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Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Sub stanzen

Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid für eine qua ntitative

Bestimmung lebender Campylobacter-Zellen aus

Lebensmittelproben und Wasser mittels real-time PCR

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Diana Seinige

Hannover

Hannover 2014

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit

Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein

Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit

1. Gutachter/ in: Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD


Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein


2. Gutachter: Prof. Dr. Waldemar Ternes

Institut für Lebensmitteltoxikologie und

Chemische Analytik

Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2014

Teile dieser Arbeit wurden durch Mittel des Sanitätsamt der Bundeswehr (Grant M /

SAB X / 9A006) gefördert. Die Standardisierung der Methode wurde durch das

Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (BMWi) (Fkz-01FS10019)

finanziell gefördert.

I

Publikationsverzeichnis

Die vorliegende Dissertation basiert in überwiegenden Teilen auf den folgenden Publikationen: Publikation 1:

SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014): Comparative Analysis and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatment for the Differentiation of Viable and Nonviable Campylobacter Cells. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2186-92. doi: 10.1128/AEM.03962-13.

Publikation 2:

SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014): Influencing Factors and Applicability of the Viability EMA-qPCR for a Detection and Quantification of Campylobacter Cells from Water Samples. PLoS One. 9 (11):e113812. doi: 10.1371/journal.pone.0113812.

Weitere Aspekte der Dissertation wurden in Form von Artikeln, Vorträgen oder Postern präsentiert: Zeitschriftenartikel:

SEINIGE, D., C. KEHRENBERG, C., KRISCHEK, A. BINDER u. G. KLEIN (2012): „Nachweis und Unterscheidung von lebenden und toten Bakterien mit der PCR am Beispiel von Campylobacter spp.“ Wehrmedizinische Monatsschrift 56. Jahrgang. Heft 8-9. August-September 2012, 198-200

Vorträge:

SEINIGE, D., G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2010): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. 1. Zwischenbericht, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 02.12.2010

II

SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Untersuchungen zur Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Campylobacter spp. mittels real-time PCR“. 52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 27.09.-30.09.2011, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.45 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. 2. Zwischenbericht, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 16.11.2011

SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. Vortrag im Rahmen des Kolloquium für Tiergesundheit und Lebensmittelqualität an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, 02.12.2011 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2012): „Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“. Vortrag im Rahmen des Workshop I „Workshop Normung von PCR-Verfahren 2012“ des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 14.02.2012

SEINIGE, D., G. KLEIN, M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE u. C. KEHRENBERG (2013): Nachweis von Campylobacter spp. aus Wasserproben. Eignet sich die EMA-real-time PCR? Vortrag im Rahmen des Workshop II „Neue Entwicklungen zu Nachweismethoden und zur Epidemiologie von Campylobacter spp.“ des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 12.03.2013

SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2013): Untersuchungen zur Membranintegrität und zum quantitativen Nachweis von Campylobacter aus Wasserproben mittels qPCR unter Anwendung interkalierender Substanzen. 54. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 24.09.-27.09.2013, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S. 62

III

Poster: KEHRENBERG, C., A. ABDULMAWJOOD, G. KLEIN u. D. SEINIGE (2011): „Quantifizierung lebender Campylobacter spp. aus Wasserproben: Eine

Evaluierungsstudie mittels EMA-real-time PCR“. 52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 27.09.-30.09.2011, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.170 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011): „Eignung der Real-time PCR unter Zusatz von interkalierenden Substanzen zur Quantifizierung und Lebend/Tot-Unterscheidung von Campylobacter spp.“. Tagung der DVG-Fachgruppe „Bakteriologie und Mykologie“, Leipzig, 27.06.-29.06.2012, Tagungsband S.217 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2012): „Eignung der EMA real-time PCR Methode zur Detektion lebender Campylobacter auf Geflügelfleisch“. 53. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 25.09.-28.09.2012, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.184 SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2013): Applicability of a qPCR method combined with an intercalating dye for detection and differentiation of viable Campylobacter cells from water samples. FEMS 2013 5th Congress of European Microbiologists, Leipzig, Germany, 21.07.-25.07.2013 Congress Book S. 229 (Nr. 559) SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2014): Bestimmung der Signalreduktion toter Campylobacter-Zellen mittels qPCR unter Anwendung der Differenzierungsmittel EMA und PMA. 55. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 23.09.-26.09.2014, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.188 SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014): A Comparative Study of the Applicability and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatments for a Selective Detection of Viable Campylobacter Cells by qPCR. 3rd EAVLD Congress der European Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 12 to 15 October, 2014, Pisa, Italy. Abstract Book S. 215 (Nr. 121)

V

Inhaltsverzeichnis

Publikationsverzeichnis ............................................................................................... I

Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... V

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................... X

Tabellenverzeichnis .................................................................................................. XII

Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. XII

1. Einleitung ......................................................................................................... 1

2. Literaturübersicht ............................................................................................. 3

2.1. Bakterien des Genus Campylobacter .............................................................. 3

2.1.1. Historie .................................................................................................. 3

2.1.2. Taxonomie und Merkmale ..................................................................... 4

2.1.3. Zoonoseerreger Campylobacter: Infektion und Erkrankungen .............. 5

2.1.4. Vorkommen von Campylobacter spp. in Geflügelfleisch ....................... 6

2.1.5. Wasser-assoziierte Campylobacter Ausbrüche ..................................... 7

2.1.6. Vorkommen von Campylobacter spp. in Wasser .................................. 8

2.1.7. Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung von Campylobacter

spp. ........................................................................................................ 9

2.2. Kriterien zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien .................... 11

2.2.1. Kultivierbarkeit von Bakterien .............................................................. 11

2.2.2. Nachweis von mRNA und rRNA .......................................................... 14

2.2.3. Bestimmung der Membranintegrität von Bakterien .............................. 15

2.2.4. Bestimmung der metabolischen Aktivität der Zelle .............................. 17

2.3. Rechtliche Regelungen zum Nachweis von darmpathogenen Campylobacter

spp. ................................................................................................................ 19

2.3.1. Problematik beim Nachweis von Campylobacter in Lebensmitteln unter

Verwendung der amtlichen Verfahren ................................................. 21

2.4. Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR und real-time PCR .............. 23

2.4.1. PCR Nachweise für Campylobacter spp. ............................................ 23

2.4.2. Real-time PCR Nachweise für Campylobacter spp. ............................ 25

VI

2.4.3. Anwendung der real-time PCR zum Nachweis von Campylobacter spp.

in Geflügelfleischproben und Wasserproben ....................................... 26

2.4.4. Einsatz von interkalierenden Substanzen für real-time PCR

Anwendungen ..................................................................................... 27

2.4.5. Nachteile bei der Anwendung interkalierender Substanzen ................ 29

2.5. Zielstellung der Studie.................................................................................... 31

3. Material und Methoden .................................................................................. 33

3.1. Bakterien Stämme und Spezies-Bestimmung ................................................ 33

3.2. Inaktivierung von Campylobacter spp. und Keimzahlbestimmung mittels

kultureller Keimzählung .................................................................................. 34

3.3. EMA- und PMA- Behandlung der Bakterienproben ........................................ 35

3.4. DNA Isolierung und qPCR Experimente ........................................................ 35

3.5. Ermittlung der Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung von

hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen ........................................................ 36

3.6. Testung der EMA-qPCR Methode zum Nachweis lebender Campylobacter-

Zellen auf Geflügelfleischproben .................................................................... 37

3.7. Isolierung von Campylobacter-Zellen aus Wasserproben .............................. 37

3.8. Testung von Oberflächenwasser-, Leitungswasser-, Mineralwasser- und

Regenwasserproben ...................................................................................... 38

3.9. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ................................................ 39

3.10. Statistische Auswertungen ............................................................................. 39

4. Zusammenfassung der Ergebnisse ............................................................... 41

4.1. Kapitel I – Resultate der Methodenentwicklung ............................................. 41

4.1.1. Untersuchungen zur Quantifizierung von Campylobacter spp. mittels

einer qPCR-Methode ........................................................................... 41

4.1.2. Bestimmung des Einflusses von EMA und PMA auf die Ergebnisse der

qPCR ................................................................................................... 42

4.1.3. Nachweis lebender Campylobacter-Zellen in Gemischen aus lebenden

und hitzeinaktivierten Zellen ................................................................ 44

4.1.4. Limitierungen von EMA und PMA bei Verwendung von hitzeinaktivierten

Campylobacter-Zellen in der qPCR ..................................................... 46

VII

4.1.5. Erstellung von Standardkurven mit Zugabe von EMA und PMA ......... 46

4.1.6. Methodenvergleichsuntersuchung zwischen den Ergebnissen aus der

EMA-qPCR und der mikrobiologischen Referenzmethode .................. 48

4.2. Kapitel II – Resultate der Anwendung der Methode an Lebensmitteln ........... 49

4.2.1. Anwendung der EMA-qPCR zum Nachweis lebender Campylobacter-

Zellen auf gespikten Hühnerfleischproben .......................................... 49

4.2.2. Vergleichende Untersuchung der Membranfiltrations- und

Zentrifugations-methode zur Isolierung von Campylobacter-Zellen aus

Wasser ................................................................................................ 51

4.2.3. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der prozentualen Anteile

lebender und toter Campylobacter-Zellen bei Verwendung der

Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode ................................ 51

4.2.4. Ergebnisse der qPCR mit und ohne EMA bei Verwendung der

Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode ................................ 52

4.2.5. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der prozentualen Anteile von

lebenden und toten Bakterienzellen in Leitungswasser- und

Oberflächenwasserproben .................................................................. 54

4.2.6. Ergebnisse der qPCR und EMA-qPCR zum Nachweis von

Campylobacter-Zellen aus unterschiedlichen Wasserproben .............. 55

4.2.7. Nachweis von lebenden Campylobacter-Zellen in unterschiedlichen

Gemischen aus lebenden und toten Zellen bei Verwendung von

Leitungswasserproben ........................................................................ 57

5. Publikationen ................................................................................................. 59

5.1. Comparative Analysis and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium

Monoazide Treatment for the Differentiation of Viable and Nonviable

Campylobacter Cells ...................................................................................... 59

5.2. Influencing Factors and Applicability of the Viability EMA-qPCR for a Detection

and Quantification of Campylobacter Cells from Water Samples ................... 61

6. Diskussion ...................................................................................................... 63

6.1. I. Abschnitt - Methodenentwicklung ............................................................... 64

VIII

6.1.1. Einfluss von EMA und PMA auf die Resultate der real-time PCR bei

Verwendung von lebenden Zellen ....................................................... 64

6.1.2. Erklärungsmodelle für Ct-Wert-Verschiebungen in qPCR-Experimenten

nach Einsatz von Differenzierungsmitteln ............................................ 66

6.1.3. Standardkurven zur Bestimmung der Keimkonzentration von

Campylobacter spp. ............................................................................. 68

6.1.4. Effektivität von EMA und PMA zur Differenzierung von lebenden und

toten Zellen .......................................................................................... 69

6.1.5. Limitierungen bei Verwendung von Differenzierungsmitteln zur

Detektion lebender Campylobacter spp. mittels qPCR ........................ 70

6.1.6. Ansätze zur Verbesserung der qPCR-Resultate unter Verwendung von

Differenzierungsmitteln ........................................................................ 72

6.1.6.1. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuchsansätzen, bei denen

eine Vorbehandlung mit EMA durchgeführt wurde .......................... 72

6.1.6.2. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuchsansätzen, bei denen

eine Vorbehandlung mit PMA durchgeführt wurde .......................... 74

6.1.7. Zusammenhang zwischen dem Inaktivierungsverfahren der Bakterien

und den Ergebnissen der qPCR .......................................................... 75

6.2. II. Abschnitt - Testung der etablierten EMA-qPCR an Lebensmittelproben ... 78

6.2.1. Geflügel ............................................................................................... 78

6.2.1.1. Möglichkeit der Anwendung der EMA-qPCR Methode bei natürlich

kontaminiertem Geflügelfleisch ....................................................... 78

6.2.1.2. Einfluss der Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch auf die Resultate der

qPCR ............................................................................................... 80

6.2.1.3. Status der Zellintegrität von Campylobacter spp. auf Geflügelfleisch .

................................................................................................... 80

6.2.2. Wasser ................................................................................................ 83

6.2.2.1. Detektion von lebenden Campylobacter-Zellen aus Wasserproben

mittels qPCR-Verfahren .................................................................. 83

6.2.2.2. Einfluss der Isolierungsmethode auf Campylobacter-Zellen aus

Wasserproben sowie auf die Ergebnisse der qPCR ....................... 84

IX

6.2.2.3. Einfluss der verwendeten Wasserart für einen Nachweis lebender

Campylobacter-Zellen aus Wasserproben ...................................... 87

6.2.2.4. Limitierungen bei Verwendung von Oberflächenwasser ................. 87

6.2.2.5. Testung von Leitungswasser, Mineralwasser und Regenwasser .... 90

6.3. Schlussfolgerung ........................................................................................... 92

7. Zusammenfassung......................................................................................... 93

8. Summary ........................................................................................................ 97

9. Literaturverzeichnis ...................................................................................... 101

Danksagung ........................................................................................................... 129

X

Abkürzungsverzeichnis

ANOVA Varianzanalyse (engl.: analysis of variance)

BfR Bundesinstitut für Risikobewertung

bp Basenpaare (engl.: base pairs)

C. Campylobacter

CCDA Kohle Cefoperazon Desoxycholat Agar (engl.: Charcoal cefoperazone desoxycholate agar)

Ct Schwellenwert-Zyklus (engl.: threshold cycle)

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: desoxyribonucleic acid)

DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen

EFSA Europäische Behörde für Lebenmsittelsicherheit (engl.: European food safety authority

EMA Ethidiummonoazid

g Erdbeschleunigung

KbE Kolonie-bildende Einheiten

l Liter

log10 Dekadischer Logarithmus

LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature

ml Milliliter

MLST Multilocus sequence typing

mRNA messenger RNA

µg Mikrogramm

µm Mikrometer

XI

µmol Mikromol

NaCl Natriumchlorid

NTU Nephelometrischer Trübungswert (engl.: nephelometric turbidity unit)

p Signifikanz

PCR Polymerase Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction)

PMA Propidiummonoazid

qPCR Quantitative real-time PCR

RFLP Restriction fragment length polymorphism

RKI Robert-Koch-Institut

RNA Ribonukleinsäure (engl.: ribonucleic acid)

rpm Umdrehungen pro Minute (engl.: revolutions per minute)

rRNA Ribosomale RNA

SD Standardabweichung (engl.: standard deviation)

spp. Spezies

UV Ultraviolett

VBNC Lebend, aber nicht kultivierbar (engl.: viable but non culturable)

W Watt

XII

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Verfahren zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien ........... 18

Tabelle 2: Zielgene zum Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR ............... 25

Tabelle 3: Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung der Differenzierungsmittel

EMA und PMA oder dem Lösungsmittel DMSO (2%) .............................. 44

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Standardkurve, erstellt aus seriellen Verdünnungsreihen von C. jejuni

DSM 4688 in drei unabhängigen Wiederholungen .............................. 42

Einleitung 1

1. Einleitung

Bakterien der Gattung Campylobacter (C.) sind in Europa die häufigsten bakteriellen

Lebensmittelinfektionserreger und Verursacher der Campylobacteriose beim

Menschen (EFSA 2013). Seit mehreren Jahren stehen sie an Platz eins der nach § 7

des Infektionsschutzgesetzes dem Robert-Koch-Institut gemeldeten bakteriellen

Durchfallerreger noch vor den Salmonellen-Erkrankungen. Allein im Jahr 2012

wurden 62.880 Erkrankungsfälle in Deutschland gemeldet (RKI 2013), die Zahl an

nicht gemeldeten Krankheitsfällen ist vermutlich jedoch noch deutlich höher (EFSA

2011). Die Übertragung des Zoonoseerregers auf den Menschen erfolgt primär durch

den Verzehr von schlecht gegartem, kontaminiertem Geflügelfleisch und

Kreuzkontaminationen während der Lebensmittelzubereitung. Neben Geflügelfleisch

und Geflügelfleischprodukten zählen auch Oberflächengewässer und verunreinigtes

Trinkwasser zu den Infektionsquellen (KOENRAAD et al. 1997, SCHÖNBERG-

NORIO et al. 2004). Handlungsoptionen zur Reduktion von Campylobacter spp. in

der Lebensmittelkette werden in den letzten Jahren europaweit diskutiert (EFSA

2011). Bislang sind jedoch geeignete Minimierungsstrategien sowie Grenzwerte zum

Keimgehalt in Lebensmitteln noch nicht in die Gesetzgebung integriert (EFSA 2011,

VO EG 2073/2005). Zur Implementierung effektiver Kontrollsysteme und für eine

quantitative Risikoanalyse ist es notwendig, geeignete sensitive Detektionsmethoden

zur Verfügung zu haben. Diese sollten als Schnellmethode einen quantitativen

Erregernachweis ermöglichen und vor allem auch zeitnahe Ergebnisse erzielen, um

einen direkten Eingriff in die Lebensmittelsicherheit gewährleisten zu können

(BOTTELDOORN et al. 2008).

Ein solcher quantitativer Erregernachweis von Campylobacter spp. wäre hierbei ein

wichtiger Schritt zur Prüfung des von einer bakteriellen Kontamination ausgehenden

Gesundheitsrisikos von Lebensmitteln. Mit herkömmlichen mikrobiologischen

Methoden ist der Erregernachweis jedoch zeitaufwändig und aufgrund der oft nicht

einheitlichen Koloniemorphologie sowie des physiologisch anspruchsvollen

2 Einleitung

Wachstums des Genus Campylobacter zudem stark erschwert (HELLEIN et al.

2012).

Molekularbiologische Nachweismethoden wie die real-time PCR bieten neben hoher

Sensitivität und Spezifität den Vorteil schneller Resultate (BEST et al. 2003). In

Kombination mit dem Einsatz eines Differenzierungsmittels ist es mit dieser Methode

zudem möglich, lebende und somit infektiöse Zellstadien von toten Zellen zu

unterscheiden (RUDI et al. 2005). Für viele Bakterienspezies - wie Legionella spp.,

Helicobacter pylori und Pseudomonas aeruginosa - wurde die Methode bereits

erfolgreich getestet (CHANG et al. 2010, AGUSTÍ et al. 2010, HELLEIN et al. 2012).

Der Einsatz der Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Campylobacter

wurde in ersten Studien durchgeführt, die Ergebnisse wurden jedoch sehr kontrovers

diskutiert (FLEKNA et al. 2007, RUDI et al. 2005). Ziel der eigenen Arbeit war es

daher, basierend auf diesen Vorstudien eine geeignete quantitative

Bestimmungsmethode für die Bakterienspezies C. jejuni und C. coli zu entwickeln,

die es ermöglicht, den Keimgehalt lebender Campylobacter-Zellen von den

Lebensmittelmatrices Geflügelfleisch und Wasser nachzuweisen. Die Entwicklung

einer quantitativen Schnellmethode zum Erregernachweis und zur Quantifizierung

stellt daher einen wichtigen Beitrag dar, um zu einer Reduktion von thermotoleranten

Campylobacter spp. in der Lebensmittelkette zu kommen. Dieses ist ein wichtiger

Schritt für die Lebensmittelsicherheit und den gesundheitlichen Verbraucherschutz.

Literaturübersicht 3

2. Literaturübersicht

2.1. Bakterien des Genus Campylobacter

2.1.1. Historie

Erstmalig isolierte der Kinderarzt Theodor Escherich im Jahre 1886 bislang

unbekannte spiralig gewundene Stäbchenbakterien aus dem Darminhalt von an

Diarrhoe erkrankten Kindern im Säuglingsalter. Zwei Jahre später gelang ihm dies

auch bei erkrankten Katzenwelpen (ESCHERICH 1886). Er benannte diese

Bakterien zunächst aufgrund ihrer gewundenen Form und Beweglichkeit als

„Vibrionen“ und bezeichnete sie mit dem Namen Vibrio felinus. Nachfolgend wurden

auch von MC FADYEAN und STOCKMAN (1913) aus Abortmaterial von Schafen

und von SMITH und TAYLOR (1919) aus abortierten Rinderfeten und Plazentateilen

spiralförmige Bakterien isoliert, die den Namen Vibrio fetus erhielten. JONES et al.

(1931) fanden Vibrionen bei an Winterdysenterie erkrankten Kälbern und DOYLE

(1948) im Colon von erkrankten Schweinen. Sie bezeichneten die Bakterien nach

ihrem Fundort entsprechend als Vibrio jejuni bzw. Vibrio coli. Beim Menschen gelang

die Isolierung von Vibrionen-ähnlichen Bakterien erstmals durch KING im Jahre 1957

aus Blutkulturen von an hämorrhagischer Enteritis erkrankten Patienten. Dieser

Vibrio fetus-ähnliche Stamm hatte jedoch ein Wachstumsoptimum bei 42 °C (anstatt

25 °C) und wurde somit als „Vibrio-like“ bezeichnet. SEBALD und VERON (1963)

stellten fest, dass sich der Guanin- und Cytosingehalt der DNA dieses Stammes von

der Gattung Vibrio unterschied und benannten diese dann mit dem neuen

Gattungsnamen „Campylobacter“, abgeleitet aus dem griechischen Wort für

„gebogener Stab“. Jedoch erst Anfang der 70er Jahre mit der Entwicklung von

antibiotikahaltigen Selektivmedien (DEKEYSER et al. 1972, SKIRROW 1977)

wurden Bakterien des Genus Campylobacter als Enteritiserreger beim Menschen

4 Literaturübersicht

anerkannt und eine Routinediagnostik der Campylobacteriose ermöglicht (KIST

2002, BUTZLER 2004).

2.1.2. Taxonomie und Merkmale

Bakterien der Gattung Campylobacter sind spiralig bis korkenzieherförmige,

gramnegative, sporenlose Bakterien aus der Klasse der Epsilonproteobacteria

welche zur Ordnung der Campylobacterales in der Familie der Campylobacteraceae

gehören. Die Gattung Campylobacter beinhaltet derzeit 32 Spezies und 13

Subspezies (LPSN), wobei die drei humanpathogenen Spezies C. jejuni, C. coli und

C. lari die größte humanmedizinische Bedeutung haben (MAN 2011, RKI 2013).

Campylobacter spp. besitzen eine Länge von 0,5 - 8,0 µm und weisen einen

Durchmesser von 0,2 - 0,5 µm auf (VANDAMME et al. 2000). Ihre Beweglichkeit

wird mit Hilfe der monotrichen, bi- oder unipolaren Begeißelung ermöglicht (URSING

et al. 1994). Campylobacter haben komplexe nutritive Ansprüche. Sie sind

chemoorganotroph und können somit keinen Sauerstoff verstoffwechseln, sondern

benötigen Nitrat als Oxidans für ihren Energiestoffwechsel (VANDAMME et al. 1991).

Optimale Anzuchtbedingungen herrschen daher bei einer mikroaeroben Atmosphäre

von 5 % O2, 10 % CO2 und 85 % N2 (CORRY et al. 1995, GHARST et al. 2013).

Aufgrund der geringen Sauerstoff- und Sauerstoffradikal-Toleranz werden zur

Anzucht von Campylobacter spp. Medien verwendet, die Schutzstoffe gegen

Sauerstoffradikale beinhalten, wie zum Beispiel Blut, Eisen oder Pyruvat (SILVA et

al. 2011). Sie wachsen auf Blut- oder Selektivnährböden, wie z.B. Karmali-Agar oder

modifiziertem Charcoal Cefoperazon Desoxycholat Agar (mCCD-Agar) bei

Temperaturen von 35,5 °C - 45,0 °C (SIMBERT 1978, SKIRROW und BENJAMIN

1980, SKIRROW 1994). Das physiologische Habitat der Campylobacter- Spezies

C. jejuni, C. coli, C. lari und C. upsaliensis ist der Darmtrakt von warmblütigen Tieren,

insbesondere Vögeln (KETLEY 1997, ABULREESH et al. 2006). Angepasst an die

Körpertemperatur dieser Spezies wachsen die thermotoleranten Arten bei einem

Temperaturoptimum von 41,5 °C (VANDAMME et al. 2000, ALLOS 2001). Außerhalb

des intestinalen Traktes ist die Tenazität jedoch limitiert, so dass eine Vermehrung


der Bakterien auf Lebensmitteln nicht möglich ist (RKI 2011). Das Überleben von

Bakterien des Genus Campylobacter bei Kühltemperaturen ist jedoch gut, und ihre

Stoffwechselaktivität bleibt bei Temperaturen um 4 °C erhalten (MAZIERO und

OLIVEIRA 2010). Obwohl keine Kälteschockproteine synthetisiert werden, können

Campylobacter spp. zum Teil auch Tiefkühltemperaturen überleben (SAMPERS et

al. 2009).

2.1.3. Zoonoseerreger Campylobacter: Infektion und Erkrankungen

Beim Geflügel zählen Campylobacter spp. zu den Kommensalen des

Intestinaltraktes und persistieren dort überwiegend symptomlos (BERRY et al. 1988,

WILLIAMS et al. 2013). Sie besiedeln vor allem den Blinddarm der Tiere und werden

von dort aus durch Kontaminationen während des Schlachtprozesses auf die

Tierkörperoberfläche verbracht (ELLERBROEK et al. 2010). Die Übertragung des

Erregers auf den Menschen erfolgt primär durch den Verzehr von schlecht gegartem,

kontaminiertem Geflügelfleisch als auch durch Kreuzkontaminationen bei der

Lebensmittelzubereitung sowie über direkten und indirekten Kontakt mit infiziertem

Geflügel (EFSA 2010). Weitere Infektionsquellen sind Rohmilch, kontaminiertes,

nicht aufbereitetes Trinkwasser sowie rohes Hackfleisch. Auch kolonisierte

Heimtiere, insbesondere durchfallerkrankte Katzen und Hundewelpen, können den

Erreger übertragen (EFSA 2005, RKI 2013). Zudem sind Infektionen durch

kontaminierte Oberflächengewässer und Trinkwasser möglich (BLACKBURN et al.

2004, SMITH et al. 2006, PITKÄNEN 2013). Hauptsächliche Verursacher der

Campylobacteriose sind die Spezies C. jejuni und C. coli und bei einigen wenigen

Fällen wurde C. lari identifiziert (RKI 2013). Überwiegende Symptome dieser

Zoonose sind gastrointestinale Beschwerden mit wässrig-blutigen Durchfällen, die in

der Regel nach einigen Tagen selbstlimitierend sind. Antibiotikatherapien sind nur in

Ausnahmefällen bei schweren Erkrankungen, Bakteriämien oder bei

immunsupprimierten Patienten angezeigt (RKI 2011). In seltenen Fällen können

neben Enteritiden jedoch schwerwiegendere Langzeitfolgen wie das Guillain-Barré-

Syndrom - eine polyneuropathische Erkrankung des Nervensystems - sowie die


reaktive Arthritis auftreten (NACHAMKIN et al. 1998). Die Inkubationszeit beträgt

zwischen 1 - 7 Tagen mit einer durchschnittlichen Krankheitsdauer von ca. einer

Woche. Eine Erregerausscheidung nach überstandener Erkrankung ist jedoch noch

lange möglich und kann bis zu 3 - 4 Wochen andauern (EFSA 2014). Die

Infektionsdosis von thermotoleranten Campylobacter wird als sehr gering

angenommen und wurde in einer Studie mit 500 Keimen angegeben (ROBINSON

1981, WALLIS 1994). In einer weiteren Studie an freiwilligen Testpersonen wurden

von BLACK et al. (1988) eine Dosis von 104 KbE/ml für eine Infektion ermittelt. Die

Infektionsdosis ist jedoch abhängig von der Virulenz des Stammes, der

Immunitätslage des Menschen sowie von auf die Bakterien einwirkenden

Umweltfaktoren (BfR 2007).

2.1.4. Vorkommen von Campylobacter spp. in Geflügelfleisch

Campylobacter spp. kommen bei vielen Haus- und Nutztieren vor, überwiegend

jedoch beim Geflügel (NACHAMKIN 2001, HUMPHREY et al. 2007, EFSA 2011).

Zwischen 20 % und 30 % der Campylobacteriosen werden durch den Konsum oder

die Verarbeitung von Hühnerfleisch und dadurch ausgelöste Kreuzkontaminationen

verursacht (EFSA 2011). Die Nachweisraten von Campylobacter auf Geflügelfleisch

im Einzelhandel sind in einer Studie von MADDEN et al. (1998) mit 38 % angegeben

worden. Dabei wurden 120 Verbraucherpackungen von Hühnerteilstücken

untersucht. ATANASSOVA und RING (1999) wiesen in einer Studie, bei der 509

Proben ausgewertet wurden, in 45,9 % der Broilerkarkassen Campylobacter spp.

nach. ALTER et al. (2004) konnten sogar bis zu 60 % Campylobacter spp. positive

Proben auf Geflügelfleischproben im Einzelhandel nachweisen. In einer Studie von

KLEIN et al. (2007), bei der 99 Hühnerkarkassen an einem Schlachthof in

Deutschland beprobt wurden, waren 51,5 % der Karkassen mit bis zu 6,5 log10 KbE

belastet. Die Mehrzahl der Keime befanden sich hierbei nach Studien von

CHANTARAPANONT et al. auf der Oberfläche des Geflügelschlachtkörpers

(CHANTARAPANONT et al. 2003, CHANTARAPANONT et al. 2004). So wurde auch

in einer vergleichenden Studie der Keimzahlbelastung der Oberfläche von


Hühnerfleisch im Vergleich zum Inneren der Produkte eine deutlich höhere Belastung

der Oberfläche ermittelt, wobei 2,4 log10 KbE/g nachgewiesen wurden.

