these doctorat mauricio schoebitz

5/13/2018 These doctorat Mauricio Schoebitz

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UNIVERSIT DE NANTES

UFR SCIENCES ET TECHNIQUES

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COLE DOCTORALE SCIENCES POUR LINGNIEUR GOSCIENCESARCHITECTURE

Anne 2010

tude de lencapsulation de rhizobactries pour labiofertilisation du bl

THSE DE DOCTORATDiscipline : Sciences de lIngnieur

Spcialit : Gnie de Procds

Prsenteet soutenue publiquement par

Mauricio Ivan SCHOEBITZ CIDLe 22 de septembre 2010, devant le jury ci-dessous

Prsident: Grald Thouand,Professeur Universit de Nantes, France.

Rapporteurs: Yvan Monne-Loccoz,Professeur Universit Lyon 1, France.Stphane Declerck,Professeur Universit Catholique deLouvain, Belgique.

Examinateurs: Rmi Saurel,Professeur AgroSup Dijon, France.Hlne Simonin, Matre de Conference, ONIRIS, FranceCo-encadrant de thse.Denis Poncelet,Professeur, ONIRIS, France

Directeur de thse.

ED : .

(Uniquement pour STIM et MTGC)

N attribu par la bibliothque


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Cette thse a t ralise dans le cadre dun projet europen financ par

RHIBAC

Food Quality & Safety FP6-FOOD-CT-2006-036297

www.rhibac.org


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REMERCIEMENTS

Ce travail a t ralis au laboratoire de Gnie de Procds Alimentaires de l'cole Nationale

Vtrinaire, Agroalimentaire et de l'Alimentation Nantes-Atlantique : ONIRIS.

Je tiens remercier Monsieur Denis Poncelet, qui, en tant que Directeur de thse, s'est toujours

montr trs disponible tout au long de la ralisation de ce travail, ainsi pour sa confiance et la libert

qu'il m'a accord ainsi que nos nombreuses discussions mont permis de progresser. Mes

remerciements sadressent galement Mme. Hlne Simonin, matre de confrences lONIRIS,

pour leur encadrement, leur soutien, disponibilit et les remarques substantielles quelle a formules

pour la finalisation de ce travail. Sans elle, ce travail naurait pas sa forme actuelle.

Mes remerciements les plus respectueux vont M. Yvan Monne-Loccoz, Professeur de lUniversit

Lyon 1 et M. Stphane Declerck, Professeur de lUniversit Catholique de Louvain qui mont faitlhonneur de prendre connaissance de ce travail et den tre rapporteurs. Merci M. Rmi Saurel,

Professeur de lAgroSup Dijon et M. Grald Thouand, Professeur de lUniversit de Nantes, davoir

accept de prsider le jury de cette thse.

Mes remerciements sadressent galement Ren Cardenas, pour sa gnrosit et pour ses prcieux

conseils qui mont guid au cours de mes tudes. Je ne saurais oublier dexprimer ma reconnaissance

Mme. Anne Franois Miegeville pour son aide fourni dans la prparation des chantillons pour la

microscopie lectronique balayage.

Je veux prsenter, mes sincres gratitudes tous les enseignants et lquipe technique de lONIRIS qui

ont contribu la ralisation de ce travail. galement, j'exprime ma gratitude toute lquipe de

Microencapsulation: Gisle, Luca, Ming, Audrey, Guy, Lola, Sariah et Carole. tous les moments

passs ensemble au labo et en dehors. laccueil chaleureux que vous mavez fait lors de mon arrive

et au soutien que vous mavez apport tout au long de ma thse.

Enfin, j'adresse mes plus sincres remerciements ma famille, qui m'a toujours soutenu et encouragau cours de la ralisation de ce travail de recherche.


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Sommaire

.........................................INTRODUCTION GNRALE 13...........................................TUDE BIBLIOGRAPHIQUE 17

..............................................................................................1. Introduction 17

.....................................................................2. La flore microbienne du sol 18

......................................................................................................2.1. La Rhizosphre 21

.......................................................2.2. Les champignons: mycorhizes arbusculaires 22

...................................................................................................2.3 Les rhizobactries 24

.......................................................................2.3.1. Mcanisme de fixation de lazote 26

...........................................................................2.3.2 Production des phytohormones 28

.........................................................2.3.3. Solubilisation des phosphates dans le sol 29

..............................................3. Inoculation des rhizobactries dans le sol 31

....................................................................................................3.1 Inoculum liquide 32

................................................................................3.1.1 Imprgnation des semences 32

................................................................................3.1.2 Pulvrisation de linoculum 32

.......................................................................................3.2. L'inoculum sous support 33

................................................................................3.2.1 Formulations base de talc 34

........................................................................3.2.2 Formulations base des tourbes 36

....................................................................3.2.3 Formulations base de vermiculite 36

.............................................................................3.2.4. Formulations base d'argile 37

.........................................................4. Lencapsulation des rhizobactries 39

..................................................4.1. Caractristiques principales de lencapsulation 40

......................................................................................4.1.1. Immobiliser et/ou isoler 40

...............................................................................................................4.1.2. Protger 41

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.....................................................................................4.1.3. Librer progressivement 42

..............................................................................4.1.4. Structurer et fonctionnaliser 42

...........................................................4.1.5 Pourquoi encapsuler des rhizobactries? 43

.............................................................................4.2 Les techniques dencapsulation 43

....................................................................................................4.2.1 Le dripping 44

.............................................................................4.3 Les matriaux dencapsulation 46

............................................................4.3.1. Caractristique de lalginate de sodium 47

..................4.3.2 Survie des rhizobactries encapsule dans des matrices dalginate 49

....................................4.3.3 Ladjonction de lamidon la matrice dencapsulation 50

.....................................................................................................Conclusion 53

............................................MATRIELS & MTHODES 55

............................................1. Micro-organismes et conditions de culture 56

......................................................................................1.1 Souches de rhizobactries 56

.................................................................................................1.2. Milieux de culture 57

.....................................................................................1.2.1 Composition milieu YEP 57

....................................................1.2.2 Milieu de culture de lInstitut Maurice R&D 58

............................................1.2.3 Prparation du milieu Trypticase soy broth (TSB) 59

.....................................1.3 Rhydratation et conservation des souches bactriennes 60

..................................................................................1.3.1. Protocole de conservation 60

.................................................................................................1.4 Cultures cellulaires 60

......................................................................................1.4.1 Cultures en Erlenmeyer 61

.......................................................................................1.4.2 Cultures en fermenteur 61

....................................................................................1.5 Dnombrement des cellules 63

...................................1.6 Dnombrement des cellules contenues dans les capsules. 64

............................................................1.7 Mthodes de caractrisation des bactries 65..........................................................1.7.1 Microscopie optique et loupe binoculaire 65

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.............................................................1.7.2 Morphologie et croissance des colonies 65

..........................................................................2. Procd dencapsulation 67

.............................................2.1 Prparation de rhizobactries pour lencapsulation 67

...........................................................2.2 Prparation de la matrice dencapsulation 69

............................................................................................................2.2.1 Matriaux 69

..............................................................................................2.2.2 Choix de lalginate 69

.................................................................................2.2.3 Choix des agents de charge 70

.................................2.2.4 Fabrication de la matrice et des solutions de glification 71

.........................................................................................2.3 Le schage des capsules 73

.............................................................................................2.4 Stockage des capsules 73

.............3. valuation de ladhsion des cellules sur les grains damidon 76

.........................................................................................3.1 Test de cosdimentation 76

3.2 Observation de ladhsion des cellules sur les granules damidon au.......................................................................microscopique lectronique balayage 78

3.2.1 Protocole de prparation des chantillons pour la microscopique lectronique........................................................................................................ balayage (MEB) 79

...4. Libration des rhizobactries des capsules dans leau et dans le sol 80

...............................................................4.1 Libration des rhizobactries dans leau 80

.......................................................................4.2 Libration des bactries dans le sol 81

.................................................5. Production des capsules chelle pilote 84

.................................................................5.1 Production de la biomasse lONIRIS 84

....................................................................................5.1.1 Prparation de la matrice 85

...........................................................................................5.1.2 Schage des capsules 87

........................................................................................5.1.3 Schage sur lit fluidis 88

.................................................................................................5.1.4 Schage ltuve 89

.......................5.2 Production des capsules lUniversit Austral du Chili (UACH) 91

................................................................................5.2.1 Encapsulation des bactries 93

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..................6. tude de lefficacit des inoculums encapsuls en champs 95

.....................................................................................6.1 Essais en champs au Chili 95

..............................................................................6.2 Essai en champs en Angleterre 99

..........................................RSULTATS & DISCUSSION 103

1.Caractrisation de la survie des rhizobactries au procd...........................................................................................dencapsulation 104

....1.1 Leffet de la nature de la matrice dencapsulation sur la viabilit cellulaire 104

1.2 volution du nombre de cellules vivantes diffrentes tapes du procd..........................................................................................................d'encapsulation 111

1.3 volution du nombre de cellules vivantes dans des billes sche durant le...........................................................................................................stockage 4 C 118

...................................................................1.4 Influence de lchelle de production 121

...........................................................1.4.1. Production des capsules pour lUACH 122

1.4.2. Production de capsules sches dalginate-amidon pour le partenaire industriel.................................................................................................................... Masstock.

