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Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für Infektionsmedizin, Institut für Mikrobiologie und Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin/Ambulatorische Klinik Vergleichende Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer Streptococcus suis- Ganzzell- und einer Subunitvakzine INGUAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.) vorgelegt von Katharina Bennecke aus Braunschweig Hannover 2008

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Zentrum für Infektionsmedizin, Institut für Mikrobiologie und Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin/Ambulatorische Klinik

Vergleichende Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer Streptococcus suis- Ganzzell- und einer Subunitvakzine

INGUAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades

einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Katharina Bennecke aus Braunschweig

Hannover 2008

Page 2: Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für ... · Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für Infektionsmedizin, Institut für Mikrobiologie und Klinik für kleine Klauentiere

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Prof. Dr. K. H. Waldmann

1. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Prof. Dr. K. H. Waldmann

2. Gutachter: PD Dr. E. große Beilage

Tag der mündlichen Prüfung: 15. Mai 2008

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Meinen Eltern

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Folgende Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits publiziert bzw. eingereicht:

BEINEKE,A., BENNECKE,K., NEIS,C., SCHRÖDER,C., WALDMANN,K.H.,

BAUMGÄRTNER,W., VALENTIN-WEIGAND,P., BAUMS,C.G. (2007)

Comparative evaluation of virulence and pathology of Streptococcus suis serotype 2

and 9 in experimentally infected growers

Vet Microbiol. in press (Available online 4. November 2007).

BENNECKE, K., SCHRÖDER, C., WALDMAN, K.H., BEINEKE, A., GOETHE, R.

VALENTIN-WEIGAND, P. , BAUMS, C.G.

„Vergleichende Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer S. suis -Ganzzell- und

einer Subunitvakzine“ auf dem 27. DVG-Kongress „Tierseuchenbekämpfung im

Spannungsfeld zwischen Wissenschaft und öffentlichen Interresse“ am 12.4.-

14.4.2007 in Berlin, Poster.

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Inhalt

1 Einleitung........................................................................................11

2 Literatur...........................................................................................13

2.1 S. suis............................................................................................................ 13

2.2 Klinik von S. suis- Infektionen........................................................................ 13

2.3 Pathologie von S. suis- Infektionen ............................................................... 14

2.4 Diagnostischer Nachweis von S. suis............................................................ 15

2.5 Epidemiologie von S. suis ............................................................................. 18

2.6 Pathogenese von S. suis- Infektionen ........................................................... 18

2.7 Virulenzfaktoren von S. suis .......................................................................... 19

2.8 Therapie und Prophylaxe von S. suis- Infektionen ........................................ 21

2.9 Immunisierungen zum Schutz gegen S. suis- Infektionen ............................. 21

2.10 Subunitvakzinen ............................................................................................ 23

2.10.1 Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien ................................................. 24

3 Material und Methoden ..................................................................26

3.1 S. suis-Stämme ............................................................................................. 26

3.2 Kultivierung der Bakterien ............................................................................. 26

3.3 Gewinnung und Einstellung der Belastungskultur ......................................... 27

3.4 Durchführung der Infektionsversuche (Allgemeine Ausführungen) ............... 27

3.4.1 Tierversuchsgenehmigungen.................................................................. 27

3.4.2 Herkunftsbestand.................................................................................... 28

3.4.3 Klinische Untersuchung .......................................................................... 28

3.4.4 Entnahme von Blutproben für die Erstellung eines Blutbildes und

Gewinnung von Serum ........................................................................... 29

3.4.5 Anästhesie der Versuchstiere ................................................................. 30

3.4.6 Ablauf der Sektion zur Untersuchung auf eine S. suis-Infektion ............. 30

3.4.7 Pathohistologische Untersuchung .......................................................... 31

3.5 Etablierung des Tiermodells für S. suis-Serotyp 9......................................... 32

3.5.1 Intranasale Infektion................................................................................ 32

3.5.2 Intravenöse Infektion............................................................................... 32

3.6 Herstellung der Vakzinen .............................................................................. 33

3.6.1 Ganzzellvakzine...................................................................................... 33

3.6.2 Subunitvakzine ....................................................................................... 33

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3.7 Immunisierungsversuche............................................................................... 34

3.7.1 Immunisierungsversuche mit homologer Belastungsinfektion ................ 35

3.7.2 Immunisierungsversuch mit heterologer Belastungsinfektion ................. 35

3.8 Kulturelle Untersuchung auf S. suis .............................................................. 36

3.9 Genotypische Differenzen von S. suis........................................................... 37

3.9.1 Präparation chromosomaler Streptokokken-DNA ................................... 37

3.9.2 Multiplex-PCR......................................................................................... 39

3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ............................................. 40

3.11 Herstellung eines rekombinanten EF-Fragmentes (rEFfrag) als ELISA-

Antigen .......................................................................................................... 43

3.11.1 Herstellung eines Anti-rEF Antiserums ................................................... 44

3.11.2 Bestimmung der Proteinkonzentration .................................................... 44

3.11.3 SDS-PAGE ............................................................................................. 44

3.11.4 Comassieblau-Färbung........................................................................... 45

3.11.5 Western Blot (BURNETT 1981) .............................................................. 46

3.12 Statistische Auswertung der Ergebnisse ....................................................... 46

4 Ergebnisse......................................................................................47

4.1 Etablierung eines S. suis-Serotyp-9-Tiermodells........................................... 47

4.1.1 Vergleichende experimentelle Infektion mit S. suis-Serotyp 2 und

Serotyp-9-Stamm A3286/94 ................................................................... 47

4.1.2 Pathologische und pathohistologische Befunde nach

experimentellen Infektionen mit S. suis-Serotyp 2 und Serotyp-9-

Stamm A3286/94 .................................................................................... 48

4.1.3 Reisolierung der Belastungsstämme (A3286/94 und Stamm 10) ........... 52

4.2 Protektive Wirkungen einer Ganzzell- und Subunitvakzine gegenüber

homologen und heterologen Belastungsinfektionen mit S. suis-Serotyp 2

bzw. 9 Stämmen............................................................................................ 53

4.2.1 Protektive Wirkung einer S. suis-Ganzzellvakzine.................................. 54

4.2.2 Untersuchung der protektiven Wirkung einer S. suis-Subunitvakzine

aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) .............................................. 59

4.3 Antikörperantworten von Schweinen nach experimenteller Infektion mit

S. suis- Serotyp-2-Stamm 10 und Serotyp-9-Stamm A3286/94 .................... 70

4.3.1 Experimentelle Infektion zur Etablierung des S. suis-Serotyp-9-

Stamm A3286/94 Modells....................................................................... 70

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4.3.2 Immunisierungs- und Belastungsversuche ............................................. 72

4.3.3 Abschätzung der Bedeutung von MRP- und MAP-spezifischen

Antikörpertitern (Gesamt IgG) als prognostische Indikatoren ................. 77

5 Diskussion ......................................................................................79

6 Zusammenfassung ........................................................................85

7 Summary.........................................................................................88

8 Literaturverzeichnis .......................................................................90

9 Anhang..........................................................................................105

9.1 Abbildungsverzeichnis..................................................................................116

9.2 Tabellenverzeichnis......................................................................................118

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Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

A. bidest. Aqua bidestilla (zweifach destilliertes Wasser)

AFLP engl.: amplified fragment-length polymorphism

AH Aluminiumhydroxid

AK Antikörper

Appl. Applikationsart

APS Ammonium Persulfate

bzw. beziehungsweise

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

cps engl.: capsular polysaccharides

Da Dalton

dATP 2’-Desoxy-Adenosin-5’-Triphosphat

dCTP 2’-Desoxy-Cytosin-5’-Triphosphat

dGTP 2’-Desoxy-Guanosin-5’-Triphosphat

d.h. das heißt

DIVA engl.: differentiating infected from vaccinated animals

DNA engl.: desoxyribonucleic acid

dNTP 2’-Desoxy-Nukleotid-5’-Triphosphat

dpi engl.: days post infectionem

dTTP 2’-Desoxy-Thymidin-5’-Triphosphat

EDTA engl.: ethylendiamine-tetraaceticacid

EF Extrazellulär Faktor

ELISA engl.: enzyme-linked immunosorbent assey

et al. et ali

evtl. eventuell

FIA engl. : Freund’s incomplete adjuvans

fbl. engl.: final bleeding

gdh Glutamatdehydrogenase

ggf. gegebenenfalls

ggr. geringgradig

GZV Ganzzellvakzine

hgr. hochgradig

i.m. Intramuskulär

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i.n. intranasal

insb. insbesondere

IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid

i.v. intravenös

LB Luria-Bertani

K Kontrollgruppe

KBE Kolonie bildende Einheit

kg Kilogramm

M Molar

MAP Murein-assoziierte Proteine

min. Minuten

mg Milligramm

mgr. mittelgradig

ml Milliliter

MLST engl.: multi locus sequence typing

mM millimolar

MP-PCR Multiplex PCR

MRP engl.: muramidase-released protein

MW Mittelwert

NaCl Natrium-Chlorid

OD Optische Dichte

ÖW Öl-in-Wasser

OFS engl.: opacity factor of S. suis

PBS engl.: phosphate buffered saline

PCR engl.: polymerase chain reaction

POD Peroxidase

prae imm. prae immun

PRRS Porzines Respiratorisches und Reproduktives Syndrom

post imm. post immun

prae Inf prae infectionem

post Inf. post infectionem

S. Streptococcus

SAS Statistical Analysis System for Windows

SDS engl.: sodium dodecylsulfate

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SDS-PAGE engl.: sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SLY Suilysin

ST Serotyp

Taq Thermus aquaticus

TCA Trichloressigsäure

TEMED Tetramethylethylendiamin

TEN Tris EDTA NaCl

THB Todd-Hewitt Broth

Th Helfer –T-Lymphozyten

TSB Tryptone Soya Broth

WO Wasser-in-Öl

(w/v) engl.: weight per volume (Gewicht pro Volumen)

V Volt

(v/v) engl.: volume per volume (Volumen pro Volumen)

z.B. zum Beispiel

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Einleitung

11

1 Einleitung

Streptococcus (S.) suis kann beim Schwein, vor allem in den ersten Lebenswochen,

Meningitis, Septikämie, Polyarthritis und plötzliche Todesfälle hervorrufen (BUSQUE

et al. 1997; HOLT et al. 1989; LAPOINTE et al. 2002; PALLARES et al. 2003;

REAMS et al. 1994). Zudem ist S. suis ein Zoonoseerreger, der beim Menschen vor

allem Meningitis auslösen kann (ARENDS u. ZANEN 1988; BUSQUE et al. 1997;

HOLT et al. 1989; LAPOINTE et al. 2002; REAMS et al. 1994). S. suis-Erkrankungen

gehören zu den Faktorenerkrankungen, da neben dem Infektionserreger biotische

und abiotische Faktoren eine wichtige Rolle für die Krankheitsentstehung spielen

(BAUMS et al. 2006; BERTHELOT-HERAULT et al. 2001; BERTHELOT-HERAULT

et al. 2005; CLIFTON-HADLEY et al. 1986).

Darüber hinaus besitzt der Erreger die Fähigkeit, Tonsillen, Schleimhäute des

Nasopharynx und des Genitaltraktes zu besiedeln, ohne jedoch eine Erkrankung

auszulösen (CLIFTON-HADLEY u. ALEXANDER 1980; KING et al. 2002; NORTON

et al. 1999; WILLIAMS et al. 1973). Inapparente Trägertiere können Ferkel mit einem

virulenten S. suis-Stamm durch Kontakt, wie zum Beispiel über den Genitaltrakt der

Sau, infizieren (CLIFTON-HADLEY et al. 1986).

Aufgrund der hohen Diversität der Kapselpolysaccharide sind derzeit 33 Serotypen

von S. suis bekannt. In Mitteleuropa werden Erkrankungen beim Hausschwein

hauptsächlich durch die Serotypen 2 und 9 verursacht (WISSELINK et al. 2001).

Für die Prophylaxe von S. suis-Erkrankungen steht in Deutschland kein kommerziell

erhältlicher Impfstoff zur Verfügung. Bei Bestandsproblemen mit S. suis werden oft

stallspezifische Vakzinen eingesetzt. Bei diesen handelt es sich um inaktivierte

Ganzzellvakzinen. S. suis-Subunitvakzinen kamen bis heute nur in experimentellen

Untersuchungen zum Einsatz. Experimentell wurden für unterschiedliche

Immunogene protektive Wirkungen gegenüber einer homologen Belastungsinfektion

aufgezeigt, d. h. Belastungsinfektionen mit dem selben Stamm. In der Praxis ist aber

auch mit dem Auftreten unterschiedlicher Serotypen zu rechnen, so dass die

protektive Wirkung gegenüber heterologen Serotypen für den Erfolg eines

Impfstoffes entscheidend ist. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der

Etablierung eines experimentellen Modells für Serotyp-9-Infektionen im Schwein.

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Einleitung

12

Dieses Modell sollte in Immunisierungsversuchen zur Untersuchung auf eine

heterologe Protektion gegenüber Serotyp 2 und Serotyp 9 eingesetzt werden. In

Vorarbeiten war bereits ein S. suis-Serotyp-2-Modell etabliert worden.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde die protektive Wirkung einer Subunitvakzine mit

einem Ganzzellimpfstoff in homologen und heterologen Belastungsversuchen

verglichen. Da viele Oberflächenproteine von Bakterien wichtige Antigene darstellen,

wurde die Subunitvakzine auf der Basis der Murein-assoziierten Fraktion hergestellt.

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Literatur

13

2 Literatur

2.1 S. suis

Bei S. suis handelt es sich um unbewegliche, grampositive, ovoide Kokken mit einer

Größe von ca. 1 μm. Diese liegen in Paaren oder selten in Kurzketten vor. Sie zeigen

ein fakultativ anaerobes Wachstum (KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1987). Die

Kolonien auf Blutagar haben nach 24 Stunden Bebrütung einen Durchmesser von

1-2 mm und sind grau und teilweise schleimig. Auf Schafblutagar zeigt S. suis eine

α-Hämolyse.

2.2 Klinik von S. suis- Infektionen

S. suis ist in der Lage, beim Schwein eine Reihe von sehr unterschiedlichen

Krankheitsbildern hervorzurufen. Nach einer Inkubationszeit von zwei bis zehn

Tagen treten klinische Veränderungen in Abhängigkeit von dem Manifestationsorgan

auf (WALDMANN u. WENDT 2004). Bei der „Enzootischen Streptokokkenmeningitis“

stellen sich im Verlauf der Erkrankung neben unspezifischen Symptomen, wie

Inappetenz und Fieber, zentralnervöse Störungen ein. Dies äußert sich meist in

motorischen Ausfallerscheinungen, wie Ataxien und Paresen. Häufig ist dieses

Erscheinungsbild mit einem Opisthotonus verbunden. Im fortgeschrittenen Stadium

treten Seitenzwangslage und Nystagmus auf. Im Zusammenhang mit einer

S. suis-Infektion kommt es weiterhin häufig zu akuten und hochgradigen Lahmheiten

mit schmerzhafter Schwellung und Rötung der Gelenke. Wenn mehrere Gelenke

betroffen sind, kann es zum Festliegen der Tiere kommen. Die Synovia hat meist

einen serofibrinösen bis eitrigen Charakter. Bei einer akuten S. suis-assoziierten

Peritonitis zeigen die Tiere eine Kyphose und eine starke Bauchdeckenspannung.

Bei einer Pleuritis kommt es zu erhöhter Atemfrequenz: Der Atemtyp wechselt von

costoabdominal zu abdominal. Des Weiteren können Pneumonie, Otitis media und

Endocarditis auftreten (REAMS et al. 1994; STAATS et al. 1997; STAATS et al.

1998a; STAATS et al. 1998b; STAATS et al. 1999a; STAATS et al. 1999b;

TORREMORELL u. PIJOAN 1998). Bei zentralnervösen Störungen sind neben der

Steptokokkenmeningitis noch Morbus Aujeszky, Kochsalzvergiftung und die

Krampfformen der Kolienterotoxämie differentialdiagnostisch in Betracht zu ziehen

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Literatur

14

(WALDMANN u. WENDT 2004). Die Haemophilus parasuis Polyserositis ist eine

wichtige Differentialdiagnose zur S. suis-assoziierten Peritonitis und Pleuritis.

2.3 Pathologie von S. suis- Infektionen

Fibrinös-eitrige Meningitiden gehören neben den akuten eitrigen Polyarthritiden,

fibrinösen Pleuritiden und Peritonitiden zu den pathologischen Veränderungen bei

S. suis-Serotyp-2-Infektionen. In Untersuchungen von MADSEN et al. (2002) über

S. suis-Serotyp 2, in denen nur die infizierten Tiere mit Läsionen berücksichtigt

wurden, zeigten 81% der Tiere typischene makroskopische Läsionen einer diffusen

exsudativen Meningitis, während 24% der Tiere eine exsudative Arthritis aufwiesen.

WILLIAMS und BLAKEMORE (1990b) fanden nach experimenteller intravenöser

Infektion die ersten Veränderungen im Gehirn am Plexus choroideus (Tabelle 1). Die

Autoren postulierten daher, dass der Eintritt von S. suis-Serotyp 2 ins Gehirn über

den Plexus choroideus erfolgt. S. suis-Infektionen manifestieren sich weiterhin häufig

in Gelenken, vor allem im Tarsal– und Karpalgelenk, und an der Serosa (WILLIAMS

u. BLAKEMORE 1990a). Bei einer Serositis, die auch mehrere Körperhöhlen

betreffen kann, treten fibrinöse Veränderungen auf (WILLIAMS u. BLAKEMORE

1990a). SANDFORD (1987) untersuchte pathologische und histologische

Veränderungen bei 53 Schweinen mit Anzeichen einer S. suis-Meningitis. Subakute

Meningoencephalitis und Meningoencephalomyelitis waren die häufigsten

Diagnosen, wobei das Alter der Tiere zwischen 5 Tagen und 26 Wochen lag. Häufige

pathologische Diagnosen waren außerdem Hyperämie der Gefäße und Blutungen im

Liquor cerebrospinalis. Histologisch konnten subakute und chronische

Leptomeningitis und Encephalitis festgestellt werden (SANFORD et al. 1987).

Weitere Untersuchungen zur Pathologie von S. suis-Serotyp 9-Infektionen wurden

von VASCONCELOS et al. (1994) durchgeführt. Das Krankheitsbild ähnelte sehr

dem der S. suis-Serotyp-2-Infektion. Auch hier erkrankten die Tiere an Meningitis,

Arthtritis, Peritonitis und Pleuritis. Der Schwerpunkt der Erkrankung lag allerdings bei

der Arthritis.

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Literatur

15

2.4 Diagnostischer Nachweis von S. suis

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, S. suis zu identifizieren. Alle S. suis-Stämme

wachsen auf Nährboden mit Schaf- oder Pferdeblut (DEVRIESE et al. 1991). Auf

Schafblutagar wachsen sie mit einer α-Hämolyse, auf Pferdeblutagar mit einer

β-Hämolyse. Bei mikroaerophiler Anzucht verstärken sich das Wachstum und die

Hämolyse (DEVRIESE et al. 1991). TARRADAS et al. (1994) stellten Vergleiche der

biochemischen Profile verschiedener Serotypen auf und konnten eine große

Heterogenität feststellen. Zur Identifikation von S. suis sind dennoch nur einige

wenige Parameter in Betracht zu ziehen. Der Voges-Proskauer- Test (VP) ermöglicht

die Differenzierung von S. suis und S. bovis. Bei S. suis ist der VP-Test negativ

(HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990; TARRADAS et al. 1994). Des Weiteren kann

S. suis Äskulin zu Glucose und Äsculetin spalten, Äsculetin reagiert daraufhin mit

FeIII-Ionen. Trehalose wird ebenfalls gespalten. Ferner wächst S. suis nicht in

Abwesenheit von 6,5% NaCl (TARRADAS et al. 1994).

Eine Identifikation von S. suis-Isolaten kann auch durch eine Genotypisierung

erfolgen. OKWUMABUA et al. (2003) zeigten, dass durch den Nachweis des

gdh-Gens (Glutamat-Dehydrogenase) von S. suis mit der PCR der Erreger von

anderen Streptokokken unterschieden werden kann. Durch eine Multiplex-PCR nach

SILVA et al. (2006) ist es möglich, den Erreger durch ein gdh spezifisches Amplifikat

nachzuweisen und gleichzeitig die Serotypen 1, 2, 7 und 9 zu differenzieren.

Über die Immunhistochemie gibt es eine weitere Möglichkeit, eine S. suis-Infektion

zu diagnostizieren. MADSEN et al. (2002) stellten Vergleiche zwischen der

bakteriologischen Untersuchung und der Immunhistochemie an. Nach ihren

Ergebnissen korrelierten bei 50% der Tiere beide Untersuchungsmethoden

miteinander.

Page 16: Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für ... · Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für Infektionsmedizin, Institut für Mikrobiologie und Klinik für kleine Klauentiere

Literatur

16

Tabelle 1: Vergleiche von Tiermodellen für S. suis- Stamm (nur Wildtyp Stämme)

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Literatur

17

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Literatur

18

2.5 Epidemiologie von S. suis

Zurzeit sind 33 Serotypen von S. suis bekannt, die anhand ihrer unterschiedlichen

Kapselpolysaccharide differenziert werden. Als Krankheitserreger ist der Serotyp 2

der am häufigsten vorkommende Serotyp weltweit (KING et al. 2002; MAROIS et al.

2007; STAATS et al. 1997; WISSELINK et al. 2000).

Die Verbreitung der Serotypen von S. suis kann regional sehr unterschiedlich sein.

Es besteht außerdem die Möglichkeit, dass sich die Prävalenzen der Serotypen in

einer Region verändern (KING et al. 2002; WISSELINK et al. 2001). So war in

Dänemark 1983 der Serotyp 7 und 1998 hauptsächlich der Serotyp 2 vorhanden

(AARESTRUP et al. 1998; PERCH et al. 1983). In den Niederlanden ist seit 1995

nicht mehr der Serotyp 2, sondern der Serotyp 9 am häufigsten (JACOBS et al.

1995; VECHT et al. 1985; WISSELINK et al. 2001). Serotyp-9-Stämme wurden in

Europa außerdem noch in Belgien und Deutschland häufig von erkrankten

Schweinen isoliert (WISSELINK et al. 2001). In Spanien kommt der Serotyp 9 mit

einer Prävalenz von 64,9% vor, gefolgt von Serotyp 2 mit 14,8% (VELA et al. 2003).