Demgegenüber war die Keimbelastung im Inneren der Produkte vernachlässigbar

gering, mit Werten um die Nachweisgrenze (SCHERER et al. 2006). Vermutlich

spielt somit die Übertragung des Erregers auf den Menschen durch

Kreuzkontaminationen oder kontaminierte Oberflächen der Lebensmittel eine

größere Rolle als der Verzehr von ungenügend gegartem Geflügelfleisch (SCHERER

et al. 2006, BfR 2007).

2.1.5. Wasser-assoziierte Campylobacter Ausbrüche

Neben Geflügelfleisch zählt auch kontaminiertes Wasser zu den Ausbruchsquellen

humaner Campylobacteriosen (HÄNNINEN et al. 2003, GUBBELS et al. 2012). Die

Kontamination von Wasser kann dabei durch einen Eintrag von Fäzes von

Wassergeflügel, Wild- oder Nutztieren und über Kontaminationen von nicht

geklärtem Abwasser in Trink- und Oberflächenwasser erfolgen (KOENRAAD et al.

1994, MERRITT et al. 1999, ABULREESH et al. 2006, HELLEIN et al. 2011). Auch

starke Regenfälle und damit einhergehende Abschwemmungen von gedüngten

Agrarflächen stellen ein Kontaminationsrisiko dar (CLARK et al. 2003, MELBY et al.

1991, RICHARDSON et al. 2007). Im Jahr 1978 wurde erstmalig von einem wasser-

bedingten Campylobacter Ausbruch in Vermont, USA, berichtet (HALEY et al. 1980,

VOGT et al. 1982). In den darauffolgenden Jahren wurde eine Vielzahl an weiteren

Campylobacteriose-Fällen, ausgelöst durch kontaminiertes Trink- und

Oberflächengewässer, beschrieben (SACKS et al. 1986, HÄNNINEN et al. 2003,

PITKÄNEN 2013). Campylobacter jejuni war in diesen Fällen die am häufigsten

nachgewiesene Spezies (GALLAY et al. 2006, SAID et al. 2003, SCHUSTER et al.

2005). Die meisten dieser Ausbrüche wurden in nordeuropäischen Ländern gemeldet

(PITKÄNEN 2013). Aufgrund mangelnder oder ungeeigneter Detektionssysteme oder

fehlender Testungen kommen in vielen Ländern Campylobacter-Ausbrüche vor,

vermutlich jedoch häufiger als bislang beschrieben (PITKÄNEN 2013).


2.1.6. Vorkommen von Campylobacter spp. in Wasser

Neben Geflügelfleisch sind kontaminiertes Trinkwasser oder mit Spülwasser

verunreinigte Lebensmittel bedeutend bei der Erregerübertragung (THOMAS et al.

1998). Zudem stellen auch kontaminierte Oberflächengewässer und Badeseen eine

mögliche Infektionsquelle dar (KOENRAAD et al. 1997, SCHÖNBERG-NORIO et al.

2004). Viele Studien zur Keimbelastung von Wasser mit Campylobacter sind

qualitativer Natur, einige wenige haben jedoch auch quantitative Ergebnisse erzielt

(EDGE et al. 2013, HOKAJÄRVI et al. 2013, PITKÄNEN 2013). Im Allgemeinen war

bei diesen Studien eine geringe Keimkonzentration zu detektieren. So haben

HELLEIN et al. (2012) in einer Studie mittels quantitativer real-time PCR Keimzahlen

von 0,14 - 4,6 x 103 Zellen pro ml in Oberflächenwasser nachgewiesen. In anderen

Studien wurden Campylobacter Keimkonzentrationen von unterhalb der

Nachweisgrenze liegend bis zu 1,0 x 102 Zellen/ml Oberflächenwasser mit der

mikrobiologischen Keimzählung bestimmt (RECHENBURG und KISTEMANN 2009,

HOKAJÄRVI et al. 2013). In einer vergleichenden Studie von OBIRI-DANSO et al.

(2001) an verschiedenen Campylobacter Spezies wurde berichtet, dass C. lari in

Wasser länger überleben kann als C. jejuni oder C. coli. KORHONEN und

MARTIKAINEN (1991) bestätigten jedoch für C. jejuni eine längere Überlebensdauer

in der kultivierbaren Form in Teichwasser als für C. coli. Die Mechanismen zum

Überleben von Campylobacter spp. im Wassermilieu sind bislang wenig bekannt

(GONZÁLES und HÄNNINEN 2012). Einflussfaktoren der Überlebensrate in

Gewässern sind zum Beispiel die Temperatur, das Sonnenlicht, die Kompetition mit

anderen Mikroorganismen sowie der Gehalt an Nähr- und Sauerstoff (THOMAS et al.

1999). Bei niedrigen Temperaturen, wenig Sonneneinstrahlung und geringen

Mengen an kompetetiver Begleitflora wird ein Überleben von Bakterien des Genus

Campylobacter begünstigt (SVENSSON et al. 2008). In einer irischen und

schwedischen Studie wurde zudem berichtet, dass auch das Vorhandensein von

Biofilmen oder in Wasser lebenden Protozoen-Arten, wie Arcanthamoeba polyphaga,

in denen die Bakterien intrazellulär überleben, das Fortbestehen in der Umwelt

sichern können (SNELLING et al. 2005, AXELSSON-OLSSON et al. 2005).


2.1.7. Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisie rung von

Campylobacter spp.

Der Nachweis und die Differenzierung von Bakterien innerhalb des Genus

Campylobacter sind häufig mit Schwierigkeiten verbunden. Aufgrund des langsamen,

kulturell anspruchsvollen Wachstums und der oft nicht einheitlichen

Koloniemorphologie des Erregers ist der kulturelle Nachweis alleine oft nicht möglich

(HELLEIN et al. 2012). Die biochemische Speziesbestimmung lässt sich aufgrund

der eingeschränkten biochemischen Aktivität von Campylobacter spp. nicht immer

eindeutig erbringen, so dass die Reproduzierbarkeit und Standardisierung dieser

Methoden schwierig ist (EBERLE und KIESS 2012).

Die Spezies-Bestimmung von Campylobacter kann auf phänotypischen oder

genotypischen Merkmalen beruhen (NACHAMKIN et al. 2008). Im Allgemeinen

haben genotypische Methoden jedoch eine höhere Differenzierungskraft als

phänotypische Methoden und werden aufgrund dessen in zunehmendem Maße

eingesetzt.

Bei der phänotypischen Speziesbestimmung werden phänotypisch erkennbare

Charakteristika eines Erregers, wie morphologische Merkmale, das Verhalten in der

Gramfärbung oder biochemische Reaktionen bestimmt. Mit der biochemischen

Differenzierung erfolgt eine Spezieseinteilung der Isolate durch die Analyse ihrer

Stoffwechselaktivität (EBERLE und KIESS 2012). Aufgrund der eingeschränkten

biochemischen Aktivität von Bakterien des Genus Campylobacter ist diese Methode

jedoch nicht immer alleinig für eine Speziesbestimmung aussagekräftig. Typische

biochemische Reaktionen zum Nachweis thermotoleranter Campylobacter spp. sind

die Oxidase- und Katalase-Reaktion. Eine Möglichkeit zur Differenzierung von

Campylobacter coli und C. jejuni kann mittels Hippurat-Hydrolyse erfolgen, dies führt

jedoch nicht immer zum sicheren Erfolg (SKIRROW und BENJAMIN 1980).

Die genotypische Speziesbestimmung ist im Allgemeinen verlässlicher und leichter

durchführbar als die phänotypische Bestimmung und beruht auf dem Nachweis von

speziesspezifischen genomischen DNA-Abschnitten (NIELSEN et al. 2000,


WASSENAAR und NEWELL 2000). PCR-basierte Verfahren zum Nachweis und zur

Speziesdifferenzierung von Campylobacter-Isolaten werden aufgrund der hohen

Sensitivität und Spezifität sowie der hohen Verlässlichkeit häufig verwendet.

Zur Feindifferenzierung verschiedener Campylobacter-Isolate sind unterschiedliche

Typisierungsmethoden etabliert. Bei der Feindifferenzierung, z.B. in

epidemiologischen Studien, ist es sinnvoll, mehrere Methoden miteinander zu

kombinieren, zum Beispiel die Serotypisierung mit einer genotypischen Methode

oder aber zwei unabhängige genotypische Methoden im Vergleich zueinander

(WASSENAAR und NEWELL 2000). Bei der serologischen Typisierung mittels

„Enzyme-linked immunosorbend assay“ (ELISA) oder mittels

Agglutinationsreaktionen werden mit Hilfe mono- oder polyklonaler Antikörper

hitzestabile O-Oberflächenantigene (Methode nach Penner) oder hitzelabile H-

Oberflächenantigene (Methode nach Lior) bestimmt (PENNER und HENNESSY

1980, LIOR et al. 1982). Spezies, die zu demselben Serotyp gehören, sind jedoch

nicht immer auch genetisch gleich und umgekehrt (WASSENAAR und NEWELL

2000). Zudem können Kreuzreaktionen auftreten (PRESTON und PENNER 1989),

so dass die Serotypisierung nicht immer als alleinige Methode zum Erfolg führt. Zur

Typisierung von Campylobacter-Isolaten mittels Bakteriophagen kann aufgrund der

unterschiedlichen Empfindlichkeit von Isolaten gegenüber Bakteriophagen bzw.

Phagensätzen eine Auswertung von Lysemustern und somit eine Phagen-

Typisierung erfolgen (FROST et al. 1999).

Als genotypische Methoden zur Feindifferenzierung haben sich die Makrorestriktion

mit anschließender Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), das „fla typing“ und die

Analyse von „amplified fragment length polymorphism“ (AFLP) als geeignet

erwiesen. Aufgrund einer genetischen Variabilität (intra- und inter-genetische

Rekombinationsereignisse, natürliche Transformation) von Campylobacter spp. in

Kombination mit Umweltstressoren (WASSENAAR et al. 1998, WASSENAAR und

NEWELL 2000) sind für tiefergreifende epidemiologische Studien sequenzbasierte

Methoden wie die „single nucleotide polymorphism“ (SNP)-Analyse, die Auswertung

von „restriction fragment length polymorphisms“ (RFLP) oder das „multi locus


sequence typing“ (MLST) sicherere Methoden zur Charakterisierung von

Campylobacter spp. (FUJIMOTO et al. 1997, WASSENAAR und NEWELL 2000).

2.2. Kriterien zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien

Die Lebensfähigkeit von Bakterien umspannt einen Gradienten, welcher auf der

einen Seite aus sich aktiv vermehrenden Zellen besteht und auf der anderen Seite

bis hin zu komplett toten Zellen mit Verlust aller Vitalfunktionen reicht (CARON et al.

1998, RUDI et al. 2005). Die direkte Abgrenzung eines exakten Zeitpunktes des

Übergangs von lebenden Zellstadien zu toten Keimen ist jedoch oft nur schwer zu

definieren (RUDI et al. 2005).

2.2.1. Kultivierbarkeit von Bakterien

Die Kultivierbarkeit und Vermehrungsfähigkeit der Bakterien auf mikrobiologischen

Nährmedien wurde lange Zeit als klassisches Kriterium der Lebensfähigkeit

herangezogen (KEER und BIRCH 2003). Mit dieser Methode kann die Anzahl

lebensfähiger Bakterien jedoch stark unterschätzt werden, da subletal geschädigte

Zellen (BLACKBURN und MCCARTHY 2000), physiologisch anspruchsvoll

wachsende Bakterien (WARD et al. 1990) und lebende, jedoch nicht kultivierbare

Bakterienstadien (VBNC) hierbei nicht immer detektiert werden (KEER und BIRCH

2003). Zudem ist die Wiederfindungsrate der Bakterien abhängig vom gewählten

Nährmedium und eine Bestimmung der Konzentration an toten Zellen in der Probe ist

hiermit nicht möglich (RUDI et al. 2005).

Zur Differenzierung lebender und toter Zellstadien sind daher alternative Methoden

entwickelt worden, die auf der Detektion unterschiedlicher Vitalparameter der Zelle

beruhen. Hierzu zählen die zelluläre Integrität, der Energiestatus, die Persistenz von

Nukleinsäuren sowie Parameter der metabolischen Aktivität der Zelle (KEER und

BIRCH 2003, FITTIPALDI et al. 2012).


Lange Zeit galten Bakterien als tot, wenn es nicht mehr möglich war, sie auf

herkömmlichen mikrobiologischen Medien zu kultivieren. Erstmalig beschrieben XU

et al. (1982) ein Stadium, das als „viable but nonculturable“ (VBNC) bezeichnet

wurde, in dem die Bakterien zwar kulturell nicht mehr anzuzüchten sind, sie aber

aufgrund von vorhandener metabolischer Aktivität noch lebensfähig sind und somit

auch für den Menschen als potentiell infektiös gelten (OLIVER 2005, FAKRUDDIN et

al. 2013). Zellen treten in dieses Stadium über, wenn sie subletalen

Umweltstressoren ausgesetzt sind, wie zum Beispiel einem erhöhtem

Sauerstoffgehalt, Nährstoffmangel, suboptimalen Temperaturen, weißem Licht oder

osmotischem Stress (OLIVER 2005), um somit einem möglichen Zelltod zu

umgehen. Neuere Studien vermuten, dass die Bildung von VBNC-Stadien ein Teil

des komplexen „cold shock response“ der Bakterien ist und die fehlende

Kultivierbarkeit als ein Nebeneffekt der gesteigerten Sensitivität gegenüber toxischen

Peroxiden in herkömmlichen Kulturmedien auftritt (PHADTARE 2004). Neben dem

Genus Campylobacter sind bislang über 61 weitere, teils humanpathogene,

Bakterienspezies beschrieben worden, die dieses Zellstadium eingehen können, wie

zum Beispiel Escherichia coli, Helicobacter pylori, Listeria monocytogenes oder

einige Salmonella-Spezies (OLIVER 2005, OLIVER 2010, AGUSTÍ et al. 2010). Bei

allen beschriebenen Spezies handelt sich um nicht sporenbildende Bakterien, die in

Form des VBNC-Stadiums eine Möglichkeit des Überlebens unter schlechten

Umweltbedingungen gefunden haben. Die Zellen zeigen in diesem Stadium

morphologische Veränderungen wie eine geschrumpfte, kokkoide Form. Die

Integrität der Zellmembran scheint jedoch nicht verändert. Sie besitzen ein hohes

Membranpotential (SIGNORETTO et al. 2000), eine herabgesetzte

Stoffwechselaktivität, jedoch einen gesteigerten ATP-Gehalt, der in toten und

geschädigten Zellen rasch absinkt (SIGNORETTO et al. 2002, OLIVER 2005,

OLIVER 2010, FAKRUDDIN et al. 2013). Die Genexpression ist ungestört und somit

ist eine Reaktion auf externe Stimuli möglich (KELL et al. 1998, MAALEJ et al. 2004).

Die Zellwand dieser Stadien weist Veränderungen auf. Sie besitzt höhere

Querverbindungen der Peptidoglykane, vermehrte Muropeptide, die kovalent

gebundene Lipoproteine beinhalten und ein verändertes Protein-Profil der äußeren


Zellmembran (SIGNORETTO et al. 2002, MUELA et al. 2008). VBNC-Zellen haben

zudem eine höhere autolytische Aktivität und können eine gesteigerte

Antibiotikaresistenz aufweisen, vermutlich resultierend aus der herabgesetzten

metabolischen Aktivität der Zelle (OLIVER 2010). Die Integrität der Zellmembran von

VBNC-Stadien ist ein bislang wenig erforschtes Thema. Einige Autoren wie ZHENG

et al. (1999) und WILLÉN et al. (2000) beschrieben jedoch kokkoide VBNC-

Zellformen der Gattung Helicobacter pylori, die in elektronenmikroskopischen

Studien eine intakte Bakterien-Doppelmembran aufweisen.

Die Fähigkeit zur Regeneration der VBNC-Zellen mit erneuter Kultivierbarkeit ist

nach Bereitstellung optimaler Wachstumsbedingungen möglich (OLIVER 1995,

WHITESIDES und OLIVER 1997, OLIVER 2010). Die Virulenz der VBNC-Stadien

wird in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert und ist am besten für die Gattung

Vibrio belegt. Einige Autoren bescheinigen eine Pathogenität der regenerierten

VBNC-Zellen im Tiermodell nach Erlangung der vollen Stoffwechselaktivität der

Zelle. OLIVER und BOCKIAN (1995) injizierten Mäusen VBNC-Zellen von Vibrio

vulnificus, die daraufhin an der Infektion starben. SUN et al. (2008) bestätigten die

Virulenz für Vibrio harveyi. Auch für die Bakterien des Genus Campylobacter ist ein

infektiöses Potential bescheinigt. Eine Kolonisierung durch VBNC Stadien von

Campylobacter spp. ist im Mausmodell (BAFFONE et al. 2006), im bebrüteten

Hühnerei (CAPPELIER et al. 1999) sowie im Huhn (STERN et al. 1994) belegt

worden. Beim Menschen gelang zudem eine in vitro Infektion humaner Caco-2 Zellen

mit VBNC-Stadien des Genus Campylobacter (CHAISOWWONG et al. 2012).

In einer neuen Studie von PATRONE et al. (2013) wurde mittels einer dreiwöchigen

Inkubationsperiode von C. jejuni-Zellen in Frischwasser bei einer Temperatur von

4 °C das VBNC-Stadium der Zellen induziert. Es konnte anschließend gezeigt

werden, dass die Zellen die Fähigkeit zur Adhäsion an intestinale Epithelzellen

beibehalten. Aus diesen Resultaten wurde vermutet, dass die VBNC-Zellen ihre

Infektiösität wiedererlangt haben (PATRONE et al. 2013).


VBNC-Zellen stellen somit ein Reservoir an potentiell infektiösen Bakterienstadien in

der Umwelt dar und sind eine nicht zu unterschätzende Gefahr für die humane

Bevölkerung (FAKRUDDIN et al. 2013).

2.2.2. Nachweis von mRNA und rRNA

Methoden zum Nachweis des Vitalitätsstatus der Zelle werden oftmals mittels

Färbung von Nukleinsäuren oder der Hybridisierung geführt (CENCIARINI-BORDE et

al. 2009). Die Amplifizierung von DNA mittels PCR ist allerdings kein geeigneter

Indikator zur Detektion der Lebensfähigkeit einer Zelle, da die DNA nach dem Tod

der Zelle noch für längere Zeit persistiert (MASTERS et al. 1994). Alternativ kann

jedoch hierfür der Nachweis von RNA anstatt von genomischer DNA erfolgen, denn

im Gegensatz zu letzterer werden RNA Moleküle nach dem Zelltod rasch abgebaut

(ALIFANO et al. 1994, FITTIPALDI et al. 2012). Der Fokus des RNA-Nachweises

wird dabei auf den Nachweis von mRNA gelegt, da es sich hierbei um hoch labile

Moleküle mit einer sehr geringen Halbwertszeit von einigen Sekunden handelt,

welche ausschließlich von metabolisch aktiven Zellen synthetisiert werden (BLEVE et

al. 2003, KEER und BIRCH 2003, MORIN et al. 2004). Somit ist eine Unterscheidung

lebender, metabolisch aktiver Zellen mittels mRNA Molekülen dem reinen Nachweis

der stabileren DNA Moleküle überlegen (FITTIPALDI et al. 2012). Ein Nachteil bei

der Arbeit mit mRNA ist jedoch die Schwierigkeit bei der Bearbeitung und dem

Umgang mit der mRNA. Durch die hohe Labilität der Moleküle, kann es häufiger zu

Degradierungen durch unzureichende Lagerung oder Bearbeitung oder durch die

Kontamination mit RNA-abbauenden Enzymen kommen, so dass der Umgang mit

den Proben erschwert werden kann. Die Expression von mRNA ist zudem abhängig

vom physiologischen Status der Zelle. Bei langsam wachsenden Bakterien oder

metabolisch inaktiveren Zellstadien kann die mRNA Konzentration unterhalb der

Detektionsgrenze der „Reverse Transkriptase“ (RT)-PCR liegen und somit falsch

negative Resultate erzeugen (FITTIPALDI et al. 2012). Außerdem können in Proben

mit hohen Konzentrationen an toten Zellen (>104 Zellen/ml) falsch positive


Ergebnisse durch Reste von übriggebliebenen mRNA-Transkripten entstehen

(SHERIDAN et al. 1998, VAITILINGOM et al. 1998, FITTIPALDI et al. 2012).

Neben mRNA ist auch der Nachweis von ribosomaler RNA als Indikator für lebende

Zellstadien verwendet worden (KEER und BIRCH 2003). Ein Vorteil gegenüber der

mRNA ist das Vorliegen einer hohen Kopienzahl in der Zelle, so dass eine hohe

Sensitivität des Assays erzielt werden kann.

Zum Nachweis und zur Quantifizierung von RNA wurden die Reverse Transkriptase

PCR (RT-PCR) sowie die „nucleic acid sequence based amplification“ (NASBA) in

verschiedenen Studien eingesetzt (UYTTENDAELE et al. 1997, MCKILLIP et al.

1998, DREIER et al. 2004, CHURRUCA et al. 2007, CENCIARINI-BORDE et al.

2009). Der rRNA-Nachweis unter Verwendung dieser Methoden war in einigen

Studien allerdings nur erfolgreich bei extremen Abtötungsmethoden, wie dem

Autoklavieren oder bei Einsatz von antimikrobiellen Chemotherapeutika (MCKILLIP

et al. 1998, SHERIDAN et al. 1998, YARON und MATTHEWS 2002, CENCIARINI-

BORDE et al. 2009). Das Detektionslimit für den Nachweis der RNA mittels RT-PCR

wurde in einer Studie von Rudi et al. (2005) mit 3 log10 Zellen/g angegeben. Die

Primerauswahl sowie die Targetlänge bei der RT-PCR sind weitere Einflussfaktoren,

die beim Nachweis der rRNA die Resultate stark beeinträchtigen können (VAN DER

VLIET et al. 1994, VILLARINO et al. 2000, YARON und MATTHEWS 2002,

CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Längere Amlikons zeigten sich dabei in Studien

von MCCARTY und ATLAS (1993) als besser geeignet zur Bestimmung des

Vitalitätsstatus der mit Chlor behandelten Zellen als die Verwendung kurzer

Amplifikate.

2.2.3. Bestimmung der Membranintegrität von Bakteri en

Methoden zur Bestimmung der Membranintegrität der Zellen sind häufig verwendete

Verfahren zum Nachweis der Lebensfähigkeit von Bakterien (FITTIPALDI et al. 2012,

NOCKER et al. 2006, RUDI et al. 2005, CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Aufgrund

der hydrophoben Eigenschaften der Phospholipidschicht von Zellmembranen ist es


geladenen oder polaren Molekülen daher nur möglich sie zu passieren, wenn sie

eine delokalisierte Ladung besitzen (CAO-HOANG et al. 2008). Die Penetration

ionisierter Substanzen, wie EMA und PMA, durch die Zellmembran kann somit ein

Indikator für den Verlust der zellulären Membranintegrität sein (Farbstoff-Exklusions-

Methode) (CAO-HOANG et al. 2008). Fluorophore Farbstoffe wie Propidiumiodid

(PI), TO-PRO-3, Hexidiumiodid, SYTOX green oder 4′,6-Diamidin-2-phenylindol

(DAPI) werden eingesetzt, um die Membranintegrität der Zelle darzustellen (LLOYD

und HAYES 1995, NOVO et al. 2000, VIVES-REGO et al. 2000). Ein häufig

verwendetes Kit für die Differenzierung lebender und toter Zellen („Live/Dead

BacLight Bacterial Viability Kit“) mittels Fluoreszenzmikroskopie beinhaltet die

Farbstoffe Propidiumiodid und SYTO9, welches eine Kombination aus den beiden

Farbstoffen SYTOX green und SYTO59 ist (ROTH et al. 1997, CAO-HOANG et al.

2008). Der DNA-Farbstoff SYTO9 färbt dabei alle Zellen in der Probe grün an,

wohingegen Propidiumiodid selektiv in membrangeschädigte, tote Zellen eindringt

und diese rot anfärbt. Für die Auswertung der Ergebnisse dieses Assays ist ein

Fluoreszenzmikroskop mit zwei optischen Detektionskanälen nötig. Das

Detektionslimit diese Verfahrens wird mit 3 log10 Zellen/g angegeben (RUDI et al.

2005). Dieses lebend-/tot-Kit ermöglicht jedoch keine Unterscheidung zwischen

Bakterien unterschiedlicher Spezies und ist somit nicht alleinig für einen Einsatz in

der Routinediagnostik an Lebensmittelproben geeignet (RUDI et al. 2005).

Um eine Differenzierung lebender und toter Zellen in Kombination mit der

Anwendung der real-time PCR zu erzielen, wurden im Jahr 2003 von NOGVA et al.

DNA interkalierende Farbstoffe wie Ethidiummonoazid (EMA) erstmalig verwendet.

Drei Jahre später erfolgte die Anwendung des weiter entwickelten Moleküls

Propidiummonoazid (PMA) von NOCKER et al. (2006). Die Unterscheidung zwischen

lebenden und toten Zellen mit Hilfe dieser Farbstoffe basiert auf der

Membranpermeabilität der Zellen (FITTIPALDI et al. 2012). Bei ihrer Anwendung

werden die Substanzen der Zellsuspension vor der PCR zugesetzt und binden nach

Photoaktivierung selektiv und irreversibel an die DNA membrangeschädigter, toter

Zellen. Die Membranen intakter, lebender Zellen bilden eine Barriere und werden

nicht durchdrungen. Ist eine Bindung der Substanz an DNA erfolgt, kann diese in der


darauffolgenden PCR nicht mehr amplifiziert werden. Somit erfolgt ein Nachweis

ausschließlich von DNA von vormals membranintakten, lebenden Zellen (RUDI et al.

2005, CENCIARINI-BORDE et al. 2009, FITTIPALDI et al. 2012).

In einer Studie von RUDI et al. (2005) zur Differenzierung lebender und toter

Campylobacter jejuni lag die Nachweisgrenze der EMA-qPCR im Vergleich zur RNA

Bestimmung sowie dem „BacLight-Kit“ bei 2 log10 Zellen/g und war somit sensitiver

als die letztgenannten Methoden.

2.2.4. Bestimmung der metabolischen Aktivität der Z elle

Direkte Indikatoren zur Beurteilung der Vitalität einer Zelle sind die Detektion der

respiratorischen Aktivität mittels Hydrolyse von 5-Cyano-2,3-ditotyltetrazoliumchlorid

(CTC) unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie oder der Durchflusszytometrie

sowie die Bestimmung der Resonanzfähigkeit der Zelle auf Umwelt- und

Substratfaktoren mittels „direct viable count-assay“ (DVC-Assay) (NWOGUH et al.

1995, KEER und BIRCH 2003, RUDI et al. 2005, NOCKER und CAMPER 2009). Bei

diesem DVC-Verfahren wird mit einem Revitalisierungschritt gearbeitet, bei dem den

Zellen ein DNA-Gyrasehemmer, wie z.B. Nalidixinsäure zugegeben wird. Dieser führt

in der angewendeten Konzentration zur Inhibition der Zellteilung und dadurch zur

Elongation der Zellen, ohne jedoch die metabolische Aktivität der Zelle zu

beeinflussen (KOGURE et al. 1979, BESNARD et al. 2000, CENCIARINI-BORDE et

al. 2009). Durch das Wachstum der lebenden Zellen mit daraus resultierender Zell-

Elongation können sie morphologisch von nichtbeeinflussten, toten Zellen

unterschieden werden (NOCKER und CAMPER 2009). In Kombination dieser

Technik mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-16S rRNA Detektion war

es einigen Autoren möglich, lebende, kulturfähige Zellen von lebenden, aber nicht

kultivierbaren Zellen (VBNC) zu unterscheiden (BAUDART et al. 2002, REGNAULT

et al. 2000, ARMISEN et al. 2004, CENCIARINI-BORDE 2009). Die verschiedenen

Methoden zur Differenzierung lebender und toter Bakterien sind in Tabelle 1

aufgeführt.


Tabelle 1: Verfahren zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien


2.3. Rechtliche Regelungen zum Nachweis von darmpat hogenen

Campylobacter spp.

Die EFSA dokumentierte im Jahr 2012 europaweit über 200.000 Fälle von

Campylobakteriose beim Menschen (EFSA 2014 b). Die Zahl an Krankheitsfällen, die

nicht den zuständigen Behörden gemeldet wurden, ist vermutlich jedoch noch

wesentlich höher. Schätzungen zufolge beträgt demnach die Gesamtzahl der

Erkrankungen in der EU etwa 9 Mio. Fälle pro Jahr (EFSA 2011). Die aus diesen

Erkrankungsfällen resultierenden Kosten für das europäische Gesundheitssystem

sind beträchtlich und werden auf etwa 2,4 Milliarden Euro geschätzt (EFSA 2011,

EFSA 2014 a, EFSA 2014 b). Für die Überwachung und Prävention dieser

Infektionskrankheit ist daher in Deutschland seit dem Jahr 2001 der Nachweis von

darmpathogenen Campylobacter-Spezies nach § 7 des Infektionsschutzgesetzes

(IfSG) meldepflichtig, sofern eine akute Infektion anzunehmen ist (IfSG 2013).

Gesonderte Regelungen bestehen darüber hinaus für Mitarbeiter der

Lebensmittelproduzierenden und -verarbeitenden Betriebe. Für diese sind der

alleinige Krankheitsverdacht sowie die Erkrankung gemäß § 6 IfSG meldepflichtig,

wenn die betreffende Person eine Tätigkeit in einem Lebensmittelbetrieb nach § 42

IfSG ausübt (IfSG 2013). Weiterhin gilt ein Tätigkeitsverbot im Falle eines

Krankheitsverdachts oder bei bestehender Campylobacter-Infektion (§ 42 IfSG

2013).

