tierärztliche hochschule hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover

Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei Hunden mit inflammatorischen Erkrankungen und Optimierung

der Messzeit des Multiplate® Aggregometers

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Monia Abid

Essen

Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke Klinik für Kleintiere 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. K. Feige

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2011

Meiner Familie

„Klingt komisch, ist aber so.”

- Die Sendung mit der Maus -

Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form eines Posters auf folgender

Fachtagung präsentiert:

19. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik“ der DVG

(InnLab 2011):

Thrombozytenfunktionsmessung mit dem Multiplate® analyser: Optimierung der

Messzeit für canines Blut

Inhaltsverzeichnis

I Einleitung ....................................................................................................... 1

II Literaturübersicht ........................................................................................ 4

1. Thrombozytenfunktion .................................................................................................... 4

1.1. Interaktion der Thrombozyten mit dem Endothel ........................................................ 4

1.2. Aktivierung der Thrombozyten .................................................................................... 5

1.2.1. Signaltransduktion ................................................................................................. 5

1.3. Sekretion der Granula-Inhaltsstoffe ............................................................................. 6

1.4. Aggregation der Thrombozyten ................................................................................... 6

1.5. Die Rolle der Thrombozyten für die Blutgerinnung (zellbasiertes Modell) ................ 7

1.5.1. Initiation ................................................................................................................ 7

1.5.2. Amplifikation ........................................................................................................ 7

1.5.3. Propagation ............................................................................................................ 8

2. Agonisten und ihre Thrombozytenoberflächenrezeptoren ........................................... 8

2.1. Kollagen und Kollagenrezeptoren ............................................................................... 8

2.2. Thrombin und Protease-aktivierte Rezeptoren ............................................................ 9

2.3. ADP und ADP-Rezeptoren ........................................................................................ 10

2.4. Eicosanoide ................................................................................................................ 10

2.5. Epinephrin .................................................................................................................. 11

3. Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel ........................................................ 11

4. Thrombozytenfunktionsdiagnostik ............................................................................... 12

4.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit ................................................................................... 13

4.2. Plättchenfunktionsanalysator PFA-100 ..................................................................... 13

4.3. Turbidimetrische Aggregometrie nach BORN .......................................................... 14

4.4. Vollblutaggregometrie ............................................................................................... 15

5. Einfluss entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion .................... 18

5.1. Übersicht vorhandener Studien .................................................................................. 18

5.2. Pathogenese entzündlich bedingter Thrombozytendysfunktionen ............................ 24

5.2.1. Thrombozytopenie als Ursache der verminderten Aggregation.......................... 24

5.2.2. Thrombozytenfunktions“erschöpfung“ ............................................................... 24

5.2.3. Anti-Plättchen Antikörper ................................................................................... 25

5.2.4. Einfluss von Endotoxinen/Lipopolysacchariden (LPS) auf die

Thrombozytenfunktion .................................................................................................. 25

5.2.5. Aggregationsinduktion durch zirkulierende Immunkomplexe............................ 26

5.2.6. Microbial surface components reacting with adhesive matrix molecules

(MSCRAMMs) .............................................................................................................. 26

III Material, Tiere und Methoden ................................................................. 28

1. Material ........................................................................................................................... 28

1.1. Geräte und Bezugsquellen ......................................................................................... 28

1.2. Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen ................................................ 29

2. Studiendesign .................................................................................................................. 30

3. Tiere ................................................................................................................................. 31

4. Blutentnahme .................................................................................................................. 33

5. Probenbehandlung .......................................................................................................... 33

6. Versuchsdurchführung .................................................................................................. 34

6.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit ................................................................................... 34

6.2. Plättchenfunktionsanalysegerät (PFA-100) ............................................................... 34

6.3. Turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung ............................................. 35

6.4. Impedanzaggregometrie ............................................................................................. 35

6.5. Thrombozytenzahl und Hämatokrit ........................................................................... 36

7. Datenanalyse ................................................................................................................... 37

8. Statistische Auswertungen ............................................................................................. 37

IV Manuskript I ............................................................................................. 38

Abstract ............................................................................................................................... 39

Introduction ........................................................................................................................ 40

Materials and methods ....................................................................................................... 41

Results .................................................................................................................................. 44

Discussion ............................................................................................................................ 45

References ............................................................................................................................ 48

V Manuskript II ............................................................................................. 58

Abstract ............................................................................................................................... 59

Introduction ........................................................................................................................ 60

Materials and methods ....................................................................................................... 61

Results .................................................................................................................................. 67

Discussion ............................................................................................................................ 68

Conclusion ........................................................................................................................... 75

References ............................................................................................................................ 76

VI Übergreifende Diskussion ......................................................................... 83

VII Zusammenfassung ................................................................................... 92

VIII Summary ................................................................................................ 95

IX Literaturverzeichnis ................................................................................. 97

X Tabellarischer Anhang ............................................................................. 119

XI Danksagungen ......................................................................................... 151

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

AA Arachidonsäure, arachidonic acid

ADP Adenosindiphosphat, adenosine diphosphate

AS Arachidonsäure, arachidonic acid

ASS Acetylsalizylsäure, acetylsalicylic acid

ATP Adenosintriphosphat, adenosine triphosphate

AU Aggregationseinheit, aggregation unit

AUC Fläche unter der Kurve, area under the curve

Ca2+ Kalzium, calcium

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat, cyclic adenosine monophosphate

ClF A Gerinnungsfaktor A, clotting factor A

cm Zentimeter, centimetre

Col Kollagen, collagen

COX Zyklooxygenase, cyclooxygenase

CT Verschlusszeit, closure time

DG Diacylglycerol

EPCR endothelialer Protein C Rezeptor, endothelial cell protein c receptor

EPI Epinephrin, epinephrine

et al. et alii (lat. und andere, and others)

F Gerinnungsfactor, coagulation factor

Fig Abbildung, figure

g Erdbeschleunigung (1 g = 9,81 m/s2), gravity

°C Grad Celsius, degree centigrade

GP Glykoprotein, glycoprotein

GV Gesamtvolumen, total volume

Htk Hämatokrit, haematocrit

IgG Immunglobulin G, immunoglobuline G

IL Interleukin, interleukin

IP3 Inositol-1,4,5-Triphosphat, inositol-1,4,5-triphosphate

kg Kilogramm, kilogram

Kol Kollagen, collagen

L Liter, litre

LPS Lipopolysachharid, lipopolysaccharide

M Mol, mol

Max Maximum, maximum

MEA Mehrfachelektroden Aggregometrie, multiple electrode aggregometry

mg Milligramm, milligram

min Minute(n), minute(s)

Min Minimum, minimum

mL Milliliter, millilitre

mm Millimeter, millimetre

mmHg Millimeter Quecksilbersäule, millimeter mercury

mmol Millimol, millimol

MSCRAMM microbial surface component reacting with adhesive matrix molecules

n Anzahl, number

NaCl Natriumchlorid, sodium chloride

p p-Wert (Irrtumswahrscheinlichkeit), p-value

PAR Protease-aktivierter Rezeptor, protease-activated receptor

PFA Plättchenfunktionsanalysegerät, platelet function analyser

PFP plättchenfreies Plasma, platelet free plasma

PIP2 Phosphoinositol-4,5-biphosphonat, phosphoinositol-4,5-biphosphate

PSGL P-Selektin Glykoprotein Ligand, P-selectin glycoprotein ligand

PRP plättchenreiches Plasma, platelet rich plasma

PTFE Polytetrafluorethylen, polytetrafluoroethylene

SD Standardabweichung, standard deviation

sec Sekunde(n), second(s)

SIRS systemisches inflammatorisches Response-Syndrom, systemic inflammatory

response syndrome

Tab. Tabelle, table

TF tissue factor

TNF Tumornekrosefaktor, tumor necrosis factor

TV Gesamtvolumen, total volume

TXA2 Thromboxan A2, thromboxane A2

TXB2 Thromboxan B2, thromboxane B2

vWF von Willebrand Faktor, von Willebrand factor

VZ Verschlusszeit, closure time

µg Mikrogramm, microgram

µL Mirkoliter, microlitre

µm Mikrometer, micrometre

µM Mikromol, micromol

I Einleitung

1

I Einleitung

Die Messung der Thrombozytenfunktion stellt eine wichtige Untersuchung im

Rahmen der Diagnostik von Hämostasestörungen dar. Die am häufigsten verwendeten

Verfahren sind die kapilläre in vivo Blutungszeit (NOLTE et al. 1997), die turbidimetrische

Thrombozytenaggregationsmessung nach Born (BORN 1962) und die automatische

Thrombozytenfunktionsanalyse mit dem Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100

(MISCHKE u. KEIDEL 2003).

Die erstmals 1980 beschriebene Impedanzaggregometrie mit Vollblut (CARDINAL u.

FLOWER 1980) war zunächst durch ihre relativ aufwendige Handhabung wenig praktikabel.

Diesem Nachteil wurde mit denen in jüngster Vergangenheit entwickelten Vollblut-

Impedanzaggregometern Rechnung getragen. Das Messprinzip beruht auf der Zunahme des

elektrischen Widerstands zwischen zwei Elektroden, wenn sich aggregierende Thrombozyten

an diese anlagern (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Die Vorteile des Einsatzes von

Vollblut im Gegensatz zur photometrischen Methode basierend auf plättchenreichem Plasma

(PRP) bestehen in der weniger aufwendigen Probenvorbereitung und Anwesenheit aller

Blutzellen. Dies bedeutet zum einen eine Zeitersparnis und zum anderen wird durch den

Verzicht auf die Zentrifugation eine artifizielle Veränderung der Plättchenvolumen-

Zusammensetzung verhindert (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005).

Eines der neueren Geräte, das sich dieses Messprinzips bedient, ist das Multiplate®

Aggregometer. Da es ursprünglich für den Einsatz in der Humanmedizin konzipiert wurde,

fand in einer früheren Studie eine Anpassung verschiedener Parameter an Hundeblut statt

(KALBANTNER et al. 2010). Eine entsprechende Überprüfung des Parameters Messzeit

wurde hingegen bisher noch nicht durchgeführt. Die in der Humanmedizin empfohlene

Messzeit von sechs Minuten wurde in der vorherigen Studie für Hundeblut auf 12 Minuten

erhöht.

Das Ziel des methodischen ersten Teils der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss

der Messzeit auf die Referenzwerte und die Sensitivität der Messergebnisse für Hundeblut zu

ermitteln und zu prüfen, ob eine Verkürzung der Messzeit ohne negative Auswirkungen auf

die Aussagekraft der Messergebnisse möglich ist.

I Einleitung

2

Entzündliche und infektiöse Erkrankungen, die eine häufige Ursache für eine

Thrombozytopenie beim Hund darstellen (GRINDEM et al. 1991), können ebenso auch mit

erworbenen Thrombozytenfunktionsstörungen einhergehen. Verschiedene Studien

untersuchten die Thrombozytenfunktion bei Hunden mit bestimmten infektiösen

Erkrankungen zumeist mit lediglich einer einzigen Methode, bei der es sich meistens um die

turbidimetrische Aggregometrie handelte (CORONA et al. 2004; BRANDAO et al. 2006).

Daneben nutzten Studien zur Untersuchung der primären Hämostase auch die kapilläre

Blutungszeit bei Hunden mit Leishmaniose (MORENO et al. 1998) und die

Plättchenfunktionsanalyse mit dem Pättchenfunktionsanalysegerät PFA-100 bei Hunden mit

experimentell induzierter Endotoxämie (YILMAZ et al. 2005). Die Mehrheit dieser Studien,

die den Einfluss von experimentell induzierten und natürlich auftretenden entzündlichen

Erkrankungen auf die Thrombozyten untersuchten, konnten eine beeinträchtigte

Plättchenfunktion in vitro beobachten (JACOBS et al. 1986; HARRUS et al. 1996a;

VALLADARES et al. 1998). Einzelne Studien berichten aber auch von einer gesteigerten

maximalen Aggregation bei Hunden mit Herzwurminfektion (BOUDREAUX et al. 1989).

Ebenso existieren im Bereich der Humanmedizin widersprüchliche Ergebnisse der

turdidimetrischen Aggregometrie aus Studien mit septischen Patienten (GAWAZ et al. 1997;

YAGUCHI et al. 2004).

Infektiöse Erkrankungen können die primäre Hämostase über verschiedene

Pathomechanismen beeinflussen. So kann die Bindung von sowohl zirkulierenden

Immunkomplexen als auch Komplexen bestehend aus Clotting factor A (ClF A, einem

adhäsivem Matrixmolekül grampositiver Bakterien), Fibrinogen und Antikörpern an den

Thrombozyten eine frühe, systemische Aktivierung der Plättchen mit anschließender

Agglutination und gesteigertem Verbrauch induzieren (LOUGHMAN et al. 2005). Des

Weiteren können Endotoxine zum einen über Bindung an die Thrombozytenoberfläche

(SABA et al. 1984; SALDEN u. BAS 1994) und zum anderen durch Modifikation der

thrombozytären Rezeptoren (NYSTROM et al. 1994) zu einer direkten Beeinträchtigung der

Plättchenfunktion führen.

Unabhängig von der Ätiologie kann jeder schwere und/oder fortgeschrittene

entzündliche Prozess zu einer ausgeprägten systemischen Reaktion des Körpers führen. Ein

systemisches inflammatorisches Response-Syndrom (SIRS) stellt eine ernste, möglicherweise

I Einleitung

3

lebensbedrohliche Lage dar, die häufig mit Hämostasestörungen assoziiert ist und ein

schnelles therapeutisches Handeln verlangt (HOPPER 2005).

Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, den Einfluss entzündlicher

Erkrankungen aufgrund bakterieller und protozoischer Infektionen auf die

Thrombozytenfunktion bei Hunden zu untersuchen. Dies geschah mittels verschiedener

Globaltests und spezifischer Methoden, zu denen auch das im ersten Teil bearbeitete, relativ

neue Multiplate® Impedanzaggregometer gehörte. Die Ergebnisse wurden mit denen einer

gesunden Kontrollgruppe verglichen und darüber hinaus wurden die Ergebnisse von Patienten

mit SIRS und ohne SIRS miteinander verglichen.

II Literaturübersicht

4


1. Thrombozytenfunktion

Thrombozyten sind in der Lage, kleine endotheliale Defekte durch die Formation eines

primären Thrombus zu verschließen und dienen somit der Aufrechterhaltung der

Gefäßintegrität (SCHARF 1997). Des Weiteren fördern sie die Heilung der

Gefäßwandverletzung und spielen eine wichtige Rolle bei Entzündungsprozessen (GENTRY

1992).

1.1. Interaktion der Thrombozyten mit dem Endothel

Eine Verletzung der Gefäßwand führt zur Freilegung subendothelialer Strukturen, die

aus Struktur- und Adhäsionsproteinen zusammengesetzt sind und deren Interaktion mit den

Thrombozyten normalerweise durch das intakte Endothel verhindert wird (RUGGERI 1994).

Von Bedeutung für die primäre Hämostase sind v.a. Kollagene, Fibronektin und Laminin,

sowie der von-Willebrand-Faktor (vWF), der vom Endothel sezerniert wird und im Fall eines

Gefäßwanddefektes an das freigelegte Kollagen binden kann (JACKSON et al. 2000). Diese

Faktoren bilden die Grundelage für die Adhäsion der Thrombozyten an den Defekt.

Die an der Adhäsion beteiligten Rezeptoren und Liganden sind abhängig von den

vorherrschenden Scherkräften: in Bereichen mit niedrigen Scherkräften (venöses

Gefäßsystem) ist die irreversible Bindung von Kollagen, Fibronektin und Laminin an die

entsprechenden thrombozytären Integrine ausreichend, um eine Ansammlung und Adhäsion

der Plättchen zu ermöglichen (KROLL et al. 1996). Bei hohen Scherkräften, wie sie im

arteriellen Stromgebiet und in der Mikrozirkulation vorherrschen, sind Bindungen mit höherer

Affinität erforderlich. In diesem Fall findet die Interaktion zunächst zwischen dem vWF und

dem thrombozytären GPIb/IX/V-Rezeptor statt (REININGER et al. 2006). Im Anschluss

erfolgt eine Stabilisierung der Plättchenadhäsion durch die bereits erwähnten irreversiblen

Bindungen mit Kollagen, Fibronektin und Laminin (SIXMA et al. 1995). Die Adhäsion der

Thrombozyten führt zum sogenannten „shape change“, einer Formveränderung der Zelle, die

mit Ausbildung von Pseudopodien einhergeht. Sie führen zur Oberflächenvergrößerung und

somit einer besseren Abdichtung des Defekts (GAWAZ 1999).


5

1.2. Aktivierung der Thrombozyten

Die Aktivierung der Thrombozyten führt zu strukturellen und funktionellen

Veränderungen der Zelle und ist Voraussetzung für den Ablauf der Aggregation. Sie wird

zum einen durch den Adhäsionsvorgang selbst, zum anderen durch chemische Stimuli in

Form von Agonisten induziert (GAWAZ 1999). Diese werden sowohl vom Thrombozyt

selbst, als auch vom umliegenden Gewebe produziert und binden an spezifische Rezeptoren

auf der Thrombozytenoberfläche. Neben dem bereits erwähnten „shape change“ und der

Freilegung des GPIIb/IIIa-Rezeptors kommt es zu einer Umorientierung der

Membranphospholipide. Von übergeordneter Bedeutung ist dabei die Translokation des

Phosphatidylserins von innen nach außen, das als Bindungsstelle für aktivierte

Gerinnungsfaktoren dient und maßgeblich an der Generierung von aktiviertem Faktor X und

Thrombin beteiligt ist (ZWAAL u. SCHROIT 1997).

1.2.1. Signaltransduktion

Die Signaltransduktion dient der Weiterleitung von Reizen außerhalb der Zelle ins

Zellinnere. Dabei sind in der Regel eine Vielzahl von Enzymen und „second messenger“

beteiligt. Im Rahmen der Thrombozytenaktivierung haben die verschiedenen

Signaltransduktionswege alle eine Erhöhung der intrazellulärem Ca2+-Konzentration zum

Ziel, die durch den Influx von extrazellulärem Ca2+ und der Degranulation erreicht wird

(ROSENFELD u. GRALNICK 1997). Die drei Enzyme Phospholipase C, Phospholipase A2

und Adenylatzykalse sind daran maßgeblich beteiligt.

Zunächst bindet ein Agonist an seinen spezifischen thrombozytären

Oberflächenrezeptor, die zur Gruppe der Guaninnukleotid-bindenden Proteine (G-Proteine)

gehören. Das aktivierte G-Protein wiederum aktiviert zwei Enzyme: die Phospholipase C und

die Phospholipase A2.

Die Phospholipase C führt zu einer hydrolytischen Spaltung des

Membranphospholipids Phosphoinositol-4,5-biphosphonat (PIP2) in Inositol-1,4,5-

Triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DG). Während IP3 zu einem Anstieg des intrazellulären

Ca2+ führt, aktiviert DG die Proteinkinase C, welche über weitere Signalproteine zur

Degranulation und der Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors führt (BRASS et al. 1997).


6

Die Phospholipase A2, zusätzlich durch die erhöhte Ca2+-Konzentration aktiviert,

bedingt die Freisetzung von Arachidonsäure (AS) aus der Plasmamembran. Sie dient als

Substrat für die Cyclooxygenase-1 (COX-1) und die Thromboxansynthetase, welche daraus

Thromboxan A2 (TxA2) bilden. Neben der Degranulation bewirkt TxA2 auch eine

Vasokonstriktion und agiert außerdem selbst als Agonist (BRASS et al. 1997).

Handelt es sich bei dem durch den Agonisten aktivierten G-Protein um ein

inhibitorisches G-Protein, führt dies zu einer Hemmung der Adenylatzyklase, was eine

erniedrigte zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP)-Konzentration zur Folge hat. cAMP

wirkt antagonistisch auf die Thrombozytenaktivierung (BRASS et al. 1997).

1.3. Sekretion der Granula-Inhaltsstoffe

Im Verlauf des Adhäsionsvorgangs kommt es zur Freisetzung der thrombozytären

Granula-Inhaltsstoffe. Dies geschieht per Exozytose (Fusion der Granulamembran mit der

Plasmamembran) und durch Verschmelzung der Granula mit dem offenen kanalikulären

System (RENDU u. BROHARD-BOHN 2001). Die Degranulation ist abhängig von der

intrazellulären Ca2+ -Konzentration, wobei jeder der drei verschiedenen Granulatypen eine

andere Schwellenkonzentration aufweist, die überschritten werden muss. Dadurch bedingt

werden zunächst die dichten Granula und dann die α -Granula, gefolgt von den Lysosomen

freigesetzt (GAWAZ 1999). Folge der Degranulation ist die Verstärkung der

Thrombozytenaktivierung, die Einleitung der Aggregation und die Rekrutierung weiterer

Blutplättchen. Im Rahmen der Degranulation der α-Granula kommt es darüber hinaus zu einer

Translokation des P-Selektins von der Granula-Membran auf die Thrombozytenoberfläche

(PENG et al. 1994).

1.4. Aggregation der Thrombozyten

Die Aggregation umfasst den Vorgang der Koadhäsion zweier Thrombozyten

(GAWAZ 1999). Eine zentrale Rolle spielt dabei der GPIIb/IIIa-Rezeptor der Blutplättchen.

Im Rahmen der Thrombozytenaktivierung werden Bindungsstellen für Fibrinogen am

GPIIb/IIIa-Rezeptor freigelegt und es findet eine primäre Aggregation statt, bei der reversible

Fibrinogenbrücken zwischen den Plättchen entstehen (RUGGERI 1994). Sobald es zur


7

Degranulation der Thrombozyten kommt, verfestigen sich die Fibrinogenbrücken, es findet

eine irreversible, sekundäre Aggregation statt (GAWAZ 1999).

Von entscheidender Bedeutung für den Prozess der Aggregation ist Ca2+, denn nur in

Anwesenheit dieses Kations kann plasmatisches Fibrinogen an den GPIIb/IIIa-Rezeptor

binden (SIESS 1989). Ca2+ und auch Fibrinogen sind außerdem in den Granula gespeichert

und liegen deshalb nach der Degranulation in besonders hoher Konzentration vor (MEYERS

et al. 1982).

1.5. Die Rolle der Thrombozyten für die Blutgerinnung (zellbasiertes Modell)

Das in den letzten Jahren etablierte zellbasierte Modell der Hämostase hat deutlich

gemacht, dass eine strikte Trennung von primärer und sekundärer Hämostase, wie es in der

Vergangenheit üblich war, in vivo nicht gegeben ist. Der Vorgang der Blutstillung wird

demnach in drei Phasen unterteilt, die überlappend ablaufen und als Initiation, Amplifikation

und Propagation bezeichnet werden (HOFFMAN u. MONROE 2001; SMITH 2009).

1.5.1. Initiation

Ein Integritätsverlust des Endothels führt zur Freilegung tissue factor (TF)-tragender

Zellen, die sich im Subendothel der Gefäßwand befinden. Physiologischerweise im Blut

zirkulierender Gerinnungsfaktor (F) VIIa bildet einen Komplex mit dem freigelegten TF

(SMITH 2009). Dieser Komplex aktiviert FX und FIX, woraufhin FXa an den Cofaktor FVa

bindet und damit einen Prothrombinasekomplex erzeugt, der aus einer kleinen Menge

Prothrombin Thrombin generieren kann (BECKER 2005). Der Prozess der Initiation findet

bis hierhin auf der TF-tragenden Zelle statt. Während FXa nach Abspaltung von der TF-

tragenden Zelle sofort durch Antithrombin und tissue factor pathway inhibitor inaktiviert

wird, ist FIXa in der Lage zu dissoziieren und zur Thrombozytenmembran zu gelangen

(ROBERTS et al. 2006).

1.5.2. Amplifikation

Das während der Initiation generierte Thrombin diffundiert in den Blutfluss und setzt

weitere Mechanismen in Gang. Auf der Thrombozytenoberfläche führt Thrombin zur

Aktivierung von FV und FXI und darüber hinaus wird FVIII mithilfe des Thrombins vom


8

zirkulierenden vWF abgespalten und aktiviert (SMITH 2009). Während FVIIIa zu einer

Amplifikation der Thrombingenerierung führt, induziert der isolierte vWF die

Thrombozytenadhäsion (s. Kap. 1.2.) und –aggregation (s. Kap. 1.4.) (HOFFMAN u.

MONROE 2001). Außerdem bindet Thrombin direkt an Rezeptoren auf der

Thrombozytenoberfläche und aktiviert dadurch die Blutplättchen. Diese vollziehen einen

„shape change“, erzeugen durch Umverteilung der Membranphospholipide eine negative

geladene, prokoagulatorische Oberfläche, die zur Bildung weiteren Thrombins beiträgt und

setzen den Inhalt ihrer Granula frei (s. Kap 1.3.) (ZWAAL u. BEVERS 1983).

1.5.3. Propagation

Die Degranulation der Thrombozyten führt zur Rekrutierung weiterer Blutplättchen,

auf deren Oberfläche Liganden exprimiert werden, die die Aggregation induzieren (SMITH

2009). Durch Aktivierung weiterer Faktoren auf der Thrombozytenoberfläche kommt es zur

Generierung größerer Mengen Thrombin, das letztendlich durch Abspaltung von Peptiden aus

Fibrinogen Fibrin bildet (BECKER 2005).

2. Agonisten und ihre Thrombozytenoberflächenrezeptoren

Die Aktivierung der Thrombozyten wird durch verschiedene lösliche Substanzen

induziert, den Agonisten. Über verschiedene Signaltransduktionswege führen sie letztendlich

alle zu einer Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors und damit der Freilegung der Fibrinogen-

Bindungsstellen. Es existiert eine Vielzahl von Plättchen-aktivierenden Substanzen, darunter

Kollagen, Thrombin, Adenosindiphosphat (ADP), AS, Ristocetin, Serotonin und Epinephrine,

die je nach Spezies unterschiedlich potent sind. Alle bisher bekannten Agonist-spezifischen

Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche gehören zur Gruppe der G-Proteine (GENTRY

2000).

2.1. Kollagen und Kollagenrezeptoren

Das Subendothel der Gefäße enthält hauptsächlich Kollagen vom Typ I, III und VI

(SAVAGE et al. 2001). Kommt es zu einer Verletzung des Endothels, werden


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Kollagenfibrillen freigelegt und können in Kontakt mit den Thrombozyten treten. Dabei

binden sie direkt an spezifische Kollagenrezeptoren auf der Plättchenoberfläche und dienen

somit sowohl der Adhäsion als auch der Aktivierung. Thrombozyten besitzen drei

verschiedene Kollagenrezeptoren: das Integrin GPIb/IIa, den zur Immunoglobulin-

Superfamilie gehörenden GPVI-Rezeptor und den von-Willebrand-Rezeptor (GPIb/IX/V)

(FARNDALE 2006). Bindet Kollagen nun an einen entsprechenden Rezeptor, kommt es zur

Freisetzung von AS aus der Plättchenmembran. Diese wird mit Hilfe der thrombozytären

Zyklooxygenase (COX-1) in Thromboxan A2 umgewandelt, welches wiederum ein potenter

Plättchenaktivator ist (YARDUMIAN et al. 1986).

2.2. Thrombin und Protease-aktivierte Rezeptoren

Thrombin ist eine Serinprotease, die Fibrinogen zu Fibrin spalten kann und einen der

potentesten aggregationsinduzierenden Agonisten darstellt (SAVAGE et al. 2001). Es wird

aus seinem inaktiven Vorläufer Prothrombin im Rahmen der Gerinnungskaskade generiert.

Dieser Vorgang wird maßgeblich durch die Anwesenheit aktivierter Thrombozyten gefördert,

deren negativ geladene Membranphospholipide die Bildung des Prothrombinasekomplexes

ermöglichen (QUINN 2005). Thrombozyten produzieren darüber hinaus selbst Thrombin,

was einen amplifizierenden Effekt auf die Aggregation hat.

Thrombin bindet an thrombozytäre Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR), die G-

Protein gekoppelt sind (MOLINO et al. 1997). Insgesamt sind vier dieser Rezeptoren bekannt:

PAR-1, PAR-2, PAR-3 und PAR-4. Während PAR-2 nicht thrombin-sensitiv ist, wird PAR-3

nur auf Mäuse-Blutplättchen exprimiert (P. J. O'BRIEN et al. 2001). Humane Thrombozyten

besitzen demnach PAR-1 und PAR-4, wobei sich die zwei Rezeptoren in ihrer Affinität für

Thrombin unterscheiden (KAHN et al. 1999). PAR-1 wird bereits durch geringe

Konzentrationen von Thrombin stimuliert und führt zu einer schnellen und kurzen

Aktivierung, für die Stimulierung von PAR-4 sind höhere Konzentrationen erforderlich

(SHAPIRO et al. 2000). Da Studien gezeigt haben, dass Thrombozyten von Hunden nicht in

gleichem Maße auf humanes Thrombin reagieren wie menschliche Thrombozyten (DERIAN

et al. 1995), scheint es Unterschiede in der Verteilung oder Sensitivität der PAR zu geben, die

aber noch nicht hinreichend geklärt sind.


10

Neben den mäßig affinen PA-Rezeptoren existiert noch ein weiterer, hochaffiner

Rezeptor für Thrombin: der GPIb-Rezeptor, welcher Bestandteil des vWF-Rezeptors

(GPIb/IX/V) ist (SOSLAU et al. 2001). Die Aktivierung dieses Rezeptors führt zu einer

Hemmung der Fibrinogenspaltung durch Thrombin, steigert aber gleichzeitig die Aktivierung

von PAR-1 (DE CANDIA et al. 2001; LI et al. 2001).

2.3. ADP und ADP-Rezeptoren

ADP ist ein Purinnukleotid, das in den dichten Granula der Thrombozyten gespeichert

und von Erythrozyten und beschädigtem Endothel freigesetzt wird (GAARDER et al. 1961;

MEYERS et al. 1982). Canine Thrombozyten weisen eine sehr unterschiedliche Sensitivität

gegenüber ADP auf, die im Verdacht steht rasseabhängig zu sein (NIELSEN et al. 2007), aber

dennoch wesentlich höher ist als die humaner Blutplättchen (SOLOVIEV et al. 1999).

Auf der Thrombozytenoberfläche befinden sich drei verschiedene Bindungsstellen für

ADP. P2Y1 und P2Y12 sind G-Protein-gekoppelte, purinerge Rezeptoren (JIN et al. 1998).

P2Y1 induziert einen „shape change“, Ca2+-Freisetzung und aktiviert die Phospholipase C,

während P2Y12 die Adenylatzyklase hemmt (DANIEL et al. 1998). Die Bindung an beide

Rezeptoren induziert letztendlich die Aggregation. Der P2X1-Rezeptor hingegen ist ein

Ionenkanal, an den sowohl ADP als auch ATP binden kann. Er ermöglicht den Influx von

Ca2+, scheint aber keine bedeutende Rolle für die Aggregation zu spielen (SAVI et al. 1997).

Seine genaue Funktion ist noch nicht hinreichend geklärt.

2.4. Eicosanoide

Eicosanoide sind hormonähnliche Signalstoffe, die von einer Vielzahl von Zellarten

und Geweben produziert werden. Dabei handelt es sich um Abkömmlinge mehrfach

ungesättigter C20-Fettsäuren, insbesondere der AS.

Die aktivierte Phospholipase A2 setzt aus der Plasmamembran AS frei (QUINN 2005).

