Clinton

o Ολοκλήρωση του 3 προγράμματος χρόνια πριν το

– αναμενόμενο Δημοσίευση στο«Science and Nature» 2001 το

Βασική μέθοδος DNA Sequencing

• Βασικά βήματα DNA Sequencing: o Fragmentation: Σπάσιμο του γονιδιώματος σε

δείγματα λίγων εκατοντάδων βάσεωνo Isolation: Προσεκτική λήψη των δειγμάτων ώστε

να διατηρούν το σήμα τουςo Amplification: Ενίσχυση του σήματος για αύξηση

της ακρίβειας των μετρήσεωνo Readout: Μετατροπή του σήματος των βάσεων

( σε μορφή που διαβάζεται από μηχανή συνήθως )σε οπτικό σήμα

• . π χ Illumina Genome Analyzer – Hiseq Systems

Fragmentation – Isolation

1. Κόψιμο δείγματος DNA σε τμήματα 400 περίπου ζευγών βάσεων

2. ( Προσκόλληση ολιγονουκλεοτιδίων μικρού ) – « » μήκους νουκλεϊκά οξέα στα άκρα λαβές για

κάθε δείγμα3. Εισαγωγή του δείγματος σε κύτταρο ροής με

« » τάπητα από ολιγονουκλεοτίδια4. Παγίδευση του δείγματος στο κύτταρο ροής λόγω

συνδέσεων των προσαρμογέων απόολιγονουκλεοτίδια

5. Προσκόλληση κάθε αλυσίδας DNA σε συγκεκριμένη θέση ώστε να επιτευχθεί isolation

Amplification

1. Χρήση της αλυσωτής αντίδρασης

(πολυμερισμού PCR) για ενίσχυση του σήματος

2. Εξέλιξη κάθε τμήματοςDNA σε cluster από

χιλιάδες ταυτόσημα αντίγραφα της

συγκεκριμένης αλυσίδας3. Δημιουργία

εκατομμυρίων ανεξάρτητων ομάδων

στο κύτταρο ροής

Readout

1. Σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας από

« » χρωματισμένα νουκλεοτίδια A,T,G,C

2. Απεικόνιση του κυττάρου μετά την ενσωμάτωση κάθε

νουκλεοτιδίου3. Διαφορετικός χρωματισμός

κάθε cluster ανάλογα με το νουκλεοτίδιο που

ενσωματώθηκε4. Επανάληψη του κύκλου

readout – κάθε νουκλεοτίδιο που προστίθεται διαθέτει

« »τερματικό

DNA Sequencing cost

Next Generation Sequencing-NGS (1)

Βασικά χαρακτηριστικά των NGS:• Παραγωγή τεράστιων ποσοτήτων δεδομένων σε

:λίγο χρόνοo : Επέκταση δυνατοτήτων Αύξηση του αριθμού

των αντιδράσεων ανά δείγμα DNAo Δημιουργία εκατοντάδων Gb (gigabases)

δεδομένων με ένα και μόνο τρέξιμοo 1000 φορές περισσότερα δεδομένα σε σχέση με

την απλή διαδικασία DNA Sequencingo 5 Μέτρηση ανθρώπινων γονιδιωμάτων σε μια

5000$. βδομάδα με λιγότερο από

Next Generation Sequencing-NGS (2)

• Multiplexing: Δυνατότητα μέτρησης πολλών

δειγμάτων σε έναπείραμα με χρήσηbarcodes

• Εκτίμηση της δραστηριότητας του RNA

με μεγαλύτερη ακρίβεια

• :Ρυθμιζόμενη ανάλυση Ρύθμιση overlap ( αριθμός ) αναγνώσεων για την μέτρηση κάθε βάσης

ανάλογα με τις ανάγκες σε ακρίβεια

Next Generation Sequencing-NGS (3)

• Whole-Genome Sequencing:o Παροχή δυνατότητας μέτρησης ολόκληρου του

γονιδιώματος ενός οργανισμού σε ελάχιστο χρονικόδιάστημα ( εφαρμογή σε μεγάλης κλίμακας

, , γονιδιώματα όπως τα ανθρώπινα αλλά και σε μικρά )γονιδιώματα βακτηρίων και ιών

• Targeted Sequencing:o Μέτρηση μόνο συγκεκριμένων περιοχών στο

γονιδίωμαo Ωφέλεια σε κόστος και χρόνοo Δυνατότητα ταυτοποίησης γενετικής διαφοροποίησηςo Δυνατότητα ανίχνευσης γενετικών μεταβλητών που

χάνονται με την παραδοσιακή μέθοδο DNA Sequencing

NGS μέθοδοι

• Polony Sequencing• Illumina Sequencing• SOLID Sequencing • DNA nanoball sequencing• Helioscope single molecule sequencing• Nanopore DNA sequencing