2. Optimisation de la survie des rhizobactries au procd...........................................................................................dencapsulation 132

...............2.1 Optimisation par la modulation de ltat physiologique des bactries 132

2.1.1 Linfluence de la phase de croissance sur la survie des cellules pendant...............................................................................lopration de schage ltuve. 132

........2.1.2 Influence de l'adjonction dosmo-protecteurs dans le milieu de culture 135

..2.2 Optimisation par la modulation des paramtres du procd dencapsulation 138

.........2.2.1 Influence de l'adjonction de glycrol dans la matrice dencapsulation 138

........2.2.2 Modification du sel de calcium utilis pour la glification de lalginate 139

............................2.2.3 Modulation du niveau de schage et stockage des capsules 142

..........................3. tude de ladhsion des rhizobactries sur lamidon 146

3.1. Influence de la souche de rhizobactries sur ladhsion la surface des

..................................................................................................... granules damidon

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3.2. Influence de ltat physiologique dEnterobacter ludwigii sur sa capacit...........................................................................dadhsion aux granules damidon 148

...............................................3.3. Effet du type damidon sur ladhsion cellulaire 149

3.4. Pourcentage dadhsion cellulaire en fonction de la concentration de lamylose......................................................................................dans les granules damidon. 152

3.5. Observation au microscope lectronique balayage des bactries adhres sur.........................................................................la surface des granules de lamidon. 155

....4. Libration progressive des rhizobactries et efficacit en champs 161

......................................4.1 Libration des rhizobactries dans leau et dans le sol 161

......................................4.1.1 Libration des B. pumilus et R. terrigena dans leau 161

.............................................4.1.2 Libration dans le sol de B. pumilus encapsule 163

................................4.2 tude de lefficacit des inoculums encapsuls en champs 166

................................CONCLUSION & PERSPECTIVES 175

..............................................................BIBLIOGRAPHIE 179

Sommaire

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INTRODUCTION GNRALE

Pendant la priode qui comprend les annes 1960-1990, le monde a vcu une immense

transformation politique et conomique, connue comme la Rvolution Verte. Cette

rvolution a permis une augmentation de la productivit agricole. Elle a t rendue possible

par la mise au point de nouvelles varits de crales haut rendement et par le

dveloppement de produits de la chimie de synthse, comme les pesticides et les engrais.

Grce la rvolution verte, le rendement des cultures a augment, et cela a permis de nourrir

la population mondiale tout en maintenant le prix des denres alimentaires des niveaux

stables.

Depuis les annes 90, nous avons pris conscience davoir pay trop cher le gain de

productivit du la Rvolution Verte. Lutilisation excessive des produits agrochimiques a

conduit une grave pollution de lenvironnement et mis en pril la sant publique.

La recherche scientifique sest intresse l'tude et l'exploration du potentiel des

microorganismes du sol, afin dutiliser leurs proprits phytosanitaires et phytostimulantes pour diminuer lutilisation des produits agrochimiques. Les produits contenant des micro-

organismes, comme les bactries ou les champignons, sont caractriss de bioengrais. Ces

micro-organismes peuvent tre inoculs seuls ou en mlanges. Les rhizobactries permettent

de fixer l'azote atmosphrique ou de le solubiliser et de mobiliser les lments nutritifs du sol.

Ils peuvent galement scrter des substances stimulant la croissance des cultures.

Les rsultats des recherches sur les proprits des bioengrais ouvrent des nouvelles pistesoffrant ainsi une alternative lutilisation des engrais chimiques. Cette alternative plus

cologiquement durable permet d'accrotre la fertilit des sols dans le cadre d'une production

agricole durable et respectueuse des agro-cosystmes.

Actuellement, linoculation du sol est ralise par pandage de tourbe pralablement

mlange une culture microbienne. Toutefois, lencapsulation des cellules dans des

hydrogels s'est avre comme une technique prometteuse (Cassidy et al. 1996). En effet,

I. Introduction Gnrale

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l'encapsulation des cellules protge les micro-organismes des agressions de l'environnement

et de la flore concurrente dj prsente dans le sol et permet une diffusion progressive des

micro-organismes dans le sol (Fages 1992; Bashan 1998).

La diminution du taux de survie, durant lencapsulation et tout particulirement pendant

l'tape de schage, reste cependant une difficult majeure. Selon plusieurs auteurs, le nombre

de cellules viables diminue jusqu une valeur infrieure 1% au cours du procd

d'encapsulation (Paul et al. 1993). La phase de schage des capsules constitue donc l'tape la

plus critique du procd dencapsulation . Elle demeure cependant indispensable, car elle

permet de maintenir l'activit biologique des capsules malgr une priode de stockage

prolonge (Bashan et Gonzalez, 1999).

Lhydrogel le plus utilis pour lencapsulation des micro-organismes est l'alginate de sodium.

Les billes dalginate sont en fait, trs fortement hydrates, 97% de leur masse tant de leau,

et ne sont pas capables de protger les micro-organismes pendant la dure du schage. Aprs

schage, les capsules sont petites et contractes, et prsentent un taux de mortalit des micro-

organismes lev. Afin d'amliorer cet tat, l'ajout d'adjuvants, tel que lamidon, a permis

daugmenter la concentration initiale en matire sche (Ivanova 2006). La formulation des

capsules base dalginate et damidon permet une diminution de la consommation dnergie

par le procd de schage et un meilleur taux de survie des micro-organismes.

Lobjectif principal de ce travail de recherche est l'augmentation de la survie des

rhizobactries encapsules et la mise au point dune mthode dinoculation fiable pour

permettre la protection des rhizobactries au sein dune matrice sche d'alginate-amidon via

limmobilisation des bactries au sein des capsules.

On sattachera notamment dterminer une formulation de matrice dencapsulation

dalginate, alginate-argile et alginate-amidon, ainsi quidentifier les conditions techniques

optimales permettant de raliser lencapsulation. On valuera galement la survie des cellules

durant le procd dimmobilisation et durant leur stockage ainsi que leur libration dans l'eau

et le sol.


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Ce travail se dcline en quatre parties :

Le premier chapitre prsente une revue bibliographique, portant sur la flore microbienne

naturelle du sol, linoculation des rhizobactries dans le sol et la production dinoculantbiologique par immobilisation des rhizobactries.

Le second chapitre porte sur la description des quipements, des techniques exprimentales et

des mthodes dexploitation des donnes employes au cours de ce travail.

Le troisime chapitre dcrit les rsultats obtenus au cours de cette tude et leur interprtation,

qui comprend: la caractrisation et loptimisation de la survie cellulaire aux diffrentes tapes

de lencapsulation en fonction des espces bactriennes, la comprhension des mcanismes de

protection cellulaire par lamidon et enfin les rsultats dapplication des capsules en champs.

Enfin, une conclusion approfondie permettra de discuter de nos rsultats et danalyser les

perspectives qui en dcoulent. Notamment, les perspectives concernant lutilisation future et

de manire massive des capsules dans le domaine agricole seront discutes.


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TUDE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Introduction

Les rhizobactries sont un groupe de bactries qui vivent associes aux racines des vgtaux

qui jouent un rle important pour la croissance des plantes. Elles colonisent les racines des

cultures cralires. Les mcanismes responsables de l'amlioration de la croissance incluent:

la fixation dazote atmosphrique, la production des hormones favorisant la croissance des

cultures et la solubilisation/mobilisation des phosphates du sol.

Lutilisation des rhizobactries dans lagriculture permet de rduire lemploi de produits

chimiques de synthse effet nfaste pour l'environnement ou doptimiser lutilisation des

engrais chimiques dans le cadre dune agriculture raisonne.

En consquence, un nombre croissant de recherches et d'tudes portent sur la gestion du

systme sol-vgtal et micro-organismes. Il s'agit de recherches encourages et dveloppes

dans le cadre de nombreux projets internationaux. Elles ont permis notamment lidentificationet la slection de diffrents genres de rhizobactries, telles que lAzospirillum (Krieg et

Dbereiner 1984), Raoultella (Van Elsas et al. 2007)etBacillus (Siddiqui 2006).

Le but de ces recherches est de dvelopper des bioengrais sous forme sche et d'obtenir une

concentration bactrienne ncessaire pour amliorer la croissance des plantes. Le travail de

recherche porte sur lencapsulation des rhizobactries, qui est considre actuellement comme

lune des techniques les plus prometteuses pour atteindre cet objectif.

Ltude bibliographique dcrira en premier lieu les mcanismes daction des rhizobactries.

Une deuxime partie sera consacre aux diffrents modes dinoculation possibles des dites

bactries dans le sol. Elle sera suivie dune troisime partie concernant la production

dinoculants contenant des rhizobactries immobilises.

II. tude Bibliographique

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2. La flore microbienne du sol

Les micro-organismes vivants dans le sol sont des bactries, des champignons, des algues, on

retrouve aussi les parties souterraines des plantes ainsi que des animaux trs varis allant des

protozoaires aux mammifres. Tous participent dune manire ou dune autre la formation

de la rhizosphre. Le tableau II.1 prsente les organismes vivants qui composent la

rhizosphre.

Tableau II.1. Abondance des organismes vivants du sol (n.d. = non dtermin) (Gobat et

al. 2003).