Diese dient als Substrat für die thrombozytäre COX-1, welche daraus als Zwischenmetabolit

Prostaglandin (PG) H2 produziert. PGH2 wird mit Hilfe der Thromboxan-Synthetase in TxA2

umgewandelt (REILLY u. FITZGERALD 1993). TxA2 ist eine labile Substanz, die eine kurze

Halbwertszeit von nur ca. 30 s hat und schnell in das inaktive Thromboxan B2 (TB2)

hydrolysiert wird (HALUSHKA et al. 1989).


11

Es existieren zwei Isoformen von TxA2-Rezeptoren: TxRα und TxRβ, die beide G-

Protein-gekoppelt sind (PAUL et al. 1999). Während TxRα die Phospholipase C aktiviert,

führt TxRβ zu einer Hemmung der Adenylatzyklase. Auch der TxA2-Vorläufer PGH2 ist in

der Lage, die Rezeptoren zu stimulieren (HALUSHKA et al. 1995). In niedrigen

Konzentrationen hat PGH2 einen amplifizierenden Effekt, während es in hohen

Konzentrationen inhibitorisch wirkt (QUINN 2005).

Nicht alle Spezies sprechen in gleichem Ausmaß auf AS und TxA2 an. Humane

Thrombozyten reagieren insgesamt stärker als Thrombozyten domestizierter Tiere (GENTRY

2000) und auch innerhalb der Spezies Hund existieren Unterschiede, die erblich bedingt zu

sein scheinen und evtl. rasseabhängig sind (NIELSEN et al. 2007; KALBANTNER et al.

2010). Auch der primäre Agonist hat einen Einfluss auf die TxA2-Produktion: eine

Aktivierung der Thrombozyten durch Kollagen oder Thrombin verursacht eine höhere TxA2-

Synthese als durch ADP (GENTRY 2000).

2.5. Epinephrin

Das Hormon Epinephrin (Adrenalin) wird im Nebennierenmark gebildet und in

Stresssituationen freigesetzt. Neben einer Vielzahl anderer lebenswichtiger Funktionen spielt

es auch eine Rolle im Rahmen der Thrombozytenaktivierung. Epinephrin bindet sowohl an

thrombozytäre stimulierende α-Rezeptoren, die zur Hemmung der Adenylatzyklase führen,

als auch an inhibitorische β-Rezeptoren (SOLOVIEV et al. 1999). Dies erklärt die

unterschiedliche Sensitivität verschiedener Spezies gegenüber Epinephrin, da die

Rezeptorendichte (α/β-Verhältnis) speziesabhängig ist (KERRY et al. 1984). Canine

Thrombozyten sprechen nur sehr schlecht auf Epinephrine an (FEINGOLD et al. 1986), es

kann lediglich den Effekt anderer Agonsiten amplifizieren (GENTRY 2000).

3. Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel

Clopidogrel ist ein Thienopyridin, das den P2Y12-ADP-Rezeptor blockiert. Dieses,

zurzeit nur in Tablettenform verfügbare Medikament, stellt eine „prodrug“ dar, welche

zunächst durch Cytochrom P450 in der Leber in ihren aktiven Metaboliten verstoffwechselt


12

werden muss (SAVI et al. 1994). Die dabei entstehenden Metaboliten sind beim Menschen

bereits eingehend untersucht worden, beim Hund hingegen noch relativ unbekannt. Beim

Menschen entstehen der aktive Metabolit R-130964, ein Thiolderivat, und der inaktive

Metabolit SR 26334 (PEREILLO et al. 2002). Letzterer konnte auch bei mit Clopidogrel

behandelten Hunden nachgewiesen werden, wenn auch in etwas niedrigeren Konzentrationen

(BRAINARD et al. 2010).

Der aktive Metabolit des Clopidogrels bindet irreversibel an den P2Y12-Rezeptor und

führt zu dessen Inaktivierung (MUELLER et al. 2007). Dadurch wird die Hemmung der

Adenylatzyklase antagonisiert, was zu einem erhöhten cAMP-Spiegel im Thrombozyten führt

(SAVI et al. 2001). Clopidogrel hemmt die ADP-induzierte Sekretion der α-Granula und die

Adhäsion am Subentdothel (GAWAZ 1999). Letztendlich führt all dies indirekt zur

Hemmung der GPIIb/IIIa-Rezeptor-Aktivierung. Außerdem scheint Clopidogrel die

Fibrinolyse zu steigern (GAWAZ 1999).

Die in der Humanmedizin gängige Dosierung von 75 mg/Tag führt nach 3–7 Tagen zu

einem steady state (SAVCIC et al. 1999). In einer Studie von BRAINARD et al. (2010)

wurde die Pharmakodynamik von Clopidogrel bei Hunden mittels Thrombelastografie,

turbidimetrischer und Impedanzaggregometrie untersucht. Die Hunde erhielten Clopidogrel in

einer Dosierung von 0,32–1,3 mg/kg/Tag über 3–5 Tage. Dabei zeigte sich, dass es bereits

drei Stunden nach Therapiebeginn zu einer signifikanten Hemmung der ADP-induzierten

Thrombozytenaggregation kommt und dass die Wirkdauer auch beim Hund ca. 24 Stunden

beträgt, wobei eine vollständige Wiederherstellung der Plättchenfunktion ca. 7 Tage nach

Absetzen des Medikaments erfolgte.

4. Thrombozytenfunktionsdiagnostik

Es existiert eine Vielzahl verschiedener Analyseverfahren zur Messung der

Thrombozytenfunktion, aber nur wenige konnten sich bisher in der Routinediagnostik

durchsetzen. Dies liegt u.a. daran, dass viele der Verfahren sehr aufwendig sind und eine

schlechte Standardisierbarkeit aufweisen. Zu den am häufigsten verwendeten Verfahren

gehören die kapilläre in-vivo Blutungszeit, die automatische Thrombozytenfunktionsanalyse


13

mit dem Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100, die turbidimetrische

Thrombozytenaggregationsmessung nach Born und die Impedanzaggregometrie.

4.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit

Die Messung der kapillären Blutungszeit gehört zu den ältesten Verfahren der

Thrombozytenfunktionsdiagnostik in der Humanmedizin (RAND et al. 2003). Der Test dient

als Screeningverfahren zur Feststellung von Störungen der primären Hämostase aufgrund

einer Thrombozytopenie, Thrombozytendysfunktion oder eines Mangels an vWF (MISCHKE

u. KEIDEL 2003).

Beim Hund wird die Blutungszeit zumeist an der bukkalen Maulschleimhaut getestet,

indem eine Inzision an der Innenseite der Lefze durchgeführt und die Zeit bis zum Stillstand

der Blutung gemessen wird. Im Rahmen der Evaluierung der Methode durch JERGENS et al.

(1987) konnten verlängerte Blutungszeiten bei Hunden mit Thrombozytopenie, von-

Willebrand-Erkrankung und Urämie, sowie nach Acetylsalizylsäure (ASS)-Verabreichung

gemessen werden. Von Nachteil bei dieser relativ weit verbreiteten Methode ist die in der

Regel erforderliche Sedation, da die Inzision schmerzhaft ist und demnach schlecht toleriert

wird (FORSYTHE u. WILLIS 1989; BRASSARD u. MEYERS 1991) und die

Schwierigkeiten, die sich beim Stoppen der Blutung im Fall einer ernsthaften

Hämostasestörung ergeben.

In den 90er Jahren stellten NOLTE et al. (1997) eine Methode zur Messung der

kapillären Blutungszeit an der Zehe von nicht-anästhesierten Hunden vor. Zur Evaluierung

der Methode erfolgten Messungen der kapillären Blutungszeit und der Kollagen-induzierten

maximalen Thrombozytenaggregation bei 11 klinisch gesunden Hunden, die zuvor intravenös

ASS appliziert bekommen hatten. Dabei konnte eine reproduzierbare Verlängerung der

Blutungszeit beobachtet werden. Die Vorteile dieser Methode sind die nicht erforderliche

Narkose und die bessere, wenn auch nicht vollständige Standardisierbarkeit (zur

Durchführung s. S. 34).

4.2. Plättchenfunktionsanalysator PFA-100

Die automatische Plättchenfunktionsanalyse mittels PFA-100 kann als ein Globaltest

der primären Hämostase angesehen werden. 1985 stellten KRATZER und BORN erstmals ein


14

Verfahren zur in vitro Messung der Blutungszeit vor (KRATZER u. BORN 1985), auf dessen

Prinzip auch der PFA-100 basiert. Dabei wird Vollblut unter einem Vakuum durch eine

Kapillare gesaugt, an deren Ende sich eine Agonisten-beschichtete Membran befindet, die

eine zentrale Öffnung aufweist und die Zeit bis zu deren Verschluss durch die Thrombozyten

gemessen wird (s. S. 34). Aufgrund der Einbeziehung von hohen Scherkräften ist der PFA-

100 besonders sensitiv gegenüber Störungen des vWF (CALATZIS 2007). Der Vorteil

gegenüber der in vivo Blutungszeit besteht in der besseren Standardisierbarkeit und einem

geringeren Aufwand (MUELLER et al. 2009).

Da das Gerät ursprünglich für den Einsatz in der Humanmedizin konzipiert wurde,

prüften verschiedene Studien seine Eignung für die Untersuchung von Hundeblut (CALLAN

u. GIGER 2001; KEIDEL 2001). Dabei stellte sich heraus, dass der PFA-100 durchaus auch

für die Untersuchung von Hundeblut geeignet ist, wobei eine der zwei verschiedenen

Messzelltypen zu bevorzugen ist (Kollagen/ADP-Messzelle). CALLAN u. GIGER (2001)

untersuchten im Einzelnen die Anwendbarkeit des Gerätes bei Hunden mit

Thrombozytopenie, Thrombopathie und von-Willebrand-Erkrankung und konnten verlängerte

Verschlusszeiten bei diesen Hunden feststellen. Aufgrund des signifikanten Einflusses des

Hämatokrits auf die Messergebnisse ist der klinische Anwendbarkeit jedoch begrenzt

(MISCHKE u. KEIDEL 2003).

4.3. Turbidimetrische Aggregometrie nach BORN

Die von BORN im Jahre 1962 vorgestellte turbidimetrische Aggregometrie basiert auf

der Änderung der optischen Dichte von plättchenreichem Plasma (PRP) nach Zugabe eines

aggregationsinduzierenden Agonisten. Diese Methode galt lange Zeit als „Goldener Standard“

in der Thrombozytenfunktionsdiagnostik, was insbesondere an der guten Standardisierbarkeit

lag (HARRISON 2005). So kann die Thrombozytenzahl im PRP problemlos durch

Verdünnung oder Aufkonzentrieren eingestellt werden, was es ermöglicht, die

Thrombozytenfunktion unabhängig von quantitativen Einflüssen zu untersuchen. Nachteil

dieser Methode ist die relativ aufwendige Probenaufbereitungszeit, die mehrere

Zentrifugationsschritte umfasst und einige unerwünschte Nebeneffekte mit sich bringt. So

werden größere Thrombozyten, die in der Regel besonders aktiv sind, häufig mit

abzentrifugiert und es kann während der Zentrifugation zu Zellschädigungen kommen


15

(DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Studien haben gezeigt, dass je nach

Separationsmethode im Durchschnitt nur 61–90% der gesamten Thrombozyten in die

Messung mit eingehen (PERSIDSKY u. LING 1982). Des Weiteren ist die Messung in

lipämischem oder ikterischem Plasma nicht möglich (RAND et al. 2003). In einer Studie von

MISCHKE et al. (2004), in der die Plättchenaggregation einer großen Anzahl klinisch

gesunder Hunde gemessen wurde, zeigte sich, dass die turbidimetrische Methode besonders

sensitiv gegenüber verminderter Aggregation ist. Dabei erwiesen sich Konzentrationen von >

25 µmol/L ADP, 10 µg/mL Kollagen und 1 IU/mL Thrombin als besonders geeignet,

wohingegen die Agonisten Ristocetin und Epinephrin für die Untersuchung von caninem

Plasma ungeeignet sind. Dies bestätigen Ergebnisse aus verschiedenen früheren Studien, die

ebenfalls ein schlechtes Ansprechen caniner Thrombozyten auf Ristocetin (LEIS et al. 1980)

und Epinephrin (CLEMMONS u. MEYERS 1984; FEINGOLD et al. 1986) im PRP

beobachten konnten.

4.4. Vollblutaggregometrie

In den letzten 25 Jahren wurden immer wieder Methoden entwickelt, die die

Aggregation im Vollblut messen (CALATZIS 2007). Der Vorteil gegenüber der Messung im

PRP besteht, neben dem Wegfall der Zentrifugation und der damit einhergehenden

Zeitersparnis, vor allem im Vorherrschen eines physiologischen Milieus. Studien haben den

Einfluss von roten und weißen Blutzellen auf die Thrombozytenfunktion aufgezeigt. So

konnten GAARDER et al. (1961) das Vorhandensein von ADP in roten Blutzellen und dessen

Effekt auf die Plättchenadhäsion belegen. SANTOS et al. (1991) konnten in ihrer Studie an

klinisch gesunden Menschen zeigen, dass Erythrozyten einen modulierenden Effekt auf die

Thrombozytenreaktivität haben, indem sie zu einer gesteigerten Plättchenaktivierung, einer

erhöhten Mobilisierung von AS aus dem Thrombozyten und einer vermehrten Ansammlung

von AS in der zellulären Umgebung führen. Dies erklärt, warum beim Vollblutverfahren im

Vergleich zum PRP eine höhere Menge an ADP zugesetzt werden muss, um eine Aggregation

zu induzieren und auf der anderen Seite weniger AS nötig ist (SIESS 1989). Ebenso haben

Leukozyten Einfluss auf die Thrombozytenfunktion: über ihren P-Selektin Glykoprotein

Liganden (PSGL) binden sie an das auf der Oberfläche aktiver Thrombozyten exprimierte P-

Selektin, was zu einer zusätzlichen Thrombingenerierung führt (BOUCHARD u. TRACY


16

2001). Ein weiterer Vorteil der Vollblutaggregometrie ist die Möglichkeit, auch ikterische

oder lipämische Proben untersuchen zu können (INGERMAN-WOJENSKI et al. 1983).

Eine Studie von DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. (2005) verglich beim Menschen

die turbidimetrische mit der Vollblutimpedanz-Aggregometrie. Dabei stellte sich die

Aggregationsmessung im Vollblut als überlegen heraus, konnte doch anhand mehrerer

Fallstudien eine verminderte Thrombozytenaggregation im Vollblut bei Patienten mit

Thrombozytendysfunktionen bzw. unter Therapie mit Plättchenhemmern festgestellt werden,

die bei der Untersuchung im PRP im Normalbereich lag. Insbesondere die Sensitivität

gegenüber Plättchenhemmern, aber auch gegenüber erblichen und erworbenen

Thrombozytendysfunktionen war im Vollblutverfahren höher.

Den ersten, erfolgversprechenden Ansatz zur Messung der Thrombozytenfunktion im

Vollblut lieferten 1979 Cardinal und Flower mit der Impedanzaggregometrie. Das Prinzip

dieser Methode basiert auf der elektrischen Widerstandserhöhung zwischen zwei Elektroden

(CARDINAL u. FLOWER 1980). Kommen die Thrombozyten in Kontakt mit der

thrombogenen Metalloberfläche der Elektroden, bilden sie eine Monoschicht auf diesen.

Durch Zugabe eines aggregationsinduzierenden Agonisten (z.B. ADP oder Kollagen) zu der

mit Kochsalzlösung verdünnten Vollblutprobe kommt es zur Anlagerung weiterer

Thrombozyten an die Monoschicht. Der sich dadurch ändernde Widerstand wird mit einem

Schreiber grafisch dargestellt (CARDINAL u. FLOWER 1980).

Eines der neuesten Verfahren basierend auf der Impedanzaggregometrie ist die

„multiple electrode aggregometry“ (MEA). Alle vorherigen Verfahren bedienten sich

wiederverwendbarer Elektroden, die nach jeder Messung gereinigt werden mussten, was eine

potentielle Fehlerquelle darstellt (TOTH et al. 2006). Bei der MEA kommen Einweg-

Messzellen zum Einsatz, die zwei Elektrodenpaare beinhalten. TÓTH et al. (2006)

untersuchten in ihrer Studie u.a. den Einfluss der Thrombozytenzahl auf die detektierte

maximale Aggregation und konnten keine Abhängigkeit feststellen, wobei allerdings alle

gemessenen Proben eine Plättchenzahl aufwiesen, die nur innerhalb des Referenzbereichs

schwankte. Des Weiteren konnte eine geringgradige spontane Thrombozytenaggregation,

evtl. durch den Rührmagneten verursacht, beobachtet werden, die bei Verwendung von

Hirudin als Antikoagulanz deutlich niedriger ausfiel als bei Citrat. Messungen mit der MEA

wiesen eine relativ hohe interindividuelle Variabilität auf, die für den Agonisten ADP


17

besonders ausgeprägt war. Die Thrombozytenaggregation war bei Hirudin-antikoagulierten

Proben signifikant höher als bei Citrat-antikoagulierten, was im Konsens mit einer anderen

Studie steht, die den Einfluss von Antikoagulantien auf die Aggregationsmessung im Vollblut

untersuchte (WALLEN et al. 1997).

In einer Studie von KALBANTNER et al. (2010) wurde erstmals systematisch die

Eignung eines Impedanzaggregometers (Multiplate® Aggregometer) für die Messung von

Hundeblut geprüft. Dabei wurden Referenzwerte etabliert (Tab. 1), verschiedene

Antikoagulantien getestet und optimale Konzentrationen verschiedener

aggregationsinduzierender Agonisten ausgearbeitet. Es stellte sich heraus, dass die Agonisten

Ristocetin und „Thrombin-Rezeptor aktivierendes Peptid 6“ (TRAP-6) keine zuverlässige

Aggregation beim Hund induzieren konnten. Für die weiteren Agonisten konnten optimale

Konzentrationen von 10 µmol/L ADP, 5 µg/mL Kollagen und 1 mmol/L AS eruiert werden,

die damit etwas höher als die für humanes Blut empfohlenen Konzentrationen liegen.

Hirudin erwies sich als Anitkoagulanz gegenüber Citrat und Citratpuffer überlegen, was mit

Beobachtungen bei humanem Blut übereinstimmt. Die für humanes Blut empfohlene

Messzeit von 6 min wurde in der Studie auf 12 min verlängert, um der Aggregationskurve das

Erreichen eines Plateaus zu ermöglichen, sodass die tatsächliche, maximale Aggregation

erfasst werden konnte.

Tabelle 1: Referenzbereiche der „area under the curve“ (AUC) und der maximalen

Aggregation für die Messung von Hundeblut für verschiedene Agonisten in ihren optimalen

Konzentrationen (KALBANTNER et al. 2010).

Agonist Referenzbereich

AUC (AU*min) max. Aggregation (AU)

ADP (10 µmol/L) 1481–3448 105–234

Kollagen (5µg/mL) 2017–3460 155–246

Arachidonsäure (1 mmol/L) 1011–3457 73,9–228


18

5. Einfluss entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion

5.1. Übersicht vorhandener Studien

In der Veterinärmedizin existieren einige wenige Studien, die den Einfluss

entzündlicher Erkrankungen auf die primäre Hämostase beim Hund untersucht haben. Zur

Messung der Thrombozytenaggregation wurde dazu in der Mehrzahl der Studien die

turbidimetrische Aggregometrie verwendet (Tab. 2). Dabei ergaben die meisten Studien eine

signifikant herabgesetzte Aggregation, die unabhängig vom eingesetzten Agonisten zu sein

schien. So konnte bei Hunden mit Leishmaniose (VALLADARES et al. 1998; CORONA et

al. 2004) und Ehrlichiose (HARRUS et al. 1996a; BRANDAO et al. 2006) eine im Vergleich

zur Kontrollgruppe signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation beobachtete werden.

Lediglich bei Herzwurminfektionen (BOUDREAUX et al. 1989) und in der frühen Phase der

experimentell induzierten akuten Pankreatitis (LUKASZYK et al. 1989) war die

Thrombozytenaggregation erhöht. Der Stichprobenumfang war bei vielen Untersuchungen

relativ klein und bei dem untersuchten Krankheitsgeschehen handelte es sich zumeist um

Infektionskrankheiten.

Hinsichtlich des Einflusses entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenzahl

existieren unterschiedliche Ergebnisse (Tab. 3). Die Mehrzahl der Studien konnte eine

signifikant erniedrigte Plättchenzahl beobachten (NAVARRO u. KOCIBA 1982;

HAUPTMAN et al. 1997; SCHETTERS et al. 2009), es wird jedoch auch vom Fehlen

signifikanter Unterschiede berichtet (BOUDREAUX et al. 1989; MORENO et al. 1998; DE

LAFORCADE et al. 2003; MORITZ et al. 2005).

Neben der turbidimetrischen Aggregometrie kamen weitere Untersuchungsverfahren

zur Beurteilung der Plättchenfunktion beim Hund zum Einsatz (Tab. 4). Dies waren die

kapilläre Blutungszeit, die bei Hunden mit Leishmaniose verlängert war (MORENO et al.

1998), der PFA-100, bei dem eine verlängerte Verschlusszeit bei Hunden mit Endotoxämie

beobachtet werden konnte (YILMAZ et al. 2005), die Durchflusszytometrie, die eine erhöhte

Expression von P-Selektin auf der Thrombozytenoberfläche von Hunden mit entzündlichen

Erkrankungen detektierte (MORITZ et al. 2005) und die Thrombelastografie, deren


19

Messungen eine höhere Amplitude bei Hunden mit Parvovirose aufzeigten (OTTO et al.

2000).

Studien aus der Humanmedizin, die die Thrombozytenaggregation mittels

turbidimetrischer Aggregometrie untersuchten (Tab. 5), konnten in Übereinstimmung mit den

Ergebnissen bei Hunden eine verminderte Aggregation bei Menschen mit Endotoxämie bzw.

Sepsis nachweisen (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al. 2004; WOTH et al. 2011). Die

beobachtete verkürzte Verschlusszeit bei Untersuchungen mit dem PFA-100 von Menschen

mit Sepsis und spontaner akuter Pankreatitis hingegen weicht von den Ergebnissen beim

Hund ab (HOMONCIK et al. 2000; MIMIDIS et al. 2004).


20

Tabelle 2: Übersicht der Studien zur Messung der Thrombozytenfunktion mittels turbidimetrischer Aggregometrie bei Hunden mit

entzündlichen Erkrankungen.

ADP = Adenosindiphosphat, AS = Arachidonsäure, Epi = Epinephrin, exp. = experimentell, klin. = klinisch, Kol = Kollagen

Studie n (n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Agonisten Ergebnisse

Boudreaux et al. (1989) 28 (34) X Herzwurm-

infektion ADP, Kol signifikant höhere ADP- und kollagen-induzierte maximale Aggregation im Vergleich zur Kontrollgruppe

Brandão et al. (2006) 7 (3) X Ehrlichiose ADP/Epi,

Kol/Epi signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation bei beiden Agonistenkombinationen

Corona et al. (2004) 30 (10) X Leishmaniose ADP, Kol signifikant niedrigere maximale Aggregation

(Kollagen > ADP) Harrus et al.

(1996a) 6 X Ehrlichiose ADP, Kol, Epi Hemmung der Plättchenaggregation bei 5 von 6 Hunden bei mindestens einem Agonisten

Jacobs et al. (1986) 4 (3) X akute

Pankreatitis ADP, Kol, AS signifikant niedrigere Aggregation bei allen Agonisten

Lukaszyk et al. (1989) 10 X akute

Pankreatitis ADP, AS

erhöhte Sensitivität der Thrombozyten für ADP bis 60 min nach Induktion, signifikant niedrigere Sensitivität nach 2h und 4h; keine Unterschiede bzgl. AS-induzierter Aggregation

Valladares et al. (1998) 6 (2) X Leishmaniose Kol signifikant niederigere kollagen-induzierte

Thrombozytenaggregation


21

Tabelle 3: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf

die Thrombozytenzahl beim Hund.

exp. = experimentell, klin. = klinisch

Studie n (n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Ergebnisse

Boudreaux et al. (1989) 28 (34) X Herzwurm-

infektion keine signifikanten Unterschiede

de Larforcade et al. (2003) 20 (28) X Sepsis keine signifikanten Unterschiede

Harrus et al. (1996a) 6 X Ehrlichiose

signifikant niedrigere Thrombozytenzahl mit Tiefpunkt zwischen Tag 17 + 24 nach der Infektion

Hauptman et al. (1997) 30 (320) X Sepsis

signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bei septischen Hunden im Vergleich zu nicht-septischen

Jacobs et al. (1986) 4 (3) X akute

Pankreatitis

keine signifikanten Unterschiede, aber signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bei erkrankten Hunden und Kontrollgruppe post OP

Lukaszyk et al. (1989) 10 X akute

Pankreatitis

signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bis 4 h nach Induktion

Moreno et al. (1998) 26 (10) X Leishmaniose keine signifikanten Unterschiede

Moritz et al. (2005) 20 (20) X Entzündung keine signifikanten Unterschiede

Navarro et al. (1982) 5 (5) X Leptospirose

signifikant niedrigere Thromobozytenzahl, niedrigste Konzentrationen an Tag 2 + 4 nach Infektion, Ausgangsniveau an Tag 10 wieder erreicht

Schetters et al. (2009) 10 X Babesiose

dramatische Abnahme der Thrombozytenzahl proportional zur Infektionsdosis.

Valladares et al. ( 1998) 6 (2) X Leishmaniose

signifikant, fortschreitend niedrigere Thrombozytentzahl, Ausgangsniveau innerhalb von 6 Monaten nach Therapie erreicht

Yilmaz et al. (2005) 17 (8) X Endotoxämie

signifikant niedrigere Thrombozytenzahl mit Tiefpunkt 0,5 h nach Infektion


22

Tabelle 4: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion (außer

turdidimetrische Aggregometrie) beim Hund.

CADP = Kollagen/ADP-Messzelle, CEPI = Kollagen/Epinephrin-Messzelle, exp. = experimentell, klin. = klinisch, MPC = mittlere Plättchenkonzentration, PFA = Plättchenfunktionsanalysegerät, VZ = Verschlusszeit

Studie n (n Kontrolle) Klin. Exp. Erkrankung Tests Ergebnisse

Moreno et al. (1998) 26 (10) X Leishmaniose kapilläre Blutungszeit

signifikante Verlängerung der Blutungszeit, insbesondere bei erkrankten Hunden mit hohen Kreatininwerten

Moritz et al. (2005) 20/20 X

gemischtes Kollektiv an

entzündl. Erkrankungen

Durchflusszytometrie (P-Selektin), MPC

zirkulierende, aktivierte Thrombozyten bei 60% der Hunde mit entzündlichen Erkrankungen; MPC sensitiver als P-Selektin zur Detektion von aktiverten Plättchen

Otto et al. (2000) 9/9 X Parvovirose Thrombelastografie signifikant höhere maximale Amplitude im

Vergleich zur Kontrollgruppe

Yilmaz et al. (2005) 17 (8) X Endotoxämie

(E.coli) PFA-100,

Hämatokrit

verkürzte VZ 0,5 h (CADP + CEPI) und verlängerte VZ 1 h (CEPI) bzw. 2 h (CADP) nach Endotoxin-Applikation; bei hochdosiertem Endotoxin VZ auch nach 48 h noch verlängert; keine signifikanten Veränderungen hinsichtlich Htk.


23

Tabelle 5: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion beim

Menschen.

ADP = Adenosindiphosphat, AS = Arachidonsäure, CADP = Kollagen/ADP-Messzelle, CEPI = Kollagen/Epinephrin-Messzelle, Epi = Epinephrin, exp. = experimentell, klin. = klinisch, Kol = Kollagen, PFA = Plättchenfunktionsanalysegerät, VZ = Verschlusszeit

Studie n (n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Tests Ergebnisse

Homoncik et al. (2000) 20 (10) X Sepsis PFA-100 verkürzte VZ sowohl bei Messungen mit CADP als

auch mit CEPI

Mimidis et al. (2004) 16 (32) X akute

Pankreatitis PFA-100 verkürzte VZ bei Messungen mit CADP, keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe bei Messungen mit CEPI

Saba et al. (1984)

nicht spezifiziert in vitro Endotoxämie

turbidimetrische Aggregometrie (ADP, Kol, AS)

signifikant niedrigere Plättchenaggregation bei allen Agonisten, Hemmung proportional zur Endotoxin-Konzentration

Whitworth et al. (1989)

nicht spezifiziert in vitro Endotoxämie

turbidimetrische Aggregometrie

(ADP, Kol, EPI); Impedanzaggregometrie

(ADP, Kol)

Impedanzaggregometrie: signifikant höhere kollagen-induzierte Aggregation turbidimetrische Aggregometrie: signifikant höhere epinephrin-induzierte Aggregation + signifikant niedrigere kollagen-induzierte Aggregation (S.enteritidis)

Woth et al. (2011) 45 (30) X Sepsis


(ADP, Kol, Epi)

signifikant niedrigere Aggregation bei allen Agonisten

Yaguchi et al. (2004) 47 (15) X Sepsis


(ADP, Kol, AS)

signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation bei allen septischen Patienten, unabhängig vom verwendeten Agonisten; AS-induzierte Aggregation am deutlichsten erniedrigt


24

5.2. Pathogenese entzündlich bedingter Thrombozytendysfunktionen

5.2.1. Thrombozytopenie als Ursache der verminderten Aggregation

Viele entzündliche Erkrankungen sind mit einer Thrombozytopenie assoziiert

(HAUPTMAN et al. 1997; VALLADARES et al. 1998; SCHETTERS et al. 2009). Diese

kann das Resultat eines erhöhten Verbrauchs, einer beeinträchtigten Produktion oder einer

gestörten Verteilung sein (FELDMAN et al. 1988). Darüber hinaus kann das Auftreten von

Anti-Plättchen Antikörpern (s. Kap. 5.2.3.) eine Thrombozytopenie verursachen

(TERRAZZANO et al. 2006). Eine Studie von GRINDEM et al. (1991) fand heraus, dass die

Thrombozytopenie von 987 Hunden in 23% der Fälle entzündlich bzw. infektiös bedingt war.

Eine mögliche Thrombozytopenie ist außerdem von Interesse bei der Auswertung der

Aggregationsmessungen. So konnte gezeigt werden, dass Thrombozytenzahlen unter 100

x103/µL zu einer deutlichen Abnahme der turbidimetrisch erfassten Aggregation führen

(RAND et al. 2003; ZHOU u. SCHMAIER 2005). Im Fall der Impedanzaggregometrie haben

bereits Thrombozytenzahlen von unter 150 x103/µL einen negativen Einfluss auf die

Messergebnisse (MENGISTU et al. 2009).

Eine Thrombozyopenie ist sicherlich in vielen Fällen maßgeblich an einer

verminderten Thrombozytenaggregation beteiligt (VALLADARES et al. 1998; YILMAZ et

al. 2005), doch haben verschiedene Studien immer wieder gezeigt, dass auch in Fällen mit

Thrombozytenzahlen im Normalbereich eine Hemmung der Plättchenfunktion auftritt

(MORENO et al. 1998; MORITZ et al. 2005). Aus diesem Grund müssen weitere

Mechanismen existieren, die eine gestörte Thrombozytenfunktion verursachen.

5.2.2. Thrombozytenfunktions“erschöpfung“

MORITZ et al. (2005) vermuten aufgrund des Nachweises einer erhöhten P-Selektin-

Expression auf der Thrombozytenoberfläche, dass Hunde mit entzündlichen Erkrankungen

vermehrt zirkulierende, aktivierte Thrombozyten aufweisen. Diese können in vitro teilweise

hypofunktional erscheinen, da sie durch die vorangegangene Aktivierung in vivo refraktär

gegenüber einer weiteren Aktivierung sind. Ähnliches konnte bei Menschen mit Morbus

Crohn (COLLINS et al. 1994) und Sepsis (GAWAZ et al. 1995) beobachtet werden.

