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Tierärztliche Hochschule Hannover

Die Oxidation der Methoxyphenole

Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol in

Pökellaken und in erhitzter Fleischmatrix

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Sarah-Maria Bölicke

Rostock

Hannover 2015

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Waldemar Ternes

Institut für Lebensmitteltoxikologie und

Chemische Analytik

Abteilung Chemische Analytik

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Waldemar Ternes

2. Gutachter: Prof. Dr. Lüppo Ellerbroek

Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2015

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Fritz-Ahrberg-Stiftung (Hannover) gefördert.

Meiner Mutter und meinem Mann

Teile dieser Arbeit wurden zur Veröffentlichung in der internationalen Fachzeitschrift

„Meat Science“ unter folgenden Titeln eingereicht:

Bölicke, S.-M., Ternes, W.

Isolation and identification of oxidation products of syringol from brines and heated meat

matrix

Und

Bölicke, S.-M., Ternes, W.

The formation of oxidation products of guaiacol in curing brine and heated meat matrix

Des Weiteren wurden Teile dieser Arbeit bereits als Poster unter folgendem Titel anlässlich

der Internationalen Fachmesse „EuroTier 2014“ vom 11.-14.November 2014 in Hannover

präsentiert und mit den Fachbesuchern diskutiert:

Kalbe, S.-M., Ternes, W.

Abbau von Phenolen in Fleischerzeugnissen und Bildung von Nitro-und Nitrosoverbindungen

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ..................................................................................................................................... I

1. Einleitung ................................................................................................................................... 1

2. Literaturübersicht ....................................................................................................................... 5

2.1. Rauch, Raucharomen und geräucherte Lebensmittel ............................................................. 5

2.1.1. Rauch .................................................................................................................................. 5

2.1.2. Raucharomen ...................................................................................................................... 5

2.1.3. Geräucherte Lebensmittel ................................................................................................... 6

2.2. Methoxyphenole des Räucherrauchs ...................................................................................... 7

2.2.1. Entstehung .......................................................................................................................... 7

2.2.2. Eigenschaften ..................................................................................................................... 9

2.2.3. Nachweis und Vorkommen in Raucharomen und geräucherten Fleischprodukten .......... 12

2.2.4. Reaktion mit Nitrit in wässrigem Milieu .......................................................................... 17

2.2.4.1. Nitrierung und Nitrosierung ......................................................................................... 17

2.2.4.2. Dimerisierung ............................................................................................................... 20

2.2.5. Reaktion mit Nitrit in Fleischprodukten ........................................................................... 23

2.3. Verwendung und Reaktion von Nitrit in Fleischprodukten .................................................. 24

2.4. Ascorbinsäure ....................................................................................................................... 27

2.4.1. Verwendung und Reaktion in Fleischprodukten .............................................................. 27

2.4.2. Antinitrosierende Wirkung ............................................................................................... 28

2.5. Analytische Methoden (Grundprinzipien) ............................................................................ 30

2.5.1. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ................................................................ 30

2.5.2. Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigchromatographie-

Massenspektrometrie (LC-MS) ........................................................................................ 31

3. Material und Methoden ............................................................................................................ 33

3.1. Geräte und Chemikalien ....................................................................................................... 33

Inhaltsverzeichnis

II

3.2. Herstellung der Reagenzien .................................................................................................. 33

3.3. Probenherstellung und –aufbereitung ................................................................................... 34

3.3.1. Wässriges Reaktionsmodell .............................................................................................. 34

3.3.1.1. Herstellung ................................................................................................................... 34

3.3.1.2. Probenentnahme ........................................................................................................... 35

3.3.2. Fleischproben ................................................................................................................... 36

3.3.2.1. Herstellung ................................................................................................................... 36

3.3.2.1.1. Fleischproben mit unterschiedlichen NaNO2-Zusätzen ...................................... 36

3.3.2.1.2. Fleischschäume .................................................................................................. 37

3.3.2.1.3. Wiederfindungsraten .......................................................................................... 37

3.3.2.2. Versuchsdurchführung.................................................................................................. 38

3.3.2.3. Probenaufbereitung ....................................................................................................... 39

3.3.2.3.1. Methanolextraktion............................................................................................. 39

3.3.2.3.2. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE) ......................................... 40

3.4. Analyse der Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte mittels HPLC-UV/VIS ...... 41

3.4.1. HPLC-UV/VIS-System .................................................................................................... 41

3.4.1.1. Aufbau .......................................................................................................................... 41

3.4.1.2. Kalibrierung .................................................................................................................. 42

3.4.1.3. Probenmessung und Gehaltsbestimmung ..................................................................... 45

3.4.1.3.1. Proben aus wässrigem Reaktionsmodell ............................................................ 45

3.4.1.3.2. Fleischextrakt ..................................................................................................... 46

3.4.1.4. Nachweis- und Bestimmungsgrenzen .......................................................................... 47

3.4.1.5. Wiederfindungsraten .................................................................................................... 48

3.5. Qualitative Analyse der Methoxyphenole und ihrer Oxidationsprodukte ............................ 48

3.5.1. Probenaufbereitung........................................................................................................... 48

3.5.2. HPLC-DAD ...................................................................................................................... 49

3.5.3. HPLC-ECD ...................................................................................................................... 49

Inhaltsverzeichnis

III

3.5.4. Spektrophotometrie .......................................................................................................... 50

3.5.5. GC-MS ............................................................................................................................. 51

3.5.6. LC-ESI-MS ...................................................................................................................... 51

3.6. Statistische Auswertung ....................................................................................................... 54

4. Ergebnisse und Diskussion ....................................................................................................... 55

4.1. Chromatographische Trennung und Identifizierung der Methoxyphenole und ihrer

Oxidationsprodukte mittels HPLC-UV/VIS und DAD, GC-MS und LC-ESI-MS .............. 55

4.1.1. Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol ......................................... 55

4.1.2. Syringol und Oxidationsprodukte ..................................................................................... 59

4.1.3. Guajakol und Oxidationsprodukte .................................................................................... 67

4.1.4. 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol und ihre Oxidationsprodukte ........................... 74

4.2. Oxidation von Syringol und Guajakol im wässrigen Reaktionsmodell und in der

Fleischmatrix ........................................................................................................................ 80

4.2.1. Methodenentwicklung und Wiederfindungsraten ............................................................ 80

4.2.2. Die Oxidation von Syringol in Pökellaken in Abhängigkeit vom pH-Wert und der

Ascorbinsäurekonzentration ............................................................................................. 84

4.2.2.1. Ergebnisse ..................................................................................................................... 84

4.2.2.2. Diskussion .................................................................................................................... 87

4.2.3. Die Oxidation von Syringol in der Fleischmatrix nach Erhitzen und simulierter

Verdauung in Abhängigkeit vom Nitrit- und Sauerstoffgehalt ........................................ 89

4.2.3.1. Ergebnisse ..................................................................................................................... 89

4.2.3.2. Diskussion .................................................................................................................... 94

4.2.4. Die Oxidation von Guajakol in Pökellaken in Abhängigkeit vom pH-Wert und der

Ascorbinsäurekonzentration ............................................................................................. 95

4.2.4.1. Ergebnisse ..................................................................................................................... 95

4.2.4.2. Diskussion .................................................................................................................... 97

4.2.5. Die Oxidation von Guajakol in der Fleischmatrix nach Erhitzen und simulierter

Verdauung in Abhängigkeit vom Nitrit- und Sauerstoffgehalt ........................................ 99

Inhaltsverzeichnis

IV

4.2.5.1. Ergebnisse ..................................................................................................................... 99

4.2.5.2. Diskussion .................................................................................................................. 102

5. Zusammenfassung .................................................................................................................. 104

6. Summary................................................................................................................................. 108

7. Literaturverzeichnis ................................................................................................................ 111

8. Anhang ................................................................................................................................... 124

8.1. Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................... 124

8.2. Glossar ................................................................................................................................ 125

8.3. Chemikalienliste ................................................................................................................. 125

8.4. Geräteliste ........................................................................................................................... 128

8.5. HPLC-UV/VIS-Chromatogramm der vier Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-

Methylsyringol und 4-Methylguajakol unter Verwendung der HPLC-Bedingungen für die

Pökellaken (vgl. Kap. 4.1.1.) .............................................................................................. 131

8.6. HPLC-UV/VIS-Chromatogramm der vier Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-

Methylsyringol und 4-Methylguajakol unter Verwendung der HPLC-Bedingungen für die

Fleischextrakte (vgl. Kap. 4.1.1.) ....................................................................................... 132

8.7. Übersicht der für die Identifizierung der aus den Pökellaken bzw. Fleischproben isolierten

Verbindungen verwendeten Analyseverfahren (vgl. Kap. 4.1.) ......................................... 133

8.8. Vergleichende Darstellung der LC-ESI-MS Spektren bzw. GC-MS Spektren der aus der

Pökellaken bzw. aus den Fleischproben isolierten Oxidationsprodukte 6-Nitrosoguajakol, 4-

Nitroguajakol und Nitrososyringol (vgl. Kap. 4.1.) ........................................................... 135

8.9. Messwerttabellen zur Berechnung des molaren Extinktionskoeffizienten von Syringol und

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (vgl. Kap. 3.5.4. und 4.2.3.1.) .................. 138

8.10. Messwerttabellen der Gehalte an Guajakol und Syringol sowie ihrer Oxidationsprodukte in

den Pökellaken (vgl. Kap. 4.2.2. bis 4.2.5.) ........................................................................ 139

8.11. Messwerttabellen der Gehalte an Guajakol und Syringol sowie ihrer Oxidationsprodukte in

den Fleischproben (vgl. Kap. 4.2.2. bis 4.2.5.) ................................................................... 141

9. Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................... 145

10. Tabellenverzeichnis ................................................................................................................ 150

Inhaltsverzeichnis

V

11. Danksagung ............................................................................................................................ 152

1. Einleitung

1

1. Einleitung

Das Räuchern gilt neben dem Trocknen und Salzen als eines der ältesten Verfahren zur

Haltbarmachung von Lebensmitteln. Gleichzeitig erfolgt durch den Rauch eine für dieses

Konservierungsverfahren typische Aromatisierung, welche durch den Eintrag veschiedenster

chemischer Verbindungen in das Räucherprodukt zustande kommt. Die Ausbildung dieses

Räucheraromas hat dazu geführt, dass die Anwendung verschiedener Räuchertechniken auch

heute noch eine große Rolle in der Zubereitung von Lebensmitteln spielt (BALTES et al.

1981).

Grundlage aller Räuchertechniken ist die thermische Zersetzung von Holz, die auch als

Pyrolyse bezeichnet wird. Bei der Pyrolyse der Holzbestandteile Cellulose, Hemicellulose

und Lignin kommt es zur Bildung verschiedenster flüchtiger chemischer Verbindungen, wie

Aldehyde, Phenole, Säuren, Carbonyle und Lactone, die neben antimikrobiellen und

antioxidativen auch über aromatisierende Eigenschaften verfügen (FREDE 2010) und sich

zusammen mit Teer- und Rußpartikeln auf der Oberfläche von geräucherten Lebensmitteln

anlagern bzw. in die Lebensmittelmatrix eindringen (WITTKOWSKI 1985).

Besondere Bedeutung kommt hierbei den phenolischen Verbindungen zu, die v.a. durch den

thermischen Abbau des Lignins entstehen. Sie verfügen sowohl über antioxidative

(KJÄLLSTRAND u. PETERSSON 2001b) als auch aromatisierende Wirkungen (BALTES u.

SÖCHTIG 1979), wobei innerhalb der Gruppe der Rauchphenole besonders die

Methoxyphenole von Bedeutung sind, da diese die größte Phenolfraktion der Räucherrauches

ausmachen (BALTES et al. 1981).

Vor dem Räuchern erfolgt bei vielen Lebensmitteln das Pökeln, d.h. der Zusatz von Pökelsalz

das überwiegend Kochsalz aber zu geringen Anteilen (0,4 %-0,5 %) auch Nitrit bzw. dessen

Salze enthält. Neben den positiven lebensmitteltechnologischen Eigenschaften des Nitrits, wie

z. B. der Konservierung, der Aromatisierung und Umrötung von Fleischprodukten, birgt

dessen Einsatz auch nachteilige Effekte (TERNES et al. 2005). Hierzu gehören u.a. die

Gefahr der Nitrosaminbildung sowie der Nitrosierung anderer im Lebensmitel enthaltener

Verbindungen, wie z. B. der Phenole. Für viele Phenole und ihre nitrosierten Derivate ist

bisher nachgewiesen worden, dass sie die Bildung kanzerogener Nitrosamine fördern und

1. Einleitung

2

auch selbst genotoxisches Potential besitzen (DAVIES u. MCWEENY 1977; KIKUGAWA u.

KATO 1988). Aus diesem Grund gilt den Phenolen des Räucherrauches, welche sich in den

Lebensmitteln in Gehalten von bis zu 280 mg/kg anreichern können, besonderes Interesse

(LUSTRE u. ISSENBERG 1970).

In Abhängigkeit von vielen Faktoren, wie z. B. der verwendeten Holzart und des

Räucherverfahrens (HITZEL et al. 2013a; PÖHLMANN et al. 2013a, b) kommt es vor allem

zur Anreicherung der Methoxyphenole Syringol und Guajakol und ihren Derivaten im

Räucherrauch aber auch in Rauchkondensaten, die anstelle von frischem Rauch für die

Lebensmittelzubereitung verwendet werden (LUSTRE u. ISSENBERG 1969; GILBERT u.

KNOWLES 1975; BALTES u. SÖCHTIG 1979). Bei der Räucherung unter Verwendung von

Hartholz wie Birke oder Erle entstehen zum überwiegenden Teil Syringol und seine

alkylsubstituierten Derivate, während die Pyrolyse von Weichholz eher zur Bildung von

Guajakol und seinen Derivaten führt (KJÄLLSTRAND et al. 2000; KJÄLLSTRAND u.

PETERSSON 2001a).

In homogenisierten Räucherspeckproben konnten bis zu 84 mg/kg unsubstituiertes Syringol

und 35,6 mg/kg an Guajakol nachgewiesen werden (LUSTRE u. ISSENBERG 1970). Da sich

die Rauchinhaltstoffe und somit auch die Methoxyphenole besonders an der Oberfläche des

Lebensmittels anlagern, ist in den äußeren Schichten der geräucherten Produkte sogar mit

noch höheren Konzentrationen selbiger zu rechnen (BRATZLER et al. 1969; KNOWLES et

al. 1975a). Auch bei der Pökelung erfolgt die Einwirkung der Pökelstoffe vor allem in den

Randbereichen-abgesehen von der Spritzpökelung, bei der die Lake direkt in das Fleisch

injiziert wird (TERNES et al. 2005). Unter Einwirkung von Hitze, wie z. B. bei der

Heißräucherung (bis zu 80 °C) oder auch beim Braten von geräucherten und gepökelten

Lebensmitteln, besteht folglich die Gefahr der Nitrosierung der Phenole durch über die

Pökelung eingebrachtes Nitrit.

Die Möglichkeit der Bildung von Nitrosophenolen in den auf diese Weise zubereiteten

Fleischprodukten führte zu zahlreichen Untersuchungen, die sich unter anderem mit der

toxikologischen Charakterisierung von Nitrosophenolen (OHSHIMA et al. 1989), der Bildung

selbiger im wässrigen Milieu und schließlich ihrem Nachweis in Lebensmitteln befassten

(KNOWLES et al. 1974b, 1975b; HOFMANN 1990).

1. Einleitung

3

Verschiedene nitrosierte geräucherte Fleischprodukte und Rauchkondensate zeigten in vitro

genotoxisches Potential. Besonders die aufgereinigte Phenolfraktion der Rauchkondensate

hatte nach ihrer Nitrosierung eine große genotoxische Wirkung in der Bakterienkultur. Die

Untersuchung der einzelnen Rauchphenole ergab, dass nitrosiertes Syringol in vitro keine

genotoxischen Eigenschaften besitzt, während für nitrosieretes Guajakol geringe genotoxische

Effekte nachgewiesen werden konnten (OHSHIMA et al. 1989; ROSENKRANZ et al. 1990).

Sowohl in vitro als auch in vivo verfügt Syringol über die Fähigkeit, die Nitrosaminbildung zu

verhindern (VIRK u. ISSENBERG 1985, 1986) und hat gleichzeitig antioxidative

Eigenschaften (BARCLAY et al. 1997).

Bisherige Extraktionsversuche von Reaktionsprodukten von Syringol mit Nitrit aus

geräucherten und gepökelten Lebensmitteln waren nicht erfolgreich. Im Gegensatz dazu

konnte nitriertes Guajakol und in einem Fall auch 6-Nitroso-4-propylguajakol und 6-Nitroso-

4-methylguajakol aus erhitztem Räucherspeck isoliert werden, wobei die eindeutige

Identifikation der letzten beiden Substanzen nicht erfolgte (KNOWLES et al. 1974b, 1975b).

Obwohl die Bildung von nitrosierten bzw. nitrierten Syringol- und Guajakolderivaten in

erhitzten und gepökelten Rauchprodukten wahrscheinlich ist, gelang somit deren Nachweis

nur in sehr begrenztem Umfang. Weitere Oxidationsprodukte der beiden Methoxyphenole

Guajakol und Syringol konnten bisher nur in wässrigem Medium nachgewiesen werden.

Guajakol reagiert im wässrigen saurem Milieu vor allem unter Bildung seiner

Nitroverbindungen (KUNG 1968; KITANOVSKI et al. 2014), während Syringol unter

selbigen Bedingungen und unter Einwirkung von UV-Licht, sowie bei enzymatischer oder

mikrobieller Oxidation vor allem dimerisiert (KUNG 1968; BETTS u. KING 1991; SUN et

al. 2010; ADELAKUN et al. 2012).

Abgesehen davon, dass bisher keine nitrosierten Reaktionsprodukte von Syringol, Guajakol,

4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol eindeutig in der Fleischmatrix nachgewiesen werden

konnten, gibt es keine Untersuchungen darüber, inwieweit unterschiedliche

Oxidationsbedingungen, z. B. verschiedene Nitritkonzentrationen, die Bildung von nitrierten

und nitrosierten Reaktionsprodukten dieser Phenole in der Fleischmatrix beeinflussen und ob

der zusätzliche Einsatz von Sauerstoff in Form von Schäumen, wie er bei der Herstellung von

Fleischmousses und –parfaits erfolgt (EHLERT et al. 1980), eine Auswirkung auf diesen

Prozess hat.

1. Einleitung

4

Ziel dieser Studie ist es daher, die Bildung von Reaktionsprodukten der vier bedeutensten

Methoxyphenole des Räucherrauches unter Nitriteinwirkung sowohl im wässrigen Milieu als

auch in der Fleischmatrix zu erforschen. Als wässrige Reaktionsmodelle dienen hierbei

Pökellaken, die unterschiedliche Konzentrationen an Ascorbinsäure enthalten. Der

Phenolabbau und die Produktbildung wird in Abhängigkeit des Gehaltes dieses

Antioxidationsmittels, sowie bei verschiedenen pH-Werten untersucht.