In England waren früher 1 und 14 die am häufigsten aus erkrankten Tieren isolierten

Serotypen (WISSELINK et al. 2001), seit einigen Jahren dominiert hier Serotyp 2

(HIGGINS et al. 1995).

2.6 Pathogenese von S. suis- Infektionen

Eine wichtige Eintrittsforte für S. suis ist der obere Respirationstrakt. Dort besiedelt

S. suis die Tonsillen und die Conchae nasales, wo dieser Erreger inapparent

persistieren kann (BAELE et al. 2001). Die Trägerrate von S. suis-Serotyp 2 variiert

zwischen 0 und 80% sehr stark. Bei vier bis zehn Wochen alten Ferkel ist die

Mehrheit der Tiere Träger von S. suis (CLIFTON-HADLEY et al. 1984). Bei S. suis-

Erkrankungen handelt es sich meist um Faktorenerkrankungen, das heißt, dass

biotische und/oder abiotische Faktoren die Erkrankung begünstigen. Zu den

biotischen Faktoren gehören virale Primärerkrankungen im Atmungstrakt, wie zum

Beispiel PRRS (GALINA et al. 1994; SCHMITT et al. 2001). Eine prädisponierende

Wirkung kann aber auch von anderen Erregern ausgehen. Durch experimentelle

Untersuchungen konnten VECHT et al. (1992) beispielsweise zeigen, dass durch

Bordetella bronchiseptica verursachte Schleimhautläsionen S. suis leichter in den

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Literatur

19

Wirtsorganismus eindringen kann (Tabelle 1). Zu den prädisponierenden abiotischen

Faktoren zählen unter anderem Stallüberbelegung, schlechte Lüftung und Umstallen

(HEINRITZI 1998).

Monozyten gelangen über das Blut in die Tonsillen und nehmen S. suis auf. Es wird

angenommen, dass die Monozyten-assoziierten Bakterien über das Blut und den

Plexus choroideus in den Liquor cerebrospinales gelangen (GALINA et al. 1994;

GOTTSCHALK u. SEGURA 2000; WILLIAMS u. BLAKEMORE 1990b).

2.7 Virulenzfaktoren von S. suis

Die Kapsel schützt S. suis vor der Phagozytose, so dass der Erreger im

Wirtsorganismus überleben kann (GOTTSCHALK u. SEGURA 2000; SMITH et al.

1999). Die bisherigen Untersuchungen zur Bedeutung der Kapsel als Virulenzfaktor

beziehen sich auf die S. suis-Serotypen 2 und 1.

VECHT et al. (1992) beschreiben zwei Proteine, die als Faktoren hochvirulenter

Serotyp 1 und 2 Stämme eine wichtige Rolle spielen können. Zum einen das

„Muramidase-released Protein“ (MRP), das eine Größe von 136 kDa hat, und zum

anderen der „Extracellular Factor“ (EF) mit einer Größe von 110 kDa. Die

dazugehörigen Gene werden mit mrp und epf bezeichnet. Innerhalb des Serotyps 2

lassen sich durch die Differenzierung von MRP und EF drei unterschiedlich virulente

S. suis-Phänotypen differenzieren. Tierexperimentelle Untersuchungen von VECHT

et al. (1992) haben gezeigt, dass MRP+EF+ Serotyp-2-Stämme wesentlich virulenter

sind als MRP+ EF* oder MRP- EF- Serotyp-2-Stämme. Der Phänotyp MRP+ EF* wird

aufgrund der tierexperimentellen Ergebnisse für das Schwein als schwach virulent

beschrieben (VECHT et al. 1991). Trotzdem zeigten epidemiologische

Untersuchungen eine große Bedeutung von MRP+ EF* Serotyp-2-Stämmen für

invasive S. suis-Erkrankungen in Mitteleuropa und Brasilien (MARTINEZ et al. 2003;

SILVA et al. 2006; WISSELINK et al. 2001). S. suis-Isolate von erkrankten Menschen

gehören auch auffallend häufig zu diesem Phänotyp (GOTTSCHALK u. SEGURA

2000; SMITH et al. 1999; VECHT et al. 1992). Der Großteil der S. suis-Serotyp-2-

Erkrankungen von Schweinen in Europa geht aber auf MRP+ EF+ Stämme zurück

(GOTTSCHALK u. SEGURA 2000; SMITH et al. 1999; WISSELINK et al. 2001).

Da für isogene mrp und epf Mutanten keine Abschwächung in experimentellen

Infektionen nachgewiesen werden konnte (VECHT et al. 1991), ist bis heute unklar,

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Literatur

20

welche Bedeutung MRP und EF als putativen Virulenzfaktoren zukommt. Bei einer

Studie von SMITH et al. (1993) ergaben vergleichende Untersuchungen über EF*

und EF+, dass bei EF* zusätzliche Sequenzabschnitte vorhanden sind, ansonsten

sind diese beiden Proteine aber identisch. Aufgrund der unterschiedlichen

Längenvarianten wurde EF* in die Klassen eins bis fünf eingeteilt. Allerdings wird

bisher davon ausgegangen, dass nur das 110 kDa EF mit der Virulenz von

S. suis-Infektionen assoziiert ist.

Auch bei MRP gibt es verschiedene Varianten, die kleinere Variante wird mit MRPs,

die größeren mit MRP* bzw. MRP** bezeichnet. SILVA et al. (2006) etablierten eine

PCR zur Differenzierung der unterschiedlichen mrp-Varianten.

S. suis-Serotyp-2-Stämme besitzen überwiegend die mrp+ Variante, die für das

136 kDa Protein kodiert. Serotyp 9-Isolate aus Mitteleuropa enthalten meistens die

mrp* Variante, die etwas größer ist (MRP*: 151 kDa).

Ein weiterer wichtiger Virulenz-assoziierter Faktor ist das Hämolysin Suilysin (Gen:

sly). Es hat eine Größe von 54 kDa und gehört zur Familie der Thiol-aktivierten

Zytolysine (JACOBS et al. 1994). Bei in vitro Versuchen konnte eine zytotoxische

Wirkung des Suilysins festgestellt werden (NORTON et al. 1999). Das Suilysin

könnte durch die Lyse von Epithel- und Endothelzellen das Überwinden der

Schleimhautbarriere erleichtern. Es wurde gezeigt, dass nicht alle virulenten Stämme

Suilysin produzieren (ALLGAIER et al. 2001; JACOBS et al. 1994).

Auch der Serumtrübungsfaktor OFS (BAUMS et al. 2006) und das Fibronektin- und

Fibrinogen-Bindeprotein (FBP) von S. suis (DE GREEFF et al. 2002) gehören zu den

Virulenz-assoziierten Faktoren.

Neben MRP, EF und Suilysin spielen noch andere Faktoren bei der Pathogenese

eine Rolle, wie z.B. die Arginin Deiminase (ArcA). GRUENING et al (2006)

untersuchten die Struktur, Regulation und Funktion des ArcA bei S. suis und fanden

heraus, dass ArcA an der Zelloberfläche von S. suis exprimiert wird. Weitere

Untersuchungen zeigten, dass die ArcA-Aktivität mit reduzierten Sauerstoff und

Glucosegehalt ansteigt (FULDE 2007; GRUENING et al. 2006). Im Gegensatz dazu

wird ArcA durch einen Temperaturanstieg von 32°C auf 42°C induziert. ArcA verleiht

S. suis die Fähigkeit, im sauren Milieu überleben zu können (GRUENING et al. 2006;

WINTERHOFF et al. 2002). Diese Funktion könnte für die Pathogenese von S. suis

eine wichtige Rolle spielen, da S. suis in sauren Kompartimenten innerhalb der

Wirtszellen überleben kann.

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Literatur

21

In Immunisierungsversuchen mit rekombinantem Surface antigen one (SAO) konnte

eine Protektion gegenüber homologen Belastungsinfektionen aufgezeigt werden

(LI et al. 2007).

2.8 Therapie und Prophylaxe von S. suis- Infektionen

Zu den prophylaktischen Maßnahmen gehören Verminderung von Stressfaktoren,

Verbesserung der Stallhygiene, Vermeidung einer Stallüberbelegung und eine gute

Belüftung der Stallungen. Ist ein Tier dennoch an einer S.suis-Infektion erkrankt,

kann eine antibiotische Behandlung zur Heilung führen. Erfolgt keine Therapie, führt

die Erkrankung häufig innerhalb von wenigen Tagen zum Tode (WALDMANN u.

WENDT 2004). Eine wirksame Prophylaxe ist eine Immunisierung, auf die im

Folgenden näher eingegangen wird.

2.9 Immunisierungen zum Schutz gegen S. suis- Infektionen

Gegenwärtig ist kein kommerzieller Impfstoff in Deutschland verfügbar. Bei

Bestandsproblemen wird häufig eine stallspezifische Vakzine eingesetzt. Diese

Impfstoffe sind mit Formalin inaktivierte Ganzzellimpfstoffe, die unter Verwendung

eines von dem entsprechenden Bestand isolierten S. suis-Stammes hergestellt

werden. WISSELINK et al. (2001,2002a) konnten durch experimentelle

Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer inaktivierten Ganzzellvakzine einen

Schutz dieser Vakzine aufzeigen (Tabelle 2).

Um eine Erkrankung der Ferkel zu minimieren, ist es möglich, eine

Muttertiervakzination, z.B. in der sechsten und zweiten Woche vor der Geburt,

durchzuführen. Somit wird der Antikörperspiegel gegen S. suis in der Kolostralmilch

erhöht (HAESEBROUCK et al. 2004).

WISSELINK et al. (2001), JACOBS et al. (1996) und LI et al. (2006, 2007) führten

Immunisierungsversuche mit Virulenz-assoziierten Faktoren durch. Versuche mit

einem rekombinanten Impfstoff wurden bis jetzt nur von LI et al. (2007)

unternommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Immunisierungsversuche mit einer heterologen Belastungsinfektion, d. h. mit einem

anderen Serotyp als dem, der für die Vakzine verwendet wurde, wurden noch nicht

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Literatur

22

beschrieben. Eine Serotyp-übergreifende Schutzwirkung ist daher bis heute für keine

S. suis-Vakzine nachgewiesen worden.

Tabelle 2: Ergebnisse von Immunisierungsversuchen mit experimenteller Belastungsinfektion (Auswahl)

Autoren Anzahl

der Tiere

Adjuvans/ Besonder-

heit Impfstoff

Belastungsstamm

(Serotyp)

Morbidität/Mortalität geimpfte Tiere(%)

Morbidität /Mortalität

Kontrolltiere(%)

LACOBS et al. 1996 3 Diluvac

Forte SLY ST 2 (P 1/7)1 20/ 0 100/100

152 Lebend-impfstoff

ST 2 (#1330)

ST 2 (# 999) 6,6/ 0 73 / 53

BUSQUE et al. 1997

153 Lebend-impfstoff

ST 2 (#1330)

ST 2 (# 999) 20 /6,6 20/6,6

HALBUR et al. 2000 10 -

PRRSV und ST2

(ISU VDL 40634/94)

Inaktivierte GZV

(SS VX)4 40/40 63/63

4 WO5 MRP (Subunit)

ST 2 (# 4005)6 -7/75

4 WO EF (Subunit)

ST 2 (# 4005) 6 -7/75

4 WO MRP und

EF (Subunit)

ST 2 (# 4005) 6 -7/25

-7/100

5 WO inaktivierte

GZV9

(#4005)

ST 2 (# 3881)6 -7/0 -7/75

5 AH8 MRP und

EF (Subunit)

ST 2 (# 3881) 6 -7/40

WISSELINK et al. 2001

5 AH inaktivierte GZV9

ST 2 (#3881) 6 -7/80

-7/80

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Literatur

23

Autoren Anzahl

der Tiere

Adjuvans/ Besonder-

heit Impfstoff

Belastungsstamm

(Serotyp)

Morbidität/Mortalität geimpfte Tiere(%)

Morbidität /Mortalität

Kontrolltiere(%)

5 WO

inaktivierteKapsel-mutante

(10cps∆EF)

ST 2 (#10)10 80/0

5 Lebend- impfstoff 10cps∆EF ST 2

(#10) 10 100/40

WISSELINK et al. 2002b

5 WO 10 ST 2 (#10) 10 0/0

100/100

LI et al.2006 8 ÖW11 SAO12

(re-kombinant)

ST 2 (#166) 37,5 / 37,5 37,5 / 37,5

FITTIPALDI et al. 2007 7 Lebend-

impfstoff BD 101 ST 2 (S735) 0 / 0 100/100

LI et al. 2007 12 Saponin13

SAO (re-

kombinant)ST 2 (#166) 18/18 58/58

1 hochvirulenter MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stamm 2 Die Tiere wurden dreimal immunisiert 3 Die Tiere wurden zweimal immunisiert 4 Es erfolgten zwei Immunisierungen, die erste mit Emulsigen®, die zweite mit Aluminiumhydroxid als

Adjuvans. 5 Wasser-in-Öl Emulsion 6 MRP +EF+ 7 Keine Angaben 8 Aluminiumhydroxid 9 Ganzzellvakzine 10 Stamm 10 (MRP+EF+SLY+) 11 Emulsigen® 12 Surface antigen one

13Quil A®

2.10 Subunitvakzinen

Subunitvakzinen basieren im Gegensatz zu Ganzzellvakzinen auf immunogenen

viralen oder bakteriellen Bestandteilen. Es wird nicht mehr der gesamte Erreger als

Impfstoffgrundlage verwendet, dafür aber eine Anreicherung der immunogenen

Strukturen, wodurch eine stärker ausgeprägte Immunantwort erzielt werden soll

(VETION 2007). Subunitvakzinen sind jedoch, mehr als Ganzzellvakzinen, auf den

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Literatur

24

Zusatz von Adjuvantien für eine ausreichend hohe Stimulationswirkung angewiesen

(GUPTA et al. 1993; HOLT et al. 1989; REAMS et al. 1994). Bis heute sind nur

wenige Subunitvakzine von S. suis im Tierversuch auf ihre protektive Wirkung

getestet worden. WISSELINK et al. (2001) untersuchten eine Subunitvakzine auf der

Grundlage von MRP und EF und erreichten damit eine partielle protektive Wirkung

gegenüber einer homologen Belastungsinfektion mit einem MRP+ EF+ SLY+ S. suis-

Serotyp-2-Stamm (Tabelle 2). Das Suilysin von S. suis erzeugte ebenfalls als

Subunitvakzine eine partielle protektive Wirkung gegenüber einer homologen

Belastungsinfektion mit einem hochvirulenten MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stamm

(Tabelle 2).

2.10.1 Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien

Die Applikation von Proteinen ohne Zusätze induziert häufig nur eine schwache, kurz

andauernde Immunantwort. Für eine bessere immunogene Wirkung werden

Gemische aus dem Protein und einem Adjuvans eingesetzt (JANEWAY 2002).

Adjuvantien (lat., adjuvare= helfen) sind definiert als eine Gruppe heterologer

Bestandteile, die verwendet werden, um eine Immunantwort auf ein Antigen zu

erreichen oder zu verstärken (GUPTA et al. 1993; SCHIJNS 2000).

In der Veterinärmedizin werden Adjuvantien bei Totimpfstoffen und Toxoiden

eingesetzt, um den Antikörpertiter zu erhöhen. Bei Tieren werden häufig Mineralgele,

wie z.B. Aluminiumhydroxid, verwendet. Diese induzieren eine starke Th 2 Antwort,

sind sicher und preiswert (COX u. COULTER 1997). Mineralgele, aber auch

Öl-in-Wasser-Emulsionen, verzögern die Freisetzung von Antigen und verstärken die

Aufnahme von Antigen in die Makrophagen (JANEWAY 2002). Öl-in-Wasser-Emulsionen bestehen aus Mikrotropfen Öl, typischerweise aus Squalen

oder Squalane, mit einer Größe von 200 nm, die in einer kontinuierlichen

Wasserphase durch oberflächenaktive Stoffe stabilisiert werden. Sie sind sicher,

preiswert und gut geeignet für amphipathische Moleküle. Für die Wirksamkeit ist es

wichtig, das Immunogen in die Ölphase einzugliedern (COX u. COULTER 1997).

Emulsigen® ist ein Beispiel für eine Öl-in-Wasser-Emulsion. Es ist eine sterile,

milchig-weiße Emulsion, die durch einen Depoteffekt die Antigene nach und nach

freisetzt und zum Schutz gegen Bakterien und Viren eine humorale Immunantwort

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Literatur

25

auslöst. Emulsigen® kann bei Ganzzell- und Subunitvakzinen eingesetzt werden

(MVP LABORATORIES 2006).

Wasser-in-Öl-Emulsionen bestehen hingegen aus Mikrotropfen Wasser, die in einer

kontinuierlichen Ölphase durch einen Oberflächen-aktiven Stoff, wie Mannit-

Monooleat, stabilisiert werden. Bei der Ölphase handelt es sich meist um Mineralöle,

Squalen oder Squalane wie zum Beispiel beim “Freund’s incomplete adjuvans“

(FIA).

WISSELINK et al. (2001) vergleichen in S. suis-Immunisierungsexperimenten das

Adjuvans Aluminiumhydroxid mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion. Die Autoren stellten

fest, dass die Wasser-in-Öl-Emulsion in Bezug auf die Stimulation der

Antikörperbildung und einer protektiven Immunität dem Aluminiumhydroxid

wesentlich überlegen war (Tabelle 2).

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Material und Methoden

26

3 Material und Methoden

3.1 S. suis-Stämme

Der hochvirulente Serotyp 2 S. suis-Stamm 10 wurde für die Herstellung der

Ganzzell- und der Subunitvakzine sowie zur homologen Belastungsinfektion

eingesetzt. Dieser Stamm exprimiert eine Vielzahl Virulenz-assoziierter Faktoren,

insbesondere MRP, EF, SLY, FBPS, ArcA und OFS (BAUMS et al. 2006; DE

GREEFF et al. 2002; FULDE 2007; WISSELINK et al. 2001). In verschiedenen

experimentellen Infektionsversuchen (Tabelle 1) konnte mit dem S. suis-Stamm 10

eine hohe Mortalität bei Absetzferkeln und Läuferschweinen hervorgerufen werden

(BAUMS et al. 2006; DE GREEFF et al. 2002; SMITH et al. 1993). Für die

heterologen Belastungsinfektionen wurde auf den Serotyp-9-Stamm A3286/94

zurückgegriffen. A3286/94 wurde ursprünglich von einem Schwein mit Meningitis

isoliert (ALLGAIER et al. 2001; REHM et al. 2007). Dieser Stamm besitzt eine große

Variante des MRP (MRP*) und enthält das Suilysingen sly (SILVA et al. 2006).

Sowohl Stamm 10 als auch A3286/94 wurden weiterhin für die Gewinnung von

Antigenen für unterschiedliche ELISA-Tests genutzt. Außerdem konnten REHM et al.

2007 mittels der „Amplified Fragment-Lenth Polymorphism“ (AFLP) und Multi-locus

sequence typing (MLST) zeigen, dass A3286/94 eine große genotypische Ähnlichkeit

mit anderen invasiven Serotyp-9- Isolaten besitzt.

3.2 Kultivierung der Bakterien

S. suis wurde auf Columbia Nährboden mit 6% Schafblut (im Folgenden:

Blutnährboden) (Oxoid, Wesel), in BactoTM „Todd Hewitt Broth“ (THB) oder in

„Tryptone Soya Broth“ (TSB), (Becton Dickson Diagnostik, Heidelberg) kultiviert. Bei

der Herstellung der Vakzinen wurden Sterilitäts- und Reinheitskontrollen der

Flüssigkulturen durch fraktionierte Ausstriche auf Blutnährböden durchgeführt. Die

Anzüchtung von E. coli erfolgte in flüssigen oder auf festen Luria-Bertani (LB) Medien

bei einer Temperatur von 37°C. Für die Selektion von E. coli-Klonen wurden folgende

Antibiotikakonzentrationen eingesetzt: 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin.

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Material und Methoden

27

3.3 Gewinnung und Einstellung der Belastungskultur

Für die Gewinnung der Belastungskulturen für beide Infektionsrouten (i.n. und i.v.),

wurden 500 μl einer Übernachtkultur in 100 ml frisches TSB-Medium überführt. Die

Inkubation der Kultur erfolgte bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,3. Es folgte die

Zentrifugation der Kultur für 10 min. bei 9270 x g mit anschließender Resuspension

des Sediments in 3 ml PBS. Die Tiere wurden mit 1,7 ml von dieser Suspension

infiziert. Durch Anlegen einer Verdünnungsreihe und Auftropfen von dreimal 20 μl

dieser Suspension auf eine Blutagarplatte konnten die KBE durch Auszählung

bestimmt werden. Aufgrund der Durchführbarkeit wurden Platten mit 20-100 KBE

ausgezählt. Anschließend erfolgte die Berechnung der KBE/ μl.

3.4 Durchführung der Infektionsversuche (Allgemeine Ausführungen)

3.4.1 Tierversuchsgenehmigungen

Im Rahmen dieser Dissertation sollten unterschiedliche Infektionsversuche mit

Schweinen durchgeführt werden. Die Etablierung eines Tiermodells für

S. suis-Serotyp-9-Infektionen fiel unter den Tierversuchsantrag „Infektion von

Schweinen mit S. suis zur Bestimmung der infektiösen Keimzahl, die Septikämie-

bzw. Meningitissymptome nach intranasaler oder intravenöser Applikation auslöst“

(Genehmigung: 509.6-42502-04/829, ehemalige Bezirksregierung Hannover). In den

Immunisierungsversuchen dieser Arbeit wurde die protektive Wirkung einer

S. suis-Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen mit einer Ganzzellvakzine

verglichen (Genehmigungen: 33-42502-06/1063 und 1093, ehemalige

Bezirksregierung Hannover). Die Behandlung der Tiere stand im Einklang mit der

“European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for

Experimental and Other Scientific Purposes” (European Treaty Series, no. 123:

http://conventions.coe.int/treaty/EN/Menuprincipal.htm).

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Material und Methoden

28

3.4.2 Herkunftsbestand

Die für die gesamten experimentellen Versuche eingesetzten 82 Tiere kamen von

einem Schweinebestand der Züchtungszentrale Deutsches Hybridschwein. Dieser

Betrieb ist frei von sly+ mrp+ epf+ cps2+ und sly+ mrp* cps9+ S. suis-Stämmen

(BAUMS 2007).

3.4.3 Klinische Untersuchung

Während der gesamten Versuchszeit wurden die Tiere morgens und abends auf

ihren klinischen Allgemeinzustand untersucht. Zunächst erfolgte eine Adspektion, bei

der der Ernährungszustand, die Anteilnahme an der Umgebung, die Haltung, die

Bewegung, das Fress- und das Sozialverhalten der Tiere erfasst wurde. Die

Körperinnentemperatur wurde bei allen Tieren morgens und abends gemessen.