Da die Infektion des Menschen mit Bakterien des Genus Campylobacter größtenteils

über kontaminierte Lebensmittel erfolgt, sind der Erregernachweis und die

Quantifizierung im Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch

(LFGB) rechtlich geregelt. Hierzu sind in der amtlichen Sammlung von

Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB zwei verschiedene Methoden

beschrieben. Ein mikrobiologischer qualitativer und quantitativer Nachweis des

Erregers sowie ein molekularbiologischer, qualitativer Nachweis von spezifischen

Genabschnitten des Erregers. Das mikrobiologische Nachweisverfahren wird als ein

„horizontales Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von Campylobacter spp. in


Lebensmitteln“ bezeichnet und basiert auf einem Anreicherungsschritt mit

nachfolgender Erregeridentifizierung und –bestätigung (§ 64 LFGB). Mit diesem

Nachweisverfahren erfolgte die Übernahme der gleichnamigen DIN EN ISO

10272:2006 in die amtliche Methodensammlung nach § 64 LFGB. Das

molekularbiologische, PCR-basierte Nachweisverfahren beschreibt einen

„Qualitativen Nachweis von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in

Lebensmitteln - durch Amplifizierung spezifischer Gensequenzen mit der PCR“ (§ 64

LFGB). Hierbei wird eine 450 bp große Region des flaA-Gens amplifiziert, wobei

jedoch nicht die nahe verwandten Bakterienspezies C. lari, C. upsaliensis, C. butzleri

sowie Helicobacter pylori und Escherichia coli mit detektiert werden (OYOFO et al.

1992).

Da Infektionen des Menschen mit Campylobacter spp. auch über kontaminiertes

Wasser hervorgerufen werden können, gelten für das Lebensmittel Trinkwasser die

rechtlichen Regelungen der Trinkwasserverordnung (TrinkwV 2001). Hierbei sind in

§ 5 TrinkwV die mikrobiologischen Anforderungen beschrieben. Nach § 5 Nr.1 dürfen

Krankheitserreger nicht in Konzentrationen vorhanden sein, die eine Schädigung der

Gesundheit des Menschen hervorrufen können. Der Grenzwert für die

Gesamtkeimzahl in Trinkwasser liegt bei 100 Kolonie-bildenden Einheiten (KbE) pro

ml Wasser. Für einige Indikatorkeime wie Escherichia coli, Enterokokken und

coliforme Bakterien sind zusätzlich dazu gesonderte Grenzwerte aufgeführt. Diese

dürfen in 100 ml Wasser nach Anreicherung der Proben nicht nachweisbar sein. Für

den Keimgehalt von Campylobacter in Trinkwasser liegen jedoch derzeit keine

gesonderten Grenzwerte vor.

Für die mikrobiologische Qualitätskontrolle von Wasserproben beschreibt die

international gültige ISO Norm 17995:2005 den Nachweis und die Zählung von

thermotoleranten Campylobacter spp. Bei diesem kulturellen Verfahren zur

Bestimmung der Keimkonzentration werden Wasservolumina von 1000 ml, 100 ml,

und 10 ml beprobt, um eine semiquantitative Bestimmung mittels „most probable

number“ (MPN)-Verfahren zu erzielen. Eine Aufkonzentrierung der Keime in Wasser

erfolgt hierbei mittels Membranfiltration. Anschließend wird eine Anreicherung in


hoch selektivem Preston-Medium sowie weniger selektiver Bolton-Bouillon parallel

durchgeführt. Nach Inkubation bei 37 °C für 48 Stunden werden die Keime auf

modifiziertem Charcoal Cefoperazon Desoxycholat-Agar (mCCD-Agar) ausplattiert

und für weitere 48 Stunden bei 41,5 °C bebrütet. Ein negatives Ergebnis kann somit

erst innerhalb von 4 Tagen erzielt werden. Bei positivem Erregernachweis schließen

sich weitere Bestätigungsschritte an, die die Untersuchungszeit noch um einige Tage

verlängern können (ISO 17995:2005, PITKÄNEN 2013).

Trotz der weltweit hohen Zahlen an Campylobacteriose-Fällen sind bislang auch

noch keine spezifischen Grenzwerte für Campylobacter-Keimzahlen in Lebensmitteln

tierischen Ursprungs verfügbar. Auf europäischer Ebene wurden jedoch im Jahr

2011 von dem Gremium für biologische Gefahren der EFSA „Empfehlungen zur

Reduktion von Campylobacter in Hühnerfleisch“ herausgegeben (EFSA 2011). Diese

beinhalten Maßnahmen in der Primärproduktion zur Erregerminimierung vor der

Schlachtung (z.B. Biosecurity, Fliegengitter, Herabsetzen des Mastalters) und

während der Fleischproduktion (z.B. Hygiene, Desinfektion, logistisches Schlachten,

Prävention fäkaler Verunreinigungen, Oberflächendekontamination der

Schlachtkörper), sowie Einschätzungen zur Wirksamkeit dieser Maßnahmen für den

Endverbraucher (EFSA 2011). Anhand dieser Minimierungsstrategien wird eine

Reduktion der Erregerhäufigkeit zwischen 50 % und 90 % angestrebt. Ansatzpunkt

ist hierbei ein mikrobiologischer Grenzwert von 1000 oder 500 KbE pro Gramm

Hautprobe der Karkassen am Schlachthof, wobei bislang 15 % bzw. 45 % der

getesteten Chargen in Deutschland (2008) diesen Kriterien nicht entsprechen (EFSA

2011).

2.3.1. Problematik beim Nachweis von Campylobacter in Lebensmitteln

unter Verwendung der amtlichen Verfahren

Campylobacter sind kulturell anspruchsvoll wachsende Bakterien und der

mikrobiologische Erregernachweis ist daher oft mit Schwierigkeiten verbunden

(SOLOMON und HOOVER 1999, BOTTELDOORN et al. 2008). Auch VBNC-Stadien


können bei Verwendung des mikrobiologischen Verfahrens nicht nachgewiesen

werden. Zudem benötigt die nach § 64 LFBG vorgeschriebene mikrobiologische

Nachweismethode von der Anreicherung bis zum Bestätigungsschritt bis zu 6 - 7

Tage und ist somit sehr zeitaufwändig (JOSEFSEN et al. 2010). Auch das

mikrobiologische Nachweisverfahren für die Detektion von Campylobacter spp. aus

Wasserproben ist sehr arbeits- und materialaufwändig und zudem auch zeitintensiv

(STELMA und WYMER 2012), vor allem wenn quantitative Ergebnisse erzielt werden

sollen (PITKÄNEN 2013). Dadurch können Untersuchungsergebnisse von

Lebensmittelproben nicht zeitnah ermittelt werden und ein direkter Eingriff in die

Lebensmittelsicherheit ist kaum möglich. Das amtlich beschriebene PCR-basierte

Verfahren hat zwar den Vorteil einer Zeitersparnis, so dass schnelle Resultate

innerhalb von 3 - 4 Stunden erzielt werden können (RUDI et al. 2005, JOSEFSEN et

al. 2010), mit dieser Methode ist jedoch eine Unterscheidung zwischen lebenden und

somit infektiösen Bakterienstadien und toten Keimen nicht möglich. Rückschlüsse

auf die Infektiösität der Lebensmittelprobe für den Konsumenten können mit diesem

Verfahren daher nicht geschlossen werden.

Ähnliche Probleme beim kulturellen Nachweisverfahren von Campylobacter spp. aus

Wasserproben nach der ISO 17995:2005 Methode haben auch andere Autoren

festgestellt. Bei der Detektion von Campylobacter spp. aus Wasser ist die Art der

Wasserprobe von zentraler Bedeutung, vor allem wenn eine hohe Konzentration an

fäkaler Begleitflora, wie bei Oberflächenwasser oder Abwasserproben, vorhanden

sein kann (PITKÄNEN 2013). Diese Begleitflora könnte während der Anreicherung

oder direkten Ausplattierung der Proben zu einer kompetetiven Hemmung der

Campylobacter-Zellen führen (ABULREESH et al. 2005). Aufgrund dieser

Problematik wurde eine Modifikation der ISO 17995:2005 Methode vorgenommen.

Bei Proben mit einer hohen Begleitflora kann zum Beispiel ein höheres

Filtrationsvolumen, die Verwendung größerer Filter oder eine Modifikation der

Inkubationszeiten einen positiven Erregernachweis erbringen (HIJNEN et al. 2000,

HUNT et al. 2001, HÄNNINEN et al. 2003, PITKÄNEN et al. 2009). Diese

Methodenanpassungen sollten jedoch für jede Wasserart differenziert etabliert


werden, da sie die Wiederfindungsrate der Bakterien beeinflussen können (KHAN et

al. 2009, PITKÄNEN et al. 2009).

Andere Autoren schlugen die Kombination aus der mikrobiologischen

Voranreicherung mit einer anschließenden Bestätigung der Isolate mittels PCR-

Verfahren vor. Hierbei wurde jedoch keine Quantifizierung der Bakterien

durchgeführt. Zur Bestätigung präsumtiver Campylobacter Isolate ist der Einsatz der

PCR Methode alternativ zu herkömmlichen Bestätigungsverfahren möglich

(PITKÄNEN 2013). Vorteil der Anwendung von PCR-Verfahren zur Bestätigung von

Campylobacter spp. ist, dass hierbei keine Reinkulturen der Isolate benötigt werden

(PITKÄNEN et al. 2009). Ein weiterer Vorteil beim Einsatz von PCR Verfahren nach

selektiver Voranreicherung ist eine Verkürzung der Nachweiszeit der Erreger von

mehreren Tagen auf bis zu 5 Stunden (PITKÄNEN 2013). Die Anwendung der PCR

Methoden nach Anreicherung der Bakterien kann zudem das Risiko falsch positiver

Resultate minimieren, wenn speziesfremde Begleitkeime das Wachstum von

Campylobacter spp. auf festen Nährböden verdrängen (PITKÄNEN 2013).

2.4. Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR und real-time PCR

Seit Entwicklung der ersten PCR-basierten Methode zum Nachweis von

Campylobacter spp. vor über 20 Jahren (OYOFO et al. 1992) finden PCR Methoden

in jüngster Zeit immer häufiger Anwendung (GHARST et al. 2013). Herkömmlichen

mikrobiologischen Methoden sind sie aufgrund der zeiteffizienten Durchführung und

der Möglichkeit zur Detektion von VBNC-Zellen überlegen (ABULREESH et al.

2006).

2.4.1. PCR Nachweise für Campylobacter spp.

Häufig verwendete PCR-basierte Methoden zum spezifischen Nachweis des Genus

Campylobacter amplifizieren Zielsequenzen des DNA-Abschnitts, welcher die 16S

rRNA kodiert (JOSEFSEN et al. 2004, PERELLE et al. 2004 und HELLEIN et al.


2012), der 23S rRNA (500bp) (ENGVALL et al. 2002) und der 16S-23S rDNA

„internal transcribed spacer region“ (ITS) (KHAN und EDGE 2007). Für den Spezies-

spezifischen Nachweis von C. jejuni wird in einigen Studien das Hippurikase-Gen

hipO detektiert (DINGLE et al. 2005, PERSSON und OLSEN 2005). DENIS et al.

1999 beschreiben zudem das „membrane-associated protein“-Gen mapA als

erfolgreich zum Nachweis von C. jejuni. Zur Identifizierung von C. coli sind

Zielsequenzen des ceuE-Gens (Enterocholin-uptake-periplasmic-binding-protein) als

erfolgreich dargestellt (SAILS et al. 2003).

„Multiplex“-basierte Nachweisverfahren von WAAGE et al. (1999) und MOORE et al.

(2001) beschreiben die Flaggelin-Gene flaA und flaB als geeignete Zielsequenzen für

PCR-Nachweise von C. jejuni, C. coli und C. lari. Eine weitere molekularbiologische

Studie von JENSEN et al. (2005) beschreibt das glyA-Gen, welches die Serin

Hydroxymethyltransferase codiert, als geeignetes Target zum speziesspezifischen

Nachweis von Campylobacter. Vorteil ist hierbei, dass das Gen hoch konserviert ist,

jedoch genug Sequenzvariationen für die speziesspezifische Differenzierung von

C. jejuni, C. coli, C. lari und C. upsaliensis zeigt (JENSEN et al. 2005). DENIS et al.

(1999) etablierten ein „multiplex“-basiertes Verfahren, welches die Zielgene 16 rDNA

(gattungsspezifisch), mapA (C. jejuni) und ceuE (C. coli) zum Nachweis von

Campylobacter aus verschiedenen Lebensmitteln amplifiziert. NAYAK et al. (2005)

sowie HELLEIN et al. (2011) etablierten eine „multiplex“ PCR zur Differenzierung von

C. jejuni und C. coli. Dabei wurde das cadF-Gen zur genusspezifischen Detektion

amplifiziert. Für die speziesspezifische Differenzierung wurde das ceuE-Gen (C. coli)

verwendet sowie ein bislang undefiniertes Gen, das eine Sequenz-Übereinstimmung

von 67 % mit einem Gen zeigt, welches für eine Oxidoreduktase-Untereinheit von C.

jejuni codiert (C. jejuni). Weitere Autoren beschrieben die ORF-C Sequenz (115 bp)

(SAILS et al. 2003) sowie das cpn60-Gen (1512 bp) (BANIHASHEMI et al. 2012) als

erfolgreiche PCR Targetgene zum Nachweis von Campylobacter spp. in

Lebensmittel- und Wasserproben. Die Zielgene zum Nachweis von Campylobacter

spp. sind in Tabelle 2 zusammengefasst.


Tabelle 2: Zielgene zum Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR

2.4.2. Real-time PCR Nachweise für Campylobacter spp.

Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR Methode, welche in der Regel eine

Amplifikation der Ziel-DNA in einem PCR-Thermocycler und eine anschließende

Gelelektrophorese und Anfärbung des Amplifikates umfasst, stellt die quantitative

real-time PCR (qPCR) eine Weiterentwicklung der Methodik dar. Mit diesem

Verfahren ist eine Möglichkeit geschaffen, Campylobacter spp. nicht nur qualitativ

nachzuweisen, sondern auch eine quantitative Aussage treffen zu können. Hierbei

erfolgt die PCR-Reaktion sowie die Detektion des PCR-Produktes, je nach

verwendetem Sondensystem, in einem zeitnahen oder zeitgleichen Schritt, so dass

eine aufwändige Auftrennung und Färbung des PCR-Produktes wie bei der

konventionellen PCR entfällt. Dabei wird mittels fluoreszenzmarkierter Farbstoffe


oder -Sondensysteme das PCR-Produkt „sichtbar“ gemacht. Hierbei steigt das

Fluoreszenzsignal proportional zur Produktmenge, so dass eine quantitative

Bestimmung erreicht werden kann (CAO-HOANG et al. 2008).

Die Eignung der real-time PCR ist für verschiedene Matrices erfolgreich getestet

worden. Zur Quantifizierung von Campylobacter spp. aus Kotproben ist in Studien

von LUND et al. (2004) und RUDI et al. (2004) die qPCR Methode erfolgreich

eingesetzt worden. Auch für Geflügelfleisch (YANG et al. 2003, WOLFFS et al. 2005,

BOTTELDOORN et al. 2008), Milch (YANG et al. 2003, SOEJIMA et al. 2011b) und

Wasser (YANG et al. 2003, TISSIER et al. 2012) wurden qPCR Methoden zur

Detektion von Campylobacter spp. von verschiedenen Autoren beschrieben

(BOTTELDOORN et al. 2008).

2.4.3. Anwendung der real-time PCR zum Nachweis von Campylobacter

spp. in Geflügelfleischproben und Wasserproben

Erste Anwendungen der real-time PCR bei Geflügelfleisch zeigten eine gute Eignung

der Methode zum Nachweis von Campylobacter spp. (RUDI et al. 2005, JOSEFSEN

et al. 2010). JOSEFSEN et al. (2010) gelang der Nachweis von lebenden

Campylobacter spp. auf Geflügelfleisch mit einer hohen Korrelation zur

herkömmlichen mikrobiologischen Keimzählung. Eine weitere real-time PCR basierte

Methode wurde von BOTTELDOORN et al. (2008) publiziert, um eine Quantifizierung

von Bakterien des Genus Campylobacter auf Hühnerkarkassen zu ermöglichen. In

dieser Studie wurde jedoch keine Unterscheidung von lebenden und toten Zellen

getroffen.

Die direkte Quantifizierung von Bakterien des Genus Campylobacter aus

Wasserproben mittels real-time PCR ist in vielen Studien bereits erfolgreich

eingesetzt worden, zunächst jedoch ohne eine Differenzierung von lebenden und

toten Zellstadien zu erzielen (NOGVA et al. 2000, YANG et al. 2003, NAM et al.

2005, VAN DYKE et al. 2010, CLARK et al. 2011, PARK et al. 2011, PITKÄNEN

2013). Demgegenüber ist für den quantitativen Nachweis lebender Campylobacter-


Zellen aus Wasserproben in der Literatur bislang wenig bekannt (BAE und WUERTZ

2012, BANIHASHEMI et al. 2012). In zwei initialen Studien wurde die Eignung der

interkalierenden Substanzen nicht geprüft und zudem kein Vergleich verschiedener

Aufkonzentrierungsverfahren oder Wasserarten durchgeführt. Diese Studien dienten

lediglich dem Zweck, die Überlebensrate der Bakterien in Wasser zu bestimmen oder

waren primär dazu bestimmt eine geeignete Targetlänge für die qPCR zu ermitteln

(BAE und WUERTZ 2012, BANIHASHEMI et al. 2012).

Dagegen wurden für andere Erreger bereits quantitative Nachweise lebender Zellen

mittels real-time PCR aus Wasserproben geführt. So wurde für den Nachweis von

Pseudomonas aeruginosa eine Filter basierte Propidiummonoazid (PMA)-qPCR

Methode für künstlich infiziertes Wasser eingesetzt (HELLEIN et al. 2012). Auch für

Escherichia coli ist eine qPCR Methode beschrieben, bei welcher PMA anstatt EMA

bei ultraschallgereinigtem Gemüsewaschwasser verwendet wurde (ELIZAQUÍVEL et

al. 2012). INOUE et al. (2008) beschrieben eine EMA-qPCR basierte Methode, für

den Nachweis lebender Escherichia coli aus Teichwasser.

Zum quantitativen Nachweis von Bakterien des Genus Campylobacter aus Wasser

wurde in einer neueren Studie von TISSIER et al. (2012) eine Methode als

erfolgreich dargestellt, in der aus 20 Liter Wasserproben C. jejuni und C. coli mittels

Membranfiltration isoliert wurden und deren Keimgehalt mittels qPCR bestimmt

wurde. Eine Berücksichtigung des Vitalitätsstatus der Zellen wurde hierbei jedoch

nicht getroffen. Für den quantitativen Nachweis von lebenden Campylobacter spp.

aus Wasserproben mittels qPCR ist in der Literatur bislang jedoch wenig bekannt

(BAE und WUERTZ 2012, BANIHASHEMI et al. 2012).

2.4.4. Einsatz von interkalierenden Substanzen für real-time PCR

Anwendungen

Ein Vorteil der real-time PCR gegenüber der herkömmlichen PCR Methodik ist zwar

die Möglichkeit, eine Quantifizierung (z.B. über die Anzahl von Genomkopien)

vornehmen zu können, jedoch behebt auch diese PCR-Technik nicht das Problem,


dass sowohl DNA von vormals lebenden als auch von vormals toten Zellen

nachgewiesen wird (PITKÄNEN 2013). Eine Differenzierung von lebenden und damit

infektiösen Bakterien und toten Keimen ist somit nicht möglich. Deshalb wurden in

den letzten Jahren verstärkt DNA interkalierende Substanzen, wie Ethidiummonoazid

(EMA) und Propidiummonoazid (PMA) eingesetzt, die der zu untersuchenden Probe

vor der qPCR Durchführung zugesetzt werden (NOCKER et al. 2006, RUDI et al.

2005, JOSEFSEN et al. 2010, AGUSTÍ et al. 2010). Diese Substanzen dringen in

membrangeschädigte, tote Zellen ein oder lagern sich an freie DNA an und binden

nach einer Belichtung kovalent und damit irreversibel an die DNA (RUDI et al. 2005).

Die DNA lebender Zellen, an welche keine Substanz gebunden ist, wird in der

anschließenden qPCR amplifiziert, während die DNA vormals membrangeschädigter

Zellen mit gebundener interkalierender Substanz nicht mehr amplifiziert werden kann

(CENCIARINI-BORDE et al. 2009). In sich anschließenden Studien wurde zudem

berichtet, dass schon bei der Isolierung der genomischen DNA große Teile der mit

interkalierenden Substanzen gebundenen und somit unlöslich gewordenen DNA

zusammen mit dem Zellüberstand verworfen werden (NOCKER und CAMPER

2006). Beim Einsatz einer Kombination aus DNA interkalierenden Substanzen und

der real-time PCR Methodik ist somit ein quantitativer Nachweis an lebenden und

damit potentiell infektiösen Bakterien in der Probe möglich. Die Eignung der

kombinierten Methode aus qPCR und interkalierenden Substanzen ist jedoch stark

spezies- und matrixabhängig (CENCIARINI-BORDE et al. 2009, NOCKER und

CAMPER 2009), so dass die Eignung dieses methodischen Ansatzes für eine

quantitative Keimzahlbestimmung bei verschiedenen Bakterienspezies in der

Literatur unterschiedlich bewertet wird. FLEKNA et al. (2007) stuften EMA als nicht

geeignet für Listeria monocytogenes ein, wohingegen WANG und MUSTAPHA

(2010) für Salmonella enterica eine sehr gute Eignung zur quantitativen

Keimzahlbestimmung lebender Zellen bestätigten.

Für einen Nachweis von Bakterien des Genus Campylobacter wurde der Einsatz der

EMA-qPCR kontrovers diskutiert. In Studien von RUDI et al. (2005) wurde die

Differenzierungssubstanz EMA erfolgreich für den quantitativen Nachweis von

lebenden Campylobacter spp. eingesetzt. Eine Studie von FLEKNA et al. (2007)


widersprach diesen Ergebnissen jedoch und stufte EMA als nicht geeignet zum

Nachweis von lebenden Listeria monocytogenes und Campylobacter spp. ein. In

dieser Studie wurde jedoch nur der Typstamm C. jejuni DSM 4688T getestet und

keine weiteren Untersuchungen mit Feldstämmen durchgeführt. Auch der Einsatz

von PMA wurde hierbei nicht überprüft, dem von einigen Autoren eine höhere

Effektivität sowie eine Spezies- und Matrix-unabhängigere Anwendung bescheinigt

wird (CENCIARINI-BORDE et al. 2009, NOCKER und CAMPER 2009). Vermutlich ist

dies bedingt durch die erweiterte Molekülstruktur der Substanz, die im Vergleich zu

EMA eine zusätzliche positive Ladung besitzt und somit eine reduzierte

Penetrationsfähigkeit von lebenden, membranintakten Zellen aufweist (NOCKER et

al. 2006). Die Effektivität der Differenzierungskraft von PMA konnte für einige

Bakterienspezies, wie Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella

enterica subsp. enterica serovar Typhimurium oder Serratia marcescens belegt

werden (NOCKER et al. 2007, PAN und BREIDT 2007). Diese bessere Eignung

konnte jedoch nicht für alle Anwendungen und Erreger bestätigt werden (LEE und

LEVIN 2009).

2.4.5. Nachteile bei der Anwendung interkalierender Substanzen

Wichtig ist, ob der Einsatz einer Differenzierungssubstanz die Ergebnisse der real-

time PCR beeinträchtigt. Dies wurde bislang in der Literatur kontrovers gesehen.

Auch wenn nicht bei allen Autoren eine Ct-Wert Verschiebung beobachtet wurde,

konnten FLEKNA et al. (2007) und HEIN et al. (2007) in ihren Studien einen Einfluss

der Differenzierungssubstanz EMA auf das qPCR Signal feststellen, indem es zu

einer Verschiebung der Ct-Werte im Vergleich zu unbehandelten Zellen kam. Andere

Autoren erzielten gegensätzliche Ergebnisse (RUDI et al. 2005, WANG und

MUSTAPHA 2010) und konnten bei Einsatz der EMA-qPCR keine Verschiebung der

Ct-Werte bei lebenden Bakterien beobachten. Bei diesen Studien wurde jedoch nicht

bewertet, ob sich eine Verschiebung der Amplifikationskurve in der qPCR wirkstoff-

und konzentrationsabhängig darstellt.


Da die Differenzierung von lebenden und toten Zellen bei Verwendung von DNA

interkalierenden Substanzen, wie EMA und PMA, auf dem Kriterium der

Membranintegrität der Zellen beruht, können bei Inaktivierungsverfahren von

Bakterien, die nicht zu einer Schädigung der zellulären Membran führen,

gegensätzliche Ergebnisse auftreten. Ein Beispiel hierfür ist die Abtötung von

Bakterien mittels UV-Strahlung. Bei diesem Inaktivierungsverfahren wird die DNA der

Zelle geschädigt, die Integrität der Zellmembran jedoch primär nicht beeinflusst

(SINHA und HADER 2002, CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Somit ist eine

Differenzierung lebender und toter Zellen mit membranundurchlässigen

Differenzierungsmitteln, wie EMA und PMA, bei diesem Verfahren schwer möglich.

Ein weiterer Nachteil beim Umgang mit DNA interkalierenden Substanzen, wie EMA

und PMA, ist die Toxizität der Stoffe. Für EMA und PMA liegen bislang noch keine

substanzspezifischen Toxizitätstestungen vor, aufgrund ihrer strukturellen

Verwandtschaft zu den Derivaten Ethidiumbromid bzw. Propidiumiodid und einem

ähnlichen Reaktionsmechanismus sollte jedoch von einem ähnlichen

Gefährdungspotential im Umgang mit diesen Stoffen ausgegangen werden. Die

Senatskommision der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) zur Prüfung

gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe hat Ethidiumbromid als kanzerogen deklariert

und stuft die mutagene Wirkung der Substanz als „begründet“ ein (DFG 2005).

Dementsprechend sollte auch bei den DNA interkalierenden Substanzen EMA und

PMA ein ähnliches Gefährdungspotential angenommen werden. Entsprechende

Schutzkleidung, wie Nitrilhandschuhe, und ein ordnungsgemäßer Umgang mit diesen

Substanzen sind hierbei unerlässlich. Zur Entsorgung ethidiumbromidhaltiger Abfälle

bestehen darüber hinaus gesonderte Regelungen nach der EU-Richtlinie

91/689/EWG für gefährliche Abfälle, die zum Beispiel eine Inaktivierung der

Substanzen in flüssiger Lösung durch Absorption an einen Aktivkohlefilter vorsieht.

Dieser Aktivkohlefilter ist anschließend als fester Sonderabfall zu entsorgen.

Aufgrund der strukturellen Verwandtschaft zu Ethidiumbromid ist bei der Entsorgung

der Substanzen EMA und PMA eine ähnliche Verfahrensweise zu empfehlen.


2.5. Zielstellung der Studie

Ein amtliches Verfahren zur schnellen und quantitativen Bestimmung von

Campylobacter spp. aus Lebensmittelmatrices ist derzeit nicht verfügbar. Zur

Etablierung von Minimierungsstrategien, welche zu einer Reduktion von

Campylobacter spp. in der Lebensmittelkette führen sollen, ist es jedoch notwendig,

geeignete sensitive und spezifische quantitative Nachweisverfahren zur Verfügung

zu haben.

Daher war es Ziel dieser Studie, die Eignung von interkalierenden Substanzen in

Kombination mit einer real-time PCR zu testen und somit eine „viability“-qPCR zu

etablieren, die eine schnelle Quantifizierung lebender Campylobacter-Zellen

ermöglicht. Als DNA-interkalierende Substanzen sollten EMA und PMA in

unterschiedlichen Konzentrationen verwendet werden, ihre Eignung zur

Unterscheidung von lebenden und toten Campylobacter vergleichend getestet

werden und Nachteile, die durch die Anwendung der Substanzen resultieren,

ermittelt werden. Die Methode sollte zunächst an Typstämmen von Campylobacter

etabliert sowie anschließend an verschiedenen Feldisolaten getestet werden.

Weiterhin war es Ziel der Untersuchungen, die Methodik für die Analyse von Proben

der Lebensmittelmatrix Geflügel anzupassen und zu klären, ob das

Methodenprotokoll auch für den Nachweis und die Quantifizierung von lebenden

Campylobacter spp. aus Wasserproben geeignet ist. Hierbei sollten zunächst

geeignete Bedingungen für die Isolierung der Keime aus Wasserproben ermittelt

werden, um eine anschließende “viability“-qPCR durchführen zu können.