Innerhalb der Fleischmatrix wird die Auswirkung unterschiedlicher Nitritkonzentrationen auf

Oxidation der Phenole untersucht, wobei neben der gesetzlich vorgegebenen

Nitrithöchstmenge von 150 mg/kg (Zusatzstoffzulassungsverordnung) auch höhere und -im

Falle von Syringol- auch niedrigere Nitritkonzentrationen zum Einsatz kommen, um die

Entstehung der Reaktionsprodukte auch unter mehr oder weniger begünstigten

Oxidationsbedingungen zu untersuchen. Des Weiteren wird der Effekt von erhöhten

Sauerstoffkonzentrationen in der Fleischmatrix auf die Produktbildung analysiert.

Die zu untersuchenden Fleischproben werden zunächst auf 80 °C erhitzt, um die

Hitzeeinwirkung beim Heißräuchern oder Braten von Fleischerzeugnissen nachzuahmen,

anschließend erfolgt die simulierte Verdauung der Fleischproben mittels Pepsin und

Salzsäure, um die Umsetzung der Analyten unter Reaktionsbedingungen, wie sie im

Magenmilieu vorliegen, zu untersuchen.

Die erzielten Ergebnisse sollen Aufschluss darüber geben, ob und in welchem Umfang es in

Pökellaken und innerhalb der Fleischmatrix zum Abbau der Methoxyphenole, v.a. von

Syringol und Guajakol, infolge der Umsetzung mit Nitrit kommt und welche

Reaktionsprodukte hierbei entstehen.

Hierbei ist zu vermuten, dass unter günstigen Oxidationsbedingungen, wie erhöhten Nitrit-

und Sauerstoffkonzentrationen, eine vermehrte Produktbildung stattfindet. Der Nachweis der

Bildung dieser Verbindungen unter Bedingungen, wie sie in der Lebensmittelverarbeitung

üblich sind, würde einen wichtigen Beitrag für die Bewertung gepökelter und geräucherter

Lebensmittel leisten.

2. Literaturübersicht

5


2.1. Rauch, Raucharomen und geräucherte Lebensmittel

2.1.1. Rauch

Das Räuchern ist eines der ältesten Verfahren zur Konservierung von Lebensmitteln. Als

Rauch wird hierbei laut "Aromenverordnung (Artikel 22 d. Verordnung zur Neuordnung

lebensmittelrechtlicher Kennzeichnungsvorschriften) in der Fassung der Bekanntmachung

vom 2. Mai 2006 (BGBl. I S. 1127), die zuletzt durch Artikel 1 der Verordnung vom 29.

September 2011 (BGBl. I S. 1996) geändert worden ist" der frisch entwickelte Rauch aus

naturbelassenen Hölzern, Zweigen, Heidekraut und Nadelholzsamenständen unter

Mitverwendung von Gewürzen definiert. Räucherrauch gilt als Zusatzstoff. Er enthält

verschiedene Komponenten, denen eine antimikrobielle (Aldehyde, Phenole, Säuren),

antioxidative (Phenole, Phenolaldehyde, Phenolsäuren) und aromabildende (Phenole,

Carbonyle, Lactone) Wirkung nachgewiesen worden ist. Des Weiteren sind Carbonyle und

Phenolaldehyde an der Farbbildung des Räuchergutes beteiligt.

Neben diesen Inhaltsstoffen, die die gewünschte Haltbarkeit geräucherter Lebensmittel

bewirken, kommt es beim Räuchern auch zur unerwünschten Bildung kanzerogener

polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK). Diese entstehen bei der Verbrennung

organischen Materials, v.a. bei langen Räucherzeiten und hohen

Rauchentstehungstemperaturen (> 600 °C) (FREDE 2010).

2.1.2. Raucharomen

Laut „VERORDNUNG (EG) Nr. 2065/2003 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND

DES RATES vom 10. November 2003 über Raucharomen zur tatsächlichen oder

beabsichtigten Verwendung in oder auf Lebensmitteln“ beginnt die Erzeugung von

Raucharomen mit der Gewinnung eines wässriges Primärrauchkondensats, einer

wasserunlöslichen Teerphase und einer wasserunlöslichen öligen Phase, welche durch die

Auftrennung kondensierten Rauchs gewonnen werden. Nach dem Aufreinigen des wässrigen


6

Primärrauchkondensates und bestimmter Fraktionen der Teerphase zur Beseitigung

gesundheitsschädlicher Rauchkomponenten können die gereinigten Anteile in oder auf

Lebensmitteln oder zur Herstellung von Raucharomen verwendet werden.

2.1.3. Geräucherte Lebensmittel

Das Auffinden von ca. 90.000 Jahre alten Räucherkammern im nördlichen Mitteleuropa gilt

als einer der ersten Belege für das Räuchern von Lebensmitteln zum Zwecke der

Haltbarmachung (BALTES et al. 1981). Im Laufe der Zeit wurden verschiedene

Räuchermethoden entwickelt, die jeweils zur Herstellung typischer Produkte verwendet

werden und sich vor allem in der Räuchertemperatur, der Behandlungsdauer und der

Räucherzeit unterscheiden (Tab.1).

Räucherverfahren Heißräuchern Warmräuchern Kalträuchern

Temperatur 50 bis 90 °C 25 bis 45 °C 15 bis 25 °C

Behandlungsdauer 20 bis 120 min 2 bis 4 h Bis ca. 6 Wochen

Räucherzeit 5 bis 100 min Kürzer als

Behandlungsdauer

Kürzer als

Behandlungsdauer

Typische Produkte Brühwurst,

Kochwurst,

Würstchen, Kasseler

Schweinebauch,

Schinken,

Bauernbratwurst,

Berliner Knacker

Roh-und

Dauerwürste,

Rohschinken,

Kochwurst

Tabelle 1 Merkmale verschiedener Räucherverfahren (modifiziert nach TERNES et al. (2005)

Bei allen Verfahren kommt es neben der Trocknung des Räuchergutes zur Anreicherung einer

Vielzahl von Rauchinhaltsstoffen vor allem auf der Oberfläche und in den äußeren Schichten

des geräucherten Produktes, welche sich verschiedenen Substanzklassen zuordnen lassen. In

der Gasphase des durch Holzpyrolyse freigesetzten Räucherrauchs finden sich neben

Alkoholen, Aldehyden, Ketonen, Lactonen und Estern verschiedene phenolische

Verbindungen, während sich die Teerphase aus Ruß-und Teerpartikeln zusammensetzt, die

sich ebenfalls auf dem Produkt niederschlagen (WITTKOWSKI 1985). Den Phenolen kommt


7

als Bestandteil der flüchtigen Rauchverbindungen besondere Bedeutung zu, da sie neben der

aromabildenden Wirkung durch ihre antioxidativen Eigenschaften besonders zur

Konservierung des Räuchergutes beitragen (TERNES et al. 2005).

2.2. Methoxyphenole des Räucherrauchs

2.2.1. Entstehung

Die drei wichtigsten Bestandteile des Holzes sind Cellulose (50 %), Hemicellulose (25 %)

und Lignin (25 %) (TERNES 2008). Durch die thermische Behandlung des Holzes während

des Räucherprozesses erfolgt in Abhängigkeit von der Temperatur die Pyrolyse dieser

Bestandteile, die jeweils ein charakteristisches Zerfallsmuster aufweisen. Die Hemicellulose

stellt den thermolabilsten Bestandteil dar, dessen Pyrolyse bereits bei einer Temperatur von

200 °C einsetzt, der pyrolytische Abbau der Cellulose beginnt ab 260 °C bis 310 °C und

Lignin wird ab 310 °C bis 500 °C umgesetzt (BALTES et al. 1981). Während die aus Glucose

aufgebaute Cellulose zu Oligo-und Polysacchariden sowie geringen Mengen Furanen und

Phenolen abgebaut wird, erfolgt die Pyrolyse der Hemicellulose größtenteils über die Bildung

von Furanen und aliphatischen Carbonsäuren (GILBERT u. KNOWLES 1975). Lignin, als

dritter Hauptbestandteil des Holzes, bildet die wichtigste Quelle für die Entstehung

phenolischer Verbindungen durch pyrolytischen Abbau. Bei Lignin handelt es sich um ein

Polymerisat aus Phenylpropaneinheiten, welches in das Cellulose-und Hemicellulosegerüst

der Pflanze eingelagert wird und zu zunehmender Verholzung der Zelle und letztendlich zum

Zelltod führt, sodass die vollständig lignifizierte Zelle vor allem Stützfunktion erfüllt.

Zwischenprodukte des thermischen Ligninabbaus bilden die Sinapinsäure sowie die

Ferulasäure. Beide Verbindungen werden zunächst durch Decarboxylierung zu ihren

Vinylhomologen abgebaut, um schließlich über die Syringa- bzw. Vanillinsäure zu Syringol

(2,6-Dimethoxyphenol) und Guajakol (2-Methoxyphenol) und ihren Derivaten oxidiert zu

werden (Abb.1) (WITTKOWSKI 1985).


8

Lignin

HO

OCH3

H3CO CH CH COOH

OCH3

HO

CH CH COOH

Sinapinsäure Ferulasäure

OCH3

HO

H3CO CH CH2

OCH3

HO

CH CH2

Vinylsyringol Vinylguajakol

OCH3

HO

H3CO CHO

OCH3

HO

CHO

Syringaldehyd Vanillin

HO

OCH3

H3CO COOH

OCH3

HO

COOH

Syringasäure Vanillinsäure

OCH3

HO

H3CO

OCH3

HO

Syringol Guajakol

Abbildung 1 Bildung von Syringol und Guajakol während des pyrolytischen Ligninabbaus (mod.

nach WITTKOWSKI (1985))

Die Gehalte an Syringol und Guajakol bzw. ihrer alkylsubstituierten Derivate variieren stark

in Abhängigkeit von der verwendeten Holzart (FUJIMAKI et al. 1974). Während Harthölzer

über zusätzliche Methoxygruppen innerhalb des Ligninpolymers verfügen und daher vor


9

allem zu Syringol und in geringem Umfang zu Guajakol abgebaut werden, wird bei der

Pyrolyse von Weichhölzern fast ausschließlich Guajakol freigesetzt (Tab. 2).

Weichholz Hartholz

Fichte (Picea) Kiefer (Pinus) Birke (Betula) Erle (Alnus)

Guajakol und

Guajakolderivate

(mg/m3)

70a 150a 70a 39b

Syringol und

Syringolderivate

(mg/m3)

-a -a 320a 143b

Tabelle 2 Gehalte von Guajakol und Guajakolderivaten sowie Syringol und Syringolderivaten im

Räucherrauch verschiedener Hart- und Weichholzarten (a KJÄLLSTRAND et al. (2000); b

KJÄLLSTRAND u. PETERSSON (2001a))

Die Derivatisierung von Guajakol und Syringol erfolgt über die Substitution von Methyl-,

Ethyl-, Propyl-, Vinyl-, Allyl- und Propenylgruppen in para- oder ortho-Stellung zu der

phenolischen Hydroxygruppe, wobei die Länge der Seitenkette die Anzahl von drei C-

Atomen nicht übersteigt (GILBERT u. KNOWLES 1975; KJÄLLSTRAND et al. 2000).

2.2.2. Eigenschaften

Phenole sind aromatische Kohlenwasserstoffe, an deren Phenylring eine oder mehrere

Hydroxygruppen gebunden sind. Durch den positiven mesomeren Effekt der Hydroxygruppe,

d. h. durch die Möglichkeit eines der Elektronenpaare des Sauerstoffatoms in den Phenylrest

zu verschieben, besteht im Bereich der ortho- bzw. para-Stellung zu Hydroxygruppe eine

erhöhte Ladungsdichte (Abb. 2), die dazu führt, dass elektrophile Substituenten bevorzugt an

diesen Positionen angreifen.


10

Abbildung 2 Mesomeriestabilisierung eines Phenols durch die phenolische Hydroxygruppe (nach

ZEECK et al. (2005))

Die Phenole reagieren mit einem durchschnittlichen pKs-Wert von 10 (Tab. 3) als schwache Säuren

(ZEECK et al. 2005).

Wichtige Methoxyphenole des

Räucherrauches

Strukturformeln pKS-Werte in wässriger

Lösung bei 25 °Ca

Syringol H3CO

OH

OCH3

9,98

4-Methylsyringol

H3CO

OH

OCH3

CH3

10,01

Guajakol

OH

OCH3

9,93

4-Methylguajakol

OH

OCH3

CH3

10,27

Tabelle 3 Strukturformeln und pKS-Werte (a RAGNAR et al. (2000)) vier wichtiger Methoxyphenole

des Räucherrauches


11

Phenolische Verbindungen kommen unter anderem in Pflanzen in Form von Aroma-, Farb-,

Gerb- und Geschmacksstoffen und Wachstumsregulatoren vor (TERNES et al. 2005). Sie

verfügen teilweise, wie im Fall des Polyphenols Epigallocatechin, sowohl über antioxidative,

antinitrosierende als auch anticarcinogene Eigenschaften, denen zum anderen nitrosierende

oder mutagene Wirkungen anderer Phenole gegenüberstehen (CHALLIS u. BARTLETT

1975; WALKER et al. 1982; D'ISCHIA et al. 2011; IWASAKI et al. 2011). Des Weiteren

konnte für einige phenolische Verbindungen eine antimikrobielle Aktivität in verschiedenen

Lebensmitteln nachgewiesen werden (RACCACH 1984).

Die im Räucherrauch vorkommenden Methoxyphenole Guajakol und Syringol, sowie ihre

methylierten Derivate zeichnen sich durch ihre aromagebende und antioxidative Wirkung aus.

Sie tragen entscheidend zum typischen Geruch und Geschmack geräucherter Lebensmittel

bei. Die von BALTES u. SÖCHTIG (1979) durchgeführte ausführliche sensorische

Beurteilung der genannten Methoxyphenole ergab, dass Guajakol und Syringol für den

rauchig-aromatischen, würzigen, sowie süß-scharfen Geruch und Geschmack von

Raucharomakondensaten und aromatisierten Brühwürsten verantwortlich sind, während das

4-Methylguajakol eine fruchtige, angenehme Räuchernote bewirkt. Untersuchungen von

WASSERMAN (1966) zeigten jedoch, dass ein reines Gemisch dieser drei wichtigen

Aromakomponenten nur ein entfernt raucharomaartiges Geruchs- bzw. Geschmacksprofil

aufweist. Es ist somit naheliegend, dass die genannten Methoxyphenole einen großen Einfluss

auf die Aromaentwicklung haben, diese aber nicht ausschließlich bestimmen, sondern eine

Modifikation durch andere weniger prominente Rauchkomponenten erfolgt.

Besondere Bedeutung kommt neben den geschmacksbildenden Eigenschaften von Syringol

und Guajakol, ihren antioxidativem und somit lebensmittelkonservierendem Potential zu.

Dieses lässt sich unter anderen von der Fähigkeit der Methoxyphenole herleiten, durch

Abspaltung des phenolischen Wasserstoffs der Hydroxygruppe mesomeriestabilisierte

Phenoxyradikale bilden zu können, die im Vergleich zu unsubstituierten Phenolen durch die

Methoxygruppe in ortho-Stellung zusätzlich stabilisiert werden. Aus diesem Grund verfügen

die aus den Harthölzern gebildeten 2,6-Dimethoxyphenole wie Syringol und seine Derivate

erwartungsgemäß über eine größere antioxidative Wirkung als die Monomethoxyphenole

Guajakol und 4-Methylguajakol (BARCLAY et al. 1997).


12

Die gebildeten stabilen Phenoxyradikale (ArO●) wirken als Radikalfänger und sind somit in

der Lage andere radikalische Verbindungen wie zum Beispiel Peroxid- oder

Superoxidradikale (ROO●) abzufangen ohne die Kettenreaktion fortzusetzten und führen auf

diesem Wege zum Abbruch des Radikalketten-Mechanismus, beziehungsweise verhindern

effektiv dessen Initiation (BARCLAY et al. 1997; OGATA et al. 1997; KJÄLLSTRAND u.

PETERSSON 2001b).

ROO ArOH ROOH ArO

ROO ArO nicht radikalische Produkte

Abbildung 3 Radikalkettenabbruch durch Phenoxyradikale (nach BARCLAY et al. (1997))

Des Weiteren ist für Syringol eine antinitrosierende Wirkung nachgewiesen worden, die

vergleichbar ist mit der von Ascorbinsäure. Bei 37 °C und einem pH-Wert von 3 hemmt

Syringol die Nitrosierung des Amins N-Morpholin sowohl in vitro als auch in vivo und

erweist sich somit um das bis zu Neunfache wirksamer als ebenfalls getestetes Phenol (VIRK

u. ISSENBERG 1985, 1986).

2.2.3. Nachweis und Vorkommen in Raucharomen und geräucherten

Fleischprodukten

Aufgrund ihrer aromagebenden und antioxidativen Wirkung (Kap. 2.1.2) war die qualitative

und quantitative Bestimmung der in geräucherten Lebensmitteln vorkommenden Phenole

bisher Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Mit Hilfe colorimetrischer Bestimmung

wurde der Phenolgehalt geräucherter Brühwurst in unterschiedlichen Schichten des Produktes

ermittelt. Die höchste Konzentration an Phenolen war erwartungsgemäß in der äußersten

Schicht von 1,6 mm Dicke zu finden und betrug 37 mg/kg. In den inneren Schichten nahm die

Phenolkonzentration kontinuierlich ab, sodass in einer Tiefe von 11,2 mm nur noch 7,8 mg/kg

Phenole nachweisbar waren (BRATZLER et al. 1969). In der genannten Untersuchung wurde


13

2,6-Trichloro-p-benzoquinoneimine verwendet, welches in para-Position an die Phenole

bindet und dabei die Farbbildung bewirkte, die colorimetrisch erfasst werden konnte. Da

hierfür die para-Position des Phenols unbesetzt sein muss, konnten para-substituierte

Verbindungen mit diesem Verfahren jedoch nicht erfasst werden (GILBERT u. KNOWLES

1975). Außerdem bildeten die einzelnen Phenole unterschiedliche Farbintensitäten aus, was

den Abgleich der komplexen aus den Proben isolierten Phenolextrakte mit Standardlösungen

(angefertigt aus wenigen phenolischen Referenzsubstanzen) erschwerte (LUSTRE u.