Beim Auftreten von Fieber (> 40,5°C), bei einer Störung des Allgemeinbefindens

oder bei spezifischen Anzeichen einer S. suis-Erkrankung, insb. bei zentralnervösen

Störungen oder Lahmheiten, wurde eine genauere klinische Untersuchung

durchgeführt. Nach der Auskultation von Herz und Lunge der erkrankten Tiere

erfolgte eine Untersuchung des Bewegungsapparates mit Adspektion und Palpation

der Gelenke sowie die Untersuchung des Nervensystems, die sich auf die

Anteilnahme an der Umgebung, Haltung und Bewegung des Tieres beschränkte. Bei

einer hochgradigen oder einer persistierenden, d. h. länger als 24 h anhaltenden,

mittelgradigen Störung des Allgemeinbefindens, wurden die Tiere durch eine

intravenöse Applikation mit Pentobarbital euthanasiert. Zentralnervöse Störungen

oder Anzeichen einer akuten Polyarthritis waren in jedem Fall ausreichende Kriterien

für die unmittelbare Euthanasie des entsprechenden Schweines.

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Material und Methoden

29

3.4.4 Entnahme von Blutproben für die Erstellung eines Blutbildes und Gewinnung von Serum

Tabelle 3: Zeitpunkte der Blutentnahmen

Tage der Blutentnahme Probenart 1 3 Tage vor der Immunisierung EDTA-Blut, Serum

Tag der ersten Immunisierung EDTA-Blut

1 Tag nach der ersten Immunisierung EDTA-Blut

Tag der 2. Immunisierung EDTA-Blut

2 Tage nach der 2. Immunisierung EDTA-Blut, Serum

Tag der Belastungsinfektion2 EDTA-Blut, Serum

2 Tage nach Belastungsinfektion EDTA-Blut, Serum

4 Tage nach der Belastungsinfektion EDTA-Blut

6 Tage nach der Belastungsinfektion EDTA-Blut

10 Tage nach der Belastungsinfektion EDTA-Blut, Serum 1 EDTA-Blut für die Untersuchung eines Blutbildes. Serum für die Bestimmung des

Antikörpertiters. 2 Beginn der Blutentnahme für den Etablierungsversuch für S. suis-Serotyp-9-Infektion

Für die Blutentnahme wurden die Tiere in Rückenlage fixiert. Die Entnahme erfolgte

aus der Vena cava cranialis. Das Manubrium sterni und die erste Rippe dienten als

Orientierungspunkte. Der Einstich wurde senkrecht und ggf. leicht median

durchgeführt. Bei den oben aufgeführten Probenentnahmen (Tabelle 3) wurde ein

9 ml EDTA-Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) und ggf. noch ein 10 ml Serum-

Röhrchen (Sarstedt) gefüllt. Die Zählung der Leukozyten im Haemozytometer und

deren Differenzierung in klassischen Blutausstrichen nach Wright wurde

dankenswerter Weise von dem Labor der Klinik für kleine Klauentiere und

forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik ausgeführt. Vor der Gewinnung des

Serums erfolgte für einige Stunden eine Kühlung der mit Blut gefüllten

Serum-Röhrchen auf 8°C. Anschließend wurden die Röhrchen für 5 min. bei

3000 x g zentrifugiert. Der Überstand (Serum) wurde in 2 ml Reaktionsgefäße

(Sarstedt) überführt und bis zur Bestimmung der Antikörpertiter bei -70°C gelagert.

Die Antikörperbestimmung erfolgte im Serum, welches drei Tage vor der

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Material und Methoden

30

Immunisierung und am Tag der Belastungsinfektion entnommen worden war. Die

übrigen Serumproben wurden für weitere Untersuchungen bei –70°C asserviert.

3.4.5 Anästhesie der Versuchstiere

Eine Anästhsie der Tiere erfolgte zur komplikationslosen Entnahme der

Tupferproben von der Tonsillenoberfläche, der Applikation von Essigsäure und zur

anschließenden Infektion mit S. suis. Die Anästhesie wurde mit 2 mg Azaperon/kg

Körpergewicht und 10 mg Ketamin/kg Körpergewicht durch intramuskuläre

Applikation am Ohrgrund des Tieres durchgeführt.

3.4.6 Ablauf der Sektion zur Untersuchung auf eine S. suis-Infektion

Die Durchführung der Sektion und weitere postmortale Untersuchungen der

Schweine verfolgten das Ziel, das Vorliegen einer S. suis-Infektion abzuklären und

dadurch verursachte krankhafte Veränderungen zu erfassen. Mit Ausnahme von

zusätzlichen Gelenkuntersuchungen bei Lahmheiten wurden von jedem Tier die

gleichen Proben für die bakteriologischen und histologischen Untersuchungen

gewonnen. Grundsätzlich erfolgte von jeder histologisch untersuchten Lokalisation

auch eine kulturelle bakteriologische Untersuchung auf S. suis.

Nach der Euthanasie wurden zunächst ein Tarsalgelenkpunktat und Liquor

cerebrospinalis gewonnen und makroskopisch beurteilt. Die entsprechenden

Hautbereiche wurden vor der Punktion rasiert und mit 80% Ethanol desinfiziert. Die

Punktion zur Gewinnung des Liquor cerebrospinalis erfolgte durch das Foramen

atlanto-occipitale. Bei einer Lahmheit wurde zusätzlich auch eine Punktion des

betroffenen Gelenkes durchgeführt. Bei Unklarheit, insbesondere bei makroskopisch

unauffälligen Gelenkpunktaten, wurden alle Gelenke der betroffenen Gliedmaße

punktiert.

Nach dem Anbringen von Entlastungsschnitten und dem Enthäuten der ventralen

Bauchdecke wurde die Bauchhöhle von kaudal nach kranial in der Linea alba

eröffnet. Vor der vollständigen Öffnung der Bauchhöhle wurde eine Tupferprobe vom

Peritoneum für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Im Anschluss folgte

die adspektorische und palpatorische Untersuchung der Bauchhöhle und deren

Organe. Für die histologischen Untersuchungen wurden von Leber, Milz und

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Material und Methoden

31

Peritoneum Organstücke in Formalin fixiert. Benachbarte Gewebestücke von Milz

und Leber wurden für die bakteriologische Untersuchung gewonnen. Nach der

Eröffnung des Thorax in der Rippen-Rippenknorpelgrenze von kaudal nach kranial

wurden Pleura- und Perikardhöhle mit Tupfern beprobt. Zusammen mit der Zunge,

dem Waldeyerschen Rachenring, Trachea und Ösophagus wurden die Brustorgane

exenteriert. Nach der Adspektion und Palpation der exenterierten Organe wurde ein

Lobus cranialis der Lunge sowie die Tonsilla veli palatini für weitere bakteriologische

und histologische Untersuchungen entnommen. Zusätzlich wurden Pleura costalis

aus einem Interkostalspalt und Synovialmembran von allen punktierten Gelenken,

d. h. mindestens von einem Tarsalgelenk, in Formalin fixiert. Untersuchungen auf

Endokarditis, Otitis media und Otitis interna wurden im Rahmen dieser Dissertation

nicht durchgeführt. Diese Entscheidung stand im Zusammenhang mit Erfahrungen

aus vorangegangenen Infektionsversuchen (BAUMS 2007).

Nach dem Abtrennen des Kopfes im Atlanto-Okzipitalgelenk wurden die Haut und

Muskulatur des Kopfes entfernt. Das Eröffnen des Schädels erfolgte durch Anlegen

zweier Querschnitte durch die Schädelkarlotte in Höhe der lateralen Augenwinkel. Es

folgte ein Längsschnitt vom Foramen occipitale bis zu den Endpunkten der

Querschnitte. Nach dem Entfernen des Schädeldaches und der Dura mater wurden

die Nervenabgänge mit einer Schere durchtrennt. Das Gehirn wurde für die

pathohistologische Untersuchung in Formalin fixiert.

3.4.7 Pathohistologische Untersuchung

Für die pathohistologischen Untersuchungen wurden bei der Sektion zur

Untersuchung auf eine S. suis-Infektion Organproben (Tonsilla veli palatini, Lobus

cranialis der Lunge, Pleura, Leber, Milz, Peritoneum, Gehirn, Tarsalgelenk und ggf.

weitere Gelenke) wie unter 3.4.6 beschrieben entnommen. Diese wurden in

gepuffertem 10 % Formalin fixiert. Die pathohistologischen Untersuchungen wurden

dankenswerter Weise von Dr. Andreas Beinecke (Institut für Pathologie, Stiftung

Tierärztliche Hochschule Hannover) durchgeführt.

Die Ergebnisse wurden in einem Pathoscore Verfahren, wie bei BAUMS et al. (2006)

beschrieben, zusammengefasst. Mittelgradige bis hochgradige, multifokale oder

diffuse, fibrinös-eitrige Veränderungen wurden in Abhängigkeit von dem Organ mit

einem Score von 5 oder 4 beurteilt (Gehirn: 5; anderes Gewebe außer Gehirn wie

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Material und Methoden

32

Serosa und Synovia: 4). Im Fall einer geringgradigen, fokalen, fibrinös-eitrigen

Meningitis oder Plexus chorioiditis wurde der Score 3 vergeben. Geringgradige,

fokale, fibrinös-eitrige Veränderungen aller Organe außer dem Gehirn resultierten in

einem Score von 2. Minimale fibrinös-eitrige Veränderungen bekamen einen Score

von 1. Lymphoplasmazelluläre Infiltrationen und granulomatöse Entzündungen

wurden in diesem Score nicht in Betracht gezogen. Um einen Vergleich zwischen

den Tiergruppen zu ermöglichen, wurden die höchsten Scores der einzelnen Tiere

zusammengefasst und durch die Tierzahl der Gruppe dividiert (ω = Σscoremax/nTiere).

3.5 Etablierung des Tiermodells für S. suis-Serotyp 9

3.5.1 Intranasale Infektion

Die Tiere wurden mit einem Alter von 7-8 Wochen in zwei Gruppen eingestallt. Die

Einteilung erfolgte randomisiert. Vier Tage nach der Aufstallung wurde unter Narkose

eine Tupferprobe von der Tonsillenoberfläche entnommen. Anschließend wurden

den Tieren 3 ml 1% Essigsäure mit einem Actuator (Valois Deutschland GmbH,

Düsseldorf) intranasal verabreicht. Zwei Stunden nach der Applikation der

Essigsäure wurden die Tiere erneut anästhesiert, um die intranasale Infektion mit

S. suis-Stamm 10 (Serotyp 2) bzw. Stamm A3286/94 (Serotyp 9) durchzuführen

(Applikation erneut mit einem Actuator). Die Infektionsdosis betrug 109 KBE. Elf Tage

nach der Infektion erfolgte in Narkose eine Tupferentnahme an der

Tonsillenoberfläche von den mit Stamm A3286/94 infizierten Tieren, da diese Tiere

keine Anzeichen einer Erkrankung aufwiesen. Am 20. Tag nach der Infektion wurden

alle überlebenden Schweine euthanasiert.

3.5.2 Intravenöse Infektion

Vier Tiere im Alter von 8 Wochen wurden einen Tag nach der Aufstallung und

vorheriger Anästhesie intravenös belastet. Vor der Infektion wurde eine Tupferprobe

von der Tonsillenoberfläche entnommen. Anschließend bekamen die Tiere über die

laterale Ohrvene 108 KBE A3286/94 (Serotyp 9) appliziert.

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Material und Methoden

33

3.6 Herstellung der Vakzinen

3.6.1 Ganzzellvakzine

Für die Herstellung der Ganzzellvakzine wurde eine THB-Übernachtkultur von

S. suis-Stamm 10 eingesetzt (Inkubation bei 37°C in einem Kulturvolumen von

18 ml). Nach der Reinheitskontrolle erfolgte die Zugabe von Formaldehyd in einer

finalen Konzentration von 0,1%. Die Kultur wurde dann für 6-8 Stunden gerührt und

anschließend auf Sterilität kontrolliert. Die inaktivierte Kultur verblieb bis zum

Gebrauch bei 8°C. Um einen Vergleich der Wirkung der S. suis-Antigene aus der

Ganzzell- mit denen aus der Subunitvakzine zu ermöglichen, wurden zu den

inaktivierten Bakterien 18 ml PBS hinzugefügt. Dadurch wurden vergleichbare

Proteinkonzentrationen und Volumina erreicht. Als Adjuvantien kamen Emulsigen® in

einer finalen Konzentration von 20% bzw. Aluminiumhydroxid in einer finalen

Konzentration von 0,4% zum Einsatz. Die Impfdosis betrug 108 KBE.

3.6.2 Subunitvakzine

Es wurde eine Subunitvakzine hergestellt, die sich im wesentlichen aus den Murein-

assoziierten Proteinen zusammensetzte, die von einem virulenten Serotyp-2-Stamm

unter Stressbedingungen, wie sie auch bei einer Infektion auftreten, gebildet werden.

Die Induktion der Stressbedingungen erfolgte durch eine Erhöhung der

Kultivierungstemperatur von 37°C auf 42°C.

Ausgang für die Herstellung der Subunitvakzine war eine bei 37°C inkubierte 100 ml

THB S. suis-Kultur von Stamm 10 mit einer OD600 von 0,3 (frühe exponentielle

Phase). Zur Kontrolle der Induktion wurden 20 ml von der Kultur abgenommen und

für 15 min. bei 9270 x g und 4°C zentrifugiert. Die übrige für die Herstellung der

Subunitvakzine eingesetzte Kultur wurde einer Temperaturanhebung auf 42°C für

zwei Stunden unterzogen und anschließend wurde eine OD600-Messung

durchgeführt. Nach der Zentrifugation beider Kulturen wurde das Sediment in

Muramidasepuffer (30 mM Tris HCl pH =7,5; 25% (w/v) Saccharose; 0,2 mg/ml

Lysozym; 0,5 M Na EDTA) resupendiert und für 45 min. bei 37°C inkubiert. Nach

Zentrifugation der Protoplasten erfolgte die Präzipitation der im Überstand

befindlichen Murein-assoziierten Proteine durch die Zugabe von Trichloressigsäure

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Material und Methoden

34

in einer finalen 10% Konzentration über Nacht bei 8°C. Nach dem zweimaligen

Waschen der sedimentierten Murein-assoziierten Proteine mit 80% Aceton wurde

das Sediment in PBS resuspendiert (100 μl PBS für den vor der

Temperaturanhebung und 3 ml PBS für den nach der Temperaturanhebung

gewonnenen Protoplastenüberstand). Im Anschluss wurde eine

Proteinkonzentrationsbestimmung durchgeführt. Es folgte die Zugabe von

Formaldehyd zum Protoplastenüberstand, so dass eine Endkonzentration von 0,1%

erreicht wurde. Die Lösung wurde daraufhin über Nacht bei 4°C gekühlt und

anschließend für 6-8 Stunden gerührt. Im Anschluß erfolgte die Zugabe von 21 ml

THB. Dann wurden Emulsigen® oder Aluminiumhydroxid als Adjuvans mit einer

finalen Konzentration von 20% bzw. 0,4% hinzugegeben, und die Präparate wurden

für 6-8 Stunden weiter gerührt. Vor der Applikation der Lösung wurde diese

nochmals für 6-8 Stunden gerührt. Für die Immunisierung wurden 2,5 mg Protein/Tier

eingesetzt.

Placebo Zur Herstellung des Placebos wurde steriles THB-Medium, PBS und Emulsigen® in

den Anteilen wie in der eingesetzten Subunit- und Ganzzellvakzine gemischt. Es

erfolgte die Zugabe von Formaldehyd (finale Konzentration: 0,1%). Den Tieren der

Kontrollgruppe wurden 2,5 ml des Placebos appliziert.

3.7 Immunisierungsversuche

Die Ferkel wurden mit einem Alter von drei bis vier Wochen (Tag des Absetzens) auf

Hartgummifußboden bei einer konstanten Stalltemperatur von 29°C aufgestallt,

Wasser stand den Tieren durch Nippeltränken frei zur Verfügung. Die Fütterung

erfolgte morgens und abends mit Gerstenschrot und Sojapellets. Zur Beschäftigung

erhielten die Tiere einmal täglich Heucops.

Es erfolgte eine randomisierte Einteilung in jeweils drei gleich große Gruppen.

Sieben und 18 Tage nach der Aufstallung wurde bei jedem Versuch jeweils einer

Gruppe die Ganzzell-, die Subunitvakzine oder das Placebo am Ohrgrund subcutan

appliziert.

Die Belastungsinfektion der Tiere erfolgte 14 Tage nach der letzten Immunisierung.

Zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion waren die Tiere sieben bis acht Wochen alt.

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Material und Methoden

35

Während der gesamten Versuchszeit wurden die Tiere im Abstand von acht bis 14

Stunden auf ihren klinischen Allgemeinzustand wie unter 3.4.3 beschrieben

untersucht. Die Euthanasie und Sektion der Tiere folgte nach den in 3.4.3 und 3.4.6

festgelegten Kriterien.

3.7.1 Immunisierungsversuche mit homologer Belastungsinfektion

Im Immunisierungsversuch mit homologer Belastungsinfektion erfolgte sowohl die

Herstellung der Vakzinen als auch die Belastungsinfektion mit dem S. suis-Stamm10.

Nach Prädisposition mit 1% Essigsäure wurden die Tiere intranasal mit 109 KBE

S. suis-Stamm 10 infiziert. Dieses Experiment wurde mit zwei unterschiedlichen

Adjuvantien durchgeführt. Im ersten Versuch wurde Aluminiumhydroxid verwendet.

Im darauffolgenden Versuch verwendeten wir Emulsigen®, eine Öl-in-Wasser

Emulsion. Die Tiergruppen hatten jeweils eine Größe von acht Absetzferkeln. In der

Gruppe der Ganzzellvakzine starb jeweils ein Tier aus unbekannter Ursache vor der

ersten Immunisierung (Tabelle 4).

3.7.2 Immunisierungsversuch mit heterologer Belastungsinfektion

Im Gegensatz zum Immunisierungsversuch mit homologer Belastungsinfektion

erfolgte die heterologe Belastungsinfektion mit dem S. suis-Serotyp-9-Stamm

A3286/94. Dieser Stamm wurde intravenös über die laterale Ohrvene in einer

Konzentration von 108 KBE appliziert. Sechs Tiere waren jeweils in den einzelnen

Gruppen aufgestallt (Tabelle 4).

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Material und Methoden

36

Tabelle 4: Übersicht der Infektions- und Immunisierungsversuche mit Schweinen

Anzahl der Tiere

S. suis-Stamm der Vakzine 1 Vakzine Adjuvans

S. suis-Belastungs-

stamm2,3

Applikationsart bei der

Infektion

6 - - - 10 i.n.

6 - - - A3286/94 i.n.

4 - - - A3286/94 i.v.

7 10 GZV4 AH 10 i.n.

8 10 SUV5 AH 10 i.n.

8 Placebo K6 AH 10 i.n.

7 10 GZV4 ÖW 10 i.n.

8 10 SUV5 ÖW 10 i.n.

8 Placebo K6 ÖW 10 i.n.

6 10 GZV4 ÖW A3286/94 i.v

6 10 SUV5 ÖW A3286/94 i.v

6 Placebo K6 ÖW A3286/94 i.v 1,2 Stamm 10 ist ein MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stamm. 3 A3286/94 ist ein MRP* SLY+ Serotyp-9-Stamm. 4 Ganzzellvakzine 5 Subunitvakzine 6 Kontrollgruppe (Placebo)

3.8 Kulturelle Untersuchung auf S. suis

Grundsätzlich erfolgte für alle histologisch untersuchten Gewebe auch eine kulturelle

Untersuchung auf S. suis wobei andere Infektionserreger ausgeschlossen wurden.

Hierfür wurden Gewebeproben der Tonsilla veli palatini, eines

Lungenspitzenlappens, der Milz und der Leber gewonnen. Liquor cerebrospinalis,

Gelenkpunktate sowie Tupfer von Pleura, Peritoneum und Perikard kamen als

Untersuchungsmaterial für die anderen Lokalisationen zum Einsatz. Die Entnahme

der Tupferproben der serösen Auskleidungen der Körperhöhlen erfolgte unmittelbar

nach dem Eröffnen der Körperhöhle, d. h. bevor die Organe zur genaueren

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Material und Methoden

37

Untersuchung dargestellt wurden. Bei allen Tieren wurde mindestens ein

Tarsalgelenkpunktat untersucht. Die Gewinnung weiterer Gelenkpunktate erfolgte

nur im Fall von Lahmheiten.

Im Labor wurden die Organproben mit Ausnahme der Lunge in Alkohol getaucht und

abgeflammt. Nach Herstellung einer frischen Schnittfläche erfolgte die Isolierung auf

Blutagar und Streptokokken-Staphylokokken Selektivnährboden (Oxoid). Die

Tupferproben vom Peritoneum, Pleura und Perikard sowie Liquor cerebrospinalis

und Synovia wurden ebenfalls auf Blut- und Streptokokken-Staphylokokken

Selektivnährboden fraktioniert ausgestrichen. Die Isolierung aus eitrigen

Gelenkpunktaten erfolgte nach vorheriger Anreicherung in 10 ml THB unter aeroben

Bedingungen für 24 Stunden bei 37°C. Die Anreicherungskultur wurde fraktioniert auf

den genannten Nährböden ausgestrichen. Nach der makroskopischen Beurteilung

der Kulturen auf den festen Nährböden wurden die α-hämolysierenden

Streptokokken auf Blutagar subkultiviert. Die Diagnose „S. suis“ und die Bestimmung

des S. suis-Genotyps erfolgte nach Präparation der chromosomalen DNA der

isolierten α-hämolysierenden Steptokokken über eine Multiplex-PCR (SILVA et al.

2006).

3.9 Genotypische Differenzen von S. suis

3.9.1 Präparation chromosomaler Streptokokken-DNA

Benötigte Reagenzien:

TEN-Puffer 50 mM Tris-HCl pH = 8; 1 mM EDTA, 100 mM NaCl

SDS-Lösung 20%

Lysozym Stammlösung mit 100 mg/ml

RNAse Stammlösung mit 10 mg/ml

Proteinnase K- Lösung Stammlösung mit 20 mg/ml

CTAB- Lösung 10% in 0,7 M NaCl

NaCl- Lösung 4 M

Chloroform/Isoamylalkohol 24:1

Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1

Isopropanol- Lösung 100%

Ethanol- Lösung 80% Alle aufgeführten Chemikalien wurden von der Firma Roth bezogen.