Material und Methoden 33

3. Material und Methoden

3.1. Bakterien Stämme und Spezies-Bestimmung

Für die Versuche wurde der Typstamm C. jejuni DSM 4688T (Leibniz-Institut,

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig,

Deutschland) verwendet. Zur Testung der Methode an Feldisolaten wurden 16

C. jejuni- und C. coli-Feldisolate vom Geflügel aus der Institutssammlung des

Instituts für Lebensmittelqualtität und –sicherheit der Stiftung Tierärztliche

Hochschule Hannover eingesetzt. Die Bakterienstämme wurden als Kryokulturen bei

-80 °C gelagert. Die Anzucht der Isolate erfolgte auf „modified charcoal cefoperazone

desoxycholate agar“ (CCDA)-Platten (Oxoid, Wesel, Deutschland) für 24 Stunden

unter mikroaerober Atmosphäre (5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2). Die Bebrütungs-

temperatur wurde dabei auf 41,5 ± 1,0 °C festgelegt. Für eine kulturelle Keimzählung

wurde eine Bebrütungszeit von 48 Stunden verwendet. Zur Spezies-Bestimmung

wurde ein multiplex PCR-Nachweis durchgeführt, der eine Zielsequenz der 16S

rDNA zum Nachweis des Genus Campylobacter sowie Sequenzabschnitte des mapA

oder ceuE Genes zum Nachweis der Spezies C. jejuni oder C. coli amplifiziert

(Amtliche Methodensammlung des Friedrich-Loeffler-Institut 2014). Dabei wurde ein

Probenvolumen von 45 µl verwendet, welches 35,8 µl steriles Wasser, 5 µl PCR-

Pufferlösung (c=15mmol/l MgCl2), 2 µl Desoxynukleosidtriphosphat-Mix, 1 µl Primer

MD 16S1/S2, 1 µl Primer MD mapA1/A2, MD COL2/COL3 und 0,2 µl Taq-DNA-

Polymerase beinhaltete. Für die PCR wurde eine initiale Denaturierung für 60 sec.

bei 95 °C mit anschließenden 35 Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 30 sec.,

einem Annealingschritt bei 59 °C für 90 sec. und einer Elongationsphase bei 72 °C

für 60 sec. durchgeführt. Die abschließende Elongation wurde bei 72 °C für 5 min.

vorgenommen. Die PCR-Produkte wurden anschließend auf ein 1,5 %iges Agarose-

Gel aufgetragen. Der Genus-spezifische Nachweis erfolgt mit einem Amplifikat von

857 bp, das Spezies-spezifische Amplifikat für C. jejuni wird bei 589 bp und für

34 Material und Methoden

C. coli bei 462 bp detektiert (Amtliche Methodensammlung des Friedrich-Loeffler-

Institut 2014).

3.2. Inaktivierung von Campylobacter spp. und Keimzahlbestimmung

mittels kultureller Keimzählung

Zur Bestimmung der optimalen Abtötungstemperatur wurden Campylobacter-Zellen

(ca. 106 KbE/ml) verwendet, welche über 24 Stunden auf CCD-Agarplatten bebrütet

wurden. Diese werden im Folgenden als lebende Zellen bezeichnet. Nach

Resuspension der Zellen in 0,9 % NaCl wurden die Keimsuspensionen bei 60 °C,

65 °C, 70 °C und 75 °C in einem Wasserbad (GFL, Burgwedel, Deutschland) für 15

oder 20 min. inkubiert. Ein anschließendes Ausplattieren der Bakteriensuspensionen

auf Agarplatten diente zur Überprüfung auf vorhandenes bakterielles Wachstum.

Dafür wurden für jede Verdünnungsstufe jeweils 100 µl der Bakteriensuspension auf

10 CCD-Agarplatten ausplattiert und für 48 Stunden inkubiert. Das vollständige

Fehlen des Wachstums auf der Agarplatte wurde als erfolgreiche Abtötung der Zellen

gewertet. Die optimale Abtötungsmethode für Campylobacter spp. stellte sich bei

70 °C für 15 min. dar und wurde somit für die folgenden Versuche verwendet. Für die

Herstellung von Gemischen aus über 24 Stunden kultivierten (lebenden) und

hitzeinaktivierten Zellen wurden die Zellen im Verhältnis 1:1, 1:10, 1:100 und 1:1000

(lebend:tot) gemischt. Für die Einstellung der Keimkonzentration wurden 4 - 5

Campylobacter-Kolonien von einer 24 Stunden bebrüteten Agarplatte in 0,9 % NaCl

gelöst und auf einen McFarland Standard von 0,5 eingestellt. Für die kulturelle

Keimzählung und zur Bestätigung der eingestellten Keimkonzentrationen wurden

serielle Verdünnungsreihen der Bakterienkultur in Verdünnungen von 10-1 bis 10-6

hergestellt und 100 µl der Keimsuspension auf jeweils 10 CCD-Agarplatten

ausgespatelt. Anschließend wurden die Agarplatten für 48 Stunden bei 41,5 ± 1,0 °C

in mikroaerober Atmosphäre bebrütet. Die Keimkonzentration wurde aus dem

gewichteten Mittelwert von Agarplatten mit 100-300 auszählbaren

Kolonien/Agarplatte bestimmt.


3.3. EMA- und PMA- Behandlung der Bakterienproben

Die lyophilisierten EMA (Invitrogen, Darmstadt, Deutschland) und PMA (VWR,

Darmstadt, Deutschland) Feststoffe wurden in 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO)

gelöst und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Sie wurden der

bakteriellen Suspension in Endkonzentrationen von 10 µg/ml (23,81 µmol/l) EMA

sowie 100 µg/ml (238,10 µmol/l) EMA oder 25,55 µg/ml (50 µmol/l) PMA und 51,10

µmol/l (100 µmol/l) PMA zugegeben. Die Proben wurden anschließend für 15 min. im

Dunkeln bei einer Temperatur von 22 ± 1 °C unter mehrmaligem Schwenken

inkubiert und für weitere 15 min. mit einer 500 W Halogenlampe (Düwi Typ R7s, REV

Ritter, Mömbris, Deutschland) belichtet, um die photoinduzierte Bindung der

Substanzen an die DNA zu aktivieren. Dazu wurde die Halogenlampe in einem

Abstand von 20 cm zu den Proben platziert. Zur Verhinderung übermäßiger

Erhitzung wurden die Proben während der Belichtung in einem eisgekühlten

Probenständer gelagert. Um den Lichteinfall nicht zu behindern, wurden dabei die

Deckel der Probengefäße geöffnet.

3.4. DNA Isolierung und qPCR Experimente

Zur Isolierung genomischer DNA wurde das DNeasy blood and tissue kit (QIAGEN,

Hilden, Deutschland) eingesetzt und die Isolierung nach Herstellerangaben

durchgeführt. Für die quantitative real-time PCR zum Nachweis von Campylobacter

spp. wurde das SureFood® PATHOGEN Campylobacter PLUS LC Kit (Congen,

Berlin, Deutschland) verwendet, welches die drei Spezies Campylobacter jejuni,

C. coli und C. lari detektiert. Hierbei wird ein 287-bp großes Amplikat des Zielgens

der 16S rRNA amplifiziert. Die Detektionsgrenze dieses Kits ist vom Hersteller mit ≤ 5

Kopien/Probe angegeben. Das 25 µl PCR-Probenvolumen beinhaltete 18,6 µl

Campylobacter Plus LC reaction mix, 1,1 µl fluorescence detection setup (FDE),

0,3 µl Taq-Polymerase und 5 µl template DNA. Die PCR-Reaktion wurde bei 95 °C

für 60 sec. mit anschließenden 45 Zyklen bei 95 °C für 10 sec. und 60 °C für 15 sec.


durchgeführt. Bei jedem Reaktionsansatz wurden Postiv-, Negativ- und

Extraktionskontrollen, ein DNA-Standard mit bekannter Konzentration sowie eine

interne Amplifikationskontrolle mitgeführt. Die qPCR Experimente wurden mit einem

LightCycler 480 II Gerät (Roche, Diagnostics, Mannheim, Deutschland) durchgeführt.

Die Gerätesoftware wurde verwendet, um den „Threshold cycle“ (Ct-Wert) mittels der

„Second Derivate Maximum“-Methode zu bestimmen. Zur Berechnung der Anzahl

lebender Campylobacter-Zellen in der Probe wurde ein interner DNA-Standard aus

EMA behandelten Zellen verwendet und zusammen mit einer EMA-Standardkurve

für die Berechnungen genutzt, um die Verschiebung der Ct-Werte durch die

Verwendung des Differenzierungsmittels auszugleichen. Die Berechnung der

Keimkonzentration aus den ermittelten Ct-Werten unter Verwendung der

Standardkurve erfolgte mittels der Gerätesoftware. Jeder Versuch wurde in drei

unabhängigen Wiederholungen getestet.

3.5. Ermittlung der Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung von

hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen

Zur Bestimmung der Signalreduktion unter Verwendung der interkalierenden

Substanzen (Differenzierungsmittel) bei hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen

wurden serielle Verdünnungsreihen von C. jejuni DSM 4688 (mit einem

Ausgangskeimgehalt von 2,34 x 107 - 2,99 x 107) hergestellt und mit den

Differenzierungsmitteln EMA oder PMA versetzt. Dabei wurden die

Differenzierungsmittel in Konzentrationen von 10 µg/ml EMA und 100 µg/ml EMA

sowie 25,55 µg/ml PMA und 51,10 µg/ml PMA eingesetzt und die Proben, wie in

Abschnitt 3.3. beschrieben, weiter bearbeitet. Nach Isolierung der genomischen DNA

wurden die Keimgehalte mittels qPCR und EMA-qPCR bestimmt. Zudem wurden die

hitzeinaktivierten Zellen einer EMA-Doppelbehandlung unterzogen. Dabei wurden die

Proben mit 10 µg/ml EMA versetzt und nach Inkubation im Dunkeln einer Belichtung

unterzogen, um eine Bindung von EMA an die DNA zu induzieren. Bei diesem

Belichtungsschritt wurden zudem überschüssige, ungebundene EMA-Moleküle in der

Lösung inaktiviert. Direkt im Anschluss daran wurde eine zweite Behandlung der


Bakteriensuspension mit EMA in Endkonzentrationen von 10 µg/ml durchgeführt. Die

weitere Bearbeitung der Proben erfolgte wie beschrieben. In allen Versuchsansätzen

wurden Kontrollproben von unbehandelten, hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen

mitgeführt. Die Versuche wurden in drei unabhängigen Wiederholungen getestet.

3.6. Testung der EMA-qPCR Methode zum Nachweis lebe nder

Campylobacter-Zellen auf Geflügelfleischproben

Für die Testung der EMA-qPCR Methode an der Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch

wurden tiefgekühlte Hühnerschenkel mit Rückenstück aus dem Einzelhandel

verwendet und bei -20 °C bis zur weiteren Probenbearbeitung gelagert. Nach dem

Auftauen der Hühnerschenkel für 14 Stunden bei 21 ± 1 °C wurden die Proben mit

unterschiedlichen Konzentrationen (KbE/ml) an lebenden, hitzeinaktivierten oder

Gemischen aus lebenden und hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen (1:10, 1:100

und 1:1000 lebenden zu toten Zellen) versetzt. Anschließend erfolgte eine Inkubation

der Proben für 20 min. bei einer Temperatur von 21 ± 1 °C. Zur Reisolierung der

Keime wurden die Hühnerschenkel in sterile Stomacherbeutel verbracht und mit

100 ml NaCl (0,9 %) für 2 min. geschüttelt. Der Keimgehalt in der NaCl-Suspension

wurde mittels qPCR und EMA-qPCR bestimmt und nach serieller Verdünnung der

Bakteriensuspension mit den Ergebnissen der mikrobiologischen Keimzählung

verglichen.

3.7. Isolierung von Campylobacter-Zellen aus Wasserproben

Um eine geeignete Methode zur Aufkonzentrierung von Campylobacter spp. aus

Wasserproben zu ermitteln, wurden die Membranfiltrationsmethode und die

Zentrifugationsmethode vergleichend untersucht. Dafür wurden serielle

Verdünnungsreihen von Campylobacter jejuni DSM 4688 in NaCl (0,9 %) hergestellt.

Bei diesen Versuchsreihen wurde NaCl verwendet, um einen Einfluss des

osmotischen Drucks auf die Zellen auszuschließen.


Bei der Filtrationsmethode wurden 10 ml von jeder Keimverdünnung durch einen

Zellulose Ester Membranfilter (Biosart 100 Monitore, 0,45 µm Porengröße, Sartorius,

Göttingen, Deutschland) mittels einer Vakuumpumpe (Typ MP 1 Pfeiffer, Asslar,

Deutschland) filtriert. Anschließend wurden die Filter mit 10 ml NaCl (0,9 %)

nachgespült, um an der Gefäßwand anhaftende Bakterien zu entfernen. Mit einer

sterilen Pinzette wurde der Membranfilter in einen Erlenmeyerkolben mit 10 ml NaCl

(0,9 %) überführt und zur Reisolierung der Keime von der Filtermembran für 2 min.

gevortext.

Für die Zentrifugationsmethode wurde von jeder seriellen Verdünnungsstufe der

Keime in NaCl ein Probenvolumen von 100 ml verwendet und die Keimsuspensionen

für 15 min. bei 5141 x g zentrifugiert. Der Zentrifugationsüberstand wurde

anschließend abgesaugt und das Bakterienpellet in 1 ml 0,9 % NaCl resuspendiert.

Die Keimgehalte wurden mittels der qPCR, der EMA-qPCR und der

mikrobiologischen Keimzählung in drei unabhängigen Wiederholungen bestimmt.

3.8. Testung von Oberflächenwasser-, Leitungswasser -, Mineralwasser-

und Regenwasserproben

Zur Testung des Einflusses von verschiedenen Wasserarten auf die Ergebnisse der

EMA-qPCR Methode wurden Oberflächenwasser- und Leitungswasserproben

untersucht und mit den Ergebnissen einer mit Campylobacter spp.-gespikten

Kontrolle aus 0,9 % NaCl verglichen. Das Oberflächenwasser wurde von einem

Teich aus Isernhagen, Deutschland, entnommen. Die Leitungswasserproben wurden

aus der öffentlichen Trinkwasserversorgung (Hannover, Deutschland) gezogen. Die

Wasserproben wurden mit verschiedenen Konzentrationen an lebenden C. jejuni und

C. coli oder Gemischen aus lebenden und toten Zellen (1:10, 1:100 lebend zu tot)

versetzt und der Keimgehalt mit der qPCR Methode, der EMA-qPCR Methode und

der mikrobiologischen Keimzählung bestimmt. Um die EMA-qPCR Methode an

weiteren Wasserarten zu testen wurden Regenwasser- und Mineralwasserproben

untersucht. Das Regenwasser wurde in Hannover, Deutschland, gesammelt und das


Mineralwasser ohne Kohlensäure (EDEKA, Hamburg, Deutschland) aus dem

Einzelhandel bezogen. Die Keimkonzentrationen wurden in jeweils drei

unabhängigen Wiederholungen ermittelt.

3.9. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen

Die fluoreszenzmikroskopische Methode wurde eingesetzt, um Veränderungen der

Integrität der bakteriellen Zellmembran, welche durch die

Aufkonzentrierungsmethoden oder durch die verschiedenen Wasserarten

hervorgerufen wurden, zu ermitteln. Dafür wurden die DNA-interkalierenden

Farbstoffe Propidiumiodid (rot) zur Färbung der membrangeschädigten Zellen und

SYTO® 9 (grün) zur Färbung membranintakter Zellen verwendet (im Verhältnis 1:1).

Die Farbstoffe wurden einem Probenvolumen von 1 ml zugesetzt (LIVE/DEAD®

BacLight™ Bacterial Viability Kit, Invitrogen, Darmstadt, Deutschland). Die Proben

wurden für 10 min. im Dunkeln inkubiert und anschließend bei 3000 rpm für 5 min.

zentrifugiert, um die Zellen zur mikroskopischen Auswertung auf den Boden der

Mikrotiterplatte abzusenken. Die mikroskopische Auswertung wurde mit einem Leica

Konfokalmikroskop DMI6000CS durchgeführt (Leica Microsystems, Wetzlar,

Germany) und dabei ein HCX PL APO lambda blue 63.0 x 1.40 Öl UV-Objektiv

verwendet. Für jede Probe wurden mindestens sechs fluoreszenzmikroskopische

Bilder in die Auswertung einbezogen, um den Mittelwert der prozentualen Anteile

gefärbter Zellen zu berechnen. Dabei stellten sich lebende Zellen rot dar, tote Zellen

waren grün und intermediäre Zellen orange gefärbt. Alle Versuche wurden in drei

unabhängigen Wiederholungen durchgeführt.

3.10. Statistische Auswertungen

Für die Berechnung der Keimkonzentration einer Probe mittels der erstellten

Standardkurve wurde die LightCycler Software (Roche) verwendet. Die Berechnung

der PCR-Effizienz erfolgte mittels der Formel E = 10(-1/S) – 1. Dafür wurde die

Steigung (S) der Standardkurve aus seriellen Verdünnungen von C. jejuni DSM 4688


(KbE/ml) in Abhängigkeit von den ermittelten Ct-Werten der qPCR berechnet. Die

statistischen Auswertungen wurden mittels der GraphPad Prism 6® Software

(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Zum Vergleich der

mathematisch berechneten Werte mit den experimentell erzielten Resultaten einer

Signalreduktion bei Anwendung von EMA und PMA, wurde die two-way ANOVA

Analyse mit einem „Sidak´s multiple comparison“ post-hoc Test verwendet. Die

statistische Signifikanz aus den Ergebnissen der mikrobiologischen Keimzählung und

den Ergebnissen der qPCR oder der fluoreszenzmikroskopischen Auswertung wurde

mittels one-way ANOVA Analyse, mit sich anschließendem „Dunett`s multiple

comparison test“ für nicht wiederholte Messungen oder „Tukey´s multiple comparison

test“ für wiederholte Messungen, ermittelt. Das Signifikanzniveau wurde dabei auf

0,05 festgelegt. Um einen Vergleich zwischen den Ergebnissen der

mikrobiologischen Keimzählung und den Ergebnissen der qPCR zu erlangen, wurde

die Pearson-Regressionsanalyse eingesetzt. Dafür wurde die Microsoft Excel

Software verwendet. Zusätzlich dazu wurde die Bland-Altman Analyse nach

GROUVEN et al. (2007) eingesetzt, um einen Vergleich der Ergebnisse aus beiden

Methoden zu erzielen.

Zusammenfassung der Ergebnisse 41

4. Zusammenfassung der Ergebnisse

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden in zwei Kapitel untergliedert. Im

ersten Abschnitt werden die Ergebnisse der Analysen zur Austestung der Eignung

einer qPCR-Methode zum Nachweis lebender Campylobacter-Zellen beschrieben.

Im zweiten Abschnitt erfolgte die Anwendung der etablierten Methode an der

Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch und die Testung der qPCR-Methode für den

Nachweis von Campylobacter spp. aus Wasserproben.

4.1. Kapitel I – Resultate der Methodenentwicklung

4.1.1. Untersuchungen zur Quantifizierung von Campylobacter spp. mittels

einer qPCR-Methode

Um mit einer qPCR-Analyse eine Quantifizierung von Campylobacter-Zellen in einer

Probe durchführen zu können, wurde zunächst eine Standardkurve unter

Verwendung serieller Verdünnungen von bekannten Keimkonzentrationen an

C. jejuni DSM 4688 erstellt. Die Keimkonzentrationen von C. jejuni wurden zuvor mit

der mikrobiologischen Keimzählung bestimmt. Anschließend wurde mittels der

Gerätesoftware eine Gerade erstellt, bei der die in der qPCR erhaltenen Ct-Werte auf

der X-Achse und die durch die Standardmethode (mikrobiologische Keimzählung)

erhaltenen Keimkonzentrationen auf der Y-Achse aufgetragen wurden (s. Abbildung

1). Die so erstellte Standardkurve zeigte einen linearen Verlauf im Bereich von 1,85 x

102 bis 1,85 x 108 KbE/ml. In diesem Bereich kann die Standardkurve somit zur

Detektion von Campylobacter spp. genutzt werden, wobei 102 KbE/ml als

Detektionsgrenze definiert wurde. Die Steigung dieser Standardkurve war mit -3,34

sehr nah an dem idealen Wert von 3,32 Ct-Werten pro Zunahme der

Keimkonzentration um eine log10-Stufe. Zur Berechnung der PCR-Effizienz (E)

42 Zusammenfassung der Ergebnisse

wurde die Formel E = 10(-1/S) - 1 verwendet. Mittels dieser Formel konnte eine hohe

PCR-Effizienz von 98,9 % errechnet werden.

Später wurde ein interner DNA-Standard mit bekannter Keimkonzentration von

C. jejuni DSM 4688 hergestellt und zusammen mit der erstellten Standardkurve zur

Berechnung der Keimkonzentration in einer Probe mit unbekannter

Keimkonzentration verwendet. Zur Charakterisierung der qPCR wurde ein Vergleich

der Ergebnisse aus der qPCR (aus den Ct-Werten berechnete Keimkonzentrationen)

und der mikrobiologischen Keimzählung durchgeführt. Die Korrelation der Methoden

wurde mittels Pearson-Regressionsanalyse dargestellt und dabei konnte ein hoher

Korrelationskoeffizient von R2=0,997 errechnet werden, so dass hierbei eine gute

Übereinstimmung der Ergebnisse aus beiden Detektionsmethoden ermittelt werden

konnte.

Abbildung 1: Standardkurve, erstellt aus seriellen Verdünnungsreihen von C. jejuni

DSM 4688 in drei unabhängigen Wiederholungen

4.1.2. Bestimmung des Einflusses von EMA und PMA au f die Ergebnisse

der qPCR

In einem nächsten Schritt wurde getestet, ob durch den Einsatz der

Differenzierungsmittel EMA und PMA die Ergebnisse der qPCR beeinträchtigt

werden. Dafür wurden 24 Stunden auf Agarplatten bebrütete C. jejuni DSM 4688-

Zellen (welche im Folgenden als lebende Zellen bezeichnet werden) mit

unterschiedlichen Konzentrationen der beiden Differenzierungsmittel versetzt


(10 µg/ml EMA und 100 µg/ml EMA; 25,55 µg/ml PMA und 51,10 µg/ml PMA) und im

Vergleich zu unbehandelten Zellen untersucht. Zur Kontrolle, ob das Lösungsmittel

DMSO (2 %) die Ergebnisse beeinträchtigt, wurde eine Kontrollprobe mit dem

Lösungsmittel DMSO (2 %) mitgeführt.

Bei Verwendung der Differenzierungsmittel EMA und PMA oder dem Lösungsmittel

DMSO kam es zu einer Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR im Vergleich zu den

unbehandelten Zellen. Die Verschiebung der Ct-Werte zeigte sich bei EMA deutlicher

als bei Verwendung von PMA und stellte sich zudem konzentrationsabhängig dar.

Eine signifikante Erhöhung der Ct-Werte bei Verwendung lebender Campylobacter-

Zellen konnte bei Einsatz von EMA 10 µg/ml und EMA 100 µg/ml sowie bei PMA in

der Konzentration von 51,10 µg/ml beobachtet werden (s. Tabelle 3). Bei

Verwendung von EMA 100 µg/ml war diese Verschiebung am deutlichsten

ausgeprägt und betrug im Mittelwert 11,84 ± 3,70 SD Ct-Werte. Aufgrund dieser

hohen Ct-Verschiebung wurde EMA in der Konzentration von 100 µg/ml für die

weiteren Versuche nicht mehr verwendet. Eine graphische Darstellung der

Ergebnisse ist in Abbildung 1 der Publikation 1 aufgeführt.


Tabelle 3: Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung der Differenzierungsmittel

EMA und PMA oder dem Lösungsmittel DMSO (2%)

4.1.3. Nachweis lebender Campylobacter-Zellen in Gemischen aus

lebenden und hitzeinaktivierten Zellen

Um die Differenzierungskraft von EMA und PMA in Gemischen aus lebenden und

toten Zellen zu bestimmen, wurden Keimsuspensionen mit unterschiedlichen

Konzentrationen an lebenden und toten Zellen hergestellt (100 %, 50 %, 10 %, 1 %

oder 0,1 % lebende Zellen). Die Differenzierungsmittel EMA und PMA wurden

anschließend in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt (10 µg/ml EMA, 51,10

µg/ml PMA und 25,55 µg/ml PMA) und der Keimgehalt der Proben mittels qPCR

bestimmt. Die durch membrangeschädigte, tote Zellen resultierende Erhöhung der

Ct-Werte in der qPCR wurde gemäß NOCKER et al. (2007) als Signalreduktion

definiert. Zur Ermittlung der Signalreduktion in der qPCR wurde die Differenz der Ct-

Werte aus den mit Differenzierungsmittel behandelten Zellen und den unbehandelten

Zellen berechnet.


Bei Verwendung der Differenzierungssubstanzen konnte in allen getesteten

Konzentrationen von EMA und PMA eine Zunahme der Signalreduktion bei

steigender Konzentration an toten Zellen erzielt werden. Eine Ausnahme bildete

hierbei PMA in der Konzentration von 25,55 µg/ml, bei deren Einsatz keine weitere

Signalreduktion erreicht wurde, wenn weniger als 10 % lebende Zellen in der Probe

enthalten waren. Diese Ergebnisse sind in der Publikation 1 in Abbildung 2

dargestellt.

Um nun die Differenzierungskraft von EMA und PMA zu bestimmen, wurde die in den

Versuchen experimentell erzielte Signalreduktion mit dem jeweiligen theoretisch zu

erwarteten Wert verglichen. Als theoretisch erwarteter Wert wird eine Reduktion um

3,32 Ct-Werte in der qPCR erwartet, wenn die Keimkonzentration lebender Zellen um

eine log10-Stufe abnimmt. Bei einem Auftragen der erzielten Ct-Werte in der qPCR

gegen die eingesetzte Keimkonzentration lebender Zellen (durch mikrobiologische

Keimzählung bestimmt) kann die Signalreduktion in Form der Steigung einer

Geraden, welche durch die Messwerte gelegt wurde, abgelesen werden. Bei

Verwendung von EMA 10 µg/ml in den Versuchsreihen wurde eine Steigung von

-3,27 berechnet, welches einer Signalreduktion von -3,27 Ct-Werten pro log10-

Abnahme lebender Zellen entspricht. Auch bei Verwendung von PMA 51,10 µg/ml

konnte eine noch relativ nahe am theoretischen Wert liegende Signalreduktion von

-2,97 Ct-Werten pro log10-Abnahme lebender Zellen in Gemischen aus lebenden und

toten Zellen erzielt werden. Ausnahme bildete hierbei PMA in der Konzentration von

25,55 µg/ml, bei dessen Einsatz eine signifikante Abweichung (Steigung -1,24) im

Vergleich zum mathematisch erwarteten Wert der Regressionssteigung von -3,32 zu

verzeichnen war. Somit zeigte sich PMA 25,55 µg/ml als nicht ausreichend zur

Differenzierung lebender Zellen in Gemischen aus lebenden und toten Zellen.


4.1.4. Limitierungen von EMA und PMA bei Verwendung von

hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen in der qPCR

Um zu prüfen, ob EMA und PMA zu einer kompletten Signalreduktion in der qPCR

bei Verwendung ausschließlich toter Campylobacter-Zellen in der Probe führen,

wurden hitzeinaktivierte Zellen in Keimkonzentrationen von 107 - 102 KbE/ml

eingesetzt. Diese wurden mit beiden Differenzierungsmitteln in unterschiedlichen

Konzentrationen (10 µg/ml EMA, 51,10 µg/ml PMA und 25,55 µg/ml PMA) behandelt

und anschließend in die qPCR eingesetzt. Bei Verwendung von bis zu 104 KbE/ml

toten Zellen konnte mit beiden Differenzierungsmitteln in allen getesteten

Konzentrationen eine vollständige Signalreduktion (definiert als Ct-Wert >35) erzielt

werden. Wurden Konzentrationen toter Zellen von 105 KbE/ml eingesetzt, konnte nur

mit dem Differenzierungsmittel PMA eine vollständige Signalreduktion erreicht

werden. Bei Verwendung höherer Keimkonzentrationen (>106 KbE/ml) in den

untersuchten Proben vermochten beide Differenzierungsmittel EMA und PMA keine

vollständige Signalreduktion erbringen. Dennoch konnte bei allen getesteten,

hitzeinaktivierten Proben eine signifikante Signalreduktion (5,51 bis 9,85 Ct-Werte) im

Vergleich zu den unbehandelten Zellen erreicht werden. Eine Doppelbehandlung der

Zellen mit 10 µg/ml EMA konnte die Ergebnisse deutlich verbessern, so dass bei

Keimkonzentrationen bis zu 106 KbE/ml Ct-Werte von >35 in der qPCR erzielt

wurden. Eine graphische Darstellung der Ergebnisse befindet sich in der Abbildung 3

der Publikation 1.

4.1.5. Erstellung von Standardkurven mit Zugabe von EMA und PMA

Da sich EMA 10 µg/ml und PMA 51,10 µg/ml als geeignet zur Differenzierung

lebender und toter Campylobacter-Zellen erwiesen haben, wurden in einem nächsten

Schritt die Standardkurven, welche zur Berechnung der Keimkonzentration an

lebenden Zellen in einer Probe benötigt werden, unter Verwendung von EMA und

PMA erstellt. Dieser Schritt erschien notwendig, da die Standardkurven prinzipiell auf


die Versuchsbedingungen angepasst werden müssen. Diese beiden Standardkurven

wurden in drei unabhängigen Wiederholungen erstellt, um die Konstanz und

Linearität der Ct-Wert-Verschiebung bei Einsatz der Differenzierungsmittel zu testen.

Anschließend wurden die mit EMA und PMA erstellten Standardkurven mit der

unbehandelten Standardkurve (Kontrolle) vergleichend untersucht. Der Einsatz

beider Differenzierungsmittel resultierte dabei in einer Verschiebung der

Standardkurve im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Diese Verschiebung war

bei Verwendung von EMA konstant und unabhängig von der eingesetzten

Keimkonzentration, so dass eine gute Übereinstimmung der Steigung beider

Geraden erzielt werden konnte (-3,346 bei einer Vorbehandlung mit EMA 10 µg/ml

und -3,349 bei der unbehandelten Kontrolle). Bei Verwendung von PMA 51,10 µg/ml

wurden jedoch andere Ergebnisse erzielt. Hierbei stellte sich die Verschiebung der

Standardkurve nicht parallel zu der unbehandelten Kontrolle dar, sondern die

Verschiebung zeigte sich abhängig von der eingesetzten Keimkonzentration. Dabei

wurden bei steigenden Keimkonzentrationen im Verhältnis niedrigere Ct-Werte in der

qPCR ermittelt. Demzufolge war eine Abweichung der Steigung der Geraden im

Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen festzustellen (-3,603). Um einen

Vergleich der Korrelationskoeffizienten mit und ohne Zugabe der

Differenzierungsmittel zu erzielen, wurde die Pearson-Regressionsanalyse

verwendet. Bei Verwendung von EMA sowie der unbehandelten Kontrolle konnten

hohe Korrelationskoeffizienten erzielt werden (R2=0,977). Obwohl auch bei Einsatz

von PMA ein hoher Korrelationskoeffizient ermittelt werden konnte (R2=0,989), zeigte

die Standardkurve mit Zugabe von PMA eine Verschiebung im Vergleich zu der

unbehandelten Kontrollkurve, welches in Abbildung 4 der Publikation 1 gezeigt ist.