ISSENBERG 1969). Eine weitere Methode zur Isolierung und Bestimmung von

Rauchphenolen aus der Fleischmatrix wurde von LUSTRE u. ISSENBERG (1970)

entwickelt. Hierfür wurde durch Eiweißfällung mittels 40 %iger Trichloressigsäure zunächst

ein Fleischextrakt gewonnen, aus dem anschließend durch Fraktionierung und

Diethyletherextraktion die gesuchten Phenole isoliert wurden. Bei der Fraktionierung wurde

mit Hilfe von 40 %iger Natronlauge zunächst ein pH-Wert von 12 eingestellt und

anschließend mit Diethylether extrahiert. Die Diethyletherphase, in welcher sich die Lipide

sowie neutrale Verbindungen befanden, wurde verworfen. Die Phenole, die bei pH 12 als

Salze in der wässrigen Phase vorlagen, wurden daraufhin durch Einleiten von

Kohlenstoffdioxid (pH-Wert Senkung auf 6,8) aus diesen gelöst und konnten durch

wiederholtes Waschen mit Diethylether extrahiert werden. Nach Aufkonzentrierung des

Extraktes erfolgte die Trennung und Detektion der Phenole mittels Gaschromatographie in

Kopplung mit Massenspektrometrie (GC-MS). Die Konzentration der durch diese Methode

aus geräucherten Schweinebauch isolierten Phenole betrug 280 mg/kg, wobei Syringol mit

einem Gehalt von 84 mg/kg, Guajakol mit 35,6 mg/kg, 4-Methylguajakol mit 28,6 mg/kg und

4-Methylsyringol mit 35,6 mg/kg nachgewiesen wurde (LUSTRE u. ISSENBERG 1970). Die

Bestimmung und Trennung der Phenole mittels GC-MS ermöglichte die Auftrennung und

quantitative Bestimmung einer Vielzahl von flüchtigen Verbindungen aus dem Rauch, wobei

die Sensitivität durch Bildung der Trimethylsilylether der untersuchten Phenole bedeutend

erhöht wurde (KORNREICH u. ISSENBERG 1972). Die trimethylsilylierten Derivate

zeichneten sich durch eine herabgesetzte Polarität und eine Erhöhung der Flüchtigkeit im

Vergleich zu den underivatisierten Phenolen aus, was zu einer verkürzten Retention und

verbesserten Peaksymmetrie führte. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnten in aus Buchenholz


14

gewonnenem Räucherrauch bis zu 119 phenolische Verbindungen nachgewiesen werden

(WITTKOWSKI et al. 1981).

Die beschriebene Methode für die Isolierung der Methoxyphenole aus der Fleischmatrix und

ihr anschließender Nachweis mit Hilfe von GC-MS diente ISSENBERG et al. (1971)

zunächst zur Bestimmung der Wiederfindungsrate von 14C-Phenol aus dem Ethanolextrakt

geräucherten Schweinebauches. Die Wiederfindungsrate des kombinierten Verfahrens

(Ethanolextraktion und Fraktionierung auf Grundlage unterschiedlicher Acidität) betrug 59 %.

Durch LUTEN et al. (1979) wurde die Fraktionierung dahingehend modifiziert, dass sich an

die Extraktion mittels Diethylether noch die Zugabe gesättigter Kochsalzlösung und die

Extraktion der Phenole mittels Chloroform anschloss, was zu einer Wiederfindung von 84 %

bzw. 76 % für Guajakol bzw. 4-Methylguajakol aus kaltgeräuchertem Hering führte.

KNOWLES et al. (1975a) befassten sich mit der Extraktion von Rauchphenolen aus

Raucharomakondensaten sowie geräuchertem und gepökeltem Schinken unter Verwendung

der Issenbergschen Methode (siehe oben). In den untersuchten Raucharomakondensaten

machten die Methoxyphenole Guajakol, 4-Methylguajakol, Syringol, 4-Methylsyringol und

trans-Isoeugenol ca. 50 % des Gesamtphenolgehaltes aus. Insgesamt wurden 23

Hauptkomponenten der Phenolfraktion der Rauchkondensate mittels GC-MS identifiziert.

Des Weiteren gelang ihnen die gewebe- und schichtenabhängige semiquantitative

Gehaltsbestimmung der Phenole in mittels Elektrospray-Verfahrens geräuchertem Schinken.

Während sich in der Rinde des Schinkens (9,5 % der Gesamtmasse) 27 % der Phenole fanden,

lagen in der äußersten Muskelschicht (8,5 % der Gesamtmasse) 48 % der Phenole vor. Im Fett

(36 % der Gesamtmasse) und in der der inneren Muskelschicht (45,3 % der Gesamtmasse)

waren hingegen nur 5,7 % bzw. 18,6 % der Phenole zu finden. Im Zusammenhang mit diesen

Studien wurde wiederholt (GILBERT u. KNOWLES 1975; KNOWLES et al. 1975a) auf eine

gewisse Selektivität bei der Extraktion der Phenole aus der Fleischmatrix verwiesen, welche

auf die starke Proteinbindung derselben mit der Fleischmatrix zurückgeführt wurde, was die

erzielten Ergebnisse dahingehend einschränkte, dass nur qualitative und semiquantitative

Aussagen über den Phenolgehalt in den untersuchten Fleischprodukten getroffen werden

konnten. Die Bindung der unter anderem im Fleisch vorkommenden α-Aminosäure Lysin

durch die phenolische Fraktion von Rauchkondensaten wurde von CHEN u. ISSENBERG

(1972) untersucht. Es zeigte sich, dass die Phenolfraktion nach Zugabe zu einer


15

Fleischsuspension einen Verlust von 38 % des frei verfügbaren Lysins bewirkte, was einen

weiteren Hinweis auf die verstärkte Bindung der Phenole durch bestimmte Fleischproteine

gab.

Ein weiteres Verfahren zur Isolierung phenolischer und somit leicht flüchtiger Verbindungen

aus Rauch und Rauchprodukten stellt die Wasserdampfdestillation nach

ANTONACOPOULOS (1960) dar, die unter anderem von BALTES u. SÖCHTIG (1979) zur

Bestimmung niedermolekularer Verbindungen aus Raucharomapräparaten genutzt wurde.

Hierbei wurde nach Zugabe von Lithiumchloridlösung und konzentrierter Salzsäure die

Wasserdampfdestillation mit auf 140°C überhitztem Wasserdampf durchgeführt.

Anschließend wurde das Destillat auf pH 5,5 bis 6 angesäuert und die Analyten durch

mehrmaliges Waschen mit Diethylether extrahiert. Die Detektion erfolgte ebenfalls mittels

GC-MS. Die Untersuchung von 12 Raucharomapräparaten (davon 2 Räuchersalze) ergab,

dass Guajakol, 4-Methylguajakol und Syringol in allen Präparaten quantitativ bestimmt

werden konnten, während 4-Methylsyringol immerhin in 11 Präparaten nachweisbar war

(BALTES u. SÖCHTIG 1979). Die Konzentration von Guajakol variierte bei 10 Präparaten

(exklusive der 2 Räuchersalze) von 409 mg/kg bis 5869 mg/kg und für Syringol von

39 mg/kg bis 9609 mg/kg. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass selbst zwischen zwei

Chargen eines Rauchkondensates des gleichen Herstellers die Zusammensetzung der

phenolischen Fraktion starken Schwankungen unterlag und dass die Gehalte der Phenole

während einer Lagerung von vier Monaten um bis zu 30 % des Ausgangswertes abnahmen.

Der Phenolgehalt in geräuchertem Hering wird stark beeinflusst von der Dauer des

Räucherns, der verwendeten Räuchertemperatur, sowie dem angewendetem

Räucherverfahren, wobei mit es mit zunehmender Räucherdauer und steigender Temperatur

zu einem signifikanten Anstieg des Phenolgehaltes kommt (SÉROT et al. 2004).

Die Abhängigkeit der Phenolkonzentration in Fleischprodukten von verschiedenen

Räucherbedingungen war Gegenstand umfangreicher Untersuchungen, die sich mit dem

Einfluss unterschiedlicher Holzarten (HITZEL et al. 2013b), Darmtypen und Fettgehalte

(PÖHLMANN et al. 2013b), Raucherzeugungsverfahren (PÖHLMANN et al. 2013a) und

Räucherbedingungen im Glimmrauchverfahren (PÖHLMANN et al. 2012) befassten. Die

Extraktion der Phenole aus den untersuchten geräucherten Fleischprodukten (Minisalamis und

Brühwürstchen) erfolgte ebenfalls mit Hilfe der Wasserdampfdestillation der homogenisierten


16

Fleischproben und mehrmaliger Diethyletherextraktion (siehe oben). Nach Aufreinigung der

Proben mittels Kieselgel wurden die Gehalte der trimethylsilylierten Phenole Guajakol, 4-

Methylguajakol, Syringol, Eugenol und trans-Isoeugenol durch GC-MS bestimmt. Ein Teil

der Ergebnisse dieser Studien ist in Tabelle 4 dargestellt.

Untersuchtes

Fleischerzeugnis

Untersuchte Räucher-

/Produktkomponente

Gehalt des Phenols /der Gesamtphenole im Fleischprodukt in mg/kg

Guajakol 4-Methylguajakol Syringol Gesamtphenol-

gehalt

Minisalamisa Buchenholzrauch 16,4 11,6 14,2 53,5

Fichtenrauch 34,5 33,4 2,3 86,4

Brühwürstchena Buchenholzrauch 4,9 7,5 25,1 77,2

Fichtenrauch 10,2 24,9 2,8 122

Brühwürstchenb

(über Buche

geräuchert)

Schafsaitling 6,0 10,1 25,9 93,6

Cellulosedarm

(geschält) 2,9 4,9 17,3 48,8

Kollagen 2,0 3,6 15,0 46,6

Tabelle 4 Gehalte an Guajakol, 4-Methylguajakol und Syringol, sowie der Gesamtphenolgehalt

(Summe der Gehalte an Guajakol, 4-Methylguajakol, Syringol, Eugenol und trans-Isoeugenol) in

geräucherten Minisalamis und Brühwürstchen in Abhängigkeit von der Holzart und dem bei der

Wurstherstellung verwendeten Darmtyp (a :HITZEL et al. (2013b);b :PÖHLMANN et al. (2013b))

Der Anteil an Syringol in den über Hartholz (z. B. Buche) geräucherten Produkten war im

Vergleich zu den Gehalten an Guajakol und 4-Methylsyringol gleich bzw. größer, wobei eine

starke Abhängigkeit von dem untersuchten Fleischerzeugnis bestand. Beim Weichholz

(Fichte) überwog der Anteil von Guajakol und 4-Methylguajakol. Die Brühwürstchen im

Schafsaitling wiesen den höchsten Phenolgehalt auf, während Syringol durch die

Buchenholzräucherung bei allen Darmtypen wiederum den höchsten Gehalt im Vergleich zu

Guajakol und 4-Methylguajakol hatte.

Mit ansteigendem Fettgehalt der Brühwürstchen (von 9,9 % Fett auf 39,1 % Fett) nahm die

Konzentration von Syringol um 30 % ab, während der Gesamtphenolgehalt bei allen

Fettstufen mit 62,0 mg/kg bis 64,6 mg/kg relativ konstant blieb (PÖHLMANN et al. 2013b).


17

Des Weiteren bestand eine Abhängigkeit des Phenolgehaltes vom Raucherzeugungsverfahren.

Dieser war am höchsten in mit Dampfrauch geräucherten Brühwürsten und am niedrigsten für

das Räuchern mit Friktionsrauch (PÖHLMANN et al. 2013a).

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Gehalte der im Räucherrauch, in

Rauchkondensaten und in geräucherten Lebensmitteln nachgewiesenen Phenole stark in

Abhängigkeit von den Herstellungsbedingungen, der Beschaffenheit des untersuchten

Produktes sowie im Falle von geräucherten Fleischprodukten auch innerhalb des Produktes in

Abhängigkeit vom untersuchten Gewebe/ der Gewebeschicht schwanken. Weiterhin wird die

Gehaltsbestimmung nicht zuletzt durch das verwendete Extraktionsverfahren beeinflusst, das

bisher auf der Verwendung hoher Extraktionstemperaturen (Wasserdampfdestillation) oder

der Einstellung stark alkalischer bzw. azider pH-Werte beruhte, die anschließend die

Extraktion mittels Diethylether ermöglichten.

Während die Detektion phenolischer Verbindungen aus pflanzlichen Matrices bereits vielfach

mit Hilfe von flüssigchromatograpischen Methoden in Kopplung mit Massenspektrometrie

erfolgte (LC-MS) (PAREJO et al. 2004; ALMELA et al. 2006; HOSSAIN et al. 2010),

wurden die Methoxyphenole des Räucherrauches nach ihrer Trimethylsilylierung bisher

überwiegend mittels gaschromatographischer Verfahren und Massenspektrometrie (GC-MS)

analysiert (siehe oben). Nur vereinzelt wurden glycosylierte und unglycosylierte

Phenolderivate des Rauches in Wein durch LC-MS bestimmt (CABONI et al. 2007;

HAYASAKA et al. 2010; DUNGEY et al. 2011). Dies liegt vor allem an den basischen pKS-

Werten der alkylierten und/oder alkoxylierten Rauchphenole (siehe Kap. 2.2.2.), die eine

ausreichende Ionisierung und somit eine Detektion z. B. mittels ESI-MS im sauren Milieu

verhindern. Nur die Verwendung alkalischer Eluenten ermöglicht die Detektion der

Methoxyphenole mit Hilfe von LC-ESI-MS (LÜDERS 1999).

2.2.4. Reaktion mit Nitrit in wässrigem Milieu

2.2.4.1. Nitrierung und Nitrosierung

Phenole werden mit Nitrit im wässrigen Milieu in Abhängigkeit von den

Reaktionsbedingungen nitriert, nitrosiert oder zu ihren Dimeren oxidiert. Die Nitrierung bzw.

Nitrosierung des Phenols erfolgt in para- oder ortho-Stellung zur Hydroxygruppe, da diese

einen positiven mesomeren Effekt hat und somit zu einer erhöhten negativen Ladungsdichte


18

an diesen Positionen führt (ZEECK et al. 2005). Nitrit kann in wässriger saurer Lösung

sowohl NO+ als auch NO2+ bilden, welche durch elektrophilen Angriff an den genannten

Positionen an das Phenol binden, sofern diese noch unsubstituiert sind (VIONE et al. 2000;

VOLLHARDT u. SCHORE 2011).

Die Reaktionskinetik der Phenolnitrierung ist hierbei stark abhängig von gegebenenfalls

bereits vorhandenen Substituenten, dem umgebenden Milieu, dem pH-Wert und der

Reaktionstemperatur. So können z. B. benachbarte Methylgruppen in meta-Position durch

sterische Blockierung die Nitrosierung in para-Position behindern (FERNANDEZ-

LIENCRES et al. 1997) und beim 3,5-Di-tert-butylphenol wird die Nitrosierung sogar

vollständig gehemmt (GONZALEZ-MANCEBO et al. 1999). Die Theorie der Entstehung von

Nitrophenol durch Oxidation des korrespondierenden Nitrosophenols, wie sie bereits in

Dioxan bei 40 °C bewiesen werden konnte (OGATA u. TEZUKA 1968), lies sich durch

Versuche in Aktivschlamm (JEWELL et al. 2014) und in wässrigem Medium (VIONE et al.

2004) nicht bestätigen. Ergebnisse der beiden letztgenannten Studien zeigten, dass die

Nitrierung und Nitrosierung der untersuchten Phenole weitgehend unabhängig voneinander

verlief.

Die Reaktion der Methoxyphenole des Rauches mit Nitrit wurde bisher vor allem in

Verbindung mit ihrer Bedeutung als Pyrolyseprodukte des Holzes in wässrigem Milieu

untersucht. Unter stark sauren Bedingungen (pH 2) und bei 70 °C reagierte Guajakol mit

salpetriger Säure zu 2-Methoxybenzochinon-4-monoxim, dem Tautomer von 4-

Nitrosoguajakol (UFFMANN 1967), sowie zu 6-Nitroguajakol, 4-Nitroguajakol und 4,6-

Dinitroguajakol. Wurde der pH-Wert auf 1 erniedrigt, entstanden bei einer

Reaktionstemperatur von 100 °C lediglich die Nitroguajakole. Wurde 4-Nitrosoguajakol unter

gleichen Bedingungen mit salpetriger Säure oxidiert, bildete sich 4-Nitroguajakol und 4,6-

Dinitroguajakol (KUNG 1968). Auch unter milderen Reaktionsbedingungen bei einem pH-

Wert von 4 und unter Einwirkung von UV-Licht konnte die Bildung von 4-Nitroguajakol, 6-

Nitroguajakol und geringer Mengen an 4,6-Dinitroguajakol durch Nitrierung von Guajakol in

wässriger Lösung nachgewiesen werden (KITANOVSKI et al. 2014).

Die Oxidation von 4-Methylguajakol mit salpetriger Säure bei 70 °C verlief über die Bildung

mehrerer Zwischenprodukte. Durch Substitution mittels NO+ erfolgte zunächst die

Nitrosierung zu 4-Methyl-6-nitrosoguajakol, welches anschließend zu 4-Methyl-6-


19

nitroguajakol weiteroxidiert wurde. Nach Demethylierung und Bildung eines chinoiden

Zwischenproduktes entstanden u.a. nicht-zyklische Endprodukte wie Oxalsäure (SOBOLEV

1961).

Wie Untersuchungen bezüglich der potentiellen Genotoxizität nitrosierbarer phenolischer

Verbindungen in Abhängigkeit von ihren strukturellen Eigenschaften zeigten, besitzt

nitrosiertes Syringol laut CASE Vorhersage im Gegensatz zu nitrosiertem Phenol keine

genotoxische Potenz. Das CASE Verfahren ist ein Verfahren zur Identifikation struktureller

Komponenten bestimmter Verbindungen, die für die Ausbildung möglicher Mutagenizität

sowie der geschätzten genotoxischen Potenz verantwortlich sind. Voraussetzung für die

Ausbildung einer solchen genotoxischen Potenz im Falle nitrosierter Phenole ist laut CASE

Methode das Vorhandensein unsubstituierter para- oder ortho-Positionen, sowie einer freien

meta-Position. Des Weiteren ist die Genotoxizität des jeweiligen Phenols abhängig von

dessen Fähigkeit reaktive Phenyldiazonium-Ionen auszubilden. Laut CASE Verfahren besteht

für nitrosiertes Guajakol ein geringes genotoxisches Potential (ROSENKRANZ et al. 1990).

Phenol reagiert mit Nitrit im sauren Milieu unter Bildung von mutagenem p-Diazochinon und

p-Nitrosophenol. Während das Diazochinon direkt mutagen wirkt, fördert p-Nitrosophenol

die Nitrosierung sekundärer Amine (siehe Kap. 2.3.2) (WALKER et al. 1979; KIKUGAWA

u. KATO 1988). Auch p-Nitroso-o-cresol, p-Nitrosothymol und 2,6-Dinitrosoresorcinol

katalysieren die Bildung von Nitrosaminen (DAVIES u. MCWEENY 1977; DAVIES et al.

1980). Nitrososyringol hingegen hemmt die Entstehung von Nitrosaminen vergleichbar mit

Ascorbinsäure, sowohl in vitro, als auch in in vivo Experimenten. Syringol reagiert schneller

mit Nitrit als die untersuchten Amine Morpholin oder Pyrrolidin und verhindert auf diesem

Wege deren Nitrosierung. Das entstehende 4-Nitrososyringol hat im Gegensatz zu den oben

genannten Nitrosophenolen keinen katalysierenden Einfluss auf die Nitrosaminbildung

(VIRK u. ISSENBERG 1985, 1986).