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Material und Methoden

38

Durchführung:

Eine 10 ml THB- Übernachtkultur der isolierten α -hämolysierenden Streptokokken,

die unter aeroben Bedingungen und bei 37°C bebrütet wurde, wurde für 15 min. bei

5000 x g und 4°C abzentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstandes wurde das

Sediment in 500 μl TEN-Puffer mit 10 mg/ml Lysozym und 0,18 mg/ml RNAase

resuspendiert. Es erfolgte eine Inkubation für eine Stunde bei 37°C. Nach Zugabe

von 15 μl 20%iger SDS-Lösung und 10 μl 20 mg/ml Proteinase K-Lösung und

wiederholtem Schwenken wurde erneut für eine Stunde bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurden 125 μl 4 M NaCl und, nach vorsichtigem Mischen, 80 μl von

einer auf 60°C erwärmten 10% CTAB-Lösung zugegeben und für 10 min. bei 60°C

inkubiert. Die DNA-Extraktion erfolgte durch die Zugabe von 780 μl

Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) und wiederholtem Schwenken. Nach der

Zentrifugation für 15 min. bei 10.000 x g wurde der Überstand, von der Interphase

abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zu dem Extrakt wurden

780 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gegeben. Nach Schwenken und

einer Zentrifugation für 10 min. bei 10.000 x g wurde der Überstand in ein neues

Reaktionsgefäß überführt. Durch die Zugabe von 500 μl Isopropanol und

vorsichtigem Mischen wurde die DNA ausgefällt. Es folgte eine erneute

Zentrifugation für 30 min. bei 10.000 x g und 4°C. Anschließend wurde nach dem

Verwerfen des Überstandes noch durch die Zugabe von 500 μl –20°C kalter 80%

Ethanol-Lösung und Zentrifugation für 30 min. bei 10.000 x g die DNA gewaschen.

Der Überstand wurde daraufhin abgenommen, die DNA getrocknet und anschließend

in 50 μl Wasser (Sigma) über Nacht bei 8°C aufgenommen.

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Material und Methoden

39

3.9.2 Multiplex-PCR

Benötigte Reagenzien:

Chromosomale DNA der α-hämolysierenden Streptokokken-Isolate

10x PCR Puffer 200 mM Tris-HCl pH 8,4 ; 500mM KCl

MgCl2-Lösung 50 mM

dATP,dCTP,dGTP,dTTP

Lösung (dNTP)

Stammlösungen mit 100mM je dNTP

Taq DNA-Polymerase 5 U/ μl

Primer- Stammlösung 50 μM

100 bp DNA Leiter Alle aufgeführten Reagenzien wurden von Invitrogen, Karlsruhe, bezogen.

In einem 200 μl Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht) wurde eine 1:50 Verdünnung

der gereinigten DNA (3.9) in A. bidest. hergestellt. Von dieser Verdünnung wurden

5 μl in 35 μl A. bidest. überführt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 10 μl eines

Mastermixes, so dass sich folgende Konzentrationen im Reaktionsansatz befanden:

1x PCR-Puffer; 1,5 mM MgCl2 ; je 20 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP; 19,8 nM

mrpR; 19,8 nM mrpL; 36,5 nM epf1BRR; 36,5 epfL; 43,8 nM cps1JL; 43,8 nM

cps1JR; 35,4 nM cps2JL; 35,4 nM cps2JR; 30,2 nM cps 7HL; 30,2 nM cps7HR; 26,1

nM cps9HR; 26,1 nM cps9HL; 18,8 nM slynewL; 18,8 nM slynewR; 18,8 nM adiSnL;

18,8 nM adiSnR; 20,8 nM gdhsuisL; 20,8 nM gdhsuisR und 2 Units Taq DNA-

Polymerase. Die Proben durchliefen sofort im Anschluss folgendes PCR-Programm:

initiale Denaturierung bei 94°C für 2 min.; 30 Zyklen: 1 min. bei 94°C,1 min. bei 58°C

und ersten 30 min. bei 72°C sowie eine finale Extension bei 72°C für 2 min. Der

Nachweis von Amplifikaten erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Der

Größenstandard wurde unter Verwendung der 100bp DNA-Leiter durchgeführt

(MANIATIS 1989). Im Anschluß erfolgte die Fotographie des Agarosegels und die

digitale Verarbeitung (Imago, MWG, München). Die Sequenzen der aufgeführten

Primer sowie weitere Angaben zu dieser MP-PCR wurden bereits von SILVA et al.

(2006) publiziert.

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Material und Methoden

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3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Benötigte Reagenzien:

Carbonatpuffer 50mM NaHCO3 50mM Na2CO3 (pH=9,6)

PBST (20) pH = 7,4 0,1 M NaCl

0,01 M Na2HPO4 x 12H2O

0,002 M KCl

0,001 M KH2PO4

0,05 %Tween 20

Citrat-Phosphatpuffer, pH=4,25

(für ABTS)

50 mM C6H8O7 H2O mit 50 mM Na2H2PO4

H2O auf pH= 4,25 einstellen

ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-

6-sulfonsäure)1,

0,1 M Citrat-Phosphatpuffer

H2O2 0,002%

Rinderserumalbumin (BSA) 5 μg BSA/Vertiefung in Carbonatpuffer

Magermilchpulver 5% in PBST

Ziege anti-Schwein IgG (H+L) Artikelnummer: 114-035-003; Dianova,

Hamburg Falls keine anderen Angaben vorliegen, wurden die Chemikalien von der Firma Roth

bezogen. 1 Boehringer, Mannheim

In Vorversuchen wurden unterschiedliche ELISA-Bedingungen ausgetestet. Es

erfolgte ein Vergleich unterschiedlicher Mikrotiterplatten, die Bestimmung einer

geeigneten Antigenkonzentrationen für das Beschichten der Vertiefungen und der

Vergleich möglicher Referenzseren in Verdünnungssreihen.

Als Referenzprobe für den anti-MRP- und anti-EFfrag ELISA diente ein

Rekonvaleszenzserum, das 20 Tage nach einer experimentellen intranasalen

Infektion mit 109 KBE S. suis-Stamm 10 von einem Läuferschwein in einem

vorangegangenen Versuch gewonnen wurde. Dieses Tier stammte ursprünglich aus

demselben Herkunftsbetrieb wie die Versuchstiere dieser Arbeit. Es zeigte in Folge

der experimentellen Infektion mehrere Fieberschübe und wurde 20 Tage nach der

Infektion euthanasiert. Die nach der doppelt logarithmischen Auswertung über eine

Regressionsanalyse berechnete Aktivität dieses Rekonvaleszenzserums wurde mit

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Material und Methoden

41

100 ELISA-Units festgelegt. Als Negativkontrollen dienten Serumproben, die in

vorangegangenen Versuchen vor experimentellen Infektion gewonnen worden

waren.

Als Referenzprobe für die beiden ELISAs zur Bestimmung von Antikörpern gegen

Murein-assoziierte Proteine (anti-MAP ELISAs) kam ein Pool aus 10

Hyperimmunseren zum Einsatz, die im Rahmen einer vorangeganen Ph.D.-These

(BENGA 2004) nach einer dreimaligen Immunisierung von Schweinen mit MAP-

Fraktionen des MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stammes I9841/1 gewonnen wurden, der

für diesen Zweck bei 32°C kultiviert worden war (MAP32).

In dieser Dissertation wurden Serumproben auf Antikörpertiter im ELISA untersucht,

die drei Tage vor den Immunisierungen und am Tag der Belastungsinfektion von den

Tieren entnommen wurden. Maxisorb-Platten (Nunc, Wiesbaden) wurden mit

verschiedenen Antigenen beschichtet (MRP, EFfrag) (3.11). Als Antigene wurde eine

Fraktion aus Murein-assoziierten Proteinen (Protoplastenüberständen) von S. suis-

Serotyp 2 oder 9 in einer Konzentration von 5 μg Protein/Vertiefung in

Carbonatpuffer (pH = 9,6) eingesetzt und über Nacht im Kühlschrank inkubiert. Die

letzten beiden Reihen auf der „96-microwell“ Platte wurden mit 5 μg

Rinderserumalbumin (BSA) pro Vertiefung beschichtet. Nach der Inkubation wurden

die Platten drei mal mit PBST gewaschen. Anschließend wurden die Platten zwei

Stunden bei 37°C in 5% Magermilch in PBST geblockt (200 µl pro Vertiefung). Nach

dreimaligem Waschen mit PBST erfolgte die Belegung der Platte mit

Serumverdünnungen. Jede Serumprobe wurde in einer Verdünnungsreihe von vier

aufeinander folgenden 1:2 Verdünnungsstufen gemessen (beginnend bei 1:200). Alle

Messungen erfolgten als Duplikate. Die Platte wurde für eine Stunde schüttelnd bei

37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen erfolgte die Zugabe von 100 μl einer

1:20000 Verdünnung eines Peroxidase (POD)-Konjugates, das alle IgG-Klassen vom

Schwein erkennt. Nach einer Stunde Inkubation und dreimaligen Waschen wurden

100 μl des ABTS Substrats (ABTS mit 0,002% H2O2) hinzugefügt. Nach 15 min.

wurde die OD405 fotometrisch (Tecan Grödig, Österreich) bestimmt. Alle

Waschschritte wurden mit einem Dynatch „microplate washer“ durchgeführt.

Der ELISA sollte Qualitätskriterien genügen, die in Anlehnung an eine WHO-

Richtlinie zur Bestimmung von ELISA-Units zur Kontrolle von

Pneumokokkenimpfungen beim Menschen festgelegt wurden

(www.vaccine.uab.edu).

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Material und Methoden

42

Für den anti-MRP ELISA wurden folgende Qualitätskriterien festgelegt:

1. Die Standardabweichung der beiden Messungen (Duplikate) einer

Probenverdünnung durfte nicht mehr als 22 % betragen.

2. Die Negativkontrolle (Tier 101 prae inf.) musste Werte unter 5 ELISA-Units

annehmen.

3. Als Positivkontrolle wurde das anti-MRP Hyperimmunserum 667 fbl.

eingesetzt. Dieses Serum stammt von einem Immunisierungsversuch des

Impfstoffwerkes Dessau Tornau, bei dem ein Jungschwein (667) einmal mit

1 mg und weitere drei Male mit 0,5 mg MRP immunisiert wurde (Einsatz

eines Adjuvans, Aluminiumhydroxid, nur bei der letzten Immunisierung).

Für 667 fbl. wurden Werte zwischen 50 und 130 ELISA-Units akzeptiert.

4. Die Steigung der Regressionsgeraden des Referenzserums (Tier 101 fbl.)

sollte einen Wert zwischen 0,8 und 1,2 annehmen.

5. Der Korrelationskoeffizient der Regressionsanalyse des Referenzserums

musste mind. 0,98 betragen.

Für die ELISAs zur Bestimmung von Antikörpern gegen Murein-assoziierte Proteine

von Stamm 10 bzw. Stamm 9 wurden folgende Qualitätskriterien festgelegt:

1. Die Standardabweichung der beiden Messungen (Duplikate) einer

Probenverdünnung durfte nicht mehr als 22 % betragen.

2. Da keine Seren von Gnotobioten zur Verfügung standen, wurden als

„Negativkontrollen“ Seren von nicht immunisierten bzw. nicht infizierten

Absetzferkeln des Herkunftsbestandes eingesetzt, für die Werte bis zu 22

ELISA-Units akzeptiert wurden.

3. Das Rekonvaleszenzserum „116 fbl.“ aus dem Vorversuch dieser

Dissertation fungierte als Positivkontrolle. Für „116 fbl.“ wurden Werte

zwischen 45 und 80 ELISA-Units akzeptiert.

4. Die Steigung der Regressionsgeraden des Serumpools MAP32 sollte einen

Wert zwischen 0,8 und 1,2 annehmen.

5. Der Korrelationskoeffizient der Regressionsanalyse des Referenzserums

musste mind. 0,98 betragen.

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Material und Methoden

43

3.11 Herstellung eines rekombinanten EF-Fragmentes (rEFfrag) als ELISA-Antigen

Der Virulenz-assoziierte extrazelluläre Faktor (EF) von virulenten

S. suis-Serotyp 1- und 2-Stämmen induziert bei einer Infektion mit diesen Stämmen

die Bildung von anti-EF Antikörpern (SMITH et al. 1993; VECHT et al. 1991). Die

Subunitvakzine auf der Grundlage der Murein-assoziierten Proteine war frei von EF.

Aus diesem Grund konnte durch die Bestimmung von

EF-spezifischen Antikörpern eine Unterscheidung von mit der Subunitvakzine

immunisierten und mit EF+ S. suis-Stämmen infizierten Schweinen ermöglicht

werden (DIVA-Prinzip), (MAAS et al. 2006). Aufgrund dieser Zusammenhänge wurde

für die Etablierung eines ELISAs zur Bestimmung von EF-spezifischen Antikörpern

die Gewinnung eines rekombinanten EF-Fragmentes vorgenommen.

Das rekombinante EF-Fragment (rEFfrag) sollte die Aminosäuren 576 bis 840 von

EF beinhalten (siehe „gene accession“ Nummer QO7289). Zur Herstellung dieses

Fragmentes aus chromosomaler DNA von S. suis-Stamm 10 wurde zunächst mit den

Primern EpfBamHI (GAACTGGATCCTACGGGAGC) and EpfendSphI

(TGCCGCATGCGTTCGACTGGTTAATAG) das 801 bp lange epf-Amplifikat

generiert. In dieser PCR wurden die gleichen Bedingungen wie in der Multiplex-PCR

zur Typisierung der S. suis-Isolate eingesetzt (3.9.2). Die Elution des 801 bp

epf-Amplifikates aus dem Gel erfolgte mit dem „Gel Extraction Kit“ (Sigma) nach den

Angaben des Herstellers. Für die Klonierung wurden das epf-Amplifikat und der

pQE31-Vektor (Qiagen) mit den Restriktionsenzymen BamHI und SphI (New

England Biolabs) geschnitten. Die Ligation der beiden Fragmente erfolgte nach

Phenol/Chloroform-Extraktion und Präzipitation (Isopropanol/Alkohol) nach den

Angaben des Herstellers der Ligase (Promega). Nach Elektroporation in E. coli M15

und phänotypischer Expression in LB bei 37°C für eine Stunde mussten zur

Selektion der transformierten Bakterien Proben auf LB Nährböden mit Ampicillin und

Kanamycin ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert werden. Nach der

Subkultivierung wurde die Plasmid-DNA der Klone isoliert und über einen

Restriktionsverdau analysiert. Nach der Gewinnung eines Klons mit dem erwarteten

801 bp großen epf-Insert (im Folgenden: M15 pQEepffrag) konnte die phänotypische

Überprüfung wie folgt durchgeführt werden: Nach dem Wachstum bis zu einer OD600

von 0,4 wurde 1M IPTG hinzugeben und für drei Stunden bei 37°C inkubiert. Als

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Material und Methoden

44

Negativkontrolle wurde vor IPTG Zugabe 1 ml von der Kultur abgenommen,

zentrifugiert und in 2fachem Probenpuffer resuspendiert. Beide Proben wurden durch

SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Western Blot und einem monoklonalen

EF-Antikörper entwickelt. Die Reinigung von rEFfrag über eine

Ni2+- Affinitätschromatographie unter nativen Bedingungen erfolgte nach den

Angaben des Herstellers (Machery-Nagel).

3.11.1 Herstellung eines Anti-rEF Antiserums

Die Herstellung eines polyklonalen Anitserums gegen gereinigtes rEFfrag erfolgte

durch dreifache Immunisierung eines Kaninchens mit 0,1 mg gereinigten Protein in

„Freund’s incomplete Adjuvans“. Die Immunisierungen bzw. Booster erfolgten im

Abstand von zehn Tagen subkutan. Vor und nach den Immunisierungen wurden

Serumproben für Untersuchung im Western Blot entnommen. Das polyklonale

Antiserum gegen rEFfrag wurde durch Entblutung des Kaninchens gewonnen.

3.11.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der BIORAD Dc Assay nach den

Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Proteine wurden in einer Mikrotiterplatte

(96 well) verdünnt und durch eine fotometrische Messung bei 595 nm die

Proteinkonzentration mit Standard bestimmt.

3.11.3 SDS-PAGE

Benötigte Reagenzien für ein 8% SDS-Gel (Mini-V 8-10):

Trenngel Sammelgel

H2O 2,3 ml 1,75 ml

Acrylamid 1,35 ml 0,4 ml

1,5 M Tris pH=8,8 1,25 ml

0,5 M Tris pH=8,8 0,75 ml

20% SDS 25 µl 12,5 µl

TEMED 3 µl 2,5 µl

10% APS 100 µl 50 µl

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Material und Methoden

45

Die SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) nach

LAEMMLI (1970) wurde in einem vertikalen System durchgeführt. Es wurde zunächst

ein Trenngel gegossen. Nach einer 30 min. Polymerisation wurde dieses Trenngel

(8%) mit einem Sammelgel (8%) überschichtet. Die Proben wurden vorher mit PBS

auf die gleiche Proteinkonzentration eingestellt. Durch eine Erhitzung auf 95°C für

10 min. erfolgte eine vollständige Denaturierung der Proteine. Die

Elektrophoresekammer (Biorad, München) wurde mit einem SDS-Laufpuffer gefüllt,

und die vorbereiteten Proben wurden auf das Gel geladen und für eine Stunde bei

150 V aufgetrennt.

3.11.4 Comassieblau-Färbung

Färbelösung 0,25% (w/v) Commassie Brilliant Blau

R250 (Sigma, Steinheim), 45% (v/v)

Methanol, 10% (v/v) Essigsäure

Entfärbelösung 30%(v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure

Geltrocknungslösung 25% (v/v) Ethanol, 8% (v/v) Essigsäure,

10% (v/v) Glyzerin

Das SDS-Gel wurde für ca. 20 min. mit der Färbelösung gefärbt. Anschließend

erfolgte die Entfärbung des Hintergrundes mit der Entfärbelösung. Alle Schritte

wurden auf einem Schwenktisch durchgeführt. Vor dem Trocknen des Geles wurde

es mit einem Scanner digital dokumentiert. Nach vollständiger Entfärbung erfolgte

die Konservierung durch eine Geltrocknung. Hierfür wurde eine Zellophanfolie in eine

Geltrocknungslösung gelegt. Die entfärbten Gele wurden luftblasenfrei zwischen

zwei Folien gelegt und in einen Rahmen gespannt. Die dreistündige Trocknung

erfolgte durch einen Geltrockner (Biorad, München).

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Material und Methoden

46

3.11.5 Western Blot (BURNETT 1981)

Benötigte Reagenzien:

Transferpuffer 24,8 mM Tris, 113 mM Glycin, 20% Methanol, 10% SDS

TBST 10 mM Tris pH = 8; 150 mM NaCl ; 0,05% Tween 20

Nach der Auftrennung der Proteine wurde das Gel von den Glasplatten gelöst, das

Sammelgel wurde abgetrennt und das Trenngel in Transferpuffer eingelegt. Auch die

Nitrozellulosemembran (NZ-Membran), das Filterpapier und der Schaumstoff wurden

10 min. in Transferpuffer eingelegt. Danach erfolgte das luftblasenfreie Schichten

von Schaumstoff-Filterpapier-NZ-Membran-Filterpapier-Schaumstoff. Nach dem

Schließen wurde der Halter in das Tank Blot System eingelassen, indem sich

ebenfalls der Tansferpuffer befand. Der Transfer von dem Gel auf die NZ-Membran

erfolgte für 90 min. bei 100 V. Anschließend wurde das Gel verworfen und die

NZ-Membran in 3% Magermilch in TBST über Nacht geblockt, um unspezifische

Bindungen zu vermeiden. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurde nun ein

Primär-Antikörper (Anti-rEF) in der erforderlichen Verdünnung (1:250) für eine

Stunde auf die NZ-Membran gegeben. Nach dreimaligem Waschen folgte die

Inkubation mit dem Antikörper-POD-Konjugat (1:20.000) für eine Stunde. Die

Antikörper wurden jeweils in Waschpuffer verdünnt. Alle Waschschritte erfolgten für

eine Dauer von jeweils 5 min. Die Inkubationsschritte wurden auf einem

Schwenktisch, die Waschschritte auf einem Schüttler durchgeführt.

Nach dem zweite Antikörper und mehrmaligem Waschen wurde die NZ-Membran

durch Filterpapier gründlich getrocknet und mit einer Chemolumineszenz-Lösung

(Pierce, Rockford) für 4 min. beschichtet. Nach erneutem Trocknen wurde ein

Röntgenfilm (Biomax,Kodak) auf die NZ-Membran gelegt und entwickelt.

3.12 Statistische Auswertung der Ergebnisse

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem „Statistical Analysis System for

Windows“, SAS® und wurde zusammen mit Herrn Dr. Beyerbach (Institut für

Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung, Tierärztliche Hochschule

Hannover) durchgeführt. Der zeitliche Verlauf der Merkmale Mortalität und Morbidität

wurde in Kaplan-Meyer-Diagrammen dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte

mit dem Log-Rank-Test.

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Ergebnisse

47

4 Ergebnisse

4.1 Etablierung eines S. suis-Serotyp-9-Tiermodells

In dem ersten Teil der Arbeit wurden zwei invasive S. suis-Pathotypen in einem

intranasalen Infektionsmodell von Läuferschweinen auf ihre virulenten Eigenschaften

hin miteinander verglichen. Wie in den folgenden Infektionen der

Immunisierungsversuche kam zum einen der hochvirulente MRP+ EF+ SLY+

Serotyp-2-Stamm 10 zum Einsatz, zum anderen wurde erstmals ein

Serotyp-9-Stamm in experimentellen S. suis-Infektionen getestet. Der ausgewählte

Serotyp-9-Stamm (A3286/94) war von einem Schwein mit Meningitis isoliert worden

(ALLGAIER et al. 2001).