Anhand der besseren Resultate bei Verwendung von EMA wurde daraufhin EMA in

der Konzentration von 10 µg/ml für die weiteren Untersuchungen ausgewählt und für

alle folgenden Versuche verwendet.

Aufgrund einer Verschiebung der Ct-Werte bei Einsatz des Differenzierungsmittels

EMA wurde ein interner DNA-Standard aus EMA behandelten Zellen verwendet und

bei allen weiteren Untersuchungen mitgeführt. Nur so konnte die Keimkonzentration

an lebenden Campylobacter-Zellen in der Probe korrekt bestimmt werden. Dieser


DNA-Standard wurde zusammen mit der EMA-Standardkurve für alle folgenden

Versuche verwendet.

4.1.6. Methodenvergleichsuntersuchung zwischen den Ergebnissen aus

der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Referenzmeth ode

Um einen Vergleich der Ergebnisse aus der EMA-qPCR und der klassisch-

mikrobiologischen Keimzählung zu ermöglichen, wurde die Pearson-

Regressionsanalyse und die Bland-Altman Analyse eingesetzt. Die Pearson-

Regressionsanalyse diente zur Darstellung der Korrelation zwischen der klassisch-

mikrobiologischen Keimzählung und den Ergebnissen der berechneten

Keimkonzentrationen aus der qPCR. Die Bland-Altman Analyse wurde zur

Berechnung der Übereinstimmung der beiden Detektionsmethoden eingesetzt. Für

diese Vergleichsuntersuchungen wurden die Keimkonzentrationen von 16

Feldisolaten sowie den Typstämmen C. jejuni DSM 4688 und C. coli DSM 4689,

welche mit der EMA-qPCR berechnet und parallel dazu mit der mikrobiologischen

Keimzählung ermittelt wurden, vergleichend untersucht. Bei Verwendung von

lebenden Campylobacter-Zellen konnte mittels Pearson-Regressionsanalyse ein

hoher Korrelationskoeffizient von R2=0,947 mit einer Steigung der Geraden von

1,029 erzielt werden. Auch bei einer Methodenvergleichsuntersuchung mittels der

Bland-Altman Analyse konnte eine gute Übereinstimmung der Methoden erzielt

werden, hierbei wurde eine mittlere Differenz der Resultate im Vergleich der

Methoden von -0,047 mit einer Standardabweichung von 0,461 errechnet. Die 95 %

Grenzen der Übereinstimmung betrugen 0,856 (obere Grenze) und -0,951 (untere

Grenze), so dass eine hohe Übereinstimmung der beiden Detektionsverfahren erzielt

werden konnte.

In einem nächsten Schritt wurde die Methodenvergleichsuntersuchung auch mit

Gemischen aus lebenden und toten (bis zu 1:1000 lebenden zu toten Zellen)

Campylobacter-Zellen durchgeführt. Ebenso wie bei Verwendung der lebenden

Zellen wurde auch bei den Versuchsreihen mit Gemischen aus lebenden und toten


Zellen eine hohe Übereinstimmung der Messwerte aus beiden Detektionsmethoden

erzielt. Dabei wurde ein hoher Korrelationskoeffizient von R2=0,99 mit einer Steigung

der Geraden von 1,022 errechnet. Die gute Übereinstimmung der beiden Methoden

wurde zudem mit einer Bland-Altman Analyse bestätigt, in welcher ein Mittelwert der

Differenzen von -0,136 ± 0,175 SD log10 KbE und 95 % Übereinstimmungsgrenzen

von 0,479 und -0,207 log10 KbE ermittelt werden konnten. Somit ist es mit der EMA-

qPCR Methode möglich, äquivalente Ergebnisse zur mikrobiologischen

Referenzmethode zu erzielen.

4.2. Kapitel II – Resultate der Anwendung der Metho de an Lebensmitteln

Nach Etablierung der EMA-qPCR Methode für den Nachweis von lebenden

Campylobacter-Zellen wurde die Methode in einem nächsten Schritt an

unterschiedlichen Lebensmittelmatrices wie bei Geflügelfleisch und Wasserproben

getestet.

4.2.1. Anwendung der EMA-qPCR zum Nachweis lebender Campylobacter-

Zellen auf gespikten Hühnerfleischproben

Da kontaminiertes Geflügelfleisch die Hauptquelle humaner Campylobacteriosen

darstellt, wurde die EMA-qPCR Methode für den Nachweis und die Differenzierung

lebender Campylobacter auf Geflügelfleisch getestet. Dafür wurden der Typstamm

C. jejuni DSM 4688 sowie verschiedene Feldisolate von C. jejuni (n=7) und C. coli

(n=9) in unterschiedlichen Konzentrationen (bis zu 106 KbE/ml) auf

Hühnerschenkelproben mit Rückenstück aufgebracht. Die Keime wurden

anschließend reisoliert und die Keimkonzentrationen der Bakterien vergleichend

mittels der qPCR, der EMA-qPCR Methode sowie mit der mikrobiologischen

Keimzählung bestimmt. Die in dieser Studie verwendeten Geflügelfleischproben aus

dem Einzelhandel zeigten hierbei bereits eine natürliche Kontamination mit

Campylobacter spp., welche trotz Tiefkühlung der Geflügelstücke mittels


mikrobiologischer Keimzählung detektiert werden konnten. Die Keimkonzentrationen

lagen dabei zwischen 102-103 KbE/ml pro verwendetem Hühnerteilstück.

Bei den mit lebenden Campylobacter-Zellen versetzten Geflügelfleischproben konnte

eine hohe Übereinstimmung der Resultate aus der EMA-qPCR im Vergleich zur

mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden. Die Korrelation der Ergebnisse

ließ sich durch einen hohen Korrelationskoeffizienten von R2=0,95 mit einer Steigung

der Geraden von 1,221 berechnen. Zudem konnte die gute Übereinstimmung der

beiden Methoden mittels einer Bland-Altman Analyse verifiziert werden (mittlere

Differenz von -0,648 ± 0,564 (SD) log10 KbE mit einem 95 % Limit der

Übereinstimmung von 0,458 und -1,754 log10 KbE).

In einem nächsten Schritt wurden die Geflügelfleischproben mit unterschiedlichen

Gemischen aus lebenden und hitzeinaktivierten C. jejuni DSM 4688 versetzt. Die

Keimkonzentration auf den Geflügelteilstücken wurde dann mittels EMA-qPCR und

mikrobiologischer Referenzmethode vergleichend bestimmt. Während bei der

Keimkonzentrationsbestimmung mittels qPCR ohne vorherige Zugabe von EMA eine

konstante Keimzahl von 5,160 ± 0,117 (SD) log10 KbE unabhängig von der

Konzentration lebender Zellen auf den Hühnerfleischproben ermittelt wurde, konnte

unter Verwendung von EMA die Überlegenheit der EMA-qPCR Methode dargestellt

werden. Dabei konnten im Gegensatz zu den Resultaten ohne Einsatz von EMA in

der qPCR mit Zugabe von EMA steigende Ct-Werte bei steigenden Konzentrationen

an toten Zellen errechnet werden. In Analogie zu den Ergebnissen der lebenden

Campylobacter-Zellen konnte auch bei Gemischen aus lebenden und toten Zellen

auf Geflügelfleisch ein hoher Korrelationskoeffizient (R2=0,840; Steigung der

Geraden von 0,966) aus den Ergebnissen der EMA-qPCR und der mikrobiologischen

Referenzmethode erzielt werden. Die graphische Darstellung der Ergebnisse ist in

der Publikation 1 in Abbildung 6 ersichtlich. Darüber hinaus konnte die

Übereinstimmung der Methoden mittels Bland-Altman Analyse bestätigt werden, bei

der eine mittlere Differenz der beiden Methoden von 0,214 ± 0,462 (SD) log10 KbE

sowie unteren und oberen 95 % Übereinstimmungsgrenzen von -0,691 und 1,119

errechnet wurden.


4.2.2. Vergleichende Untersuchung der Membranfiltra tions- und

Zentrifugations-methode zur Isolierung von Campylobacter-Zellen

aus Wasser

Da bei der bakteriellen Untersuchung von Wasserproben in der Regel ein

Aufkonzentrierungsschritt nötig ist, wurden die beiden häufig verwendeten

Aufkonzentrierungsmethoden der Zentrifugation und der Membranfiltration zur

Isolierung von C. jejuni DSM 4688 aus Wasserproben vergleichend getestet. Dafür

wurden serielle Verdünnungsreihen von lebenden C. jejuni (von 107 - 101 KbE/ml) in

NaCl (0,9 %) hergestellt. Die physiologische Kochsalzlösung wurde verwendet, um

einen schädigenden Effekt des Wassers auf die Zellen durch den osmotischen Druck

zu verhindern. Die Keimkonzentrationen wurden vor und nach der Zentrifugation und

Filtration der Proben mit der mikrobiologischen Keimzählung bestimmt. Alle

Versuche wurden in drei unabhängigen Wiederholungen durchgeführt, um den

Mittelwert des Zellverlustes zu ermitteln. Bei Verwendung von beiden

Aufkonzentrierungsmethoden zeigte sich ein Verlust an Campylobacter-Zellen. Im

Vergleich der beiden Methoden konnte bei der Zentrifugationsmethode ein signifikant

(p<0,05) höherer Zellverlust als bei der Filtrationsmethode detektiert werden. Bei der

Zentrifugationsmethode betrug der Zellverlust 1,08 ± 0,021 SD log10 KbE/ml, bei der

Filtrationsmethode war der Zellverlust mit 0,73 ± 0,161 SD log10 KbE/ml etwas

geringer (p<0,05). Dieser Zellverlust zeigte sich jedoch unabhängig von der

Keimkonzentration der Campylobacter-Zellen in der gespikten Probe.

4.2.3. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der pro zentualen Anteile

lebender und toter Campylobacter-Zellen bei Verwendung der

Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode

Um zu ermitteln, ob durch die Verwendung der Zentrifugations- und

Membranfiltrationsmethode die prozentualen Anteile lebender und toter

Campylobacter-Zellen beeinflusst werden, wurde die Fluoreszenzmikroskopie

eingesetzt. Dafür wurden mit Campylobacter-Zellen (zwischen 3,0 x 105 - 1,5 x 106


KbE/ml C. jejuni DSM 4688) gespikte 0,9 % NaCl-Proben (Suspensionen)

verwendet. Die prozentualen Anteile von lebenden und toten Zellen wurden nach der

Zentrifugation und Membranfiltration im Vergleich zu den unbehandelten Proben

bestimmt. Von jeweils drei Replikaten pro Probe wurden mindestens sechs

fluoreszenzmikroskopische Bilder in die Auswertungen einbezogen, um den

Mittelwert der Ergebnisse zu bestimmen. Bei beiden Methoden zeigte sich eine

Verschiebung der prozentualen Anteile lebender und toter Zellen. Dabei konnten

signifikant (p<0,05) höhere prozentuale Anteile an lebenden Zellen (grün) nach

Zentrifugation (76,95 %) und Filtration (79,55 %) im Vergleich zu der unbehandelten

Probe (61,08 %) detektiert werden. Demgegenüber befanden sich 23,05 % (nach

Zentrifugation), 20,45 % (nach Filtration) und 38,92 % (ohne Aufkonzentrierungs-

schritt) tote Zellen (rot) in der Probe. Intermediäre Zellen (orange) wurden nicht

nachgewiesen. Im Vergleich der beiden Aufkonzentrierungsmethoden bestand kein

signifikanter Unterschied der prozentualen Anteile von lebenden und toten Zellen.

Diese Ergebnisse sind in der Abbildung 1 der Publikation 2 dargestellt.

4.2.4. Ergebnisse der qPCR mit und ohne EMA bei Ver wendung der

Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode

Um den Einfluss der Aufkonzentrierungsmethoden auf die Ergebnisse der qPCR zu

testen, wurden serielle Verdünnungsreihen von C. jejuni DSM 4688 in NaCl (0,9 %)

hergestellt. Der Keimgehalt wurde nach Zentrifugation oder Membranfiltration mittels

qPCR, EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung vergleichend bestimmt.

Nach Zentrifugation der Proben zeigten die Ergebnisse der qPCR ohne EMA

signifikant (p<0,05) höhere Keimkonzentrationen (0,78 ± 0,184 SD log10 KbE/ml) im

Vergleich zur mikrobiologischen Referenzmethode. Bei einer grafischen Auftragung

der ermittelten Keimkonzentrationen aus der qPCR und der mikrobiologischen

Keimzählung zeigte sich dabei eine Verschiebung der Detektionsgeraden aus den

Ergebnissen der qPCR ohne EMA im Vergleich zur mikrobiologischen

Referenzmethode. Dagegen konnte mittels EMA-qPCR eine hohe Übereinstimmung

der Ergebnisse zu den Ergebnissen der Referenzmethode erzielt werden, so dass


kein signifikanter Unterschied (p>0,05) zwischen den Methoden zu verzeichnen war.

Eine graphische Darstellung der Ergebnisse ist in der Abbildung 2A der Publikation 2

ersichtlich.

Um eine Korrelation zwischen den Ergebnissen der qPCR mit und ohne EMA und

der mikrobiologischen Referenzmethode darzustellen, wurde die Pearson-

Regressionsanalyse verwendet. Dabei konnte bei Zentrifugation der Proben mit der

EMA-qPCR eine hohe Korrelation der ermittelten Keimkonzentrationen (R2=0,866;

mit einer Steigung der Geraden von 0,815) zu der mikrobiologischen

Referenzmethode ermittelt werden. Trotz der Verschiebung der Detektionsgeraden

bei Verwendung der qPCR ohne Zugabe von EMA wurde eine hohe Korrelation

(R2=0,925) zu den mittels mikrobiologischer Keimzählung erzielten

Keimkonzentrationen errechnet.

Im Gegensatz dazu konnte bei Filtration der Proben sowohl bei den Ergebnissen der

qPCR als auch bei der EMA-qPCR eine hohe Übereinstimmung im Vergleich zur

mikrobiologischen Keimzählung erzielt werden (diese Ergebnisse sind in der

Abbildung 2B der Publikation 2 dargestellt). Signifikante Unterschiede zwischen den

Methoden ließen sich nicht feststellen (p>0,05). Mittels Pearson-Regressionsanalyse

ließ sich die Übereinstimmung der Messwerte darstellen und hohe

Korrelationskoeffizienten berechnen (ohne EMA: R2=0,942; Steigung=1,001 und mit

EMA: R2=0,893; Steigung=0,954).

Nach diesen Ergebnissen zeigte sich die Filtrationsmethode als besser geeignet zur

Isolierung von Campylobacter-Zellen aus Wasserproben, so dass diese Methode für

die folgenden Versuche verwendet wurde.


4.2.5. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der pro zentualen Anteile

von lebenden und toten Bakterienzellen in Leitungsw asser- und

Oberflächenwasserproben

Um den Einfluss verschiedener Wasserarten auf Campylobacter-Zellen zu ermitteln,

wurden gespikete Oberflächenwasser- und Leitungswasserproben mit der

fluoreszenzmikroskopischen Methode vergleichend untersucht Dafür wurden die

Wasserproben sowie eine NaCl-Kontrollprobe mit 5,0 x 105 KbE/ml C. jejuni DSM

4688 versetzt und für 45 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die prozentualen

Anteile lebender und toter Zellen wurden anschließend mittels

fluoreszenzmikroskopischer Auswertung bestimmt und mit den Ergebnissen der

NaCl-Kontrollprobe verglichen.

Bei den Leitungswasserproben stimmten die prozentualen Anteile von lebenden und

toten Zellen (Mittelwert von: 50,18 % lebenden, 46,73 % toten und 3,09 %

intermediären Zellen) mit den Ergebnissen der NaCl-Kontrollprobe überein

(Mittelwert von: 56,87 % lebenden, 41,10 % toten und 2,03 % intermediären Zellen),

und es konnte kein signifikanter Unterschied (p>0,05) zwischen den beiden Medien

ermittelt werden.

Im Gegensatz dazu wurde bei den Oberflächenwasserproben ein hoher prozentualer

Anteil an toten Zellen in den Proben detektiert (Mittelwert von: 13,82 % lebenden,

81,59 % toten und 4,59 % intermediären Zellen), so dass ein signifikanter

Unterschied (p<0,05) im Vergleich zu den Ergebnissen der NaCl-Kontrollprobe

ermittelt werden konnte. Eine grafische Darstellung der Ergebnisse zeigen die

Abbildungen 3A, B und C der Publikation 2.


4.2.6. Ergebnisse der qPCR und EMA-qPCR zum Nachwei s von

Campylobacter-Zellen aus unterschiedlichen Wasserproben

Die Wasserproben wurden mit 1,5 x 107 - 2,3 x 102 KbE/ml des Typstamms C. jejuni

DSM 4688 versetzt. Nach Filtration der Proben wurden die Keimkonzentrationen mit

der qPCR und der EMA-qPCR bestimmt und mit den Ergebnissen der

mikrobiologischen Referenzmethode verglichen. Obwohl bei den

Leitungswasserproben die qPCR ohne EMA etwas höhere Keimzahlen detektierte

als die mikrobiologische Referenzmethode (s. Abbildung 4 der Publikation 2), konnte

ein hoher Korrelationskoeffizient (R2=0,921; Steigung der Gerade=0,864) zur

kulturellen Nachweismethode erzielt werden. Bei Verwendung der EMA-qPCR zeigte

sich ebenfalls eine hohe Übereinstimmung der Messwerte zur mikrobiologischen

Keimzählung (R2=0,863; Steigung=0,939). Dies konnte auch mit einer Bland-Altman

Analyse bestätigt werden, welche zum Vergleich zweier Methoden eingesetzt wird.

Dabei zeigten die Ergebnisse der EMA-qPCR und der mikrobiologischen

Referenzmethode eine Differenz der detektierten Keimkonzentrationen von 0,189

± 0,579 log10 KbE/ml mit unteren und oberen 95 % Grenzen der Übereinstimmung

von -0,946 und 1,323 (Abbildung 5B der Publikation 2). Auch mit der qPCR ohne

EMA konnte eine gute Übereinstimmung zur Referenzmethode ermittelt werden. Hier

zeigten sich eine Differenz des ermittelten Keimgehaltes von -0,099 ± 0,442 SD log10

KbE/ml und Übereinstimmungsgrenzen von -0,965 und 0,766 (Abbildung 5A der

Publikation 2).

Da die EMA-qPCR Methode eine gute Eignung zum Nachweis und zur

Quantifizierung lebender Campylobacter-Zellen in Leitungswasserproben zeigte,

wurde die Methode auch an Mineralwasser- und Regenwasserproben getestet. In

Analogie zu den Ergebnissen bei Verwendung von Leitungswasser konnten auch bei

Mineralwasser- und Regenwasserproben hohe Korrelationen zwischen den

Ergebnissen der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Referenzmethode erzielt

werden (R2=0,989; Steigung=1,013 bei Mineralwasser und R2=0,929;

Steigung=0,951 bei Regenwasser). Die Methodenvergleichsuntersuchungen mittels


Bland-Altman Analyse zeigten sowohl bei Mineralwasser als auch bei Regenwasser

eine hohe Übereinstimmung der beiden Detektionsmethoden (Mineralwasser:

Differenz des ermittelten Keimgehaltes von 0,153 ± 0,171 SD log10 KbE/ml und

Übereinstimmungsgrenzen von -0,183 und 0,488; Regenwasser: Mittlere Differenz

der beiden Methoden von 0,138 ± 0,439 SD log10 KbE sowie unteren und oberen

95 % Übereinstimmungsgrenzen von -0,722 und 0,998).

In einem weiteren Schritt dieser Versuchsreihe wurde die EMA-qPCR auch zur

Detektion von Campylobacter in Oberflächenwasser getestet. Bei Verwendung von

Oberflächenwasser konnte jedoch keine Übereinstimmung der EMA-qPCR zur

mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden (R2=0,0005, Steigung=0,0143).

Die geringe Übereinstimmung der Methoden wurde mittels einer Bland-Altman

Analyse bestätigt, bei welcher eine Differenz der Ergebnisse von 1,119 ± 1,166 SD

log10 KbE/ml mit 95 % Übereinstimmungsgrenzen von -1,166 und 3,405 ermittelt

wurden.

Abschließend war es wichtig, die Eignung der Methode auch unter Verwendung

unterschiedlicher Feldisolate zu überprüfen. Dazu wurden insgesamt 13 Feldisolate

der Spezies C. jejuni (n=7) und C. coli (n=6) aus Leitungswasserproben mittels der

Filtrationsmethode isoliert und mit der EMA-qPCR im Vergleich zur

mikrobiologischen Referenzmethode untersucht. Bei zwei Isolaten war eine

Keimkonzentrationsbestimmung mittels EMA-qPCR möglich, diese gelang jedoch

nicht mit der mikrobiologischen Keimzählung. Diese zwei Isolate wurden folglich von

einer Berechnung mittels der Pearson–Regressionsanalyse ausgeschlossen. Für die

verbleibenden 11Isolate konnte jedoch ein hoher Korrelationskoeffizient im Vergleich

der Resultate aus der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzahlbestimmung

erzielt werden (R2=0,936; Steigung=0,928). Diese Ergebnisse sind in der Abbildung 6

der Publikation 2 graphisch dargestellt.


4.2.7. Nachweis von lebenden Campylobacter-Zellen in unterschiedlichen

Gemischen aus lebenden und toten Zellen bei Verwend ung von

Leitungswasserproben

Diese Versuchsreihe diente dazu, die Eignung der entwickelten EMA-qPCR Methode

zur Detektion von lebenden Campylobacter-Zellen aus Leitungswasser zu testen,

auch wenn tote Zellen in der Wasserprobe vorhanden sind. Hierbei wurden

Gemische aus lebenden und toten C. jejuni DSM 4688 (1:10 und 1:100 lebende zu

toten Zellen) hergestellt, das Leitungswasser mit diesen Gemischen versetzt und als

Proben eingesetzt. Die Keimkonzentrationen wurden parallel mittels der qPCR, der

EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung bestimmt. Mittels einer

vergleichenden Bland-Altman Analyse wurde in der qPCR ohne Einsatz von EMA

eine geringe Übereinstimmung der Ergebnisse im Vergleich zur mikrobiologischen

Keimzählung ermittelt. Dabei wurde eine Differenz der Keimkonzentration zur

mikrobiologischen Referenzmethode von -2,247 ± 0,778 SD log10 KbE/ml und

Übereinstimmungsgrenzen von -0,721 und 3,773 errechnet. Im Gegensatz dazu

konnte bei Einsatz der EMA-qPCR Methode eine generelle Übereinstimmung zur

mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden. Die Differenz der Ergebnisse

aus einer vergleichenden Bland-Altman Analyse betrug 0,017 ± 0,7151 SD log10

KbE/ml mit unteren und oberen Übereinstimmungsgrenzen von -1,385 und 1,419.

Somit konnte in diesen Versuchsreihen eine Überlegenheit der EMA-qPCR zur

Quantifizierung von Campylobacter spp. in Gemischen aus lebenden und toten

Zellen im Vergleich zu den Ergebnissen ohne Verwendung von EMA dargestellt

werden.

Publikationen 59

5. Publikationen

5.1. Comparative Analysis and Limitations of Ethidi um Monoazide and

Propidium Monoazide Treatment for the Differentiati on of Viable and

Nonviable Campylobacter Cells

Published in Applied and Environmental Microbiology , Vol. 80 , No. 7, 2014,

Pages 2186-2192. doi: 10.1128/AEM.03962-13.

DIANA SEINIGE, CARSTEN KRISCHEK, GUENTER KLEIN,

and CORINNA KEHRENBERG *

Institute for Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover,

Foundation, Hannover, Germany

Running title: Comparing EMA and PMA pretreatments of Campylobacter

Link: http://aem.asm.org/content/80/7/2186.long

* Corresponding author: Mailing address: Institute for Food Quality and Food Safety,

University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, 30173

Hannover, Germany; Phone: +49-511-856-7554. Fax: +49-511-856-7694. Electronic mail

address: [email protected]

• Planung der Experimente: D. Seinige, G. Klein, C. Kehrenberg • Durchführung der Experimente: D. Seinige • Auswertung der Ergebnisse: D. Seinige, C. Krischek, C. Kehrenberg • Verfassen oder kritische Durchsicht

des Manuskriptes: D. Seinige, C. Krischek, G. Klein, C. Kehrenberg

60 Publikationen

ABSTRACT

The lack of differentiation between viable and nonv iable bacterial cells limits

the implementation of PCR-based methods for routine diagnostic approaches.

Recently, the combination of a quantitative real-ti me PCR (qPCR) and ethidium

monoazide (EMA) or propidium monoazide (PMA) pretre atment has been

described to circumvent this disadvantage. In regar d to the suitability of this

approach for Campylobacter spp ., conflicting results have been reported.

Thus, we compared the suitabilities of EMA and PMA in various concentrations

for a Campylobacter viability qPCR method. The presence of either

intercalating dye, EMA or PMA, leads to concentrati on-dependent shifts toward

higher threshold cycle (C t) values, especially after EMA treatment. However,

regression analysis resulted in high correlation co efficient ( R2) values of 0.99

(EMA) and 0.98 (PMA) between Campylobacter counts determined by qPCR

and culture-based enumeration. EMA (10 µg/ml) and P MA (51.10 µg/ml)

removed DNA selectively from nonviable cells in mix ed samples at

viable/nonviable ratios of up to 1:1,000. The optim ized EMA protocol was

successfully applied to 16 Campylobacter jejuni and Campylobacter coli field

isolates from poultry and indicated the applicabili ty for field isolates as well.

EMA-qPCR and culture-based enumeration of Campylobacter spiked chicken

leg quarters resulted in comparable bacterial cell counts. The correlation

coefficient between the two analytical methods was 0.95. Nevertheless, larger

amounts of nonviable cells (>10 4) resulted in an incomplete qPCR signal

reduction, representing a serious methodological li mitation, but double

staining with EMA considerably improved the signal inhibition. Hence, the

proposed Campylobacter viability EMA-qPCR provides a promising rapid

method for diagnostic applications, but further res earch is needed to

circumvent the limitation.

Publikationen 61

5.2. Influencing Factors and Applicability of the V iability EMA-qPCR for a

Detection and Quantification of Campylobacter Cells from Water

Samples

Published in PLoS One, 2014, accepted,

PLoS One. 9 (11):e113812. doi: 10.1371/journal.pone .0113812.

DIANA SEINIGE1, MAREN VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE2, CARSTEN KRISCHEK1,

GÜNTER KLEIN1, and CORINNA KEHRENBERG1 *

1Institute of Food Quality and Food Safety, 2Institute for Physiological Chemistry,

University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany

Short title: Detection of viable Campylobacter in water samples

Keywords: Campylobacter, quantification, water samples, viability, fluorescence

microscopy, qPCR, EMA-qPCR

Link: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0113812

* Corresponding author: Mailing address: Institute of Food Quality and Food Safety,

University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, D-

30173 Hannover, Germany; Phone: +49-511-856-7554. Fax: +49-511-856-7694.

Electronic mail address: [email protected]

• Planung der Experimente: D. Seinige, G. Klein, C. Kehrenberg • Durchführung der Experimente: D. Seinige • Auswertung der Ergebnisse: D. Seinige, M. von Köckritz-Blickwede,

C. Krischek, C. Kehrenberg • Verfassen oder kritische Durchsicht

des Manuskriptes: D. Seinige, M. von Köckritz-Blickwede, C. Krischek, G. Klein, C. Kehrenberg

62 Publikationen

ABSTRACT

In recent years, increasing numbers of human campyl obacteriosis cases

caused by contaminated water have been reported. As the culture-based

detection of Campylobacter is time consuming and can yield false-negative

results, the suitability of a quantitative real-tim e PCR method in combination

with an ethidium monoazide pretreatment of samples (EMA-qPCR) for the

rapid, quantitative detection of viable Campylobacter cells from water samples

was investigated. EMA-qPCR has been shown to be a p romising rapid method

for the detection of viable Campylobacter spp. from food samples. Application

of membrane filtration and centrifugation, two meth ods frequently used for the

isolation of bacteria from water, revealed a mean l oss of up to 1.08 log 10

cells/ml from spiked samples. Both methods used alo ne lead to a loss of dead

bacteria and accumulation of viable bacteria in the sample as shown by

fluorescence microscopy. After filtration of sample s, no significant differences

could be detected in subsequent qPCR experiments wi th and without EMA

pretreatment compared to culture-based enumeration. High correlations

(R2=0.942 without EMA, R 2=0.893 with EMA) were obtained. After centrifugatio n

of samples, qPCR results overestimated Campylobacter counts, whereas

results from both EMA-qPCR and the reference method were comparable. As

up to 81.59% of nonviable cells were detected in po nd water, EMA-qPCR failed

to detect correct quantities of viable cells. Howev er, analyses of spiked tap

water samples revealed a high correlation (R 2=0.863) between results from

EMA-qPCR and the reference method. After membrane f iltration, EMA-qPCR

was successfully applied to Campylobacter field isolates, and results indicated

an advantage over qPCR by analysing defined mixture s of viable and nonviable

cells. In conclusion, EMA-qPCR is a suitable method to detect viable

Campylobacter from water samples, but the isolation technique an d the

type/quality of the water sample impact the results .