Τύποι γονιδιωματικών ομάδων

(1)δεδομένων

• Sequence Variation Data: o Γενετικές διαφοροποιήσεις

όπως εκδηλώνονται στην αλληλουχία αμινοξέων των

πρωτεϊνώνo Προσεγγίσεις για την

ταξινόμηση των γενετικών:διαφοροποιήσεων

1. SNP Genotyping Arrays: Χρήση συγκεκριμένης

αλληλουχίας βάσεων(SNP array)

2. Resequencing: Σύγκριση « » με πρότυπο

γονιδίωμα

Τύποι γονιδιωματικών ομάδων

(2)δεδομένων

• Transcriptomic Data: o Δεδομένα που σχετίζονται με την μετατροπή του

DNA σε RNAo : ) Αναγνώριση α πρόωροι ή μεταγενέστεροι

, ) τερματισμοί της αλληλουχίας αμινοξέων β , ) συγχώνευση γονιδίων γ τάξεις RNA που δεν

μετατρέπονται σε πρωτεϊνες• Epigenomic data: Πληροφορίες σχετικά με τις

( επιγενετικές τροποποιήσεις αλλαγές στο DNA που )επηρεάζουν την δομή των πρωτεϊνών

• Interactome data: Μελέτη αλληλεπίδρασης DNA- , πρωτεϊνών RNA- , - .πρωτεϊνών πρωτεϊνών πρωτεϊνών

Προγράμματα συνεργασίας

• Προγράμματα ανάλυσης και συνδυασμού δεδομένων: o Roadmap Epigenomics Projecto ENCODE Projecto Cancer Genome Atlas

• - Προγράμματα δημιουργίας επι γονιδιωματικών χαρτών ( τόσο ) – για τον άνθρωπο όσο και για άλλους οργανισμούς

: αποτύπωσης ρυθμιστικών για τον μεταβολισμό στοιχείωνo Roadmap Epigenome Consortiumo ENCODE Consortium ( χαρτογράφηση πρωτεϊνικών

)τροποποιήσεωνo ModENCODE Consortium ( για Drosophila )και σκουλήκιαo ENCODE project ( )για ποντίκια

• Online :εργαλεία για συνδυαστική ανάλυση Galaxy, DAVID .κλπ

Προβλήματα στην εφαρμογή των

genomics

• :Για τον επιστήμοναo Καταιγισμός δεδομένωνo Ελλιπή εργαλεία συνδυαστικής ανάλυσηςo Δυσχέρεια στην ανίχνευση γονιδιωματικών

( δεδομένων καλής ποιότητας χρήση Genome Browsers όπως ο Entrez Genome για αυτόν τον

)λόγο• - (Βιο πληροφοριακά bio-informative) :εμπόδια

o Προβλήματα στην διαχείριση των αποτελεσμάτων μεθόδων NGS

(1)Μελλοντικές προοπτικές

• :Βελτίωση της ακρίβειας των διαγνώσεωνo Βελτίωση αξιοπιστίας μετρήσεων ακόμα και

από πολύ μικρό δείγμα DNAo Δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων για

ασθένειες από δείγματα FFPE ( αποθηκευμένα σε βιβλιοθήκες τμήματα DNA ) ιστών τα οποία

, σήμερα υφίστανται σημαντική αλλοίωση λόγω, προετοιμασίας χρωματισμού και αποθήκευσης

• :Μείωση της ευαισθησίας του δείγματος σε θόρυβοo . , Εισαγωγή θορύβου λόγω π χ του εδάφους του

θαλασσινού νερού ή του ανθρώπινου εντέρου

(2)Μελλοντικές προοπτικές

• :Περαιτέρω μείωση του κόστουςo Το κόστος ανάλυσης ενός γονιδιώματος σε

λίγα χρόνια αναμένεται να γίνει ίσο με το σημερινό κόστος ανάλυσης ενός μόνο γονιδίου

• :Ανάπτυξη γονιδιακών φαρμάκων με συνεισφοράo στην φαρμακευτική μέσω μείωσης των χρόνων

έρευνας και έγκρισης νέων φαρμάκωνo στην γεωργίαo στην διάγνωση και θεραπεία ασθενειών όπως ο

καρκίνος

Προκλήσεις• :Τεχνικές προκλήσεις

o Μείωση του χρόνου προετοιμασίας του δείγματος για εισαγωγή στην εκάστοτε μηχανή

o Μεταφορά των αποτελεσμάτων γονιδιωματικής ανάλυσης από τοπικούς υπολογιστές σε cloud

• – :Μη τεχνικές προκλήσεις Ηθικά διλήμματαo Θα έπρεπε ασφαλιστικές εταιρίες να έχουν πρόσβαση

;σε γονιδιωματικές πληροφορίεςo Τι επίδραση θα έχει η διάγνωση ότι ένα άτομο είναι

πολύ πιθανό να εμφανίσει κάποια ασθένεια στο μέλλον ;στο ίδιο το άτομο και στην οικογένειά του

o Germline Therapy ( εισαγωγή συγκεκριμένων γενετικών . ) – χαρακτηριστικών π χ σε αυγά Ποιος αποφασίζει ποια

;γενετικά χαρακτηριστικά είναι επιθυμητά και ποια όχι

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ

Σας ευχαριστούμε!