Weitere Genotoxizitätstest unter Verwendung von Bakterienkulturen bestätigten die geringen

bzw. nicht vorhandenen genotoxischen Eigenschaften nitrosierten Guajakols und Syringols.

Gleichzeitig wurde sowohl für nitrosierte Rauchkondensate als auch für nitrosierte

geräucherte Lebensmittel eine hohe Genotoxizität nachgewiesen, wobei die separat

untersuchte aufgereinigte nitrosierte Phenolfraktion der Kondensate die höchste Genotoxizität


20

zeigte. Ohne Nitritzusatz bei ansonsten gleichen Reaktionsbedingungen zeigten sich keine

genotoxischen Effekte in der Bakterienkultur (OHSHIMA et al. 1989).

2.2.4.2. Dimerisierung

Neben der Nitrierung bzw. Nitrosierung, spielt die Dimerisierung eine wichtige Rolle bei der

oxidativen Umsetzung von Phenolen. Hierbei kommt es zur radikalischen Kopplung zweier

Phenoxyradikale entweder in Form einer C-C Bindung zwischen den in para-Position zu der

phenolischen Hydroxygruppe befindlichen C-Atomen der Radikale oder zur C-O Bindung

zwischen dem O-Atom der phenolischen Hydroxygruppe und dem in para-Position

befindlichen C-Atom eines Phenoxyradikals (SUN et al. 2010). Im Falle von 2,6-

Dimethylphenol wird im sauren Milieu ausschließlich das C-C gekoppelte Dimer gebildet,

während unter dem Einfluss eines basischen Reaktionsmediums nur die C-O gekoppelte

Dimerisierung stattfindet (KOBAYASHI u. HIGASHIMURA 2003).


21

Abbildung 4 Radikalische Dimerisierung eines Phenols durch C-C bzw. C-O Kopplung in saurem und

basischem wässrigem Reaktionsmedium (mod. nach KOBAYASHI u. HIGASHIMURA (2003) und

SUN et al. (2010))

Die Bildung der Phenoxyradikale erfolgt über die Oxidation des entsprechenden Phenols

durch Oxidationsmittel, Basen, Säuren oder unter Einfluss von Katalysatoren wie Oxidasen,

Wasserstoffperoxid oder Peroxidasen (KOBAYASHI u. HIGASHIMURA 2003).

Die oxidative Dimerisierung unter Nitriteinwirkung in der Fleischmatrix wurde bereits für das

Phenol p-Cymen-2,3-diol, ein wichtiges Antioxidans des Thymians, belegt (RAINIS u.

TERNES 2013).

Für Syringol wurde die Dimerisierung als Folge enzymatischer Umsetzung mittels Laccase

(WAN et al. 2008), durch Mikroorganismen (Aspergillus ssp. und Pseudomonas ssp.)

(BETTS u. KING 1991) oder unter Einwirkung von UV-Licht mit und ohne

Wasserstoffperoxid als Katalysator nachgewiesen, während die Dimerisierung von Guajakol


22

unter Einfluss von UV-Licht und Wasserstoffperoxid untersucht worden ist (SUN et al. 2010).

Die Umsetzung erfolgte hierbei im wässrigen Milieu oder in organischen Lösemitteln. Für

Versuche in organischen Lösemitteln ist ein fördernder Einfluss auf die Dimerbildung v.a. für

Lösemittel relativ geringer Polarität wie. z. B. Aceton belegt worden (ADELAKUN et al.

2012). Während bei der Umsetzung des Syringols durch Enzyme wie Laccase und unter UV-

Bestrahlung das Dimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol entsteht, liegt bei der

oxidativen Kopplung durch Mikroorganismen und bei der Oxidation durch Salpetersäure im

stark sauren wässrigen Milieu (pH 2 und 70 °C) die chinoide Form als 3,3′,5,5′-

Tetramethoxydiphenochinon vor (Abb. 5) Im Zusammenhang mit der Chinonbildung wurde

stets die Entstehung von Präzipitaten aus lilafarbenen, nadelförmigen Kristallen beschrieben

(KUNG 1968; BETTS u. KING 1991) (vgl. hierzu Kap. 4.1.2.).

OH

H3CO OCH3

OCH3

OH

H3CO

O

O

H3CO OCH3

OCH3H3CO

3,3',5,5'-Tetramethoxy-1,1'-

biphenyl-4,4'-diol3,3',5,5'-Tetramethoxy-

diphenochinon

Abbildung 5 Strukturformel des Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol und

seines Chinons 3,3′,5,5′-Tetramethoxydiphenochinon (nach ADELAKUN et al. (2012) und BETTS u.

KING (1991))

Aus wässrigem Raucharoma konnte sowohl das Syringoldimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-

biphenyl-4,4′-diol als auch das dimerisierte Guajakol 3,3′-4,4′-dihydroxy-1,1′-biphenyl

isoliert werden (GUILLEN u. IBARGOITIA 1998).


23

In Tests zur Bestimmung der antioxidativen Wirkung (DPPH und FRAP) wies das Dimer des

Syringols ein ungefähr doppelt so großes antioxidatives Potenzial wie undimerisiertes

Syringol auf (ADELAKUN et al. 2012) und auch für andere Phenoldimere, die sich von

Mono- oder Dimethoxyphenolen des Räucherrauches herleiten lassen, wurde eine

antioxidative Wirkung belegt, die die der Monomere nachweislich übertrifft (BARCLAY et

al. 1997).

2.2.5. Reaktion mit Nitrit in Fleischprodukten

Aufgrund des hohen Gehaltes an Methoxyphenolen in geräucherten Lebensmitteln und

Raucharomen (Kap. 2.2.3.) und den teilweise gesundheitlich bedenklichen Eigenschaften der

Reaktionsprodukte phenolischer Verbindungen mit Nitrit im wässrigen Milieu (Kap. 2.2.5.)

war der Nachweis selbiger Reaktionsprodukte in geräucherten und gepökelten

Fleischprodukten Gegenstand umfangreicher Untersuchungen. Zunächst erfolgte die

Untersuchung nitrosierter Raucharomapräparate, der sich vergleichende Studien über die

Bildung von Nitro-bzw. Nitrosophenolen in geräucherten und gepökelten Fleischprodukten

anschlossen (KNOWLES et al. 1974b, 1975b). Wiederholt wurde hierbei auf die

Schwierigkeit der Extraktion der entsprechenden Verbindungen aus der Fleischmatrix

hingewiesen (KNOWLES et al. 1974b; GILBERT u. KNOWLES 1975; KNOWLES et al.

1975b). Aus den nitrosierten Raucharomapräparaten wurden neben einer Vielzahl an

alkylsubstituierten Nitrophenolen die nitrierten Guajakolderivate 6-Nitroguajakol, 4-

Nitroguajakol und 6-Nitro-4-methylguajakol isoliert. Die Extraktion der gesuchten

Verbindungen aus gepökeltem und geräuchertem Schinkenspeck wurde mittels

Fraktionierung auf Grundlage unterschiedlicher Aziditäten und Diethyletherextraktion (siehe

Kapitel 2.2.3.) durchgeführt. Auch im Schinkenspeck konnten vor allem alkylsubstituierte

Nitrophenole (v.a. Methyl-, Ethyl- und Butylnitrophenole) nachgewiesen werden. Erst in den

Speckproben, die einer Hitzebehandlung (Braten in einer Elektrischen Pfanne) und/ oder

simulierter Verdauung (Zugabe von Salzsäure, 37 °C, 2 h) unterzogen wurden, erfolgte der

Nachweis der nitrierten Methoxyphenole 6-Nitroguajakol, 4-Nitroguajakol, 6-Nitro-4-

methylguajakol, n-Nitro-4-methylguajakol und 6-Nitro-4-allylguajakol. Bezüglich des

Nachweises nitrosierter Reaktionsprodukte des Guajakols bzw. des 4-Methylguajakols sind

die Angaben der Autoren widersprüchlich. Während KNOWLES et al. (1974b) über die


24

vorläufige Identifizierung von 6-Nitroso-4-methylguajakol und 6-Nitroso-4-propylguajakol

aus nitrosierten Raucharomen und gebratenem, traditionell geräuchertem Schinkenspeck

berichteten, gaben sie bei der späteren ausführlicheren Veröffentlichung ihrer Ergebnisse an,

sowohl aus den nitrosierten Raucharomen, als auch aus den Schinkenspeckproben keinerlei

Nitrosophenole isoliert zu haben (KNOWLES et al. 1975b). Die Gründe für das Fehlen von

Nitrosoverbindungen sahen die Autoren in der weiteren Oxidation der Nitrosophenole zu den

korrespondierenden Nitrophenolen. Des Weiteren fällt auf, dass in beiden Studien keinerlei

nitrierte bzw. nitrosierte Syringolderivate nachgewiesen wurden, obwohl Syringol und seine

alkylsubtituierten Derivate in den nicht nitrosierten Raucharomen und gepökelten und

geräucherten Schinkenspeckproben teilweise mehr als 50 % der gesamten Phenolfraktion

ausmachten (KNOWLES et al. 1975a). Als Gründe für das Fehlen der nitrierten bzw.

nitrosierten Syringolderivate vermuteten die Autoren eine erfolgte Demethylierung der

entsprechenden Verbindungen und somit die Bildung anderer Phenolderivate, die mit der

angewandten Methodik nicht nachweisbar waren, sehr langsam verlaufende

Nitrosierungsreaktionen oder eine Verhinderung der Nitrosierung durch das Fehlen

nitrosierbarer freier ortho- bzw. para-Positionen wie es z. B. beim 4-Methylsyringol der Fall

ist. Aufgrund von Extraktionsproblemen aus der Fleischmatrix erfolgte in keiner der

genannten Studien eine quantitative Bestimmung der Phenol- bzw. Nitrophenolgehalte

(KNOWLES et al. 1975b).

Auch HOFMANN (1990) gelang lediglich der Nachweis nitrierter alkylsubstituierter Phenole

sowie von 4-Nitroresorcin aus gepökelten, geräucherten rohen oder heißgeräucherten

Schinken und geräucherten Rohwürsten. Auch in dieser Studie wurde das Fehlen jeglicher

Nitrosophenole zum einen mit der möglichen sofortigen Oxidation der Nitrosophenole zu den

entsprechenden Nitrophenolen, zum anderen mit der Bildung von Chinonmonoximen, den

Tautomeren der Nitrosophenole, die mit der Methodik nicht erfasst werden konnten,

begründet. Als dritten Grund nennt der Autor die Möglichkeit der Oxidation der

Nitrosoverbindungen während der Extraktion und Probenaufreinigung.

2.3. Verwendung und Reaktion von Nitrit in Fleischprodukten

Während molekularer Stickstoff (N2) aufgrund seiner festen Dreifachbindung zwischen den

beiden Stickstoffatomen ein reaktionsträges Gas ist, verfügt das Stickstoffatom selbst über


25

eine komplexe Reaktivität. Aufgrund seiner 5 Außenelektronen besitzt es mehrere

Oxidationsstufen: von N3- (NH3) über N5+ (HNO3) und N3+ (N2O3 und HNO2), sowie N2+ und

N4+ in NO bzw. NO2. Letztere zwei Verbindungen entstehen im sauren Milieu, wie es z. B. in

Fleischprodukten vorliegt, unter Disproportionierung von N2O3, welches wiederum aus

salpetriger Säure (HNO2) generiert wird (Abb. 6) (HONIKEL 2008).

Abbildung 6 Umsetzung von HNO2 im sauren Milieu

Salpetrige Säure wird Fleischprodukten in Form von Pökelsalz zugesetzt. Dieses besteht

überwiegend aus Kochsalz (99,5-99,6 %) und 0,4-0,5 % salpetriger Säure (HNO2) oder

Salpetersäure (HNO3) bzw. aus deren Kalium- oder Natriumsalzen (DUNKELBERG et al.

2007). Die Pökelung dient der Konservierung, Farbstabilisierung und Aromatisierung von

Fleisch und Wurstwaren. Sie erfolgt entweder in Form der Nass- oder der Trockenpökelung.

Bei erster wird das Fleisch in die Pökellake eingelegt (Lakepökelung) oder diese wird direkt

in das Gewebe eingespritzt (Spritzpökelung). Bei der Trockenpökelung wird das Fleischstück

mit dem Salz eingerieben und anschließend 4-8 Wochen gelagert (TERNES et al. 2005).

Durch das Salz erfolgt der Wasserentzug aus dem Gewebe und es kommt zur Absenkung des

aw-Wertes (Maß für die Wasseraktivität), wodurch das mikrobielle Wachstum, dessen

Grundvoraussetzung die Verfügbarkeit von Wasser ist, effektiv gehemmt wird. Die

antimikrobielle und somit konservierende Wirkung des Nitrits entsteht durch die Bildung von

Stickoxiden, die über die Aminogruppe die Dehydrogenase von Bakterien blockieren, was in

Verbindung mit dem durch das Kochsalz hervorgerufenen Wasserentzug vor allem zur

Wachstumshemmung von Clostridium botulinum führt, welches das hochtoxische

Botulinustoxin bildet (SIELAFF 1996).

Die Umrötung des Fleisches und somit die Ausbildung des typischen „Pökelrotes“ ist eine

weitere erwünschte Wirkung des Nitrits im gepökelten Fleischprodukt. Hierzu kommt es

durch die Reaktion des Muskeleiweißes Myoglobin mit Nitrit zu Metmyoglobin, welches mit


26

dem durch Reduktion des Nitrits gebildeten Stickoxid (NO) weiter zu Nitrosometmyoglobin

reagiert. Das Nitrosometmyoglobin bildet in Verbindung mit direkt nitrosiertem Myoglobin

(Nitrosomyoglobin) stabile, leuchtend rote Komplexe („Pökelrot“), welche im Gegensatz zu

dem in ungepökeltem Fleisch vorliegenden Myoglobin auch nach dem Erhitzen ihre rote

Farbe behalten. Außerdem schützt Nitrosomyoglobin vor der Lipidperoxidation, d. h. vor dem

durch Fettsäureperoxylradikale hervorgerufenen Fettverderb (BELITZ et al. 2001).

Nitrit ist während der Pökelung an der Ausbildung des typischen Pökelaromas (CHO u.

BRATZLER 1970), wobei die Zugabe anderer aromatisierender Verbindungen z. B. durch

das gleichzeitige Räuchern der gepökelten Fleischprodukte diesen Effekt maskieren können

(WASSERMAN u. TALLEY 1972).

Nachteilige Effekte des Einsatzes von Nitrit bei der Fleischpökelung sind die Gefahr der

Nitrosaminbildung im Fleisch, sowie die der Nitritvergiftung durch die Einnahme toxischer

Mengen Nitrits (BRUNING-FANN u. KANEENE 1993; DUNKELBERG et al. 2007). Beide

Effekte treten im Zusammenhang mit dem Vorhandensein ungebundenen Nitrits auf, welches

nicht bereits mit anderen Inhaltstoffen wie zum Beispiel Myoglobin reagiert hat. Die Bildung

von Nitrosaminen in gepökelten Fleischprodukten erfolgt durch die Nitrosierung sekundärer

und tertiärer Amine (v.a. Prolin und Dimethylamin) durch Nitrosylkationen (NO+) zu

Nitrosopyrrolidin und Nitrosodimethylamin. Die Entstehung der kanzerogenen Nitrosamine

kann durch die Zugabe von antinitrosierenden Agenzien wie α-Tocopherol und Ascorbinsäure

um bis zu 90 % gehemmt werden (TERNES 2008). Erhitzen der Fleischprodukte in

Anwesenheit von Sauerstoff, wie es z. B. beim Braten von gepökeltem Speck erfolgt, führt zu

einer Zunahme der Nitrosaminbildung (DENNIS et al. 1982).

Die Gefahr der Nitritintoxikation besteht v. a. für Kleinkinder und Säuglinge. Bei Aufnahme

toxischer Mengen an Nitrit wird Hämoglobin (zentrales Fe2+) zu Methämoglobin (zentrales

Fe3+) oxidiert, welches im Gegensatz zu Hämoglobin Sauerstoff irreversibel bindet, sodass

keine Sauerstoffabgabe in die Gewebe erfolgen kann (DUNKELBERG et al. 2007). Um

sowohl die Nitrosaminbildung im Fleischprodukt als auch eine mögliche Nitritvergiftung zu

verhindern, ist die einzuhaltende Höchstmenge an Natriumnitrit bzw. Kaliumnitrit in der

Zusatzstoffzulassungsverordnung (ZZulV Teil C Andere Konservierungsstoffe, Liste 1 Nitrite

und Nitrate; Stand: 21.05.2012) gesetzlich geregelt und beträgt 150 mg/kg in


27

Fleischerzeugnissen, wobei die Höchstmengen für einzelne traditionell gepökelte

Fleischprodukte zwischen 175 mg/kg und 50 mg/kg im Endprodukt liegen.

2.4. Ascorbinsäure

2.4.1. Verwendung und Reaktion in Fleischprodukten

Ascorbinsäure, auch bekannt als Vitamin C, ist ein Antioxidant, welches natürlicherweise vor

allem in pflanzlichen Geweben vorkommt, aber auch synthetisch hergestellt und als

Lebensmittelzusatzstoff (Ascorbinsäure (E 300), Natriumascorbat (E 301), Calciumascorbat

(E 302)) vielen Lebensmitteln zugesetzt wird (TERNES et al. 2005).

Unter Abspaltung eines Elektrons bildet sich aus L-Ascorbinsäure ein L-

Ascorbinsäureradikal, welches sowohl oxidative, als auch reduzierende Eigenschaften hat und

mit anderen Radikalen reagieren kann. Auf diesem Wege führt es zum Radikalkettenabbruch

und kann, wenn es Fetten in Form seines fettlöslichen Esters Ascorbylpalmitat zugesetzt wird,

die Lipidautoxidation durch Peroxidradikale verhindern (LIAO u. SEIB 1988). Da

unveresterte L-Ascorbinsäure nicht fettlöslich ist, kann sie selbst die Lipidautoxidation nicht

verhindern, kann jedoch die Wirkung anderer fettlöslicher Antioxidantien wie Tocopherol

durch dessen Regeneration verlängern und hat somit in Fetten synergistische Effekte

(TERNES et al. 2005). Die Zugabe von Ascorbinsäure in wässrige Systeme wie z. B.

Pökellaken und die dadurch bedingte Erniedrigung des pH-Wertes kann in Verbindung mit

hohen Nitritgehalten zu einem vermehrten Abbau von Antioxidantien wie Tocochromanolen

führen (GERLING u. TERNES 2014).

In gepökelten Fleischprodukten beschleunigt Ascorbinsäure die Umrötung (Kap. 2.3) durch

die Reduktion von Nitrit zu NO, das wiederum verstärkt mit Myoglobin reagieren kann

(FREDE 2010). Sie wird dabei selbst zu Dehydroascorbinsäure oxidiert (Abb. 7).