4.1.1 Vergleichende experimentelle Infektion mit S. suis-Serotyp 2 und Serotyp-9-Stamm A3286/94

Fünf von sechs Tieren, die mit dem S. suis-Serotyp-2-Stamm-10 infiziert worden

waren, entwickelten klinische Symptome mit Fieber und Leukozytose. Zwei der Tiere

(106 und 119) zeigten zentralnervöse Störungen, wie Tremor, Opisthotonus und

Ataxie. Bei zwei weiteren Tieren (120 und 107) konnten hochgradige Lahmheiten

festgestellt werden. Ein Tier (148) zeigte im klinischen Bild eine Kyphose und

Apathie (Tabelle 5). Im Gegensatz dazu konnten während der gesamten

Versuchszeit von 20 Tagen keine klinischen Anzeichen bei den sechs Tieren

beobachtet werden, die mit dem S. suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 intranasal

infiziert worden waren. Die Körpertemperatur lag bei allen Messungen unter 40°C

(Tabelle 5). Dennoch stiegen innerhalb von elf Tagen nach der Infektion bei fünf der

sechs Tiere, die mit Serotyp 9 intranasal infiziert worden waren, die Leukozyten

temporär auf Werte über 22G/l an (Tabelle 5). Daraufhin wurden vier weitere Tiere

intravenös mit 108 KBE A3286/94 infiziert. Drei dieser Tiere (97, 99, 100) zeigten

innerhalb von 24 Stunden Anzeichen einer akuten Polyarthritis. Das vierte Schwein

(98) wies zentralnervöse Störungen mit Ataxie und Tremor auf. Dieses Tier (98) hatte

auch eine extrem hohe Körpertemperatur (42,7°C). Zwei weitere intravenös infizierte

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Ergebnisse

48

Tiere (97, 99) zeigten ebenfalls eine Erhöhung der Körpertemperatur auf Werte

> 40,5°C. Bei einem Tier (100) konnte trotz Erkrankung keine Erhöhung der

Körpertemperatur festgestellt werden. Alle vier Schweine wurden aufgrund ihres

schweren Krankheitsbildes innerhalb von 24 Stunden nach der Infektion

euthanasiert. Als Ergebnis ist festzuhalten, dass klinisch manifeste Erkrankungen bei

Läuferschweinen mit dem S. suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 durch eine

intravenöse, nicht jedoch durch eine intranasale Applikation hervorgerufen werden

konnten. Im Gegensatz dazu wurden durch eine intranasale Applikation des

S. suis-Serotyp-2-Stammes 10 in der gleichen Altersklasse schwere Erkrankungen

mit hohem Fieber und zum Teil mit zentralnervösen Störungen induziert.

Tabelle 5: Virulenz von S. suis-Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) und Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) in experimentellen Infektionen von Läuferschweinen

Experimentelle S. suis -Infektion

max. Körper-

temperatur (°C)

max. Leukozyten-zahl (G/l) 2 Anzahl der

infizierten Tiere

Stamm Appl. KBE Morbi-dität

Morta-lität

klinische Symp-tome 1

≤40 40 –40,5 ≥40,5 ≤ 22 22 –

30 ≥ 30

6 10 i. n. 109 5/6 4/6 4/6 1/6 3/6 2/6 1/6 4/6 1/6

6 A3286/94 i. n. 109 0/6 0/6 0/6 6/6 0/6 0/6 1/6 5/6 0/6

4 A3286/94 i. v. 108 4/4 4/4 4/4 1/4 0/4 3/4 2/4 2/4 0/4 1 Klinische Symptome, wie Apathie, Anorexie, zentralnervöse Störungen und akute Lahmheit. 2 Leukozytenwerte von Blutproben aus der Vena cava craniallis, die 3, 5, 7 und 11 Tage nach

der Infektion entnommen wurden. Alle Tiere wiesen vor der Infektion Werte unter 20 G/l auf.

4.1.2 Pathologische und pathohistologische Befunde nach experimentellen Infektionen mit S. suis-Serotyp 2 und Serotyp-9-Stamm A3286/94

Alle Versuchstiere wurden in einer Sektion auf Veränderungen durch eine

S. suis-Infektion untersucht (3.4.6). Wie unter 4.1 aufgeführt, wurden vier von sechs

der intranasal mit Stamm 10 und bei allen vier intravenös mit Stamm A3286/94

infizierten Tieren vorzeitig euthanasiert und anschließend seziert aufgrund einer

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Ergebnisse

49

schweren akuten Erkrankung. Alle übrigen Versuchstiere wurden 20 Tage nach der

Infektion euthanasiert und pathologisch untersucht.

Bei den drei Tieren (106, 116, 98), die aufgrund von zentralnervösen Störungen

euthanasiert wurden, konnten keine makroskopischen Veränderungen in der Sektion

festgestellt werden. Das Tier (148) mit der Kyphose zeigte in der Sektion eine

hochgradig fibrinöse Peritonitis. Die an Lahmheit erkrankten Tiere (120, 97, 99, 100)

wiesen in den betroffenen Gelenken eine milchig-gelbe Synovia auf.

Die Proben für die pathohistologischen Untersuchungen wurden im Rahmen der

Sektion zur Untersuchung auf typische Veränderungen einer S. suis-Infektion nach

einem im Vorfeld festgelegten Ablauf gewonnen (3.4.6). Die pathohistologischen

Untersuchungen der Tiere, die mit A3286/94 intranasal infiziert worden waren,

ergaben Läsionen und Infiltrationen in mehreren Organen (Tabelle 6). Gerringgradige

Peritonitis und/oder Pleuritis wurde bei allen sechs Schweinen diagnostiziert. Bei vier

Tieren waren diese fibrinös-eitrig (7, 10, 116,132), zwei andere Tiere wiesen

lymphoplasmazelluläre Infiltrationen in Pleura und/oder Peritoneum auf (6, 8). Von

den mit A3286/94 intranasal infizierten Schweinen war bei dem Tier 116 der Grad

und die Ausdehnung der Entzündungen im Gehirn am stärksten. Es konnte eine

geringgradige multifokale, teils lymphoplasmazytäre, teils fibrinös-eitrige Meningitis

sowie eine mittelgradige multifokale fibrinöse Ventrikulitis festgestellt werden

(Abbildung 16). Eine geringgradige fokale eitrige Meningitis lag in derselben Gruppe

bei dem Schwein 10 vor. Die anderen vier Läufer dieser Gruppe (6, 7, 8, 132) zeigten

lymphoplasmazelluläre Infiltrationen der Meningen und/oder des Plexus chorioideus

bzw. eine multifokale granulomatöse Enzephalitis (132).

Nur in der Gruppe, die intranasal mit Stamm10 infiziert worden war, konnten mittel-

bzw. hochgradige fibrinös-eitrige Meningitiden diagnostiziert werden. Zwei Tiere (106

und 119), die bereits durch zentralnervöse Störungen aufgefallen waren, zeigten

diese pathologischen Veränderungen (Tabelle 6 und Abbildung 13). Ähnlich wie bei

den mit Serotyp 9 intranasal infizierten Tieren wurden bei drei anderen Tieren dieser

Gruppe eine lymphoplasmazelluläre Meningitis und teils eine Plexus chorioiditis

festgestellt. Fibrinös-eitrige Veränderungen unterschiedlichen Grades waren bei den

Tieren dieser Versuchsgruppe noch in anderen Geweben zu erkennen (Tabelle 6).

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Ergebnisse

50

Bei dem Tier 148 lag beispielsweise eine hochgradige diffuse bzw. multifokale

fibrinös-eitrige Pleuritis und Peritonitis vor (Abbildung 15).

Die geschilderten pathohistologischen Veränderungen führten zu einem höheren

Pathoscore bei der mit Stamm 10 (3,2) als bei der mit Stamm A3286/94 (2,5)

infizierten Gruppe (Tabelle 6).

Einen hohen Pathoscore von 4,0 wies ferner die Gruppe auf, die intravenös mit

A3286/94 infiziert worden war. Drei Tiere (97, 99, 100) zeigten mittelgradige bis

hochgradige neutrophile Infiltrationen in der Synovialis des Tarsalgelenks (Abbildung

14). Zudem lagen bei allen vier Tieren eine eitrige Splenitis und eine multifokale,

eitrige Pneumonie in unterschiedlichen Schweregraden vor (Tabelle 6). Das Schwein

98 zeigte im Gegensatz zu den anderen drei Tieren nicht nur eine hochgradige

multifokale eitrige Splenitis sondern auch eine mittelgradige multifokale eitrige

Hepatitis.

Zusammenfassend konnten schwerwiegende Befunde durch die pathohistologische

Untersuchung hauptsächlich in den intranasal mit MRP+EF+SLY+ Serotyp-2-Stamm

10 und in den intravenös mit Serotyp-9-Stamm A3286/94 infizierten Tieren

festgestellt werden. Die Tiere, die mit dem Serotyp-9-Stamm intranasal infiziert

worden waren, zeigten meist nur minimale bis geringgradig fokale Veränderungen in

den Serosen und im Gehirn. Neutrophile Infiltrationen waren in mehreren Organen

aufzufinden. Nach der intravenösen Infektion mit dem Serotyp-9-Stamm waren die

Veränderungen hauptsächlich in den Gelenken vorhanden.

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Ergebnisse

51

Tabelle 6: Fibrinös-eitrige Entzündungen bei mit S. suis-Stamm 10 oder mit Serotyp-9-Stamm A3286/94 infizierten Läuferschweinen.

1 E

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Ergebnisse

52

4.1.3 Reisolierung der Belastungsstämme (A3286/94 und Stamm 10)

Als Nachweis der Belastungsstämme galt die Identifizierung des Genotyps.

Der Infektionsstamm konnte in unterschiedlichen Organen erkrankter Tiere, die mit

Stamm 10 intranasal oder mit A3286/94 intravenös infizierten worden waren, kulturell

nachgewiesen werden. Bis auf den Tonsillentupfer von Tier 8 war allerdings in allen

Proben der mit Stamm A3286/94 intranasal infizierten Schweine der

Belastungsstamm kulturell nicht nachweisbar (Tabelle 7).

Bei den Tieren mit mittel- oder hochgradiger fibrinös-eitriger Meningitis (106 und 119)

konnte der Infektionsstamm aus dem Liquor cerebrospinalis isoliert werden. Der

gleiche Stamm wurde auch aus der Leber und dem Peritoneum des mit Stamm 10

infizierten Schweines 148 isoliert.

Der Belastungsstamm A3286/94 wurde in dem Liquor cerebrospinals von Tier 98

nach intravenöser Applikation kulturell diagnostiziert. Alle weiteren

Gehirnflüssigkeitsproben waren in der kulturellen Untersuchung auf S. suis negativ

(Tabelle 7). Aus der Gelenkflüssigkeit konnte nur bei den drei Schweinen 97, 99 und

100 mit fibrinös-eitriger Tarsitis bzw. Karpitis nach intravenöser A3286/94 Infektion

der Belastungsstamm isoliert werden. Bei dem Tier 98 wurde der Belastungsstamm

in der Leber, Milz und dem Pleuratupfer, bei Tier 97 in dem Peritonealtupfer kulturell

nachgewiesen (Tabelle 7).

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass der Belastungsstamm bei drei von sechs

mit Stamm 10 intranasal und allen mit Stamm A3286/94 intravenös belasteten

Schweinen in inneren Organen nachgewiesen wurde. Der kulturelle Nachweis der

Belastungsstämme war mit Ausnahme der Tonsillenproben mit fibrinös-eitrigen

Organveränderungen assoziiert. Für die subklinischen pathohistologischen

Veränderungen der intranasal mit A3286/94 infizierten Schweine gelang im Rahmen

dieser Dissertation kein Erregernachweis.

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Ergebnisse

53

Tabelle 7: Reisolierung des Belastungsstammes von Läuferschweinen, die mit S. suis-Stamm 10 oder Stamm A3286/94 infiziert worden sind.

Experimentelle S. suis- Infektion

Anzahl der Tiere in denen der S. suis-Belastungsstamm1 isoliert werden konnte Infizierte

Tiere Tonsille2

Alter n Stamm Appl.2 KBE

2-11 dpi

20 dpi Lu

nge3

Ser

osa4

Milz

und

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er L

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Liqu

or

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spin

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Syn

ovia

6

7-8 6 10 i. n. 109 2/6 1/2 0/6 0/6 1/6 2/6 0/6

7-8 6 A3286/94 i. n. 109 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

7-8 4 A3286/94 i. v. 108 1/4 3/4 2/4 2/4 1/4 3/4

1 Der Belastungsstamm konnte von der Kultur mit einer MP-PCR differenziert werden

(siehe 3.8). 2 Tonsillentupfer oder Organprobe, Tage nach der Infektion (dpi). 3Untersuchung eines Lobus cranialis. 4Pleura-, Peritoneal- und/oder Perikardhöhle. 5Tarsal- und Karpalgelenkpunktate.

4.2 Protektive Wirkungen einer Ganzzell- und Subunitvakzine gegenüber homologen und heterologen Belastungsinfektionen mit S. suis-Serotyp 2 bzw. 9 Stämmen

Im zweiten Teil der Dissertation wurde die protektive Wirkung einer Subunitvakzine

aus Murein-assoziierten Proteinen mit der protektiven Wirkung einer Ganzzellvakzine

verglichen, beide auf der Grundlage des Serotyp-2-Stammes 10.

Insgesamt wurden drei Immunisierungsversuche durchgeführt, zwei mit homologer

und einer mit heterologer Belastungsinfektion. In dem Vorversuch zur Etablierung

eines Serotyp-9-Infektionsmodells (4.1) wurde festgestellt, dass der für die homologe

Belastungsinfektion eingesetzte hochvirulente Serotyp-2-Stamm 10 im intranasalen

Infektionsmodell eine hohe Morbidität hervorrief, während der für die heterologen

Belastungsinfektion ausgewählte MRP* SLY+ Serotyp-9-Stamm A3286/94 erst nach

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Ergebnisse

54

intravenöser Applikation zu klinisch manifesten Erkrankungen führte. Aus diesem

Grund wurden die homologen Belastungsinfektionen intranasal und die heterologen

intravenös durchgeführt. Der einzige Unterschied der beiden homologen

Belastungsversuche war die Wahl des Adjuvans. Im ersten Immunisierungsversuch

kam Aluminiumhydroxid, im zweiten eine Öl-in-Wasser-Emulsion (Emulsigen®) zum

Einsatz.

Nach den jeweiligen Immunisierungen zeigten die Tiere, die mit Aluminiumhydroxid

als Adjuvans immunisiert worden waren, keine klinisch erkennbare Reaktion auf die

Immunisierung. Die Tiere des zweiten und dritten Immunisierungsversuches, denen

eine Öl-in-Wasser-Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans appliziert worden war, fielen

sechs bis acht Stunden nach der Immunisierung durch deutliche Reaktionen auf. Alle

Tiere, einschließlich der mit dem Placebo behandelten Kontrollgruppe, hatten eine

Körpertemperatur über 40°C. Sie zeigten verminderte Aufmerksamkeit und Anorexie.

24 Stunden nach der Immunisierung war die Körpertemperatur bei allen Tieren

wieder unter 40°C. Die Tiere waren aufmerksam und zeigten Appetit.

4.2.1 Protektive Wirkung einer S. suis-Ganzzellvakzine

4.2.1.1 Homologe Belastungsinfektion

Im ersten Versuch verhielt sich die mit der Ganzzellvakzine immunisierte Gruppe in

Bezug auf Morbidität und Mortalität in Folge der homologen Belastungsinfektion nicht

signifikant unterschiedlich zur Placebogruppe (Morbidität: P = 0,1455; Mortalität:

P = 0,2668). Es verstarben fünf von sieben Tiere (51-57) aus der Gruppe der

Ganzzellvakzine und fünf von acht aus der Placebo-Gruppe (71-78) an den Folgen

einer Infektion mit dem homologen Belastungsstamm (Abbildung 1, Tabelle 8). In

dieser Ganzzellvakzinegruppe stellten sich bei zwei Tieren zentralnervöse Störungen

ein. Eines dieser Tiere (51) zeigte hochgradigen Tremor. Das andere Tier (55) fiel

durch krampfartiges Stehen mit hochgradigem Tremor auf. Ein weiteres Tier (52)

wies eine hochgradige Lahmheit der vorderen linken Gliedmaße auf. Es konnte eine

Umfangsvermehrung des Karpalgelenkes und milchig-gelblich trübe Synovia

beobachtet werden. Zwei weitere Tiere (53, 57) zeigten Apathie und wiesen eine

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Ergebnisse

55

Körpertemperatur von > 41°C auf. Bei den klinisch nicht erkrankten Tieren (54, 56)

konnte während der gesamten Versuchszeit keine Erhöhung der Körpertemperatur

registriert werden (< 40,5°C) (Tabelle 8). Bei den hämatologischen Untersuchungen

wurde bei drei erkrankten Tieren (51, 52, 53) ein Anstieg der Leukozyten auf > 22 G/l

festgestellt (Tabelle 8). Auch bei Tier 54, welches keine Anzeichen einer klinischen

Erkrankung und keine Temperaturerhöhung aufwies, erfolgte ein Anstieg der

Leukozyten auf >22 G/l. Tier 56, welches ebenfalls klinisch nicht erkrankte, zeigte

wie die Tiere 55 und 57, keinen Anstieg (< 22 G/l) der Leukozyten (Tabelle 8).

In der Placebo-Gruppe zeigten zwei Schweine (74, 71) zentralnervöse Störungen

und drei weitere Tiere (72, 73, 75) Apathie.

Sowohl in der Ganzzellvakzine- als auch in der Placebogruppe konnte der

Belastungsstamm bei der Mehrzahl der erkrankten Tiere aus den betroffenen

Geweben isoliert werden (Tabelle 9). In beiden Gruppen wurden bei allen erkrankten

Tieren in den histologischen Untersuchungen pathologische Veränderungen

diagnostiziert, die mit dem klinischen Bild der Tiere korrelierten (Tabelle 10).

Beispielsweise lagen bei den beiden Tieren (51, 55) mit zentralnervösen Störungen

aus der Ganzzellvakzinegruppe hochgradige diffuse fibrinös-eitrige Meningitiden vor,

die mit dem Nachweis des Belastungsstammes im Liquor cerebrospinalis bzw.

Gehirntupfer mit hochgradigem Keimgehalt assoziiert waren. Bei jeweils vier Tieren

aus der Ganzzellvakzine- bzw. Kontrollgruppe konnten fibrinös-eitrige bzw. eitrige

Entzündungen in mehreren Organen nachgewiesen werden. So konnten zum

Beispiel bei dem Tier 55 mit der klinisch manifesten Meningitis noch zusätzlich eine

mittel- bzw. geringgradige multifokale eitrige Polyserositis und Splenitis festgestellt

werden. In minimal und geringgradig entzündetem Gewebe erfolgte, wie in anderen

Infektionsversuchen, häufig kein Nachweis des Belastungsstammes. Weiterhin war

es nicht möglich, in dem Gelenkpunktat von Tier 52 mit der hochgradigen diffusen

fibrinös-eitrigen Synovialitis den Erreger zu bestätigen. Dieses Phänomen der

eitrigen sterilen Gelenkpunktate wurde in den unterschiedlichen

Belastungsversuchen dieser Dissertation wiederholt beobachtet. In anderen

entzündlich veränderten Geweben der entsprechenden Tiere konnte der

Belastungsstamm jedoch häufig nachgewiesen werden (Tabelle 9 und 10).

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Ergebnisse

56

Beispielsweise wurde bei dem Tier 52 noch eine mittelgradige diffuse fibrinös-eitrige

Pleuritis diagnostiziert, die mit einem Nachweis des Belastungsstammes im

Pleuratupfer assoziiert war.

Im zweiten Versuch mit der Öl-in-Wasser Emulsion konnte im Vergleich zur Placebo

behandelten Gruppe bezüglich der Mortalität und Morbidität eine signifikante

protektive Wirkung (P=0,005) erzielt werden (Abbildung 3 und 4). In dieser

Ganzzellvakzinegruppe verstarben zwei von sieben Tieren. Zu den Symptomen

dieser beiden Tiere gehörten zum einen eine zentralnervöse Störung (93) zum

anderen Lahmheiten (98). Die Körpertemperatur dieser beiden Tiere war zum

Zeitpunkt der Euthanasie auf > 40,5°C angestiegen. Die Temperatur der anderen

Tiere dieser Gruppe lag bis zum Ende des Versuches unter 40,5°C (Tabelle 8). Das

an Lahmheit erkrankte Tier (98) zeigte, wie drei klinisch nicht erkrankte Tiere, eine

Erhöhung der Leukozytenwerte auf > 22 G/l (Tabelle 8). Abgesehen von einer

Ausnahme in der Placebogruppe (48) konnte bei allen klinisch erkrankten Tieren der

Ganzzellvakzinegruppe (93, 98) und der Placebo-Gruppe im zweiten Versuch der

Belastungsstamm in mindestens einem inneren Organ nachgewiesen werden

(Tabelle 9). Die Erregernachweise gingen in jedem dieser Fälle mit fibrinös-eitrigen

Entzündungen der entsprechenden Organe einher. Zusätzlich konnte bei Tier 98

eine geringgradig fokal eitrige Peritonitis festgestellt werden, ohne dass ein

Erregernachweis vorlag. Bei den klinisch nicht erkrankten Tieren der

Ganzzellvakzinegruppe konnte der Belastungsstamm bei vier von fünf Tieren aus

den Tonsillen post mortem reisoliert werden (Tabelle 9). Grundsätzlich waren im

zweiten Experiment in der Placebogruppe Nachweise des Belastungsstammes aus

mehreren inneren Organen häufiger als in den beiden immunisierten Gruppen

(Tabelle 9). So konnte bei vier Tieren (41, 44, 45, 46) der Placebogruppe der

Belastungsstamm in mindestens drei unterschiedlichen inneren Lokalisationen (d. h.

außer Lunge und Tonsille) nachgewiesen werden, während dieses Merkmal einer

generalisierten bakteriellen Erkrankung bei keinem der mit der Ganzzellvakzine

immunisierten Tiere vorlag. Die protektive Wirkung der Ganzzellvakzine im zweiten

Immunisierungsexperiment manifestierte sich auch in einem sehr niedrigen

Pathoscore von nur 1,25, während die Placebogruppe des gleichen Versuches 3,75

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Ergebnisse

57

erreichte (Tabelle 10). Im Einklang mit den klinischen und bakteriologischen

Ergebnissen konnte hingegen die Ganzzellvakzine im ersten Immunisierungsversuch

mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans keinen Schutz vor fibrinös-eitrigen

Veränderungen als Folge einer homologen Belastungsinfektion vermitteln

(Pathoscore von 3,2; Tabelle 10). Die pathohistologischen Veränderungen waren

hauptsächlich Meningitiden und Serositiden. Unterschiede in Bezug auf die

Manifestationsorgane waren zwischen den einzelnen Gruppen des ersten und

zweiten Versuches nicht zu erkennen (Tabelle 10).