PEERSCHKE (1985) fand heraus, dass diese Refraktärphase mit einer gehemmten


25

intrathrombozytären Ca2+-Mobilisation und dem Unvermögen, Fibrinogen zu binden

einhergeht. Dies würde letztendlich in einer verminderten Aggregationsfähigkeit resultieren.

Andere Autoren bezeichnen dieses Phänomen als „Erschöpfung“ der Thrombozytenfunktion,

die auch im Rahmen der caninen Ehrlichiose (BRANDAO et al. 2006) und bei Hunden mit

akuter Pankreatitis (JACOBS et al. 1986) beobachtet wurde. Diese Thrombozyten zirkulieren

weiterhin im Blut und beeinflussen somit mögliche Messungen in vitro (J. R. O'BRIEN

1978).

5.2.3. Anti-Plättchen Antikörper

Im Serum von an Ehrlichiose oder Leishmaniose erkrankten Hunden konnten Anti-

Plättchen Antikörper nachgewiesen werden. Im Fall der Leishmaniose besteht ein

Zusammenhang zwischen klinischem Stadium der Erkrankungen, der Thrombozytenzahl und

dem Auftreten von Antikörpern (TERRAZZANO et al. 2006), während im Fall einer

Ehrlichiose Anti-Plättchen Antikörper insbesondere in der akuten Phase vorhanden sind

(HARRUS et al. 1996b). Die Eliminierung durch die Antikörper führt zu einer

Thrombozytopenie, während eine Bindung der Antikörper an die Thrombozytenoberfläche,

v.a. wenn diese an Rezeptoren erfolgt, eine Thrombozytendysfunktion hervorrufen kann. In

einer weiteren Studie von HARRUS et al. (1996a) kam es aber auch dann zu einer Hemmung

der Thrombozytenaggregation, wenn keine Antikörper mehr vorhanden waren. Diese

Beobachtung spricht dafür, dass es weitere Faktoren geben muss, die zu einer

Thrombozytenfunktionstörung führen.

5.2.4. Einfluss von Endotoxinen/Lipopolysacchariden (LPS) auf die

Thrombozytenfunktion

Studien konnten zeigen, dass Endotoxine bzw. LPS über verschiedene Mechanismen

Einfluss auf die Thrombozytenfunktion nehmen können (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al.

2004; WOTH et al. 2011). So konnte gezeigt werden, dass Endotoxine in der Lage sind,

direkt an Thrombozyten zu binden und auf diese Weise die Thrombozytenfunktion zu

beeinträchtigen (SALDEN u. BAS 1994). Darüber hinaus können LPS das Endothel der

Gefäßwand schädigen (HARLAN et al. 1983) und zu einer gesteigerten Expression von

Adhäsionsmolekülen auf dem Endothel führen (JILMA et al. 1999) und im Speziellen die


26

vermehrte Freisetzung von vWF induzieren (GRALNICK et al. 1989). Dies resultiert in einen

erhöhten Verbrauch an Blutplättchen, was eine Thrombozytopenie zur Konsequenz hat. Ein

weiterer Mechanismus wird von NYSTROM et al. (1994) beschrieben, die eine herabgesetzte

Reaktionsfähigkeit der Thrombozyten von Patienten mit Endotoxämie gegenüber dem

Agonisten Epinephrin feststellen konnten und dies auf einen Mangel an Adrenorezeptoren auf

der Thrombozytenoberfläche zurückführten. Ähnliches konnte in einer Studie von SABA et

al. (1984) für den Agonisten bzw. Metaboliten TxA2 beobachtet werden. Das stark reduzierte

Ansprechen der Thrombozyten auf TxA2 scheint das Resultat einer Hemmung der

Plättchendegranulation und einer Beeinträchtigung des Calciumtransports zu sein.

5.2.5. Aggregationsinduktion durch zirkulierende Immunkomplexe

Immunkomplexe sind in der Lage, über einen thrombozytären IgG-Rezeptor, den

FcγIIA-Rezeptor, eine Agglutination der Plättchen zu induzieren (CLARK et al. 1982).

Antikörper des Immunkomplexes binden an den auf der Thrombozytenoberfläche

exprimierten FcγIIA-Rezeptor und führen dadurch zu einer Agglutination der Thrombozyten

(SJOBRING et al. 2002; JANCAR u. SANCHEZ CRESPO 2005). Zirkulierende

Immunkomplexe wurden bereits im Rahmen der caninen Leishmaniose nachgewiesen

(PUMAROLA et al. 1991; LOPEZ et al. 1996).

5.2.6. Microbial surface components reacting with adhesive matrix molecules

(MSCRAMMs)

Auf der Oberfläche grampositiver Bakterien (insbesondere Staphylokokken) konnte

eine Gruppe von Oberflächenadhesinen, sogenannte „microbial surface components reacting

with adhesive matrix molecules“ (MSCRAMMs) identifiziert werden, die u.a. die Adhäsion

an und Aktivierung von Thrombozyten bewirken können (PATTI et al. 1994). Zu diesen

MSCRAMMs zählt auch der clotting factor A (ClF A), an den sowohl Fibrinogen als auch

spezifische Antikörper binden können. Das gebundene Fibrinogen kann, da es aufgrund der

Immobilisation eine Konformationsänderung erfährt, an den inaktiven GPIIa/IIIb-Rezeptor

auf der Thrombozytenoberfläche binden und somit über Brückenbildung eine Vernetzung der

Thrombozyten induzieren (PATTI et al. 1994). Des Weiteren führt der an den ClF A

gebundene Antikörper über Bindung an den thrombozytären FcγIIA-Rezeptor zur Aktivierung


27

des Thrombozyten (LOUGHMAN et al. 2005). Eine Studie von KERRIGAN et al. (2008)

zeigte außerdem, dass die alleinige Bindung des Fibrinogen-ClF A-Komplexes an den

Thrombozyten nicht ausreicht, um eine vollständige Aggregation zu induzieren. Erst die

simultane Bindung von Fibrinogen und Antikörpern an den ClF A ermöglicht dies. Dieser

Pathomechanismus kann somit letztendlich die Anzahl der refraktären Thrombozyten erhöhen

und somit eine gehemmte in vitro Aggregation hervorrufen.

III Material, Tiere und Methoden

28


1. Material

1.1. Geräte und Bezugsquellen

Beckman Coulter GmbH, Krefeld

Allegra™ 6 KR Centrifuge

Dynabyte Informationssysteme GmbH, München

Multiplate® 5.0 Analyzer

ERKA. Kallmeyer Medizintechnik GmbH & Co. KG, Bad Tölz

Pädiatrisches Sphygomanometer

Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim

ACCU-CHEK Softclix® Classic

Rolf Greiner Biochemica GmbH, Flacht

APACT 4

Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn

Advia 120 Hematology System

Dade PFA-100

Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz

Sigma 1-14 Mikrozentrifuge


29

1.2 Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen

B.Braun Melsungen AG, Melsungen

Isotone Kochsalzlösung 0,9%

Softasept® N Hautdesinfektionsmittel

Becton Dickinson GmbH, Drogheda, Irland

BD Microlance™ 3 sterile Kanüle 1,2 x 40 mm (18G x 1 ½ “) (rosa)

Bioanalytic GmbH, Umkirch/Freiburg

Natriumcitratlösung 0,11 mol/L

BioHit Oyj, Helsinki, Finnland

BioHit Optifit Tip 350 µL

Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim am Rhein

Finalgon® Capsicum Creme 26,5 mg/50 g

Brand Plastibrand® GmbH, Wertheim

Pipettenspitzen 50-1000 μl, blau

Pipettenspitzen 2-100 μl, gelb

Dynabyte GmbH, München

Multiplate® ADPtest (Adenosindiphosphat)

Multiplate® COLtest (Kollagen)

Multiplate® ASPItest (Arachidonsäure)

Dynabyte Informationssysteme GmbH, München

Multiplate® 4,5 ml Hirudin Blood Tube


30

Eppendorf AG, Hamburg

Einkanal Pipette Reference® (variabel) 10-100 μl, 100-1000 μl

Einkanal Pipette Reference® (fix) 25 μl, 50 μl, 200 μl

Eppendorf Reaktionsgefäße 3810 (1,5ml)

LABiTec GmbH, Ahrensburg

Micro cuvettes + Mixer micro (1x4mm)

Sarstedt Aktiengesellschaft & Co., Nürnbrecht

1,3 ml-Mikroprobengefäße mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (1,6 mg/ml)

1,3 ml-Mikroprobengefäße mit Tri-Natrium-Citrat-Lösung (0,13 ml Citratlösung)

Röhre 10 ml, 95 x 16,8 mm, PS

S-Monovette® 3,8 ml 9 NC (PFA)

Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn

DADE® PFA Collagen/EPI Test Cartridge

DADE® PFA Collagen/ADP Test Cartridge

Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien

Terumo® sterile Kanüle 0,9 x 40 mm (20G x 1 ½ “) (gelb)

Verum Diagnostica GmbH, München

Multiplate® Messzellen

2. Studiendesign

Im ersten Teil der Dissertation wurden Messungen von 134 Proben von 117 Hunden

mit unterschiedlichen Erkrankungen und 83 klinisch gesunden Hunden mit dem Multiplate®

Aggregometer durchgeführt. Dabei kamen 3 verschiedene Agonisten in ihren optimalen

Konzentrationen zum Einsatz (s.u.) und die Parameter “area under the curve“ (AUC) und

“maximale Aggregation” wurden nach Testzeiten von 6 min, 8 min, 10 min und 12 min


31

berechnet. Basierend auf den gesunden Hunden wurden Referenzwerte für die jeweiligen

Messzeiten und Agonisten erstellt und die Messergebnisse der erkrankten Hunde in Relation

dazu in erniedrigt, normal und erhöht eingeteilt. Die Verteilung innerhalb dieser Kategorien

wurde zu den unterschiedlichen Messzeiten verglichen. Zusätzlich wurden 8 Proben mit

definierter Aggregationsschwäche von 4 klinisch gesunden Hunden, die mit dem

Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel behandelt wurden, untersucht. Die Hunde

erhielten Clopidogrel in einer Dosierung von 2–4 mg/kg/d per os an 3 aufeinanderfolgenden

Tagen und die Blutproben wurden an Tag 3 und 4 entnommen. Da kein Effekt auf eine

Kollagen-induzierte Aggregation zu erwarten war, wurden nur die Agonisten ADP und AS

verwendet. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte wie bereits beschrieben.

Im zweiten Teil der Dissertation erfolgte die Untersuchung der Thrombozytenfunktion

25 entzündlich erkrankter Hunde und einer Kontrollgruppe (n=27–69) mittels kapillärer

Blutungszeit, automatischer Plättchenfunktionsanalyse mit dem

Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100, turbidimetrischer

Thrombozytenaggregationsmessung nach Born, Vollblutimpedanzaggregometrie mit dem

Multiplate® Aggregometer, Thrombozytenzahl und Hämatokrit. Die Messergebnisse der

erkrankten Hunde wurden mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Die erkrankten Hunde

wurden außerdem in zwei Gruppen eingeteilt: SIRS (n=15) und NonSIRS (n=10), basierend

auf den Kriterien des systemischen inflammatorischen Response-Syndroms. Demnach

mussten mindestens zwei der folgenden Befunde gegeben sein, um eine Zuordnung zur SIRS-

Gruppe vorzunehmen: Herzfrequenz > 120/min, Atemfrequenz > 20/min, Körpertemperatur

< 38°C oder > 39°C, Leukozytenzahl > 18.000 oder < 5.000 (modifiziert nach HAUPTMAN

et al., 1997). Die zwei Gruppen wurden miteinander verglichen.

3. Tiere

Die 117 erkrankten Hunde im methodischen ersten Teil der Arbeit waren Patienten der

Kleintierklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Sie umfassten 67 Patienten mit

Neoplasien (22 maligne Lymphome, 10 Leukämien, 15 Karzinome (inkl. 4

Mammakarzinome), 7 maligne Histiozytosen, 3 Hämangiosarkome, 2 multiple Myelome und

8 Hunde mit jeweils 1 anderen Neoplasie), 14 Hunde mit nicht-neoplastischen Hepatopathien

(7 portosystemische Shunts, 5 degenerative Hepatopathien und 2 andere), 18 mit lokalen oder


32

systemischen Infektionserkrankungen (4 mit Leptospirose, 2 mit Leishmaniose, 6 Abszesse, 2

mit Pyothorax, 2 mit Bronchopneumonie, 1 Pyometra, 1 Sepsis), 3 mit immunhämolytischer

Anämie, 2 mit Hämophilie A, 2 mit von Willebrand Krankheit, 3 Niereninsuffizienzen, 2 mit

Prostatazysten und 6 mit anderen Erkrankungen. Von 9 Tieren wurde mehr als eine Blutprobe

entnommen (bis zu 4).

Eine Vorbehandlung mit gerinnungsbeeinflussenden Medikamenten und/oder das

Vorliegen anderer Primärerkrankungen führten zum Ausschluss der Tiere. Zur Erstellung der

Referenzwerte wurden 83 klinisch gesunde Hunde unterschiedlichen Geschlechts, Rasse und

Alters herangezogen. Die Tiere wurden von Privathaltern zur Verfügung gestellt. Bei den mit

Clopidogrel behandelten Hunden handelte es sich um klinisch gesunde Beagle aus dem Besitz

der Kleintierklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

Die 25 unter einer entzündlichen Erkrankung leidenden Hunde im zweiten Teil der

Arbeit setzten sich aus 15 Hündinnen (davon 3 kastriert) und 10 Rüden (davon 1 kastriert)

zusammen, das Alter betrug 9 Monate bis 12 Jahre, mit einem Median von 5 Jahren und 10

Monaten. Folgende Rassen waren vertreten: 4 Mischlinge, 2 Deutsche Schäferhunde, 2

Beagle, 2 Golden Retriever und jeweils 1 Airedale Terrier, Bracke, Kleiner Münsterländer,

Border Collie, Gordon Setter, Briard, Entlebucher Sennenhund, American Staffordshire

Terrier, Alano, Rhodesian Ridgeback, Hovawart, Bordeauxdogge, Labrador, Norfolk Terrier,

Dobermann und American Cocker Spaniel. Die Erkrankungen setzten sich wie folgt

zusammen: Abszess (n=6), Leptospirose (n=3), Leishmaniose (n=3), Prostatitis (n=3),

Pyometra (n=3), Bronchopneumonie (n=3), Pankreatitis (n=2), Sepsis (n=1) und Peritonitis

(n=1). Auch diese Tiere erhielten keine Vorbehandlung mit Medikamenten, die die primäre

Blutgerinnung beeinflussen und wiesen keine weitere Grunderkrankung auf.

Bei der kapillären Blutungszeit dienten 47, beim PFA-100 41, bei der

turbidimetrischen Methode 27, bei der Impedanzaggregometrie 65 und bei der Plättchenzahl

und dem Hämatokrit 69 klinisch gesunde Hunde der Erstellung von Referenzwerten. Auch

diese Tiere stammten aus privater Haltung.

Der Tierversuch erfolgte gemäß den Bestimmungen des Deutschen

Tierschutzgesetzes. Eine Genehmigung der Versuche erfolgte durch den offiziellen

Tierschutzbeauftragten der Tierärztlichen Hochschule und die Ethikkommission beim


33

Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit

(Referenznummer 07A 514).

4. Blutentnahme

Die Blutproben wurden durch Punktion der zuvor mit einem alkoholischen

Desinfektionsmittel desinfizierten Vena saphena medialis, Vena cephalica antebrachii oder

Vena jugularis externa mittels einer sterilen Einmalkanüle (1,2 x 40 mm) entnommen. Um

eine frühzeitige Aktivierung der Thrombozyten zu verhindern, wurde lediglich leichter Druck

zur Stauung der Vene angewendet. Für die jeweiligen Messungen kamen unterschiedliche

Blutprobengefäße zum Einsatz: a) mit gepufferter Citratlösung (Tri-Natriumcitrat /

Citronensäure-Puffer-Lösung 0,129 mol/L pH 5,5) beschickte Probengefäße

(Fassungsvermögen 3,8 mL) für die Analyse mittels PFA-100, b) Probengefäße mit einem

Volumen von 10 mL, die 1 mL Citratlösung enthielten und zur Herstellung des PRP für die

Methode nach Born dienten, c) 4,5 mL fassende, mit dem Antikoagulanz Hirudin beschichtete

Probengefäße zur Messung mit dem Multiplate® Analyzer und d) mit EDTA beschickte 1,3

mL Probengefäße zur Anfertigung eines Blutbildes. Mit Ausnahme des letztgenannten

Probengefäßes wurden alle bis zum markierten, maximalen Fassungsvermögen mit Blut

gefüllt. Unverzüglich nach der Entnahme wurden Blut und Antikoagulanz durch behutsames

Schwenken miteinander vermischt.

5. Probenbehandlung

Die Proben zur Funktionsanalyse der Thrombozyten wurden frühestens 30 min und

spätestens 3 Stunden nach Entnahme untersucht, so wie es für humanes Blut empfohlen wird.

Während dieser Zeit wurde das Blut bei Raumtemperatur gelagert und unmittelbar vor den

jeweiligen Messungen vorsichtig geschwenkt.

Um das für die turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung benötigte PRP

herzustellen, wurde das Vollblut bei 250 x g für 15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die

Plättchenzahl des separierten Überstandes wurde mittels automatischem Blutzellmessgerät

ermittelt und, falls nötig, auf 150 x 10³/µL durch Hinzufügen von plättchenfreiem Plasma

(PFP) verdünnt. Die Herstellung des PFPs erfolgte durch weitere Zentrifugation.


34

6. Versuchsdurchführung

6.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit

Zur Messung der kapillären Blutungszeit kam die Methode nach NOLTE et al. (1997)

zum Einsatz. Im Gegensatz zu der häufig angewendeten Schleimhaut-Blutungszeit müssen

die Tiere nicht narkotisiert werden. Die Hunde wurden in Seitenlage gebracht und die

Außenseite der Vorderzehe wurde rasiert. Zur Gewährleistung von standardisierten

Bedingungen wurde eine durchblutungsfördernde Salbe (Finalgon® Crème, Boehringer

Ingelheim) auf den rasierten Bereich aufgetragen und nach 1 Minute wieder entfernt. Im

Anschluss sorgte eine pädiatrische Blutdruckmanschette um das Vorderbein 1 Minute vor

Beginn und während der Messung für einen konstanten Druck von 70 mmHg. Mit einer

sterilen, halbautomatischen Blutlanzette (Softclix II®, Roche Diagnostics) wurden zwei

Stiche oberhalb des Ballenhorns gesetzt und die austretenden Blutstropfen alle 15 Sekunden

bis zum Stillstand der Blutung mit einem Tupfer vorsichtig von der Seite aufgesaugt. Die

durchschnittliche Blutungszeit wurde durch Berechnung des Mittelwerts beider Messungen

ermittelt.

6.2. Plättchenfunktionsanalysegerät (PFA-100)

Das Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100 (Siemens Healthcare Diagnostics) stellt

eine in-vitro Methode zur Messung der Thrombozytenfunktion im Vollblut dar und wurde in

der Vergangenheit auch für Hundeblut optimiert (KEIDEL 2001). Das System besteht aus

einem Mikroprozessor-gesteuerten Gerät und Einmaltestzellen, die ein verletztes Blutgefäß

simulieren (KUNDU et al. 1995). Vollblut wird in das Probenreservoir der zuvor in das Gerät

eingesetzten Testzelle pipettiert und unter einem konstanten Vakuum von 40 mmHg durch

eine Kapillare gesogen. Diese leitet das aspirierte Blut zu einer je nach Messzelltyp

unterschiedlich beschichteten Membran, die eine zentrale Öffnung aufweist, an der sich die

Plättchen anlagern und einen Thrombus bilden. Die Zeit bis zum vollständigen Verschluss

dieser Öffnung wird als „Verschlusszeit“ (in s; maximale Messzeit: 300 s) und der Verbrauch

an Blut als „Gesamtvolumen“ (in µL) angegeben. Die Messungen wurden nach den

Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, wobei nur ein Testkanal verwendet wurde, d.h.


35

es fand keine Parallelmessung statt. Es kamen zwei verschiedene Agonistenkombinationen

zum Einsatz: Kollagen/ADP-Messzellen und Kollagen/Epinephrin-Messzellen.

6.3. Turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung

Die turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung nach BORN (1962) galt

lange Zeit als der „Goldstandard“ zur Feststellung von Plättchenfunktionsstörungen

(DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Das Messprinzip basiert auf einer Änderung der

optischen Dichte des PRP nach Zugabe eines aggregationsinduzierenden Agonisten aufgrund

des Ausfallens der aggregierenden Thrombozyten. In dieser Studie wurde ein Aggregometer

mit 4 Kanälen und einer computerbasierten Kurvenauswertung genutzt (APACT 4, Rolf

Greiner Biochemica). Jeder Kanal wurde vor jeder Messung kalibriert, indem zuerst eine

Küvette mit 200 µL PFP und 20 µL NaCl gemessen und als Referenz für eine Aggregation

von 100% festgelegt wurde und anschließend eine Küvette mit 200 µL PRP und 20 µL NaCl

eine Aggregation von 0% markierte. In den darauf folgenden Messungen kamen folgende

Agonisten in den angeführten Endkonzentrationen zum Einsatz: ADP in den

Endkonzentrationen 10 µmol/L, 20 µmol/L und 40 µmol/L und Kollagen in den

Endkonzentrationen 10 µg/mL, 20 µg/mL und 40 µg/mL. Im Anschluss an die Kalibrierung

wurden 20 µL des Agonisten in 200 µL PRP pipettiert und die Messung im Moment der

Zugabe gestartet. Während der Messung wurde das Probengemisch mittels Magnetrührer

vermengt. Die Messungen wurden über 12 Minuten in Form einer Kurve aufgezeichnet und

die maximale Aggregation automatisch berechnet.

6.4. Impedanzaggregometrie

Das Multiplate® Aggregometer ist eine Weiterentwicklung der erstmals von Cardinal

und Flower beschriebenen elektrischen Vollblutaggregometrie (CALATZIS 2007). Das Gerät

besitzt 5 Kanäle, die mit Einwegmesszellen bestückt werden. Jede Messzelle beinhaltet zwei

unabhängige Sensoren, die jeweils aus zwei silberbeschichteten Kupferdrähten mit einer

Länge von 3,2 mm bestehen. Eine Messzelle besitzt einen Buchsenbereich, der die Sensoren

mit dem Instrument verbindet, einen Pipettiereinlass, ein Probenreservoir, in das die

Sensordrähte hineinragen und einen PTFE-beschichteten Magnetrührstab. Die Messungen

wurden wie vom Herstellen empfohlen durchgeführt. Zunächst wurden 300 µL einer auf 37°C


36

erwärmten NaCl-Lösung und 300 µL der mit Hirudin antikoagulierten Blutprobe in das

Probenreservoir der Messzelle pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 3 Minuten bei 37°C

wurden 20 µL des jeweiligen Agonisten hinzugefügt und die Messung gestartet. Die Messzeit

von in der Humanmedizin üblichen 6 Minuten wurde auf 12 Minuten erhöht, um den

Aggregationskurven das Erreichen eines Plateaus zu ermöglichen (KALBANTNER et al.

2010). Die aggregierenden Thrombozyten heften sich an die Sensordrähte und führen zu

einem Anstieg des elektrischen Widerstandes, welcher vom Gerät erfasst und in die

willkürliche Einheit „aggregation units“ (AU) konvertiert wird. Zur Quantifizierung der

Aggregation wurde die „area under the curve“ (AUC in AU*min), die von der Steigung

(„velocity“ in AU/min) und der maximalen Aggregation abhängig ist, herangezogen

(CALATZIS 2007). Da die zwei Sensorpaare den elektrischen Widerstand unabhängig

voneinander aufzeichnen, dienen sie als interne Kontrolle. Jedes Sensorpaar erzeugt eine

Aggregationskurve. Im Falle einer Abweichung von mehr als 20% vom Mittelwert oder

einem Korrelationskoeffizient unter 0,98 wurde die Messung wiederholt.

Die Messungen im ersten, methodischen Teil der Arbeit wurden mit folgenden

Agonisten in ihren optimalen Endkonzentrationen durchgeführt: ADP in einer Konzentration

von 10 µmol/L, Kollagen in einer Konzentration von 5 µg/mL und AS in einer Konzentration

von 1 mmol/L. Im zweiten Teil der Studie wurde eine größere Bandbreite an Konzentrationen

eingesetzt: ADP in Endkonzentrationen von 5 µmol/L, 10 µmol/L und 20 µmol/L, Kollagen

in den Endkonzentrationen 3 µg/mL, 5 µg/mL und 10 µg/mL und AS in Endkonzentrationen

von 0,5 mmol/L und 1 mmol/L.

6.5. Thrombozytenzahl und Hämatokrit

Die Thrombozytenzahl und der Hämatokrit im EDTA-Vollblut und im PRP wurden

mittels automatischem Blutzellmessgerät (ADVIA 120, Siemens Healthcare Diagnostics,

Eschborn) gemessen. Das Gerät detektiert Blutplättchen und Erythrozyten mit Hilfe eines

lasergestützen Multiparameter-Hämatologiesystems. Dies beruht auf einer Doppelwinkel-

Laser-Streulicht-Messung an isovolumetrisch gekugelten Erythrozyten und Thrombozyten

oder an Zellkernen sowie auf der Messung eines Streulichtsignals. Der Hämatokrit wird dabei

nach folgender Formel berechnet: Hämatokrit [%] = MCV [fL] x Erythrozytenzahl [/pL] / 10.


37

7. Datenanalyse

Im methodischen Teil der Arbeit wurden die Aggregationskurven der

Impedanzaggregometrie vom Multiplate® Analyser auf einen Computer mit der

Tabellenkalkulationssoftware Microsoft Excel™ exportiert. Die exportierten Tabellen geben

die Aggregation [AU] in 0,57 sec Intervallen wieder, sodass die Umrechnung in die Einheit

„area under the curve“ [AU*min] nötig war. Dies erfolgte gemäß der Herstellerempfehlung

durch Addition der einzelnen Aggregationswerte über die Zeit (6, 8, 10 und 12 min) und

Division der Summe durch 60. Außerdem wurde durch Bestimmung des höchsten

Aggregationswerts im Messzeitraum die maximale Aggregation ermittelt.

8. Statistische Auswertungen

Die vergleichende Statistik wurde mit dem Programm SPSS 16.0 durchgeführt. Initial

erfolgte die Überprüfung sämtlicher Stichproben mittels Kolmogorov-Smirnov-Test auf

Normalverteilung. Zur Ermittlung der Referenzwerte wurden die 2,5%- und 97,5%- bzw. 5%-

und 95%-Quantile berechnet. Im methodischen ersten Teil der Arbeit wurde für jeden

Agonisten und die Parameter AUC und maximale Aggregation Mehrfeldertafeln angelegt,

die die Anzahl der Messergebnisse unterhalb des, im und oberhalb des Referenzbereichs zu

den verschiedenen Messzeiten enthielten. Sie wurden mit Hilfe eines Chi-Quadrat-Tests

ausgewertet. Des Weiteren dienten ANOVA mit Messwiederholungen und gepaarte t-Tests

dem Vergleich der Referenzwerte zu den verschiedenen Messzeiten. Die mit Clopidogrel

behandelten Hunde wurden zu den verschiedenen Zeitpunkten mittels ungepaartem t-Test mit

der Kontrollgruppe verglichen.

Im zweiten Teil der Studie wurden die Mittelwerte der Kontrollgruppe und der

erkrankten Tiere sowie der Tiere mit und ohne SIRS mittels ungepaarten t-Tests verglichen.

Zum Gruppenvergleich der Daten des PFA-100 wurde der Mann-Whitney-Test herangezogen,

da aufgrund der zensierten Werte für diese Messgröße keine Normalverteilung gegeben war.

Wurde bei der Messung die maximale Messzeit von 300 s erreicht, so wurde der Wert zur

statistischen Auswertung durch den Wert 301s ersetzt. Als signifikant wurden jeweils

Differenzen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von < 5% (p < 0,05) bezeichnet.

IV Manuskript I

38

Influence of test time on results of the

Multiplate® impedance aggregometer in dogs

Running title: Optimal test time of the Multiplate® analyser

Monia Abid, Kerstin Kalbantner, Reinhard Mischke1

IV Manuskript I

From the Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hanover

1Corresponding Author: Reinhard Mischke, Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hanover,

Bünteweg 9, D-30559 Hannover, Germany. [email protected]

(Tel: +49 511 9536200; fax: +49 511 6204)

mailto:[email protected]�

IV Manuskript I

39

Abstract. The Multiplate® analyser is a relatively new impedance aggregometer designed for

human medicine, but was recently evaluated for canine blood. The aim of this study was to

determine the influence of test time on reference values and the validity of measurement

results in canine blood. Based on blood samples of 83 healthy dogs, reference values for

different test times (6, 8, 10 and 12 min) were established for maximum aggregation and area

under the curve (AUC) values for ADP-, collagen-, and arachidonic acid-induced aggregation.

The results of 134 samples of 117 dogs with various diseases and 8 samples with reduced

platelet function owing to treatment with the platelet aggregation inhibitor clopidogrel were

calculated at the different test times and classified as decreased, normal or increased.

Maximum aggregation and AUC values increased significantly with increasing test time. Chi-

square test did not show significant differences between the various test times with regard to

the number of increased and decreased measurement results for any agonists. All samples of

dogs treated with clopidogrel and measured with the agonist ADP revealed decreased AUC

values at any time point. The results of our study indicate that test time significantly

influences absolute maximum aggregation and AUC values, but has limited influence on

sensitivity of measurement results of canine blood using the investigated instrument.

Key words: Whole blood aggregometry; ADP; collagen; arachidonic acid; reference values;

sensitivity; clopidogrel

IV Manuskript I

40

Introduction

The measurement of platelet function is an important part of haemostasis diagnostics.

Several laboratory methods have been developed through the last decades, one of them is the

impedance aggregometry. This method measures the increase in electrical resistance in whole

blood resulting from platelet accumulation between test electrodes.5 Advantages of using

whole blood aggregometry in comparison to the turbidimetry on platelet-rich plasma (PRP)

are the lacking necessity to prepare PRP. Therefore, the method is less time consuming and

no artificial changes of platelet volume composition can occur. In addition, the presence of

other blood cells and of a surface may better imitate physiologic conditions.5

One of the newer devices which is based on this principle is the Multiplate® analyser.

As primarily designed for human blood samples, an adjustment of several parameters was

made to allow measurements in canine plasma.7 A parameter not elaborated in detail so far is

the test time. The manufacturer recommends a test time of 6 minutes for human blood in

order to reduce time exposure. In contrast, a recording time of 12 minutes was used for canine

blood in the previous study, allowing the curves to almost plateau.7

The aim of this study was to determine the influence of the test time on reference

values and on the sensitivity of measurement results of the Multiplate® analyser in canine

plasma and to prove whether a reduction of the test time can be performed without negative

influence on the validity of the assay.

IV Manuskript I

41

Materials and methods

Study design

Measurements of 83 healthy dogs and 134 samples from 117 dogs with various

diseases were performed using 3 different agonists (adenosine diphosphate [ADP], collagen,

arachidonic acid [AA]) and the test parameters “area under the curve” (AUC) and “maximal

aggregation” were calculated after a test time of 6, 8, 10 and 12 minutes. Based on the

clinically healthy dogs, reference values for each test time and agonist were calculated. The

results of the diseased dogs were classified in relation to reference values as decreased,

normal or increased and the distribution among categories between the different test times

was compared.