Diskussion 63

6. Diskussion

Der quantitative Nachweis von Campylobacter spp. ist von Bedeutung, um

insbesondere bei Geflügelfleischprodukten aber auch bei Wasserproben die

lebensmittelhygienische Qualität beurteilen zu können (KEER und BIRCH 2003,

PITKÄNEN 2013, KRÜGER et al. 2014). Mit der Entwicklung einer Schnellmethode

zur Quantifizierung der Bakterien, welche nur lebende Campylobacter-Zellen

detektiert, wäre es möglich, Keimzahlen auf oder in kontaminierten Lebensmitteln zu

ermitteln und durch entsprechende Massnahmen das Infektionsrisiko für den

Konsumenten zu minimieren. Somit könnte mittels dieser Methode ein wichtiger

Schritt zur Senkung der Anzahl humaner Campylobacteriose-Fälle erreicht werden.

Das amtliche, kulturelle „Horizontale Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von

Campylobacter spp.“ nach § 64 des LFGB, sowie die DIN EN ISO 10272-1:2006,

nutzen das kulturelle Anzuchtverfahren der Bakterien auf Agarplatten, um die Anzahl

Kolonie-bildender Einheiten (KbE) zu bestimmen (§ 64 LFGB, DIN EN ISO 10272-

1:2006).

Die quantitative Keimzahlbestimmung mittels dieses mikrobiologischen

Keimzählverfahrens ist jedoch abhängig von vielen Faktoren, wie dem gewählten

Anzuchtmedium, der Probenmatrix sowie dem metabolischen Status und der

Zellintegrität der Bakterien (RUDI et al. 2005). Zudem ist der kulturelle

Erregernachweis bei langsam wachsenden Bakterienspezies und physiologisch

anspruchsvollen Keimen wie Campylobacter stark erschwert (SOLOMON und

HOOVER 1999, BOTTELDOORN et al. 2008, STINGL et al. 2012). Aufgrund dieser

Nachteile sowie der langen Zeitdauer bis zur Erlangung von

Untersuchungsresultaten, welche nach der amtlichen Nachweismethode nach § 64

LFGB bis zu 6 - 7 Tage beträgt, ist kein zeitnaher Eingriff in die

Lebensmittelsicherheit mehr möglich. Auch Steuerungsfunktionen, welche die

Ausbreitung von Erregern verhindern sollen, können somit nicht zeitnah umgesetzt

werden. Demzufolge ist die Entwicklung von kulturunabhängigen, quantitativen

Schnellmethoden zum Nachweis von Campylobacter spp. für eine Einschätzung des

64 Diskussion

Gesundheitsrisikos von Lebensmitteln von entscheidender Bedeutung (KRÜGER et

al. 2014).

Mit der Entwicklung von PCR und real-time PCR Verfahren für den Nachweis von

Campylobacter spp. stehen Schnellmethoden zur Verfügung, die eine zeitnahe

Untersuchung von Proben ermöglichen (RUDI et al. 2005). Unter Verwendung von

EMA oder PMA in Kombination mit quantitativen real-time PCR (qPCR) Verfahren

könnten zudem lebende und somit potentiell infektiöse Bakterienstadien von toten

Zellen differenziert werden (CAWTHORN und WITTHUHN 2008, CHANG et al. 2010,

HELLEIN et al. 2012).

6.1. I. Abschnitt - Methodenentwicklung

Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde eine geeignete Methode entwickelt, die einen

Nachweis lebender Campylobacter-Zellen mittels der qPCR Methode ermöglicht.

Dabei wurden Faktoren, die zu einer Beeinflussung der Ergebnisse der qPCR führen

können, wie unterschiedliche interkalierende Substanzen (Differenzierungsmittel)

und verschiedene Arbeitskonzentrationen der Differenzierungsmittel, vergleichend

untersucht. Die Ergebnisse werden in den folgenden Abschnitten diskutiert.

6.1.1. Einfluss von EMA und PMA auf die Resultate d er real-time PCR bei

Verwendung von lebenden Zellen

Da anzunehmen war, dass die eingesetzten Differenzierungsmittel zu einer

Beeinflussung von qPCR Ergebnissen führen, wurden EMA und PMA in

unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt und die Ct-Werte (als Ergebnisse der

qPCR-Analysen) mit den Resultaten der unbehandelten Zellen verglichen. Dabei

zeigten beide Differenzierungsmittel eine Erhöhung der Ct-Werte in der qPCR im

Vergleich zu den unbehandelten Zellen. Vermutlich resultierte die Ct-Verschiebung

aus dem partiellen Eindringen der Differenzierungsmittel in lebende Zellen, deren

DNA dann in einer folgenden qPCR nicht mehr amplifiziert werden konnte welches

Diskussion 65

somit zu höheren Ct-Werten im Vergleich zur unbehandelten Kontrollprobe führte.

Zum anderen war aus den Ergebnissen zu erkennen, dass die Ct-Wert Verschiebung

abhängig von dem verwendeten Differenzierungsmittel ist, denn sie zeigte sich bei

EMA deutlicher als bei einem Einsatz von PMA. Die unterschiedliche Ausprägung

der Ct-Werte-Verschiebung der getesteten Differenzierungsmittel EMA und PMA ist

vermutlich bedingt durch die unterschiedliche Ladung der beiden Substanzen. Da die

hydrophobe Phospholipidschicht der bakteriellen Zellmembran nur für ungeladene

Moleküle oder Substanzen mit einer dezentralisierten Ladung passierbar ist (CAO-

HOANG et al. 2008), resultiert die unterschiedliche Ausprägung der Penetration bei

lebenden Zellen mit intakter Zellmembran darauf, dass PMA im Gegensatz zu EMA

eine weitere positive Ladung besitzt. Dadurch wird die Penetration durch die

bakterielle Zellmembran lebender Zellen bei PMA selektiver verhindert, so dass die

Erhöhung der Ct-Werte in der qPCR bei einem Einsatz von PMA geringer ausgeprägt

ist (NOCKER et al. 2006, CAWTHORN und WITTHUHN 2008). Der Effekt einer

Erhöhung der Ct-Werte beim Einsatz der Substanz EMA wurde auch zuvor in Studien

anderer Autoren an Bakterienspezies wie Salmonella enterica, Enterobacter

sakazakii, Staphylococcus aureus und Escherichia coli beschrieben (NOCKER et al.

2006, NOCKER und CAMPER 2006, CAWTHORN und WITTHUHN 2008,

KOBAYASHI et al. 2009). Auch für Campylobacter spp. konnte eine Beeinflussung

der Ct-Werte bei Verwendung von EMA von anderen Autoren beobachtet werden

(FLEKNA et al. 2007, KRÜGER et al. 2014).

Bei der Verwendung von PMA wurde in der vorliegenden Studie ebenfalls eine Ct-

Wert Verschiebung bei lebenden Zellen beobachtet. Dieses lässt vermuten, dass

auch das Differenzierungsmittel PMA die Bakterienmembran lebender Zellen partiell

durchdringen kann. In der Literatur wird der Einfluss von PMA auf lebende Zellen

kontrovers gesehen. So konnte in weiteren Studien zur Detektion und Quantifizierung

der Bakterienspezies Mycobakterium avium subsp. paratuberculosis, Salmonella

enterica und Legionella pneumophila bei Verwendung von PMA ebenfalls eine

Erhöhung der Ct-Werte lebender Zellen in der qPCR beobachtet werden (KRALIK et

al. 2010, LIANG et al. 2011, LOOZEN et al. 2011, YÁÑEZ et al. 2011). Andere

Autoren erzielten jedoch gegensätzliche Ergebnisse und konnten bei Verwendung

66 Diskussion

von PMA keine Signalreduktion lebender Zellen bei der Detektion von Enterobacter

sakazakii, Staphylococcus aureus, Listeria monozytogenes, Escherichia coli, C.

jejuni und C. coli beobachten (CAWTHORN und WITTHUHN 2008, NOCKER et al.

2006, KRÜGER et al. 2014). In diesen Studien wurde jedoch eine geringere

Konzentration an PMA als in der vorliegenden Arbeit verwendet oder es wurde nur

eine Beurteilung über die Intensität von Agarosegelbanden durchgeführt. So

applizierten KRÜGER et al. (2014) eine geringere PMA Konzentration von 20 µmol/l.

Die niedrigste getestete PMA-Konzentration in der vorliegenden Studie betrug jedoch

50 µmol/l (25,55 µg/ml) und dabei konnte eine Konzentrationsabhängigkeit der Ct-

Wert Verschiebung dargestellt werden. Bei dem Einsatz von geringeren

Konzentrationen des Differenzierungsmittels wurden auch geringere Verschiebungen

der Ct-Werte beobachtet. Diese Resultate lassen vermuten, dass bei steigender

Konzentration der Differenzierungssubstanz eine höhere Penetration der Substanz

durch intakte Zellmembranen erfolgt. Die Konzentration von 50 µmol/l PMA stellte

sich jedoch in den weiteren Versuchen als nicht ausreichend dar, um eine

Differenzierung zwischen lebenden und toten Campylobacter-Zellen zu ermöglichen.

In der Literatur gibt es für die Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR bei

Verwendung von Differenzierungsmitteln neben der oben erwähnten Erklärung noch

weitere Erklärungsmodelle, die im nächsten Kapitel detailliert beschrieben werden.

6.1.2. Erklärungsmodelle für C t-Wert-Verschiebungen in qPCR-

Experimenten nach Einsatz von Differenzierungsmitte ln

Neben dem partiellen Eindringen der Substanzen in lebende Zellen basiert ein

weiteres Erklärungsmodell für die Ct-Wert-Verschiebungen auf dem Vorhandensein

von membrangeschädigten Zellfraktionen, die zum Teil auch in 24 Stunden

angezüchteten Bakterienkulturen zu finden sind (YÁÑEZ et al. 2011). Dabei ist

bekannt, dass Bakterienkulturen sowohl in flüssigen als auch in festen Nährmedien

einen Anteil an membrangeschädigten Zellen beinhalten können. Frisch

angezüchtete Bakterienkulturen werden aber häufig mit dem Anteil an lebenden

(oder membranintakten) Zellen gleichgesetzt. Da das Prinzip der

Diskussion 67

Differenzierungsmittel auf der Membranpermeabilität der Zellen beruht, können aber

membrangeschädigte oder tote Zellen, welche sich in diesen frischen Kulturen

befinden, durch die aufgenommenen Differenzierungsmittel zu einer Ct-Wert

Verschiebung in der qPCR führen. Zudem ist eine Änderung der

Membranpermeabilität im Verlauf der Wachstumsphase der Bakterien möglich

(FITTIPALDI et al. 2012). GEDALANGA und OLSON (2009) beobachteten in ihrer

Studie an Escherichia coli in unterschiedlichen Wachstumsphasen, dass EMA

überwiegend bei sich schnell teilenden sowie älteren Bakterien in die Zellen

eindringen konnte und folgerten daraus, dass die Membranpermeabilität der

Bakterien im Verlaufe des Wachstums Veränderungen unterworfen ist. Bei Bakterien

in unterschiedlichen Wachstumsphasen könne somit auch eine unterschiedliche

Effektivität bei der Aufnahme von EMA in die Zelle erfolgen und somit zu einer

Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR führen (GEDALANGA und OLSON 2009).

Eine weitere Erklärung kann der toxische Effekt der Substanzen auf lebende Zellen

sein. Zur Testung des Effektes der Substanz EMA auf die Zellen führten RUECKERT

et al. (2005) einen Zytotoxizitätstest ein. Dabei wurden flüssige Bakterienkulturen von

Anoxybacillus flavithermus mit dem Differenzierungsmittel EMA versetzt und

anschließend das Koloniewachstum auf einer Agarplatte beurteilt. Die Autoren

folgerten daraus, dass die Reduktion des Koloniewachstums um so höher ist, je

höher der zytotoxische Effekt der Substanz auf die Zellen ausgeprägt ist. Aus diesen

Ergebnissen zogen sie die Schlussfolgerung, dass der zytotoxische Effekt auf

lebende Zellen mit der Fähigkeit zur Penetration intakter Zellmembranen verglichen

werden kann. Somit ist bei einer hohen Zytotoxizität der Substanz auch ein

vermehrtes Eindringen in lebende und membranintakte Zellen möglich (RUECKERT

et al. 2005). In mehreren Studien an unterschiedlichen Bakterienspezies stellte sich

die Zytotoxizität von EMA konzentrationsabhängig dar und nahm bei steigenden

Konzentrationen an EMA zu, bis hin zu einer vollständigen Unterdrückung des

Koloniewachstums (RUECKERT et al. 2005, FLEKNA et al. 2007, SOEJIMA et al.

2007). Eine konzentrationsabhängige Zytotoxizität konnte auch bei PMA beobachtet

werden, welche dazu führte, dass höhere Konzentrationen der Substanz zu einer

gesteigerten Wachstumsreduktion führten (YÁÑEZ et al. 2011, GENSBERGER et al.

68 Diskussion

2013). Diese Wachstumsreduktion war aber nicht so deutlich ausgeprägt als bei

Verwendung von EMA.

Die Verschiebung der Ct-Werte in der qPCR kann somit durch mehrere Faktoren

bedingt sein: 1) die Differenzierungsmittel können teilweise auch in lebende Zellen

eindringen, 2) es befanden sich membrangeschädigte Zellfraktionen in der Probe, 3)

Zellen in unterschiedlichen Wachstumsphasen zeigten eine differenzierte Aufnahme

der Substanzen und 4) die Differenzierungsmittel übten einen zytotoxischen Effekt

auf lebende Zellen aus. Welcher dieser Faktoren den größten Einfluss bei dem

Bakteriengenus Campylobacter hat, ist bislang nicht geklärt. Durch die Ergebnisse

dieser Arbeit ließ sich aber zeigen, dass eine konzentrationsabhängige Ct-Wert

Verschiebung bei Verwendung beider Differenzierungsmittel vorliegt, welche bei den

Resultaten der qPCR berücksichtigt werden muss.

6.1.3. Standardkurven zur Bestimmung der Keimkonzen tration von

Campylobacter spp.

Die für eine qPCR erforderlichen Standardkurven wurden unter Zugabe von EMA

oder PMA zu Proben mit bekannter Keimkonzentration ermittelt. Dieses erschien

erforderlich, um die durch interkalierende Substanzen bedingte Ct-Wert

Verschiebung ausgleichen zu können. Bei der Erstellung von Standardkurven ist eine

Anpassung auf die Versuchsbedingungen prinzipiell notwendig (TAKAHASHI et al.

2005, KÖPPEL et al. 2012). Dieses Anpassung wurde in anderen Studien zur

Quantifizierung lebender Campylobacter-Zellen jedoch nicht durchgeführt, welches

einen Unterschied der hier entwickelten Methode darstellt (RUDI et al. 2005,

JOSEFSEN et al. 2010, BAE und WUERTZ 2012, HELLEIN 2012). Dabei ist zu

bedenken, dass die Standardkurve unter Verwendung von 24 Stunden auf

Agarplatten kultivierten Campylobacter-Zellen erstellt wurde. Eine Verwendung von

gestressten oder in anderen Medien kultivierten Zellen könnte demzufolge zu

divergierenden Ergebnissen führen. Jedoch ist eine Testung der Methode unter

Verwendung der Vielzahl an möglichen Stressfaktoren auf die Zellen sowie von

Diskussion 69

unterschiedlichen Anzuchtmedien oder Isolierungsmatrices aufgrund der zeit- und

arbeitsintensiven Versuchsdurchführung und der finanziellen Grenzen nicht möglich.

Unter Verwendung der angepassten Standardkurve konnten mittels EMA-qPCR in

mehreren Versuchsreihen vergleichbare Resultate zu der mikrobiologischen

Referenzmethode erzielt werden. Dieses zeigte sich in einer hohen Korrelation

(R2=0,947) zwischen den beiden Methoden und ließ sich durch eine

Methodenvergleichsuntersuchung mittels Bland-Altman Testung bestätigen.

6.1.4. Effektivität von EMA und PMA zur Differenzie rung von lebenden und

toten Zellen

Die Effektivität der Differenzierungsmittel zur Unterscheidung lebender und toter

Zellen bestimmt die Effizienz, falsch-positive Signale in den Ergebnissen der qPCR

auszuschließen (FITTIPALDI et al. 2012). Daher wurde die Eignung einer

Vorbehandlung mit beiden Differenzierungsmitteln untersucht, um lebende

Campylobacter-Zellen aus Gemischen an lebenden und toten Zellen (bis zu 1:1000)

zu detektieren. Dabei zeigte sich, dass sowohl eine Vorbehandlung von

Campylobacter-Zellen mit EMA (10 µg/ml) als auch mit PMA (51,10 µg/ml) geeignet

ist, um lebende Zellen mittels qPCR in den Gemischen zu detektieren. Dies ließ sich

in einer hohen Korrelation zur mikrobiologischen Referenzmethode auch bei der

Auswertung dieser Versuchsreihen darstellen. Demgegenüber vermochte PMA in der

Konzentration von 25,55 µg/ml keine ausreichende Differenzierung zu erbringen.

Eine schlechtere Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen bei

Verwendung von PMA wurde auch von anderen Autoren beschrieben. So

beschrieben LØVDAL et al. (2011), dass die PMA-qPCR unter Verwendung einer

Konzentration von 50 µmol/l PMA ungeeignet zur Diskriminierung lebender und toter

Zellen von Listeria innocua ist. Auch BAE und WUERTZ (2009) erzielten in ihrer

Studie an Bacteroides fragilis keine ausreichende Differenzierung lebender und toter

Zellen in gemischten Proben bei Verwendung von PMA 100 µmol/l. Die

Überlebensrate der Bakterien in Proben mit gemischter bakterieller Flora, wie bei

Fischfilets, wurde von LEE und LEVIN (2009a) bestimmt. Dabei wurden bei

70 Diskussion

hitzebehandelten Proben nach Zugabe von PMA mittels qPCR höhere Keimzahlen

detektiert als bei Verwendung von EMA oder bei der vergleichenden

Keimkonzentrationsbestimmung mittels mikrobiologischer Zellzählung. Die Autoren

folgerten daraus, dass EMA effektiver bei der Membranpenetration

temperaturgeschädigter Zellen ist als PMA. Auch CHEN und CHANG (2010) kamen

bei ihren Untersuchungen an Legionella pneumophila zu der gleichen

Schlussfolgerung. Bei inaktivierten Legionella pneumophila benötigten CHANG et al.

(2010) für eine Differenzierung lebender und toter Zellen bis zu 4-fach höhere

Konzentrationen an PMA als an EMA. Auch in der vorliegenden Arbeit wurde eine

über 5-fach höhere Konzentration an PMA im Vergleich zu EMA benötigt, um eine

effektive Reduktion der toten Zellen bei gemischten Proben an lebenden und toten

Zellen in den getesteten Keimkonzentrationen zu erzielen.

Die gleichen Faktoren, die eine Aufnahme von PMA bei lebenden, membranintakten

Zellen verhindern, scheinen auch die Aufnahme der Substanz in

membrangeschädigte Zellen zu reduzieren. Somit kehrt sich der vermeintliche

Nachteil des verwendeten Differenzierungsmittels EMA, lebende Zellen in stärkerem

Maße zu durchdringen, bei Verwendung von Bakteriensuspensionen mit Gemischen

an lebenden und toten Zellen in einen Vorteil um (FITTIPALDI et al. 2012).

6.1.5. Limitierungen bei Verwendung von Differenzie rungsmitteln zur

Detektion lebender Campylobacter spp. mittels qPCR

Die optimale qPCR Methode zur Bestimmung der Keimkonzentration in bakteriellen

Gemischen aus lebenden und toten Zellen würde idealerweise das Signal aller toten

Zellen vollständig unterbinden und dabei gleichzeitig die Amplifikation lebender

Zellen nicht beeinträchtigen (FITTIPALDI et al. 2012). Bei Verwendung höherer

Keimzahlen hitzeinaktivierter Zellen (>105 KbE/ml) ließen sich in dieser Studie die

qPCR Signale durch keines der Differenzierungsmittel vollständig unterdrücken.

Auch von anderen Autoren wurde beobachtet, dass sehr hohe Anzahlen toter Zellen

zu einer ungenügenden Unterdrückung von PCR-Signalen führen. So beschrieben

Diskussion 71

PACHOLEWICZ et al. (2013) in ihrer Studie an Broilerkarkassen eine unvollständige

Reduktion des Signals toter Campylobacter-Zellen in einer PMA-qPCR bei

Verwendung von über 104 KbE/ml in der Probe. Diese Ergebnisse wurden auch von

anderen Autoren bestätigt, die über eine unvollständige Reduktion des qPCR

Signals toter Bakterien bei Keimgehalten über 104 - 105 KbE/ml bei Bakterienspezies

wie Listeria pneumophila, Listeria monocytogenes und Listeria innocua berichteten

(PAN und BREIDT 2007, LØVDAL et al. 2011). Wichtig ist zu bemerken, dass in

Studien, bei denen tote Zellen keine falsch positiven Signale erbrachten, die

Differenz zwischen lebenden und toten Zellen häufig Konzentrationen von 103

KbE/ml nicht überschritten (WANG und LEVIN 2006, CHEN und CHANG 2010).

Somit wurde das Detektionslimit der Keimkonzentrationen toter Zellen nicht erreicht.

In anderen Studien wurde die Untersuchung sehr hoher Konzentrationen an toten

Zellen gar nicht durchgeführt, so dass diese methodische Limitierung nicht erkennbar

war.

Der Grund für die Relevanz der Keimkonzentration an toten Zellen bei der qPCR für

die Differenzierungsfähigkeit lebender Keime mittels DNA interkalierenden

Substanzen ist bislang noch nicht ausreichend geklärt. Möglich wäre jedoch, dass

eine hohe Keimkonzentration an toten Zellen durch eine vermehrte Aufnahme der

Substanzen die zur Verfügung stehende absolute Konzentration an

Differenzierungsmittel pro Zelle in der Probe reduziert. Somit könnte die Amplifikation

der membrangeschädigten Zellen in der qPCR nicht ausreichend unterdrückt werden

(FITTIPALDI et al. 2012). Diese Hypothese vermuteten auch VARMA et al. (2009) in

ihrer Studie an Abwasserproben, die eine hohe bakterielle Begleitflora beinhaltete. In

dieser Studie war die Effektivität von PMA mit steigenden Keimkonzentrationen an

toten Zellen in der Probe negativ korreliert.

72 Diskussion

6.1.6. Ansätze zur Verbesserung der qPCR-Resultate unter Verwendung

von Differenzierungsmitteln

Da in der vorliegenden Studie beide Differenzierungsmittel, EMA und PMA, tote

Zellen in Keimkonzentrationen von über 105 KbE/ml in der qPCR nicht vollständig

unterdrücken konnten, war es ein nächstes Ziel der Arbeit, erste Ansätze zu finden,

um die Signalreduktion toter Zellen zu verbessern. Dazu wurde eine

Doppelbehandlung der hitzeinaktivierten Zellen mit EMA in der Konzentration von 10

µg/ml durchgeführt. Diese Doppelbehandlung führte zu einer deutlichen Steigerung

der Signalreduktion von toten Zellen (bis zu 106 KbE/ml), welche auch die

Signalreduktion bei Verwendung von PMA übertraf. Eine ähnliche Methodik haben

MINAMI et al. (2010) in ihrer Studie an Enterobacter sakazakii getestet. Auch hier

konnten gute Ergebnisse mit einer EMA-Doppelbehandlung zur Signalreduktion von

hohen Konzentrationen an toten Zellen (bis zu 107 Zellen/ml) erzielt werden. Dabei

ist zu bedenken, dass die Doppelbehandlung mit EMA lediglich einen Ausblick für

eine zukünftige Weiterentwicklung darstellen sollte, um die Limitierung der Methode

zu umgehen. Dabei müssten jedoch noch andere Effekte, wie die Verschiebung der

Ct-Werte in der qPCR oder die Korrelation der Ergebnisse aus der qPCR nach einer

EMA-Doppelbehandlung zu der mikrobiologischen Referenzmethode, geprüft

werden.

Auch in der Literatur wurden Entwicklungen dargestellt, um die Signalreduktion toter

Zellen zu verbessern und gleichzeitig die Aufnahme der Differenzierungsmittel in

lebende Zellen zu reduzieren. Dieses wird in den folgenden Kapiteln diskutiert.

6.1.6.1. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuc hsansätzen, bei denen

eine Vorbehandlung mit EMA durchgeführt wurde

Bei Verwendung von EMA ist ein möglicher Ansatz, die Konzentration der Substanz

zu senken, so dass weniger EMA-Moleküle in die Zellen eindringen können (CHEN

und CHANG 2010, MINAMI et al. 2010, SHI et al. 2011). Dafür wurde von

Diskussion 73

verschiedenen Autoren die vormals üblicherweise recht hohe verwendete

Konzentration von um 100 µg/ml (INGLIS et al. 2010, FLEKNA et al. 2007, NOCKER

und CAMPER 2006, RUDI et al. 2005) in neueren Studien deutlich gesenkt und

häufig 10 µg/ml verwendet (MINAMI et al. 2010, SHI et al. 2011, SOEJIMA et al.

2011a, WANG et al. 2009). Dieser Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit

aufgegriffen und die deutlich niedrigere Konzentration von 10 µg/ml EMA erfolgreich

eingesetzt. Dieses war möglich, da EMA auch in geringen Konzentrationen die

Effizienz besitzt, membrangeschädigte Zellen zu durchdringen (FITTIPALDI et al.

2012). Sogar noch deutlich geringere Konzentrationen von EMA zwischen 2,5 µg/ml

und 1 µg/ml wurden in einigen anderen Studien an Bakterienspezies wie Vibrio

vulnificus, Legionella, Bifidobacterium als ausreichend erachtet, um das Signal toter

Zellen zu unterdrücken (WANG und LEVIN 2006, CHEN und CHANG 2010, MENG

et al. 2010, LEE und LEVIN 2009a). Da in diesen Studien jedoch häufig sehr

unterschiedliche Versuchsbedingungen verwendet wurden, wie die

Abtötungsmethode, die Inkubationszeit, die Belichtungsquelle und die Dichte der

Bakteriensuspension, sind diese Ergebnisse nicht immer vollständig miteinander

vergleichbar (FITTIPALDI et al. 2012).

Ein anderer Ansatz, welcher beschrieben wurde um die Aufnahme von EMA in

lebende Zellen zu minimieren, ist eine Inkubation der mit EMA behandelten Proben

auf Eis oder bei Temperaturen um 4°C vorzunehmen (LØVDAL et al. 2011).

Während in vielen Studien die Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt wurde

(RUDI et al. 2005, JOSEFSEN et al. 2010) konnte in Studien an Listeria

pneumophila, Listeria monocytogenes, Enterobacteriaceae und Enterobacter

sakazakii bei einer Inkubationstemperatur von 4°C unter Verwendung von 10 - 20

µg/ml EMA keine oder nur eine marginale Signalreduktion lebender Zellen

beschrieben werden (CHANG et al. 2009, SOEJIMA et al. 2008, MINAMI et al.

2010). In der vorliegenden Studie wurde die Belichtung der Proben zur

photoaktivierten Bindung von EMA an die DNA auf Eis durchgeführt, um eine

übermäßige Erwärmung der Proben durch die eingesetzte Halogenlampe zu

verhindern. Da bekannt ist, dass bei geringeren Temperaturen die

74 Diskussion

Membranpermeabilität der Zellen abnimmt, sollte somit eine verminderte Aufnahme

der Substanz in lebende Zellen erzielt werden (VAN DE VOSSENBERG et al. 1995).

6.1.6.2. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuc hsansätzen, bei denen

eine Vorbehandlung mit PMA durchgeführt wurde

Zur Verbesserung der Resultate bei einem Einsatz von PMA für die Differenzierung

lebender Campylobacter-Zellen von membrangeschädigten Zellen wurden von

BANIHASHEMI et al. (2012) die Verwendung von längeren Amplifikaten in der qPCR

als hilfreich beschrieben. In dieser Studie wurden verschiedene Amplikonlängen von

147 bp, 899 bp und 1512 bp bei Amplifikation eines internen Fragmentes des cpn60-

Gens für einen PMA PCR-Nachweis von C. jejuni vergleichend untersucht. Die

Amplifikationssignale von hitzeinaktivierten Zellen (1 x 107 KbE/ml) konnten bei PCR-

Assays mit dem Ziel der Amplifikation des 1512 bp Fragmentes vollständig inhibiert

werden, wohingegen dies bei den kürzeren Fragmenten nicht vollständig gelang.

Als zugrunde liegendes Prinzip wurde dabei vermutet, dass sich DNA interkalierende

Substanzen in einer bestimmen stöchiometrischen Häufigkeit an die DNA binden und

damit die Amplifikation in der qPCR inhibieren (BARNI et al. 1981, MARX et al.

1997). Eine strukturelle DNA-Veränderung durch diese Bindung würde dabei

theoretisch ausreichen, um die DNA Polymerase bei der Amplifikation zu behindern.

Dies führt bei Verwendung längerer Targetsequenzen zu einer höheren

Wahrscheinlichkeit, dass die darin gebundenen interkalierenden Substanzen die

Amplifikation der Polymerase behindern und somit das Amplifikationssignal

membrangeschädigter Zellen stärker inhibieren (SOEJIMA et al. 2008, CONTRERAS

et al. 2011, SOEJIMA et al. 2011b).

Eine Verlängerung des PCR-Amplikons könnte auch bei der in der vorliegenden

Arbeit verwendeten EMA-qPCR eine interessante Alternative zur Umgehung der

Limitierung darstellen. Da jedoch ein validiertes Detektionssystem für Campylobacter

spp. ein wichtiges Auswahlkriterium darstellte, wurde mit einem validierten

Diskussion 75

Nachweiskit gearbeitet, welches ein kürzeres DNA-Fragment von 287 bp als PCR-

Amplifikat nachweist.