4.2.1.2 Heterologer Belastungsinfektion

Im dritten Immunisierungsversuch erzielte die Applikation der Ganzzellvakzine in

Bezug auf die Mortalität keinen signifikanten protektiven Schutz (P = 0,2841)

gegenüber der heterologen Belastungsinfektion (Abbildung 5). Im Gegensatz zur

Placebogruppe, in der fünf von sechs Tiere verendeten, überlebten aber in der

Ganzzellvakzinegruppe drei Tiere. In dieser Ganzzellvakzinegruppe zeigten zwei

Tiere (201, 203) hochgradige Lahmheiten. Bei Tier 203 waren zwei Gliedmaßen

betroffen, wodurch das Tier in der Bewegung stark eingeschränkt war. Obwohl die

Tiere 201 und 203 der Ganzzellvakzinegruppe das klinische Bild einer akuten

Arthritis zeigten, blieb der Nachweis einer Synovialitis in der histologischen

Untersuchung aus (Abbildung 10). Die Ursache dafür ist unklar, insbesondere da bei

einem Tier (203) das Gelenkpunktat makroskopisch verändert war (getrübt und

gelblich). Ein weiteres Tier (205) zeigte zentralnervöse Störungen in Form von

Kreisbewegungen und Tremor. In der Placebo-Gruppe kamen zwei Tiere (214, 218)

durch hochgradige Lahmheit der Hintergliedmaße zum Festliegen. Zwei weitere

Tiere (215, 216) zeigten zentralnervöse Störungen, wie Tremor und

Gleichgewichtsstörungen (215). Ein Tier (217) wurde tot aufgefunden.

Im Gegensatz zur Mortalität lag im dritten Versuch für die Morbidität eine statistisch

signifikante protektive Wirkung (P = 0,0426) der Ganzzellvakzine im Vergleich zum

Placebo vor (Abbildung 6). Während in der Placebogruppe in Folge der heterologen

Infektion fünf von sechs Tieren Fieber entwickelten, blieben in der

Ganzzellvakzinegruppe die drei klinisch nicht erkrankten Tiere (202, 204, 206) bei

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Ergebnisse

58

allen Messungen unter 40,5°C (Tabelle 8). Alle Tiere der Ganzzellvakzinegruppe, bis

auf 206, zeigten jedoch nach der Belastungsinfektion eine Leukozytose. Bei drei

erkrankten Tieren (214, 217, 218) der Placebogruppe konnte hingegen kein Anstieg

der Leukozyten (Tabelle 8) dokumentiert werden. Dieser Unterschied stand

wahrscheinlich in Zusammenhang mit dem perakuten Krankheitsverlauf der

Placebogruppe. Bei den klinisch erkrankten Tieren gab es, wie in den ersten beiden

Immunisierungsversuchen keine deutlichen Unterschiede im Krankheitsbild zwischen

den beiden Gruppen. Zentralnervöse Störungen und hochgradige Lahmheiten

prägten das Krankheitsbild (Tabelle 8). Die ersten Tiere erkrankten in allen Gruppen

bereits am ersten Tag nach der Belastungsinfektion (Abbildung 6). Die

Körpertemperatur der klinisch erkrankten Tiere der Ganzzellvakzinegruppe lag wie in

der Placebogruppe über 40,5°C. Die Reisolierung des Belastungsstammes erfolgte

nur bei jeweils zwei Tieren der Ganzzellvakzine- (201, 205) bzw. der Placebogruppe

(215, 217). Der Erregernachweis war in der Milz von Tier 205 und im Perikard von

Tier 201 möglich. In der Placebo-Gruppe konnte bei einem verstorbenen Tier (217) in

vier verschiedenen Organen (Lunge, Milz, Leber, Gehirn) der Erreger nachgewiesen

werden. Ein Isolat des Belastungsstammes aus dem Gehirn lag auch bei dem Tier

215 vor (Tabelle 9). Alle eitrigen Gelenkpunktate (203, 212, 214) des heterologen

Belastungsversuches erwiesen sich als steril.

In der pathohistologische Auswertung des dritten Immunisierungsversuches mit der

heterologen Belastungsinfektion gab es deutliche Unterschiede zwischen der

Ganzzellvakzine- und der Placebogruppe (Tabelle 10). In der Ganzzellvakzinegruppe

konnten bei keinem Tier fibrinös-eitrige Veränderungen festgestellt werden, die über

den Grad geringgradig hinausgingen oder die sich als diffus darstellten.

Einschränkend ist aber zu berücksichtigen, dass für die beiden Tiere aus der

Ganzzellvakzinegruppe mit akuter Lahmheit der Nachweis der Synovialitis ausblieb.

Die schwersten dokumentierten Veränderungen in dieser Gruppe hatte das Tier 203,

bei dem eine geringgradige fibrinös-eitrige, multifokale Pleuritis und eine

geringgradige eitrige, multifokale Splenitis diagnostiziert wurde. Im Gegensatz dazu

hatten in der Placebogruppe drei Tiere mittel- oder hochgradige fibrinös-eitrige

Entzündungen, insbesondere lagen bei den Tieren 215 und 217 hochgradige

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Ergebnisse

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fibrinös-eitrige, diffuse Meningitiden vor (Tabelle 10). Diese Unterschiede kamen

auch in den sehr unterschiedlichen Pathoscores der beiden Gruppen zum Ausdruck:

Die Ganzzellvakzinegruppe erzielte einen sehr niedrigeren Score von nur 0,8 im

heterologen Belastungsversuch, während die Placebo-Gruppe 3,0 erreichte (Tabelle

10).

4.2.1.3 Fazit zur S. suis-Ganzzellvakzine

Die S. suis-Ganzzellvakzine rief bei Absetzferkeln nach zweimaliger Applikation

einen signifikanten Schutz gegenüber einer homologen intranasalen

Belastungsinfektion mit einem hochvirulenten Serotyp-2-Stamm hervor, die 14 Tage

nach der zweiten Immunisierung erfolgte. Diese Protektion konnte mit einem Öl-in-

Wasser Adjuvans (Emulsigen®), jedoch nicht mit dem Adjuvans Aluminiumhydroxid,

erzielt werden. Diese Arbeit lieferte erstmalig Hinweise, dass eine Serotyp-2-

Ganzzellvakzine auch einen eingeschränkten partiellen Schutz gegenüber einer

heterologen intravenösen Belastungsinfektion mit einem Serotyp-9-Stamm vermitteln

kann. Hierfür sprachen geringe Unterschiede in Mortalität und Morbidität sowie

deutliche Unterschiede bei den pathohistologischen Befunden im Vergleich zur

Placebogruppe.

4.2.2 Untersuchung der protektiven Wirkung einer S. suis-Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP)

4.2.2.1 Homologe Belastungsinfektion

Parallel zu den Immunisierungen mit der Ganzzellvakzine wurde immer auch eine

Gruppe gleichaltriger Schweine mit einer S. suis-Subunitvakzine behandelt, die sich

aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) zusammensetzte.

Im ersten Versuch mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans verstarben in dieser

Subunitvakzinegruppe mit vier von acht Tieren annähernd so viele Tiere wie in der

Placebogruppe (Tabelle 8 sowie Abbildung 1). Fünf Tiere dieser

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Ergebnisse

60

Subunitvakzinegruppe wiesen im ersten Versuch eine vorübergehende

Körpertemperatur von > 40,5°C auf (Tabelle 8). Ein Tier (68) mit Fieber zeigte keine

weiteren klinischen Anzeichen einer Erkrankung. Bei den anderen erkrankten Tieren

prägten zentralnervöse Störungen und akute hochgradige Lahmheiten das klinische

Bild. Zwei Tiere (62, 67) erkrankten an einer fibrinös-eitrige Synovialitis der

Tarsalgelenke (Tabelle 9). In diesen beiden Fällen gelang der kulturelle Nachweis

des Belastungsstammes aus den eitrigen Gelenkpunktaten. Das Tier 67 zeigte eine

hochgradige Störung des Allgemeinbefindens mit Festliegen im Zusammenhang mit

Symptomen einer beidseitigen Tarsitis. Bei diesem Tier konnten mit dem

Serotyp-2-Belastungsstamm assoziierte gering- oder mittelgradige multifokale

fibrinös-eitrige Entzündungen in insgesamt fünf unterschiedlichen Geweben

diagnostiziert werden (Lunge, Milz, Peritoneum, Meningen, Tarsalgelenke). Ein

ähnliches Bild zeichnete sich bei den Tieren 63 und 66 ab, bei denen fibrinös-eitrige

Entzündungen in drei unterschiedlichen Geweben festgestellt wurden. Im

Vordergrund standen bei diesen beiden Tieren mittelgradige multifokale

fibrinös-eitrige Meningitiden, die in einem Fall (66) mit zentralnervösen Störungen

und in dem anderen (63) mit Apathie assoziiert waren. Der Nachweis von

multifokalen fibrinös-eitrigen Entzündungen in mindestens drei unterschiedlichen

Geweben der drei Tiere 63, 66 und 67 sprach für generalisierte bakterielle

Erkrankungen, die mit Ausnahme der Ganzzellvakzinegruppe des zweiten

Experimentes in allen mit Stamm 10 belasteten Gruppen auftrat. In der

Subunitvakzinegruppe des ersten Experimentes erfolgte der Nachweis einer

Leukozytose in Folge der Belastungsinfektion bei drei von fünf erkrankten Tieren (62,

63, 66) und bei einem klinisch unauffälligen Tier (64). Deutliche Unterschiede in

Bezug auf die Ausbildung einer Leukozytose waren somit im ersten Experiment

zwischen den drei Gruppen nicht erkennbar (Tabelle 8). Im Einklang mit dem

ungestörten Allgemeinempfinden konnte bei den klinisch nicht erkrankten Tieren kein

Reisolat aus inneren Organen gewonnen werden. Die pathologischen

Untersuchungen ergaben jedoch bei zwei Tieren Veränderungen in Form einer

mittelgradigen (64) bzw. geringgradigen (61) fokalen fibrinös-eitrigen Meningitis

(Tabelle 10).

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Ergebnisse

61

Im zweiten Versuch mit Emulsigen als Adjuvans konnte die MAP-Subunitakzine

keine mit der Ganzzellvakzine vergleichbare Schutzwirkung gegenüber einer

homologen Belastungsinfektion mit dem hochvirulenten Serotyp-2-Stamm erzielen

(Tabelle 8, Abbildung 3 und 4). Ein verzögertes Eintreten der mittel- bis

hochgradigen Störung des Allgemeinbefindens bei den erkrankten Tieren der MAP-

Subunitvakzinegruppe im Vergleich zu den erkrankten Tieren der Placebo-Gruppe

war im zweiten Versuch aber auffällig. In der statistischen Auswertung der Kaplan-

Meyer Diagramme (Abbildung 3 und 4) resultierte dies in schwach signifikanten

Unterschieden zwischen der MAP-Subunitvakzine- und der Placebogruppe bezüglich

der Morbidität (P = 0,0065), jedoch nicht der Mortalität (P = 0,3974).

Das Spektrum der Symptomatik und Pathologie war in der Subunitvakzinegruppe

des zweiten Experimentes sehr vielfältig (Tabelle 8 und 10). Bei zwei Tieren traten

akute Lahmheiten (85, 90) auf. Zwei weitere Tiere (86, 87) verstarben in Folge

hochgradiger diffuser fibrinös-eitriger Meningitiden, die mit dem Nachweis des

Belastungsstammes im Liquor cerebrospinalis bzw. im Gehirntupfer korrelierten. Vier

Tiere (84, 85, 86, 88) entwickelten in Folge der Belastungsinfektion fibrinös-eitrige

Pleuritiden bzw. in einem Fall (88) sogar eine teils fibrinöse teils nekrotisierende

Pleuropneumonie. Ein Tier (90) fiel durch eine fokale eitrige Hepatitis auf. Es ist

festzuhalten, dass bei den pathohistologischen Untersuchungen insgesamt keine

deutlichen Unterschiede in Bezug auf den Grad und die Ausdehnung der fibrinös-

eitrigen Veränderungen zwischen der Subunit- und der Placebogruppe festgestellt

wurden (Tabelle 10). Dies kommt auch in den Pathoscores der beiden Gruppen zum

Ausdruck (3,1 bzw. 3,75, Tabelle 10).

4.2.2.2 Heterologe Belastungsinfektion

Im dritten Versuch mit der heterologen Belastungsinfektion überlebte in der

Subunitvakzine- wie in der Placebogruppe nur eines von sechs Tieren. Die

statistische Auswertung des Verlaufs des Merkmals Mortalität im Kaplan-Meyer-

Diagramm (Abbildung 5) ergab entsprechend keine signifikanten Unterschiede

zwischen der Subunitvakzine- und der Placebogruppe (P =0,4785). Fünf Tiere dieser

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Ergebnisse

62

Gruppe zeigten hochgradige Lahmheiten. Meist waren mehrere Gelenke betroffen,

so dass drei Tiere (208, 210, 211) nicht mehr in der Lage waren aufzustehen. Tier

208 zeigte trotz Lahmheit zusammen mit dem gesunden Tier (209) keinen Anstieg

der Leukozyten. In der Kontrollgruppe zeichnete sich ein ähnliches Bild ab. Auch hier

lag der Schwerpunkt der Erkrankung bei hochgradigen Lahmheiten. Bei den

erkrankten Tieren der Kontrollgruppe konnte ein Temperaturanstieg von >40,5°C

gemessen werden. Während in der Gruppe der Subunitvakzine nur drei Tiere (208,

211, 212) einen Anstieg der Körpertemperatur zeigten. Dies manifestierte sich bei

der statistischen Auswertung der Morbidität im Vergleich zur Placebogruppe in einem

schwach signifikanten Schutz (P = 0,0170) (Abbildung 6). Der kulturelle Nachweis

des Belastungsstammes konnte nur bei einem Tier (210) der Subunitvakzinegruppe

in zwei Organen (Lunge, Peritoneum) erbracht werden (Tabell 9). Im Gegensatz zu

den homologen Belastungsversuchen konnte in den eitrigen Gelenkpunktaten trotz

Anreicherung kein Erreger nachgewiesen werden. In der pathohistologischen

Untersuchung konnten in der Subunitvakzinegruppe zwei (211, 212) mittelgradige

multifokale fibrinös-eitrige Synovialitiden diagnostiziert werden. Für drei Tiere (207,

208, 210) mit akuten Lahmheiten fehlte aber der Nachweis einer Synovialitis. Der

Pathoscore lag mit 1,5 unter dem der Placebogruppe, die durch den Nachweis

hochgradiger fibrinös-eitriger Entzündungen im Gehirn, Gelenk, Leber und/oder Milz

einen hohen Score von 3,0 erzielte (Tabelle 10).

4.2.2.3 Fazit zur Subunitvakzine

Abschließend ist festzuhalten, dass in keiner mit der Subunitvakzine immunisierten

Gruppe ein signifikanter Schutz vor Mortalität im Vergleich zur Placebogruppe erzielt

werden konnte. Im Vergleich zur Placebogruppe konnte aber unter Berücksichtigung

des zeitlichen Verlaufes im zweiten und dritten Versuch eine schwach signifikante

Schutzwirkung in Bezug auf das Merkmal Morbidität nachgewiesen werden

(Abbildung 4 und 6). Im Gegensatz zum ersten Versuch zeigte auch das Merkmal

Mortalität im zweiten homologen Belastungsversuch mit Emulsigen® als Adjuvans in

der Gruppe der Subunitvakzine einen weniger steilen Anstieg als in der

Placebogruppe (Abbildung 4). Im Immunisierungsversuch mit der heterologen

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Ergebnisse

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Belastungsinfektion verendeten in der Gruppe der Subunitvakzine genauso viele

Tiere wie in der Placebogruppe. Die pathologischen Ergebnisse sprachen aber für

ein geringeres Ausmaß fibrinös-eitriger Entzündungen in der Subunitvakzine- im

Vergleich zur Placebogruppe (Tabelle 10).

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Ergebnisse

64

Abbildung 1: Mortalität bei Schweinen, die nach einer zweimaligen Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid. (Kaplan-Meyer Diagramm)

Abbildung 2: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8)aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid. (Kaplan-Meyer Diagramm)

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Ergebnisse

65

Abbildung 3: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-Meyer Diagramm)

Abbildung 4: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-Meyer Diagramm)

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Ergebnisse

66

Abbildung 5: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine(n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8) intravenös mit dem heterologen Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®).(Kaplan-Meyer Diagramm)

Abbildung 6: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8) heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-Meyer Diagramm)

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Ergebnisse

67

Tabelle 8: Klinische Befunde bei Schweinen, die nach einer Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) homolog mit Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden.

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Ergebnisse

68

Tabelle 9: Reisolation des Belastungsstammes von Schweinen, die mit einer Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) immunisiert und anschließend homolog mit Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden.

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69

Tabelle 10: Differenzierung von fibrinös-eitrigen Entzündungen bei Schweinen nach homologer (Stamm 10) oder heterologer (Stamm A3286/94) Belastungsinfektion in Immunisierungsexperimenten mit einem Pathoscore von 1 bis 5 (1: minimal; 2 und 3: geringgradig und fokal; 4 und 5: mittel- oder hochgradig sowie multifokal oder diffus) 1

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Ergebnisse

70

4.3 Antikörperantworten von Schweinen nach experimenteller Infektion mit S. suis- Serotyp-2-Stamm 10 und Serotyp-9-Stamm A3286/94

Im dritten Teil dieser Dissertation wurde untersucht, wie sich der Gehalt der

spezifischen Immunglobuline G im Serum der Versuchstiere in Folge der Infektion

bzw. der Immunisierung veränderte. Es wurden zunächst ELISA-Verfahren für die

Bestimmung von relativen Antikörpertitern gegen MAP und MRP sowie EF etabliert.

Diese Etablierungsarbeiten ermöglichten das Festlegen von Qualitätskriterien (3.10).

Eine Berücksichtigung von Messwerten für diesen Ergebnisteil erfolgte nur, wenn alle

Kriterien erfüllt waren. Trotz wiederholter Versuche war es nicht möglich, einen

Ganzzell-ELISA zu etablieren, der ähnlichen Qualitätskriterien standhielt. Das in allen

ELISAs eingesetzte Konjugat erkannte nach Herstellerangaben alle IgG-Subtypen.

4.3.1 Experimentelle Infektion zur Etablierung des S. suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 Modells

Im Rahmen der Etablierung eines Modells für S. suis-Serotyp-9-Stamm Schweine

intranasal mit dem Serotyp-9-Stamm A3286/94 infiziert. Keines der Tiere entwickelte

Symptome einer S. suis-Erkrankung. In hämatologischen und pathologische

Untersuchungen konnten aber Hinweise auf entzündliche Veränderungen in Folge

dieser intranasalen Belastungsinfektion gewonnen werden (siehe 4.1 und BEINEKE

et al. 2007). Es sollten die relativen Antikörpertiter gegen MAP und MRP sowie EF

prae und 20 Tage post infectionem verglichen werden. Bei der Interpretation der

Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass die Versuchstiere aus einem Bestand

kamen, der frei von Serotyp-9-Stämmen, aber nicht frei von S. suis war. In Proben

von Tieren dieses Bestandes wurden bis heute keine S. suis-Stämme nachgewiesen,

die positiv für das EF-Gen epf waren (BAUMS 2007). Vereinzelt konnten aber von

den Tonsillen Stämme isoliert werden, die das mrp-Gen trugen.

In Abbildung 7 sind die Antikörpertiter für die intranasal mit Stamm A3286/94

infizierte Gruppe vor und nach der Infektion dargestellt. Alle Tiere dieser Gruppe

zeigten einen Anstieg MRP-spezifischer Antikörper. Dieser Titeranstieg erreichte

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Ergebnisse

71

jedoch bei keinem dieser Tiere Werte über 100 ELISA-Units. Bei fünf dieser sechs

Tiere konnte ein Anstieg spezifischer Antikörper gegen MAP Stamm A3286/94

festgestellt werden. Nach der Infektion wurde bei zwei Tieren (8, 116) ein anti-MAP

Antikörpertiter über 100 ELISA Units gemessen. In der Untersuchung des

Antikörperspiegels gegen EF konnte bei diesen mit A3286/94 infizierten Tieren wie

erwartet kein Anstieg ermittelt werden (Abbildung 7). In der mit Stamm 10 infizierten

Gruppe zeigten zwei der drei Tiere (119, 150), die mindestens die ersten fünf Tage

nach der Belastungsinfektion überlebten, eine Erhöhung des Antikörpertiters gegen

EF von 6 bzw. 8,7 ELISA-Units auf über 20 ELISA-Units. Bei diesen beiden Tieren

erfolgte auch ein Anstieg der Antikörpertiter gegen MRP und MAP auf Werte über

100 ELISA Units.

Abbildung 7: Antikörper gegen MRP (136 kDa Variante), MAP von A3286/94 und EF (110 kDa Variante) vor bzw. 20 Tage nach der intranasalen Infektion mit dem MRP+ SLY+ Serotyp 9 Stamm A3286/94 (EF negativ).

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Ergebnisse

72

4.3.2 Immunisierungs- und Belastungsversuche

Die Etablierung des anti EF-ELISAs stand in Zusammenhang mit der Möglichkeit, auf

Grundlage der MAP-Subunitvakzine das DIVA-Konzept für MRP+ EF+

Serotyp-2-Stämme umzusetzen. Aufgrund der mangelhaften protektiven Wirkung der

Subunitvakzine wurde in den serologischen Untersuchungen zunächst auf die

Untersuchung der Antikörpertiter gegen EF verzichtet. Zum Nachweis der Induktion

der Antikörperbildung in Folge der Immunisierung mit der MAP-Subunit- bzw. der

Ganzzellvakzine wurde der MRP- und der MAP-ELISA eingesetzt.

In den beiden ersten Immunisierungsversuchen mit homologer Belastungsinfektion

konnte sowohl in der Ganzzell- als auch in der Subunitvakzinegruppe ein Anstieg der

Antikörper gegen MRP und MAP festgestellt werden (Abbildungen 8 und 9). Im

ersten Immunisierungsversuch mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans lagen jedoch 14

Tage nach der zweiten Immunisierung die relativen Antikörpertiter gegen MRP und

MAP bei allen Tieren unter 100 ELISA Units (Abbildung 8). Im Gegensatz dazu

entwickelten im zweiten Immunisierungsversuch mit Emulsigen® als Adjuvans alle

Tiere der Ganzzellvakzinegruppe 14 Tage nach der zweiten Immunisierung relative

MRP-spezifische Antikörpertiter über 100 ELISA-Units. Mit Ausnahme von zwei

Tieren (83, 85) konnte auch bei den Tieren der Subunitvakzinegruppe im zweiten

Immunisierungsversuch ein Anstieg der Antikörper auf Werte über 100 ELISA Units

festgestellt werden (Abbildung 9). Der Mittelwert des relativen Antikörperspiegels lag

bei Tieren der Ganzzellvakzinegruppe mit 369 ELISA-Units deutlich über dem der

Subunitvakzinegruppe mit 238 ELISA-Units. In den Kontrollgruppen des ersten und

zweiten Immunisierungsversuches konnte bei keinem Tier ein Anstieg des

MRP-spezifischen Antikörpertiters auf Werte über 100 ELISA-Units nachgewiesen

werden (Abbildungen 8 und 9).