In addition, 8 samples with defined aggregation deficiency which were taken from 4

healthy dogs that were treated with the platelet aggregation inhibitor clopidogrel were

measured. Dogs received clopidogrela in doses of 2–4 mg/kg/d orally on three consecutive

days and blood samples were collected on the third and fourth day. Aggregation was induced

with ADP and AA and the data were analysed as described in experiment 1.

The experimental procedure was approved by the appropriate ethics committee (Lower

Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety, reference number 07A 514).

Animals

The clinically healthy dogs included animals of different gender and breeds and were

provided by private owners. The age of the dogs varied from 1 to 12 years with a median of

IV Manuskript I

42

2.5 years. The health status was defined based on clinical examination, a blood cell count and

biochemical profile. An exclusion criterion was treatment with any drug influencing platelet

function.

All 117 diseased dogs used in this study were patients of the Small Animal Clinic,

University of Veterinary Medicine Hannover. There were 67 patients with neoplasia (22

lymphomas, 10 leukaemias, 15 carcinomas (incl. 4 mammary carcinomas), 7 histiocytic

sarcomas, 3 haemangiosarcomas, 2 multiple myeloma and 8 dogs with individually different

other neoplasias, respectively), 14 dogs with non-neoplastic hepatopathies (7 portosystemic

shunts, 5 degenerative hepatopathies and 2 others), 18 with local or systemic infectious

diseases (4 leptospirosis, 2 leishmaniosis, 6 abscesses, 2 pyothorax, 2 bronchopneumonias, 1

pyometra, 1 sepsis), 3 with immunohaemolytic anaemia, 2 with haemophilia A, 2 with von

Willebrand diseases, 3 renal insufficiencies, 2 with prostatic cysts, and 6 with miscellaneous

disorders. Of 9 dogs, more than one blood samples (up to four) were taken.

The 4 dogs that were treated with clopidogrel in experiment 2 were clinically healthy

Beagles owned by the Small Animal Clinic.

Sample collection

Blood samples were taken from the saphenous, cephalic or jugular vein using sterile

disposable needles (1.2 x 40 mm). Only gentle pressure was used to raise the vein to minimise

stasis potentially activating the platelets. Blood for impedance aggregometry was collected

into 4.5 mL plastic tubes covered with hirudinb, which has less influence on platelets than

citrate. Blood and anticoagulant were immediately thoroughly mixed by careful swaying.

IV Manuskript I

43

The samples were tested between 30 minutes and 3 hours after collection, as

recommended for human blood. During this period of time, the blood was stored at room

temperature and swayed carefully just before starting the measurement.

Test procedure and data analysis

The Multiplate® analyserc is an advancement of the whole blood aggregation by

Cardinal and Flower4.2 It has five channels for parallel testing which are assembled with

single-use test cells.11

The test was performed as recommended by the manufacturer. After pipetting 300 µl

of isotonic sodium chloride solution (prewarmed to 37 °C) into the test cell, 300 µl of hirudin-

anticoagulated blood was added. At the end of a three minute incubation time at 37 °C 20 µl

of agonist solution was added and the measurement started. The increase of electrical

resistance caused by platelets attaching on the surface of the sensors was recorded over 12

minutes and converted into arbitrary “aggregation units” (AU). Aggregation was quantified

by the area under the curve (AUC in AU*min) which depends on the velocity (AU/min) of

aggregation and maximal aggregation.2 Optimal agonist concentrations which were approved

in a previous study7 were used: 10 µmol/L ADPd, 5 µg/mL collagene, and 1 mmol/L AAf.

Aggregation curves were exported from the Multiplate® analyser to a computer on

which the spreadsheet software Microsoft Excel™ was installed. The resulting Excel file

provided aggregation units in intervals of 0.57 seconds. AUC values were calculated for the

different test times (6, 8, 10, 12 minutes) as described by the manufacturer by summarizing

the single aggregation values over time and dividing the sum by 60, following an instruction

IV Manuskript I

44

provided by the manufacturer. In addition, maximum aggregation values were generated from

the Excel files, i.e. the maximal values within a defined test time were chosen.

Statistical analysis

Data were tested for normal distribution using Kolmogorov-Smirnov test. All

examined parameters showed normal distribution. Results were expressed as arithmetic mean

and standard deviation. In addition, the following reference values were calculated based on

results of healthy dogs: 2.5%, 10%, 25%, 50% (median), 75%, 90%, and 97.5% quantiles.

Comparison of the results of normal dogs at different test times were performed with one-way

ANOVA (repeated measurements) and t-test for paired observations considering Bonferroni`s

correction. Comparison of results of normal dogs and clopidogrel-treated dogs at different test

times were performed with student`s t-test. Contingency tables for each agonist were

compiled including the numbers of increased, normal and decreased results at the 4 test times.

Evaluation of the contingency table in both experiments was performed with Chi square test.

P < 0.05 was considered significant. Statistical analysis was performed using SPSS 17.0

German.g

Results

Reference values that were calculated for the different agonists at the different test

times are presented in Tables 1 and 2. ANOVA revealed significant differences between

different test times for both AUC values and maximum aggregation values, independent

which agonist was used (P < 0.001). Post hoc analyses revealed significant differences

IV Manuskript I

45

between all test times for both parameters and all agonists, and thus even a significant

increase in maximum aggregation between test times 10 and 12 minutes. Chi square test did

not show significant differences between the different test times with regard to the number of

samples with AUC or maximal aggregation below, within and above the reference range for

any of the agonist (Figs. 1,2).

ADP- and AA-induced AUC and maximum aggregation values of clopidogrel treated

dogs were lower when compared to untreated healthy dogs at all test times (P < 0.001 (t test);

Figs. 3–6). Irrespectively of the test time, all AUC values of ADP-induced aggregation from

dogs treated with clopidogrel were below the reference range (Fig. 3). All maximal

aggregation values performed with the agonist ADP were below the reference range using a

test time of 6 or 8 minutes, respectively, but 1/8 value was within the lower limit when the

test time was prolonged to 10 and 12 minutes (Fig. 4). After induction with AA, reduced

values were also found for the majority of the AUC values (7/8 [6 minutes] or 6/8 [8, 10 and

12 minutes]) and part of the maximal aggregation values (5/8 [6 minutes] or 4/8 [8, 10 and 12

minutes]), without significant influence of the test time (P > 0.05, Chi square test) (Figs. 5, 6).

Discussion

The results of the present study indicate that test time significantly influences test

results of the Multiplate® analyser such as maximal aggregation. Therefore, reference values

must be established for the used test time. If test time-adjusted reference values are used, the

test time does not seem to have a significant influence on the sensitivity and specificity of

IV Manuskript I

46

measurements using the Multiplate® analyser. Therefore, a short test time of 6 minutes seems

appropriate and may even have a slightly superior sensitivity.

A test time of 6 min is recommended by the manufacturer for human blood samples

and in most of the human studies using the Multiplate® analyser this time setting has been

chosen.2,3,8,12 Deviating from this, Tòth et al.11 chose a test time of 5 minutes in their study. In

the available human and veterinary literature no studies could be found, which systematically

compared different test times with respect to the diagnostic accuracy. The results of the

present study seem therefore also of interest for the human medicine.

The reason for using a test time of 12 minutes for canine blood in the previous study

on canine sample material was to allow the aggregation curves to almost plateau.7 This may,

for example, allow to report true “maximum aggregation values”. The main reason to use a

standard test time of 6 minutes, which usually does not allow to finish aggregation reaction,

seems to be the reduced analysis time.

The main limitation of our study is the lack of a reference method in the first

experiment. Therefore, it is undefined whether the results below or above the reference range

actually represent true or false positive results. Therefore, we performed a second experiment

based on sample material from clopidogrel-treated dogs. Clopidogrel is a potent, non-

competitive inhibitor of the platelet ADP membrane receptor P2Y128 which irreversibly

inhibits the binding of ADP to its platelet membrane receptors. A significantly reduced ADP-

induced platelet aggregation was already described in dogs receiving clopidogrel at the

dosage which we administrated to the dogs in the present study.1 Therefore, it can be assumed

that all of the blood samples taken from treated dogs and measured with the agonist ADP

were below the reference values.

IV Manuskript I

47

The reduction of AA-induced aggregation in clopidogrel-treated dogs may be

surprising, but an influence of clopidogrel on arachidonic acid-induced aggregation was also

detected in human platelets.6,9 Although the inhibition is specific and does not significantly

affect cyclo-oxygenase (COX) or AA metabolism, clopidogrel can indirectly inhibit platelet

aggregation induced by agonists other than ADP by blocking the amplification of platelet

activation by released ADP. ADP binding is necessary for activation of the GPIIb/IIIa

receptor, which is necessary for linking different platelets together by fibrinogen to form the

platelet aggregate.10

In conclusion, the results of our study indicate that the influence of test time on the

validity of measurement results in canine whole blood aggregometry is minor, if

interpretation is performed based on test time-adjusted reference values. A reduction of test

time of canine plasma to 6 minutes – which corresponds to the recommendation in humans –

is possible and associated with at least the same validity as longer test times.

Sources and manufacturers

a. Clopidogrel AbZ 75 mg, AbZ-Pharma GmbH, Blaubeuren, Germany.

b. Thrombin Inhibitor blood collection tube 4.5 ml suited for Sarstedt® system, Dynabyte®

Informationssysteme GmbH; Munich, Germany

c Dynabyte Informationssysteme GmbH, Munich, Germany.

d. ADPtest, Dynabyte Informationssysteme GmbH, Munich, Germany.

e. COLtest, Dynabyte Informationssysteme GmbH, Munich, Germany.

f. ASPItest, Dynabyte Informationssysteme GmbH, Munich, Germany.

g. SPSS Inc., Chicago, USA.

IV Manuskript I

48

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IV Manuskript I

49

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IV Manuskript I

50

Table 1

Reference values of area under the curve (AUC; AU*min) values measured with the

Multiplate® analyser in 83 healthy dogs at different test times using different agonists.

agonist test time (Min) mean standard

deviation Quantiles

2.5 10 25 50 75 90 97.5

ADP 10 µmol/l

6 965 ± 228 498 681 797 972 1135 1309 1384

8 1479 ± 344 831 1035 1259 1485 1718 1988 2112

10 2022 ± 466 1241 1415 1648 2055 2346 2696 2931

12 2352 ± 577 1167 1548 1907 2393 2741 3139 3443

Collagen 5 µg/ml

6 1060 ± 174 662 845 937 1084 1169 1298 1378

8 1706 ± 265 1050 1379 1514 1739 1861 2060 2219

10 2402 ± 367 1490 1945 2113 2425 2640 2878 3134

12 2810 ± 436 1751 2275 2459 2836 3082 3332 3691

Arachidonic acid

1 mmol/l

6 879 ± 282 417 500 633 898 1091 1288 1450

8 1346 ± 422 630 770 978 1355 1681 1937 2192

10 1837 ± 572 857 1032 1348 1819 2257 2602 3024

12 2137 ± 687 997 1200 1557 2089 2580 3054 3630

IV Manuskript I

51

Table 2

Reference values of maximal aggregation (AU) values measured with the Multiplate®

analyser in 83 healthy dogs at different test times using different agonists.

agonist test time (Min) mean standard

deviation Quantiles

2.5 10 25 50 75 90 97.5

ADP 10 µmol/l

6 139 ± 32.0 78.6 96.7 115 140 160 183 200

8 151 ± 34.7 93.0 106 125 153 176 197 220

10 157 ± 35.5 96.3 111 128 159 186 203 226

12 160 ± 36.0 97.0 112 130 163 188 208 232

Collagen 5 µg/ml

6 172 ± 26.5 108 139 153 173 190 205 224

8 191 ± 30.2 121 152 169 193 213 226 253

10 201 ± 32.7 128 161 177 203 222 238 266

12 205 ± 33.8 129 165 179 205 226 243 271

Arachidonic acid

1 mmol/l

6 127 ± 38.9 52.7 73.4 96.8 126 155 177 208

8 137 ± 44.5 56.7 74.9 101 137 167 196 228

10 143 ± 44.6 61.1 85.1 108 141 178 203 237

12 146 ± 46.6 61.7 86.1 110 143 178 204 258

IV Manuskript I

52

a)

b)

c)

Fig. 1

Distribution of increased, normal and decreased area under the curve (AUC) results measured

with the Multiplate® analyser in 134 samples from 117 dogs with various diseases at 4

different test times. Measurements were performed with the agonists ADP (a), collagen (b)

and arachidonic acid (AA) (c).

IV Manuskript I

53

a)

b)

c)

Fig. 2

Distribution of increased, normal and decreased maximal aggregation results measured with

the Multiplate® analyser in 134 samples from 117 dogs with various diseases at 4 different

test times. Measurements were performed with the agonists ADP (a), collagen (b) and

arachidonic acid (AA) (c).

IV Manuskript I

54

0

500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

6 8 10 12Test time (minutes)

AUC

(AU

xmin

)

Fig. 3

Influence of test time on area under the curve (AUC) values (individual values, mean ±

standard deviation) of ADP-induced impedance aggregometry using the Multiplate® analyser

in 83 samples of healthy dogs and 8 samples from clopidogrel-treated dogs (reference values

are highlighted in grey)

IV Manuskript I

55


0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

Max

imal

agg

rega

tion

(AU

)

Fig. 4

Influence of test time on maximum aggregation values (individual values, mean ± standard

deviation) of ADP-induced impedance aggregometry using the Multiplate® analyser in 83

samples of healthy dogs and 8 samples from clopidogrel-treated dogs (reference values are

highlighted in grey)

IV Manuskript I

56

0

500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000


AUC

(AU

xmin

)

Fig. 5

Influence of test time on AUC values (individual values, mean ± standard deviation) of

arachidonic acid-induced impedance aggregometry using the Multiplate® analyser in 83

samples of healthy dogs and 8 samples from clopidogrel-treated dogs (reference values are

highlighted in grey)

IV Manuskript I

57

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

Max

imal

agg

rega

tion

(AU

)


Fig. 6

Influence of test time on maximum aggregation values (individual values, mean ± standard

deviation) of arachidonic acid-induced impedance aggregometry using the Multiplate®

analyser in 83 samples of healthy dogs and 8 samples from clopidogrel-treated dogs

(reference values are highlighted in grey)

V Manuskript II

58

Platelet function in dogs with inflammatory diseases

M. Abid, K. Kalbantner, R. Mischke*

Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, D-30559

Hannover, Germany

V Manuskript II

* Corresponding author. Tel.: +49 511 9536200

E-mail adress: [email protected] (R. Mischke)

mailto:[email protected]�

V Manuskript II

59

Abstract. The aim of this study was to examine the influence of inflammatory diseases on

primary haemostasis in dogs. Six different parameters were used for testing platelet function

in 25 dogs with bacterial or protozoal infections: capillary bleeding time, automatic platelet

function analysis (PFA 100, collagen/ adenosine diphosphate [ADP] and collagen/epinephrine

cartridges), turbidimetric platelet aggregation, impedance aggregometry using a multiple

electrode aggregometer, platelet count and haematocrit. Results of the 25 diseased dogs were

compared to the control group and additionally classified into two subgroups based on

criteria of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (groups “SIRS” and

“NonSIRS”) and compared among each other. The following findings were observed in dogs

with inflammatory diseases when compared to the control group: a significantly prolonged

closure time of the automatic platelet function analyser measured with both cartridges (e.g.

Col/ADP: 83 [55–301] s vs. 65 [47–99]; median [minimum–maximum]; P < 0.0001 ); a

significant decrease in maximal aggregation of the turbidimetric aggregometry induced with

adenosine diphosphate (ADP) (e.g. 40 µmol/L: 45.2 ± 26.8 % vs. 67.3 ± 21.8; mean ± SD; P

= 0.003) and collagen; a partly (conc 5 µg/mL) significant increase of collagen-induced

impedance aggregometry and significant suppression of arachidonic acid-induced impedance

aggregometry. A higher collagen-induced impedance aggregation was the only significant

differences between subgroups “SIRS” and “NonSIRS”.

The results of the present study indicate that, although individual tests indicate

enhanced platelet aggregation, most of the in vitro tests revealed a normal or minor to

moderately reduced functionality. The reduced aggregability may partly indicate that platelets

are already activated.

Keywords: platelet function, bacterial infection, protozoal infection, platelet aggregation,

SIRS, dog

V Manuskript II

60

Introduction

Inflammatory and infectious diseases are a frequent cause of thrombocytopenia in

dogs (Grindem et al., 1991; de Laforcade et al., 2003), but can also be associated with aquired

platelet function disorders. Different studies in dogs with certain infections investigated

platelet function mainly using only one individual method that often was the turbidimetric

aggregometry (Corona et al., 2004; Brandão et al., 2006). Other methods of primary

haemostasis that were studied included the capillary bleeding time (CBT) in dogs with

leishmaniosis (Moreno et al., 1998). In addition, the platelet function analyser was tested in an

experimental canine model of endoxemia (Yilmaz et al, 2005). The majority of these studies

on experimentally induced and naturally occurring inflammatory diseases revealed a decrease

in platelet function in vitro (Jacobs et al., 1986; Harrus et al., 1996; Valladares et al., 1998).

However, individual studies showed an increase of maximal aggregation in dogs with

heartworm infection (Boudreaux et al., 1989). Studies on human patients suffering from

sepsis also revealed contradictory results for the turbidimetric aggregometry (Gawaz et al.,

1997; Yaguchi et al., 2004).

Infectious diseases can effect primary haemostasis via different pathomechanisms

including an early and systemic activation of platelets, followed by agglutination and

consumption caused by binding of circulating immunocomplexes or complexes of clotting

factor A (an adhesive matrix molecule of gram positive bacteria) with fibrinogen and

antibodies (Loughman et al., 2005). Endotoxin can directly impair platelet function by

binding on platelet membranes (Saba et al., 1984; Salden and Bas, 1994) and by modification

of platelet receptors (Nystrom et al., 1994).

V Manuskript II

61

Regardless of aetiology, every severe and/or progressed inflammatory process can

lead to a distinct systemic reaction of the body of the patient. A systemic inflammatory

response syndrome (SIRS) indicates a severe, possibly life-threatening state that is often

associated with haemostatic disorders and requires a rapid therapeutic intervention (Hopper

and Bateman, 2005).

The aim of this study was to examine the influence of inflammatory diseases caused

by bacterial and protozoal infections on platelet function in dogs using different global tests

and specific methods including a novel impedance aggregometer. The results were compared

with those of a healthy control group and, additionally, the values of patients with and without

SIRS were compared.

Materials and methods

Study design

Platelet function of 25 dogs with different inflammatory diseases and a control group

of 27–69 clinically healthy dogs were tested by following methods: capillary bleeding time,

automatic platelet function analysis using the platelet function analyser PFA-100,

turbidimetric platelet aggregation according to Born, impedance aggregometry using the

Multiplate® analyser, platelet count and haematocrit. Due to heterogeneity of inflammatory

diseases, dogs were additionally classified into two groups based on criteria of systemic

V Manuskript II

62

inflammatory response syndrome (SIRS) (group “SIRS” and “NonSIRS”) and subgroups

were compared among each other.

The experimental protocol was approved by the competent ethics committee of the

responsible national agency (Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food

Safety, reference number 07A 514).

Animal selection

All dogs used in this study were patients of the Small Animal Clinic, University of

Veterinary Medicine Hannover. Selection criteria were the presence of a local or systemic

inflammatory disease caused by bacterial or protozoal infections, no treatment with any drug

influencing platelets and no other primary diseases. The inflammatory diseases included

abscesses (n=6; 2 at lateral thoracic wall, 2 at cervical region, 1 at the back, 1 at the

abdominal wall), leptospirosis (n=3), leishmaniasis (n=3), prostatitis (n=3), pyometra (n=3),

bronchopneumonia (n=3), pancreatitis (n=2), peritonitis (n=1) and sepsis (n=1).

The subgroup “SIRS” (n=15) included all animals fulfilling the criteria for a systemic

inflammatory response syndrome, i.e. 2 or more of the following findings were given: heart

rate > 120/min, respiratory rate > 20/min, rectal temperature < 38°C or > 39°C, white blood

cell count > 18.000 or < 5.000 (Hauptman et al., 1997). Group “NonSIRS” (n=10) included

all other animals. Group “SIRS” included dogs with abscesses (n=4), leptospirosis (n=2),

leishmaniasis (n=1), prostatitis (n=2), pyometra (n=1), bronchopneumonia (n=3), pancreatitis

(n=1) and sepsis (n=1). Group “Non-SIRS” included dogs with abscesses (n=2), leptospirosis

V Manuskript II

63

(n=1), leishmaniasis (n=2), prostatitis (n=1), pyometra (n=2), pancreatitis (n=1) and

peritonitis (n=1).

There were 15 bitches, three of them neutered and 10 male dogs, including a neutered

one. Age ranged from nine months to twelve years, with a median of 5 years and 10 months.

Following breeds were represented: four mongrels, two German Shepherds, two Beagles, two

Golden Retrievers and one of each of the following breeds: Airedale Terrier, Bracke, Small

Munsterlander, Border Collie, Gordon Setter, Briard, Entlebucher Mountain Dog, American

Staffordshire Terrier, Alano, Rhodesian Ridgeback, Hovawart, French Mastiff, Labrador

Retriever, Norfolk Terrier, Doberman and American Cocker Spaniel.

The control group consisted of clinically healthy, private-owned dogs of different

gender, age and breed. Their number varied between the different methods (capillary

bleeding: n = 47, PFA-100: n = 41, turbidimetric method: n = 27, impedance aggregometry: n

= 65, platelet count and haematocrit = 69).

Blood sample collection

Blood samples were taken from the saphenous, cephalic or jugular vein using sterile

disposable needles (1.2 x 40 mm). Gentle pressure was used to raise the vein to minimise

stress for the platelets. Blood was collected into several plastic tubes (Sarstedt): a) 3,8 mL

tubes covered with buffered citrate solution (0.129 mol/L trisodium citrate/citric acid buffer

solution pH 5.5) used for the platelet function analyser PFA-100, b) 10 mL tubes containing 1

mL of 0.11 mol/L citrate solution (one part for nine parts of blood) for preparation of platelet

V Manuskript II

64

rich plasma (PRP) required for the turbidimetric aggregometry, c) 4,5 mL hirudin-coated

tubes (Dynabyte Medical) for impedance aggregometry measurements by Multiplate

Analyzer and d) 1,3 mL tubes covered with EDTA for blood count. Blood and anticoagulant

were immediately thoroughly mixed by careful swaying. Platelet function analysis was

performed between 30 minutes and 3 hours after blood sample collection, as recommended

for human blood. During this period of time, blood was stored at room temperature and

swayed carefully just before starting the measurement.

For the preparation of PRP whole blood was centrifugated at 250 x g for 15 min at

room temperature. Platelet count of the separated supernatant was measured using an

automatic blood cell counter (ADVIA 120, Siemens Healthcare Diagnostics) and, if

necessary, diluted or concentrated to 150 x 10³ platelets/µL. Part of the plasma was converted

in 1.3 ml plastic tubes and centrifugated again for ten min at 16,000 x g to achieve platelet

free plasma (PFP).

Capillary bleeding time

Capillary bleeding time (CBT) was measured according to the method described by

Nolte et al. (1997). The non-anaesthetized dogs were brought in lateral position and two

punctures were set on the lateral side of a front toe close to the edge of the horny skin of the

pad using a sterile semi-automatic blood lancet (Softclix II, Roche Diagnostics). While steady

pressure was maintained, the occurring blood drops were dabbed off carefully every 15 s until

the bleeding stopped and average bleeding time was calculated from the two parallel

punctures.

V Manuskript II

65

Platelet function analyzer (PFA-100)

The platelet function analyzer PFA-100 (Siemens Healthcare Diagnostics) aspirates

whole blood under constant vacuum (40 mmHg) through a capillary to a membrane coated

with collagen and adenosine-5’-diphosphate (CADP cartridge) or collagen and epinephrine

(CEPI cartridge). This membrane has a central aperture on which the platelets form a

thrombus. The time required to completely close this aperture is reported as ‘closure time’ (in

s; maximal testing time: 300 s) and the consumption of blood as ‘total volume’ (in µL).

Measurements were performed as recommended by the manufacturer.

Turbidimetric platelet aggregation

The turbidimetric method according to Born (1962) was measured using an

aggregometer with four channels and computer-based curve analysis (APACT 4, Rolf Greiner

Biochemica) and is based on the recording of the changes in optical density after adding

agonists to PRP with a standardized platelet count (in this study: 150 x10³/µL). Every

channel was calibrated by using two standards. The first standard (100% aggregation,

corresponding to the light transmission of PFP) was achieved by adding 20 µL isotonic NaCl

to 200 µL PFP, the second standard (0% aggregation) was prepared by adding 20 µL isotonic

NaCl to 200 µL PRP. After incubation of 200 µL PRP for 2 min at 37 °C, aggregation was

induced by adding 20 µL platelet agonist containing solutions (Dynabyte) to achieve final

concentrations of 10, 20 or 40 µmol/L adenosine-5’-diphosphate (ADP) or 10, 20, 40 µg/mL

collagen. The maximum aggregation was recorded over 12 min and calculated automatically.

V Manuskript II

66

Impedance aggregometry

Impedance aggregometry measured with the Multiplate® analyser (Dynabyte GmbH)

was performed as recommended by the manufacturer (i.e., incubation of 300 µl isotonic

sodium chloride solution and 300 µl blood over 3 min and addition of 20 µl agonist solution)

with exception of the test time (12 min instead of 6 min). Three different aggregation

inducing agonists (Dynabyte GmbH) were used in the following final concentrations: 5, 10

and 20 µmol/L ADP, 3, 5 and 10 µg/mL collagen and 0.5 and 1 mmol/L arachidonic acid

(AA). Of the different parameters provided by the machine, the ‘area under the curve’ (AUC)

value (in aggregation units [AU]*min) was reported.

Haematocrit and platelet count

Haematocrit, whole blood and PRP platelet counts were measured automatically using

a blood cell counter (ADVIA120, Siemens Healthcare Diagnostics). The instrument detects

platelets and red blood cells using a double angle laser light scattering procedure after

isovolumetric sphering and calculates haematocrit based on red blood cell count and mean

cell volume.

Statistical analysis

Data were tested for standard normal distribution using Kolmogorov-Smirnov test.

Reference values were calculated based on 2.5% and 97.5% quantiles of the control group.

Group comparisons of parameters with normal distribution (impedance aggregometry, the

V Manuskript II

67

turbidometric method, capillary bleeding time, haematocrit and platelet count) were

performed with unpaired Student’s t tests. Owing to the censored data delivered by the

platelet function analyzer PFA-100, normal distribution could not be tested/was not present

and Mann-Whitney U test was used for group comparison. Measurements with a result of >

300 s were set to 301 s for statistical analysis. P–values < 0.05 were considered significant.

Statistical analysis was performed using SPSS 16.0 German (SPSS Inc.).

Results

There was no significant difference between the capillary bleeding time of the dogs

with inflammatory diseases and healthy dogs (Table 1). When compared to the reference

values, more dogs (6/25) had a shorter CBT than prolonged (3/25). Dogs with shortened CBT

included 2 patients with abscesses, two with prostatitis, one with pyometra and one with

bronchopneumonia, dogs with prolonged CBT included both dogs with pancreatitis and one

with leptospirosis.

A significantly prolonged PFA-100 closure time compared to the control group

measured with both CADP and CEPI cartridges was observed in dogs with inflammatory

diseases. Total volume was only significantly increased when using the CADP test cells. In

nearly half of the dogs (12/25), results (closure time and total volume) obtained with the

collagen/ADP cartridge exceeded the reference range. The 12 dogs with prolonged closure

time (CADP cartridge) included all 3 dogs with leishmaniosis, 2/3 dogs with leptospirosis, the

two dogs with pancreatitis, the dog with sepsis and the dog with peritonitis, but only 1/6 dogs

with abscesses, 1/3 dogs with prostatitis, and 1/3 dogs with pyometra. 7/12 patients with

V Manuskript II

68

prolonged closure time (CADP cartridge) had anaemia and/or thrombocytopenia. Dogs with

prolonged closure time (CADP cartridge) and normal haematocrit and platelet count included

one dog each with the following diagnoses: leptospirosis, leishmaniosis, pyometra, prostatitis,

and peritonitis.

Dogs with inflammatory diseases also showed a significantly reduced maximal

aggregation of turbidimetric platelet aggregation using different concentrations of ADP and

collagen. In addition, AUC values of AA-induced whole blood aggregation were significantly

lower in dogs with inflammatory diseases. Only whole blood aggregation induced by 5 µg/mL

collagen showed a slightly higher AUC values in dogs with inflammatory diseases. Platelet

count was not different between normal dogs and dogs with inflammatory disorders, but

haematocrit values were considerably lower.

In view of platelet function tests, the only significant difference between the

subgroups was a higher AUC value in whole blood aggregometry induced with 5 µg/ml

collagen in dogs with SIRS. Dogs with SIRS had also significantly lower platelet counts and

haematocrit values (Table 1).

Discussion

The results of our study indicate that dogs with inflammatory diseases have a

moderately impaired platelet function although individual tests (collagen-induced impedance

aggregometry) indicate hyperaggregability. The minor to moderate changes are not expressed

by changes of the capillary bleeding time that can be regarded as a global test of primary

V Manuskript II

69

haemostasis and may be a consequence of the heterogeneous patients and low sensitivity of

the test. Although the method undertakes some effort to standardize blood flow in the

puncture area (Nolte et al., 1997), the result is influenced by a wide range of possible

influencing factors resulting in a high inaccuracy of the method. Factors influencing the result

include factors of the animals (blood pressure, thickness of skin, vessel-wall structure and

distribution of capillaries) as well as technical aspects (amount of circulation promoting salve,

pressure applied when performing the puncture). The animal-derived factors can vary

between different breeds and individuals (Thomas et al., 1979; Forsythe et al., 1989).

In contrast to our study, Moreno et al. (1998) found a prolonged CBT in dogs naturally

infected with leishmania. In this study, dogs naturally infected with leishmania showed a

prolonged capillary bleeding time (mean 93.0 sec) when compared to healthy control dogs

(mean 143.0 sec; p = 0.02) (Moreno et al., 1998). However, the result that dogs with

leishmaniosis with increased creatinine values (> 1.5 mg/dL) had significantly longer CBTs

when compared to patients with normal creatinine values might indicate that the prolongation

is partially due to renal failure. This can also explain the discrepancy to the present study on a

heterogenous group of inflammatory diseases, because renal failure is a common finding in

leishmaniasis but does not obligatorily occur in other inflammatory diseases.

Closure times of PFA-100 were prolonged in dogs with inflammatory diseases,

regardless of the presence of SIRS, using the CADP and CEPI cartridge. This indicates a

reduced function of platelets to form an aggregate under high shear rates and is well in

confirmation with the results of platelet aggregation (under low shear rates). In confirmation

with these results, after a shortened closure time in the initial phase of 30 minutes, prolonged

V Manuskript II

70

closure times of CADP and CEPI cartridges were found in dogs suffering from

experimentally induced endotoxemia (Yilmaz et al., 2005). Whereas our two dogs with

pancreatitis had prolonged closure times, a human study on mild acute pancreatitis patients

detected shortened closure times for both cartridge types and concluded a an increased

adhesiveness and aggregation (Mimidis et al., 2004). This discrepancy can probably be

explained by a difference in the severity of the disease and possibly by a difference in the

stage of disease.