Organismes No bre Biomasse m yenne

par grammede sol sec

par m3 kg/haprof. 20 cm

% (sansles racines)

Bactries 106 - 109 1011 - 1014 1 500 25

Champignons n.d. n.d. 3 500 59

Algues 103 - 105 108 - 109 10 1 000 Traces

Protozoaires 104 106 109 1011 250 4

Faune du sol 0,1 1 000 10 5.106 1 5 000 12

Racines n.d. n.d. 6 000 -

Total n.d. n.d. env. 12 000 100

Bactries

Au sens large, le terme de bactrie regroupe les organismes unicellulaires organisation de

type procaryote (Bactries et Archaea), contrairement par exemple aux levures, qui sont des

eucaryotes. Certaines bactries du sol se dplacent laide de flagelles qui fonctionnent

comme des hlices de bateau entranes par un moteur rotatif. Dautres, frquentes dans lessols et litires, se meuvent en rampant la surface de corps solides (Huang et al, 2002).

Le changement de composition du sol et du gaz dans un terrain est surtout li aux fonctions

bactriennes (Hurst et al, 2001). Par exemple, lactivit respiratoire arobie, qui consomme

loxygne, peut mener lanoxie : cela concerne les sols hydromorphes, o la diffusion de

lair est restreinte, mais aussi le centre de grandes particules dans des sols ars. En prsence

dun excs de substrat carbon, les bactries accaparent lazote disponible. En revanche,


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dautres, dans des conditions de carence en azote, sont capables de fixer lazote

atmosphrique N2 et denrichir le sol en azote organique et minral.

Les cyanobactries sont photosynthtiques et leur activit est identique celle deschloroplastes des algues et les vgtaux. Nombre dentre elles (ex. Nostoc, Anabaena)

peuvent fixer lazote. Certaines vivent en symbiose avec des plantes, commeAnabaena azolla

dans les tissus des plantes fougres flottantes du genre Azolla. Elles constituent alors,

limage des algues vertes, des symbioses semblables des lichens (cyanolichens).

Par la synthse de facteurs de croissance (vitamines) dune part, et dantibiotiques dautre

part, certaines bactries exercent un contrle positif ou ngatif sur dautres organismes.

Mais cest avant tout par leurs fonctions biogochimiques, telles que la minralisation de la

matire organique, loxydation des composs inorganiques rduits, la rduction anarobique

des composs inorganiques oxyds, la solubilisation ou la prcipitation de minraux, sans

oublier la transformation de certains composants organiques en humine, que les bactries

jouent un rle essentiel dans la formation et lvolution du sol.

Le bon droulement de toutes les tapes de croissance des plantes ncessite des sols bien

vivants dont les habitants (faune, champignons, algues et bactries) contribueront tous

rechercher et mettre la disposition de la plante tous les lments nutritifs dont elle a

besoin. Parmi tous ces lments, lazote est celui dont la disponibilit est souvent critique

pour la production du bl.

Champignons

Les champignons sont tous des eucaryotes htrotrophes arobies digestion extracellulaire.

Ils peuvent toutefois appartenir des groupes taxonomiques trs variables.

Les champignons transportent activement des quantits importantes deau et de substances

dun endroit lautre du sol. La translocation des lments organiques sert fertiliser le sol.

Lextraction des sels minraux prend toute sa signification chez les mycorhizes. Cest pourquoi les racines dun vgtal ralisent une forte association symbiotique avec les


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champignons. Le champignon est ici un collecteur des sels minraux, quil transfre la

plante ou garde en rserve pendant la saison morte.

Certains champignons sont spcialiss dans lutilisation de polysaccharides vgtaux et/oulignine, et peuvent accumuler dans leur myclium ou dans leurs spores des composs

mlaniss prcurseurs des matires humiques. Dautres sont habitus vivre avec les plantes,

en prlevant directement les aliments organiques dont ils ont besoin. Cette adaptation est

souvent symbiotique, comme dans le cas des mycorhizes dj voques, mais parfois

parasitaires.

Algues

Les algues microscopiques, unicellulaires ou en colonies filamenteuses, sont souvent

abondantes dans les sols, mais restent surtout localises la surface ou dans de larges fissures.

Trois groupes taxonomiques eucaryotes sont reprsents : les algues vertes (Chlorophyces :

Chlamydomonas, Chlorellia, Pleurococcus), les algues jaune-vertes ( Xantophyces :

Heterococcus, Vaucheria) ces deux groupes dominent dans les sol acides et les diatomes

(Bacillariophyces, Achnanthes, Navicula, Pinnularia), majoritaires dans les sols neutres ou

alcalins. Quand aux algues bleues, les cyanophyces, elles sont en ralit des bactries.

Selon les sols, la biomasse algale, cyanobactries incluses, est comprise entre 10 et 1000 kg

de matire sche par hectare, avec un maximum de 24 kg pour les seules cyanobactries des

rizires. Il a t dnombr de 102 109 individus par gramme de terre dans les sols (Davet,

1996).

Grce leur activit photosynthtique, les algues colonisent rapidement les surfaces minrales

brutes, dont elles acclrent laltration par les substances dissolvantes. Elles produisent aussi

les polysaccharides extracellulaires qui agrgent les particules solides et en renforcent la

cohsion. En milieu aquatique et dans les sols submergs, certaines forment de la craie en

prcipitant la calcite.


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2.1. La Rhizosphre

La rhizosphre est le volume de sol qui adhre aux racines des plantes. Cest la zone

d'absorption des nutriments et de l'eau et dinteraction entre les racines des plantes et les

micro-organismes associs. Les interactions dans la rhizosphre sont trs importantes et

intensives entre la plante, le sol et les micro-organismes du sol. En fait, les interactions

biochimiques et les changes de molcules de signalisation entre les plantes et les

microorganismes du sol peuvent influencer de manire significative la croissance des crales

(Pinton et al 2001; Werner 2004).

Figure II.1. Schma de linteractions entre les bactries et les vgtaux au niveau de la

rhizosphre.(http://biosol.esitpa.org/).

Les plantes vivent au contact de nombreux micro-organismes. Ce contact est permanent et

troit puisque l'on peut dtecter plus de 109 microorganismes par gramme de racine. La

plupart de ces micro-organismes vivent probablement en saprophytes (leur action principale

est le recyclage de la matire organique). Certains exercent un effet nfaste (organismes

pathognes par exemple) et d'autres peuvent, au contraire, protger et favoriser le

dveloppement des vgtaux.


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http://biosol.esitpa.org/http://biosol.esitpa.org/


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Dans la rhizosphre les organismes vivants qui favorisent la croissance des vgtaux sont

essentiellement, des bactries et des champignons, grce leur capacit de fixation d'azote,

production dhormones et solubilisation des phosphates.

2.2. Les champignons: mycorhizes arbusculaires

Les champignons constituent un rgne part, ils constituent dans notre cas ce qu'on pourrait

appeler la flore fongique . Ils ne font partie ni du rgne animal, ni du rgne vgtal.

Cependant, leur comportement alimentaire les rend davantage semblables aux animaux

quaux plantes. Tout comme les animaux, ils sont htrotrophes vis--vis du carbone, cest--

dire quils ont besoin dune source de carbone organique externe pour salimenter,contrairement aux plantes vertes qui produisent elles-mmes ces lments grce la

photosynthse.

La dnomination de mycorhizes a t utilise la premire fois en 1885 par A.B Frank pour

dcrire la modification des structures de certaines espces forestires. Elle a t utilise depuis

pour designer les associations symbiotiques entre les champignons et les racines des plantes

(Smith et Read 1997).

Le mot arbuscules dsigne des structures intracellulaires trs ramifies, les arbuscules

proprement dits sont censs tre des sites de transfert des lments nutritionnels entre le

champignon et la plante. Ces arbuscules maximisent la surface de contact entre la plante hte

et les champignons pour permettre l'change d'lments nutritifs (Sylvia 2005).

Les mycorhizes arbusculaires sont constitues par lassociation symbiotique dun champignon

et des racines dune plante. En dautres termes, il s'agit l d'une racine colonise par un

champignon mycorhizien qui en a modifi sa morphologie. Les mycorhizes arbusculaires

dplacent activement des quantits importantes deau et des substances nutritionnelles dun

endroit lautre du sol. Le dplacement mcanique des lments organiques permet de

fertiliser le sol. Cest pourquoi les racines des vgtaux effectuent une forte association

symbiotique avec les champignons. Le champignon est un collecteur de sels minraux, qui les


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transfre la plante, les minraux rcolts ce qui constitue une rserve pendant la saison

morte.

Ces champignons appartiennent aussi bien aux Basidiomyctes quaux Ascomyctes etGlomromyctes et ils forment des symbioses mycorhiziennes avec les racines de la majorit

des plantes terrestres. Les diffrents types de mycorhizes qui existent se distinguent la fois

par les groupes taxonomiques des partenaires symbiotiques impliqus (plantes et

champignons) et par les structures typiques formes dans la symbiose (Peduzzi et Boucher-

Rodoni 2002).

Plus de 80 % des espces vgtales de la plante s'organisent sous la forme dassociation

symbiotique avec les mycorhizes (German et al. 2000; Siddiqui 2006). Suite la colonisation

par les mycorhizes, la fonction des racines se modifie sous leffet du myclium structur sous

la forme de mycorhizes arbusculaires. ce jour, on dnombre environ 120 espces de

champignons capables de former ce type de mycorhizes; ils appartiennent tous aux

Glomromyctes et ne peuvent pas tre cultivs seuls (en labsence de la plante hte). Leur

cycle biologique dans le sol repose entirement sur la prsence de racines vivantes de la

plante hte .