Im dritten Immunisierungsexperiment zeigte sich wie im zweiten Versuch ein

deutlicher Anstieg des Titers der MRP-spezifischen Antikörper bei allen Tieren der

Ganzzell- und der Subunitvakzinegruppe (Abbildung 10). Die Varianz der

Antikörpertiter nach der Vakzinierung mit der Ganzzell- oder der Subunitvakzine war

im dritten wie auch zuvor im zweiten Immunisierungsexperiment sehr groß

(Standardabweichungen von 160 bis 230 ELISA-Units innerhalb einer Gruppe).

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Ergebnisse

73

Trotzdem waren die Mittelwerte der MRP-spezifischen Antikörpertiter im zweiten und

dritten Immunisierungsexperiment gut reproduzierbar. Die Mittelwerte der

Ganzzellvakzine- bzw. Subunitvakzinegruppe im dritten Versuch waren 348 bzw. 265

ELISA-Units.

Die Tiere des zweiten und dritten Immunisierungsversuches wurden serologisch

auch auf einen Anstieg des Antikörpertiters gegen die Fraktion aus Murein-

assoziierten Proteinen von Stamm 10 untersucht. In Folge der Immunisierung trat bei

allen Tieren sowohl in der Ganzzell- als auch in der Subunitvakzinegruppe in beiden

Immunisierungsversuchen eine deutliche Serokonversion auf. Beide Gruppen

verhielten sich in Bezug auf diese Antikörpertiter sehr ähnlich und erreichten in

beiden Versuchen Mittelwerte zwischen 200 und 300 ELISA-Units (Abbildungen 11

und 12). Die Varianz der Antikörpertiter war 14 Tage nach der zweiten

Immunisierung innerhalb einer Gruppe sehr groß (Standardabweichungen von 80 bis

230 ELISA-Units innerhalb einer Gruppe). Mit Ausnahme von zwei Tieren erreichten

alle Tiere dieser immunisierten Gruppen MAP-spezifische Antikörpertiter mit Werten

über 100 ELISA-Units. Nur das Tier 94 der Ganzzellvakzinegruppe im zweiten

Versuch und das Tier 209 der Subunitvakzinegruppe des dritten Versuches blieben

mit 95 bzw. 70 ELISA-Units am 14. Tag nach der zweiten Immunisierung unter

diesem Grenzwert. Im dritten Immunisierungsversuch hatten in allen drei Gruppen

jeweils zwei Tiere Ausgangstiter mit Werten über 20 ELISA-Units, die im Vergleich zu

den positiven und negativen Kontrollen des ELISA als schwach positiv auffielen.

Diese schwach positiven relativen Titer, die auch in der Kontrollgruppe beobachtet

wurden, waren vermutlich Ausdruck der Auseinandersetzung mit anderen S. suis-

Stämmen, die bei allen Versuchstieren in den Tonsillen nachgewiesen wurden

(Ergebnisse nicht gezeigt).

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass in allen drei Immunisierungsversuchen

sowohl in den Ganzzell- als auch in den Subunitvakzinegruppen im Gegensatz zu

den Kontrollgruppen Serokonversionen gegenüber MRP in Folge der Immunisierung

nachgewiesen wurden. Die MRP-spezifischen Antikörpertiter erreichten in beiden

Versuchen mit der Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans im Gegensatz

zu dem ersten Versuch mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans Werte, die deutlich über

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Ergebnisse

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dem relativen Titer von 100 ELISA-Units des Rekonvaleszenzserums lagen. In den

beiden letzten Versuchen mit der Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) waren die

MRP-spezifischen Antikörpertiter in der Ganzzellvakzinegruppe tendenziell höher als

in der Subunitvakzinegruppe. Untersuchungen der Antikörpertiter gegen die Fraktion

der Murein-assoziierten Proteine ergaben ein sehr ähnliches Bild. Die

Ganzzellvakzinegruppe erzielte sowohl im zweiten als auch im dritten Versuch

höhere Mittelwerte für MAP-spezifische Antikörper als die entsprechende

MAP-Subunitvakzinegruppe.

Abbildung 8: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten Immunisierung (Alter von 3-4 Wochen) sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 51-57), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 61-68) oder einem Placebo (K, Tier 71-78) bei Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans. (1. Immunisierungsversuch, vor der homologen Belastungsinfektion).

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Ergebnisse

75

Abbildung 9: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8 Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90) oder einem Placebo (K, Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans. ( 2. Immunisierungsversuch, vor der homologen Belastungsinfektion).

Abbildung 10: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8 Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212) oder einem Placebo (K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans ( 3. Immunisierungsversuch, vor der heterologen Belastungsinfektion).

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Ergebnisse

76

Abbildung 11: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10 vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90) oder einem Placebo (K, Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans (2. Immunisierungsversuch, vor homologer Belastungsinfektion).

Abbildung 12: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10 vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212) oder einem Placebo (K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans. (3. Immunisierungsversuch, vor heterologer Belastungsinfektion).

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Ergebnisse

77

4.3.3 Abschätzung der Bedeutung von MRP- und MAP-spezifischen Antikörpertitern (Gesamt IgG) als prognostische Indikatoren

Mehr als die Hälfte aller Versuchstiere mit Antikörpertitern > 100 ELISA-Units sowohl

gegen MRP als auch gegen MAP erkrankten bzw. verstarben in Folge der

S. suis-Infektion (Tabelle 11). Im zweiten Versuch entwickelte ein Tier (98) aus der

Ganzzellvakzinegruppe und zwei Tiere (86, 87) aus der Subunitvakzinegruppe eine

hochgradige diffuse fibrinös-eitrige Meningitis, obwohl diese Versuchstiere vor der

homologen Belastungsinfektion sowohl gegenüber MRP als auch gegenüber MAP

Antikörpertiter über 150 ELISA-Units aufwiesen. In dem dritten Versuch mit

heterologer Belastungsinfektion war in den immunisierten Gruppen gleichfalls kein

Zusammenhang zwischen hohen Antikörpertitern und Protektion zu erkennen. Die

Tiere 211 und 212 aus der MAP-Subunitvakzinegruppe hatten beispielsweise vor der

Belastungsinfektion sehr hohe MRP- und MAP-spezifische Antikörpertiter von über

400 bzw. 160 ELISA-Units. Trotzdem entwickelten beide Tiere schwere Lahmheiten

im Zusammenhang mit mittelgradigen multifokalen fibrinös-eitrigen Tarsitiden.

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Ergebnisse

78

Tabelle 11: Mortalität und Morbidität aller Versuchstiere im Zusammenhang mit Antikörpertitern gegen MRP bzw. MAP vor der experimentellen Belastungsinfektion

MRP MAP-Serotyp 2

ELISA-Units 14 Tage nach der 2. Immunisierung > 100 < 100 > 100 < 100

Anzahl der überlebenden Tiere 9 13 10 3 Mortalität

Anzahl der verstorbenen Tiere 13 29 18 10

Positiver prädiktiver Wert für Protektion vor Mortalität 0,41 0,36

Negativer prädiktiver Wert für Protektion vor Mortalität 0,59 0,77

Anzahl nicht erkrankter Tiere 8 10 8 3

Morbidität

Anzahl erkrankter Tiere 15 31 17 13

Positiver prädiktiver Wert für Protektion vor Morbidität 0,35 0,32

Negativer prädiktiver Wert für Protektion vor Morbidität 0,76 0,81

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Diskussion

79

5 Diskussion

In dem ersten Teil dieser Arbeit sollte ein Infektionsmodell für

S. suis-Serotyp-9-Stämme etabliert werden. Ein erheblicher Anteil von etwa 20% der

invasiven S. suis Erkrankungen in Europa kann auf Serotyp-9-Stämme zurückgeführt

werden (SILVA et al. 2006; WISSELINK et al. 2002b). Eine vergleichbare Bedeutung

besitzen vor allem in Mitteleuropa nur noch Serotyp-2-Stämme. Die Etablierung

eines Infektionsmodells für S. suis-Serotyp 9 eröffnete die Möglichkeit, in

Immunisierungsexperimenten mit Vakzinen aus Serotyp 2 Antigenen deren

Schutzwirkung gegenüber einer heterologen Belastungsinfektion mit Serotyp-9-

Stämmen zu untersuchen. Der Bedarf an einem Impfstoff mit einer solchen

heterologen Schutzwirkung ist in Europa erheblich. Es wäre erstmalig möglich,

S. suis-Erkrankungen in der Schweineproduktion prophylaktisch mit stallspezifischen

Vakzinen entgegen zu wirken.

Im Gegensatz zu dem Serotyp-2-Stamm 10 führte die intranasale Applikation des

Serotyp-9-Stammes A3286/94 bei sieben bis acht Wochen alten Ferkeln nicht zu

klinisch manifesten Erkrankungen. Aufgrund dieses Ergebnisses könnten Zweifel

aufkommen, ob der ausgewählte Stamm A3286/94 wirklich ein Vertreter der

virulenten Serotyp-9-Stämme ist, die in Europa für erhebliche Tierverluste

verantwortlich sind. Dieser Kritikpunkt erscheint vor allem plausibel, da bei S. suis

sehr unterschiedliche Genotypen zu einem Serotyp gehören können (KING et al.

2002; REHM et al. 2007; SMITH et al. 1997), die sich in der Virulenz erheblich

unterscheiden können. Aus folgenden Gründen erscheinen diese Zweifel aber

unberechtigt: A3286/94 wurde aus dem Gehirn von einem Schwein mit Meningitis

isoliert. Dieser Stamm exprimiert eine große Variante des „Muramidase-released

Proteins“ (MRP*) und besitzt das Suilysingen sly (SILVA et al. 2006). Beide Faktoren

sind Marker virulenter S. suis-Stämme (ALLGAIER et al. 2001; STAATS et al. 1999a;

VECHT et al. 1991). Typisierungen mit der AFLP und MLST zeigen, dass A3286/94

genetisch eng verwandt mit anderen Serotyp-9-Stämmen ist, die auch aus inneren

Organen von erkrankten Tieren isoliert wurden (REHM et al. 2007). Insbesondere

gehört A3286/94 zum klonalen Komplex 87. Klonale Komplexe stehen häufig im

Zusammenhang mit besonderen Virulenz- und Resistenzmerkmalen der

entsprechenden Stämme. Obwohl die intranasale Infektion mit A3286/94 klinisch

unauffällig verlief, spricht der Anstieg der Leukozyten im Blut in der ersten Woche

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Diskussion

80

nach der Infektion für eine akute Infektion. Ferner konnten in den

pathohistologischen Untersuchungen dieser Tiere 20 Tage nach der Infektion

entzündliche Veränderungen der Serosen und im Gehirn festgestellt werden. Im

Einklang mit dem ungestörten Allgemeinbefinden waren diese Veränderungen alle

geringgradig und fokal begrenzt. Mit den im Rahmen dieser Dissertation

durchgeführten kulturellen bakteriologischen Untersuchungen war es nicht möglich,

den Erreger zu isolieren. Mit immunhistologischen und molekularbiologischen

Untersuchungen des Gehirns konnte aber in drei dieser sechs Fälle der

Belastungsstamm nachgewiesen werden (BEINECKE et al. 2007). Bei den anderen

drei Tieren konnten keine anderen Infektionserreger durch die bakteriologische

Untersuchung festgestellt werden. Nach intravenöser Applikation des

Serotyp-9-Stammes A3286/94 entwickelten alle vier infizierten Schweine klinisch

manifeste S. suis-Erkrankungen, insbesondere Synovialitis, Serositis und Meningitis.

Aufgrund der schwachen Virulenz des Serotyp-9-Stammes A3286/94 im intranasalen

Infektionsmodell wurden die Belastungsinfektionen mit A3286/94 in den

Immunisierungsversuchen intravenös ausgeführt.

In dem zweiten Teil der Arbeit sollte die protektive Wirkung einer Ganzzell- und einer

Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen verglichen werden. Die protektive

Wirkung von Ganzzellvakzinen gegenüber homologen Belastungsinfektionen mit

Serotyp-2-Stämmen konnte in vorangegangenen Studien von Wisselink et al. (2001,

2002) und BUSQUE et al. (1997) experimentell belegt werden (Tabelle 2).

Ganzzellvakzinen in der Form stallspezifischer Impfstoffe sind in Deutschland heute

vor allem bei Bestandsproblemen ein wichtiges Instrument zur Bekämpfung von

S. suis-Erkrankungen. Diese Form der Vakzinierung besitzt aber eine Reihe von

Nachteilen: Die Vakzinierung kann erst erfolgen, nachdem Erkrankungen aufgetreten

sind und die Diagnostik sowie die Herstellung der stallspezifischen Vakzine

abgeschlossen wurde. Die Herstellung der stallspezifischen Vakzinen erfolgt nicht

nach einer tierexperimentellen Prüfung der protektiven Wirkung.

Obwohl für S. suis keine Belastungsversuche mit heterologen Serotypen

beschrieben wurden (Tabelle 2), wird S. suis-Ganzzellvakzinen grundsätzlich keine

Serotyp-übergreifende Schutzwirkung zugesprochen (BAUMS 2007), Rekombinante

Impfstoffe und Subunitvakzinen lassen sich genauer standardisieren.

Ganzzellvakzinen aus Wildtypstämmen ermöglichen im Allgemeinen keine

Unterscheidung von infizierten und immunisierten Tieren. Aufgrund dieser Nachteile

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Diskussion

81

wurde in dieser Arbeit der Einsatz einer Subunitvakzine als Alternative zu einer

Ganzzellvakzine geprüft. Die untersuchte Subunitvakzine bestand im Wesentlichen

aus den Murein-assoziierten Proteinen. Diese Faktoren sind an der Oberfläche der

Bakterien mit der Zellwand verankert und häufig gute Immunogene. Somit bestanden

grundsätzlich gute Voraussetzungen, dass entsprechende Antikörper eine

opsonisierende Wirkung entfalten könnten. In dieser Arbeit konnte aber im

Gegensatz zur untersuchten Ganzzellvakzine durch die Applikation der

Subunitvakzine kein signifikanter Schutz vor Mortalität in Folge einer homologen

Belastungsinfektion erzielt werden. Für die Entwicklung zukünftiger Impfstoffe könnte

das Verständnis der unterschiedlichen Wirkung der beiden Vakzinen eine wichtige

Rolle spielen. Eine nahe liegende Erklärung wäre, dass in der Subunitvakzine

bestimmte Faktoren fehlten, die in der Ganzzellvakzine als Immunogene eine

wichtige Funktion erfüllten. JACOBS et al. (1996) und WISSELINK et al. (2001)

konnten zeigen, dass Immunisierungen mit Suilysin bzw. EF zur Protektion

gegenüber hochvirulenten MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stämmen beitragen. Da diese

beiden Faktoren sekretiert werden, fehlen sie in der untersuchten Subunitvakzine. In

der Ganzzellvakzine sind sie aber in geringen Mengen vorhanden. Antikörper gegen

sekretierte Faktoren können keine opsonisierende sondern nur eine neutralisierende

Wirkung entfalten. Um zu klären, ob Antikörper gegen sekretierte Faktoren für die

beobachteten Unterschiede eine Rolle spielen, sollte in zukünftigen Experimenten

analysiert werden, ob sich die Seren der immunisierten Tiere beider Gruppen in ihren

opsonisierenden Eigenschaften unterscheiden. Ferner sollten die EF-spezifischen

Antikörper bei diesen Versuchstieren bestimmt werden.

Die Kapsel von S. suis-Serotyp-2-Stämmen ist eine weitere Möglichkeit den Erreger

vor der Phagozytose zu schützen (SMITH et al. 1999). Epitope von Oberflächen-

assoziierten Proteinen, insbesondere auch solche von MAP, sind im bekapselten

Zustand häufig maskiert, so dass eine Bindung von Antikörpern unterbleibt. Dies

könnte ein Grund sein, warum die Tiere der MAP-Subunitvakzinegruppen trotz

vorhandener MAP-spezifischer Antikörper keinen ausreichenden Schutz gegen die

S. suis-Stamm aufwiesen. In der Ganzzellvakzine liegen die Bakterien im

bekapselten Zustand vor.

Die Immunisierung mit der Ganzzellvakzine könnte somit auch eine

Antikörperbildung gegen Kapselbestandteile provoziert haben, obwohl Polysacharide

grundsätzlich schlechte Immunogene sind. Die Bildung Kapsel-spezifischer

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Diskussion

82

Antikörper bei den Tieren der Ganzzellvakzinegruppen des zweiten und dritten

Versuches wäre auch eine Erklärung für die bessere Schutzwirkung der

Ganzzellvakzine gegen den hochvirulenten homologen Serotyp-2-Stamm als gegen

den weniger virulenten heterologen Serotyp-9-Stamm. Die Bestimmung Kapsel-

spezifischer Antikörpertiter in zukünftigen Untersuchungen könnte daher zu einem

besseren Verständnis beitragen. Nach der enttäuschenden Wirkung der MAP-

Subunitvakzine sollte Impfstoffen mit S. suis-Kapselbestandteilen vermehrt

Aufmerksamkeit geschenkt werden. In der Humanmedizin haben sich

Kombinationsvakzinen aus Kapselbestandteilen von unterschiedlichen

Pneumokokken-Serotypen als Impfstoffe durchgesetzt (MARCHESE et al. 2006).

Problematisch ist in diesem Zusammenhang allerdings, dass bakterielle

Kapselpolysaccharide eine Antikörperbildung vorwiegend unabhängig von T-Zellen

induzieren, so dass bei Kindern unter zwei Jahren nur eine unzureichende

Antikörperbildung stattfindet (SNAPPER et al. 2001). Es liegen jedoch noch keine

Untersuchungen vor, dass diese Vakzine auf Ferkel übertragen werden kann.

Die serologischen Untersuchungen im dritten Abschnitt zeigen, dass die Applikation

der Subunitvakzine mit der Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans zur

Induktion von MRP- und MAP-spezifischen Antikörpern führte. Der durchschnittliche

Antikörpertiter war 14 Tage nach der zweiten Immunisierung in der

Ganzzellvakzinegruppe aber größer als in der Subunitvakzine. Dieser Unterschied ist

bemerkenswert, da in der Subunitvakzinegruppe ausschließlich mit MAP immunisiert

wurde. Außerdem war die mit einer Immunisierung applizierte Menge dieser Proteine

in der Subunitvakzine weit größer als die zu erwartende Menge der Murein-

assoziierten Proteine in einer Impfdosis der Ganzzellvakzine. Der Grund für diese

Diskrepanz könnte mit dem Lysozym-Verdau in dem Protokoll zur Herstellung der

MAP-Fraktion für die Subunitvakzine zusammenhängen. In der Ganzzellvakzine sind

die Murein-assoziierten Proteine fest mit der Zellwand assoziiert. Ein Großteil dieser

Proteine ist über das LPXTG-Motif sogar kovalent mit dem Mureingerüst verbunden.

Durch den Lysozymverdau wird bei der Herstellung der MAP-Fraktion dieses

Mureingerüst größtenteils degradiert. Das Mureingerüst besitzt Eigenschaften eines

Adjuvans. In neuen experimentellen Immunisierungsansätzen in der

humanmedizinischen Forschung werden Antigene mit dem Mureingerüst von

Laktokokken verankert, um diese Adjuvanseigenschaften zu nutzen (AUDOUY et al.

2006; MANNAM et al. 2004; MOORTHY u. RAMASAMY 2007). Das Mureingerüst

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Diskussion

83

bzw. die Zellwand von S. suis aktiviert über den Toll-like Rezeptor 2 des Wirtes die

Expression zahlreicher Interleukine (GRAVELINE et al. 2007). KHAN et al. (2005)

konnten im S. pneumoniae Mausmodell zeigen, dass Toll-like Rezeptor 2-Aktivierung

die humorale Immunantwort, insbesondere die Th1-Antwort, moduliert. Somit könnte

das Mureingerüst über seine immunmodulatorischen Eigenschaften in der

Ganzzellvakzine eine verstärkte Antikörperproduktion, insbesondere auch eine Th1-

Antwort, gegen die Murein-assoziierten Proteine bewirkt haben, die in der

Subunitvakzine trotz der höheren Konzentration der Murein-assoziierten Proteine

ausgeblieben ist. Da aber weder der MRP- noch der MAP-Antikörpertiter sich als

zuverlässiger prognostischer Indikator erwies (4.3.3), ist zu erwarten, dass noch

andere Faktoren für die unterschiedliche protektive Wirkung der beiden Vakzinen

eine wichtige Rolle gespielt haben.

Neben dem Antigen besitzt die Wahl des Adjuvans eine wichtige Funktion für die

protektive Wirkung einer Vakzine. Die Bedeutung des Adjuvans für eine

S. suis-Vakzine wird in einem Vergleich der Ergebnisse des ersten und zweiten

Immunisierungsexperimentes dieser Arbeit deutlich. Eine signifikante protektive

Wirkung der Ganzzellvakzine konnte nur mit der Öl-in-Wasser Emulsion nicht aber

mit Aluminiumhydroxid hervorgerufen werden. Diese Ergebnisse stehen im Einklang

mit Immunisierungsversuchen von WISSELINK et al. (2001), die mit einem

Wasser-in-Öl Adjuvans nicht aber nicht mit Aluminiumhydroxid eine protektive

Wirkungen einer S. suis-Ganzzellvakzine aufzeigen. Die in dieser Arbeit eingesetzte

Öl-in-Wasser Emulsion könnte als Adjuvans für die Ganzzellvakzine eine sehr gute

Wirkung, für die Subunitvakzine aber eine nicht hinreichende Wirkung erzielt haben.

Wobei die Unterschiede in der Verträglichkeit in diesen Versuchen nicht genauer

untersucht wurden. Öl-in-Wasser Emulsionen sind hervorragend geeignet für

amphipathische Moleküle, da diese in der Ölphase verankert werden (COX u.