28

OO

OHHO

H

HHO

HO2 HNO2

O

O O

OHO

HO

H

H

2 NO 2 H2O

L-Ascorbinsäure Dehydroascorbinsäure

Abbildung 7 Redoxreaktion der Ascorbinsäure mit Nitrit (TERNES 2008)

Zur Verringerung der Nitritmenge in gepökelten Fleischprodukten (Kap. 2.3.) wird

Ascorbinsäure in einer Konzentration von 200-750 mg/kg eingesetzt. Oberhalb einer

Konzentration von 300 mg/kg im Fleischprodukt besteht jedoch die Gefahr der

Nitrosaminbildung infolge von Transnitrosierung gebildeter Nitrosohydroascorbinsäure

(TERNES 2008).

2.4.2. Antinitrosierende Wirkung

Weitere Bedeutung erlangt Ascorbinsäure durch die Hemmung der Nitrosaminbildung, indem

es selbst mit nitrosierenden Stickoxiden nach dem in Abbildung 8 gezeigtem Mechanismus

reagiert und so eine Nitrosierung anderer Verbindungen im wässrigen Milieu effektiv

verhindert (Abb. 8) (W. R. LICHT et al. 1988).


29

Abbildung 8 Mechanismus für die inhibitorsche Wirkung von Ascorbinsäure auf die

Nitrosaminbildung durch nitrosierende Stickoxide im offenen, aeroben System (mod. nach W. R.

LICHT et al. (1988))

Entscheidend für die Hemmung der Nitrosierung durch Ascorbinsäure im offenen System ist

hierbei der Abtransport des gebildeten NO (welches Amine nicht nitrosiert (TANNENBAUM

et al. 1991)) oder dessen Regeneration zu den nitrosierenden Stickoxiden. Im offenen in vivo

System wie dem Magen kann NO über die Mukosa absorbiert werden (WILLIAM R. LICHT

et al. 1986) während es in vitro als gasförmige Verbindung entweicht. In geschlossenen

Systemen oder bei nicht vollständigem Abtransport wird NO in Anwesenheit von Sauerstoff

zu reaktiven Stickoxiden regeneriert (TANNENBAUM 1980). Des Weiteren wird

Ascorbinsäure durch vorhandenen Sauerstoff verstärkt selbst oxidiert und steht deshalb nicht

mehr für den Abbau von Nitrit zu NO zur Verfügung (ARCHER et al. 1975; MIRVISH

1975). Während Ascorbinsäure im wässrigen System die Nitrosierung durch in Abbildung 8

angegebenen Mechanismus v. a. in Abwesenheit von Sauerstoff (ARCHER et al. 1975) und

bei niedrigen Reaktionstemperaturen effektiv verhindern kann (W. R. LICHT et al. 1988), hat

es in lipophilem Medium aufgrund seiner lipophoben Eigenschaften keine inhibitorische

Wirkung. Im heterogenen Milieu kann das gebildete NO in lipophile Bereiche diffundieren


30

und dort nach erfolgter Oxidation wiederum mit vorhandenen Aminen reagieren (BARTSCH

et al. 1988).

In gepökeltem Speck konnte nach Zusatz von Dimethylamin und Ascorbinsäure die

Entstehung von Nitrosodimethylamin nachgewiesen werden, wobei die Konzentration des

Nitrosamins nach dem Braten (95-100 °C) im Fettgewebe teilweise um das 10-fache höher

war als im angrenzenden Muskelgewebe. Des Weiteren zeigte sich ein antinitrosierender

Effekt der Ascorbinsäure, besonders wenn diese in equimolarem Verhältnis zum zugesetzten

Nitrit vorlag (MOTTRAM et al. 1975).

Da das Ascorbat-Ion (pKS 4,3) um das 230fache schneller mit Nitrit reagiert als

Ascorbinsäure, liegt das pH-Optimum für die antinitrosierende Wirkung von Ascorbinsäure

bei 3-5 (MIRVISH 1975). Aber auch bei neutralem und basischem pH verhindert

Ascorbinsäure effektiv die Nitrosierung von Morpholin (COONEY et al. 1986). In vitro

hemmt Ascorbinsäure im equimolaren Verhältnis zu Nitrit und selbst bei Anwesenheit von

Sauerstoff die Nitrosierung von Dimethylamin, Morpholin und Piperazin nahezu vollständig

(ARCHER et al. 1975; MIRVISH 1975). Auch in vivo blockiert Ascorbinsäure die

intragastrische Nitrosierung der genannten Amine im Tierversuch. Für den Menschen besteht

ein Zusammenhang zwischen der Aufnahme von Ascorbinsäure mit der Nahrung und einem

vermindertem Krebsrisiko im Bereich des Magens, des Ösophagus und der Mundhöhle

(BARTSCH et al. 1988).

2.5. Analytische Methoden (Grundprinzipien)

2.5.1. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)

Bei der Hochleistungsflussigchomatographie (HPLC) erfolgt die chromatographische

Trennung von Stoffgemischen, indem eine stationäre, feste Phase (Säule) von einer mobilen

flüssigen Phase (Eluent) durchströmt wird. Die mobile Phase enthält hierbei die zu

trennenden Analyte, die durch unterschiedlich starke Wechselwirkungen mit dem

Trägermaterial der Säule zurückgehalten werden. Diese unterschiedliche Retention kann

anhand der Retentionszeit, d.h. der Zeit, die die Substanz benötigt, um durch die Trennsäule

zu wandern, bestimmt werden. Die Retentionszeit einer Substanz ist innerhalb eines Systems

für diesen Stoff charakteristisch, sodass das chromatographische Verhalten des Stoffes seiner

Identifizierung bzw. seiner Reinheitsbestimmung dienen kann (ZEECK et al. 2005).


31

Für die Trennung werden verschiedene Trägermaterialien der Säulen verwendet, die

unterschiedliche Wechselwirkungen mit den Analyten eingehen. Bei der Verwendung von

Normalphasen kommen v.a. Kieselgele zum Einsatz, die auf ihrer Oberfläche polare Gruppen

tragen und mit den Analyten hydrophile Wechselwirkungen eingehen. Umkehrphasen

hingegen verfügen über unpolare Oberflächen und reagieren mit dem Analyten über

hydrophobe Wechselwirkungen. Weitere Faktoren, die die Retention der Analyten

beeinflussen sind der Porendurchmesser des Trägermaterials, die Säulenlänge, der

Säulendurchmesser und die Zusammensetzung der mobilen Phase, die meist aus

Lösemittelgemischen aus Wasser, organischem Lösemittel und einem Puffer oder Ionenpaar-

Reagenz besteht (LOTTSPEICH u. ZORBAS 1998).

2.5.2. Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und

Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)

Bei der Gaschromatographie wird die flüssige Probe sofort nach dem Einspritzen verdampft

und mit der mobilen, gasförmigen Phase (Stickstoff oder Helium) in eine Kapillarsäule

eingeleitet, wo die Auftrennung der Analyten erfolgt. Dieses Verfahren eignet sich v.a. für die

Trennung flüchtiger organischer Verbindungen. Anschließend erfolgt deren Detektion mittels

Massenspektrometrie (OHLS 2010).

Bei der massenpektrometrischen Analyse wird die zu untersuchende Substanz in einer

Ionenquelle ionisiert. Anschließend erfolgt die Auftrennung der Ionen entsprechend ihrem

Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) im Vakuum. Der Detektor registriert die eintreffenden

Ionen. Aus den detektierten Signalen werden Massenspektren erstellt, aus denen das m/z-

Verhältnis sowie die Signalintensitäten der jeweiligen Ionen ablesbar sind.

Für die Ionisierung der Analyten stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Bei der

Elektronenstoßionisation (EI) wird der Analyt mit energiereichen Elektronen beschossen und

es kommt zur Bildung eines Molekülions. Da die Ionisierungsenergie des Analyten bei

diesem Elektronenbeschuss oft überschritten wird, kommt es zu Zerfallsprozessen, d.h. zur

charakteristischen Fragmentierung der Molekülionen. Anhand des m/z-Verhältnisses dieses

Molekülions sowie seines Fragmentierungsmusters können Rückschlüsse auf dessen Identität

erfolgen (ZEECK et al. 2005).


32

Im Gegensatz zur Gaschromatographie gelangt der Analyt bei der Flüssigchromatographie in

der flüssigen mobilen Phase in die Ionenquelle, wo seine Ionisierung stattfindet.

Bei der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie kommen vor allem zwei

Ionisierungstechniken zum Einsatz, die Elektrospray-Ionisation (ESI) und die chemische

Ionisation bei Atmosphärendruck (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI). Bei der

Ionisation mittels ESI erfolgt zunächst die Zerstäubung der Probe in kleinste geladene

Tröpfchen in einem angelegten elektrischen Feld unter Verwendung eines Spraygases (z. B.

N2). Noch in diesen Tröpfchen enthaltenes Lösemittel verdampft und die nunmehr

verbleibenden Analyt-Ionen werden im Hochvakuum des Analysators (z. B.

Quadrupolmassenanalysator) entsprechend ihres m/z-Verhältnisses getrennt und in den

Massendetektor weitergeleitet. Bei der Ionisation mittels ESI können sowohl negativ geladene

(negativ ion mode) als auch positive geladene Ionen (positive ion mode) gebildet werden

(LOTTSPEICH u. ZORBAS 1998).

3. Material und Methoden

33


3.1. Geräte und Chemikalien

Eine vollständige tabellarische Aufstellung aller verwendeten Chemikalien und Geräte

befindet sich im Anhang unter Kapitel 8.3 und 8.4.

3.2. Herstellung der Reagenzien

Phenollösungen

Für die Herstellung der Phenollösungen von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol oder 4-

Methylguajakol wurden jeweils 500 mg des entsprechenden Phenols in 5 mL Ethanol gelöst

und anschließend je nach Versuchsaufbau der Pökellake oder der Fleischprobe in der

vorgegebenen Konzentration hinzugefügt.

Die Phenollösungen wurden im Dunkeln bei -18 °C aufbewahrt und erwiesen sich unter

diesen Bedingungen über einen Zeitraum von mindestens vier Wochen als stabil.

Salzsäurelösung 0,5 M

Für die Ansäuerung der hergestellten Marinaden auf pH 3, sowie für die Simulation der

Verdauung der Fleischproben wurde eine 0,5 molare Salzsäurelösung (HCl) hergestellt.

Hierfür wurden 10,35 mL einer 37 %igen rauchenden HCl-Lösung mit destilliertem Wasser

auf 250 mL verdünnt.

Ammoniaklösung 2 M

Für die Einstellung der Marinaden auf pH 5, sowie für die Anhebung des pH-Wertes der

Fleischproben nach der simulierten Verdauung wurde eine 2 M Ammoniaklösung (NH3)

hergestellt. Hierfür wurden 5,8 mL einer 30-33 %igen NH3-Lösung mit destilliertem Wasser

auf 50 mL verdünnt.


34

Pepsinlösung

Die Pepsinlösung für die Simulation der Verdauung der Fleischproben wurde hergestellt mit

50 mg Pepsin auf 10 mL destilliertes Wasser, welches zuvor mit 0,5 M HCl-Lösung auf einen

pH von 4,5 eingestellt wurde. Die Pepsinlösung wurde vor jedem Verdauungsversuch kurz

vor ihrer Zugabe zur Fleischmatrix frisch hergestellt.

Nitritpökelsalz 0,45 %

Für die Herstellung des Nitritpökelsalzes mit 0,45 % Natriumnitrit wurde 0,9 %iges

Nitritpökelsalz mit Kochsalz im Verhältnis 1:2 verdünnt.

Nitrit-Kochsalzlösung 0,8 %

Für den Ansatz der Fleischproben mit einem Nitritgehalt von 400 mg/kg wurde eine wässrige

Nitrit-Kochsalzlösung hergestellt, hierfür wurden 4 g Kochsalz (NaCl) und 160 mg

Natriumnitrit (NaNO2) in 20 mL destilliertem Wasser gelöst.

Ascorbinsäure-Lösung 2 %ig

Für die Herstellung der Marinaden und der Fleischproben wurde eine 2 %ige Ascorbinsäure-

Lösung hergestellt, indem 100 mg Ascorbinsäure in 5 mL destilliertem Wasser gelöst wurden.

Die Herstellung der Ascorbinsäure-Lösung erfolgte jeweils unmittelbar vor ihrer Zugabe zu

den Proben.

3.3. Probenherstellung und –aufbereitung

3.3.1. Wässriges Reaktionsmodell

3.3.1.1. Herstellung

Die Pökellaken wurden als wässrige Lösungen hergestellt, die 1,66 % Nitritpökelsalz

enthielten. Der Nitritgehalt des Pökelsalzes betrug 0,9 %, sodass die resultierende

Konzentration an NaNO2 in der Pökellake 150 mg/L war. Des Weiteren erfolgte der Zusatz

des zu untersuchenden Methoxyphenols in einer Konzentration von 200 mg/L. Zuletzt wurden

gemäß den Versuchsmodellen zwei unterschiedliche Konzentrationen an Ascorbinsäure

hinzugegeben. Diese waren 100 mg/L und 500 mg/L Ascorbinsäure in der Lake.


35

Sofort nach ihrer Herstellung wurde der pH-Wert der Laken gemessen. Die Pökellaken

wurden daraufhin im Wasserbad für 40 min bei 80 °C erhitzt und anschließend im Eisbad auf

18 °C gekühlt.

Die abgekühlten Proben wurden mit 0,5 M Salzsäurelösung auf einen pH-Wert von pH 3

angesäuert und in einem auf 40 °C temperiertem Wasserbad für 1 h erhitzt und anschließend

im Eisbad auf 18 °C abgekühlt. Zuletzt wurde der pH-Wert mit 2 M Ammoniaklösung auf pH

5 eingestellt, um eine weitere Reaktion der Analyten bei pH 3 zu unterbinden.

Für jeden Lakeversuch (je zwei unterschiedliche Ascorbinsäurekonzentrationen für jeweils

eines der vier untersuchten Methoxyphenole) wurden jeweils sechs Ansätze hergestellt.

Da sich v. a. in den Pökellaken mit Syringol-Zusatz nach dem Erhitzten bei 80 °C ein dunkler,

violett-brauner Niederschlag bildete, wurden weitere Versuche durchgeführt, um die

Entstehung desselben unter verschiedenen Reaktionsbedingungen näher zu untersuchen.

Hierfür wurden Pökellaken mit 100 mg/L Ascorbinsäure, 1,66 % Nitritpökelsalz (150 mg/kg

NaNO2) und 50 mg/L Syringol oder 1,66 % Nitritpökelsalz und 50 mg/L Syringol oder

100 mg/L Ascorbinsäure und 50 mg/L Syringol hergestellt und jeweils für 40 min bei 80 °C

erhitzt und anschließend bei 24 °C gelagert oder ohne Erhitzen im Dunkeln bei 24 °C oder

7 °C gelagert. Die Proben wurden jeweils nach 1, 3, 5 und 24 h auf die Bildung von

Niederschlägen optisch untersucht.

3.3.1.2. Probenentnahme

Die Probenentnahme erfolgte zunächst, nachdem die Laken auf 80 °C erhitzt und

anschließend auf 18 °C gekühlt worden waren, sowie ein zweites Mal nach der Einstellung

des pH-Wertes auf pH 5 mit 2 M Ammoniaklösung.

Es wurden jeweils 4 mL der Lake entnommen und mit Hilfe eines Spritzenfilters (Nylon,

Porendurchmesser 0,45 µm) filtriert. Dies geschah, um die dunklen, violett-braunen

Niederschläge zu entfernen, die sich in den Laken, die Guajakol oder Syringol enthielten,

gebildet hatten.

Schließlich wurden 2,5 mL der filtrierten Lakeproben zusammen mit 250 µL 4-

Methylguajakol (1 g/L) als internem Standard (bzw. 250 µL 4-Methylsyringol (1 g/L) als


36

internem Standard für die Pökellaken, die 4-Methylguajakol als Analyten enthielten) in 5 mL

Messkolben überführt und mit destilliertem Wasser auf 5 mL aufgefüllt. Daraufhin wurden

die Proben mittels HPLC-UV/VIS bezüglich ihrer Phenolgehalte und der Entstehung von

Reaktionsprodukten analysiert.

Der abfiltrierte violett-braune Niederschlag der Pökellaken, die Syringol als Analyten

enthielten, wurde mit Methanol und destilliertem Wasser gespült und bei 37 °C im

Trockenschrank getrocknet. Ein Teil des getrockneten Niederschlages wurde mit destilliertem

Wasser gemischt und mikroskopisch untersucht.

Anschließend wurden 2 mg des Niederschlages mit 5 mL Chloroform gemischt, wobei ein

Teil des Niederschlages in Lösung ging. Ungelöste Anteile wurden mit einem Spritzenfilter

abfiltriert. Das klare, gelbe Filtrat wurde zunächst mittels HPLC-UV/VIS chromatographisch

getrennt und fraktioniert. Die einzelnen Fraktionen wurden mit Hilfe von GC-MS analysiert.

Der in Methanol gelöste Niederschlag aus den Pökellaken mit Guajakol-Zusatz wurde mittels

HPLC-UV/VIS sowie mit LC-MS analysiert.

3.3.2. Fleischproben

3.3.2.1. Herstellung

3.3.2.1.1. Fleischproben mit unterschiedlichen NaNO2-Zusätzen

Für die Herstellung der Fleischproben wurde gemischtes Hackfleisch aus 55 %

Schweinefleisch und 45 % Rindfleisch (Hackfleisch gemischt, Markendiscounter) verwendet.

Die Proben enthielten jeweils 100 mg/kg Ascorbinsäure, sowie 100 mg/kg Syringol oder 4-

Methylsyringol oder 60 mg/kg Guajakol oder 4-Methylguajakol. Des Weiteren wurde den

Proben entweder aus 1,66 % Nitritpökelsalz (enthält entweder 0,45 % oder 0,9 % NaNO2)

oder 5 % einer 0,8 % igen Nitrit-Kochsalzlösung zugesetzt. Die hieraus resultierenden

Konzentrationen an NaNO2 im Fleisch betrugen somit 75 mg/kg, 150 mg/kg oder 400 mg/kg.

Bevor die noch rohen Proben für die Versuche in Schraubdeckelgläser gefüllt wurden,

wurden sie mit Hilfe einer Moulinette homogenisiert.

Für jeden Versuch wurden jeweils sechs Ansätze hergestellt.


37

3.3.2.1.2. Fleischschäume

Für die Simulation von Reaktionsbedingungen wie sie in Fleischmousses oder -parfaits

vorliegen, erfolgte die Herstellung von Fleischproben, denen 20 % w/w Eiklar zugesetzt

wurde. Das Eiklar wurde vorher entweder durch Aufschlagen mit Luft oder mit Sauerstoff zu

Eischnee verarbeitet und dann unter die bereits homogenisierte Fleischmasse gehoben. Die

Proben enthielten außerdem 100 mg/kg Ascorbinsäure, 1,66 % Nitritpökelsalz (0,9 % NaNO2)

und jeweils 100 mg/kg Syringol oder 4-Methylsyringol oder 60 mg/kg Guajakol oder 4-

Methylguajakol. Als Vergleichsproben wurden Fleischproben verwendet, die anstatt des

Eischaumes 20 % unaufgeschlagenes Eiklar enthielten.