6.1.7. Zusammenhang zwischen dem Inaktivierungsverf ahren der Bakterien

und den Ergebnissen der qPCR

Die in der vorliegenden Arbeit verwendete Differenzierung lebender und toter Zellen

mittels DNA-interkalierender Substanzen beruht auf dem Kriterium der

Membranintegrität der Bakterien („dye exclusion method“) (CAO-HOANG et al.

2008). Ein Bakterium kann mit dieser Methode somit nur als tot erkannt werden,

wenn eine Membranschädigung der Zelle vorliegt (RUDI et al. 2005, NOCKER et al.

2007, CENCIARINI-BORDE et al. 2009). In der vorliegenden Studie wurde für die

Inaktivierung von C. jejuni und C. coli eine Hitzebehandlung bei einer Temperatur

von 70 °C verwendet. Mittels dieses Verfahrens war es problemlos möglich, lebend-

tot Gemische aus hitzeinaktivierten Zellen bis zu einem Verhältnis von 1:1000

lebenden zu toten Zellen unter Verwendung der EMA-qPCR zu differenzieren.

Darüber hinaus wurde die Kultivierbarkeit der Bakterien als vergleichende

Referenzmethode zur Erfassung lebender Zellstadien verwendet. Werden andere

Kriterien einer lebend-tot Unterscheidung (siehe Kapitel 2.2.) zu Grunde gelegt, wie

die eintretende RNA Degradation, die Abnahme metabolischer Aktivität und der

Verlust des Energiestatus, kann es zu divergierenden Ergebnissen kommen. Auch

andere Inaktivierungsverfahren können zu abweichenden Ergebnissen führen

(NOCKER et al. 2006, NOCKER und CAMPER 2006, NOCKER et al. 2007,

CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Limitierungen können immer dann auftreten,

wenn die Abtötungsmethode zu keiner Membranschädigung führt. Ein typisches

Beispiel hierfür ist die Inaktivierung von Bakterien mittels UV-Licht. Dieses Verfahren

führt zu einer Degradierung der bakteriellen DNA, ohne die Permeabilität der

Zellmembran direkt zu beeinflussen (SINHA und HADER 2002, CENCIARINI-

BORDE et al. 2009). Bei diesem Abtötungsverfahren hat sich somit in Studien von

NOCKER et al. (2007) sowie BANIHASHEMI et al. (2012) die Anwendung der PMA-

qPCR Methode bei verschiedenen Bakterienspezies wie C. jejuni, Salmonella

76 Diskussion

enterica und E. coli O157:H7 als nicht geeignet erwiesen, um die Amplifikation toter

Zellen zu unterdrücken. Die EMA-qPCR wurde für die Anwendung bei UV-

inaktivierten Zellen bislang noch nicht getestet, es kann jedoch aufgrund des

gleichen Reaktionsmechanismus vermutet werden, dass hierbei ähnliche Ergebnisse

erzielt werden (CENCIARINI-BORDE et al. 2009).

Zwar wurde in der vorliegenden Studie die Hitzeinaktivierung zur Abtötung der

Campylobacter-Zellen gewählt, aber die Ergebnisse früherer Studien lassen die

Schlussfolgerung zu, dass bei weiteren Abtötungsmethoden, welche zu einer

Schädigung der Zellmembran führen (Desinfektionsmittel, Antibiotika), ebenfalls eine

lebend-tot Differenzierung mit interkalierenden Substanzen durchgeführt werden

kann. Das ermöglicht zum Beispiel die Kontrolle von Desinfektionsmaßnahmen

mittels EMA-qPCR.

Bei Verwendung von Desinfektionsmitteln, welche zu einer Schädigung der

bakteriellen Zellmembran führen, wie Alkohol, Hypochlorid, Benzalkoniumchlorid,

Glutaraldehyd oder Wasserstoffperoxid, konnte in Studien anderer Autoren -wie zu

erwarten- mit EMA und PMA eine Differenzierung lebender und toter Bakterien erzielt

werden (RUDI et al. 2005, NOCKER et al. 2007, DELGADO-VISCOGLIOSI et al.

2009, KRÜGER et al. 2014). Zu bedenken ist, dass sich die Ergebnisse bei

Verwendung dieser Desinfektionsmittel konzentrationsabhängig darstellten. Ein

Beispiel zeigte, dass steigende Konzentrationen der quaternären

Ammoniumverbindung Benzalkoniumchlorid (15-60 ppm) in einer Studie von

NOCKER et al. (2007) zu steigenden Signalreduktionen in der PCR (bis zu 17 Ct-

Werte bei 60 ppm) bei mit PMA behandelten Zellen führten. In einer Studie an

Listeria innocua wurde PMA keine ausreichende Signalreduktion bei mit Isopropanol

behandelten Zellen bescheinigt (LØVDAL et al. 2011). In dieser Studie wurde jedoch

mit einer hohen Konzentration an toten Zellen (9 x 107 KbE/ml) gearbeitet, so dass

PMA vermutlich die Amplifikation aller membrangeschädigten Zellen nicht vollständig

unterdrücken konnte. Zudem wurde ein sehr kurzes PCR Produkt von 101 bp

verwendet, welches zu keiner ausreichenden Signalreduktion führte (SOEJIMA et al.

2008, LØVDAL et al. 2011).

Diskussion 77

Bei der Inaktivierung von Bakterien mittels Hitzebehandlung berichteten LEE und

LEVIN (2009a), dass die bakterielle Zellmembran erst einen gewissen Grad der

Schädigung aufweisen muss, damit EMA und PMA in die Zelle aufgenommen

werden können. Dieser Effekt wurde bei einer nicht weiter differenzierten bakteriellen

Mischflora auf Fischfilets erst bei Temperaturen von 60 °C oder höher erreicht, bei

welcher eine signifikante Aufnahme der Differenzierungsmittel erfolgte (CENCIARINI-

BORDE et al. 2009, LEE und LEVIN 2009a). Auch NOCKER et al. (2007) konnten

zwischen 60 °C und 70 °C die stärksten Signalreduktionen bei Mycobacterium avium

subsp. avium erzielen. Temperaturen über 70 °C erbrachten dabei keine weitere

Signalreduktion. Die Verwendung von Antibiotika wie Gentamicin und Vancomycin

führten bei C. jejuni und Stapylococcus spp. zu einer signifikanten Signalreduktion in

der EMA-qPCR sowie der PMA-qPCR (RUDI et al. 2005, KOBAYASHI et al. 2010).

KOBAYASHI et al. (2010) beobachteten in ihrer vergleichenden Studie mit

Vancomycin und Gentamicin, dass die Stärke der Signalreduktion von dem

Wirkmechanismus der Antibiotika auf die Bakterien abhängig ist. Da Vancomycin

einen direkten Effekt auf die bakterielle Zellmembran ausübt (Behinderung der

Quervernetzungen der Peptidoglycan-Schicht), konnte hierbei eine deutlichere

Signalreduktion in der PMA-qPCR beobachtet werden als bei Gentamicin

(KOBAYASHI et al. 2010). Im Gegensatz dazu führt das Aminoglycosid-Antibiotikum

Gentamicin vermutlich zu einer indirekten Schädigung der bakteriellen Zellmembran

durch eine Hemmung der Zellmembranbildung und deren Integrität (Hemmung der

Proteinsynthese, durch Bindung an die 30S Untereinheit der Ribosomen). Somit

wurde bei Einsatz von Gentamicin eine geringere Signalreduktion der toten Zellen in

der PMA-qPCR ermittelt (KOBAYASHI et al. 2010). Auch für weitere Anwendungen

nach einer Abtötung von Campylobacter-Zellen mittels Desinfektionsmitteln oder

Antibiotika, welche eine Schädigung der bakteriellen Zellmembran verursachen,

scheint somit die Anwendung der EMA-qPCR Methode zur Differenzierung lebender

und toter Zellen möglich zu sein.

78 Diskussion

6.2. II. Abschnitt - Testung der etablierten EMA-qP CR an

Lebensmittelproben

Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die EMA-qPCR Methode an den

Lebensmittelmatrices Geflügelfleisch und Wasserproben getestet. Dabei wurden

verschiedene Einflussfaktoren wie der Matrixeffekt, das Reisolierungsverfahren und

verschiedene Wasserarten untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche werden in

den folgenden Kapiteln diskutiert.

6.2.1. Geflügel

6.2.1.1. Möglichkeit der Anwendung der EMA-qPCR Met hode bei natürlich

kontaminiertem Geflügelfleisch

Zur Bestimmung des Keimgehaltes von Campylobacter spp. in den Proben wurde die

mikrobiologische Keimzählung als Referenzmethode verwendet und die Ergebnisse

der qPCR mit dieser Referenzmethode verglichen. Zwar ist diese mikrobiologische

Methode zum Nachweis von Campylobacter spp. nicht immer erfolgreich (STINGL et

al. 2012), sie stellt jedoch das amtlich beschriebene Nachweisverfahren nach § 64

LFGB dar. Zu bedenken ist ferner, dass mit der qPCR-Methode Genomkopien

detektiert werden, welches einen Vergleich mit der Referenzmethode (KbE/ml)

erschwert. Durch eine Abstimmung der Standardkurve auf die Kolonie-bildenden

Einheiten von Campylobacter spp. wurde versucht, diese Problematik zu

berücksichtigen.

Der Anwendungsbereich der in der vorliegenden Arbeit verwendeten qPCR Methode

wurde auf 102 - 108 KbE/ml festgelegt. Der Keimgehalt von Campylobacter spp. auf

natürlich kontaminierten Geflügelkarkassen ist in verschiedenen Studien

unterschiedlich angegeben. Er variiert je nach Hygienemanagement in der

Primärproduktion, dem Transport und auf dem Schlachthof sowie in Studien

Diskussion 79

unterschiedlicher Länder (SPROSTON et al. 2014). Während in den USA die

Wasserkühlung unter Zugabe von Chlor eine gängige Methode ist, konnten hierbei

überwiegend Keimkonzentrationen von unter 102 KbE/g Karkasse detektiert werden

(HABIB et al. 2008). Ähnliche Ergebnisse wurden in einer kanadischen Studie erzielt,

in welcher zwischen 0 und 102 KbE/ml Spülprobe der Karkassen ermittelt wurden

(SPROSTON et al. 2014). Da diese Methode der Chlordesinfektion bislang nicht in

Europa verwendet wird (STERN und PRETANIK 2006), konnten in europäischen

Studien in der Mehrzahl der Fälle Keimgehalte bis zu 104 KbE/ml Spülprobe

detektiert werden, nur wenige Schlachtkörper zeigten einen höheren Keimgehalt

(JOSEFSEN et al. 2010, PACHOLEWICZ et al. 2013). Damit liegen die Keimgehalte

bei natürlich kontaminierten Hühnerkarkassen im Anwendungsbereich der qPCR

Methode, so dass ein Nachweis von Campylobacter mittels dieser Methode bei

natürlich kontaminiertem Geflügelfleisch möglich zu sein scheint.

Um den Anteil an toten Campylobacter-Zellen bei natürlich kontaminierten

Geflügelkarkassen zu ermitteln, wurde in einer Studie von PACHOLEWICZ et al.

(2013) der Gehalt an Campylobacter spp. bei Hühnerkarkassen am Schlachthof

mittels qPCR (ohne Differenzierungsmittel) und mikrobiologischer Keimzählung

vergleichend untersucht. Die Differenz aus den ermittelten Genomkopien und den

Kolonie-bildenden Einheiten betrug weniger als 3 log10/Probe. Daraus lässt sich

schließen, dass der Anteil von toten oder membrangeschädigten Campylobacter-

Zellen auf frischen Hühnerkarkassen relativ gering war. Somit scheint die EMA-

qPCR Methode für die Anwendung bei natürlich kontaminierten Hühnerkarkassen

geeignet zu sein. Zu bedenken ist, dass bei höheren Konzentrationen an toten Zellen

(>104 KbE), wie zum Beispiel nach Desinfektionsmaßnahmen oder bei längerer

Lagerung, die Limitierung der Methode (nicht ausreichende Signalreduktion) zum

Tragen kommen kann. In diesem Fall könnte eine Doppelbehandlung mit EMA, wie

in dieser Arbeit beschrieben, oder die Verwendung längerer Targetsequenzen

(BANIHASHEMI et al. 2012) eine Verbesserung der Resultate erzielen.

80 Diskussion

6.2.1.2. Einfluss der Lebensmittelmatrix Geflügelfl eisch auf die Resultate

der qPCR

Für eine Quantifizierung von Bakterien ist es wichtig, den Einfluss der Probenmatrix

auf die Ergebnisse der qPCR zu kennen, um aussagekräftige Ergebnisse zu

erlangen (JOSEFSEN et al. 2010). Um den Einfluss der Lebensmittelmatrix

Geflügelfleisch auf die Ergebnisse der EMA-qPCR zu testen, wurden

unterschiedliche Hühnerkarkassen mit der gleichen Menge an C. jejuni und C. coli

versetzt. Diese Untersuchungen wurden unter Verwendung von geringen, mittleren

und hohen Keimkonzentrationen durchgeführt. Bei der anschließenden

Keimdetektion konnte eine hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen der EMA-

qPCR Methode und der mikrobiologischen Keimzählung erzielt werden (R2=0,953).

Die Standardabweichungen der mittels EMA-qPCR detektierten

Keimkonzentrationen bei den unterschiedlichen Karkassen, die mit der gleichen

Keimkonzentration versetzt wurden, betrugen zwischen 0,67 - 0,81 SD log10 KbE/ml

SD. Daraus lässt sich schließen, dass die Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch die

Ergebnisse der EMA-qPCR nicht beeinträchtigt. Ähnliche Resultate erzielten

JOSEFSEN et al. (2010) in ihrer Studie, in welcher jeweils drei Spülproben von

Hühnerkarkassen mit der gleichen Keimkonzentration versetzt wurden und dabei

keine signifikanten Abweichungen in den Ergebnissen der PMA-qPCR ermittelt

wurden.

6.2.1.3. Status der Zellintegrität von Campylobacter spp. auf Geflügelfleisch

Zur Etablierung der EMA-qPCR Methode für eine Anwendung bei Geflügelfleisch-

Proben wurde tiefgekühltes Hühnerfleisch aus dem Einzelhandel verwendet. Einige

dieser Hühnerteilstücke zeigten bereits eine natürliche Kontamination mit

Campylobacter spp. Bei diesen kontaminierten Teilstücken wurden

Keimkonzentrationen zwischen 102 und 103 KbE/ml Spülprobe ermittelt, welche trotz

Tiefkühlung der Proben mittels mikrobiologischer Keimzählung detektiert werden

konnten. Somit waren lebende und vermutlich temperatur- und O2-gestresste

Diskussion 81

Campylobacter-Zellen bereits auf den Hühnerteilstücken nachzuweisen. Diese

ermittelten Keimkonzentrationen stimmen nahezu mit den Resultaten von MAZIERO

et al. (2010) überein, die in ihrer Studie nach Tiefkühlung von Geflügelfleisch bei

-20 °C für 28 Tage eine Campylobacter-Keimkonzentration von ungefähr 101 KbE/g

Fleisch mittels direkter mikrobiologischer Keimzählung nachweisen konnten.

Aufgrund der in der vorliegenden Arbeit bereits bestehenden Kontamination der

Geflügelfleischproben mit Campylobacter spp. und der aus der Lagerung der Proben

resultierenden Einwirkungen von Stressfaktoren auf die Zellen, wie zum Beispiel die

niedrigen Temperaturen, die Sauerstoffexposition und die Austrocknung, kann ein

breites Spektrum an vorhandenen Zellschädigungen der Keime auf den

Hühnerfleischproben angenommen werden, welches zur Beeinflussung der

Ergebnisse führen kann.

Wenngleich bekannt ist, dass gestresste oder ältere Zellen die Ergebnisse der qPCR

beeinträchtigen können (KRÜGER et al. 2014), konnte bei natürlich kontaminiertem

Hühnerfleisch, welches durch die Lagerung und Tiefkühlung ältere und gestresste

Zellen inbegriffen hatte, eine hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen der EMA-

qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung ermittelt werden. Die

Übereinstimmung der beiden Methoden wurde mittels Bland-Altman Analyse

bestätigt. Somit konnte eine prinzipielle Eignung der EMA-qPCR für die Anwendung

bei Lebensmittelproben nachgewiesen werden. Dies war nicht nur mit dem C. jejuni

Typstamm DSM 4688 möglich, sondern auch mit unterschiedlichen Feldisolaten

sowie definierten Gemischen an lebenden und toten Zellen.

Auch HE und CHEN (2010) testeten eine EMA-qPCR an gestressten C. jejuni-Zellen.

Hierbei wurden die Zellen einer verlängerten Inkubationszeit von einer Woche mit

niedrigen Kultivierungstemperaturen bei 25 °C, einer Inkubation unter Sauerstoff

sowie einer Nährstoffmangelsituation ausgesetzt. Unter diesen Bedingungen zeigten

99 % der Zellen morphologische Veränderung von kokkoider Form sowie fehlendes

kulturelles Bakterienwachstum. Bei 96 % dieser Zellen konnte jedoch eine intakte

bakterielle Zellmembran mittels fluoreszenzmikroskopischer Auswertung sowie der

EMA real-time PCR ermittelt werden. Die Autoren schlussfolgerten daraus, dass eine

82 Diskussion

qPCR mit EMA auch für gestresste und ältere Campylobacter-Zellen geeignet ist (HE

und CHEN 2010). Eine Eignung der EMA-qPCR selbst nach Einwirkung von

Stressfaktoren auf die Zellen (durch niedrige Temperaturen oder Sauerstoffzufuhr)

wurde auch in der vorliegenden Arbeit festgestellt und bestätigte somit die

Ergebnisse von HE und CHEN (2010).

LEE und LEVIN (2009b) bescheinigten der EMA-qPCR zur Detektion von Vibrio

vulnificus, welche zuvor für bis zu 72 Stunden einer Kühl- und

Tiefkühltemperaturbehandlung (4 °C, -20 °C) ausgesetzt waren, eine gute Eignung

zur Differenzierung lebender und toter Zellen. Allerdings setzten die Autoren eine

Vorbehandlung der Zellen mit Natriumdeoxycholat ein. Diese Substanz führt zu einer

erhöhten Durchlässigkeit von Membranproteinen und bewirkt somit eine erleichterte

Aufnahme von EMA in die Zellen (LEE und LEVIN 2009b). Bei diesem

Versuchsansatz konnten die Autoren eine hohe Korrelation zwischen der EMA-qPCR

und der mikrobiologischen Keimzählung (KbE) unter Verwendung von

Natriumdeoxycholat erzielen.

Da bekannt ist, dass Campylobacter-Zellen unter Stressbedingungen in das VBNC-

Stadium übergehen können (OLIVER et al. 2005), ist ein Vorkommen dieser

Zellstadien auf dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten Geflügelfleisch zu

vermuten. Die Integrität der bakteriellen Zellmembran der VBNC-Zellstadien ist

bislang wenig erforscht. ZHENG et al. (1999) und WILLÉN et al. (2000) beschrieben

jedoch bei Bakterienspezies wie Helicobacter pylori VBNC-Zellformen mit einer

intakten Bakterien-Doppelmembran. Bei einer intakten Bakterienmembran ist

demnach vermutlich ein Nachweis von VBNC-Campylobacter spp. mit der in dieser

Arbeit beschriebenen Methode möglich. Für andere Bakterienspezies wurde dies

bereits erfolgreich getestet. So konnten GEDALANGA und OLSON (2009) in ihrer

Studie an Escherichia coli mittels EMA-qPCR einen Nachweis dieser VBNC-

Bakterienstadien erzielen. Aus diesen Resultaten lässt sich somit vermuten, dass

Campylobacter VBNC-Zellen, bei einer intakten Zellmembran, mit der in der

vorliegenden Studie verwendeten EMA-qPCR Methode detektiert werden können.

Diskussion 83

6.2.2. Wasser

6.2.2.1. Detektion von lebenden Campylobacter-Zellen aus Wasserproben

mittels qPCR-Verfahren

Nicht nur der Konsum von kontaminiertem Geflügelfleisch, sondern auch

kontaminiertes Wasser ist eine häufig berichtete Quelle humaner

Campylobacteriose-Fälle (THOMAS et al. 1998, JACOBS-REITSMA et al. 2008), so

dass es in den letzten Jahren zu zahlreichen Berichten über gastrointestinale

Infektionen durch die Aufnahme kontaminierten Wassers gekommen ist (KUUSI et

al. 2005, VAN DYKE et al. 2010, PITKÄNEN 2013). Der Nachweis von

Campylobacter spp. aus Wasserproben ist jedoch oftmals mit Schwierigkeiten

verbunden. So erschweren eine geringe Keimkonzentration, geschädigte Zellen

sowie das physiologisch anspruchsvolle Wachstum von Campylobacter den

mikrobiologischen Nachweis und können demzufolge zu falsch negativen Resultaten

führen (PITKÄNEN 2013). Das konventionelle mikrobiologische Nachweisverfahren

von Campylobacter aus Wasserproben nach DIN EN ISO 17995:2005 ist sehr

zeitaufwändig und es ermöglicht ausschließlich eine semiquantitative Bestimmung

der Keimkonzentration nach Voranreicherung der Zellen durch Berechnung der

„most probable number“ (MPN). Eine standardisierte Nachweismethode zur

Quantifizierung von lebenden Campylobacter-Zellen aus Wasserproben mittels eines

PCR-Schnellverfahrens ist derzeit nicht verfügbar. Daher wurden in den letzten

Jahren PCR-basierte Methoden entwickelt, um Campylobacter Zielsequenzen in

Wasserproben nachweisen zu können (KHAN et al. 2009, EDGE et al. 2013,

TISSIER et al. 2012). Für eine Differenzierung lebender Campylobacter-Zellen aus

Wasserproben unter Verwendung von DNA-interkalierenden Substanzen ist jedoch

bislang sehr wenig in der Literatur bekannt (BAE und WUERTZ 2012,

BANIHASHEMI et al. 2012, PITKÄNEN 2013).

Demzufolge war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Eignung der EMA-qPCR für

den Nachweis lebender Campylobacter-Zellen aus Wasserproben zu testen. Dazu

84 Diskussion

wurden verschiedene Faktoren, die eine Verwendung interkalierender Substanzen

beeinflussen können, wie die Wahl der Isolierungsmethode oder der Einfluss von

verschiedenen Wasserarten, untersucht.

6.2.2.2. Einfluss der Isolierungsmethode auf Campylobacter-Zellen aus

Wasserproben sowie auf die Ergebnisse der qPCR

Zum Nachweis der üblicherweise geringen Konzentrationen von Campylobacter spp.

in Wasser sind Verfahren zur Aufkonzentrierung der Zellen in Wasserproben

notwendig (PITKÄNEN 2013). Die Standardmethode zum Nachweis thermotoleranter

Campylobacter spp. nach DIN EN ISO 17995:2005 basiert auf einem

Aufkonzentrierungsschritt mittels Membranfiltration. Auch in anderen Studien wurde

die Membranfiltration zum Nachweis der Zellen in Wasser verwendet (KHAN et al.

2009, BAE und WUERTZ 2012, TISSIER et al. 2012, DELGADO-VISCOGLIOSI et

al. 2009). Alternativ dazu wurde von KHAN et al. (2009) ein Zentrifugationsverfahren

beschrieben, welches von den Autoren der Studie parallel zur

Membranfiltrationsmethode für den Nachweis von C. jejuni und C. coli aus 699

Wasserproben von landwirtschaftlichen Nutzflächen vergleichend eingesetzt wurde.

Eine hohe Detektionsrate von C. jejuni konnte dabei mit beiden Methoden erzielt

werden. Dagegen war für den Nachweis von C. coli die Zentrifugationsmethode dem

Filtrationsverfahren überlegen. Jedoch wurde in diesen Studien die

Membranintegrität der Zellen nicht berücksichtigt, sondern eine semiquantitative

Bestimmung nach Voranreicherung der Proben vorgenommen. Auch von EDGE et

al. (2013), sowie BANIHASHEMI et al. (2012) wurden Zentrifugationsmethoden zur

Aufkonzentrierung der Zellen aus Wasserproben verwendet.

Da unbekannt war, ob diese Aufkonzentrierungsverfahren die Ergebnisse der EMA-

qPCR beeinträchtigen können, wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst ein

geeignetes Verfahren zur Isolierung von Campylobacter spp. aus Wasserproben

ermittelt. Dazu wurden die Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode

vergleichend untersucht. Sowohl die getestete Zentrifugationsmethode als auch die

Diskussion 85

Filtrationsmethode führten zu einem Keimverlust in der mikrobiologischen

Keimzählung bis zu 1,08 log10 KbE/ml. Dieser Zellverlust war vermutlich durch die

Anwendung der Methoden bedingt. Aufgrund des schmalen Durchmessers der

Campylobacter-Zellen könnte bei der Filtrationsmethode eine Retention der Keime

auf der Filtermembran oder in dessen Poren ein ursächlicher Faktor sein (THOMAS

et al. 1999, TISSIER et al. 2012), welches zu einer inkompletten Reisolierung der

Keime von der Filtermembran führte. Bei der Zentrifugationsmethode wäre ein

Verlust der Zellen durch das Absaugen des flüssigen Überstandes möglich, da

hierbei nur das Bakterienpellet weiter verwendet wurde (KHAN et al. 2009). Zudem

könnte eine Schädigung der Zellen durch die Zentrifugalkraft hervorgerufen worden

sein, welche zu einer Abtötung der Campylobacter-Zellen führen kann. Da in der

vorliegenden Arbeit bei der Zentrifugationsmethode eine geringere

Rotationsgeschwindigkeit als in anderen Studien verwendet wurde, war hierbei mit

geringeren Einflüssen auf die Zellen zu rechnen (KHAN et al. 2009, BANIHASHEMI

et al. 2012, EDGE et al. 2013). Da sich ein Membranfilter mit einem

Porendurchmesser von 0,45 µm als besonders geeignet zur Isolierung von

Campylobacter spp. aus Wasserproben dargestellt hat, (DIN EN ISO 17995:2005,

DELGADO-VISCOGLIOSI et al. 2009, KHAN et al. 2009, BAE und WUERTZ 2012),

ist dieser Porendurchmesser auch in der vorliegenden Arbeit eingesetzt worden.

Zwar berichteten TISSIER et al. 2012 von Membranfiltern mit geringerem

Porendurchmesser (0,2 µm), die eine Verbesserung der Resultate erzielen können.

Die Autoren bemängelten hierbei jedoch, dass die Filtermembran schneller verstopft

und bei Anlegen eines höheren Vakuums zur Überwindung dieses Hindernisses die

Zellen vermehrt geschädigt würden. Diese vermehrte Zellschädigung könnte

allerdings die Ergebnisse einer lebend-tot Differenzierung beeinflussen. Von den

Autoren wurde zudem zur Verbesserung der Isolierungsrate die Verwendung eines

alkalischen Elutionspuffers (pH 9) mit 3 % Fleischextrakt postuliert. Dieser Puffer

verschiebt die Ladung der Filtermembran in das Negative, so dass ein

Abstoßungseffekt mit der negativ geladenen Bakterienmembran erfolgen soll. Dieser

Effekt konnte eine verbesserte Ablösung der Zellen von der Filtermembran bewirken

(TISSIER et al. 2012). Zu beachten ist jedoch bei Verwendung dieses Puffers, dass

86 Diskussion

ein Verfahren zur lebend-tot Differenzierung der Zellen im Anschluss nicht

durchgeführt werden kann, da die Überlebensrate der Campylobacter-Zellen bei

diesen Umweltbedingungen sehr schnell absinkt (TISSIER et al. 2012). Diese stark

reduzierte Überlebensrate stellte den Grund dar, dass der modifizierte Elutionspuffer

in der vorliegenden Arbeit nicht eingesetzt wurde.

Die Resultate der fluoreszenzmikroskopischen Analysen zeigten eine Erhöhung der

prozentualen Anteile lebender Zellen im Vergleich zu der unbehandelten

Kontrollprobe sowohl nach Anwendung der Filtrations- als auch der

Zentrifugationsmethode. Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden

Aufkonzentrierungsmethoden bestand nicht. Dies lässt auf einen Verlust von

überwiegend toten Zellen oder freier DNA schließen, welche die Filterporen passiert

haben (Membranfiltration) oder zusammen mit dem Zentrifugationsüberstand

abgesaugt wurden (Zentrifugationsmethode).

Nach einer Zentrifugation der Proben zeigten die qPCR-Ergebnisse ohne vorherige

Zugabe von EMA zu den Zellen signifikant höhere Keimkonzentrationen im Vergleich

zur mikrobiologischen Keimzählung. Bei Einsatz von EMA hingegen war kein

signifikanter Unterschied zur mikrobiologischen Referenzmethode zu ermitteln.

Dieses Ergebnis lässt eine unvollständige Entfernung von membrangeschädigten

Zellen oder freier DNA mit dem Zentrifugationsüberstand vermuten. Im Gegensatz

dazu konnte bei der Filtrationsmethode eine hohe Übereinstimmung der qPCR mit

und ohne EMA im Vergleich zur mikrobiologischen Keimzählung erzielt werden.

Obwohl ähnliche prozentuale Anteile lebender und toter Zellen in der

fluoreszenzmikroskopischen Auswertung nach Anwendung beider

Isolierungsverfahren (Filtration und Zentrifugation) ermittelt wurden, fiel ein

Unterschied der qPCR-Ergebnisse mit und ohne EMA nur nach Zentrifugation der

Proben auf. Diese zunächst widersprüchlich erscheinenden Ergebnisse könnten aus

einem unterschiedlichen Anfärbeverhalten der verwendeten Farbstoffe, nicht visuell

erkennbare Veränderungen in der Fluoreszenz oder kleinen Bruchstücke der DNA

bzw. einzelsträngige DNA in der Probe, die sich in der Fluoreszenzmikroskopie nicht

Diskussion 87

anfärben lassen, resultieren. Dies müsste in weiterführenden Untersuchungen

geklärt werden.