COULTER 1997). In der Ganzzellvakzine sind neben Murein-assoziierten Proteinen

noch Lipoproteine und andere mit der Zellmembranassoziierte Proteine vorhanden,

die diesen optimalen amphipatischen Aufbau für eine Öl-in-Wasser Emulsion

besitzen. Bei einem großen Teil der Proteine der Subunitvakzine könnte die

Inkorporation in die Öltropfen aufgrund fehlender hydrophober Domänen

ausgeblieben sein. In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, dass LI et al.

(2006, 2007) Emulsigen® als unzureichendes Adjuvans für einen rekombinanten

S. suis-Impfstoff auf der Grundlage des Proteins Sao beschreiben. Nach ihren

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Diskussion

84

Ergebnissen wurde mit Emulsigen® vorwiegend die Bildung von Immunglobulin G1-

Antikörpern ohne opsonophagozytierende Wirkung induziert. Das Protein Sao ist

über ein LPXTG-Motif kovalent mit dem Mureingerüst verbunden. Es gehört somit zu

den Murein-assoziierten Proteinen von S. suis-Serotyp-2-Stämmen LI et al. (2006)

und sollte damit Bestandteil der MAP-Subunitvakzine sein. In zukünftigen Arbeiten

sollte eine weiterführende serologische Untersuchung der Seren der Versuchstiere

dieser Arbeit einschließlich einer Bestimmung von IgG-Subtypen vorgenommen

werden. Diese Differenzierungen zusammen mit Untersuchungen auf

opsonosierende Eigenschaften sollten zeigen, ob die Ergebnisse von LI et al. (2006)

auch für die MAP-Subunitvakzinegruppe zutreffen.

Die Abstände zwischen den Impfungen und der Belastungsinfektion wurden aufgrund

der Versuchsbedingungen gewählt. Die Stallungen boten nicht ausreichend Platz,

um die Tiere unter Versuchsbedingungen über längere Zeit zu halten. In

weiterführenden Untersuchungen sind überlegungen zu treffen, die Abstände

zwischen der ersten und der zweiten Impfung von 11 Tage auf 21 Tage zu

vergrößern, um eventuell einen besseren Schutz der Vakzine zu erreichen.

Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass unter Verwendung einer

Öl-in-Wasser Emulsion als Adjuvans eine S. suis-Serotyp-2-Ganzzellvakzine einen

wesentlich besseren, jedoch noch nicht einen zufriedenstellenden Schutz gegen

S. suis-Infektionen hervorruft, als eine Subunitvakzine aus Murein-assoziierten

Proteinen. Diese Protektion war gegenüber dem homologen hochvirulenten Serotyp-

2-Stamm hoch signifikant und manifestierte sich in zahlreichen Unterschieden zur

Kontrollgruppe, zum Beispiel in einem niedrigeren Pathoscore und dem Ausbleiben

einer generalisierten bakteriellen Erkrankungen. Erstmalig wurden in dieser Arbeit

Hinweise gewonnen, dass eine Serotyp-2-Ganzzellvakzine auch einen schwachen

Schutz vor Morbidität und Mortalität in Folge einer heterologen Belastungsinfektion

mit einem Serotyp-9-Stamm vermittelt. Die genauere Analyse dieser protektiven

Wirkungen der Ganzzellvakzine in zukünftigen Untersuchungen verspricht die

Möglichkeit, durch Modifikationen, gegebenenfalls auch durch Kombination

unterschiedlicher Stämme, einen Impfstoff mit signifikanter Serotyp-übergreifender

Schutzwirkung zu entwickeln.

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Zusammenfassung

85

6 Zusammenfassung

Katharina Benneke: Vergleichende Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer Streptococcus

suis Ganzzell- und einer Subunitvakzine

Streptococcus suis ist ein invasiver Krankheitserreger, der unter anderem Meningitis,

Septikämie und Arthritis verursacht. Der Erreger zeichnet sich durch eine große

Vielfalt an Serotypen aus. Die Entwicklung eines Impfstoffes mit einer Serotyp

übergreifenden Schutzwirkung ist daher ein wichtiges Forschungsziel. Da viele

Oberflächenproteine wie das „Muramidase-released Protein“ (MRP) wichtige

Antigene darstellen, versprach eine Subunitvakzine aus Murein-assoziierten

Proteinen (MAP) eine gute Schutzwirkung. In dieser Arbeit sollte festgestellt werden,

ob eine MAP-Subunitvakzine einen besseren Schutz als eine Ganzzellvakzine

gegenüber Belastungsinfektionen mit einem homologen und einem heterologen

S. suis-Stamm erzielt. Die heterologen Belastungsinfektionen wurden mit einem

MRP*SLY+ Serotyp-9-Stamm durchgeführt, da dieser Pathotyp in Europa wie auch

der homologe MRP+ EF+ SLY+ Serotyp 2 eine große Bedeutung besitzt.

Im ersten Teil der Arbeit erfolgte die Etablierung eines Infektionsmodels für den

MRP*SLY+ Serotyp-9-Stamm A3286/94. Klinische Erkrankungen konnten im

Gegensatz zu dem hochvirulenten Serotyp-2-Stamm 10 nicht durch eine intranasale

sondern, nur durch eine intravenöse Infektion hervorgerufen werden. Daher wurden

die folgenden homologen Belastungsinfektionen mit Stamm 10 intranasal und die

heterologen mit Stamm A3286/94 intravenös durchgeführt.

Im zweiten Teil wurden drei Immunisierungsversuche mit jeweils drei Gruppen

durchgeführt. Die Tiere erhielten in allen Versuchen jeweils zwei Immunisierungen im

Alter von vier und sechs Wochen mit Antigenen des MRP+ EF+ SLY+

Serotyp-2-Stammes 10 (1.Gruppe: Ganzzellvakzine; 2. Gruppe: MAP-

Subunitvakzine). Als Negativkontrolle wurde in der dritten Gruppe ein Placebo

appliziert. Die beiden S. suis-Immunisierungsversuche mit homologer

Belastungsinfektion unterschieden sich nur in der Wahl des Adjuvans. Mit

Aluminiumhydroxid als Adjuvans konnte weder durch die Applikation der Ganzzell-

noch der MAP-Subunitvakzine ein Schutz gegen die Belastungsinfektion mit Stamm

10 induziert werden. Im Gegensatz dazu erzielte die Ganzzellvakzine im zweiten

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Zusammenfassung

86

Versuch unter Einsatz einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) einen signifikanten

Schutz bezogen auf die Morbidität und Mortalität in Folge der homologen

Belastungsinfektion. Die mit MAP immunisierte Gruppe zeigte auch bei Einsatz

dieser Öl-in-Wasser Emulsion nur geringfügige Unterschiede zur Placebogruppe.

Diese klinischen Beobachtungen standen im Einklang mit einem blind

durchgeführten pathohistologischen Screening der fibrinös-eitrigen Entzündungen in

sieben unterschiedlichen inneren Organen. So manifestierte sich die protektive

Wirkung der Ganzzellvakzine in einem sehr niedrigen Pathoscore der

entsprechenden Gruppe. Der Pathoscore der Subunitvakzinegruppe lag nur leicht

unter dem der Kontrollgruppe. Mittel- und hochgradige fibrinös-eitrige Veränderungen

waren in der Mehrzahl der Fälle mit dem kulturellen Nachweis des homologen

Belastungsstammes assoziiert. Im zweiten Versuch konnte bei vier von acht Tieren

der Placebogruppe der hochvirulente homologe Serotyp-2-Stamm in mehr als drei

inneren Lokalisationen nachgewiesen werden. In der Ganzzellvakzinegruppe des

zweiten Versuches lag dieses Merkmal einer generalisierten bakteriellen Erkrankung

bei keinem der Tiere vor.

Diese Arbeit lieferte erstmalig Hinweise, dass eine Serotyp-2-Ganzzellvakzine auch

einen schwächeren partiellen Schutz gegenüber einer heterologen intravenösen

Belastungsinfektion mit einem Serotyp-9-Stamm vermitteln kann. Hierfür sprachen

geringe Unterschiede in Mortalität und Morbidität sowie sehr deutliche Unterschiede

bei den pathohistologischen Befunden im Vergleich zur Placebogruppe. Die

MAP-Subunitvakzine zeigte auch in Bezug auf die heterologe Belastungsinfektion

keine Schutzwirkung.

Im dritten Teil wurden durch die Etablierung unterschiedlicher ELISAs zur

Bestimmung von S. suis spezifischen Antikörpern die Voraussetzungen geschaffen,

die Gruppen auf Serokonversion vergleichend zu untersuchen. In allen drei

Immunisierungsversuchen konnten Serokonversionen gegen MRP und MAP in der

Ganzzell- und MAP-Subunitvakzinegruppe nachgewiesen werden. Im ersten Versuch

mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans waren die Antikörpertiter nach der

Immunisierung deutlich niedriger als in den beiden Versuche mit der Öl-in-Wasser

Emulsion Emulsigen® . Die Applikation der Ganzzellvakzine führte sowohl in Bezug

auf MRP als auch MAP im Durchschnitt zu höheren Antikörpertitern als die

Applikation der MAP-Subunitvakzine, obwohl diese viel größere Mengen dieser

Proteine beinhaltete. Weder die Gesamt-IgG Antikörpertiter gegen MAP noch gegen

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Zusammenfassung

87

MRP erwiesen sich aber als zuverlässige prognostische Indikatoren für einen Schutz

vor einer Erkrankung bzw. vor einem Verendeten in Folge einer experimentelllen

S. suis-Infektion.

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Summary

88

7 Summary

Katharina Benneke: Comparative investigations of the protection provided by a Streptococcus suis bacterin and a subunit vaccine

Streptococcus suis is an invasive pathogen causing mainly meningitis, septicaemia

and arthritis in young pigs. This pathogen displays a large variety of serotypes. The

development of a vaccine which provides effective protection against different

serotypes remains an important unsolved problem in S. suis research. Many surface

proteins, such as the ”muramidase-released protein“ (MRP), are bound to murein

and constitute important antigens. In this study a subunit vaccine made up of murein-

associated proteins (MAP) was investigated as a vaccine candidate. The objective of

this study was to compare a MAP subunit vaccine and a bacterin in homologous and

heterologous challenge experiments. The heterologous challenge was performed

with an MRP* SLY+ serotype 9 strain, as this pathotype, like the homologous

MRP+EF+SLY+ serotype 2, causes substantial economic losses in Europe.

Firstly, an infection model for the MRP*SLY+ serotype 9 strain A3286/94 was

established. In contrast to the highly virulent S. suis serotype 2 strain 10, disease

with clinical manifestation could not be induced by intranasal application of A3286/94,

but by intravenous application. Therefore, the following homologous challenges with

strain 10 were performed intranasally, and the heterologous challenges with strain

A3286/94 intravenously.

Secondly, three immunisation experiments were conducted with three groups each.

In all experiments, the animals received two immunisations with antigens of the

MRP+ EF+ SLY+ serotype 2 strain 10 at the ages of 4 and 6 weeks, respectively. (1st

group: bacterin; 2nd group: MAP-subunit vaccine). The third group received a placebo

as a negative control. The only difference in the two S. suis immunization

experiments with homologous exposure was the choice of adjuvant. It was neither

possible with the bacterin nor with the MAP-subunit vaccine to induce protection

against strain 10 with aluminium hydroxide as adjuvant. In contrast, a significant

protection concerning morbidity and mortality after homologous infection was

achieved through bacterin immunisation in the second experiment with an oil-in-water

emulsion (Emulsigen®) as adjuvant. However, the group immunized with MAP in the

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Summary

89

oil-in-water emulsion showed only very little difference to the placebo group. These

clinical observations were in agreement with the results of a blind histological

screening of fibrinosuppurative inflammations in seven different internal organs. The

protective effect of the bacterin in the oil-in-water emulsion corresponded to a low

pathological score of the respective group. The pathological score of the respective

MAP-subunit group was only slightly below the control group. In the majority of

cases, moderate and severe fibrinosuppurative inflammations were associated with

detection of the homologous challenge strain by culture. In the second experiment

the highly virulent serotype 2 strain was isolated from more than three internal

localisations in four out of eight animals in the placebo group. This characteristic

feature of a generalised bacterial infection was not found in any of the animals

immunised with the bacterin in oil-in-water emulsion.

This study suggested for the first time that a serotype 2 bacterin might also provide

partial protection against a heterologous intravenous exposure to a serotype 9 strain.

This was supported both by the slight differences in morbidity and mortality and the

very clear differences in the histological findings in comparison to the placebo group.

The MAP subunit vaccine did not provide any protection against heterologous

challenge.

In the third part, ELISAs were established to determine antibody titres specific for

S. suis. This allowed investigation of seroconversion in the different immunisation

groups. Seroconversion against MRP and MAP was demonstrated in the bacterin

and MAP subunit vaccine groups of all three experiments. In the first experiment with

aluminium hydroxide as adjuvant, the antibody titres after immunisation were much

lower than in the two experiments with the oil-in-water emulsion Emulsigen®. The

application of the bacterin led to higher average antibody titres against MRP and also

MAP than application of the MAP subunit vaccine, although the latter contained much

higher amounts of these proteins. However, neither the IgG antibody titre against

MAP nor that against MRP were reliable prognostic indicators of protection against

disease or death caused by experimental infection with S. suis.

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9 Anhang

Tabelle 12: Pathohistologische Diagnosen und Nachweise der Belastungstämme von allen Tieren im Überblick

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Anhang

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* fibrinöse und/oder eitrige Entzündungen

** (+) = geringgradiger,

(++) = mittelgradiger;

(+++) = hochgradiger Keimgehalt α-hämolysierender Streptokokken

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Abbildung 13: Tier 119 mit hgr. diffuse fibrinös-eitrige Meningitis nach intranasaler S. suis Stamm 10 Infektion. HE-Färbung. Vergrößerung 20 x.

Abbildung 14: Tier 97 mit hgr. multifokaler fibrinös-eitriger Synovialitis nach intravenöser Infektion mit S. suis A3286/94 (Serotyp 9). HE-Färbung. Vergrößerung 20 x.

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Abbildung 15: Tier 148 mit hgr. diffuser fibrinös-eitriger Pleuritis nach intranasaler S. suis Infektion mit Stamm 10. HE-Färbung. Vergrößerung 20 x.

Abbildung 16: Tier 116 mit mgr. multifokaler fibrinöser Ventrikulitis (F= Fibrin) einschließlich Plexus Choroiditis (CP). HE-Färbung. Vergößerung 40 x.

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9.1 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Mortalität bei Schweinen, die nach einer zweimaligen

Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine

(n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo

(Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+

epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid.

(Kaplan-Meyer Diagramm)..............................................................................64

Abbildung 2: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit

einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8)aus Murein-

assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8)

intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert

wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid. (Kaplan-Meyer

Diagramm) ......................................................................................................64

Abbildung 3: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit

einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-

assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8)

intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert

wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®).

(Kaplan-Meyer Diagramm)..............................................................................65

Abbildung 4: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit

einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-

assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8)

intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert

wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®).

(Kaplan-Meyer Diagramm)..............................................................................65

Abbildung 5: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit

einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine(n=8) aus Murein-

assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8)

intravenös mit dem heterologen Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9)

infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion

(Emulsigen®).(Kaplan-Meyer Diagramm) ........................................................66

Abbildung 6: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit

einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-

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assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8)

heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. Als

Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-

Meyer Diagramm) ...........................................................................................66

Abbildung 7: Antikörper gegen MRP (136 kDa Variante), MAP von A3286/94

und EF (110 kDa Variante) vor bzw. 20 Tage nach der intranasalen

Infektion mit dem MRP+ SLY+ Serotyp 9 Stamm A3286/94 (EF negativ).......71

Abbildung 8: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten

Immunisierung (Alter von 3-4 Wochen) sowie 14 Tage nach der 2.

Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 51-57), einer

Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 61-68)

oder einem Placebo (K, Tier 71-78) bei Verwendung von

Aluminiumhydroxid als Adjuvans. (1. Immunisierungsversuch, vor der

homologen Belastungsinfektion). ....................................................................74

Abbildung 9: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten

Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8

Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer

Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90)

oder einem Placebo (K, Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-

Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans. ( 2.

Immunisierungsversuch, vor der homologen Belastungsinfektion). ................75

Abbildung 10: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten

Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8

Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer

Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212)

oder einem Placebo (K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-

Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans ( 3.

Immunisierungsversuch, vor der heterologen Belastungsinfektion). ...............75

Abbildung 11: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10

vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung

mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer Subunitvakzine aus

Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90) oder einem Placebo (K,

Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®)

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als Adjuvans (2. Immunisierungsversuch, vor homologer

Belastungsinfektion)........................................................................................76

Abbildung 12: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10

vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung

mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer Subunitvakzine aus

Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212) oder einem Placebo

(K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion

(Emulsigen®) als Adjuvans. (3. Immunisierungsversuch, vor heterologer

Belastungsinfektion)........................................................................................76

Abbildung 13: Tier 119 mit hgr. diffuse fibrinös-eitrige Meningitis nach

intranasaler S. suis Stamm 10 Infektion. HE-Färbung. Vergrößerung 20

x. ...................................................................................................................114

Abbildung 14: Tier 97 mit hgr. multifokaler fibrinös-eitriger Synovialitis nach

intravenöser Infektion mit S. suis A3286/94 (Serotyp 9). HE-Färbung.

Vergrößerung 20 x. .......................................................................................114

Abbildung 15: Tier 148 mit hgr. diffuser fibrinös-eitriger Pleuritis nach

intranasaler S. suis Infektion mit Stamm 10. HE-Färbung. Vergrößerung

20 x. ..............................................................................................................115

Abbildung 16: Tier 116 mit mgr. multifokaler fibrinöser Ventrikulitis (F= Fibrin)

einschließlich Plexus Choroiditis (CP). HE-Färbung. Vergößerung 40 x.......115

9.2 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Vergleiche von Tiermodellen für S. suis- Stamm (nur Wildtyp

Stämme) .........................................................................................................16

Tabelle 2: Ergebnisse von Immunisierungsversuchen mit experimenteller

Belastungsinfektion (Auswahl) ........................................................................22

Tabelle 3: Zeitpunkte der Blutentnahmen..................................................................29

Tabelle 4: Übersicht der Infektions- und Immunisierungsversuche mit

Schweinen ......................................................................................................36

Tabelle 5: Virulenz von S. suis-Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) und Stamm

A3286/94 (mrp* sly+ cps9) in experimentellen Infektionen von

Läuferschweinen.............................................................................................48

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Tabelle 6: Fibrinös-eitrige Entzündungen bei mit S. suis-Stamm 10 oder mit

Serotyp-9-Stamm A3286/94 infizierten Läuferschweinen. ..............................51

Tabelle 7: Reisolierung des Belastungsstammes von Läuferschweinen, die mit

S. suis-Stamm 10 oder Stamm A3286/94 infiziert worden sind. .....................53

Tabelle 8: Klinische Befunde bei Schweinen, die nach einer Immunisierung mit

einer Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-

assoziierten Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) homolog mit

Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm A3286/94

(mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. ....................................................................67

Tabelle 9: Reisolation des Belastungsstammes von Schweinen, die mit einer

Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten

Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) immunisiert und anschließend

homolog mit Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm

A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden.....................................................68

Tabelle 10: Differenzierung von fibrinös-eitrigen Entzündungen bei Schweinen

nach homologer (Stamm 10) oder heterologer (Stamm A3286/94)

Belastungsinfektion in Immunisierungsexperimenten mit einem

Pathoscore von 1 bis 5 (1: minimal; 2 und 3: geringgradig und fokal; 4

und 5: mittel- oder hochgradig sowie multifokal oder diffus) 1 .........................69

Tabelle 11: Mortalität und Morbidität aller Versuchstiere im Zusammenhang mit

Antikörpertitern gegen MRP bzw. MAP vor der experimentellen

Belastungsinfektion.........................................................................................78

Tabelle 12: Pathohistologische Diagnosen und Nachweise der

Belastungstämme von allen Tieren im Überblick ..........................................105

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Danksagung

Mein erster Dank geht an Herrn Prof. Dr. P. Valentin-Weigand und Herrn Prof. Dr. K. H. Waldmann für die Bereitstellung des interessanten Themas, für die Betreuung und bereitwillige Unterstützung. Herrn Dr. C. G. Baums möchte ich herzlich für die Organisation, Planung und Unterstützung bei der Durchführung der Tierversuche, für die Betreuung der Laborarbeit und für die Hilfe bei der Zusammenstellung der Dissertation danken. Danken möchte ich auch Frau Dr. C. Schroeder für die aktive Unterstützung in den Tierversuchen und der Beratung in klinischen Fragen. Für die Bearbeitung der Blutproben möchte ich ganz herzlich Herrn Prof. Dr. Ganter und seiner Arbeitsgruppe, hier insbesondere Frau Großmann, danken. Die Arbeitsgruppe der Abteilung Valentin-Weigand unterstützte mich während der gesamten Dissertation. Vor allem bedanke ich mich bei Frau C. Neis, Herrn PhD M. Fulde, Herrn PhD L. Benga für die tatkräftige Hilfe bei der Durchführung der Sektionen. Einen wichtigen Teil dieses Forschungsprojektes konnte durch die pathohistologischen Untersuchungen der Organproben von Herrn Dr. A. Beineke vom Institut für Pathologie verwirklicht werden. Herrn Fiedler und Herrn Richter danke ich für die problemlosen Tiertransporte zur Tierärztliche Hochschule Hannover. Weiterhin möchte ich Herrn Henstorf für die Bereitstellung von Nährböden danken. Auch Herrn W. Scharnhorst danke ich für die sorgfältige Reinigung und Desinfektion der Stallungen nach den Tierversuchen sowie für die Unterstützung bei den Vorbereitungsarbeiten im Tierstall. Für die Unterstützung und Beratung zur Etablierung des ELISAs danke ich Herrn Dr. T. Rehm. Des Weiteren danke ich Herrn Dr. Fischer aus der IVD GmbH für die Bereitstellung von Elmulsigen® und für die professionelle Beratung zur Herstellung der Ganzzellvakzine. An dieser Stelle möchte ich mich auch bei Herrn Dr. M. Beyerbach vom Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung für die Unterstützung bei der statistischen Auswertung meiner Daten und bei Herrn J. Merkel für die Hilfestellung zur digitalen Bearbeitung bedanken. Finanziert wurde diese Arbeit von der IDT Biologika GmbH, Dessau-Tornau, auch hierfür herzlichen Dank. Mein besonderer Dank gilt meiner Familie und Philipp, die mich im gesamten Studium tatkräftig unterstützt haben und mir das Erreichen meiner Ziele ermöglichten.