Davon ausgehend, dass der Sauerstoffgehalt in der Luft, die für das Aufschlagen des Eiklars

verwendet wurde 20 % v/v ausmachte und im mit Sauerstoff angereichertem Luftgemisch ca.

80 % v/v betrug, errechnet sich ein Sauerstoffgehalt von 16 % v/v bzw. 64 % v/v in den

Schäumen. Zugrunde liegt dieser Berechnung, dass das Eiklar (100 mL) durch das

Aufschäumen auf das 5-fache (500 mL) seines Ausgangsvolumens gebracht wurde.

Für jeden Versuch wurden jeweils sechs Ansätze hergestellt.

3.3.2.1.3. Wiederfindungsraten

Für die Ermittlung der Wiederfindungsraten aus der Fleischmatrix, wurden Fleischproben

hergestellt, die jeweils 100 mg/kg Syringol oder 4-Methylsyringol oder 60 mg/kg Guajakol

oder 4-Methylguajakol enthielten. Es erfolgte kein Zusatz von Nitritpökelsalz oder

Ascorbinsäure. Die Bestimmung der Wiederfindungsraten erfolgte sowohl nach dem Erhitzen

(80 °C, 45 min) als auch nach der simulierten Verdauung (siehe unten).

Des Weiteren erfolgte die Bestimmung der Wiederfindungsraten der Oxidationsprodukte von

Syringol und Guajakol nach deren Zugabe zu Fleischproben, denen weder Nitritpökelsalz,

noch Ascorbinsäure oder unreagiertes Phenol zugesetzt worden waren. Hierfür wurden die

Reaktionsprodukte zunächst aus den Pökellaken mittels Festphasenextraktion extrahiert und

im Anschluss an ihre chromatographische Auftrennung fraktioniert. Die unterschiedlichen

Fraktionen wurden den Fleischproben vor dem Erhitzen auf 80 °C zugesetzt. Die Extraktion


38

der Oxidationsprodukte erfolgte sowohl nach dem Erhitzen, als auch nach der simulierten

Verdauung der Fleischproben (siehe Versuchsdurchführung).

Die Stichprobenzahl war n = 6 für die Ermittlung der Wiederfindung der Phenole und der

Oxidationsprodukte von Guajakol und Syringol aus den erhitzten und auch aus den

„verdauten“ Fleischproben.

Um den Einfluss der Temperatur als auch der Dauer des Erhitzens auf die Extrahierbarkeit

von 6-Nitrosoguajakol und Nitrososyringol zu untersuchen, wurden weiterhin Fleischproben

ohne Nitritpökelsalz-, Ascorbinsäure- oder Phenolzusatz hergestellt, denen jeweils eines

dieser Oxidationsprodukte zugesetzt worden war. Ihre Extraktion erfolgte nachdem die

Proben entweder für 30 min bei 80 °C, für 45 min bei 60 °C oder für 30 min bei 60 °C erhitzt

worden waren. Die Stichprobenzahl für diese Versuche war jeweils n = 2

3.3.2.2. Versuchsdurchführung

Nach ihrer Herstellung wurden die Fleischproben in Schraubdeckelgläser gefüllt und im

Wasserbad bei 80 °C für 45 min erhitzt, um das Erhitzen bei der Lebensmittelherstellung

(z. B. Heißräucherung) bzw. -zubereitung (z. B. Braten) nachzustellen. Anschließend wurden

die Proben im Eisbad auf eine Kerntemperatur von 18 °C abgekühlt und erneut mit der

Moulinette homogenisiert. Der pH-Wert der homogenisierten Fleischmasse betrug 6,2.

Von der Probe wurden 3 g für die Extraktion abgenommen.

Die simulierte Verdauung der Fleischproben erfolgte unter Herstellung von dem Magenmilieu

ähnlichen Reaktionsbedingungen in Anlehnung an die von SØRENSEN u. BUKHAVE

(2010) entwickelte Methodik.. Die Zugabe von Pepsin und Salzsäure diente hierbei dem

Proteinaufschluss des Fleisches sowie der Herstellung eines sauren Reaktionsmilieus, wie es

im Magen vorliegt.

10 g der zuvor erhitzten und anschließend homogenisierten Fleischprobe (siehe oben) wurden

für die Durchführung der simulierten Verdauung in Zentrifugengläser gefüllt. Es erfolgte die

Zugabe von 5 mL 0,5 M HCl-Lösung sowie 1,5 mL Pepsinlösung zur Fleischmasse und deren

Homogenisierung mit Hilfe eines Stabhomogenisierers. Noch am Stab verbleibende Reste der

Fleischprobe wurden zusammen mit 1 mL destilliertem Wasser in das Zentrifugenglas


39

überführt. Der pH-Wert der auf diese Weise hergestellten Fleischlösung war 3,6. Daraufhin

wurden die Proben bei 40 °C für 1 h im Wasserbad erhitzt und anschließend auf 18 °C

abgekühlt. Zuletzt erfolgte der Zusatz von 1 mL 2 M Ammoniaklösung zu der Fleischprobe.

Für die Extraktion wurden 5 g der Fleischprobe abgenommen.

Für die Lagerungsversuche wurden Fleischproben mit 1,66 % Nitritpökelsalz (0,9 % NaNO2),

100 mg/kg Ascorbinsäure und den oben angegebenen Phenolgehalten (60 bzw. 100 mg/kg)

hergestellt und wie bereits beschrieben bei 80 °C für 45 min erhitzt. Die verschlossenen

Schraubdeckelgläser wurden nach dem Abkühlen im Eisbad für 7 Tage bei 7 °C im Dunkeln

gelagert. Anschließend wurden die Proben mit der Moulinette homogenisiert und die

simulierte Verdauung wurde durchgeführt (siehe oben).

3.3.2.3. Probenaufbereitung

Die Extraktion der Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte aus der Fleischmatrix

erfolgte nach dem in Abbildung 9 dargestellten Schema.

3.3.2.3.1. Methanolextraktion

Zunächst wurde die Extraktion der Analyten mittels Methanol durchgeführt. Hierfür wurden

3 g bzw. 5 g der Fleischproben (siehe Versuchsdurchführung) in Zentrifugenröhrchen gefüllt

und zusammen mit 5 mL Methanol, welches zuvor auf ca. 50 °C erwärmt worden war, mit

Hilfe eines Stabhomogenisierers homogenisiert. Die Methanol-Fleisch-Emulsion wurde im

Gefrierschrank (-30 °C) auf eine Temperatur von 0 °C abgekühlt und anschließend bei 0 °C

und 20.000 rpm für 4 min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand durch

einen Faltenfilter in einen 150 mL Messkolben abfiltriert.

Die Methanolextraktion wurde noch zweimal auf gleiche Weise wiederholt. In einem vierten

Extraktionsschritt wurden anstatt des Methanols 5 mL destilliertes Wasser verwendet,

ansonsten wurde wie bei den drei vorherigen Methanolextraktionen verfahren.

Der 150 mL Messkolben, in welchem sich das Filtrat aus den vier Extraktionsschritten

befand, wurde mit destilliertem Wasser aufgefüllt.

Es schloss sich die Festphasenextraktion (SPE, siehe Kap. 3.3.2.3.2.) des Methanol-Wasser-

Fleischextraktes an.


40

Abbildung 9 Extraktionsschema für die Methoxyphenole und ihre Oxidationsprodukte aus der

Fleischmatrix

3.3.2.3.2. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE)

Die Festphasenextraktion des Fleischextraktes wurde durchgeführt, um störende

Matrixbestandteile, wie Fett und Eiklar, zu entfernen und eine Aufkonzentrierung der

Analyten zu erreichen. Sie erfolgte unter Verwendung von LiChrolut® EN SPE Kartuschen

(40-120 µm, 200 mg), die auf einer Vakuumkammer fixiert wurden, um die aufgebrachten

Flüssigkeiten unter Verwendung von Unterdruck durch die Kartuschen ziehen zu können.

Zunächst wurden die Kartuschen mit jeweils 10 mL Methanol gespült und anschließend mit


41

10 mL destilliertem Wasser konditioniert. Danach wurden die 150 mL Methanol-Wasser-

Fleischextrakt aufgebracht. Nachdem der Extrakt vollständig durchgelaufen war, wurde die

Kartusche mit 10 mL destilliertem Wasser gewaschen und kurz getrocknet. Die auf der

Kartusche verbliebenen Analyten wurden mit 4 mL auf 40 °C erwärmtem Methanol eluiert.

Das Eluat wurde in einem Spitzkolben aufgefangen und bei 37 °C unter Stickstoffatmosphäre

auf 300 µL aufkonzentriert. Der konzentrierte Fleischextrakt wurde zusammen mit 50 µL

internem Standard (4-Methylguajakol bzw. 4-Methylsyringol, siehe Kap. 3.3.1.2.) in einen

1 mL Messkolben überführt und mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Daraufhin wurden die

Fleischextrakte mittels HPLC-UV/VIS analysiert, anschließend in Probengläschen gefüllt und

bei -30 °C im Dunkeln gelagert.

3.4. Analyse der Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte mittels

HPLC-UV/VIS

3.4.1. HPLC-UV/VIS-System

3.4.1.1. Aufbau

Die chromatographische Trennung der Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte aus

der Pökellake und dem Fleischextrakt wurde unter verschiedenen HPLC-Bedingungen

durchgeführt (Tabelle 5). Grund hierfür war zum einen die hohe Matrixbelastung in den

Fleischextrakten, die vor allem die Messung der Oxidationsprodukte bei einer Wellenlänge

von 272 nm behinderte, bei 330 nm jedoch keinen störenden Effekt hatte. Deshalb wurden die

Gehalte der Methoxyphenole bei 272 nm bestimmt, während ihre Oxidationsprodukte

überwiegend bei 330 nm vermessen wurden. Zum anderen musste bei den Fleischextrakten

eine kleinere Säule, eine niedrigere Flussrate und ein höheres Injektionsvolumen verwendet

werden, um die Oxidationsprodukte in den vorliegenden Konzentrationsbereichen erfassen zu

können, die im Vergleich zu den Pökellakeproben deutlich niedriger waren. Trotz des

hierdurch erhöhten Probenvolumens waren die Analytenpeaks der UV/VIS-Chromatogramme

basisliniengetrennt. Außerdem zeigten sich im Vergleich zu den Chromatogrammen der

Pökellaken, bei denen ein geringeres Probenvolumen appliziert wurde, keine Hinweise auf

eine Überladung der Säule wie z. B. verstärktes Peaktailing.


42

HPLC-Bedingungen Pökellake Fleischextrakt

Verwendete RP-Säule 250 mm Nucleodur C-18

Isis® (Innendurchmesser

4,6 mm; Partikelgröße 5 µm)

ohne Vorsäule

150 mm Nucleodur C-18

Isis® (Innendurchmesser

3 mm; Partikelgröße 3 µm)

mit Vorsäule

Injektionsvolumen 20 µL 100 µL

Eluent Wasser/Acetonitril/TEAOH/Essigsäure

(69,2:30:0,5:0,3; v/v/v/v), isokratisch

Flussrate 1 mL/min 0,3 mL/min

Einstellung UV/VIS-

Detektor 272 nm 272 nm und 330 nm

Tabelle 5 HPLC-Bedingungen für die Analyse der Pökellake bzw. des Fleischextraktes

Das HPLC System bestand aus einer Knauer Maxistar K-1000 HPLC-Pumpe, einer Knauer

Interface Box und einem Injektionsventil mit einer 20 µL bzw. 100 µL Probenschleife. Die

Detektion der Analyte erfolgte mit einem Jasco 875 Intelligent UV/VIS Detektor. Nachdem

die Probe diesen passiert hatte, wurde sie über einen 641 VA-Detektor zu einem 650

Elektrochemischen Detektor weitergeleitet und dort abermals vermessen.

Die Aufzeichnung und Auswertung der erhaltenen Daten erfolgte mittels Eurochrom 2.05

Software.

HPLC-UV/VIS-Chromatogramme der vier Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-

Methylsyringol und 4-Methylguajakol gemessen mit den HPLC-Bedingungen, wie sie für die

Pökellaken und Fleischextrakte verwendet wurden, befinden sich im Anhang unter Kapitel

8.5. und 8.6..

3.4.1.2. Kalibrierung

Für die Durchführung einer externen Kalibrierung wurden aus den Stammlösungen der

Phenole Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol oder 4-Methylguajakol jeweils verschiedene

Verdünnungsstufen hergestellt, die den zu erwartenden Konzentrationsbereichen der aus den


43

Pökellaken bzw. Fleischproben isolierten Phenole entsprachen. In jedem Fall erfolgte die

Herstellung von mindestens 5 Verdünnungsstufen. Aus den erhaltenen Peakflächen

(Peakfläche = area under the curve) der unterschiedlichen Verdünnungsstufen wurde in

Abhängigkeit zu der bekannten Konzentration des jeweiligen Phenols eine lineare

Kalibrierfunktion (y = mx+n) erstellt, anhand derer sich die unbekannten Phenolgehalte in der

anschließend vermessenen Pökellake- bzw. Fleischprobe bestimmen ließen. Die Variable m

gibt in der Kalibrierfunktion die Steigung der Kalibriergeraden an und ist ein Maß für die

Empfindlichkeit der Analysenmethode, während n für den Ordinatenabschnitt der Geraden

steht.

Abbildung 10 Beispiel für eine Kalibriergerade von Guajakol unter den für die Pökellakeproben

verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (272 nm)

Die Kalibrierung erfolgte sowohl unter den HPLC-Bedingungen, die für die Analyse der

Pökellaken verwendet wurden als auch für die Bedingungen, die der Bestimmung der Phenole

und ihrer Oxidationsprodukte in den Fleischprodukten zugrunde lagen.

Für die Gehaltsbestimmung der Oxidationsprodukte von Guajakol und Syringol wurde

überwiegend 5-Nitroguajakol als Kalibriersubstanz verwendet, da es den Reaktionsprodukten

sowohl strukturell, als auch bezüglich seines UV-Spektrums ähnelt. Auch für die Anfertigung

der Kalibriergeraden für 5-Nitroguajakol wurden zunächst in Vorversuchen die zu

erwartenden Peakflächen der Analyten ermittelt, anschließend mit den Peakflächen für

unterschiedliche Verdünnungsstufen von 5-Nitroguajakol verglichen und die Gehalte der

Oxidationsprodukte anhand von 5-Nitroguajakoläquivalenten bestimmt.

0

10

20

30

40

0 20 40 60 80 100 120

Pea

kfl

äch

e (m

V*

min

)

Konzentration Guajakol (mg/L)

y = 0,312x + 0,810

R2 = 0,999


44

Abbildung 11 Beispiel für eine Kalibriergerade von 5-Nitroguajakol unter den für die

Pökellakeproben verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (272 nm)

Abbildung 12 Beispiel für eine Kalibriergerade von 5-Nitroguajakol unter den für die Fleischextrakte

verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (330 nm)

Nur im Falle des gebildeten Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol

diente Syringol aufgrund seines vergleichbaren UV-Spektrums als Vergleichssubstanz, sodass

die Gehalte dieses Dimers als Syringoläquivalente angegeben wurden.

Als interner Standard zur Feststellung messtechnisch bedingter Abweichungen diente 4-

Methylguajakol, da dieses Phenol weder mit den anderen untersuchten Phenolen, noch mit

einem ihrer Reaktionsprodukte unter den verwendeten HPLC-Bedingungen coeluiert. Bei den

Proben, die 4-Methylguajakol als zu untersuchendes Phenol enthielten, war 4-Methylsyringol

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14Pea

kfl

äch

e (m

V*

min

)

Konzentration 5-Nitroguajakol (mg/L)

0

5

10

15

20

25

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Pea

kfl

äch

e (m

V*

min

)

Konzentration 5-Nitroguajakol (mg/kg)

y = 8,793x + 0,775

R2 = 0,999

y = 0,341x + 0,138

R2 = 0,994


45

der interne Standard, welches ebenfalls keine chromatographischen Überlagerungen mit 4-

Methylguajakol oder seinen Oxidationsprodukten zeigt.

3.4.1.3. Probenmessung und Gehaltsbestimmung

3.4.1.3.1. Proben aus wässrigem Reaktionsmodell

Die Pökellakenproben wurden direkt nach ihrer Herstellung mittels HPLC-UV/VIS unter den

in Kap. 3.4.1.1. angegebenen Bedingungen vermessen.

Die Identifizierung der Substanzpeaks erfolgte mittels LC-ESI-MS und GC-MS nach ihrer

Fraktionierung und anschließenden Aufreinigung und Aufkonzentrierung mit Hilfe der

Festphasenextraktion (siehe Kap. 3.5.1.).

Die Gehalte an noch vorhandenem bzw. nicht bereits oxidiertem Phenol wurden anhand der

für die Pökellake erstellten Kalibrierfunktion für die einzelnen Phenole bestimmt, während

die Gehaltsbestimmung der Oxidationsprodukte unter Einbeziehung der Kalibrierfunktion für

5-Nitroguajakol für Pökellaken erfolgte (siehe Kap. 3.4.1.2.).

Die Bestimmung der Gehalte erfolgte hierbei über die Peakfläche der integrierten zugehörigen

Substanzpeaks der HPLC-UV/VIS-Chromatogramme unter Berücksichtigung der

Verdünnung der Pökellaken, die im Zuge ihrer Aufarbeitung für die Messungen stattfand

(Kap. 3.3.1.2.).

Für die Gehaltsberechnung ergab sich folgende Gleichung:

cP = ( (PA - n) / m) * VP / VR * z

cP = Konzentration des Analyten in der Pökellake in mg/L

PA = Peakfläche des Analyten in mV*min

n = Achsenabschnitt der Kalibriergeraden der zugehörigen Kalibriersubstanz

m = Steigung der Kalibriergeraden der zugehörigen Kalibriersubstanz

VP = tatsächliches Probenvolumen der Pökellakeproben in mL

VR = Bezugsvolumen der Pökellakeproben (50 mL)

z = Verdünnung der Pökellaken im Zuge der Probenaufarbeitung 1:2 (z = 2)


46

3.4.1.3.2. Fleischextrakt

Auch die Fleischextrakte wurden nach ihrer Herstellung mittels HPLC-UV/VIS unter den in

Kap. 3.4.1.1. angegebenen Bedingungen vermessen.

Die Identifizierung der Substanzpeaks erfolgte mittels LC-ESI-MS und GC-MS nach ihrer

Fraktionierung und anschließenden Aufreinigung und Aufkonzentrierung mit Hilfe der

Festphasenextraktion (siehe Kap. 3.5.1.).

Die Gehalte an noch vorhandenem bzw. nicht bereits oxidiertem Phenol wurden anhand der

für die Fleischextrakte erstellten Kalibrierfunktion für die einzelnen Phenole bestimmt,

während die Gehaltsbestimmung der Oxidationsprodukte unter Einbeziehung der

Kalibrierfunktion für 5-Nitroguajakol für Fleischextrakte erfolgte. Im Falle des

Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol erfolgte die

Gehaltsbestimmung in Syringoläquivalenten (siehe Kap. 3.4.1.2.).