Significance of measurements using the CEPI cartridge are limited in individual

canine blood samples, because the reference range exceeds the upper measurement range of

300 s as a consequence of the limited sensitivity of canine platelets towards epinephrine

(Callan and Giger, 2001; Mischke and Keidel, 2003; Nielsen et al., 2007), that is confirmed

in the present study. Nevertheless, group comparison revealed a significant increase of the CT

measured with the CEPI cartridge in dogs with inflammatory diseases.

Interpretation of the test results of the platelet function analyser have always to be

performed with additional consideration of the platelet count and haematocrit values. Both

parameters influence significantly the test result (Callan and Giger, 2001; Mischke and

Keidel, 2003). Therefore the changes of the platelet function analyser which were found by

Yilmaz et al. (2005) following experimentally induced endotoxemia do not necessarily reflect

the damaging properties of endotoxin on platelet function, but may be mainly a consequence

of the remarkable parallel decrease of platelet count.

V Manuskript II

71

Our dogs with inflammatory diseases had significantly lower haematocrit values (39.7

± 8.3 % vs. 47.9 ± 4.1) and the tendency towards lower platelet counts (242 ± 117 vs. 294 ±

88 x 103/µL). Nevertheless, the influence of the haematocrit in our study seems to be limited,

because only minor changes were observed between haematocrit values of 40 and 48 %

(Callan and Giger, 2001), which represent the lower reference range of haematocrit in dogs.

These values are probably associated with very similar blood flow conditions and blood cell

distribution within the vessel, these factors are regarded as pathomechanisms for the

alterations of the results of the platelet function analyser in anaemic individuals (Dietrich et

al., 1995; Mischke and Keidel, 2003). The influence of platelet count seems also limited,

because only 6/25 dogs with inflammation had platelet counts below the reference range,

whereas changes of the platelet count within the reference range do not significantly influence

the test result (Mischke and Keidel, 2003).

In addition, increase of von Willebrand factor (vWF) concentration, which was not

measured in our patients but was probably increased in most of our dogs due to its role as an

acute phase reactant, adversely affects (i.e. shortens) closure time of the platelet function

analyser and, thereby, can mask impaired platelet function. Homoncik et al. (2000) detected

an 85 % increase of the vWF level after endotoxin injection to healthy humans which was

associated with a 38 and 47 % decrease of the CT measured by the CADP and CEPI cartridge,

respectively.

Decreased measurement signals of turbidimetric platelet aggregometry in dogs with

inflammatory diseases using agonists ADP and collagen are well in confirmation with the

results of several studies examining the influence of certain infections including leishmaniosis

V Manuskript II

72

and ehrlichiosis on platelet aggregation (Harrus et al., 1996; Corona et al., 2004; Brandão et

al., 2006). Similarly, dogs with experimentally induced acute pancreatitis showed a reduced

platelet aggregation using the turbidimetric method (Jacobs et al., 1986; Lukaszyk et al.,

1989). An increased platelet aggregation was only observed in the early phase after induction

of pancreatitis (Lukaszyk et al., 1989). Studies on human patients with sepsis mainly revealed

concordant results, i.e. decreased platelet aggregability (Saba et al., 1984; Yaguchi et al.,

2004; Woth et al., 2011). Yaguchi et al. (2004), for example, observed a decrease in platelet

aggregation in all septic patients (n=47) compared to controls, regardless of the agonist used.

Variable causes for platelet functional disorders in dogs with infectious diseases in

general and for decreased platelet aggregation in particular include damage of platelet

membrane receptors by infectious agents such as Leishmania, which also causes an immune-

mediated process (Corona et al., 2004). Anti-platelet antibodies could be identified in dogs

with infectious diseases such as leishmaniosis and ehrlichiosis and are supposed to interact

with platelet membrane glycoproteins (Harrus et al., 1996; Terrazzano et al., 2005; Dircks et

al. 2009).

Measurements of P-selectin expression indicate increased expression under

inflammatory conditions (Yeo et al., 1993; Moritz et al., 2005). P-selectin is a component of

α-granules and is expressed on the platelet surface after granule secretion (Mickelson, 1996).

This activation may lead to a refractory state regarding in vitro induction of platelet

aggregation by agonists (Moritz et al., 2005). These platelets appear to be hypofunctional in

in vitro aggregation assays and may contribute to the decreased signals of agonist-induced

platelet aggregation. Other authors also mention “exhausted platelets”, which represent

V Manuskript II

73

platelets after reversible interaction with vascular or intravascular substances in or near the

pancreas, or interaction of platelets with some circulating inhibit remain in the circulation

(O’Brien, 1978; Jacobs et al., 1986).

Endotoxin binding to platelets can impair platelet function via different

pathomechanisms including reduced mean adrenoreceptor density on the platelet membrane

causing reduced platelet responsiveness by epinephrine, reduced platelet conformational

changes, and an impaired calcium metabolism (Saba et al., 1984 ; Nystrom et al., 1994).

Gram positive bacteria also influence platelets, because adhesive matrix molecules such as

clotting factor A forms complexes with fibrinogen and antibodies which induce platelet

agglutination (Loughman et al., 2005).

Low platelet count can not only affect the analysis of the platelet function analyser,

but may also cause reduced agonist-induced platelet aggregation (Hanke et al., 2010). The

adjustment of platelet count in the turidimetric assay excludes a significant contribution of

platelet count to the significantly reduced test results of the turbidimetric assay in the present

study. In contrast, platelet count may have influenced the results of the impedance method,

but these differed significantly dependent on the agonist used making a significant influence

unlikely. In addition, thrombocytopenia was rare among the patients in the current study.

It has been suggested that there may be a general shift of platelet functionality under

inflammatory conditions/sepsis from haemostasis towards other functions (esp. within

inflammation) like vascular healing (Yaguchi et al., 2004). α-granules contain, beside

coagulation factors and adhesion proteins, growth factors, one of them is the vascular

endothelial growth factor (VEGF) (Maloney et al., 1998). Sepsis causes an alteration in α-

V Manuskript II

74

granule content manifested in an increased release of VEGF. That suggests a redistribution of

platelet function from hemostasis to tissue repair and vascular healing (Yaguchi et al., 2004).

The remarkable decrease of AA-induced whole blood aggregation, which we detected

in dogs with inflammatory diseases, regardless of the presence of SIRS is well in

confirmation with the observations made in a study by Lundahl et al. (1996) which revealed a

decreased capability of fibrinogen binding in response to AA in human intensive care patients

(among others patient with sepsis) and with observations made in a study by Yaguchi et al.

(2004) in human septic patients. In this study, the most severe sepsis-induced inhibition of the

turbidimetric platelet aggregation of approximately 50 % from the values of the reference

group, was seen for cycclooxygenase pathway induced with AA. AA is metabolized by COX-

1 to PGH2 which in high concentrations has inhibitory effects on platelet function (Quinn,

2005). Because inflammation is associated with an increased release of AA followed by an

increased production of prostaglandins, the further addition of AA may lead to much higher

concentration of PGH2 in the platelet than under physiological conditions.

Interestingly, collagen-induced whole blood aggregation, in contrast to collagen-

induced turbidimetric aggregation, was partly increased in dogs with inflammatory diseases

and in dogs with SIRS. Our observation is, however, in accordance with observations made in

a human study by Whitworth et al. (1989), who used ADP and collagen for inducing

aggregation in both turbidimetric and impedance measurements in patients with endotoxemia.

While collagen-induced aggregation was increased in impedance aggregometry, it was

decreased in the turbidimetric method. The discrepancy to other agonists may reflect the

specific activation mechanism of collagen after binding to the platelet collagen receptor

V Manuskript II

75

(adhesion). The fact that this phenomenon was only observed in impedance aggregometry

may indicate the role of other blood cells that are also influenced by inflammatory processes

and interaction between platelets and leukocytes or red blood cells, that are probably the main

reason for the discrepancies between the results of the turbidimetric method on PRP and

whole blood aggregometry on whole blood. In a current study, an increased number of

platelet-neutrophil aggregates were observed in dogs with SIRS (Dircks et al., 2011).

Unexpectedly, SIRS and Non-SIRS animals did not have systematic significant

differences which may be possible due to the heterogenous composition of patients included

in both groups. In a human study, platelet aggregation was more severely altered in patients

with severe sepsis than in those with uncomplicated sepsis (Yaguchi et al., 2004).

Conclusion

The results of the present study indicate that inflammatory diseases caused by bacterial

and protozoal infections have an inhibitory effect on platelet function in dogs. Significant

alterations of primary haemostasis are mainly associated with systemic infectious diseases

and less frequently observed in local processes (abscesses), but the presence of SIRS does not

seem to have a significant impact on the severity of the alterations.

Conflict of interest statement

None of the authors has any financial or personal relationships that could

inappropriately influence or bias the content of the paper.

V Manuskript II

76

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V Manuskript II

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V Manuskript II

80

Table 1 Different parameters of primary haemostasis (mean ± standard deviation or median, minimum-maximum) in dogs with various inflammatory diseases (n=25) in comparison to a healthy controls (n =27–65). Additional comparison of the dogs with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (n=15) and dogs without SIRS (n=10).

Parameter Units Reference range

1 Control Group

2 Inflam. diseases

Stat. comparison

(1,2)

3 SIRS

4 NonSIRS

Stat. comparison

(3,4)

Capillary bleeding time sec 45–124.5 74.4 ± 21.3

74.5 ± 46.5 0.988 74.6

± 52.7 74.5

± 41.5 0.998

Platelet function analysis

(PFA-100)

CADPa

CTb sec 47–98 65 (47–99)

83 (55–301) < 0.001 75

(55–301) 123

(57–301) 0.255

CADP TVc µL 231–303 263

(231–303) 300

(161–870) 0.025 297 (230–870)

314 (161–870) 0.846

CEPId

CT sec 73–301 152 (73–301)

301 (92–301) 0.013 301

(108–301) 301

(92–301) 0.531

CEPI TV µL 279–871 474

(278–871) 618

(140–872) 0.355 757 (300–872)

582 (140–871) 0.505

Maximum aggregation

(Turbidimetric aggregometry)

ADPe

40 µmol/L % 32.8 –118 67.3 ± 21.8

45.2 ± 26.8 0.003 41.0

± 19.5 51.6

± 35.8 0.461

ADP 20 µmol/L % 24.6–95.9 59.1

± 21.9 46.4

± 24.2 0.066 42.6 ± 17.5

52.1 ± 32.3 0.466

ADP 10 µmol/L % 19.7–78.7 49.0

± 16.5 36.3

± 21.1 0.025 32.7 ± 17.2

41.8 ± 26.3 0.358

Collagen 40 µg/mL % 36.2–92.9 75.4

± 15.4 58.2

± 23.3 0.004 51.6 ± 13.3

67.3 ± 31.2 0.213

Collagen 20 µg/mL % 43.8– 119 80.9

± 19.2 66.9

± 23.8 0.034 62.7 ± 11.9

72.8 ± 34.5 0.448

Collagen 10 µg/mL % 51.8 - 111 79.4

± 14.0 70.7

± 24.3 0.131 69.2 ± 14.4

72.8 ± 34.9 0.785

Area under the curve

(Impedance aggregometry)

ADP 20 µmol/L AU*min 1248–3380 2240

± 473 2221

± 1033 0.932 2221 ± 1177

2220 ± 831 0.997

ADP 10 µmol/L AU*min 1492–3483 2380

± 498 2285

± 1103 0.683 2301 ± 1319

2261 ± 735 0.931

ADP 5 µmol/L AU*min 662–3502 2193

± 623 2095 ± 983 0.644 2251

± 1147 1860 ± 653 0.290

Collagen 10 µg/mL AU*min 1568–3821 2650

± 482 3003

± 1200 0.165 3374 ± 1144

2446 ± 1108 0.056


± 416 3236

± 1113 0.043 3640 ± 1077

2630 ± 905 0.023


± 563 3066

± 1111 0.065 3279 ± 1192

2746 ± 945 0.248

AAf

1 mmol/L AU*min 1005–3493 2103 ± 654

1495 ± 848 < 0.001 1545

± 929 1419 ± 751 0.725

AA 0,5 mmol/L AU*min 727–2973 1975

± 650 1334 ± 778 < 0.001 1349

± 758 1311 ± 849 0.907

V Manuskript II

81

Continuation Table 1

Parameter Units Reference range

1 Control Group

2 Inflam. diseases

Stat. comparison

(1,2)

3 SIRS

4 NonSIRS

Stat. comparison

(3,4)

Platelet count 10³/µL 139–580 294 ± 88

242 ± 117 0.051 217

± 124 279

± 101 0.199

Haematocrit (%) 40.2–55.6 47.9 ± 4.1

39.7 ± 8.3 < 0.001 37.8

± 7.6 42.6 ± 8.8 0.159

a collagen/ADP cartridge; b closure time; c total volume; d collagen/epinephrine cartridge; e adenosine diphosphate; f arachidonic acid; g Kruskal-Wallis test; h significant t-test between groups

V Manuskript II

82

Table 2 Numer of decreased, normal (within reference values), and increased values of different parameters of primary haemostasis in dogs with various inflammatory diseases (n=25). Additional comparison of the dogs with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (n=15) and dogs without SIRS (n=10).

a collagen/ADP cartridge; b closure time; c total volume; d collagen/epinephrine cartridge; e adenosine diphosphate; f arachidonic acid

Parameter

Inflammatory diseases (n=25)

SIRS (n=15)

NonSIRS (n=10)

↓ = ↑ ↓ = ↑ ↓ = ↑

Capillary bleeding time 6 12 3 3 6 2 3 6 1

Platelet function analysis

(PFA-100)

CADPa

CTb 0 13 12 0 10 5 0 3 7

CADP TVc 2 11 12 1 8 6 1 3 6

CEPId

CT 0 25 0 0 15 0 0 10 0

CEPI TV 1 23 1 0 14 1 1 9 0

Maximum aggregation

(Turbidimetric aggregometry)

ADPe

40 µmol/L 6 14 0 3 9 0 3 5 0

ADP 20 µmol/L 5 15 0 3 9 0 2 6 0

ADP 10 µmol/L 4 15 1 3 9 0 1 6 1

Collagen 40 µg/mL 3 15 1 1 10 0 2 5 1

Collagen 20 µg/mL 3 16 0 1 10 0 2 6 0

Collagen 10 µg/mL 3 15 1 1 10 0 2 5 1

Area under the curve

(Impedance aggregometry)

ADP 20 µmol/L 6 17 2 5 8 2 1 9 0

ADP 10 µmol/L 6 16 3 5 7 3 1 9 0

ADP 5 µmol/L 2 21 2 2 11 2 0 10 0

Collagen 10 µg/mL 4 14 7 1 9 5 3 5 2

Collagen 5 µg/mL 2 12 11 1 5 9 1 7 2

Collagen 3 µg/mL 0 16 9 0 8 7 0 8 2

AAf

1 mmol/L 9 16 0 5 10 0 4 6 0

AA 0,5 mmol/L 6 18 1 3 11 1 3 7 0

Platelet count 6 19 0 6 9 0 0 10 0

Haematocrit 11 14 0 8 7 0 3 7 0

VI Übergreifende Diskussion

83


Mit der vorliegenden Arbeit konnte ein weiterer Beitrag zur Optimierung des

Multiplate® Aggregometers für seinen Einsatz in der Veterinärmedizin geleistet werden. Dies

ist insofern von klinischem Interesse, als dass die Vollblutaggregometrie entscheidende

Vorteile gegenüber der bisher gängigen Messung der Thrombozytenfunktion im PRP hat. So

entfällt die mit der Zentrifugation einhergehende Zellschädigung und artifizielle Veränderung

der Plättchenvolumen-Verteilung. Neben der damit verbundenen Zeitersparnis kann die

Aggregation außerdem in einem physiologischen Milieu stattfinden, da alle Blutbestandteile

vorhanden sind (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Auch die Messung von

ikterischen und lipämischen Proben, die im PRP zu erheblichen Problemen führt, ist mit dem

Impedanzaggregometer ohne Weiteres möglich (RAND et al. 2003).

Bereits zuvor wurde von KALBANTNER et al. (2010) die Eignung des Gerätes zur

Messung von Hundeblut geprüft. Dabei wurden Referenzwerte etabliert, verschiedene

Antikoagulantien getestet und optimale Konzentrationen der verschiedenen Agonisten

ausgearbeitet. Im methodischen Teil der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus der

Parameter „Messzeit“ überprüft. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Messzeit einen

signifikanten Einfluss auf die Messergebnisse des Multiplate® Aggregometers hat. Dies gilt

sowohl für die AUC als auch für die maximale Aggregation sowie für alle verwendeten

Agonisten. Die in dieser Studie verwendeten Agonisten wurden in den zuvor in der Studie

von KALBANTNER et al. (2010) eruierten optimalen Konzentrationen von 10 µmol/L ADP,

5 µg/mL Kollagen und 1 mmol/L AS verwendet. Diese Konzentrationen induzierten eine

maximale Aggregation bei minimalen interindividuellen Schwankungen. Da sich in der

Studie zeigte, dass die Agonisten Ristocetin und „Thrombin-Rezeptor aktivierendes Peptid 6“

(TRAP-6) keine zuverlässige Aggregation beim Hund induzieren konnten, wurde auf den

Einsatz dieser Agonisten verzichtet.

Aufgrund des Einflusses der Messzeit auf die Ergebnisse ist es notwendig,

Referenzwerte für die jeweilige Messzeit und den jeweiligen Parameter zu erstellen. Beim

Einsatz von an die Messzeit angepassten Referenzwerten scheint die Messzeit dann keinen

signifikanten Einfluss auf die Sensititvität und Spezifität der Messungen zu haben. Daher


84

kann eine kurze Messzeit von 6 min als ausreichend angesehen werden und weist offenbar

sogar eine geringfügig höhere Sensitivität auf.

Der Hersteller empfiehlt eine Messzeit von 6 min für humane Blutproben und dieser

Empfehlung wird in den meisten der humanmedizinischen Studien auch nachgekommen

(CALATZIS 2007; MUELLER et al. 2007; VON PAPE et al. 2007; CAN et al. 2010).

Abweichend davon wählten TÓTH et al. (2006) in ihrer Studie eine Messzeit von 5 min. Es

konnten weder in der human- noch in der veterinärmedizinischen verfügbaren Literatur

Studien gefunden werden, die systematisch verschiedene Messzeiten im Hinblick auf die

diagnostische Genauigkeit verglichen haben. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie

scheinen demnach auch für die Humanmedizin von Interesse.

Die in der früheren Studie von KALBANTNER et al. (2010) verwendete Messzeit von

12 min für canine Blutproben diente dazu, den Aggregationskurven das Erreichen eines

Plateaus zu ermöglichen. Dies macht es u.a. möglich, die wahre maximale Aggregation zu

ermitteln. Ein reduzierter Zeitaufwand scheint der Hauptgrund für die Anwendung einer 6-

minütigen Messzeit zu sein, die in der Regel die Aggregationsreaktion nicht zum Abschluss

kommen lässt.

Eine Einschränkung unserer methodischen Studie ist das Fehlen einer

Referenzmethode im ersten Teil des Experiments. Dadurch konnte nicht abschließend geklärt

werden, ob die ober- oder unterhalb des Referenzbereiches liegenden Ergebnisse wahr oder

falsch positiv sind. Aus diesem Grund haben wir ein zweites Experiment basierend auf

Probenmaterial von Clopidogrel-behandelten Hunden durchgeführt. Clopidogrel ist ein

potenter, nicht-kompetitiver Antagonist des thrombozytären ADP-Rezeptors P2Y12, der die

Bindung von ADP an seinen Plättchenmembranrezeptor irreversibel hemmt (MUELLER et

al. 2007).

Bereits zuvor wurde eine signifikant reduzierte ADP-induzierte

Thrombozytenaggregation bei Hunden beschrieben, die Clopidogrel in der von uns

verabreichten Dosierung erhielten (BRAINARD et al. 2010). Daher war anzunehmen, dass

alle Proben der behandelten Hunde, die mit dem Agonisten ADP gemessen wurden, unterhalb

des Referenzbereichs liegen, wie es auch in unserer Studie der Fall war. Die verminderte AS-

induzierte Aggregation der Clopidogrel-behandelten Hunde mag auf den ersten Blick


85

überraschend erscheinen, doch konnte derselbe Effekt auch bei humanen Thrombozyten

beobachtet werden (EDER et al. 2007; PENZ et al. 2010).

Obwohl die Hemmung der Aggregation durch Clopidogrel rezeptorspezifisch ist und

sich nicht deutlich auf die COX oder den AS-Metabolismus auswirkt, kann Clopidogrel

indirekt auch die durch andere Agonisten induzierte Aggregation hemmen, indem es die

Amplifikation der Thrombozytenaktivierung durch freigesetztes ADP blockiert. Die Bindung

von ADP ist notwendig, um die Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors zu induzieren, der die

Vernetzung der Thrombozyten untereinander durch Fibrinogenbrücken ermöglicht (SIESS

1989).

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse des ersten methodischen Teils unserer

Studie, dass der Einfluss der Messzeit auf die Aussagekraft der Messergebnisse der

Vollblutimpedanzaggregometrie bei Hunden gering ist, sofern die Interpretation der

Ergebnisse basierend auf Referenzwerten erfolgt, die spezifisch für die einzelne Messzeit

etabliert wurden. Die Verkürzung der Messzeit für Hundeblut auf 6 min – wie für humanes

Blut empfohlen - scheint daher möglich und geht mit einer mindestens gleichwertigen

Aussagekraft gegenüber längeren Messzeiten einher.

Das Multiplate® Aggregometer war auch Bestandteil des zweiten Teils der

vorliegenden Arbeit. Da die Untersuchungen zur Optimierung der Messzeit und zum Einfluss

entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion parallel stattfanden, wurde im

klinischen Teil eine Messzeit von 12 min vorerst beibehalten. Die Ergebnisse des zweiten

Teils dieser Arbeit zeigen, dass Hunde mit entzündlichen Erkrankungen oft eine mäßig

beeinträchtigte Thrombozytenfunktion aufweisen, auch wenn einzelne Tests ein gesteigertes

Aggregationsvermögen aufzeigten (Kollagen-induzierte Impedanzaggregometrie). Diese

geringfügigen bis moderaten Veränderungen wurden jedoch nicht im Rahmen der kapillären

Blutungszeit erfasst, die als Globaltest der primären Hämostase angesehen werden kann. Dies

ist vermutlich auf die Heterogenität der Patienten und die niedrige Sensitivität des Tests

zurückzuführen. Zwar erfolgt bei der Methode eine weitestgehende Standardisierung des

Blutflusses im Punktionsgebiet (NOLTE et al. 1997), doch werden die Ergebnisse durch eine

Bandbreite weiterer möglicher Faktoren beeinflusst, die zu einer relativ hohen

Messungenauigkeit der Methode führen. Zu diesen Faktoren gehören zum einen Tier-

abhängige Faktoren (Blutdruck, Hautdicke, Gefäßwandbeschaffenheit und Verteilung der


86

Kapillaren), die von Rasse zu Rasse und Hund zu Hund variieren können (THOMAS et al.

1979; FORSYTHE u. WILLIS 1989), und zum anderen technische Aspekte (Menge an

hyperämisierender Salbe, angewendeter Druck beim Setzen der Punktionen).

MORENO et al. (1998) beobachteten im Gegensatz zu unserer Studie eine verlängerte

kapilläre Blutungszeit bei Hunden mit Leishmaniose. Natürlich infizierte Hunde zeigten dabei

eine signifikant längere Blutungszeit (Mittelwert 93,0 sec) im Vergleich zur Kontrollgruppe

(143,0 sec, p = 0,02). Die signifikant längere Blutungszeit bei an Leishmaniose erkrankten

Hunden mit erhöhten Kreatininwerten (> 1,5 mg/dL) verglichen mit Patienten mit normalen

Kreatininwerten lässt jedoch vermuten, dass die Verlängerung zumindest teilweise durch ein

Nierenversagen bedingt war. Während Nierenversagen eine häufige Begleiterscheinung der

Leishmaniose ist, tritt es nicht zwangsläufig auch im Rahmen anderer entzündlicher

Erkrankungen auf. Dies erklärt die abweichenden Resultate unserer Studie, in der eine

größere Bandbreite an inflammatorischen Erkrankungen vertreten war.

Die Verschlusszeiten des Plättchenfunktionsanalysegerätes PFA-100 waren bei den

Hunden mit entzündlichen Erkrankungen für beide Messzelltypen verlängert, was eine

beeinträchtigte Fähigkeit der Thrombozyten zur Bildung eines Aggregates unter hohen

Scherkräften nahelegt. Dies steht in Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen der

Thrombozytenaggregation (unter niedrigen Scherkräften) und den Ergebnissen einer Studie,

die nach einer verkürzten Verschlusszeit (in den ersten 30 min) eine verlängerte

Verschlusszeit der CADP- und CEPI-Messzellen bei Hunden mit experimentell induzierter

Endotoxämie darlegen (YILMAZ et al. 2005). Während die zwei Hunde mit Pankreatitis in

unserer Studie eine verlängerte Verschlusszeit aufwiesen, konnte bei Patienten mit einer

milden akuten Pankreatitis in einer humanmedizinischen Studie eine verkürzte Verschlusszeit

für beide Messzelltypen festgestellt werden, die auf ein erhöhtes Adhäsion- und

Aggregationsvermögen der Plättchen zurückgeführt wurde (MIMIDIS et al. 2004). Diese

abweichenden Resultate können wahrscheinlich durch den unterschiedlichen Schweregrad

und möglicherweise auch durch ein unterschiedliches Stadium der Erkrankung erklärt

werden.

Die Aussagekraft der Ergebnisse von einzelnen Hundeblutproben bei Messungen mit

der CEPI-Messzelle ist eingeschränkt, da der Referenzbereich für Hundeblut die maximale

Messzeit von 300 s aufgrund der geringen Sensitivität caniner Thrombozyten für Epinephrin


87

überschreitet (CALLAN u. GIGER 2001; MISCHKE u. KEIDEL 2003; NIELSEN et al.

2007), was in unserer Studie bestätigt werden konnte. Dennoch zeigte der Gruppenvergleich

eine signifikant verlängerte Verschlusszeit bei Hunden mit entzündlichen Erkrankungen im

Fall der CEPI-Messzelle.

Bei der Interpretation der Messergebnisse des PFA-100 müssen immer auch der

Hämatokrit und die Thrombozytenzahl der Probe berücksichtigt werden. Beide Parameter

haben einen signifikanten Einfluss auf die Messergebnisse. So konnten CALLAN und GIGER

(2001) bei Hundeblutproben mit einer Thrombozytenzahl von < 100 x103/µL eine

Verlängerung der Verschlusszeit bei beiden Messzelltypen beobachten, die bei < 50 x103/µL

besonders deutlich ausgeprägt war. Eine Studie von MISCHKE und KEIDEL (2003) zeigte,

dass bereits ein Abfall des Hämatokrits von 40 % auf 30 % eine signifikante Verlängerung

der Verschlusszeit und Erhöhung des Gesamtvolumens verursacht. Aus diesem Grund

spiegeln die in der Studie von YILMAZ et al. (2005) beobachteten verlängerten

Verschlusszeiten bei Hunden mit experimentell induzierter Endotoxämie nicht zwangsläufig

die Schädigung der Thrombozytenfunktion durch Endotoxine wider, sondern sind wohl

hauptsächlich auf den deutlichen, zeitgleichen Abfall der Thrombozytenzahl zurückzuführen.

Die Hunde mit entzündlichen Erkrankungen in unserer Studie hatten einen signifikant

erniedrigten Hämatokrit (39,7 ± 8.3 % vs. 47,9 ± 4,1 % bei der gesunden Kontrolle) und eine

tendenziell erniedrigte Thrombozytenzahl (242 ± 117 vs. 294 ± 88 x 103/µL). Dennoch

scheint der Einfluss des Hämatokrits in unserer Studie begrenzt zu sein, da nur geringe

Unterschiede der PFA-100-Ergebnisse zwischen Hämatokritwerten von 40 und 48 %

beobachtet werden konnten (CALLAN u. GIGER 2001), die sich im unteren Referenzbereich

für Hunde bewegen. Diese Werte führen wahrscheinlich zu keinen bedeutenden

Veränderungen der Blutflussbedingungen und Verteilung der Blutzellen im Gefäß, welche als

entscheidende Faktoren der Pathomechanismen anzusehen sind, die eine Änderung der

Ergebnisse des PFA-100 bei anämischen Patienten verursachen (DIETRICH et al. 1995;

MISCHKE u. KEIDEL 2003). Auch die Thrombozytenzahl scheint in unserer Studie nur

einen begrenzten Einfluss gehabt zu haben, da lediglich 6 von 25 Hunden mit Entzündungen

eine Thrombozytenzahl unterhalb des Referenzbereichs aufwiesen und Schwankungen der

Thrombozytenzahl innerhalb des Referenzbereichs keinen signifikanten Einfluss auf die

Messergebnisse haben (MISCHKE u. KEIDEL 2003).


88

Ein weiterer Faktor, der im Rahmen der automatischen Plättchenfunktionsanalyse von

Interesse ist, ist die vWF-Konzentration, die bei unseren Patienten zwar nicht erfasst wurde,

aber wahrscheinlich aufgrund der Rolle des vWF als Akute-Phase-Protein bei den meisten

Hunden erhöht war. Die damit verbundene Verkürzung der Verschlusszeit kann – umgekehrt

zur Thrombozytopenie und Anämie – zur Maskierung einer beeinträchtigten

Thrombozytenfunktion führen, d.h. zu falsch negativen/normalen Werte trotz erworbener

Thrombozytenfunktionsstörung. So konnten HOMONCIK et al. (2000) nach einer Endotoxin-

Injektion bei gesunden Menschen einen 85 %igen Anstieg der vWF-Konzentration feststellen,

der mit einer 38 bzw. 47–%igen Verkürzung der Verschlusszeit bei der CADP- bzw. CEPI-

Messzelle einherging.

Die von uns gemessene erniedrigte ADP- und Kollagen-induzierte maximale

Aggregation der turbidimetrischen Aggregometrie bei Hunden mit entzündlichen

Erkrankungen bestätigt die Ergebnisse verschiedener Studien, die den Einfluss bestimmter

Infektionserkrankungen wie Leishmaniose und Ehrlichiose auf die Thrombozytenaggregation

untersucht haben (HARRUS et al. 1996a; CORONA et al. 2004; BRANDAO et al. 2006).

Ebenso zeigten Hunde mit experimentell induzierter akuter Pankreatitis eine reduzierte

Thrombozytenaggregation im Rahmen der turbidimetrischen Aggregometrie (JACOBS et al.

1986; LUKASZYK et al. 1989). Lediglich in der frühen Phase nach der induzierten

Pankreatitis konnte eine erhöhte Plättchenaggregation beobachtet werden (LUKASZYK et al.

1989). Auch Studien aus der Humanmedizin berichten von übereinstimmenden Ergebnissen

im Sinne eines beeinträchtigten Aggregationsvermögen der Thrombozyten bei Patienten mit

Sepsis (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al. 2004; WOTH et al. 2011). So konnten

YAGUCHI et al. (2004) beispielsweise eine im Vergleich zur Kontrollgruppe erniedrigte

Thrombozytenaggregation bei allen septischen Patienten (n=47), unabhängig vom

verwendeten Agonisten beobachten.