En association avec le champignon, un nombre important de processus physiologiques des

plantes sont amliors: nutrition minrale, rsistance aux stress biotiques (maladies) et

abiotiques (pollution), enracinement et floraison. Leffet sur la croissance des plantes est trs

positif: accroissement parfois important en poids sec, en taille et modification de la teneur en

lments. La nutrition de la plante notamment en azote (minral surtout) et en phosphore est

amliore par son transfert du champignon vers la plante (les capacits lytiques du

champignon sont largement suprieures celles de la plante, de mme que la surface draine).

De mme, le transfert de leau est favoris; on a pu montrer que les mycorhizes accroissent

sensiblement la rsistance la scheresse, notamment en conditions extrmes (zones arides).

On observe galement les effets non nutritionnels comme la protection de la plante contre les

bactries et champignons phytopathognes et la tolrance des plantes aux mtaux lourds, ainsi

qu'ventuellement une tolrance au calcaire (plantes calcifuges). De son ct, le champignonreoit des sucres, des vitamines et des molcules complexes (Weger et al. 1995).


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La colonisation des plantes par les mycorhizes arbusculaires peut affecter de manire

importante la population des bactries bnfiques associes la rhizosphre. La synergie entre

rhizobactries et mycorhizes ont t dcrites comme ayant un effet de promotion sur la

croissance des plantes et des arbres (Glick et al. 1999).

2.3 Les rhizobactries

Les rhizobactries sont des bactries qui sont aptes coloniser les racines de faon intense.

Les bactries non symbiotiques rpondant cette dfinition appartiennent diffrents genres

et espces dont les plus tudis sont: Azospirillum spp, Bacillus spp, Pseudomonas spp.

(Kilian et al. 2000). Les effets bnfiques des rhizobactries sont lis leur position

stratgique linterface sol-racine. En effet, le rhizoplan et la rhizosphre sont le sige

dchanges intenses entre la plante et le milieu environnant (Brown 1974). Ces changes sont

rciproques. La plante libre des exsudats racinaires qui sont constitus de substances

organiques carbones et azotes : polysaccharides, acides organiques et protines (Beckmann

et al. 1994). De mme, la densit des bactries est plus leve dans la rhizosphre que dans le

sol distant des racines : il sagit de leffet rhizosphre (Fages 1992; Ravikumar et al. 2004).

La quantit et la composition des exsudats racinaires conditionnent galement la nature desactivits bactriennes. Ces activits rsultent de la synthse de mtabolites tels que les

sidrophores, les substances de croissance et les lipopolysaccharides .

Si la plante libre des composs organiques, linverse elle prlve de leau et des lments

minraux indispensables son mtabolisme. Ce prlvement est dailleurs associ

lextrusion de protons qui contribue abaisser la valeur du pH de la rhizosphre. Les racines

sont galement capables dabsorber certaines molcules organiques, produites par les micro-organismes prsents dans la rhizosphre. Les changes entre la plante et le sol sont influencs

par les rhizobactries et ce dautant plus que leur densit et leur activit sont leves. Cette

influence se manifeste par une modification de la croissance de la plante et de la frquence

des infections fongiques de la racine. Selon les rhizobactries prsentes, ces modifications

peuvent tre positives ou ngatives pour la plante. Leur tude a donc suscit lintrt de

nombreux chercheurs .


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Les rhizobactries sont les bactries prsentes dans la rhizosphre. Elles peuvent promouvoir

la croissance des plantes grce plusieurs mcanismes : la fixation biologique de lazote, la

synthse des phytohormones, l'augmentation de la disponibilit du phosphate, la diminution

du stress environnemental et la synergie avec dautres micro-organismes dans le sol (Fuentes-Ramirez et Caballero-Mellado 2005).

Le nombre de bactries identifies en tant que rhizobactries ou PGPR (en anglais Plant

Growth Promoting Rhizobacteria ) a connu une croissance notable ces dernires annes, ceci

est le rsultat de plusieurs tudes et recherches incluant un grand ventail de plantes. Le

tableau II.2 montre leffet de lutilisation des rhizobactries sur laugmentation de la

croissance et de la protection aux maladies chez les plantes.

Tableau II.2. Les rhizobactries: laugmentation de la croissance des plantes et la

protection aux maladies.

Rhizobactrie Culture Effet Rfrence

Pseudomonasluorescens

Betterave Meilleure rsistance aux

maladies

(Moenne-Loccoz et al.1999)

Bacillus pumilus Tomate Meilleure rsistance aux

maladies

(Benhamou et al. 1998)

Paenibacillusmacerans et

Bacillus subtilis

Riz Promotion de la croissancedes plantes

(Vasudevan et al. 2002)

zospirillumbrasilense

Bl Promotion de la croissancedes plantes

(Kim et al. 2005)

Pseudomonasluorescens


(de Freitas et Germida1992)

Pantoeaagglomerans


(Amellal et al. 1998)

Bacillus simplexet Bacillus firmus


(Barneix et al. 2005)

Ces recherches ont contribu au progrs des connaissances des diffrents mcanismesdaction directe et/ou indirecte des rhizobactries (Baker et Cook 1974).


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Les mcanismes indirects se manifestent lorsque les rhizobactries agissent en tant que

contrle biologique. Elles confrent ainsi la plante une rsistance accrue aux maladies

fongiques et bactriennes. Ce mcanisme indirect stimule galement la croissance des autres

bactries symbiotiques qui protgent aussi les plantes des sols dj contamins parmicroorganismes pathognes.

Les mcanismes directs incluent la production de phytohormones, lamlioration du captage

des lments nutritifs chez les plantes (libration des phosphates) et la fixation de lazote

atmosphrique. Les diffrents mcanismes directs de promotion de la croissance sont ici

dtaills.

2.3.1. Mcanisme de fixation de lazote

La dcouverte de la fixation de lazote par les lgumineuses remonte au 19 me sicle. Il a fallu

prs de cinquante ans pour tablir que laptitude des lgumineuses utiliser lazote de lair

tait due la prsence de nodules sur les racines, induites par des ferments contenus dans le

sol. Cette dcouverte fut rapidement suivie par lisolement des Rhizobium, puis de plusieurs

autres bactries fixatrices dazote dans la rhizosphre (Glick et al. 1999).

La canne sucre a t considre comme un modle vgtal, dans lequel a t tudie la

fixation dazote (Smith 1995).

La raction ralise par le complexe nitrognase exige :

- 8 lectrons et 8 protons pour la rduction

- 16 ATP pour la fourniture de lnergie dactivation

La raction complte est donc :

N2 + 8e+ 8H+ 16 ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi


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La formation dammoniaque saccompagne toujours de celle dhydrogne. Les lectrons

proviennent de deux sources selon les souches :

- de NADH, H+

ou/et FADH2 fournis par les processus cataboliques (cycle deKrebs, -oxydation des acides gras, etc.).

- de la ferrdoxine ou/et de NADH, H+ form au cours de la photophosphorylation

acyclique.

Le complexe enzymatique de nitrognase est constitu de 2 mtalloprotines qui comportent

trois groupements prosthtiques diffrents. La premire est une rductase (appele

nitrognase 1) et renferme 2 sous-units identiques. Elle contient du fer et se comporte

comme une rductase. Pour chaque lectron rcupr du donneur et cd la nitrognase, il y

a consommation de 2 liaisons phosphatiques riches en nergie (2 ATP). La seconde est la

nitrognase (nitrognase 2), organise en 2 sous-units identiques et en 2 sous-units

identiques. Sous forme ttramrique 22, elle reoit les lectrons de la rductase pour rduire

lazote atmosphrique.

Figure II.3. Fixation biologique de lazote par le complexe nitrognase.

L'activit de la nitrognase est contrle par la concentration du milieu en NH4+ et par la

concentration en oxygne. La prsence des ions ammonium inhibe lactivit enzymatique. La

molcule doxygne peut endommager l'enzyme nitrognase de manire irrversible, par


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oxydation des protines enzymatiques. Il existe aussi dautres facteurs qui influencent cette

activit, et par consquent la fixation dazote.

2.3.2 Production des phytohormones

Une phytohormone est une molcule gnralement produite par la plante. C'est une molcule

qui rgule la croissance vgtale ou qui intervient dans la communication entre individus

vgtaux diffrents. Ces phytohormones peuvent avoir des effets bnfiques sur la croissance

vgtale et le dveloppement des plantes (Salysbury et Ross 1992).

Pour tre une phytohormone, une substance doit normalement tre:

endogne (non fournie par l'environnement),

oligodynamique (agir faible dose, de l'ordre de la micromole) et

vectrice d'une information (apporte une cellule cible slectivement sensible son

action et dont elle influence le fonctionnement).

La plupart des rhizobactries produisent des hormones auxquelles les vgtaux sont sensibles.

Ces hormones scrtes par les bactries sajoutent l'ventail ou "Pool" des hormones

vgtales endognes (Bashan 1998). Ainsi, les hormones bactriennes stimulent le

dveloppement du systme racinaire ainsi que la croissance globale de la plante hte. Dans le

mme temps, l'augmentation rsultante de la production des mtabolites vgtaux est utilise

par les bactries pour leur propre croissance, ce qui permet une relation rciproque bnfique

entre plantes et rhizobactries (Patten et Glick 2002).