Die Bestimmung der Gehalte erfolgte hierbei über die Peakfläche der integrierten zugehörigen

Substanzpeaks der HPLC-UV/VIS-Chromatogramme unter Berücksichtigung der

Aufkonzentrierung der Fleischextrakte, die im Zuge ihrer Aufarbeitung stattfand (Kap.

3.3.2.3.2.).

Für die Gehaltsberechnung der Analyte in den Fleischproben ergab sich folgende Gleichung:

cF = ( (PA - n) / m) * MP / MR * ER / EP * z

cF = Konzentration des Analyten in der Fleischprobe in mg/kg

PA = Peakfläche des Analyten in mV*min

n = Achsenabschnitt der Kalibriergeraden der zugehörigen Kalibriersubstanz

m = Steigung der Kalibriergeraden der zugehörigen Kalibriersubstanz

MP = tatsächliche Probenmasse der Fleischproben in g

MR = Bezugsmasse der Fleischproben (50 g)

ER = Bezugsmasse der für die Extraktion verwendeten Fleischprobe (erhitzte Probe: ER = 3 g; Probe mit

simulierter Verdauung: ER = 5 g)

EP = tatsächliche Masse der für die Extraktion verwendeten Fleischprobe

z = Faktor für die Verdünnung bzw. Aufkonzentrierung der Fleischproben im Zuge der Probenaufbereitung

(erhitzte Proben: z = 1/3; Probe mit simulierter Verdauung: z = 1/2,7)


47

3.4.1.4. Nachweis- und Bestimmungsgrenzen

Die Nachweisgrenze gibt an, ab welcher Konzentration des Analyten in der Probe unter den

verwendeten Messbedingungen eine Aussage über dessen Vorhandensein in der Probe

getroffen werden kann, wohingegen die Bestimmungsgrenze diejenige Analytkonzentration

ist, die mindestens in der Probe vorliegen muss, damit eine Aussage über den Analytengehalt

getroffen werden kann. Unterhalb dieser Konzentration ist keine sichere quantitative

Bestimmung des Analyten möglich (GOTTWALD 2000).

Sowohl die Nachweis- als auch die Bestimmungsgrenze wurde über die Messung des

Basislinienrauschens der HPLC-UV/VIS-Chromatogramme von vier unabhängig voneinander

hergestellten Leerproben ermittelt, die jeweils doppelt vermessen wurden. Die Leerproben der

Pökellaken bzw. Fleischproben wurden unter Zusatz von 100 mg/L bzw. 100 mg/kg

Ascorbinsäure und 1,66 % Nitritpökelsalz ohne Zugabe von Phenolen hergestellt, auf 80 °C

für 40 min bzw. 45 min erhitzt und anschließend wie in Kapitel 3.3. beschrieben

aufgearbeitet.

Anhand der Signale ebenfalls eingespritzter niedrig konzentrierter Standardlösungen von

Guajakol, Syringol, 4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol und 5-Nitroguajakol wurden

anschließend über die Signal/Rauschverhältnisse die Nachweisgrenzen (3-faches Rauschen)

und Bestimmungsgrenzen (6-faches Rauschen) bestimmt (Tabelle 6)

Pökellake Fleischproben

Methoxphenole NG (mg/L) BG (mg/L) NG (mg/kg) BG (mg/kg)

Syringol 3,06a 6,12a 0,64a 1,28a

4-Methylsyringol 1,40a 2,80a 0,25a 0,50a

Guajakol 0,58a 1,16a 0,07a 0,14a

4-Methylguajakol 0,38a 0,76a 0,08a 0,16a

5-Nitroguajakol 0,56a 1,12a 0,08b 0,16b

Tabelle 6 Nachweisgrenzen (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG) der Methoxyphenole in den

Pökellaken und in den Fleischproben nach dem Erhitzen auf 80 °C; HPLC-Bedingungen siehe Kap.

3.4.1.1.; a NG und BG bestimmt bei 272 nm; b NG und BG bestimmt bei 330 nm


48

3.4.1.5. Wiederfindungsraten

Die Bestimmung der Wiederfindungsraten in Abhängigkeit von der Probenmatrix für die vier

Methoxyphenole und die Oxidationsprodukte von Guajakol und Syringol erfolgte durch

Zugabe bekannter Mengen dieser Analyte zur Fleischmatrix und ihrer anschließenden

Extraktion (siehe Kapitel 3.3.2.1.3.). Nach der Messung der Fleischextrakte mittels HPLC-

UV/VIS wurden die Konzentrationen der extrahierten Analyte ermittelt und die

Wiederfindungsraten (WFR) unter Verwendung folgender Gleichung bestimmt:

WFR = [Konzentration der extrahierten Analyte in der Fleischprobe in mg/kg]*100/[erwartete

Konzentration der zugesetzten Analyte in der Fleischprobe in mg/kg]

3.5. Qualitative Analyse der Methoxyphenole und ihrer Oxidationsprodukte

3.5.1. Probenaufbereitung

Für die Identifizierung der mittels HPLC-UV/VIS aufgetrennten Methoxyphenole sowie ihrer

Oxidationsprodukte erfolgte zunächst ihre Fraktionierung und Aufreinigung aus den

Pökellaken bzw. Fleischextrakten. Diese wurden hierfür in das HPLC-UV/VIS-System

(Bedingungen siehe Kap. 3.4.1.1.) eingespritzt und die aufgetrennten Substanzen wurden,

nachdem sie den UV/VIS-Detektor passiert hatten, in gekühlten Erlenmeyerkolben

aufgefangen.

Zur Aufkonzentrierung der Analyten und ihrer Reinigung von im Eluenten befindlichem

TEAOH und Essigsäure erfolgte die Festphasenextraktion. Das aufgefangene Volumen wurde

zunächst im Verhältnis 1:3 mit destilliertem Wasser verdünnt, um den Anteil von Acetonitril

(30 % im Eluenten) auf 10 % des Gesamtvolumens zu verringern, damit die Analyten bei der

Probenaufgabe auf den Kartuschen verbleiben und nicht durch einen zu hohen Anteil an

organischem Lösemittel verfrüht eluiert würden.

Die Festphasenextraktion erfolgte nach dem in Kapitel 3.3.2.3.2. beschriebenen Verfahren.

Nach ihrer Elution von der SPE-Kartusche wurden die Analyten mit Stickstoff bei 37 °C auf


49

300 µL aufkonzentriert und in Probengläschen überführt. Die Lagerung der Analytlösungen

erfolgte bei -30 °C im Dunkeln unter Argonatmosphäre.

3.5.2. HPLC-DAD

Die HPLC-Bedingungen, die zur Messung Probenlösungen und der fraktionierten Analyte

mittels HPLC-DAD verwendet wurden, waren identisch mit den in Kapitel 3.4.1.1.

beschriebenen. Die Detektion erfolgte mit einem Knauer WellChrom DAD K-2700 Detektor,

der mit einer Knauer WellChrom LAMP K-2701 verbunden war und durch eine Knauer

Interface box mit Hilfe von Eurochrom 2.05 Software kontrolliert wurde.

Der Eluent war Wasser/ Acetonitril (70:30, v/v).

3.5.3. HPLC-ECD

Für die Detektion der Probenlösungen sowie der fraktionierten Analyten mittels HPLC-ECD

wurde hinter den UV/VIS Detektor (siehe Kap. 3.4.1.1.) ein 641 VA-Detektor mit einem 650

Elektrochemischen Detektor angeschlossen. Die Proben wurden auf diese Weise, nachdem sie

den UV/VIS-Detektor passiert hatten, abermals mittels elektrochemischer Detektion erfasst.

Für die Bestimmung der Halbstufenpotentiale von Phenol, 4-Nitrosophenol, 4-Nitrophenol, 2-

Nitrophenol, 4-Methylguajakol, 4-Methylguajakol und von Syringol und Guajakol sowie

ihren Oxidationsprodukten aus den Pökellaken wurden Voltammogramme im Bereich von

300 mV bis 1250 mV in Intervallen von 50 mV erstellt. Die HPLC-Bedingungen entsprachen

denen für die Messung der Pökellaken unter HPLC-UV/VIS verwendeten. Die Konzentration

der Standardlösungen war 10 mg/L für Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-

Methylguajakol, 12,5 mg/L für Phenol, 25 mg/L für 4-Nitrosophenol und 100 mg/L für 2- und

4-Nitrophenol. Für die Messung der Oxidationsprodukte von Guajakol und Syringol aus den

Pökellaken wurden die Laken wie in Kapitel 3.3.1.1 beschrieben hergestellt und anschließend

mittels Festphasenextraktion (Kap. 3.3.2.3.2.) gereinigt, bevor sie ebenfalls elektrochemisch

vermessen wurden.

Die Berechnung der Halbstufenpotentiale aus den mit Hilfe der Voltammogramme erhaltenen

Graphen erfolgte unter Verwendung von GraphPad.Prism® 6.0 Software mittels nicht-linearer

Regression (Model: Y = Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope)) nach Bildung des

dekadischen Logarithmus von U.


50

3.5.4. Spektrophotometrie

Die spektrophotometrische Analyse von Syringol und 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-

4,4′-diol erfolgte mittels eines Uvikon 930 Spektrophotometers bei einer Scan-

Geschwindigikeit von 200 nm/min, einem Scan-Interval von 1 nm und mit einer Küvette von

1 cm Schichtdicke. Für die spektrophotometrische Untersuchung wurde Syringol in

Chloroform gelöst und eine Lösung mit einer Konzentration von 50 mg/L hergestellt.

Für die Herstellung einer 50 mg/L 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol-Lösung aus

dem in den Pökellaken gebildeten Niederschlag wurden 10 mg des abfiltrierten und

getrockneten Niederschlages (Kap. 3.3.1.2.) in 100 mL Chloroform gelöst, noch vorhandene

dunkle Schwebstoffe wurden durch Zugabe von 80 mL destilliertem Wasser aus der

Chloroformphase in die wässrige Phase überführt, woraufhin beide Phasen klar und gelb

vorlagen. Die Chloroformphase wurde im Verhältnis 1:2 mit Chloroform verdünnt und

spektrophotometrisch untersucht.

Die Extinktion von fünf jeweils unabhängig voneinander hergestellten Analytlösungen wurde

bei einer Wellenlänge von 272 nm gemessen.

Die Berechnung der molaren Extinktionskoeffizienten von Syringol und 3,3′,5,5′-

Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol erfolgte mit Hilfe des Lambert-Beer`schen Gesetzes

(GOTTWALD u. HEINRICH 1998):

ε = E/c*d

ε = molarer Extinktionskoeffizient (L*cm/mol)

E = Extinktion

c = Konzentration des Analyten in mol/L

d = Schichtdicke der Küvette

Es ergab sich rechnerisch ein mittlerer molarer Extinktionskoeffizient von

ε = 1087 L*cm/mol für Syringol und ε = 8224 L*cm/mol für 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-

biphenyl-4,4′-diol (siehe Anhang unter 8.9.).


51

3.5.5. GC-MS

Die fraktionierten Analytlösungen (Kap.3.5.1.) wurden mittels Gaschromatographie-

Massenspektrometrie untersucht. Hierfür wurde ein 3300/3400 Varian Gaschromatograph in

Verbindung mit einem Finnigan MAT SSQ 710 Massenspektrometer verwendet. Die

chromatographische Trennung erfolgte mit Hilfe einer J&W Scientific DB-5 Trennsäle mit

einer Länge von 60 m, einer Schichtdicke von 0,25 µm und einem Innendurchmesser von

0,25 mm. Als Trägergas wurde Helium genutzt.

Die Anfangstemperatur der Säule war 120 °C. Die Temperatur wurde innerhalb von 13 min

auf 250 °C und in den folgenden 6 min auf 300 °C erhöht und blieb dann für 20 min konstant

bei 300 °C.

Die Temperatur der Transferkapillare wurde gleichbleibend bei 300 °C gehalten, während der

Injektor von anfangs 120 °C innerhalb von 4 min auf 320 °C aufgeheizt wurde. Es wurden

6 µL Probe injiziert.

Die Auswertung der erhaltenen Signale erfolgte mittels ICIS EXECUTIVE Version 8.2.1

Software.

3.5.6. LC-ESI-MS

Die chromatographische Trennung und Detektion der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-

Methylsyringol, 4-Methylguajakol, 5-Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-methoxyphenol mittels

HPLC-ESI-MS erfolgte unter in den in Tabelle 7 und Abbildung 13 dargestellten

Bedingungen:


52

Tabelle 7 HPLC-ESI-MS Bedingungen für die chromatographische Trennung und

massenspektrometrische Detektion von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol, 5-

Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-methoxyphenol mittels HPLC-ESI-MS

Pumpe/Autosampler/Controller Waters 616 Gradientenpumpe und Waters

171 Plus Autosampler verbunden mit einer

Waters 600 Kontrolleinheit

Eluent Eluent A: Wasser/Acetonitril (90:10, v/v);

Eluent B: Wasser/Acetonitril (50:50, v/v)

beide Eluenten enthielten

Ammoniumhydrogencarbonat als Puffer in

einer Konzentration von n = 0,01 mol/L;

Gradientensystem (siehe Abb. 13)

Säule Nucleodur C 18 ISIS® (Länge: 150 mm;

Innendurchmesser: 3 mm; Partikelgröße:

3 µm)

Säulentemperatur 20 °C

Flussrate 0,3 mL/min

Injektionsvolumen 5 µL

Gas Stickstoff (Sheathgas-Strom 60 u, Hilfsstrom

10 u)

Detektor/Detektoreinstellungen Finnigan LCQ Classic Massenspektrometer

mit Elektrospray-Ionisation (ESI), negativer

Ionenmodus, Total-Ionen-Chromatogramm

Modus (TIC), Temperatur der Kapillare

250 °C

Massenbereich m/z 50 bis m/z 500

Software XCalibur 1.3 (Thermo Scientific)


53

Abbildung 13 Schema des Gradientensystems für die Elution der Methoxyphenole Syringol,

Guajakol, 4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol, 5-Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-methoxyphenol

mittels HPLC-ESI-MS (Eluent A: Wasser/Acetonitril (90:10, v/v), Eluent B: Wasser/Acetonitril

(50:50, v/v), enthalten jeweils Ammoniumhydrogencarbonat (n = 0,01 mol/L))

Die Konzentration der Analyten in der zu messenden Lösung betrug jeweils 100 mg/L für

Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol und 50 mg/L für 5-Nitroguajakol

und 2-Nitroso-5-methoxyphenol.

Die massenspektrometrische Analyse der aus den Pökellaken bzw. Fleischproben isolierten

Oxidationsprodukte erfolgte unter nahezu identischen Bedingungen wie den in Tabelle 8

angeführten.

Für die chromatographische Trennung der in den Pökellaken bzw. Fleischextrakten

enthaltenen Substanzen wurde jedoch ein Eluent aus Wasser/Acetonitril/Essigsäure

(69,7:30:0.3, v/v/v) unter isokratischen Bedingungen verwendet.

Anschließend wurden die mittels HPLC-UV/VIS fraktionierten und mit Hilfe der

Festphasenextraktion aufgereinigten und aufkonzentrierten Analytlösungen (Kapitel 3.5.1.) in

das HPLC-ESI-MS-System appliziert und im TIC-Modus detektiert.

Zuletzt erfolgte die direkte Injektion der fraktionierten Analyte über die Probenkapillare in die

ESI-Quelle. Die auf diese Weise direkt eingespritzten Oxidationsprodukte wurden im MS

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60

An

teil

Elu

ent

in

%

Zeit in min

Eluent A

Eluent B


54

bzw. MS/MS Modus analysiert, wobei die Fragmentierung mit einer Kollisionsenergie von

30 u durchgeführt wurde. Die erhaltenen Massenspektren wurden mit TunePlus 1.3 Software

ausgewertet.

3.6. Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der erhaltenen Daten wurde mit Hilfe des SAS Statistical

Analysis Program (SAS für Windows) Version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)

durchgeführt. Für verbundene Stichproben erfolgte eine zweifaktorielle Varianzanalyse,

während unabhängige Proben der einfaktoriellen Varianzanalyse unter Verwendung des

Ryan-Einot-Gabriel-Welsch multiple range Tests unterzogen wurden. Der t-Test für

ungepaarte bzw. gepaarte Stichproben wurde durchgeführt, wenn lediglich zwei Gruppen auf

signifikante Unterschiede verglichen wurden. Für alle statistischen Untersuchungen galt ein

Signifikanzniveau von p ≤ 0,05. Die Berechnung der Mittelwerte und Standardabweichungen

erfolgte mit Excel 2010 Software (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA).

4. Ergebnisse und Diskussion

55


4.1. Chromatographische Trennung und Identifizierung der Methoxyphenole

und ihrer Oxidationsprodukte mittels HPLC-UV/VIS und DAD, GC-MS

und LC-ESI-MS

Die qualitative Analyse der Reaktionsprodukte nach ihrer Isolation und Aufbereitung (Kap.

3.5.1.) wurde mit Hilfe von LC-ESI-MS und GC-MS unter Berücksichtigung ihrer

charakteristischen Fragmentierungsmuster durchgeführt. Für alle identifizierten Produkte

zeigten die LC-MS-Spektren der jeweils aus den Pökellaken und Fleischproben isolierten

Reaktionsprodukte identische Molekül- und Fragmentionen. Ebenso verhielt es sich mit den

GC-MS-Spektren. Lediglich im Falle des aus den Fleischproben extrahierten Nitrososyringols

und Nitrosyringols war die Bestimmung mittels GC-MS aufgrund der geringen Mengen der

isolierten Substanzen nicht möglich, aber auch für diese Verbindungen stimmten die

erhaltenen LC-MS Daten mit denen des aus den Pökellaken isolierten Nitrososyringols und

Nitrosyringols überein. Eine Übersicht der jeweils für die Identifizierung der Verbindungen

verwendeten Analyseverfahren befindet sich im Anhang unter 8.7..

Beispielhaft sind die LC-MS-Spektren von 6-Nitrosoguajakol und GC-MS-Spektren von 6-

Nitroguajakol aus der Pökellake und aus dem Fleischextrakt, sowie die LC-MS Spektren von

Nitrososyringol aus beiden Matrices im Anhang vergleichend dargestellt (Kap. 8.8.).

4.1.1. Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol

Die chromatographische Trennung der vier untersuchten Methoxyphenole wurde zunächst mit

Hilfe von HPLC-UV/VIS durchgeführt. Beispielchromatogramme für die Trennung unter

HPLC-Bedingungen, wie sie für die Analyse der Pökellaken bzw. der Fleischextrakte

verwendet wurden, befinden sich im Anhang unter Kapitel 8.5. und 8.6.. Die

chromatographische Trennung der vier Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte

mittels HPLC-UV/VIS erfolgte erstmalig im Rahmen dieser Studie, nachdem die bisherige


56

Analyse dieser Substanzen vorrangig unter Verwendung von GC-MS durchgeführt worden

war (KNOWLES et al. 1975a, b; PÖHLMANN et al. 2012).