Eine mögliche Ursache für die Thrombozytenfunktionsstörung bei Hunden mit

Infektionserkrankungen im Allgemeinen und eine beeinträchtigte Thrombozytenaggregation

im Speziellen ist die Beschädigung der thrombozytären Membranrezeptoren durch infektiöse

Erreger wie Leishmanien, die darüber hinaus einen immunvermittelten Prozess induzieren

(CORONA et al. 2004). Anti-Plättchen-Antikörper konnten bei Hunden mit

Infektionskrankheiten wie Leishmaniose und Ehrlichiose identifiziert werden und stehen im


89

Verdacht mit den Membranglykoproteinen der Thrombozyten zu interagieren (HARRUS et

al. 1996; TERRAZZANO et al. 2006; DIRCKS et al. 2009).

Messungen der P-Selektin-Expression auf der Thrombozytenoberfläche zeigten eine

erhöhte Expression unter inflammatorischen Bedingungen (YEO et al. 1993; MORITZ et al.

2005). P-Selektin ist ein Bestandteil der α-Granula und wird nach der Degranulation auf der

Thrombozytenoberfläche exprimiert (MICHELSON 1996) und somit ein Marker für die

Plättchenaktivierung. Die im Rahmen entzündlicher Prozesse gesteigerte Aktivierung der

Thrombozyten führt wohlmöglich zu einem refraktären Zustand bezüglich einer Induktion der

Thrombozytenaggregation durch Agonisten in vitro (MORITZ et al. 2005). Diese

Thrombozyten erscheinen bei in vitro Aggregationsmessungen hypofunktional und könnten

dadurch für die erniedrigten Ergebnisse der Agonist-induzierten

Thrombozytenaggregationsmessung verantwortlich sein. Andere Autoren berichten von

„erschöpften Thrombozyten“, bei denen es sich um Plättchen handelt, die nach einer

reversiblen Interaktion mit vaskulären oder intravaskulären Substanzen im oder in der Nähe

des Pankreas oder nach einer Interaktion mit einem nicht näher definierten zirkulierenden

Inhibitor in der Zirkulation verbleiben (O’BRIEN 1978; JACOBS et al. 1986).

Die Bindung von Endotoxinen kann über verschiedene Pathomechanismen zu einer

Beeinträchtigung der Thrombozytenfunktion führen. So induzieren Endotoxine zum einen

eine reduzierte mittlere Adrenorezeptoren-Dichte auf der Plättchenmembran, die ein

vermindertes Ansprechen der Thrombozyten auf Epinephrin verursacht und zum anderen

bewirken sie eine herabgesetzte Konformationsänderung und einen beeinträchtigten

Kalziummetabolismus (SABA et al. 1984; NYSTROM et al. 1994). Grampositive Bakterien

können Thrombozyten über adhäsive Matrixmoleküle wie den ClF A beeinflussen, indem

dieser Komplexe mit Fibrinogen und spezifischen Antikörpern bildet, die eine

Thrombozytenagglutination induzieren (LOUGHMAN et al. 2005).

Niedrige Thrombozytenzahlen beeinflussen nicht nur die Messungen mit dem PFA-

100, sondern können ebenso eine verminderte Agonist-induzierte Thrombozytenaggregation

verursachen (HANKE et al. 2010). Die Einstellung der Plättchenzahl im PRP für die

turbidimetrische Aggregometrie schließt eine Beteiligung der Thrombozytenzahl an den

signifikant erniedrigten Messergebnissen bei dieser Methode aus. Im Gegensatz dazu kann die

Thrombozytenzahl die Ergebnisse der Impedanzaggregometrie theoretisch zwar durchaus


90

beeinflussen (MENGISTU et al. 2009), doch scheint dies unwahrscheinlich, da nicht bei allen

Agonisten signifikante Unterschiede festgestellt werden konnten. Außerdem wiesen nur

wenige Patienten in der vorliegenden Studie eine Thrombozytopenie auf.

YAGUCHI et al. (2004) vermuteten eine allgemeine Verschiebung der

Thrombozytenfunktion unter inflammatorischen bzw. septischen Bedingungen von der

Hämostase in Richtung anderer Funktionen wie z.B. Gefäßheilung. Die α-Granula enthalten

neben Gerinnungsfaktoren und Adhäsionsproteinen, auch Wachstumsfaktoren, zu denen u.a.

auch der vascular endothelial growth factor (VEGF) gehört (MALONEY et al. 1998). Im

Rahmen einer Sepsis kommt es zu Veränderungen in der Zusammensetzung des α-Granula-

Inhaltes, die sich in einer erhöhten Freisetzung von VEGF manifestieren. Dies lässt eine

Umorientierung der Plättchenfunktion von der Hämostase hin zur Gewebereparatur und

Gefäßheilung vermuten (YAGUCHI et al. 2004).

Die auffallende Verminderung der AS-induzierten Vollblutaggregation bei Hunden

mit entzündlichen Erkrankungen bestätigt Beobachtungen, die sowohl in einer Studie von

LUNDAHL et al. (1996) gemacht wurden, bei der ein vermindertes Fibrinogen-

Bindungsvermögen der Plättchen von Intensivpatienten (u.a. mit Sepsis) gezeigt werden

konnten als auch in einer Studie von YAGUCHI et al. (2004) mit septischen Menschen. In

dieser Studie konnte die stärkste Sepsis-induzierte Hemmung der turbidimetrischen

Thrombozytenaggregation um bis zu 50 % bezogen auf die Kontrollgruppe bei der AS-

induzierten Aggregation gemessen werden. AS wird über die COX-1 in PGH2 metabolisiert,

das in hohen Konzentrationen einen inhibitorischen Effekt auf die Thrombozytenfunktion hat

(QUINN 2005). Da es im Rahmen von Entzündungsprozessen zu einer gesteigerten

Freisetzung von AS gefolgt von einer gesteigerten Prostaglandinproduktion kommt, kann die

weitere Zugabe von AS während der Aggregometrie eine wesentlich höhere PGH2-

Konzentration in der Umgebung des Thrombozyten als unter physiologischen Bedingungen

verursachen.

Interessanterweise war die Kollagen-induzierte Aggregation im Vollblut im Gegensatz

zur Kollagen-induzierten turbidimetrischen Aggregation teilweise bei Hunden mit

entzündlichen Erkrankungen und bei Hunden mit SIRS signifikant erhöht. Diese Beobachtung

steht in Übereinstimmung mit den Ergebnissen einer humanmedizinischen Studie von

WHITWORTH et al. (1989), die für die Messung von Proben endotoxämischer Patienten


91

ADP und Kollagen zur Aggregationsinduktion bei beiden Methoden verwendeten. Während

die Kollagen-induzierte Aggregation der Impedanzaggregometrie erhöht war, zeigte sich bei

der turbidimetrischen Aggregometrie eine erniedrigte Aggregation. Die Diskrepanz zu den

anderen Agonisten spiegelt möglicherweise den spezifischen Aktivierungsmechanismus von

Kollagen nach Bindung an den thrombozytären Kollagenrezeptor wider. Die Tatsache, dass

dieser Effekt nur bei der Impedanzaggregometrie beobachtet werden konnte, lässt die

Beteiligung anderer Blutzellen vermuten, die ebenso durch entzündliche Prozesse beeinflusst

werden. Einer der Hauptgründe für die abweichenden Ergebnisse der Messung im PRP und

um Vollblut könnte demnach in der Interaktion der Thrombozyten mit Leukozyten oder

Erythrozyten liegen. In einer aktuellen Studie konnte eine erhöhte Anzahl von Thrombozyten-

Neutrophilen-Aggregaten bei Hunden mit SIRS nachgewiesen werden (DIRCKS et al. 2011).

Überraschenderweise gab es keine systematischen signifikanten Unterschiede

zwischen den Gruppen „SIRS“ und „NonSIRS“, was wohlmöglich auf die heterogene

Zusammensetzung der Patienten in beiden Gruppen zurückzuführen ist. In einer

humanmedizinischen Studie konnte gezeigt werden, dass die

Thrombozytenaggregationhemmung bei Patienten mit ernster Sepsis stärker ausgeprägt war

als bei solchen mit unkomplizierter Sepsis (YAGUCHI et al. 2004).

Die Ergebnisse des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit zeigen zusammenfassend,

dass entzündliche Erkrankungen, die durch bakterielle und protozoische Infektionen

hervorgerufen wurden, einen inhibitorischen Effekt auf die Thrombozytenfunktion von

Hunden haben. Signifikante Veränderungen der primären Hämostase sind hauptsächlich mit

systemischen Infektionserkrankungen assoziiert und seltener bei lokalen Prozessen, wie z.B.

Abszessen, zu beobachten. Das Vorliegen eines SIRS scheint jedoch keinen signifikanten

Einfluss auf die Ausprägung der Veränderungen zu haben. Weiterführende Untersuchungen

unter Einbeziehung größerer Zahlen von Patienten mit definerten Infektionserkrankungen in

verschiedenen Stadien und zusätzlicher Berücksichtigung von Entzündungsparametern wären

lohnend.

VII Zusammenfassung

92

VII Zusammenfassung

Monia Abid (2011)

Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei Hunden mit inflammatorischen Erkrankungen

und Optimierung der Messzeit des Multiplate® Aggregometers

Im ersten Teil dieser Dissertation wurde der Einfluss der Messzeit auf die

Referenzwerte und die Aussagekraft der Ergebnisse des Multiplate® Aggregometers, einem

relativ neuen Impedanzaggregometer, bei Hunden untersucht. Da es für den Einsatz in der

Humanmedizin entwickelt wurde, fand kürzlich in einer vorangegangenen Studie eine

Evaluierung des Gerätes für Hundeblut statt, bei der eine Messzeit von 12 min verwendet

wurde, die von der Empfehlung des Herstellers (6 min für humanes Blut) abweicht. Basierend

auf Blutproben von 83 klinisch gesunden Hunden wurden Referenzwerte für verschiedene

Messzeiten (6, 8, 10 und 12 min) für die Parameter „area under the curve“ (AUC) und

maximale Aggregation ermittelt. Die Messergebnisse von 134 Proben von 117 Hunden mit

diversen Erkrankungen und 8 Proben mit verminderter Thrombozytenfunktion aufgrund einer

Behandlung mit dem Plättchenaggregationshemmer Clopidogrel wurden zu den

verschiedenen Messzeiten ausgewertet und in erniedrigt, normal und erhöht eingeteilt. Zum

Einsatz kamen drei verschiedene aggregationsinduzierende Agonisten in ihren optimalen

Konzentrationen: Adenosindiphosphat (ADP, 10 µmol/L), Kollagen (5 µg/mL) und

Arachidonsäure (AS, 1 mmol/L). Es konnte eine signifikante Erhöhung der maximalen

Aggegations- und AUC-Werte bei den gesunden Kontrollen mit steigender Messzeit

beobachtet werden. Mittels Chi-Quadrat Test ergaben sich für keinen Agonisten signifikanten

Unterschiede zwischen den verschiedenen Messzeiten in Bezug auf die Anzahl der erhöhten

und erniedrigten Messergebnisse bei den Patientenproben. Alle Proben der mit Clopidogrel

behandelten Hunde, die mit dem Agonisten ADP gemessen wurden, wiesen erniedrigte AUC-

Werte bei allen Messzeiten auf. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Messzeit einen

signifikanten Einfluss auf die maximalen Aggregations- und AUC-Werte hat, der Einfluss auf

die Sensitivität der Messergebnisse von Hundeblut bei diesem Gerät aber begrenzt ist.

VII Zusammenfassung

93

Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, den Einfluss entzündlicher

Erkrankungen auf die primäre Hämostase beim Hund zu untersuchen. Dazu wurden sechs

verschiedene Parameter zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion bei 25 Hunden mit

bakteriellen und protozoischen Infektionen verwendet: kapilläre Blutungszeit, automatische

Plättchenfunctionsanalyse (PFA 100: Kollagen/ADP [CADP] und Kollagen/Epinephrin

[CEPI] Messzellen), turbidimetrische Thrombozytenaggregation (mit Agonisten ADP und

Kollagen), Impedanzaggregometrie (mit Agonisten ADP, Kollagen und AS) mit einem

multiplen Elektrodenaggregometers, Thrombozytenzahl und Hämatokrit. Die Ergebnisse der

25 erkrankten Hunde wurden mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Darüber hinaus

wurden die erkrankten Tiere basierend auf Kriterien des systemischen inflammatorischen

Response-Syndroms (SIRS) in zwei Untergruppen eingeteilt (Gruppe „SIRS“ und

„NonSIRS“) und miteinander verglichen.

Im Vergleich zur Kontrollgruppe ergab sich bei den Hunden mit entzündlichen

Erkrankungen eine signifikant verlängerte Verschlusszeit der automatischen

Plättchenfunktionsanalyse bei beiden Messzelltypen (z.B. CADP: 83 [55–301] sec vs. 65 [47–

99] sec; Median [Minimum–Maximum]; P < 0,0001). Dabei wiesen 12 der 25 Hunde eine

verlängerte Verschlusszeit auf (Kol/ADP-Messzelle), darunter alle Hunde mit Leishmaniose,

2/3 Hunden mit Leptospirose, alle Hunde mit Pankreatitis, der Hund mit Sepsis und der Hund

mit Peritonitis, aber nur 1/6 Hunden mit Abszessen, 1/3 Hunden mit Prostatitis und 1/3

Hunden mit Pyometra. 7 der 12 Patienten mit verlängerter Verschlusszeit (CADP-Messzelle)

litten unter einer Anämie und/oder eine Thrombozytopenie. Es konnte eine signifikante

Verminderung der maximalen Aggregation der erkrankten Hunde bei der ADP- und

Kollagen-induzierten turbidimetrischen Aggregometrie beobachtet werden (z.B. 40 µmol/L

ADP: 45,2 ± 26,8 % vs. 67,3 ± 21,8; Mittelwert ± Standardabweichung; P = 0,003). Des

Weiteren ergab sich bei den Tieren mit entzündlichen Erkrankungen eine zum Teil signifikant

erhöhte Kollagen-induzierte (5 µg/mL Kollagen) und signifikant erniedrigte AS-induzierte

Aggregation im Rahmen der Impedanzaggregometrie. Der einzige signifikante Unterschied

zwischen den Untergruppen „SIRS“ und „NonSIRS“ zeigte sich in einer höheren Kollagen-

induzierten Impedanzaggregation der „SIRS“-Gruppe.

Die Ergebnisse des zweiten Teils dieser Arbeit zeigen, dass die meisten in vitro

Methoden eine normale oder geringgradige bis moderate Beeinträchtigung der

VII Zusammenfassung

94

Thrombozytenfunktion aufzeigen, auch wenn einzelne Tests eine gesteigerte

Thrombozytenaggregation erkennen lassen. Das reduzierte Aggregationsvermögen könnte

neben schädigenden Einflüssen der Infektionen teilweise auch zum Ausdruck bringen, dass

die Thrombozyten bereits in vivo aktiviert wurden.

VIII Summary

95

VIII Summary

Monia Abid (2011)

Measurement of platelet function in dogs with inflammatory diseases and optimization

of test time of the Multiplate® analyser

In the first part of this study the influence of test time on reference values and on the

validity of measurement results of the Multiplate® analyser, a relatively new impedance

aggregometer, in canine blood was determined. As designed for human medicine, the device

was recently evaluated for canine blood in a previous study using a test time of 12 min which

deviates from the recommendation of the manufacturer (6 min for human blood). Based on

blood samples of 83 healthy dogs, reference values for different test times (6, 8, 10 and 12

min) were established for maximum aggregation and area under the curve (AUC) values. The

results of 134 samples of 117 dogs with various diseases and 8 samples with reduced platelet

function owing to treatment with the platelet aggregation inhibitor clopidogrel were

calculated at the different test times and classified as decreased, normal or increased. Three

different aggregation inducing agonists in their optimal concentrations were used: adenosine

diphosphate (ADP, 10 µmol/L), collagen (5 µg/mL) und arachidonic acid (AA, 1 mmol/L).

Maximum aggregation and AUC values increased significantly in the healthy control group

with increasing test time. Chi-square test did not show significant differences between the

various test times with regard to the number of increased and decreased measurement result of

the patients for any agonists. All samples of dogs treated with clopidogrel and measured with

the agonist ADP revealed decreased AUC values at any time point. The results of our study

indicate that test time significantly influences absolute maximum aggregation and AUC

values, but has limited influence on sensitivity of measurement results of canine blood using

the investigated instrument.

The aim of the second part of our study was to examine the influence of inflammatory

diseases on primary haemostasis in dogs. Six different parameters were used for testing

platelet function in 25 dogs with bacterial or protozoal infections: capillary bleeding time,

automatic platelet function analysis (PFA 100: collagen/ADP [CADP] and

VIII Summary

96

collagen/epinephrine [CEPI] cartridges), turbidimetric platelet aggregation (with agonists

ADP and collagen), impedance aggregometry (with agonists ADP, collagen and AA) using a

multiple electrode aggregometer, platelet count and haematocrit. Results of the 25 diseased

dogs were compared to the control group and additionally classified into two subgroups

based on criteria of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (groups “SIRS” and

“NonSIRS”) and compared among each other.

Compared to the control group, a significantly prolonged closure time of the automatic

platelet function analyser measured with both cartridges (e.g. CADP: 83 [55–301] sec vs. 65

[47–99] sec; median [minimum–maximum]; P < 0.0001) was observed in dogs with

inflammatory diseases. There were 12 of the 25 dogs with prolonged closure time

(collagen/ADP cartridge) which included all dogs with leishmaniosis, 2/3 dogs with

leptospirosis, all dogs with pancreatitis, the dog with sepsis and the dog with peritonitis, but

only 1/6 dogs with abscesses, 1/3 dogs with prostatitis, and 1/3 dogs with pyometra. 7/12

patients with prolonged closure time (CADP cartridge) had anaemia and/or

thrombocytopenia. There was a significant decrease in maximal aggregation of the

turbidimetric aggregometry induced with ADP (e.g. 40 µmol/L: 45.2 ± 26.8 % vs. 67.3 ±

21.8; mean ± SD; P = 0.003) and collagen in dogs with inflammatory diseases. Furthermore, a

partly (conc 5 µg/mL) significant increase of collagen-induced impedance aggregometry and

significant suppression of AA-induced impedance aggregometry was observed in these dogs.

A higher collagen-induced impedance aggregation of groupe “SIRS” was the only significant

differences between subgroups “SIRS” and “NonSIRS”.

The results of the present study indicate that, although individual tests indicate

enhanced platelet aggregation, most of the in vitro tests revealed a normal or minor to

moderately reduced functionality. The reduced aggregability may partly indicate that platelets

are already activated.

IX Literaturverzeichnis

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X Tabellarischer Anhang

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Tab. A1: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) von 83 klinische gesunden

Hunden gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer Messzeit von 6, 8, 10 und

12 min. Zum Einsatz kamen die Agonisten Adenosindiphosphat (ADP, 10 µmol/L), Kollagen

(5 µg/mL) und Arachidonsäure (AS, 1 mmol/L).

Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

1 891 1373 1896 2209 1167 1861 2607 3048 948 1443 1967 2278 2 753 1147 1564 1819 937 1454 2003 2284 866 1313 1787 2070 3 1363 2119 2945 3448 1226 2012 2895 3435 413 623 852 995 4 978 1521 2126 2502 1119 1804 2553 3005 1088 1682 2326 2713 5 901 1375 1883 2186 880 1380 1929 2199 818 1247 1717 2004 6 1214 1872 2576 2999 1077 1667 2314 2682 1124 1708 2346 2739 7 617 934 1275 1481 660 1026 1423 1636 605 918 1258 1463 8 732 1125 1537 1790 1040 1671 2357 2770 907 1435 2029 2377 9 665 1031 1431 1671 680 1163 1701 2017 652 1014 1401 1628 10 1142 1695 2286 2646 1104 1805 2564 2957 1090 1660 2260 2611 11 1122 1713 2333 2702 1229 1951 2717 3142 603 932 1271 1469 12 1386 2047 2731 3133 1179 1878 2640 3103 575 888 1226 1424 13 937 1485 2077 2423 942 1521 2132 2459 1014 1559 2128 2456 14 862 1361 1910 2248 860 1422 2061 2441 913 1433 1995 2345 15 941 1373 1809 2063 1180 1851 2575 2961 801 1195 1595 1831 16 972 1519 2123 2487 1142 1826 2543 2956 1162 1811 2524 3840 17 1049 1631 2244 2606 887 1536 2273 2683 1033 1603 2195 2542 18 974 1499 2056 2393 1087 1750 2436 2809 956 1522 2153 2548 19 808 1267 1769 2076 846 1360 1917 2222 858 1361 1922 2279 20 994 1498 2052 2393 1278 2010 2788 3232 451 725 1010 1170 21 919 1515 2163 2539 1164 1892 2677 3141 658 1062 1491 1737 22 690 1091 1518 1763 1033 1747 2544 2969 524 845 1194 1388 23 1516 2270 3065 3547 1349 2060 2808 3255 1149 1691 2245 2571 24 1208 1854 2529 2934 1274 2062 2896 3325 587 909 1266 1484 25 903 1282 1648 1862 1064 1668 2292 2648 956 1380 1791 2031 26 856 1330 1838 2136 984 1584 2243 2553 473 757 1064 1245 27 851 1279 1707 1951 928 1467 2043 2374 1165 1813 2497 2904 28 715 1111 1530 1776 1041 1763 2575 3073 942 1508 2128 2511 29 280 426 582 783 708 1313 2007 2402 750 1158 1603 1872 30 974 1481 2018 2327 1108 1689 2281 2590 1288 1897 2445 2718 31 1131 1718 2358 2754 1131 1808 2578 2976 1325 2020 2772 3230 32 1344 2003 2674 3068 1378 2141 2960 3460 1437 2194 2988 3457 33 1157 1735 2352 2731 834 1389 1999 2361 1391 2170 3028 3560


120

Fortsetzung 1 Tab. A1:

Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

34 1137 1762 2420 2813 1099 1708 2367 2767 1039 1539 2028 2301 35 667 1020 1405 1637 819 1321 1860 2134 572 906 1273 1493 36 749 1179 1642 1914 956 1574 2236 2604 637 976 1328 1522 37 765 1169 1589 1835 1119 1810 2534 2954 1108 1633 2137 2429 38 1148 1716 2320 2685 1099 1735 2424 2836 1340 2032 2752 3179 39 950 1473 2022 2354 873 1408 1993 2338 1013 1584 2170 2511 40 728 1134 1561 1806 1245 2005 2822 3269 575 808 1011 1113 41 932 1410 1926 2229 954 1474 2013 2322 658 1023 1423 1661 42 1207 1871 2532 2900 1104 1837 2610 2919 472 690 897 1011 43 947 1479 2055 2406 1105 1765 2482 3074 1152 1768 2420 2805 44 1338 2051 2801 3250 1252 2022 2835 3315 1164 1829 2542 2970 45 778 1190 1620 1156 962 1524 2120 2479 892 1355 1821 2089 46 992 1516 2065 1265 1429 2200 3019 3516 1332 1964 2628 3026 47 797 1260 1729 3397 908 1514 2189 2602 692 1153 1639 1919 48 855 1298 1752 2942 875 1378 1913 2237 898 1312 1685 1883 49 675 1015 1374 2430 1330 2059 2830 3296 538 882 1268 1499 50 1032 1548 2069 1989 825 1407 2047 2442 502 751 1004 1156 51 851 1296 1775 1525 857 1394 1966 2315 956 1461 1989 2304 52 1002 1526 2084 2426 1169 1752 2352 2704 1060 1594 2150 2478 53 981 1527 2114 2473 1017 1676 2398 2833 844 1306 1789 2072 54 1330 2046 2750 3143 1155 1885 2643 3082 633 989 1348 1557 55 652 989 1344 1553 1252 1931 2624 3033 906 1347 1792 2045 56 741 1169 1631 1907 844 1368 1931 2269 735 1082 1424 1621 57 1066 1674 2322 2708 1077 1714 2391 2803 1091 1685 2309 2683 58 817 1259 1758 2075 937 1556 2212 2599 965 1502 2052 2365 59 951 1461 1999 2320 1301 2055 2852 3337 1116 1690 2257 2580 60 991 1596 2252 2651 982 1660 2373 2799 576 980 1427 1703 61 1175 1764 2346 2680 1010 1785 2643 3157 460 691 933 1072 62 828 1264 1726 2005 939 1497 2083 2430 746 1187 1684 1992 63 1135 1726 2344 2711 947 1526 2157 2545 1000 1492 1977 2250 64 990 1524 2062 2362 1175 1926 2713 3187 577 892 1209 1402 65 1304 2031 2779 3213 923 1563 2292 2750 655 962 1265 1437 66 1216 1887 2604 3035 1084 1739 2432 2856 585 978 1424 1701 67 1007 1575 2206 2602 1125 1775 2472 2901 1451 2102 2755 3155 68 1250 1965 2710 3148 1016 1676 2423 2890 867 1329 1819 2110 69 1168 1812 2511 2941 1294 2070 2915 3444 1178 1824 2562 3005 70 599 931 1287 1498 641 1037 1466 1721 499 790 1106 1293 71 1120 1712 2350 2741 978 1522 2096 2434 1128 1681 2258 2608 72 804 1267 1778 2098 912 1444 2035 2403 1185 1803 2455 2858 73 985 1544 2158 2540 1152 1800 2511 2956 981 1536 2149 2530 74 703 1040 1368 1545 1367 2221 3147 3710 777 1125 1469 1671


121


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

75 773 1144 1496 1680 1117 1842 2644 3145 1288 1963 2664 3073 76 1357 2045 2754 3174 1143 1857 2616 3067 912 1408 1921 2218 77 1312 1964 2636 3036 1204 1856 2523 2913 696 1082 1489 1732 78 1068 1609 2170 2507 1014 1700 2430 2870 497 738 984 1129 79 1113 1718 2359 2743 1374 2330 3420 4113 771 1165 1568 1806 80 994 1485 1983 2266 1306 2097 2949 3474 361 555 751 767 81 955 1414 1876 2147 1139 1767 2425 2825 1525 2310 3137 3638 82 786 1182 1572 1787 1152 1803 2494 2904 1034 1582 2164 2511 83 487 820 1237 1511 938 1494 2113 2500 769 1189 1648 1924


122

Tab. A2: Ergebnisse der „maximalen Aggregation“ (AU) von 83 klinische gesunden

Hunden gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer Messzeit von 6, 8, 10 und

12 min. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP (10 µmol/L), Kollagen (5 µg/mL) und AS (1

mmol/L).

Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

1 131,6 141,0 153,4 156,0 185,3 205,9 216,0 219,4 133,5 145,1 149,6 152,3 2 105,8 115,1 121,5 126,0 138,8 152,3 158,3 160,5 123,0 132,8 136,9 141,0 3 200,6 225,8 240,0 244,1 204,4 238,5 259,9 270,8 51,8 57,4 64,5 70,5 4 144,8 163,9 177,8 182,6 180,8 204,0 219,0 226,9 160,5 176,3 186,4 192,8 5 127,1 141,1 145,9 148,9 134,6 149,3 160,1 165,8 115,1 128,3 137,3 142,5 6 178,9 193,1 203,6 208,1 157,1 177,4 188,6 193,5 156,0 174,4 185,3 192,0 7 84,4 92,6 99,4 105,0 97,9 107,6 115,1 116,6 85,5 91,1 100,5 103,1 8 107,3 113,6 120,4 124,1 169,5 188,3 200,3 205,9 137,6 160,1 174,0 177,4 9 98,3 107,6 118,5 124,5 122,6 145,9 159,0 166,9 96,8 106,5 111,8 115,5 10 147,4 161,6 171,4 176,6 186,8 207,8 218,3 220,5 157,1 165,0 171,0 171,4 11 158,3 173,6 176,6 180,4 193,5 211,9 222,0 223,5 90,0 94,9 97,5 98,3 12 180,8 193,5 196,9 197,3 184,9 208,5 223,5 229,1 85,9 92,6 97,5 100,1 13 145,9 161,3 170,6 171,4 156,4 171,0 174,0 175,1 145,9 161,6 163,1 164,6 14 133,5 149,3 160,9 165,4 147,4 171,8 187,5 195,4 138,8 155,3 165,0 170,6 15 121,1 124,5 124,5 125,3 179,6 198,0 209,3 213,4 109,1 114,4 114,8 116,6 16 145,9 164,6 176,3 180,4 184,5 200,6 204,4 205,1 173,6 195,8 208,1 265,1 17 156,4 170,6 176,3 177,0 166,5 197,6 216,0 222,0 154,1 166,5 168,8 168,8 18 142,9 154,1 162,0 167,3 177,8 193,1 195,8 196,1 149,3 170,6 186,0 190,1 19 122,6 135,0 147,4 151,9 137,6 152,6 161,6 164,6 133,9 151,1 168,4 175,1 20 136,1 149,3 162,8 166,9 196,5 214,9 223,1 224,3 72,0 80,3 82,1 82,9 21 156,8 179,6 186,0 187,1 193,5 214,9 228,8 232,5 106,1 120,4 122,6 122,6 22 108,8 117,8 121,9 122,3 183,0 217,1 230,6 232,5 82,5 96,4 99,8 100,9 23 203,6 221,3 227,6 234,0 193,1 207,8 214,1 215,3 146,6 158,6 158,6 161,3 24 173,3 188,6 193,5 197,3 213,4 231,0 240,8 241,5 107,3 119,6 127,9 131,6 25 110,3 110,3 110,3 110,3 164,6 176,3 178,5 178,5 120,0 122,3 126,4 131,6 26 124,9 141,0 145,5 146,6 159,4 179,6 189,8 192,8 75,4 84,0 90,0 91,9 27 120,0 122,3 122,6 124,5 144,8 158,6 166,1 171,0 175,9 189,8 196,1 197,3 28 106,9 116,3 120,0 120,4 189,0 219,0 238,1 245,6 149,3 168,4 182,6 186,8 29 47,3 49,9 54,0 55,9 152,6 187,5 203,3 204,0 108,8 121,1 130,1 133,5 30 136,5 147,4 154,9 155,6 161,3 167,3 168,8 169,1 177,4 178,1 178,1 178,1 31 158,3 175,5 188,3 193,5 181,5 198,4 210,4 215,6 186,0 205,5 217,9 219,8 32 181,9 189,0 190,9 191,6 205,9 225,0 236,6 243,4 204,4 221,6 227,6 228,0 33 157,1 170,3 178,9 184,9 147,4 164,6 177,0 181,1 208,5 231,4 252,8 259,5 34 169,1 182,6 188,3 189,4 163,1 181,5 191,3 209,9 153,8 163,9 164,6 165,0 35 94,1 104,6 113,6 114,8 133,1 148,1 154,9 156,4 90,4 99,8 107,6 110,3 36 114,8 127,1 133,9 134,3 164,3 182,3 189,8 192,4 93,8 97,9 100,5 101,3 37 111,8 118,5 120,8 121,1 187,1 202,9 207,0 207,4 150,8 154,1 155,3 157,1