La promotion de la croissance des racines par les hormones est l'un des facteurs principaux

qui ont t identifis comme tant bnfiques au rendement de production des plantes. La

production bactrienne des hormones constituerait l'essentiel du mcanisme de stimulation de

la croissance des plantes grce la grande sensibilit des racines aux hormones. Par exemple,

les rhizobactries scrtent de faibles quantits dhormones telles que les auxines qui

stimulent l'longation des racines. Par ce biais, elles sont capables de promouvoir lacroissance des racines latrales ou le dveloppement des poils absorbants (Brick 1996).


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Figure II.4. Racines de plantes de tomate a et b racines de plantes contrle sans

rhizobactries; c et d racines de plantes inocules avecEnterobacter ludwigii.

La figure II.4 montre leffet de l'augmentation des poils absorbants dans les plantes de tomate

due linoculation dEnterobacter ludwigii isole par Schoebitz et al. (2009). Sur les figures

II.4 a et b les racines des plantes de tomate non inocules, nous navons observ aucune

promotion de croissance. En revanche, les figures c et dmontrent un dveloppement abondant

des poils absorbants.

2.3.3. Solubilisation des phosphates dans le sol

Les micro-organismes du sol peuvent galement favoriser la croissance des plantes en

amliorant les transformations de la matire organique des sols et en mobilisant des

nutriments inorganiques.


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Les phosphates sont prsents sous forme insoluble dans le sol et ne sont donc pas accessibles

par les plantes. Certaines rhizobactries peuvent librer des acides organiques et des enzymes

qui solubilisent les molcules phosphates.

Par exemple, Pseudomonas spp. libre dans le sol l'enzyme phytase. Cette enzyme est

responsable de la libration du phosphate, tel que linositol hexaphosphate. Dans des essais

pratiqus au Qubec (Canada) en champ ouvert, linoculation de Pseudomonas spp. a gnr

une augmentation du rendement du champ de mas tudi. Dans un autre essai, ce mme

rhizobactrie a permit une augmentation du rendement des cultures de laitue de 18 % (Smith

1995).

Les scientifiques sont bien convaincus et daccord aujourdhui pour dire que lun des moyens

pour raliser cet objectif est dapporter ou de rintroduire dans les sols des rhizobactries.

Plusieurs types de bactries peuvent remplir cette fonction de solubilisations des phosphates

dans le sol, mais il est ncessaire de mettre au point une stratgie pour isoler les bactries les

plus performantes, optimiser leur intgration dans les sols et vrifier leur efficacit dans les

champs.

Concernant leur intgration dans les sols, nous parlerons dans la partie suivante de

lincorporation de rhizobactries par inoculation sous forme de cultures liquides et par

lintermdiaire de supports solides comme la tourbe, le talc, la vermiculite ou sous forme

encapsule.


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3. Inoculation des rhizobactries dans le sol

Ltude des effets bnfiques de linoculation des rhizobactries nest pas rcente, car durant

les annes 1897, l'entreprise Bayer avait mis sur le march allemand un produit fabriqu

base de bactries stimulantes de la croissance des crales. Les bioengrais ont t fabriqus

l'aide de la souche Bacillus subtilis (Marshall 1968). Linoculation des rhizobactries sur les

champs a t ralise grande chelle par lUnion Sovitique en 1958 sur 10 millions

dhectares. Les bactries utilises appartenaient principalement aux espces Azotobacter

chroococcum etBacillus megaterium (Cassidy et al. 1996). Cependant, Mishutin et Naumova

(1962) ont estim que ce traitement na engendr que des augmentations modestes de

rendements et sur seulement 50 70 % des surfaces. Malgr ces rsultats, linoculation des

rhizobactries a fait lobjet dexprimentations prcises ralises petite chelle dans divers

pays (Bashan 1986; Hernandez et al. 2009). partir des annes 90, aux tats-Unis, la

rhizobactrieB. subtilis a commenc tre employe sur 2 millions d'hectares de cultures .

Les donnes accumules (1974-1994) de l'inoculation sur le terrain dans le monde suggrent

que les techniques d'inoculation ont connu une augmentation significative du rendement des

cultures de l'ordre de 5-30% (Okon et Labandera-Gonzalez 1994).

La microflore rhizosphrique est constitue dun ensemble de micro-organismes en quilibre,

si la rhizobactrie introduite ne colonise pas la rhizosphre de faon agressive, son activit

bnfique ne peut pas sexprimer, car lquilibre microbien antrieur linoculation se rtablit

rapidement. Par contre, lutilisation de certaines souches dAzospirillum brasilense aptes se

maintenir et se dvelopper sur le systme racinaire saccompagne deffets bnfiques

significatifs pour les plantes inocules (Krieg et Dbereiner 1984; Fages 1990). la suite delintrt suscit par ces publications, une grande partie du travail de recherche ralis sur les

rhizobactries est maintenant effectue sur des bactries appartenant au genreAzospirillum.

Pour amliorer la colonisation des rhizobactries dans la rhizosphre, ces dernires doivent

tres implantes au plus prs des graines sous la forme dinoculum liquide, ou solide (talc,

tourbe vermiculite et argile) ou d'inoculum encapsul. Dans les parties suivant, nous

montrerons les diffrents aspects de lintroduction de rhizobactries dans le sol.


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3.1 Inoculum liquide

Les inoculums sous forme liquide sont les plus simples utiliser et les moins coteux. La

prparation de ce type dinoculum s'effectue en mlangeant les bactries soit avec un milieu

de culture, soit avec une solution spcifique pralablement formule.

Il existe principalement deux faons de traiter les semences pour lapplication dinoculum

liquide bactrien. La premire faon consiste mlanger les graines dans linoculum liquide

et la deuxime pulvriser linoculum sur le sillon des semis.

3.1.1 Imprgnation des semences

Les semences sont mlanges dans la suspension avant les semis. Cette mthode permet une

mise en contact direct et immdiat entre les bactries et les graines. La probabilit de prsence

des rhizobactries sur les racines est par consquent particulirement leve. Cette mthode

dapplication ne permet pas davoir sur toutes les semences le mme nombre des bactries,

car on n'obtient pas un mlange homogne dans tout l'ensemble des semences. Par ailleurs, les

bactries ne sont pas suffisamment protges contre les conditions de l'environnement et lescontaminations durant le transport et lapplication dans les champs (Bashan et al. 2002).

Cest pourquoi les semences imprgnes sont parfois sches l'air libre, pour tre

ultrieurement utilises dans les deux prochains jours. Ce type dinoculum est couramment

utilis aux tats-Unis, au Canada, en Argentine et au Brsil, et principalement pour la culture

du soja, du mais, des lentilles, des petits pois et des arachides (Bashan 1998).

3.1.2 Pulvrisation de linoculum

La pulvrisation de linoculum liquide sur les graines ou lpandage dans les champs de

linoculum doivent tre effectus quelques jours aprs ensemencement des graines. Pour ce

type de pratique, lagriculteur doit possder quelques connaissances en microbiologie, car

linoculum doit tre gnralement prpar juste avant son application (Morgan et al. 2006).

L'agriculteur doit investir dans l'achat des rservoirs refroidis pour permettre la conservationde linoculum liquide dans de bonnes conditions.


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Linoculum liquide peut tre pulvris directement dans le sillon des semis, ce qui offre une

plus grande quantit de bactries disponibles que celles qui sont inocules directement sur les

semences (Cassidy et al. 1996).

Pour certaines rhizobactries, telles que Azospirillum spp., les formulations liquides s'avrent

largement dfavorables, car elles ne fournissent pas un environnement protecteur pour lesdites

rhizobactries. Pour certaines espces vgtales, les inoculant liquides doivent tre appliqus

pendant plusieurs jours aprs les semis gnrant ainsi un travail supplmentaire et un cot

additionnel non ngligeable pour lagriculteur.

Lemploi optimal dengrais biologique dans le monde agricole actuel ncessiterait donc son

stockage sans que celui-ci perde son efficacit et viabilit cellulaire. Afin de faciliter la

manipulation, lapplication et la conservation de linoculum liquide, il est donc, ncessaire de

dshydrater les bactries sous un support solide afin de protger les rhizobactries.

3.2. L'inoculum sous support

Les microorganismes peuvent galement tres introduits dans le sol par lintermdiaire duninoculant solide, dont le composant principal est appel support. Un bon support doit avoir

comme caractristiques essentielles: la capacit de librer un grand nombre de cellules viables

dans de bonnes conditions physiologiques et ce au moment opportun.

Le plus souvent, les supports utiliss dans les formulations solides sont organiques et

minraux. Il sagit de tourbe, de talc, dargile et de vermiculite (figure II.5). Ils permettent

damliorer le taux de survie des bactries. Le tableau II.3 reporte la concentration dediffrents inoculums solides aprs des temps de stockage variables et pour diverses espces de

rhizobactries. La diminution du temps de conservation des bactries varie selon le type

bactrien, le type dinoculant utilis et selon la granulomtrie des particules.


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Tableau II.3. Dure de conservation des formulations en fonction des bactries et des

inoculant utiliss (Siddiqui 2006).