Wie bereits oben erwähnt, konnte nach Isolierung der Keime mittels

Membranfiltration eine gute Übereinstimmung der qPCR-Ergebnisse mit und ohne

EMA-Vorbehandlung der Zellen erzielt werden. Daraus lässt sich vermuten, dass bei

der Filtration der Proben überwiegend membrangeschädigte Zellen oder freie DNA

die Filterporen passieren, welches auch in einer Studie von CLARK et al. (2011)

beobachtet wurde. Dies kann als ein Vorteil der Filtrationsmethode gegenüber der

Zentrifugationsmethode für die Anwendung der EMA-qPCR zur Detektion lebender

Zellen angesehen werden, da die Effektivität der EMA-qPCR durch den reduzierten

Anteil toter Zellen oder freier DNA wahrscheinlich gesteigert werden kann.

6.2.2.3. Einfluss der verwendeten Wasserart für ein en Nachweis lebender

Campylobacter-Zellen aus Wasserproben

In einem nächsten Schritt wurde der Einfluss verschiedener Wasserarten auf die

Membranintegrität der Zellen und auf die Ergebnisse der qPCR getestet. Dafür

wurden Oberflächenwasser und Leitungswasser mit Campylobacter spp. versetzt

und im Vergleich zur NaCl-Probe (0,9 %) untersucht, die als Kontrollprobe mitgeführt

wurde.

6.2.2.4. Limitierungen bei Verwendung von Oberfläch enwasser

Bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung von Oberflächenwasser wurde im

Vergleich zur NaCl-Probe ein höherer Prozentsatz toter Zellen in der Probe detektiert

(bis zu 81,59 %), welcher sich signifikant von den Ergebnissen bei Verwendung von

NaCl unterschied (41,10 %). Vermutlich ist dies durch eine starke bakterielle

Hintergrundflora bedingt (ABULREESH et al. 2005), da mit dem

fluoreszenzmikroskopischen Verfahren keine Unterscheidung zwischen

unterschiedlichen Bakterienspezies erfolgen kann. Tatsächlich werden mit dem

88 Diskussion

Verfahren alle Bakterien in der Probe sowie freie DNA angefärbt. Eine Erklärung für

die hohe Anzahl toter Zellen in der Probe kann dabei der Zeitpunkt der Probenahme

sein. Diese wurde zwischen Oktober und Dezember 2012 durchgeführt, welches eine

geringe Temperatur sowie einen geringen Nähr- und Sauerstoffgehalt in der

Wasserprobe bedingt und somit die Überlebensrate der Bakterien in

Oberflächenwasser reduziert (OBIRI-DANSO et al. 2001).

Die Ergebnisse der EMA-qPCR bei Testung von Oberflächenwasser zeigten

signifikant höhere Keimkonzentrationen im Vergleich zur mikrobiologischen

Referenzmethode. Dies ist vermutlich bedingt durch die hohe bakterielle

Hintergrundflora an membrangeschädigten, toten Zellen in der Probe. Die Anzahl der

toten Zellen war vermutlich zu hoch, als dass diese vollständig die Filterporen

passieren und somit verloren gehen können. Da interkalierende Substanzen wie

EMA eine Differenzierung lebender und toter Zellen aufgrund der

Membranpermeabilität ermöglichen, jedoch hierbei keine Unterscheidung

verschiedener Bakterienspezies erzielen können, bindet vermutlich ein Teil der

interkalierenden Substanz an die DNA der membrangeschädigten Bakterien aus der

Hintergrundflora. Folglich stehen nicht genug freie EMA-Moleküle zur Verfügung, um

tote Campylobacter-Zellen in der Probe zu hemmen. Demzufolge konnte bei dem

verwendeten Oberflächenwasser mittels der EMA-qPCR keine ausreichende

Differenzierung lebender Zellen erbracht werden. Eine schlechte Differenzierung

mittels interkalierender Substanzen bei Verwendung von Oberflächenwasser mit

einer hohen bakteriellen Hintergrundflora konnte auch in Studien anderer Autoren

beobachtet werden (WAGNER et al. 2008, BAE und WUERTZ 2009, GEDALANGA

und OLSON 2009). Neben der Reduzierung der effektiven Substanzkonzentration

von EMA durch Bindung an DNA von Zellen aus der Hintergrundflora können zudem

organische und anorganische Komponenten in der Wasserprobe den

Photoaktivierungsprozess von EMA behindern (FITTIPALDI et al. 2011). Bei Proben

mit hoher Partikeldichte, wie bei einer starken Hintergrundflora oder bei hohen

Anteilen von organischen und anorganischen Komponenten, kann die daraus

resultierende Absorption von Licht während der Photoaktivierung zu einer

Diskussion 89

reduzierten Bindung der EMA-Moleküle an die DNA führen und somit die Effizienz

der EMA-qPCR reduzieren (RUDI et al. 2005).

Die Effektivität der Licht-induzierten Photoaktivierung ist zum einen für die Bindung

der interkalierenden Substanzen an die DNA wichtig und zum anderen für die

hydrolytische Inaktivierung überschüssiger, freier Substanz in der Probe, die nicht in

membrangeschädigte Zellen eindringen konnte (CENCIARINI-BORDE et al. 2009).

PISZ et al. (2007) vermuteten zudem in ihrer Studie zum Nachweis von Escherichia

coli in Wasserbiofilmen, dass organisches Material Kationen binden kann und somit

die verfügbare Konzentration von EMA reduzieren kann. In Studien von WAGNER et

al. (2008) an Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes und Salmonella

enterica sowie von BAE und WUERTZ (2009) an Bacteroides fragilis konnten bei

Wasserproben mit hohen Anteilen an Schwebstoffen [1000 mg/l „total suspended

solids“ (TSS)] mittels EMA und PMA-qPCR keine ausreichende Differenzierung

lebender und toter Zellen erreicht werden. LUO et al. (2010) postulierten in ihrer

Studie an Wasserproben mit Schlammbestandteilen und Sedimenten, dass eine

maximale Trübung von 10 Nephelometrischen Trübungswerten (NTU) nicht

überschritten werden sollte, um einen nachteiligen Effekt auf die PMA

Photoaktivierung zu vermeiden. Diese Ergebnisse wurden von GEDALANGA und

OLSON (2009) bestätigt, welche bei Abwasserproben mit Trübungsgraden von über

10 NTU falsch positive Resultate beim Nachweis lebender Escherichia coli erzielten.

Zur Verbesserung der Resultate verdünnten sie die Proben auf 1 - 2 NTU bevor eine

EMA Behandlung durchgeführt wurde. Die Autoren schlussfolgerten daraus eine gute

Eignung dieses Verdünnungsverfahrens bei hohen bakteriellen Konzentrationen in

der Probe, wiesen jedoch darauf hin, dass bei geringen Keimkonzentrationen der

relative Überschuss von EMA zu falsch negativen Resultaten führen könne

(GEDALANGA und OLSON 2009). Für die Gattung Campylobacter lagen bislang in

der Literatur noch keine Untersuchungen vor.

Für eine zukünftige Verbesserung der Methode bei Verwendung von

Oberflächenwasser sind verschiedene Ansätze denkbar. HELLEIN et al. 2012

berichteten, dass die Filterart die Isolierungsrate der Bakterien beeinflussen könne.

90 Diskussion

Bei Umweltwasserproben mit einer hohen Hintergrundflora seien dabei

Polyethersulfon-Filter besser geeignet als Polycarbonat-Filter, um eine Verstopfung

der Filtermembran zu vermeiden (HELLEIN et al. 2012).

Ein weiterer Ansatz zur Verbesserung der EMA-qPCR Resultate bei Verwendung

von Oberflächenwasser mit hoher bakterieller Hintergrundflora könnte eine

Doppelbehandlung der Proben mit EMA sein, welche in der vorliegenden Arbeit

beschrieben wurde. Mit dieser Methode war eine signifikante Reduktion der

Amplifikationssignale toter Campylobacter-Zellen mittels qPCR im Vergleich zu einer

einmaligen EMA-Behandlung zu erzielen. Eine weitere Möglichkeit zur Steigerung

der Signalreduktion von membrangeschädigten Zellen bei Wasserproben mit einer

hohen bakteriellen Hintergrundflora kann die Amplifikation längerer Zielsequenzen in

der qPCR darstellen, welche in Kapitel 6.1.6.2. beschrieben wurde.

6.2.2.5. Testung von Leitungswasser, Mineralwasser und Regenwasser

Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Oberflächenwasser ließen die Resultate bei

Verwendung von Leitungswasserproben auf eine Eignung der Methode schließen.

Die fluoreszenzmikroskopischen Auswertungen von mit Campylobacter spp.

versetzten Leitungswasserproben zeigten vergleichbare prozentuale Anteile lebender

und toter Zellen im Vergleich zur NaCl-Kontrollprobe. Aus diesen Ergebnissen lässt

sich vermuten, dass die Integrität der bakteriellen Zellmembran durch Verwendung

von Leitungswasser nicht beeinträchtigt wurde. Demzufolge zeigten die Ergebnisse

der qPCR mit und ohne EMA-Zugabe bei lebenden Campylobacter-Zellen nach

Membranfiltration der Proben eine gute Übereinstimmung zu den Ergebnissen der

mikrobiologischen Referenzmethode. Dieses zeigte sich in einer hohen Korrelation in

der Pearson-Regressionsanalyse und ließ sich auch mittels einer Bland-Altman

Analyse bestätigen. Auch die Testung weiterer Wasserarten wie Mineralwasser und

Regenwasser ließ auf eine gute Eignung der EMA-qPCR Methode zum Nachweis

lebender Campylobacter schließen. In Analogie zu den Ergebnissen bei Verwendung

von Leitungswasser konnten auch bei den Mineralwasser- und Regenwasserproben

Diskussion 91

hohe Korrelationen zwischen den Ergebnissen der EMA-qPCR und der

mikrobiologischen Keimzählung erzielt werden. Die Methoden-

vergleichsuntersuchung mittels Bland-Altman Analyse zeigte bei diesen Wasserarten

ebenfalls eine hohe Übereinstimmung der beiden Detektionsmethoden.

Die Überlegenheit der EMA-qPCR Methode konnte anschließend bei Verwendung

von Gemischen aus lebenden und toten Campylobacter-Zellen (bis zu 1:100 lebende

zu toten Zellen) gezeigt werden, mit denen die Leitungswasserproben versetzt

wurden. Dabei konnte eine hohe Übereinstimmung der EMA-qPCR Methode mit der

mikrobiologischen Referenzmethode in einer vergleichenden Bland-Altman Analyse

erzielt werden. Vergleichbare Ergebnisse wurden in Studien anderer Autoren erzielt,

in denen mit Verwendung von interkalierenden Substanzen die bakteriellen Spezies

Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila und Escherichia coli aus

Wasserproben mittels der Membranfiltration detektiert und quantifiziert werden

konnten (GEDALANGA und OLSON 2009, YÁÑEZ et al. 2011, HELLEIN et al. 2012).

In der DIN EN ISO 17995:2005 Methode zum „Nachweis und Zählung von

wärmebeständigen Campylobacter“ werden zur Bestimmung der „most probable

number“ (MPN) Wasserproben mit Volumina von 10 ml, 100 ml und 1000 ml

verwendet. Damit wird in der ISO-Methode teilweise ein höheres Probenvolumen als

in der vorliegenden Studie verwendet. In dieser Studie wurden kleine Volumina (10

ml) eingesetzt, um die Handhabung der Proben zu erleichtern und um die prinzipielle

Eignung einer qPCR zur Differenzierung lebender und toter Campylobacter-Zellen

mittels EMA für den Einsatz bei Wasserproben zu testen. Eine Anwendung höherer

Probenvolumina sollte dennoch ohne Schwierigkeiten möglich sein, da sich die

Membranfiltrationsmethode in Studien anderer Autoren, welche Wasserproben von

bis zu 100 Litern verwendet haben, als geeignete Methode zur Isolierung von

Keimen dargestellt hat (HIJNEN et al. 2000, HELLEIN et al. 2012, ABULREESH et

al. 2005, KHAN et al. 2009).

92 Diskussion

6.3. Schlussfolgerung

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig ein Vergleich der beiden

Differenzierungsmittel EMA und PMA für den Nachweis und die Quantifizierung von

lebenden Campylobacter spp. mittels qPCR durchgeführt. Dabei zeigten beide

Substanzen eine sehr gute Eignung zur Differenzierung von lebenden und toten

Campylobacter-Zellen. Unterschiedliche Vor- und Nachteile sowie methodische

Limitierungen bei der Verwendung von EMA oder PMA wurden dabei aufgezeigt.

Anschließend wurde ein Methodenprotokoll unter Verwendung von EMA erfolgreich

etabliert. Bei der Testung der entwickelten Methode an Lebensmittelproben konnte

an der Matrix Geflügelfleisch eine gute prinzipielle Eignung der EMA-qPCR Methode

zur Quantifizierung und zur Differenzierung von lebenden und toten Campylobacter

spp. Zellen gezeigt werden. Bei der Testung der Methode an Wasserproben zeigten

Faktoren wie die Isolierungsmethode oder die Art der Wasserprobe einen Einfluss

auf die qPCR Resultate. Für einen Nachweis lebender Campylobacter spp. aus

Leitungswasser-, Regenwasser- und Mineralwasserproben stellte sich die EMA-

qPCR als vielversprechende Methode dar. Eine Weiterentwicklung dieser

vielversprechenden Methode ist aber zu empfehlen, um die dargestellten

Limitierungen zu umgehen.

Zusammenfassung 93

7. Zusammenfassung

Diana Seinige

Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Sub stanzen

Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid für eine qua ntitative Bestimmung

lebender Campylobacter-Zellen aus Lebensmittelproben und Wasser mittels

real-time PCR

Campylobacter (C.) spp. sind europaweit die häufigsten bakteriellen Lebensmittel-

infektionserreger und verursachen gastrointestinale Infektionen beim Menschen.

Dabei werden jährlich steigende Fallzahlen berichtet. Als überwiegende

Infektionsquelle gilt kontaminiertes Geflügelfleisch, aber auch kontaminiertes Trink-

und Oberflächenwasser stellen eine zunehmend wichtige Quelle für humane

Infektionen mit Campylobacter spp. dar. Daher ist eine schnelle und zuverlässige

Diagnostikmethode zur Detektion von Campylobacter spp. dringend erforderlich. Die

fehlende Differenzierung von lebenden und somit potentiell infektiösen Zellen von

toten Zellen limitiert aber die Anwendung der quantitativen real-time PCR (qPCR) in

der Routinediagnostik an Lebensmittelproben. In jüngster Zeit wurde deshalb die

qPCR in Kombination mit DNA-interkalierenden Substanzen, wie Ethidiummonoazid

(EMA) und Propidiummonoazid (PMA), eingesetzt, um eine Unterscheidung

zwischen lebenden und toten Zellen zu ermöglichen. Diese Substanzen dringen in

membrangeschädigte Zellen ein und verhindern durch ihre Bindung an die zelluläre

DNA eine Amplifikation dieser DNA in der anschließenden PCR.

Ziel der vorliegenden Studie war es, ein qPCR-basiertes Nachweisverfahren in

Kombination mit einer interkalierenden Substanz für thermotolerante Campylobacter

spp. zu etablieren, welches einen schnellen quantitativen Erregernachweis

ermöglicht. Zudem sollte die Eignung der Methode an Proben verschiedener

Lebensmittelmatrices, wie Geflügelfleisch und Wasser, getestet werden.

94 Zusammenfassung

In den ersten Versuchsreihen wurde eine qPCR Methode zum Nachweis

thermotoleranter Campylobacter-Zellen etabliert. Dafür wurde eine Standardkurve

zur Berechnung der Keimkonzentration in einer Probe erstellt. Bei dieser

Standardkurve konnte eine hohe Korrelation zwischen den aus Ct-Werten der qPCR

errechneten Keimgehalten und den eingesetzten Keimkonzentrationen ermittelt

werden. Zudem wurde eine hohe PCR-Effizienz von 98,9% errechnet. In einem

nächsten Schritt wurde der Einfluss der interkalierenden Substanzen EMA und PMA

in unterschiedlichen Konzentrationen getestet. Dabei konnte sowohl bei Verwendung

von EMA als auch von PMA eine konzentrationsabhängige Verschiebung der

Detektionskurve mit höheren Ct-Werten in der qPCR beobachtet werden. Aufgrund

dieser Verschiebung wurde die Standardkurve auf die Versuchsbedingungen

angepasst und mittels einer Vorbehandlung der Zellen mit EMA oder PMA erstellt.

Diese neu erstellte Standardkurve wurde erstmalig zusammen mit einem internen

DNA-Standard für die Berechnung der Keimkonzentrationen verwendet. Dabei

konnten hohe Korrelationen zur mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden.

Anschließend wurde die Differenzierungskraft der interkalierenden Substanzen bei

Gemischen aus lebenden und toten Zellen getestet. In diesen Versuchsreihen

zeigten EMA (10 µg/ml) und PMA (51,10 µg/ml) eine gute Eignung zur

Differenzierung lebender von toten Zellen bei bis zu 1:1000 lebenden zu toten Zellen

in den Gemischen. In weiteren Versuchsreihen wurde die Signalreduktion in der

qPCR bei einer Vorbehandlung von hitzeinaktivierten Zellen mit den interkalierenden

Substanzen untersucht. Bei einer hohen Konzentration an toten Zellen (>104 KbE/ml)

war eine unvollständige Signalreduktion zu beobachten. Um diese Limitierung zu

umgehen wurde erstmalig eine Doppelbehandlung der Campylobacter spp.-Zellen

mit EMA (10 µg/ml) durchgeführt. Dabei konnten die Resultate deutlich verbessert

werden, so dass eine ausreichende Signalreduktion bei bis zu 106 KbE/ml an toten

Zellen erzielt wurde. Das erstellte EMA-qPCR Protokoll wurde in weiteren

Versuchsreihen an C. jejuni- und C. coli-Feldisolaten erfolgreich getestet. Dabei

konnte eine hohe Korrelation zwischen den Resultaten der qPCR und der

mikrobiologischen Referenzmethode ermittelt werden. Die etablierte EMA-qPCR

Methode wurde nachfolgend für die Anwendung an Proben der Lebensmittelmatrix

Zusammenfassung 95

Geflügelfleisch getestet. Dafür wurden verschiedene Versuchsreihen mit gespikten

Hühnerfleischproben angeschlossen, bei welchen die EMA-qPCR Methode eine sehr

gute Eignung zur Detektion lebender Campylobacter-Zellen zeigte. Dabei konnte

eine hohe Übereinstimmung der Ergebnisse aus der EMA-qPCR und der

mikrobiologischen Keimzählung ermittelt und durch eine

Methodenvergleichsuntersuchung mittels einer Bland-Altman Analyse bestätigt

werden. Zur Testung der Methode bei Wasserproben wurden in einem ersten Schritt

zwei Reisolierungsmethoden vergleichend untersucht (Membranfiltration,

Zentrifugation). Bei beiden Methoden kam es zu einem Keimverlust nach der

Zentrifugation oder der Membranfiltration und die prozentualen Anteile lebender und

toter Zellen verschoben sich zugunsten der lebenden Zellen. In weiteren

Versuchsreihen wurden die Reisolierungsmethoden in Kombination mit der qPCR

Methode getestet. Bei Filtration der Proben konnte eine hohe Übereinstimmung

zwischen den Ergebnissen der qPCR und der EMA-qPCR im Vergleich zur

kulturellen Keimzählung ermittelt werden. Im Gegensatz dazu war bei der

Zentrifugation ein höherer Keimgehalt in der qPCR ohne EMA zu detektieren. Der

Einfluss von verschiedenen Wasserarten auf die Ergebnisse der qPCR wurde in

anschließenden Versuchen ermittelt. Dabei wurde in Oberflächenwasser eine hohe

Anzahl an toten Zellen detektiert, so dass mittels der EMA-qPCR keine korrekte

Bestimmung lebender Zellen möglich war. Bei Verwendung von Leitungswasser,

Regenwasser oder Mineralwasser konnten hohe Korrelationskoeffizienten zwischen

den Ergebnissen der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung ermittelt

werden. Die Eignung der Methode für diese Wasserarten wurde in einer

Methodenvergleichsuntersuchung mittels Bland-Altman Analyse bestätigt. Die

Anwendung der Methode bei Campylobacter-Feldisolaten erzielte eine hohe

Übereinstimmung zur mikrobiologisch ermittelten Keimkonzentration. Die

Überlegenheit der EMA-qPCR Methode konnte zudem an definierten Gemischen aus

lebenden und toten Zellen bestätigt werden.

Sowohl bei Geflügelfleisch als auch bei Wasserproben zeigte sich die EMA-qPCR

Methode als vielversprechend zur Detektion lebender Campylobacter-Zellen.

96 Zusammenfassung

Aufgrund der aufgezeigten Limitierungen sollte eine weitere Validierung der Methode

durchgeführt werden.

Summary 97

8. Summary

Diana Seinige

Investigation of the suitability of the intercalati ng dyes ethidium monoazide

and propidium monoazide for a quantitative detectio n of viable Campylobacter-

cells in food samples and water by real-time PCR

In Europe, Campylobacter (C.) spp. are the most common bacterial food-borne

pathogens. Campylobacter spp. are the causative agents of gastrointestinal

infections in humans and increasing annual numbers of cases are reported. The

predominant source of infection is poultry meat, however contaminated drinking- and

surface water are also important sources of human infections with Campylobacter

spp. Hence, a fast and reliable diagnostic method for the detection of Campylobacter

spp. is urgently required. The lack of differentiation between viable and potentially

infectious cells from nonviable cells limits the implementation of quantitative real-time

PCR (qPCR) methods in routine diagnostic analysis of food samples. Recently,

combinations of qPCR assays and ethidium monoazide (EMA) or propidium

monoazide (PMA) pretreatments of cells have been proposed to achieve a

differentiation between viable and nonviable cells. EMA and PMA penetrate

membrane damaged cells and bind to cellular DNA, preventing the amplification of

DNA in subsequent qPCR experiments.

The aim of the present study was to develop a qPCR based detection method in

combination with the use of an intercalating dye for a rapid quantitative detection of

thermotolerant Campylobacter spp. In addition, the applicability of the method for

different food matrices, such as poultry meat and water was determined.

In the first series of experiments, a qPCR method for the detection of thermotolerant

Campylobacter was used. For this, a standard curve was generated for calculating

the quantities of CFU in a sample. By using this standard curve a high correlation

98 Summary

between the amount of Campylobacter spp. calculated from qPCR results and

microbiological cell enumeration was determined. The PCR efficiency corresponded

to 98.9%. In a subsequent step, the influence of the intercalating dyes EMA and PMA

on qPCR results was determined. For this, EMA and PMA were tested at different

concentrations. Results from qPCR experiments revealed concentration dependent

shifts towards higher Ct-values after application of the intercalating dyes EMA and

PMA. Therefore, the standard curve was adapted to the experimental conditions and

Campylobacter-cells were pretreated with PMA or EMA. This adapted standard curve

was used together with an internal DNA standard for quantifying Campylobacter from

food samples. A high correlation coefficient value was achieved from a plot of log10

cell counts determined by qPCR and culture enumeration. In a subsequent step, the

suitability of the intercalating dyes for differentiating between viable and nonviable

cells was tested in mixtures of live and heat-killed cells. EMA (10 µg/ml) and PMA

(51.10 µg/ml) removed DNA selectively from nonviable cells in mixed samples.

Furthermore, heat-killed cells were pretreated with the intercalating dyes and the

signal reduction in qPCR experiments was determined. At high concentrations of

dead cells (>104 CFU/ml), an incomplete signal reduction was observed. To

circumvent this limitation, a double staining of EMA (10 µg/ml) was performed and

clearly improved the signal reduction of nonviable Campylobacter-cells, if a limit of

106 CFU/ml was not exceeded. In further experiments the EMA-qPCR protocol was

successfully applied to C. jejuni and C. coli field isolates. A high correlation

coefficient value between the results of qPCR and the microbiological reference

method was calculated. The suitability of the EMA-qPCR method was subsequently

tested by using chicken meat samples. For this, chicken meat samples were spiked

with different quantities of Campylobacter. There was a linear relationship between

results from EMA-qPCR and the microbiological reference method and a method

comparison by Bland-Altman analysis showed a low variation between the methods.

In further experiments the suitability of the method was tested for water samples. For

this, two methods frequently used for the isolation of bacteria were comparatively

analyzed (membrane filtration, centrifugation). The application of both methods

Summary 99

resulted in a loss of Campylobacter-cells and an accumulation of viable cells in the

samples. After recovery of cells by membrane filtration and centrifugation, the qPCR

method with and without EMA was used. After filtration of samples, a high agreement

between results of qPCR, EMA-qPCR and the microbiological enumeration was

achieved. In contrast, after centrifugation of samples, qPCR without EMA

overestimated the quantities of Campylobacter CFU/ml. In subsequent experiments,

the influence of different types of water on the results of qPCR was determined. A

high percentage of dead cells was detected in surface water by fluorescence

microscopy, resulting in an incorrect determination of viable cells by EMA-qPCR. In

contrast, results from tap water, rain water or mineral water samples revealed high

correlation coefficient values between results from EMA-qPCR and the

microbiological cell enumeration. The suitability of EMA-qPCR for analysis of these

types of water samples was confirmed by Bland-Altman analysis. In addition, field

isolates were subjected to EMA-qPCR quantification and a high correlation

coefficient value between results from EMA-qPCR and culture enumeration was

achieved. However, when defined mixtures of viable and nonviable cells were used,

an advantage of the EMA-qPCR method over qPCR without EMA pretreatment was

detected.

In conclusion, EMA-qPCR seems to be a promising method for the detection of

viable Campylobacter-cells from chicken meat and water samples but further studies

are needed to overcome the limitations.

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2013 Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB) vom 7. August 2013 ISO Normen DIN EN ISO 10272: 2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. – Part:1: detection method (ISO 10272-1:2006), German version EN ISO 10272-1:2006 (deutsch: Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln - Horizontales Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von Campylobacter spp. - Teil 1: Nachweisverfahren (ISO 10272-1:2006); Deutsche Fassung EN ISO 10272-1:2006) DIN ISO 17995: 2005 Water Quality. Detection and Enumeration of Thermotolerant Campylobacter Species. International Organization for Standardization, Geneva, Switzerland. (deutsch: Wasserbeschaffenheit - Nachweis und Zählung von wärmebeständigen Campylobacter)

Danksagung 129

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt meinen beiden Betreuern Frau Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD und Herrn Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein für die Überlassung dieses interessanten Themas und die Möglichkeit diese Arbeit im Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit anfertigen zu können. Besonders danken möchte ich an dieser Stelle Frau Prof. Kehrenberg für die hervorragende wissenschaftliche Betreuung während der Zeit meiner Doktorarbeit, die vielen konstruktiven Gespräche und die immer währende Bereitschaft zur Hilfestellung sowie die stets freundliche und geduldige Arbeitsatmosphäre. Dank ihrer besonderen Fachkompetenz habe ich während dieser Zeit viel lernen können. Für die finanzielle Förderung von Teilen dieser Arbeit gilt mein Dank dem Sanitätsamt der Bundeswehr, vertreten durch den Oberstabsveterinär Herrn Dr. Alfred Binder. Für die finanzielle Unterstützung der Standardisierungsarbeiten der Methode danke ich dem Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie. Danken möchte ich auch Herrn PD Dr. med. vet. Carsten Krischek für seine Bereitschaft sich in die komplizierten Sachverhalte etwaiger Fragestellungen einzuarbeiten und sein offenes Ohr bei der Diskussion von statistischen Auswertungen. Eine andere Sicht auf die Dinge kann manchmal sehr hilfreich sein. Frau PD Dr. rer. nat. Maren von Köckritz-Blickwede danke ich herzlich für die Möglichkeit im Institut für Physiologische Chemie die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen durchführen zu können und für ihre Hilfestellung bei den Auswertungen trotz ihrer sehr knapp bemessenen Zeit. Für die Anleitung bei der Verwendung des Statistikprogrammes bin ich ihr besonders dankbar. Allen Mitarbeitern des Instituts, vor allem auch meinen Mit-Doktoranden und den technischen Mitarbeitern im PCR-Labor, möchte ich für die schöne und erlebnisreiche Zeit, ihre Unterstützung und die angenehme Arbeitsatmosphäre während der Doktorarbeit danken. Herrn Manfred Merle danke ich für die Hilfe bei Problemen mit dem Computer. Ganz besonders meiner Mit-Doktorandin und Bürokollegin, Ulrike Rensch, danke ich für die harmonische gemeinsame Zeit, für die vielen interessanten Gespräche, für die gegenseitige Unterstützung und für den Einblick in die „Welt der Lebensmittelchemie“, so dass aus einer Kollegin eine wahre Freundin wurde. Meiner Familie und insbesondere meinen Eltern und meiner Schwester danke ich sehr, dass sie mich auf meinem Weg fortwährend unterstützt haben und dabei einen sehr großen finanziellen, verständnisvollen und hilfreichen Teil geleistet haben. Herzlichen Dank für Eure Unterstützung und Geduld!

130 Danksagung

Zuletzt und ganz besonders von Herzen, danke ich meinem lieben Daniel für all die Unterstützung während der Zeit meiner Doktorarbeit. Ich danke Dir für Dein Verständnis und die Aufmunterungen sowie deine Bereitschaft Dich in das Arbeitsleben in einem Labor hineinzuversetzen, so dass auch für Dich die „Risikolebensmittel“ kein Fremdwort mehr sind. Ich freue mich sehr, dass es Dich gibt!

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