123


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

38 154,5 165,8 175,5 178,1 169,1 189,0 200,6 202,5 186,4 201,8 205,1 209,3 39 141,0 153,0 159,4 163,1 142,9 159,4 170,3 170,6 154,5 165,4 167,3 167,6 40 107,6 119,3 124,1 124,5 201,0 225,8 236,6 238,9 60,8 60,8 60,8 61,5 41 130,9 142,9 148,9 153,4 141,0 151,1 154,1 154,5 97,9 109,9 116,6 121,9 42 183,0 191,3 192,4 192,4 195,8 216,8 223,1 223,5 62,3 63,4 63,4 63,4 43 141,4 158,6 166,5 172,5 175,9 197,6 205,5 211,9 165,8 182,6 186,0 187,9 44 194,3 208,5 214,9 217,5 208,1 226,0 232,5 233,6 177,4 195,8 204,8 206,3 45 111,4 120,0 124,9 125,3 153,4 165,0 171,0 173,3 127,5 133,1 133,1 133,5 46 140,3 154,4 157,1 157,9 207,4 225,8 237,0 240,0 172,9 182,6 190,5 192,0 47 126,4 134,6 134,6 135,0 158,3 183,4 195,8 201,0 123,0 136,5 138,8 139,9 48 121,1 127,5 130,1 130,1 137,6 145,5 154,5 157,5 121,1 121,1 121,1 121,1 49 92,3 100,9 104,3 106,5 197,3 214,5 222,0 225,4 90,0 103,1 112,5 114,8 50 142,1 148,1 148,9 149,3 151,5 175,1 186,8 189,9 70,5 71,3 74,3 75,8 51 120,4 131,3 140,3 144,0 145,1 157,5 166,5 170,3 136,9 147,4 150,8 153,8 52 140,3 154,1 162,0 166,9 161,3 168,8 170,6 171,4 146,3 154,5 160,1 160,1 53 144,4 160,9 171,0 176,3 175,1 198,0 208,1 211,5 126,4 135,4 138,0 138,4 54 196,5 204,8 204,8 204,8 198,0 212,6 216,0 216,4 96,8 102,4 102,8 103,9 55 91,9 97,9 102,0 102,8 184,5 195,0 197,3 198,4 122,6 127,1 127,1 127,5 56 111,8 126,4 133,1 136,5 139,1 154,1 162,4 165,0 97,1 99,4 99,4 101,3 57 164,6 178,9 186,0 186,4 173,3 185,6 195,0 200,3 161,6 173,6 179,6 181,5 58 118,9 132,8 148,9 154,9 165,0 183,8 187,5 187,9 144,8 155,6 157,9 157,9 59 136,5 149,3 154,5 156,0 204,0 220,1 229,5 232,9 160,1 163,5 163,5 163,9 60 159,8 181,5 188,6 192,0 178,9 201,0 203,6 204,8 104,3 122,3 131,3 134,3 61 163,1 169,1 169,1 169,5 201,4 234,8 246,0 247,9 63,4 68,3 70,1 70,9 62 117,4 129,8 133,1 136,1 149,3 163,5 168,4 169,5 114,4 133,9 147,0 151,5 63 160,1 171,4 177,8 178,1 154,1 173,3 183,0 187,5 137,6 140,6 140,6 141,0 64 147,8 154,1 154,5 154,5 200,6 219,4 224,6 225,8 87,4 91,1 91,5 95,3 65 197,3 210,0 213,0 213,4 162,8 195,8 216,4 225,8 88,9 89,6 89,6 90,8 66 179,6 199,1 206,3 209,6 177,8 191,3 202,1 203,6 100,1 120,0 132,0 138,4 67 148,1 171,4 186,0 192,0 172,5 192,0 202,5 208,5 183,0 186,4 187,5 187,9 68 191,6 208,1 212,3 212,3 172,1 201,0 219,4 228,0 124,5 137,3 140,6 143,6 69 171,8 190,9 202,9 210,4 204,8 232,9 247,5 255,8 176,3 197,3 210,4 214,9 70 88,5 97,1 101,6 105,8 105,8 117,8 124,5 126,0 76,9 87,0 91,5 93,4 71 159,0 175,5 185,3 190,1 148,5 159,4 164,3 164,6 150,4 160,1 165,8 168,8 72 122,3 139,1 151,5 156,8 139,5 160,5 173,6 178,9 166,9 179,6 189,4 195,8 73 147,4 168,4 180,4 188,3 171,8 192,8 209,3 217,1 147,4 166,9 180,0 184,1 74 95,6 96,0 96,0 96,4 225,4 254,3 267,0 269,6 100,1 100,5 100,5 100,9 75 104,6 106,1 106,1 106,1 190,1 218,3 234,4 241,1 183,8 196,9 199,5 199,9 76 189,8 199,1 201,8 204,0 190,1 209,6 218,6 218,6 135,8 143,3 147,0 147,4 77 179,6 189,8 192,4 193,1 180,0 187,9 190,1 190,5 104,6 112,9 117,4 119,6 78 148,5 157,1 160,9 163,1 183,4 201,8 210,0 212,3 67,5 69,4 71,6 73,5 79 162,8 177,8 184,9 187,1 247,5 291,0 323,3 337,5 107,6 13,6 115,9 117,4


124


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

80 135,0 141,0 143,3 143,3 211,1 233,6 246,8 253,1 51,8 56,6 57,0 51,4 81 127,9 130,9 131,3 132,8 171,4 181,5 189,0 193,5 212,3 229,1 238,1 244,1 82 111,0 112,5 112,5 113,3 176,6 190,9 198,4 199,1 146,6 160,9 167,3 168,4 83 78,0 106,9 127,5 139,5 145,1 169,1 181,1 190,5 112,9 135,3 133,5 135,8


125

Tab. A3: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) von 117 Hunden (134 Proben)

mit verschiedenen Erkrankungen gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer

Messzeit von 6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP (10 µmol/L),

Kollagen (5 µg/mL) und AS (1 mmol/L).

Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

1 1376 1581 1745 1818 2123 3237 4348 4983 2306 3343 4455 5150 2 1186 1800 2527 3005 1436 2157 2914 3373 1550 2315 3128 3620 3 803 1379 1567 1765 757 1392 1629 1872 233 358 402 443 4 725 1064 1409 1612 630 1028 1469 1680 1245 1950 2733 3214 5 1572 2408 3307 3862 1673 2672 3724 4307 2002 2920 3816 4347 6 1023 1549 2092 2406 985 1619 2278 2653 601 904 1203 1370 7 1967 2962 4005 4638 1483 2429 3443 4042 1112 1642 2226 2595 8 741 1226 1762 2068 821 1459 2142 2438 795 1373 2083 2537 9 1149 1758 2406 2764 1152 1899 2729 3142 641 929 1233 1417 10 930 1464 2031 2375 919 1527 2161 2540 837 1306 1795 2086 11 981 1539 2165 2558 796 1304 1856 2194 669 1005 1369 1592 12 1057 1606 2205 2577 1153 1818 2546 2984 1133 1754 2413 2810 13 816 1262 1735 2016 886 1474 2142 2529 775 1194 1645 1917 14 804 1200 1617 1857 679 1140 1633 1873 191 310 452 529 15 433 631 839 960 1416 2191 2991 3436 1228 1876 2559 2970 16 798 1266 1773 2083 467 735 1025 1193 675 1042 1449 1694 17 828 1255 1704 1975 1004 1600 2218 2553 1002 1475 1959 2236 18 864 1389 1948 2283 770 1296 1880 2223 675 1060 1485 1728 19 736 1200 1712 2016 956 1576 2236 2554 877 1409 2001 2363 20 956 1451 1970 2274 1193 1829 2447 2787 1235 1878 2549 2951 21 798 1205 1627 1871 1150 1815 2512 2912 742 1144 1587 1859 22 39 90 181 243 173 295 445 547 392 634 915 1100 23 498 726 946 1068 893 1413 1972 2201 263 389 516 584 24 232 331 426 472 189 328 478 519 638 960 1308 1517 25 1293 1879 2453 2786 911 1615 2379 2834 660 988 1334 1540 26 61 95 136 154 167 276 388 429 954 1512 2130 2510 27 1303 1956 2660 3086 1725 2689 3716 4341 1184 1760 2384 2755 28 1467 2240 3032 3510 1160 1868 2641 3084 1434 2144 2901 3365 29 1095 1670 2226 2533 750 1317 1914 2225 364 553 757 874 30 451 702 954 1095 700 1137 1579 1771 215 337 473 552 31 1959 2985 4035 4618 1716 2859 4138 4932 1820 2811 3831 4484 32 714 1098 1498 1717 919 1622 2385 2708 720 1131 1589 1855 33 998 1572 2198 2588 1212 2005 2843 3314 1161 1826 2514 2922 34 993 1427 1784 1936 705 1215 1777 2020 1237 1865 2507 2885 35 937 1404 1888 2182 643 1080 1563 1756 715 1121 1557 1820 36 782 1261 1779 2093 807 1468 2226 2641 608 973 1373 1600 37 1030 1601 2194 2548 968 1554 2193 2582 593 895 1198 1374


126


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

38 1039 1690 2375 2764 982 1731 2536 3009 1084 1763 2493 2932 39 1256 1940 2598 2958 442 758 1103 1292 1098 1668 2269 2613 40 457 725 1007 1167 751 1263 1817 2053 1774 2638 3524 4065 41 258 374 494 562 1057 1885 2809 3335 299 447 615 718 42 1200 1835 2489 2873 1425 2141 2897 3344 582 984 1435 1699 43 26 43 66 69 401 882 1606 2076 242 393 571 675 44 181 352 572 681 578 1292 2228 2848 223 393 603 722 45 340 532 732 843 284 477 699 810 233 378 547 649 46 102 147 191 205 70 107 142 153 150 242 343 397 47 896 1403 1934 2234 482 888 1343 1575 856 1362 1912 2237 48 940 1392 1873 2162 1229 1981 2776 3256 472 749 1064 1259 49 1630 2531 3509 4121 2010 3109 4293 4980 1537 2314 3134 3629 50 1443 2195 2972 3437 1120 1921 2822 3245 1070 1619 2181 2503 51 633 980 1320 1484 999 1558 2137 2427 579 901 1215 1390 52 924 1372 1853 2138 825 1304 1840 2164 900 1382 1899 2217 53 597 749 910 1000 1482 2317 3221 3704 1529 2226 2888 3268 54 1281 1932 2582 2957 987 1702 2493 2921 519 758 1016 1166 55 302 490 696 812 437 766 1071 1190 227 342 474 551 56 788 1290 1835 2163 695 1332 2075 2464 402 652 937 1113 57 1516 2326 3231 3803 1994 2994 3960 4508 332 506 695 803 58 1177 1870 2577 2973 1445 2347 3316 3833 1275 1857 2371 2651 59 1477 2168 2814 3176 1274 2022 2817 3255 1564 2364 319 3547 60 735 1139 1575 1846 1213 1991 2819 3307 248 413 595 695 61 1408 2230 3143 3720 1213 1935 2724 3154 1280 1965 2716 3183 62 772 1157 1547 1773 896 1550 2190 2478 354 559 779 909 63 1392 2243 3211 3827 774 1374 2069 2455 872 1310 1763 2033 64 1017 1574 2123 2427 1033 1732 2461 2847 515 780 1067 1242 65 1257 1989 2765 3236 1163 1855 2588 2958 138 202 272 309 66 742 1159 1599 1861 957 1634 2417 2892 813 1237 1704 1989 67 493 766 1038 1187 729 1153 1560 1755 278 427 585 675 68 587 911 1236 1412 961 1552 2175 2496 261 393 536 617 69 682 960 1223 1368 1719 2652 3638 4174 442 661 883 1011 70 802 1069 1281 1388 1020 1743 2514 2953 404 525 641 703 71 611 948 1278 1462 737 1256 1790 2061 371 566 778 902 72 375 670 1021 1233 290 516 787 954 365 565 793 933 73 858 1328 1824 2120 844 1328 1837 2060 870 1308 1775 2057 74 1291 1798 2244 2483 1331 2084 2881 3362 192 304 425 494 75 860 1336 1836 2138 738 1160 1608 1849 494 795 1127 1324 76 760 1209 1629 1838 852 1400 1972 2293 162 249 345 396 77 1051 1669 2345 2758 1038 1619 2251 2638 1028 1628 2278 2670 78 837 1382 1955 2290 992 1730 2564 3060 200 339 502 594 79 1801 2833 3895 4542 1833 2980 4211 4926 418 657 917 1071


127


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

80 1196 1836 2463 2817 1050 1740 2470 2897 1075 1694 2337 2714 81 1376 2082 2810 3256 1149 1881 2721 3258 982 1499 2014 2303 82 958 1479 2006 2305 1073 1743 2456 2890 473 675 888 1014 83 1179 1793 2410 2761 1705 2795 3989 4726 546 870 1217 1429 84 1320 2133 3010 3541 1490 2376 3273 3791 1183 1835 2533 2965 85 1346 2255 3318 3980 1597 2615 3749 4449 1323 2128 3033 3598 86 1382 2222 3124 3667 1905 3159 4493 5306 1271 1991 2761 3231 87 921 1496 2081 2415 1110 1991 2939 3509 687 1055 1450 1692 88 834 1290 1760 2036 837 1426 2077 2472 836 1303 1812 2123 89 1070 1588 2135 2455 1162 1792 2419 2781 624 888 1152 1304 90 499 742 992 1140 1529 2437 3400 3990 517 786 1075 1248 91 749 1128 1509 1726 1139 1762 2379 2731 900 1361 1833 2103 92 701 1142 1620 1916 768 1359 2008 2408 293 461 644 749 93 992 1577 2218 2615 1126 1848 2641 3134 503 883 1334 1623 94 1052 1619 2205 2544 1116 1807 2558 3022 999 1510 2038 2346 95 338 582 844 999 1656 2859 4173 4972 452 727 1035 1227 96 733 1163 1609 1863 1177 1987 2853 3374 555 846 1166 1358 97 1044 1726 2519 3034 654 1073 1572 1896 317 481 661 765 98 2072 3092 4145 4772 2622 3974 5329 6122 1084 1874 2761 3311 99 700 1095 1512 1750 1082 1750 2463 2891 543 785 1028 1821

100 1660 2614 3643 4284 1533 2450 3443 4044 1007 1601 2240 2626 101 512 796 1085 1247 742 1318 1933 2293 302 469 650 755 102 1825 2756 3762 4381 2365 3575 4854 5634 1754 2549 3330 3773 103 1029 1590 2147 2459 934 1559 2317 2848 562 882 1219 1420 104 765 1312 1923 2292 1028 1845 2704 3204 616 998 1407 1648 105 441 698 1004 1198 989 1605 2302 2749 400 620 877 1037 106 870 1358 1869 2183 1230 1953 2711 3165 782 1186 1615 1874 107 194 309 426 486 661 1117 1616 1922 162 301 476 586 108 140 265 416 505 397 788 1261 1563 638 935 1240 1417 109 624 951 1260 1426 788 1304 1851 2182 336 522 713 819 110 779 1223 1707 2003 931 1555 2223 2626 354 584 843 997 111 417 675 932 1070 1093 1913 2772 3275 172 284 417 499 112 566 867 1188 1378 1124 1843 2588 3031 501 752 1024 1187 113 1437 2078 2695 3032 1432 2271 3147 3672 339 514 706 818 114 306 527 799 973 747 1329 2015 2453 243 388 555 656 115 1633 2577 3506 4037 1816 3159 4672 5620 757 1146 1570 1829 116 710 1136 1585 1855 886 1479 2097 2457 488 776 1097 1290 117 502 774 1065 1241 1850 2854 3806 4347 418 653 915 1076 118 1142 1941 2844 3425 1438 2521 3742 4522 331 523 747 887 119 1249 1846 2473 2849 1781 2750 3714 4271 916 1431 2000 2345 120 394 652 934 1104 464 865 1275 1501 348 551 780 920 121 1766 2723 3733 4342 2123 3431 4811 5668 789 1222 1699 1997 122 480 743 1024 1195 633 1123 1669 2012 738 1127 1554 1819 123 1544 2401 3287 3807 1014 1622 2260 2645 556 894 1273 1506


128


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

124 1361 2094 2883 3362 1376 2283 3306 3940 569 896 1250 1461 125 480 739 1016 1186 1003 1625 2315 2741 606 998 1446 1728 126 873 1440 2069 2466 949 1807 2825 3488 356 585 847 1011 127 902 1507 2162 2560 1244 2272 3448 4183 632 1023 1477 1769 128 363 566 793 929 484 848 1259 1506 338 554 805 960 129 1764 2653 3602 4181 2040 3268 4649 5518 2003 3060 4208 4917 130 555 876 1199 1376 683 1173 1735 2091 914 1432 2017 2388 131 94 134 173 188 396 651 935 1107 490 791 1132 1342 132 469 787 1130 1332 603 1118 1712 2080 873 1354 1887 2220 133 746 1112 1456 1634 1464 2397 3417 4047 630 834 1030 1134 134 965 1418 1826 2037 1154 1909 2753 3283 257 446 720 917


129

Tab. A4: Ergebnisse der „maximalen Aggregation“ (AU) von 117 Hunden (134 Proben)

mit verschiedenen Erkrankungen gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer

Messzeit von 6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP (10 µmol/L),

Kollagen (5 µg/mL) und AS (1 mmol/L).

Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

1 213,4 213,4 213,4 213,4 320,3 320,3 320,3 327,0 283,9 304,5 323,3 333,4 2 162,0 186,4 222,4 235,5 197,6 210,0 218,3 224,3 210,4 224,6 233,6 235,9 3 112,1 112,9 112,9 113,3 116,3 123,0 128,3 128,3 28,5 28,5 28,5 28,5 4 97,9 97,9 99,4 102,8 105,0 120,8 129,8 132,8 187,5 213,8 225,4 232,9 5 244,6 247,5 261,0 269,3 272,3 393,3 299,6 302,6 261,0 264,0 264,0 266,6 6 143,6 152,6 154,9 155,3 172,5 184,9 187,5 190,1 85,1 87,0 87,0 87,8 7 271,5 289,5 300,0 302,3 251,6 279,8 293,3 298,5 145,1 157,5 173,3 180,8 8 130,1 146,3 155,6 159,4 167,6 190,5 195,8 196,9 139,9 186,4 212,6 219,8 9 164,3 181,5 187,9 187,9 199,1 223,1 245,6 249,8 90,0 93,4 98,3 101,6 10 145,5 156,8 164,6 168,8 163,1 176,3 181,9 183,4 126,4 138,0 140,6 143,3 11 146,3 168,4 185,3 193,9 133,5 150,8 160,5 165,0 90,8 99,8 107,3 111,8 12 147,4 163,9 175,5 180,8 178,5 199,1 213,8 221,6 169,1 181,5 190,9 193,9 13 118,9 133,5 136,1 138,8 151,9 179,3 196,5 204,4 113,3 123,8 130,5 133,5 14 106,9 115,1 121,5 121,5 122,6 136,5 141,4 142,1 31,1 36,4 42,8 78,8 15 55,5 57,8 60,8 63,8 213,0 225,4 228,0 228,0 175,1 190,1 196,9 199,5 16 123,4 138,8 148,9 154,1 73,9 79,5 83,3 85,9 98,6 11,4 118,1 121,9 17 116,6 123,8 129,4 133,5 163,1 173,3 176,6 177,0 131,3 135,4 137,3 138,0 18 141,0 156,0 162,0 162 138,0 157,9 169,5 169,9 103,1 115,5 122,6 123,0 19 121,5 138,0 150,8 156,8 165,8 183,0 191,3 193,1 139,5 159,0 174,0 88,1 20 134,6 144,4 148,1 148,9 177,4 181,1 181,1 181,5 174,8 186,8 192,0 193,9 21 112,1 117,8 121,1 121,1 180,0 196,1 198,8 199,1 109,5 120,4 129,4 135,4 22 9,0 19,5 32,3 37,9 31,9 36,8 49,5 57,8 63,8 72,0 87,0 95,3 23 65,6 65,6 65,6 66 139,9 153,0 160,9 163,1 36,4 36,4 36,8 37,5 24 29,6 29,6 29,6 30,4 35,6 41,6 44,3 44,6 87,0 94,9 100,9 104,6 25 166,9 167,6 167,6 167,6 184,5 208,9 220,5 223,5 90,8 96,0 99,8 102,0 26 10,9 10,9 13,5 13,9 28,5 31,9 33,0 34,1 147,0 168,8 181,9 148,9 27 177,8 192,4 203,3 210 261,0 183,9 295,1 298,1 158,6 169,9 181,1 181,1 28 211,9 222,8 227,6 229,9 187,9 209,6 225,8 229,1 191,6 208,5 219,0 224,3 29 165,0 165,0 165,0 165 149,5 167,3 169,9 170,6 51,8 55,9 59,6 61,5 30 68,3 72,4 73,1 74,3 119,3 127,1 127,5 127,9 31,5 36,8 40,9 43,5 31 280,5 295,5 303,4 305,3 295,5 346,9 375,0 387,0 267,8 291,8 299,6 301,9 32 107,3 111,8 114,8 115,5 183,4 210,4 220,5 220,5 109,1 123,4 133,5 135,0 33 154,1 169,5 184,9 191,3 213,8 232,1 242,3 244,9 179,6 192,8 198,0 198,4 34 128,3 128,3 128,3 128,6 135,0 154,1 163,5 166,1 175,5 180,0 183,8 184,1 35 127,5 136,5 140,3 144 114,4 132,8 140,6 142,9 108,0 119,6 127,1 131,6 36 125,3 142,9 150,0 152,3 167,3 203,6 223,1 229,5 95,3 107,6 118,1 124,5 37 156,0 166,9 169,5 176,6 155,3 175,9 184,5 188,6 84,4 86,6 86,6 87,8


130


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

38 171,4 192,8 194,6 195,4 196,1 222,4 231,0 232,1 178,9 200,3 211,5 214,1 39 181,5 198,0 198,0 198 80,6 95,3 99,0 99,0 156,8 167,3 171,8 172,1 40 72,4 78,4 81,4 83,3 132,4 152,6 159,8 160,5 240,0 247,5 254,6 259,1 41 31,9 33,8 35,3 39,8 214,5 248,6 269,6 274,1 38,6 46,1 49,9 54,0 42 172,1 184,9 187,5 187,9 195,0 208,9 217,9 220,5 104,3 121,1 132,0 133,5 43 4,1 6,8 7,5 8,6 103,1 171,0 237,8 268,1 39,4 46,9 52,5 54,0 44 40,9 54,8 69,4 73,5 163,9 237,0 288,8 303,8 40,9 54,4 63,8 70,1 45 54,4 55,5 58,5 61,9 50,6 59,6 67,1 68,3 38,3 43,9 51,0 53,3 46 14,6 14,6 14,6 15 11,6 12,4 12,4 12,4 24,4 26,6 30,4 31,9 47 136,9 149,3 151,1 151,9 104,6 124,5 131,3 131,6 135,8 149,3 158,6 162,0 48 124,5 132,0 139,5 142,1 201,0 220,1 228,0 229,9 72,0 85,9 92,6 97,5 49 240,0 266,3 286,9 296,3 296,3 324,4 343,1 351,4 213,0 227,3 236,3 239,6 50 203,3 217,9 222,4 224,6 209,3 243,0 264,0 269,6 151,9 156,8 160,5 160,5 51 96,8 99,4 99,4 99,4 153,8 163,1 166,1 166,1 90,4 91,9 91,9 91,9 52 120,8 132,0 138,8 142,5 126,8 144,4 157,5 163,5 129,0 143,3 151,1 154,5 53 102,0 102,0 102,0 102,8 224,6 246,4 262,1 265,5 199,1 199,1 199,1 199,9 54 180,0 187,1 187,1 190,5 186,4 214,9 232,9 237,4 66,8 70,5 75,4 76,5 55 47,6 56,6 59,6 61,5 91,5 95,6 95,6 95,6 31,1 34,9 39,4 42,8 56 132,8 148,9 157,9 160,5 158,3 197,6 222,8 230,3 63,8 76,9 83,6 90,0 57 213,4 243,8 268,1 279,8 279,8 285,4 285,4 285,4 46,9 52,9 55,1 56,6 58 185,6 202,1 202,9 203,3 240,0 268,5 280,1 282,8 174,0 174,0 174,0 174,0 59 202,5 202,5 202,5 202,9 201,4 220,5 229,5 232,5 223,1 228,0 228,0 228,8 60 108,8 120,0 127,9 134,3 209,3 230,3 237,0 239,6 43,5 49,9 53,3 54,8 61 215,6 246,8 267,4 280,9 191,3 215,3 231,4 237,0 184,1 203,3 218,6 224,6 62 109,5 109,9 112,2 114,4 178,1 187,5 187,5 187,9 55,5 60,8 64,9 66,4 63 218,3 259,5 285,4 299,6 154,9 183,4 207,8 216,8 120,8 126,8 130,1 132,8 64 155,3 159,8 159,8 159,8 189,8 203,6 209,3 209,3 71,6 78,8 85,1 88,5 65 195,8 214,5 223,9 228,4 185,6 202,1 210,0 212,3 17,6 19,5 20,3 20,3 66 114,4 121,5 127,1 130,5 171,4 209,3 232,9 240,4 111,8 126,0 136,9 139,1 67 74,3 79,1 79,1 79,1 120,4 121,5 121,5 121,9 40,5 43,5 46,1 48,4 68 91,9 93,0 93,4 93,8 159,0 172,9 178,5 179,3 36,8 39,8 41,3 43,5 69 81,4 81,4 81,4 81,4 252,8 274,1 282,0 286,1 60,8 63,0 63,8 64,5 70 97,5 97,5 97,5 98,6 190,1 214,1 220,5 221,3 56,6 56,6 56,6 56,6 71 93,8 96,4 96,4 96,8 139,1 151,1 152,3 153,0 53,3 58,9 61,5 64,5 72 73,1 91,5 104,6 107,3 56,6 71,3 81,4 86,6 52,9 61,5 67,1 70,9 73 127,1 138,8 142,1 145,5 130,1 141,8 145,9 146,3 119,3 127,9 135,4 137,6 74 162,4 162,4 162,4 163,1 202,5 221,3 228,4 231,4 30,0 33,4 36,8 37,5 75 128,3 138,4 145,5 148,5 112,9 124,5 129,4 130,5 79,5 91,1 97,1 99,4 76 121,9 129,4 129,4 130,1 145,5 160,1 163,9 165,0 22,1 25,9 29,3 30,0 77 163,1 185,3 195,8 199,5 154,9 172,1 184,5 189,0 158,6 178,5 187,9 191,6 78 141,8 162,0 163,9 165 190,5 225,4 246,8 256,9 35,6 43,1 48,0 49,9 79 279,8 300,4 304,1 309,8 304,1 339,4 354,8 359,3 62,6 71,3 76,5 77,6


131


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

80 179,6 181,9 181,9 182,3 182,6 204,4 208,5 208,5 169,5 181,1 183,4 184,5 81 193,5 203,6 208,9 216,4 189,0 224,3 250,1 263,3 144,0 147,8 147,8 148,1 82 142,9 149,3 151,1 151,5 180,8 196,5 204,4 208,9 57,0 58,5 62,6 64,1 83 169,5 175,5 176,3 176,6 285,8 325,9 347,3 356,3 86,6 94,9 103,1 104,6 84 212,6 242,3 252,0 254,3 242,3 255,8 255,8 256,1 174,4 192 202,1 206,3 85 227,6 284,6 312,8 316,5 265,5 306,4 330 334,1 211,9 244,9 266,3 272,6 86 225,8 249,0 259,5 261,4 340,9 368,3 382,5 387,0 192,4 210,8 223,5 226,1 87 157,1 167,6 167,6 167,6 230,6 262,9 272,3 274,1 98,3 109,1 115,5 118,1 88 123,8 132,4 135,8 136,5 154,9 176,6 188,6 193,1 124,9 140,3 148,1 152,3 89 142,5 152,3 156 157,1 173,3 179,6 179,6 180,4 80,3 80,3 80,3 80,3 90 69,0 70,1 73,1 75,4 245,3 265,9 278,6 284,3 71,6 78,8 85,9 87,4 91 104,6 109,5 109,5 109,9 173,6 178,1 178,1 178,1 125,6 134,3 135,4 135,4 92 118,1 130,9 139,9 145,5 154,9 175,9 190,1 195,0 43,5 50,3 53,3 54,8 93 156,4 174,8 186,4 193,5 190,5 216 231,4 236,6 91,9 120 135,4 141,0 94 154,5 165,0 166,9 166,9 182,3 205,9 220,1 223,1 139,9 148,1 149,6 151,1 95 61,9 72,8 76,1 79,5 315,4 359,6 379,9 388,5 72,0 82,9 92,3 96,4 96 116,3 124,5 128,3 128,3 213,8 239,6 247,5 249,0 76,9 87,8 94,1 96,8 97 175,1 210,0 238,5 254,3 105,8 130,9 149,6 162,0 45,4 49,1 52,9 54,8 98 280,1 296,3 300,0 300,8 373,5 385,9 386,6 387,0 204,0 240,0 259,1 268,1 99 105,8 116,3 119,3 119,6 179,3 196,9 205,5 207,4 68,3 69,8 70,5 111,0

100 254,3 282,4 301,5 310,9 242,3 273,8 286,9 289,5 157,1 176,3 183,8 185,6 101 78,4 82,5 82,9 82,9 150,4 172,1 175,5 175,9 45,4 49,1 53,3 54,0 102 252,4 276,8 292,1 297,4 327,8 354,4 367,1 371,6 220,5 228,4 228,4 229,9 103 154,9 162,0 162,0 162 163,9 188,3 238,9 268,5 86,3 93,4 97,9 99,4 104 141,8 165,8 176,7 181,1 218,6 241,5 244,1 245,3 103,1 111,4 117,4 119,3 105 66,4 80,3 93,0 98,3 159,4 186,0 209,3 222,0 57,8 67,1 78,0 80,3 106 133,5 141,8 149,6 155,6 196,9 210,0 219,0 220,5 108,8 118,9 124,5 127,5 107 30,4 34,5 34,5 35,5 119,6 137,6 145,1 149,6 31,5 45,0 54,8 57,4 108 32,3 40,9 45,0 47,3 96,4 124,5 141,8 148,9 80,6 85,9 87,0 88,5 109 92,6 93,4 93,4 94,1 136,9 153,0 157,5 159,8 49,9 54,0 55,1 55,1 110 117,4 133,1 141,0 144 166,5 184,1 191,3 193,9 59,6 70,1 75,4 78,8 111 69,0 74,3 74,3 74,6 216,0 241,5 243,8 244,5 28,9 34,5 39,8 44,3 112 81,4 88,1 93,0 95,3 194,3 210,4 212,3 212,6 67,9 73,5 79,5 82,5 113 181,5 183,8 183,8 184,1 226,9 244,5 249,8 252,8 47,3 51,4 56,3 57,4 114 54,4 70,1 83,3 90,4 144,4 182,3 204,8 213,4 38,3 44,6 50,6 54,8 115 260,6 270,0 270,0 270 343,5 409,1 444,8 458,6 107,6 114,8 123,4 128,3 116 114,0 125,6 128,3 132 159,8 173,3 175,9 176,6 75,8 87,4 94,1 95,6 117 74,3 79,9 85,1 10,4 286,9 288,4 288,4 288,4 61,1 71,3 77,3 82,1 118 206,6 241,9 269,3 283,5 283,9 327,4 361,1 376,5 49,1 58,1 69,0 72,4 119 163,1 174,8 179,6 184,1 269,6 276,0 276,0 276,4 136,9 153,8 166,1 167,0 120 69,8 76,9 82,1 85,9 105,0 119,3 119,3 119,3 52,5 61,5 68,3 71,6 121 256,9 280,9 288,8 290,6 342,8 383,3 405,0 412,1 114,8 129,0 140,3 148,5 122 70,9 76,9 83,3 87 126,8 147,4 159,8 412,1 104,6 114,4 126,0 129,0 123 231,0 249,8 251,3 252 164,6 177,8 182,6 168,0 89,6 101,6 111,0 117,0


132


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12

124 196,5 217,5 228,4 232,1 235,5 275,6 299,6 307,5 86,6 96,4 102,8 106,1 125 70,1 74,6 81,8 87,8 163,5 186,8 203,3 209,3 101,6 120,4 132,4 140,3 126 147,0 170,3 185,6 195,8 214,1 267,4 307,1 322,9 58,9 69,4 78,8 83,6 127 161,3 180,4 188,6 195,8 262,9 315,4 246,9 359,6 98,3 120,4 135,0 145,1 128 54,0 61,5 66,8 69 93,8 110,3 119,3 122,6 54,8 67,5 74,3 80,6 129 242,3 261,4 275,3 282,8 319,5 371,6 407,3 420,8 282,0 314,3 336,4 348,4 130 89,6 93,0 93,0 93,4 124,5 149,3 168,4 175,9 138,0 156,8 174,8 183,4 131 15,4 15,4 15,4 15,4 66,8 77,6 84,0 86,6 79,1 90,4 102,0 107,3 132 85,9 94,1 99,8 100,9 129,4 157,9 176,3 181,9 127,9 145,5 158,3 165,4 133 103,9 104,3 104,3 105 246,0 277,1 296,3 305,6 73,1 73,1 73,1 73,1 134 129,0 130,1 130,1 130,9 197,3 227,6 251,6 262,1 45,4 63,4 91,1 103,9


133

Tab. A5: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) von 8 Proben Clopidogrel-

behandelter Hunde gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer Messzeit von

6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kam der Agonist ADP (10 µmol/L).