Support Rhizobactries Stockage Concentration finaleCFU/g

Talc P. fluorescens Pf1 8 mois 1,3x107

Talc B. subtilis 45 jours 1,0x106

Talc P. putida 45 jours 1,0x103

Talc P. putida (souches30,180) 6 mois 1,0x108

Tourbe P. fluorescens Pf1 8 mois 7,0x106

Tourbe +chitine

B. subtilis 6 mois 1,0x109

Tourbe P. chlororaphis (PA23) etB. subtilis (CBE4)

6 mois 1,0x108

Vermiculite P. fluorescens Pf1 8 mois 1,0x106

Vermiculite B. subtilis 45 jours 1,0x106

Vermiculite P. putida 45 jours 1,0x103

Argile P. fluorescens Pf1 4 mois 2,8x106

3.2.1 Formulations base de talc

Le silicate de magnsium est un minral naturel couramment connu sous le nom de talc, celui-

ci est disponible un faible cot sous forme de poudre. Le talc est trs peu hygroscopique et

inerte temprature ambiante ce qui rend possible une longue priode de stockage. Ce produit

est souvent utilis comme lment constituant de base dans de nombreuses formulations

bactriennes pour lagriculture.


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Kloepper et Schroth (1981) ont dmontr que le talc pouvait tre un bon support pour la

formulation de la rhizobactrieP. fluorescens . La mthode a consist mlanger de la gomme

de xanthane et du talc. Ainsi, 5 ml de gomme de xanthane (20%) ont t mlangs avec 5 ml

d'une suspension bactrienne de 1,0x109

UFC/ml. Aprs avoir laiss le mlange pendant 20min, le talc (environ 5 fois le volume du mlange bactries-gomme) a t ajout et

soigneusement mlang. Le mlange rsultant a t sch 12C pendant 3-4 jours. Les

auteurs ont observ une viabilit initiale de 8,2x107 UFC/g de poudre et aprs deux mois de

conservation ils nont pas constat une diminution du nombre des rhizobactries. Par contre,

aprs de 10 mois de stockage le nombre des rhizobactries a diminu jusqu 4,0x104 UFC/g

(Kloepper et Schroth 1981a).

Figure II.5. Les principaux supports utiliss pour linoculation de Rhizobactries dans le

sol : la tourbe (a), le talc (b), largile (c), et la vermiculite (d).

A

DC

B


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3.2.2 Formulations base des tourbes

La tourbe est un matriau vgtal organique qui se trouve couramment dans des rgions

marcageuses. Elle est issue majoritairement de la dgradation anarobie de divers vgtaux.

La tourbe est couramment employe en tant que support de stabilisation des rhizobactries.

Lavantage de lutilisation des formulations base de tourbe est la conservation de lactivit

physiologique des rhizobactries. En effet, la multiplication bactrienne peut se poursuivre

mme pendant la priode de stockage, condition, videmment, que les bactries disposent de

suffisamment de nutriments et quelles soient stockes une humidit et une temprature

adquates.

La principale difficult concernant l'utilisation de la tourbe comme support est lie sa grande

variabilit organique fortement en relation avec son origine gographique. La tourbe est en

effet une matire organique complexe. La variabilit organique de la tourbe affecte

grandement la qualit du produit final et sa stabilit au cours du stockage et a un effet

important la densit de cellules vivantes dans le produit (Siddiqui 2006). Un autre

inconvnient de lutilisation de la tourbe et sa contamination microbiologique. En effet, les

formulations des supports base de tourbe sont sujettes aux contaminations par dautresmicroorganismes, ce qui se traduit par une rduction de la dure de conservation de

l'inoculum (Bashan 1998).

3.2.3 Formulations base de vermiculite

La vermiculite est un minerai naturel proche de la famille des micas qui a subi un traitement

de chauffage trs haute temprature. Ce traitement ne fait pas fondre le matriau, mais permet sa dilatation. La principale proprit de la vermiculite est la rtention dhumidit,

raison pour laquelle elle est utilise comme support pour le dveloppement des formulations

des agents microbiens.

L'un des problmes qui limitent l'utilisation de la vermiculite comme support aux

rhizobactries, est que ce matriau offre des avantages rduits en ce qui concerne la survie des

micro-organismes pendant le stockage. Amer et Utkhede (2000) ont travaill avec lutilisation


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de la vermiculite, en tant que support pour deux souches de rhizobactrie: la soucheBacillus

subtilis cultive dans un bouillon de dextrose de pomme de terre et la souche Pseudomonas

putida cultive sur milieu King's B durant 48 h 150 revs/min 22 C. Puis, 50 ml de la

suspension bactrienne ont t mlangs avec 50 g de vermiculite. La concentration finale at denviron 108 UFC/ml. Les matriaux ont t stocks dans un rfrigrateur (4C) et

temprature ambiante (22 C), pour dterminer la population bactrienne aprs 45 jours. En

ce qui concerne le taux de survie de P. putida, sa viabilit a diminu jusqu 103 UFC/g 0C

et de 102 UFC/g 22C. En revanche, la viabilit de la rhizobactrie B. subtilis a t de 106

UFC/g 4C et 22C (Amer et Utkhede 2000).

3.2.4. Formulations base d'argile

Largile est une roche sdimentaire compose majoritairement de silicates daluminium

hydrats qui prsentent une structure feuillete. On distingue plusieurs types dargile en

fonction de lpaisseur des feuillets, telles que la kaolinite et la montmorillonite.

Laddition dargile dans la formulation bactrienne peut limiter la mortalit des cellules et leur

confre une meilleure protection. Cependant, toutes les argiles n'apportent pas le mme effet protecteur. Par exemple, l'utilisation de l'argile du type montmorillonite protge mieux les

Rhizobium trifolii des tempratures leves lorsque l'opration de schage s'effectue aux

environs de 70C (Bashan 1998). En revanche, l'argile de type kaolinite noffre pas cette

protection. Marshall et al. (1974) a expliqu cet effet par la formation dune enveloppe de

protection autour des cellules permettant ainsi de modifier le flux de leau entrant et sortant

dans les cellules pendant l'opration de schage et la rhydratation.

De plus, Bushby et Marshall (1977) ont dmontr que largile de montmorillonite protgeait

les cellules des Rhizobium leguminosarum etRhizobium trifolii mais quelle ne protgeait pas

les autres types de bactries telles queRhizobium lupini etRhizobium japonicum .

L'utilisation de l'argile dans la matrice prsente cependant un problme non ngligeable: ce

matriau offre une surface charge susceptible d'attirer des mtaux lourds. En effet, Cassidy et


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al. (1996) ont suggr que les argiles peuvent attirer les ions de quelques mtaux lourds et

ainsi devenir toxiques.

Largile reste cependant un matriau intressant si elle est utilise en complment dans unematrice dencapsulation. Par exemple, la survie de Pseudomonas fluorescens inocule 108

UFC g-1 de sol est suprieure aprs 84 jours si les bactries ont t encapsules dans une

matrice compose dalginate et de 3% de bentonite (p/v) (107 UFC g-1 de sol) en comparaison

aux bactries libres (103 UFC g-1 de sol sec) ou aux cellules encapsules avec de l'alginate

seul (106 CFU g-1 de sol) (Cassidy et al. 1996).


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4. Lencapsulation des rhizobactries

Au cours des dernires dcennies, lencapsulation des rhizobactries dans des hydrogels par la

mthode de dripping a t value. Le polymre qui a t le plus utilis est lalginate desodium, car il forme des gels dans des conditions douces pour les micro-organismes. Ces

polymres ont dmontr largement leur potentiel en tant que supports bactriens (Bashan

1998). Ils offrent des avantages substantiels par rapport la tourbe qui est reporte dans le

tableau II.4.

Le principe de l'encapsulation des cellules est de protger les micro-organismes vis--vis du

milieu environnant pour mieux les librer dans le sol et de faon progressive et prolonge(Paul et al. 1993). La vitesse de dgradation du polymre employ dpendra de l'activit

biologique des micro-organismes du sol. En rgle gnrale la dgradation du polymre doit se

produire lors de la germination des semences.

Les capsules dshydrates sont stockes temprature ambiante pendant une longue priode.

La capsule offre aux bactries un milieu favorable en diminuant le risque de mortalit et

permettant une longue conservation (Wang et al. 1999). Ces inoculants peuvent tre amliors

avec lapport de types de nutriments pour les bactries afin d'amliorer la survie des micro-

organismes, ce qui est indispensable pour la russite de l'inoculation de bactries dans le sol.

Les prparations encapsules ont rsolu de nombreux problmes lis aux inoculants

traditionnels tel que la tourbe, qui est le support couramment utilis pour les inoculants

biologiques. titre de comparaison, les caractristiques des formulations base d'alginate et

des formulations base de tourbe sont prsentes dans le tableau II.4.


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Tableau II.4. Comparaison des inoculant base dalginate et de tourbe (Mattila-

Sandholm et al. 2002).

Alginate Tourbe

Technologie industrielle existantecoteuse

Divprocdscd industriels existent

Chimiquement et physiquementuniformes

Pas uniforme (matire organiquecomplexe)

Biodgradable dans le sol Biodgradable dans le sol

Libration des bactries progressive et

prolonge Libration des bactries immdiateContrle de qualit techniquementsimple

Qualit de production non constante

Longue dure de conservation temprature ambiante

Dure de conservation limite

Volume de stockage rduit Besoin de grand volume

Forte rsistance la contamination Faible rsistance la contamination.

Faible mortalit bactrienne dans le sol Faible mortalit bactrienne dans le sol

Rsistante aux fluctuations dhumiditForte sensibilit aux fluctuationsdhumidit

Concentration maximale de l' inoculantbactrien:1011 CFU/g

La concentration de linoculantbactrien peut atteindre 108 CFU/g

4.1. Caractristiques principales de lencapsulation

Les principales fonctions de lencapsulation sont ici dcrites.