Probe Nr. Dosierung 6 min 8 min 10 min 12 min 1 4 mg/kg 184 334 516 612 2 3 mg/kg 379 656 984 1160 3 4 mg/kg 316 550 835 993 4 4 mg/kg 282 485 735 872 5 2 mg/kg 301 513 761 889 6 2 mg/kg 299 494 712 823 7 2 mg/kg 232 416 637 752 8 2 mg/kg 310 540 820 965

Tab. A6: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) von 8 Proben Clopidogrel-


6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kam der Agonist AS (1 mmol/L).

Probe Nr. Dosierung 6 min 8 min 10 min 12 min 1 4 mg/kg 323 516 753 877 2 3 mg/kg 422 644 886 1016 3 4 mg/kg 372 602 850 972 4 4 mg/kg 407 661 950 1100 5 2 mg/kg 207 341 493 565 6 2 mg/kg 97 156 218 246 7 2 mg/kg 320 482 654 737 8 2 mg/kg 196 315 444 500


134

Tab. A7: Ergebnisse der maximalen Aggregation (AU) von 8 Proben Clopidogrel-


6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kam der Agonist ADP (10 µmol/L).

Probe Nr. Dosierung 6 min 8 min 10 min 12 min 1 4 mg/kg 38,6 46,9 56,3 60,0 2 3 mg/kg 70,1 85,9 99,8 107,3 3 4 mg/kg 58,5 73,9 88,9 96,8 4 4 mg/kg 51,8 63,8 79,5 84,0 5 2 mg/kg 53,6 65,3 73,9 77,6 6 2 mg/kg 52,1 58,5 64,5 68,6 7 2 mg/kg 45,0 57,0 67,1 70,1 8 2 mg/kg 55,9 73,9 83,3 88,5

Tab. A8: Ergebnisse der maximalen Aggregation (AU) von 8 Proben Clopidogrel-


6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kam der Agonist AS (1 mmol/L).

Probe Nr. Dosierung 6 min 8 min 10 min 12 min 1 4 mg/kg 48,0 62,3 71,6 74,6 2 3 mg/kg 60,8 64,9 73,5 82,5 3 4 mg/kg 59,6 67,5 72,8 73,9 4 4 mg/kg 66,8 76,9 85,1 89,6 5 2 mg/kg 34,5 42,0 45,5 45,8 6 2 mg/kg 16,9 17,3 19,1 22,1 7 2 mg/kg 42,8 46,1 50,6 50,6 8 2 mg/kg 32,3 36,0 36,8 37,1


135

Tab. B1: Signalement, Diagnose und Gruppenzugehörigkeit der 25 Hunde mit entzündlichen

Erkrankungen.

Hund Nr. Rasse

Alter (Jahre; Monate)

Geschlecht Diagnose Gruppe

1 Airedale Terrier 3;9 w Abszess NonSIRS 2 Beagle 1;1 w Leptospirose SIRS 3 Bracke 12;3 m Prostatitis NonSIRS 4 Kleiner Münsterländer 1;5 m Prostatitis SIRS 5 Border Collie 8;2 w Pyometra SIRS 6 Gordon Setter 0;9 w Abszess SIRS 7 Deutscher Schäferhund 2;8 m Abszess SIRS 8 Golden Retriever 7;0 m Leptospirose SIRS 9 Briard 1;1 w Bronchopneumonie SIRS 10 Mischling 1;0 mk Bronchopneumonie SIRS 11 Mischling 5;9 wk Leishmaniose NonSIRS 12 Beagle 3;8 w Abszess SIRS 13 Entlebucher Sennenhund 6;1 w Leishmaniose SIRS 14 Mischling 9;0 m Sepsis SIRS 15 Am. Staffordshire Terrier 1;0 w Leptospirose NonSIRS 16 Alano 8;0 m Abszess SIRS 17 Mischling 7;6 wk Bronchopneumonie SIRS 18 Rhodesian Ridgeback 7;1 wk Leishmaniose NonSIRS 19 Hovawart 0;11 m Abszess NonSIRS 20 Bordeaux-Dogge 7;11 m Prostatitis SIRS 21 Labrador 8;6 w Peritonitis NonSIRS 22 Golden Retriever 9;8 w Pyometra NonSIRS 23 Norfolk Terrier 9;11 m Pankreatitis SIRS 24 Dobermann 1;4 w Pyometra NonSIRS 25 Am. Cocker Spaniel 5;10 w Pankreatitis NonSIRS w = weiblich; m = männlich; wk = weiblich kastriert; mk = männlich kastriert


136

Tab. B2: Befunde (rektale Körpertemperatur, Leukozytenzahl, Herz- und Atemfrequenz,

Allgemeinbefinden) der 25 an entzündlichen Erkrankungen leidenden Hunde, auf deren

Grundlage die Einteilung in die Gruppen „SIRS“ und „NonSIRS“ stattfand.

AF = Atemfrequenz, FA = Futteraufnahme, HF = Herzfrequenz, na = nicht angegeben, obB = ohne besonderen Befund, T = Temperatur, WBC = white blood cells (Leukozyten)

Hund Nr. Erkrankung T

(°C) WBC

(10³/µL) HF

(/min) AF

(/min) Allgemein-befinden

1 Abszess 40,6 15,6 obB obB gut 2 Leptospirose 37,5 3,2 120 obB reduziert 3 Prostatitis 38,0 21,7 60 obB apathisch 4 Prostatitis 39,2 24,9 obB obB reduziert 5 Pyometra 39,2 39,5 110 Polypnoe reduziert 6 Abszess 39,2 15,0 130 obB gut 7 Abszess 40,7 19,4 88 obB reduziert 8 Leptospirose 39,2 19,0 110 obB reduziert 9 Bronchopneumonie 39,9 25,5 130 Polypnoe gut 10 Bronchopneumonie 40,7 21,9 88 80 apathisch 11 Leishmaniose 37,3 7,8 obB obB gut, keine FA 12 Abszess 40,4 22,0 130 Polypnoe reduziert 13 Leishmaniose 39,5 4,4 96 obB ruhig 14 Sepsis 38,4 31,7 na Polypnoe apathisch 15 Leptospirose 38,2 37,3 96 obB matt 16 Abszess 40,6 22,4 na Dyspnoe reduziert 17 Bronchopneumonie 39,7 28,6 na Polypnoe gut 18 Leishmaniose 38,4 15,4 116 obB matt 19 Abszess 38,5 11,5 90 obB gut 20 Prostatitis 39,1 13,2 84 96 apathisch 21 Peritonitis 38,7 25,5 90 obB gut 22 Pyometra 38,5 31,4 obB obB gut, keine FA 23 Pankreatitis 38,7 18,7 132 40 apathisch 24 Pyometra 38,7 11,7 108 obB reduziert 25 Pankreatitis 38,2 3,2 90 obB matt, keine FA


137

Tab. B3: Signalement der 69 klinisch gesunden Hunde und deren Verwendung bei den

verschiedenen Methoden.

Hund Nr. Rasse Alter

(Jahre; Monate) Geschlecht Methode

1 Deutsch Langhaar 4;0 w A,E,F 2 Mischling 7;4 mk A,D,E,F 3 Mischling 6;4 wk A,D,E,F 4 Deutsch Kurzhaar 2;2 mk A,D,E,F 5 NSDT-Retriever 2;0 wk A,D,E,F 6 Australian Shepherd 1;11 W A,D,E,F 7 Beagle 8;0 mk A,D,E,F 8 Leonberger 1;10 M A,D,E,F 9 Jack Russel Terrier 5;5 mk A,D,E,F 10 Mischling 2;11 w A,D,E,F 11 Weimaraner 1;0 m D,E,F 12 Franz. Bulldogge 1;1 m A,D,E,F 13 Boxer 6;9 m A,D,E,F 14 Mischling 3;4 m A,D,E,F 15 Mischling 4;10 w A,D,E,F 16 Boxer 1;9 m D,E,F 17 Labrador 2;0 wk A,B,D,C,E,F 18 Labrador 2;10 mk A,B,E,F 19 Mischling 8;0 mk B,C,D,E,F 20 Deutsche Wachtel 7;5 m A,B,C,D,E,F 21 Shar Pei 3;5 mk A,B,C,D,E,F 22 Bolonka Zwetna 1;0 m B,C,D,E,F 23 Dalmatiner 7;7 w B,C,D,E,F 24 Flatcoated Retriever 1;10 m B,C,D,E,F 25 Lagotto Romagnolo 1;9 m B,D,E,F 26 Mischling 5;0 mk B,C,D,E,F 27 Labrador 1;3 w B,C,D,E,F 28 Golden Retriever 3;1 w B,D,E,F 29 Berner Sennenhund 3;4 wk B,C,E,F 30 Mischling 5;0 mk B,C,D,E,F 31 Australian Shepherd 1;0 w B,C,D,E,F 32 Husky 11;11 wk B,C,D,E,F 33 Golden Retriever 7;0 w B,C,D,E,F 34 Husky 9;6 m B,C,D,E,F 35 Labrador 3;4 wk B,C,D,E,F 36 Irish Wolfhound 4;1 wk B,D,E,F 37 Mischling 9;0 mk B,C,D,E,F 38 Flatcoated Retriever 1;1 m B,C,D,E,F


138

Fortsetzung Tab. B3:

Hund Nr. Rasse Alter

(Jahre; Monate) Geschlecht Methode 39 Mischling 5;4 m B,C,D,E,F 40 Deutsch Drahthaar 1;6 m B,C,D,E,F 41 Rottweiler 1;7 m A,B,D,E,F 42 Beagle 8;0 mk A,D,E,F 43 Labrador 1;6 w A,D,E,F 44 Mischling 4;6 mk A,D,E,F 45 Labrador 3;2 w A,D,E,F 46 Mischling 1;6 mk A,D,E,F 47 Mioritic 4;5 wk A,D,E,F 48 NSDT-Retriever 1;6 wk A,D,E,F 49 Golden Retriever 8;0 m A,D,E,F 50 Australian Shepherd 1;7 wk A,D,E,F 51 Labrador 8;11 m A,B,C,D,E,F 52 Deutsch Drahthaar 1;8 m A,B,C,D,E,F 53 Australian Shepherd 4;4 mk A,B,D,E,F 54 Dobermann 1;2 m A,B,D,E,F 55 Dobermann 5;6 m A,D,E,F 56 Dobermann 1;4 m A,B,D,E,F 57 Malinois 5;0 m A,B,D,E,F 58 Deutscher Schäferhund 1;8 m A,B,D,E,F 59 Dobermann 2;9 wk A,B,D,E,F 60 Dobermann 2;9 w A,B,D,E,F 61 Dobermann 5;6 w A,B,C,D,E,F 62 Deutscher Schäferhund 8;2 w A,C,D,E,F 63 Deutscher Schäferhund 2;4 w A,C,D,E,F 64 Deutscher Schäferhund 2;4 m A,B,C,D,E,F 65 Labrador 2;0 m A,B,C,D,E,F 66 Golden Retriever 9;0 mk A,B,D,E,F 67 Deutscher Schäferhund 3;10 w A,B,D,E,F 68 Malinois 3;0 w A,B,E,F 69 Deutscher Schäferhund 1;4 w A,B,D,E,F

A = kapilläre Blutungszeit, B = PFA-100, C = turbidimetrische Aggregometrie, D = Impedanzaggregometrie, E = Thrombozytenzahl, F = Hämatokrit, NSDT = Nova Scotia Duck Tolling, m = männlich, , mk = männlich kastriert, w = weiblich, wk = weiblich kastriert


139

Tab. B4: Ergebnisse der Messung der kapillären in-vivo Blutungszeit bei 25 Hunden mit


Hund Nr. Messung 1 (sec)

Messung 2 (sec)

Mittelwert (sec)

1 75 75 75 2 165 180 172,5 3 30 45 37,5 4 45 60 52,5 5 - - - 6 30 45 37,5 7 - - - 8 90 120 105 9 30 45 37,5 10 - - - 11 90 90 90 12 90 75 82,5 13 - - - 14 30 60 45 15 65 95 80 16 55 50 52,5 17 65 55 60 18 60 - 60 19 25 30 27,5 20 10 10 10 21 100 105 102,5 22 15 10 12,5 23 165 165 165 24 120 105 112,5 25 150 145 147,5


140

Tab. B5: Ergebnisse der Messung der kapillären in-vivo Blutungszeit bei 47 klinisch

gesunden Hunden.

Hund Nr. Messung 1 (sec)

Messung 2 (sec)

Mittelwert (sec)

1 60 90 75 2 75 105 90 3 60 90 75 4 45 60 52,5 5 45 45 45 6 60 60 60 7 105 75 90 8 45 45 45 9 90 105 97,5 10 45 45 45 11 60 75 67,5 12 60 45 52,5 13 75 60 67,5 14 45 60 52,5 15 105 120 112,5 16 105 120 112,5 17 60 90 75 18 75 105 90 19 90 105 97,5 20 60 45 52,5 21 60 60 60 22 90 105 97,5 23 75 90 82,5 24 60 75 67,5 25 105 90 97,5 26 75 75 75 27 90 60 75 28 45 45 45 29 90 90 90 30 75 105 90 31 45 60 52,5 32 60 75 67,5 33 105 105 105 34 120 135 127,5 35 105 120 112,5 36 75 60 67,5 37 75 75 75 38 60 60 60 39 90 75 82,5 40 60 60 60 41 75 60 67,5 42 45 45 45 43 75 60 67,5 44 60 60 60 45 90 105 97,5 46 45 60 52,5 47 60 60 60

- nicht durchgeführt


141

Tab. B6: Ergebnisse der Messung mit dem PFA-100 bei 25 Hunden mit entzündlichen

Erkrankungen. Zum Einsatz kamen Messzellen mit einer Kollagen/ADP-Beschichtung

(COL/ADP) und mit einer Kollagen/Epinephrin-Beschichtung (COL/EPI).

Hund Nr. COL/ADP COL/EPI

VZ (sec)

GV (µL) VZ (sec) GV

(µL) 1 57 234 >300 618 2 262 584 >300 821 3 >300 618 133 339 4 80 297 >300 765 5 65 279 224 468 6 55 257 177 455 7 61 246 112 300 8 75 336 268 872 9 68 230 157 339 10 57 248 >300 588 11 152 402 216 870 12 83 300 >300 817 13 199 440 >300 757 14 126 375 >300 783 15 111 318 >300 546 16 153 420 >300 765 17 63 257 108 331 18 134 347 >300 621 19 67 252 92 290 20 73 247 121 318 21 102 310 >273 687 22 64 262 >300 512 23 >245 870 >266 871 24 265 161 > 300 140 25 >241 870 >175 871

VZ = Verschlusszeit; GV = Gesamtvolumen


142

Tab. B7: Ergebnisse der Messung mit dem PFA-100 bei 41 klinisch gesunden Hunden. Zum

Einsatz kamen Messzellen mit einer Kollagen/ADP-Beschichtung (COL/ADP) und mit einer

Kollagen/Epinephrin-Beschichtung (COL/EPI).

Hund Nr. COL/ADP COL/EPI

VZ (sec) GV (µL) VZ (sec) GV (µL) 1 52 239 301 679 2 56 248 301 663 3 57 253 109 364 4 69 266 234 573 5 56 255 199 578 6 69 276 301 789 7 72 303 152 474 8 56 257 174 479 9 72 289 119 372 10 72 266 301 796 11 59 252 112 367 12 74 298 274 871 13 82 289 301 802 14 57 239 94 292 15 66 284 115 391 16 47 244 76 318 17 65 274 285 869 18 48 242 151 449 19 59 263 301 832 20 55 259 110 374 21 57 273 301 864 22 55 252 99 343 23 68 255 144 387 24 70 273 147 456 25 78 263 301 708 26 62 258 301 705 27 59 231 96 288 28 70 268 113 351 29 77 288 272 758 30 56 242 91 316 31 74 275 301 582 32 99 269 73 278 33 56 251 102 320 34 77 277 301 737 35 67 272 301 800 36 52 247 105 349 37 75 291 121 392 38 69 303 301 854 39 57 258 261 592 40 78 281 81 313 41 64 256 90 338

VZ = Verschlusszeit; GV = Gesamtvolumen


143

Tab. B8: Ergebnisse der maximalen Aggregation (%) gemessen mittels turbidimetrischer

Aggregometrie bei 25 Hunden mit entzündlichen Erkrankungen. Zum Einsatz kamen die

Agonisten ADP und Kollagen in verschiedenen Konzentrationen.

Hund Nr. ADP Kollagen

40 µmol/L

20 µmol/L

10 µmol/L

40 µg/mL

20 µg/mL

10 µg/mL

1 56,5 82,5 37,8 82,8 106,7 91,3 2 33,3 58,6 39,9 48,1 50,6 80,9 3 60,6 57,1 52,4 99,6 118,1 128 4 32,8 32,1 44,3 66,5 62,3 74,9 5 36,6 49,9 43,4 56,4 75,4 71,6 6 65,4 68 46,8 59,2 73 93,8 7 52,6 56,2 23,8 46 71,2 58,4 8 6,6 21,4 0,2 - - - 9 31,4 19,6 32 60,6 64,4 78,4 10 74,8 31,8 24,9 64,8 77,2 69,8 11 3,1 4,7 5,6 74,3 49,5 55,2 12 - - - - - - 13 17,7 21,7 16,3 - - - 14 34,5 37,1 41,1 21,2 40,2 39 15 - - - - - - 16 51,8 50,8 16 40,4 49 59,4 17 54,2 64,4 63,1 44,4 59,3 60,8 18 26,7 29,6 28,6 27,8 34,7 32,5 19 86,6 84,6 42,2 79,6 85,6 84,6 20 - - - 59,8 66,6 73,8 21 88,8 63,8 53,5 74,7 73,1 90,8 22 - - - - - - 23 - - - - - - 24 85,1 81,7 93,2 89,5 92,6 79,4 25 5,3 12,9 20,8 10,4 22 20,9



144

Tab. B9: Ergebnisse der maximalen Aggregation (%) gemessen mittels turbidimetrischer

Aggregometrie bei 27 klinisch gesunden Hunden. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP

und Kollagen in verschiedenen Konzentrationen.

Hund Nr. ADP Kollagen

40 µmol/L

20 µmol/L

10 µmol/L

40 µg/mL

20 µg/mL

10 µg/mL

1 62,5 64,7 44,4 87,9 66,1 72,3 2 50,3 38,7 54,2 49,8 49,4 67,8 3 70,5 37,0 20,7 76,9 97,1 120,7 4 40,6 27,8 23,8 83,6 75,8 86,6 5 70,8 53,9 49,8 91,2 91,9 71,9 6 79,4 91,8 47,0 75,7 90,0 81,4 7 53,8 58,7 23,1 66,7 78,2 68,7 8 70,9 22,5 22,7 83,4 83,2 86,2 9 55,6 32,5 56,5 74,0 76,2 80,3 10 45,3 43,0 53,7 81,8 61,8 91,2 11 128,8 83,3 54,6 87,4 101,6 72,4 12 97,8 81,3 72,8 78,2 127,4 96,1 13 67,0 78,5 60,7 68,9 68,2 74,1 14 77,3 86,6 50,8 85,1 73,6 90,7 15 91,9 75,7 68,7 85,8 105,8 79,8 16 76,1 66,1 39,0 89,2 67,5 68,3 17 70,2 75,8 61,4 85,0 100,4 71,5 18 79,7 62,0 79,0 75,9 89,8 93,1 19 102,8 98,7 78,3 81,6 97,5 86,3 20 51,5 35,5 49,3 92,3 68,8 84,0 21 73,9 76,8 53,8 62,5 77,4 82,1 22 55,7 38,3 45,6 76,9 86,0 84,3 23 29,0 43,5 49,8 48,8 52,0 60,0 24 47,4 61,0 46,0 67,4 85,2 89,4 25 38,5 58,2 54,9 57,4 70,8 65,5 26 77,1 76,3 43,4 93,3 100,3 73,5 27 53,5 28,8 19,1 27,8 40,0 46,3



145

Tab. B10: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) gemessen mit dem Multiplate®

Aggregometer bei 25 Hunden mit entzündlichen Erkrankungen. Zum Einsatz kamen die

Agonisten ADP, Kollagen und AS in verschiedenen Konzentrationen.

Hund Nr.

ADP Kollagen AS 20

µmol/L 10

µmol/L 5

µmol/L 10

µg/mL 5

µg/mL 3

µg/mL 1

mmol/L

0,5 mmol/

L 1 2423 2558 2141 1168 2194 1719 1592 1988 2 1006 812 1089 1223 1190 1371 551 599 3 2069 1861 1364 2683 2892 2871 953 2244 4 1825 2290 2497 2746 3060 2929 1311 501 5 4046 4542 3245 4780 4926 4832 1071 950 6 3269 3256 3503 3177 3258 2794 2303 1935 7 3155 2761 2827 4333 4726 4443 1429 1062 8 3644 3541 4131 3703 3791 3775 2965 3025 9 2944 3667 3231 5553 5306 5319 3231 2344 10 1204 1140 1064 3911 3990 3556 1248 1686 11 2734 3034 2592 1321 1896 1899 765 771 12 2047 2183 2184 3462 3165 2611 1874 1543 13 3098 3425 2546 3210 4522 3785 887 1009 14 2528 2560 2687 2549 4183 3730 1769 1459 15 367 929 818 2038 1506 2262 960 593 16 2636 2782 2778 4195 3930 3986 2824 2061 17 586 520 563 3736 3547 2979 535 761 18 1652 1911 1881 2339 3288 3077 2312 2439 19 2637 2122 1671 4056 4002 4107 1021 1190 20 1069 773 898 1995 2571 1326 906 1015 21 3163 2895 2982 2596 2362 2898 2194 1019 22 3097 3290 1641 4522 4061 4395 144 198 23 269 266 525 2030 2433 1751 269 289 24 2359 2509 2266 2275 2365 2618 2073 2265 25 1699 1499 1242 1461 1736 1611 2179 402


146

Tab. B11: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) gemessen mit dem Multiplate®

Aggregometer bei 65 klinisch gesunden Hunden. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP,

Kollagen und AS in verschiedenen Konzentrationen.

Hund Nr.

ADP Kollagen AS 20

µmol/L 10

µmol/L 5

µmol/L 10

µg/mL 5

µg/mL 3

µg/mL 1

mmol/L 0,5

mmol/L 1 2254 2209 2272 3137 3048 3083 2278 2175 2 1904 1819 1778 2574 2284 2121 2070 1683 3 3416 3448 3828 3302 3435 2949 995 1086 4 2405 2502 2569 2560 3005 2676 2713 2759 5 2145 2186 2242 2399 2199 2111 2004 1808 6 2710 2999 2917 2893 2682 3342 2739 2446 7 1258 1481 1313 1174 1636 1689 1463 1589 8 1865 1790 1003 2605 2770 2608 2377 2147 9 1751 1671 1725 1780 2017 1805 1628 1714 10 2454 2646 2179 2726 2957 2896 2611 2834 11 2360 2702 2533 2839 3142 3265 1469 2434 12 2670 3133 2309 3007 3103 3218 1424 1570 13 2198 2423 2440 2412 2459 2830 2456 2338 14 2481 2248 2040 2522 2441 2379 2345 2082 15 1914 2063 1984 3017 2961 2694 1831 2463 16 2431 2606 1534 3048 2683 3103 2542 2942 17 1733 2076 1672 2027 2222 2113 2279 1844 18 2158 2393 2061 2573 3232 2544 1170 1305 19 2238 2539 2722 2994 3141 2862 1737 1995 20 1229 1763 2039 2484 2969 2713 1388 1174 21 3361 3547 3327 3501 3255 3500 2571 2694 22 3091 2934 1159 3499 3325 3309 1484 631 23 1665 1862 1819 2457 2648 2558 2031 1416 24 1861 2136 2104 2389 2553 2346 1245 2005 25 1840 1951 1570 2408 2374 2027 2904 2275 26 1869 1776 700 2476 3073 2899 2511 2710 27 2399 2327 2631 2775 2590 3042 2718 2911 28 2676 2754 2953 2563 2976 2423 3230 2219 29 3174 3068 2805 3023 3460 1757 3457 2615 30 2264 2731 2445 2613 2361 2741 3560 3007 31 2626 2813 2848 3717 2767 3622 2301 2764 32 1446 1637 1721 2121 2134 1853 1493 934 33 1829 1914 1929 2023 2604 2585 1522 1667


147


Hund Nr.

ADP Kollagen AS 20

µmol/L 10

µmol/L 5

µmol/L 10

µg/mL 5

µg/mL 3

µg/mL 1

mmol/L 0,5

mmol/L 34 1860 1835 1901 2835 2954 2546 2429 2907 35 2393 2685 2489 2693 2836 2971 3179 2931 36 2450 2354 2078 2362 2338 2277 2511 2799 37 1820 1806 1674 3359 3269 3322 1113 1102 38 2237 2900 2456 2766 3074 3184 1011 1973 39 2560 2426 2511 2637 2704 2917 2478 2834 40 2312 2406 2405 3027 2919 2964 2805 2954 41 1554 1872 1949 2430 2479 2123 2089 1991 42 2449 2388 2544 3228 3516 1572 3026 2725 43 1989 1996 1502 2356 2602 2620 1919 832 44 1868 2010 591 2307 2237 2599 1883 1909 45 1702 1590 1116 3389 3296 780 1499 1117 46 2254 2367 2217 1899 2442 1479 1156 779 47 1889 2069 1972 2204 2315 2146 2304 2301 48 2747 2473 2479 2363 2833 2809 2072 1552 49 2810 3143 2560 2663 3082 2954 1557 831 50 2113 1907 2007 2832 2269 2571 1621 1471 51 1745 2075 2094 2064 2599 2272 2365 2023 52 2268 2651 2705 2754 2799 2441 1703 2034 53 2748 2680 1835 4013 3157 3622 1072 910 54 1831 2005 1911 2146 2430 2187 1992 1392 55 2575 2711 2526 2397 2545 2278 2250 1624 56 2171 2362 2157 2839 3187 3062 1402 1575 57 2727 3213 3031 2856 2750 3378 1437 1728 58 2354 3035 2544 2616 2856 2876 1701 1748 59 2560 2602 3186 2403 2901 3005 3155 1558 60 2788 3148 3175 2511 2890 2693 2110 2264 61 2618 2941 2906 2791 3444 3112 3005 2366 62 1498 1498 1378 1833 1721 1594 1293 1291 63 2532 2741 2692 3014 2434 2805 2608 1861 64 1899 2098 1998 2702 2403 2469 2858 2167 65 2575 2540 2790 2312 2956 2932 2530 2589


148

Tab. B12: Thrombozytenzahl (x10³/µL) und Hämatokrit (%) der 25 Hunde mit


Hund Nr. Thrombozyten-zahl Hämatokrit

1 377 45,7 2 51 45,3 3 456 40,6 4 346 34,3 5 352 27,5 6 330 42,0 7 243 42,3 8 115 27,0 9 355 47,4 10 257 42,7 11 330 36,4 12 130 37,1 13 76 37,1 14 78 38,0 15 147 46,9 16 384 32,0 17 233 41,0 18 178 44,8 19 220 53,0 20 258 49,2 21 248 43,4 22 379 38,0 23 42 24,2 24 230 54,0 25 223 23,4


149

Tab. B13: Thrombozytenzahl (x10³/µL) und Hämatokrit (%) von 69 klinisch gesunden

Hunden.


1 309 48,9 2 231 45,9 3 420 51,6 4 126 45,6 5 257 47,9 6 354 42,4 7 248 47,5 8 217 45,8 9 330 43,3 10 143 49,5 11 337 52,1 12 264 46,5 13 368 45,2 14 338 50,6 15 267 46,9 16 172 48,8 17 361 48,9 18 266 50,2 19 256 48,1 20 237 43,4 21 293 46,4 22 237 50 23 413 40,2 24 277 41,8 25 349 45,6 26 235 42 27 341 49,4 28 375 44,4 29 288 46 30 293 54,5 31 307 42,7 32 433 42,4 33 432 43,5 34 281 43 35 288 48,8 36 169 43,9


150



37 331 41,8 38 362 50 39 249 50,8 40 356 43,6 41 254 47,2 42 318 51 43 308 48,7 44 217 51,3 45 659 45,8 46 216 55 47 196 51,8 48 282 49,3 49 469 40 50 307 42,7 51 324 44,5 52 279 48,2 53 252 50,5 54 230 52,2 55 264 57,4 56 254 52 57 287 54,4 58 172 55 59 267 50,1 60 322 51 61 301 48,8 62 195 48,7 63 234 50,6 64 241 54,6 65 210 44 66 554 41,4 67 252 55 68 270 51,8 69 313 50,6

XI Danksagungen

151

XI Danksagungen

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Reinhard Mischke für die Überlassung des interessanten Themas, die stets engagierte Betreuung und die unermüdlichen Hilfestellungen beim Anfertigen dieser Arbeit. Herrn Prof. Dr. I. Nolte danke ich für die Möglichkeit der Durchführung meiner Versuche in der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Ich bedanke mich bei allen Mitarbeitern des Labors, insbesondere Herrn Dirk Menzel, für die freundliche Hilfe bei der Durchführung der Laborarbeit und die Beantwortung vieler Fragen. Darüberhinaus möchte ich mich bei allen anderen Mitarbeitern der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover bedanken, die mir bei der Entnahme der Blutproben behilflich waren. Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, Martina und Faouzi Abid, meinem Bruder Benjamin Abid und meiner Großmutter Gisela Rauchholz, die durch ihren fortwährenden liebevollen Beistand und ihre finanzielle Unterstützung diese Arbeit erst ermöglicht haben. Ich danke besonders meinen Mitdoktoranden Jan-Wighard Minde, Jette Schönig, Christina Witten, Annika Pukropski und Elisabeth Döderlein, die wohl in manchen Momenten die einzigen Menschen waren, die Situationen nachempfinden konnten und für gegenseitiges Bemitleiden, aber auch Motivation zur Verfügung standen. Weiterhin gilt mein Dank meinen Freundinnen Annika Ferkau, Lisa Homburg, Melanie Gundlach, Svenja Lösken, Lisa Krahn, Verena Reupke, Caro Gietz, Britta Lövenich, Birke Großheim und Katrin Schaper dafür, dass es sie gibt und dass sie, ob nun am Telefon oder persönlich, immer ein offenes Ohr für mich hatten. Last but not least danke ich meiner Hündin Maja, die mich gezwungen hat, mindestens drei Mal am Tag den Schreibtisch zu verlassen.

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