4.1.1. Immobiliser et/ou isoler

Limmobilisation et/ou lisolation de produits actifs permettent dviter le contact direct des

produits avec l'environnement. L'encapsulation est une mthode qui permet par exemple

deux ractifs d'tre spars et de n'entrer en contact direct avec le milieu que lors de la rupture

de la microcapsule. Le pigeage des armes au sein de microcapsules permet soit un effet


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aromatique prolong, soit sa libration uniquement lors d'une opration spcifique comme

une cuisson par exemple. Dans le cas de cellules vivantes ou denzymes, l'immobilisation

dans des microcapsule favorise leur utilisation prolonge au sein des biracteurs

fermentation continue. Dans ce cas les capsules sont permables aux substrats et aux produitsde la fermentation, mais permettent de consigner les bactries dans un espace. La

fermentation se produit l'intrieur des capsules sphriques et non pas dans le milieu liquide

de culture extrieure. Ceci permet daugmenter la densit de bactries et par voie de

consquence daccrotre les performances du fermenteur (Cassidy et al. 1996).

Lencapsulation de cellules vivantes peut galement avoir pour but de les librer de manire

contrle dans un endroit cibl comme cest le cas des bactries probiotiques encapsules par

exemple.

4.1.2. Protger

De nombreux composs organiques sont fragiles et doivent par consquent tre protgs de

leur milieu environnant. Par exemple, les vitamines ou les acides gras polyinsaturs sont

facilement dnaturs par raction d'oxydation.

De nombreux additifs industriels sont employs dans l'industrie agroalimentaire dont le fer;

son incorporation favorise l'oxydation des acides gras ce qui n'est pas forcement souhaitable.

Technologiquement il est plus avantageux d'incorporer cet lment dans le support de

capsules charges en Fe, dans ce cas, ce sera le support des capsules qui subira l'oxydation et

non pas l'aliment. En somme, ce type de microencapsulation ferrique confre une plus grande

efficacit technologique et est par voie de consquence plus conomique en ce qui concerne le

cot li aux pertes engendres par un produit dfectueux.

Les cellules vivantes sont galement sensibles aux stress physiques et chimiques provoqus

par des modifications de leur environnement. Les bactries probiotiques, par exemple,

peuvent ne pas survivre au pH trs acide de lestomac. La microencapsulation des

probiotiques peut permettre ainsi de protger les cellules du transit stomacal permettant

datteindre leur cible intestinale (Ki-Yong et Tae-Ryeon 2000).


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4.1.3. Librer progressivement

Un compos actif confin indfiniment ne prsente en soi qu'un intrt trs limit.

Lencapsulation permet de librer le principe actif ou le mdicament un moment prcis et

selon une cintique bien dfinie.

Ce n'est toutefois pas toujours le compos encapsul lui-mme qui sera libr, mais un sous-

produit li la raction avec une autre molcule venant de l'extrieur (l'eau par exemple). Le

compos encapsul sera l'un des produits de la raction, ou le catalyseur (enzyme) de ladite

raction. Dans ce cas, il est plus juste de penser en termes de transfert du principe actif vers

l'intrieur de la capsule ou vice versa, plutt qu'en terme d'une libration simple de celui-ci.

En ce qui concerne la libration progressive des rhizobactries. Bashan et al. (2002) ont

valu la libration progressive de la souche A. brasilense depuis des billes dalginate en

milieu liquide. Aprs 1 jour dessai le nombre des bactries libres a t de 3,7x103 UFC/g

de billes, aprs de 6 jours 2,3x105 UFC/g et depuis 10 jours la concentration de A. brasilense

libre a t de 6,3x105 UFC/g.

4.1.4. Structurer et fonctionnaliser

L'encapsulation permet de crer de nouvelles fonctions et des structures innovantes. Par

exemple, la permabilit de la membrane de la capsule peut tre fonction du pH du milieu,

ainsi le principe encapsul sera alors libr en fonction de la permabilit de la membrane.

L'aspect de la microcapsule peut mme servir pour la diffrentier. Par exemple, sa forme peutservir d'indicateur pour renseigner le consommateur sur la nature du produit contenu dans la

capsule. On trouve souvent sur le commerce des enrobages spcifiques possdant par exemple

un "aspect mtallis" afin de diffrencier les aliments fonctionnels des poudres

mdicamenteuses et alimentaires.


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4.1.5 Pourquoi encapsuler des rhizobactries?

Selon Bashan et al. (1998; 2002), il existe de nombreux avantages lis lencapsulation de

rhizobactries, cela permet:

De rduire la possibilit de contamination des inoculant pendant le stockage, le transport et

lapplication.

De produire linoculant en grande quantit et le stocker durant une longue priode sous la

forme de capsules sches.

De produire des inoculants avec une forme adapte aux quipements de semoir existant.

De librer de manire contrle et progressive les cellules dans le sol. De plus, les capsulessont biodgradables et non toxiques.

Nanmoins, lencapsulation des rhizobactries peut prsenter un certain nombre

dinconvnients :

La diffusion des gaz et de leau sont rduites dans la capsule.

Le procd dencapsulation peut entraner des modifications mtaboliques des cellules,notamment dues au stress hydrique engendr par le schage (Cassidy et al. 1996).

Ainsi, il peut tre ncessaire de rpter lapplication des capsules dans le sol pour un effet

optimal.

Les chercheurs ont actuellement leur disposition un ventail de techniques et de matriaux

pour immobiliser des cellules qui se sont largement dveloppes durant ces trente dernires

annes. Lencapsulation constitue certainement lheure actuelle la voie la plus prometteuse

pour permettre l'inoculation et une protection efficace des rhizobactries dans les sols.

4.2 Les techniques dencapsulation

Lencapsulation est utilise dans un grand nombre dactivits industrielles (Jackson et Lee

1991). Le nombre de travaux de recherche en encapsulation sest densifi dans lindustrie

agricole, en partie pour ce qui est de la rduction de lemploi d'engrais chimique (Marshall


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1968; Cassidy et al. 1996). Diffrentes tudes ont port sur lencapsulation des rhizobactries

(Cassidy et al 1995; Mattila-Sandholm et al. 2002; Bashan et al. 2002), avec les objectifs

suivants: lobtention dune concentration cellulaire finale suprieure ou gale 106 bactries

viables/plante, maintien de la viabilit au cours du stockage pour au moins 6 mois dans desconditions ambiantes de temprature et dhumidit, libration progressive des cellules dans le

sol.

L'encapsulation est ralise gnralement en trois tapes :

- La premire tape consiste en l'incorporation du principe actif dans la matrice ou le cur de

la capsule peut tre liquide ou solide.

- La deuxime tape est une opration mcanique consistant soit raliser une dispersion

liquide/air ou liquide/liquide (cas d'une matrice liquide), soit pulvriser une solution sur les

particules solides sous agitation mcanique (cas d'une matrice solide).

- La dernire tape consiste en une stabilisation par un procd chimique de polymrisation,

ou par un procd physico-chimique (glification, coacervation), ou physique (vaporation,

solidification) ralise sur les gouttelettes ou sur lenrobage form durant ltape prcdente.

Les applications potentielles offertes par lencapsulation ont conduit linvention et au

dveloppement de nombreuses mthodes et techniques. Cette diversit de mthodes a fini par

susciter des classifications complexes souvent incompltes (Shahidi et Han 1993; Risch 1995;

Thies 1996). Il est souvent trs difficile de les diffrencier par catgories. Il existe ainsi une

grande confusion dans les termes. Une mme technologie porte des noms variables en

fonction du domaine, un mme terme pouvant parfois tre utilis pour des technologies

diffrentes. Il y a souvent aussi confusion entre encapsulation et enrobage.

4.2.1 Le dripping

Son principe drive de la production simple de gouttelettes issues d'une aiguille ou d'un

injecteur. L'intrt principal de cette mthode est de former des gouttelettes dont la dispersion

de taille est infrieure 10% de la taille moyenne.


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Les appareils de dripping disponibles actuellement sont les suivants:

a) Gnrateur simple de gouttelettes consistant faire passer le liquide travers une buse ou

une aiguille.b) Gnrateur de gouttelettes haut dbit par rupture de jet : le jet liquide refoul la sortie

de la buse est tranch par des fils fixs sur un disque tournant grande vitesse, ce

tranchage est l'origine de la formation des gouttelettes.

c) Gnrateur de gouttelettes disque tournant : un disque rotatif, sur lequel coule le liquide,

entrane la projection de gouttelettes la priphrie du disque.

a) Gnrateur simple b) Rupture de jet c) Disque tournant

Figure II.6 Schma des diffrentes mthodes par dripping

Lencapsulation par dripping s'effectue gnralement par interaction ionique (entre alginate et

calcium) ou action thermique (cires). Les deux principes peuvent galement tre combins,

comme dans le cas du Carraghnane/KCl.


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Scale-up


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4.3 Les matriaux dencapsulation

Les matriaux dencapsulation doivent tre non toxiques, non polluants, et de qualit stable

pendant une longue dure de conservation, c'est--dire prsenter une activit et une densit

suffisante de cellules afin de les librer de manire progressive et prolonge dans le sol.

Les polymres naturels et synthtiques ont t utiliss pour lencapsulation de bactries. Les

polysaccharides extraits des algues sont considrs comme naturels, comme l'alginate, le

carraghnane, l'agar-agar, et l'agarose. Certains polymres synthtiques sont galement

utiliss pour lencapsulation de cellules vivantes, ce sont les polyacrylamides, polystyrne et

polyurthane (Trevors et al. 1992). Ces polymres synthtiques offrent, en effet, une bonnersistance mcanique qui peut tre intressante pour une utilisation en fermenteur. Cependant,

les gels sont forms par polymrisation ou par formation de ponts covalents interchanes

(rticulation), qui doivent tres raliss en prsence des microorganismes et cela peut tre

relativement hostile pour les cellules et provoquer des pertes dactivit cellulaire importantes.

L'alginate est l'un des produits le plus couramment utiliss pour l'encapsulation de micro-

organismes. Les inoculums qui en rsultent sont utiliss des fins diverses: l'immobilisationdes organelles des cellules et des enzymes pour la fermentation et l'application d'agents de

lutte biologique (Bashan et Holguin 1994).

Plusieurs polymres sont utiliss en microbiologie industrielle et environnementale, le tableau

II.5 montre le potentiel technologique important de ces diffrents supports bactriens

(Marshall 1968; Cassidy et al. 1996). Ainsi que leurs caractristiques fondamentales, leurs

avantages et leurs limites sont prsents.


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Tableau II.5. Proprits des diffrents polymres employs pour l'immobilisation des

rhizobactries.

Matriel Avantages Inconvnients Utilisation Rfrence

Polyacrylamide Facilementdisponible

coteux,monomre trstoxique,dgradationlente

Inoculation deRhizobium

(Dommergues etal. 1979)

Agar et agarose Facilementdisponible

coteux etdgradationlente

Encapsulation d'A.brasilense et de

P. fluorescens

Bashan et al1982(information non

publie)Xanthane-Gomme caroube

Fournis uneprotection pour lesbactries

Coteux Inoculation deRhizobium

(Jung et al. 1982)

Alginate Protection desrhizobactries etlibration dans lesol de manire

progressive

Rduction de ladiffusion deloxygne

InoculationdA. brasilense

(Bashan et al.2002)

4.3.1. Caractristique de lalginate de sodium

Lalginate de sodium est produit par les algues brunes (Figure II. 6), comme Macrocystis

pyrifera, Laminaria digitata, Laminaria hyperborea etEklonia cava. La production dalginate

n'est pas une exclusivit des algues, en effet, chez les bactries il existe aussi d'une production

dalginate extracellulaire. Un exemple est celui d' Azotobacter vinelandii et de plusieurs

souches de Pseudomonas (Fett et al. 1986; Fett et Wijey 1995). Les principaux pays

producteurs d'alginate au monde sont: la Norvge, la France, les tats-Unis, le Prou et le

Chili.


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La figure II.7. Algues brunes, source principale dalginate, attaches aux roches, images

des ctes de lIle de Chilo, Chili.

Les alginates sont des macromolcules linaires constitues de deux monomres lis en alpha

1-4: lacide -D-mannuronique et lacide -L-guluronique dont la masse molculaire est

comprise entre 20.000 et 200.000 Da. Lalginate glifie en prsence de certains cations

divalents et principalement le Ca2+ par simple formation de liaison ionique entre les

polymres. Les proprits de lalginate sont variables selon lorigine des algues et le procd

de fabrication. Selon leur masse molculaire, les alginates ont des proprits de solubilit et

de complexation avec le calcium.

Chaque molcule contient des rgions mannuroniques et des rgions guluroniques, et aussi

des rgions o les deux types de rsidus salternent. Le polyuronide constitu par

lenchanement des deux acides sappelle lacide alginique. Ces deux monomres ne sont pas

rpartis au hasard dans les macromolcules, mais rpartis en segments dune vingtaine

dunits. Lassemblage de ces segments en proportions variables dpend de lespce, de la

partie de lalgue considre, de lge de lalgue, du lieu de rcolte. La rpartition des

monomres dtermine les proprits glifiantes de lalginate. Nanmoins par slection de la

matire premire, il est possible de fabriquer une varit d'alginate aux caractristiques

constantes.


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La concentration d'alginate de sodium couramment employe pour l'encapsulation varie entre

1 et 3%. La solution d'alginate est mlange la culture cellulaire et est extrude dans une

solution de CaCl2 dont la concentration varie ente 0,05 et 0,1M.. Le temps de sjour des billes

dans cette solution pour obtenir la glification complte est de 30 minutes .

Plusieurs prparations base d'alginates ont t utilises pour l'encapsulation de mycorhizes

arbusculaires, dectomycorhiziens et pour l'inoculation de bactries du genreFrankia (Bashan

et al. 2002). Cette technologie a galement t utilise pour encapsuler les rhizobactries A.

brasilense (Bashan 1986; Bashan et Holguin 1994; Bashan et Gonzalez 1999) et P.

fluorescens (Paul et al. 1993).

4.3.2 Survie des rhizobactries encapsule dans des matrices dalginate

La matrice d'alginate protge les cellules du stress mcanique et limite leur mortalit pendant

le temps de stockage prolong (Morgan et al. 2006). Aprs un an de stockage temprature

ambiante, le taux de survie dAzospirillum lipoferum encapsule dans des billes d'alginate

sches est de 1010 CFU/g, la concentration dans ce cas est plus forte que dans les vecteurs

classiques (Fages 1992).

Aprs 3 ans de stockage 4C, le taux de survie de Bacillus subtilis et de Pseudomonas

corrugata immobiliss dans des billes d'alginate de sodium est de 108 UFC g-1. Aprs ces trois

annes de stockage, les bactries n'ont pas perdu leur aptitude de stimulation la croissance des

vgtaux tests. Ainsi, pendant le stockage les micro-organismes ont conserv leurs proprits

physiologiques, celles-ci taient comparables celles du bouillon de culture de la formulation

initiale (Trivedi et Pandey 2008). La survie de la souche A. brasilense Cd et P. fluorescens313 encapsules en billes dalginate aprs 14 annes de stockage a t de 105-106 UFC/g des

billes. Aprs cette priode longue de stockage, les rhizobactries n'ont pas perdu leur aptitude

de stimulation de croissance des plantes de bls. Cette tude a prouv que les bactries

peuvent survivre dans l'inoculant d'alginate au-dessus de longues priodes (Bashan et

Gonzalez 1999).


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Du point de vue agricole et industriel, il est trs intressant de pouvoir utiliser des

formulations dshydrates. Cependant, la dshydratation des capsules engendre un stress

hydrique important sur les cellules ce qui entraine la mortalit dune grande proportion de la

population bactrienne (Paul et al. 1993). Nanmoins lorsqu'elles sont correctementdshydrates le nombre de cellules survivantes peut tre suffisant pour effectuer une

inoculation correcte.

De plus, dans des conditions de stress quelques espces bactriennes sont en mesure de

produire et de stocker des substances osmoprotectrices. Par exemple, Azospirillum et

Rhizobium produisent de la proline et du glutamate pour faire face une dshydratation

(Botsford et Thomas 1990; Bashan et al. 2004). La proline et le glutamate sont des molcules

de grande importance pour la survie des cellules vis--vis du stress hydrique (Morgan et al.

2006).

Il est galement possible daugmenter la protection des bactries vis--vis de la

dshydratation par lutilisation de matriaux supplmentaires dans la formulation.

4.3.3 Ladjonction de lamidon la matrice dencapsulation

Les amidons sont souvent employs par lindustrie agroalimentaire de faon varie, car ils

fournissent une large gamme de fonctionnalit. La fonction recherche par cette industrie est

principalement la formation de gel et sa proprit collante. Dans les formulations

pharmaceutiques, lamidon est utilis comme additif et adhsif.

Lamidon est un hydrate de carbone qui constitue le principal moyen de stockage d'nergie

des vgtaux. Ce glucide est stock sous forme insoluble et morphologiquement granulaire

avec une structure semi-cristalline. Lamidon possde deux polymres de glucose : l'amylose

et l'amylopectine. Ces polymres constituent 98% de la masse totale sche des granules natifs,

le reste correspondant la masse des lipides, des minraux et des phosphates.


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Figure II.8. Les granules damidon de crales et des tubercules (Boursier, 2005).

Les granules damidons possdent une taille comprise entre 1 et 100 m, ils sont de forme

polygonale, sphrique ou lenticulaire et sont composs damylose, et damylopectine avec des

degrs de cristallisation variant dune espce botanique lautre (Wang et al. 1999) (Figure II.

8).

Certaines bactries ont laptitude d'adhrer la surface de granules damidon et il a t

suggr que l'adhsion des cellules sur les grains damidon tait lie son utilisation comme

substrat (Jankowski et al. 1997).

Figure II. 9. Adhsion des bifidobactries sur la surface des granules damidon (Mattila-

Sandholm et al. 2002).


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Au cours des dix dernires annes, un grand nombre de travaux de recherche ont vis limiter

la mortalit des cellules encapsules. Lamidon a t utilis dans ce but pour lapplication de

bactries probiotiques dans les produits laitiers ferments. L'adjonction de lamidon diminue

la mortalit prmature des cellules. Le phnomne mcanique d'adhsion des bactries surles granules d'amidon a t mis en vidence pour le genre Bifidobacterium. On a galement

observ que ces cellules qui adhraient aux granuls d'amidon taient mieux protges lors du

stockage ainsi que pendant le transit intest

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