Die Analyse von alkyl- bzw. alkoxyl-substituierten Phenolen in umweltrelevanten Matrices

wurde intensiv von LÜDERS (1999) untersucht. Dem Autoren gelang die Detektion von

Syringol und Guajakol mittels ESI-MS im negativen Ionenmodus unter Verwendung einer

stark basischen mobilen Phase (pH 12, eingestellt mit Natronlauge). In der Studie wurden

jedoch weder Spektren noch Chromatogramme dieser beiden Verbindungen veröffentlicht.

Aufgrund der pKS-Werte der von uns untersuchten Methoxyphenole, die sich im basischen

Bereich zwischen 9,93 für Guajakol und 10,27 für 4-Methylguajakol befinden (Tab. 3)

(RAGNAR et al. 2000), liegen diese Verbindungen im sauren oder neutralen Milieu nicht

ausreichend ionisiert vor, sodass sie mittels ESI-MS nicht detektiert werden können. Daher

wurde in der vorliegenden Studie für die Trennung und Detektion der vier Methoxyphenole

Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol mittels HPLC-ESI-MS im

negativen Ionenmodus ein basischer Eluent verwendet. Optimal wäre hierbei ein pH-Wert des

Eluenten von 12 gewesen, da der pH-Wert des Eluenten beim Eintritt in die Ionenquelle 2 pH-

Einheiten oberhalb des pKS-Wertes des Analyten liegen sollte, um eine nahezu vollständige

Ionisation desselben zu erreichen (KROMIDAS 2006). Da die verwendete HPLC-Säule

jedoch nur bis zu einem pH-Wert von 10 einsetzbar war, wurde der pH-Wert des Eluenten

zwischen 8,3 und 9,1 eingestellt, wobei es während der Messungen innerhalb dieses

Bereiches aufgrund des Gradientenbetriebs zu pH-Schwankungen kam. Für die Einstellung

des pH-Wertes wurde Ammoniumhydrogencarbonat verwendet, da diese Verbindung sich

aufgrund ihrer Flüchtigkeit als optimaler Puffer im basischen Bereich anbietet (ESPADA u.

RIVERA-SAGREDO 2003).

Unter diesen Bedingungen war es erstmalig möglich, sowohl die vier Methoxyphenole

Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol als auch 5-Nitroguajakol und 2-

Nitroso-5-methoxyphenol chromatographisch zu trennen und mit Hilfe von ESI-MS zu

analysieren (siehe Abb. 14).


57

Abbildung 14 HPLC-ESI-MS-Chromatogramm (TIC-Modus) von 2-Nitroso-5-methoxyphenol

(m/z 152) (I), Syringol (m/z 153) (II), Guajakol (m/z 123) (III), 5-Nitroguajakol (m/z 168) (IV), 4-

Methylsyringol (m/z 167) (V) und 4-Methylguajakol (m/z 137) (VI) im negativen Ionenmodus [M-H]-

Anschließend erfolgte die Fragmentierung der direkt in die ESI-Quelle eingespritzten Phenole

Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol, welche zuvor in alkalischem

Eluenten (pH 9,1) gelöst wurden.

Es bildeten sich die in Tabelle 8 aufgeführten Fragmente. Die ergänzende Analyse der

Phenole mittels GC-MS bestätigte die mit Hilfe von LC-ESI-MS erhaltenen Ergebnisse.

Die molekulare Masse aller vier Phenole stimmte mit den Werten für die Masse/Ladungs-

Verhältnisse (m/z) der Molekülionen, die sowohl durch LC-MS ([M-H]-) als auch GC-MS

([M]+) bestimmt wurden, überein. Die Fragmentierung unter LC-MS Bedingungen erfolgte

unter Verlust von 15 u und 28 u, welcher durch die Abspaltung eines Methylradikals von der

aromatischen Methoxygruppe, sowie von [CO] vom Sauerstoff der phenolischen

Hydroxygruppe und dem benachbarten Kohlenstoffatom verursacht wurde. Dieses

Fragmentierungsmuster erweist sich als charakteristisch für phenolische Verbindungen

(MCLAFFERTY u. TURECEK 1995) und war für alle der vier untersuchten Phenole

nachweisbar (Tab. 8). Während der Verlust von 15 u ebenfalls in der Fragmentierung mittels


58

GC-MS nachweisbar war, zeigte sich bei der Auswertung der weiteren Fragmente (mit

Ausnahme von Syringol), dass unter GC-MS Bedingungen der gleichzeitige Verlust von

[CH3] und [CO] unter Bildung eines [M-43 u]-Fragmentes auftrat.

LC-MS GC-MS

Analyt Struktur Molare

Masse

(g/mol)

MS/MS Fragmentierung

m/z (relative Intensität

%)

Fragmentierung

m/z (relative Intensität %)

Syringol (IIa)

H3CO

OH

OCH3

154

153.0 [M-H]- (99.4),

137.9 (100.0),

125.0 (48.7), 109.1 (17.9)

154.0 [M]+ (71.1), 139.1 (28.1),

104.1 (38.5), 73.1 (100.0)

Guajakol (IIIa)

OH

OCH3

124

123.0 [M-H]-

(99.3),108.1 (100.0),

95.1 (55.5)

124.0 [M]+ (100.0), 109.0 (97.2),

81.0 (52.1), 63.1 (24.9)

4-Methylsyringol

(Va)

H3CO

OH

OCH3

CH3

168

166.9 [M-H]- (62.4),

151.9 (100.0),

139.0 (10.8), 134.6 (10.3)

168.0 [M]+ (100.0),153.0 (39.3),

125.1 (16.5), 104.1 (39.07),

73.1 (98.2)

4-Methylguajakol

(VIa)

OH

OCH3

CH3

138 137.0 [M-H]- (100.0),

122.1 (23.8), 109.1 (43.2)

138.0 [M]+ (100.0), 123.0 (72.1),

104.1 (29.1), 95.1 (20.2),

73.1 (66.9)

a Zahlen in Klammern beziehen sich auf Peak-Nummern im HPLC-ESI-MS Chromatogramm in Abbildung 13.

Tabelle 8 Molekülionen und Fragmente von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-

Methylguajakol detektiert mit LC-ESI-MS und GC-MS

Die Analyse der Methoxyphenole des Räucherrauches wurde bei bisherigen Untersuchungen

stets mittels GC-MS durchgeführt, wobei zur Verbesserung des chromatographischen

Verhaltens (verkürzte Retentionszeiten, bessere Peaksymmetrie) meistens die vorherige

Derivatisierung in Form der Trimethylsylierung der Phenole erfolgte (KORNREICH u.

ISSENBERG 1972; KNOWLES et al. 1975a; PÖHLMANN et al. 2013a). Erste Versuche der

Bestimmung der Rauchphenole durch LC-MS Verfahren wurden ebenfalls nur an


59

substituierten Verbindungen durchgeführt, wie z. B. Glycosilaten oder Fluorid-

Transferprodukten (HAYASAKA et al. 2010; YEE et al. 2013).

Die Trennung und Detektion der Rauchphenole mittels HPLC-ESI-MS, wie sie in der

vorliegenden Studie erfolgte, stellt somit eine Möglichkeit der direkten Analyse der

Rauchphenole ohne vorherige Derivatisierung dar. Allerdings sind weitere Versuche zur

Steigerung der Empfindlichkeit des Analyseverfahrens notwendig, da die analysierten

Phenole in dieser Studie in relativ hohen Konzentrationen von 100 mg/L (Syringol, Guajakol,

4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol) bzw. 50 mg/L (5-Nitroguajakol, 2-Nitroso-5-

methoxyphenol) appliziert wurden.

Eine Möglichkeit der Empfindlichkeitssteigerung wäre hierbei sicherlich die Verwendung

höherer pH-Werte für die mobile Phase um eine stärkere Ionisation der Analyten zu erreichen,

wie es bereits von LÜDERS (1999) beschrieben worden ist.

Die Detektion der Oxidationsprodukte konnte jedoch auch -wie in den folgenden Kapiteln

beschrieben- unter Verwendung eines sauren Eluenten mittels LC-ESI-MS durchgeführt

werden (vgl Kap. 4.1.2. bis 4.1.4 und Anhang 8.7.).

4.1.2. Syringol und Oxidationsprodukte

Die chromatographische Trennung von Syringol und seinen Oxidationsprodukten aus den

Pökellaken wurde bei einer Wellenlänge von 272 nm durchgeführt, da in allen Laken hohe

Gehalte an Oxidationsprodukten vorlagen und die Probenmatrix zu keinen Interferenzen mit

den detektierten Verbindungen führte. Die hohen Konzentrationen an Oxidationsprodukten

erlaubten die Detektion bei einer Wellenlänge, die für diese Verbindungen nicht im

empfindlichsten Bereich lag, wie die in Abbildung 15 dargestellten UV-Spektren zeigen. Des

Weiteren war die Applikation eines geringeren Probenvolumens als bei den Fleischextrakten

möglich.

Die Fleischextrakte hingegen mussten jeweils bei zwei Wellenlängen (272 nm und 330 nm)

vermessen werden, wobei gleichzeitig die Applikation eines größeren Probenvolumens

erforderlich war. Zum einen war dies den geringen Mengen der gebildeten

Oxidationsprodukte in den Fleischproben geschuldet, die die Detektion bei an die UV-

Spektren angepasster Wellenlänge erforderte, zum anderen erwies sich die im Fleischextrakt

noch vorhandene Matrix bei der Vermessung bei 272 nm als störend. Die Bestimmung von


60

Syringol und 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol erfolgte daher in Bezug auf ihre

UV-Spektren, welche ihr Maximum im Bereich von 270 nm bzw. 280 nm hatten (siehe Abb.

15), bei 272 nm. Die Detektion von Nitroso- bzw. Nitrosyringol wurde bei 330 nm

durchgeführt, da ihre UV-Spektren ein Maximum in diesem Bereich aufwiesen.

Abbildung 15 UV/VIS-Spektren von Syringol, 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-

diol, Nitrososyringol und Nitrosyringol

Unter diesen Bedingungen konnten mittels HPLC-UV/VIS drei Oxidationsprodukte des

Syringol aus der Pökellake aufgetrennt und detektiert werden (Abb. 16 A), von denen zwei

durch Analyse mit LC-ESI-MS und GC-MS als Nitrososyringol (I) und Nitrosyringol (III)

identifiziert wurden. Die Identität des dritten Reaktionsproduktes (uv) konnte nicht aufgeklärt

werden.


61

Abbildung 16 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von Nitrososyringol (I), Syringol (II), Nitrosyringol

(III), 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (IV), einem nicht identifizierten

Oxidationsprodukt (uv), 4-Methylguajakol (als interner Standard, IS) und einem Matrixpeak (M) aus

der Pökellake (enthielt 200 mg/L Syringol (Ausgangskonzentration), 500 mg/L Ascorbinsäure und

150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 100 mg/kg

Syringol (Ausgangskonzentration), 100 mg/kg Ascorbinsäure und 150 mg/kg NaNO2) nach simulierter

Verdauung bei 272 nm (B) und der gleiche Fleischextrakt gemessen bei 330 nm (C)

Zusätzlich wurde der in den Pökellaken gebildete Niederschlag isoliert und anschließend

massenspektrometrisch und mikroskopisch untersucht und konnte letztlich als kristallisiertes

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol identifiziert werden.


62

Im Fleischextrakt (Abb. 16 B und C) fanden sich neben nicht umgesetztem Syringol (II)

dessen Oxidationsprodukte Nitrososyringol (I), Nitrosyringol (III) und nicht kristallisiertes

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (IV).

Die chromatographische Trennung von Syringol und seinen Oxidationsprodukten, deren

Bildung im Rahmen dieser Studie zum ersten Mal in der Fleischmatrix nachgewiesen werden

konnte, ist bisher nicht beschrieben.

Die Bildung eines Molekülions mit m/z 182 ([M-1]-) im LC-MS-Spektrum von

Nitrososyringol (Abb. 17 A) stimmte mit dessen berechneter molekularen Masse von

183 g/mol überein.

Das intensive Fragment mit m/z 167 konnte durch den Verlust von [CH3] von einer der beiden

Methoxygruppen in ortho-Position des Syringol begründet werden. Die weitere Bildung von

m/z 152 (Abb. 17 B) in Folge des Verlustes von 30 u durch die Abtrennung von [NO] vom

Molekülion war charakteristisch für die Massenspektren von Nitrosophenolen (SCHROLL et

al. 1967; KNOWLES et al. 1974a).

Das Molekülion mit m/z 183 ([M]+]) und die Eliminierung von [NO] ([M-30 u]) im

korrespondierenden GC-MS-Spektrum (Abb. 17 C) unterstützte hierbei die Ergebnisse der

LC-MS Analyse, wobei ein intensives Fragment bei [M-15 u] im GC-MS-Spektrum jedoch

nicht zu finden war.


63

Abbildung 17 Massenspektren des Molekülions von Nitrososyringol (isoliert aus der Pökellake

(100 mg/L ASC sd)) mit m/z 182 (A) und seines Fragmentions mit m/z 167 (B) detektiert mit ESI-MS

im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions von Nitrososyringol mit

m/z 183 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)

Auch für Nitrosyringol (M = 199g/mol) zeigte sich ein charakteristisches

Fragmentierungsmuster (Abb. 18). Das Molekülion mit m/z 198 ([M-H]-) trat zusammen mit

einem Fragment bei m/z 168 auf (Abb. 18 A und B), welches für den Verlust von 30 u in

Folge der Fragmentierung von [NO] stand, welches ein typischer Fragmentierungsschritt für

para-substituierte Nitroaromaten ist (MCLAFFERTY u. TURECEK 1995; LAMBERT et al.

2012). Das prominente Fragment bei m/z 183 im LC-MS-Spektrum (Abb. 18 A) wies auf den

Verlust von [CH3] hin, der jedoch wie schon beim Nitrososyringol durch das GC-MS-

Spektrum (Abb. 18 C) nicht bestätigt wurde. Für die Bildung des Fragmentes bei m/z 153

(Abb. 18 B) war von der Abspaltung von [CH3NO] (45 u) vom Molekülion des Nitrosyringol

auszugehen, die typisch für Nitrophenole unter den vorliegenden Bedingungen zu sein


64

scheint, da eine Standardlösung von 5-Nitroguajakol dasselbe Fragment bei [M-H-45 u] im

LC-MS-Spektrum aufwies.

Auch im GC-MS-Spektrum von Nitrosyringol war die Bildung eines Molekülions mit m/z 199

([M]+) nachweisbar (Abb. 18 C), sowie das Fragment bei m/z 169. Zusätzlich erfolgte die

Abspaltung von 46 u und die damit verbundene Bildung eines Fragmentes bei m/z 153,

welches den Verlust von [NO2] nahelegte (MCLAFFERTY u. TURECEK 1995).

Abbildung 18 Massenspektren des Molekülions von Nitrosyringol (isoliert aus der Pökellake

(100 mg/L ASC sd)) mit m/z 198 (A) und seines Fragmentions mit m/z 183 (B) detektiert mit ESI-MS

im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions von Nitrosyringol mit m/z 199

detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)

Die massenspektrometrische Analyse des in der Pökellake gebildeten Produktes „uv“ (siehe

Abb. 16 A) zeigte im LC-MS-Spektrum ein Molekülion mit m/z 168 [M-H]- und Fragmente

bei m/z 153, m/z 138 und m/z 125. Das GC-MS-Spektrum stimmte mit diesen Daten

dahingehend überein, dass das Molekülion und die Fragmente jeweils 2 u über den m/z-


65

Verhältnissen der LC-MS Daten lagen, was zur Bildung eines Molekülions bei m/z 170 [M]+

und Fragmenten bei m/z 155und m/z 127 führte. Die erhaltenen Daten ließen keine nähere

Identifizierung der Verbindung zu. Es ist jedoch zu vermerken, dass sich bei der Reaktion von

4-Methylsyringol mit Nitrit in der Pökellake eine identisches Oxidationsprodukt (QL 2)

gebildet zu haben schien, welches sowohl in der Retentionszeit der HPLC-UV/VIS und

HPLC-ESI-MS, als auch von den massenspektrometrischen Daten mit dem Syringol-Produkt

„uv“ übereinstimmte (siehe Kap.4.1.4.).

Für die Identifikation des Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol

(M = 306 g/mol) wurden die in Abbildung 19 dargestellten Massenspektren mit Daten aus der

Literatur verglichen.

Abbildung 19 Massenspektren des Molekülions von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol

(isoliert aus der Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 305 (A) und

seines Fragmentions mit m/z 290 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-);

Massenspektrum des Molekülions von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol mit m/z 306

detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)


66

Das Molekülion mit m/z 305 ([M-H]-) (Abb. 19 A) bildete Fragmente bei m/z 290, m/z 275,

m/z 261 und m/z 247 im mittels LC-MS generiertem Spektrum (Abb. 19 B). Dieses

Fragmentierungsmuster war identisch mit den LC-MS Spektren dieser Verbindung, welche

bereits mit ESI-MS im negativen Ionenmodus detektiert wurden und von ADELAKUN et al.

(2012) veröffentlicht worden sind.

Dem Verlust von einem [CH3]-Fragment aus einer der vier Methoxygruppen des Dimers

schloss sich hierbei die Abspaltung einer zweiten [CH3]-Einheit vom Molekülion an, wodurch

die Fragmente m/z 290 und m/z 275 gebildet wurden. Die weitere Fragmentierung und

Bildung von m/z 261 und m/z 247 erfolgte über die schrittweise Abspaltung von zwei [CH2]-

Fragmenten von den verbliebenen Methoxygruppen des m/z 275-Fragmentes.

Die Analyse mittels GC-MS resultierte in einem ähnlichen Fragmentierungsmuster (Abb.

19 C). Das Molekülion bei m/z 306 ([M]+) passte zu der molekularen Masse von 306 g/mol.

Die weiteren Fragmente stimmten mit den in der Literatur veröffentlichten Angaben überein

(GUILLEN u. IBARGOITIA 1998; WAN et al. 2008). Zusätzlich zu der Fragmentierung

unter LC-MS Bedingungen kam es zum gleichzeitigen Verlust von einem [CH3]- und zwei

[CH2]-Fragmenten also insgesamt 43 u, der zur Bildung von m/z 263 führte. Die Aufspaltung

des Dimers in die zwei Monomere begründete die Entstehung von m/z 153.

Zusätzlich zu den aus den Proben über präparative HPLC isolierten Substanzen, wurde der

braun-violette Niederschlag, der sich in den Pökellaken bei der Umsetzung von Syringol mit

Nitrit bildete, analysiert. Die mikroskopische Untersuchung ergab, dass der Niederschlag aus

dunkel-violetten nadelförmigen Kristallen bestand (Abb. 20).

Nachdem die Kristalle mit Chloroform gelöst worden waren, wurde die Substanz ebenfalls

mittels GC-MS analysiert. Die ermittelten GC-MS-Daten stimmten mit denen des Dimers

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (Abb. 19 C) überein.

Die Bildung violetter Kristalle wurde im Zusammenhang mit der oxidativen Umsetzung von

Syringol im sauren wässrigen Milieu bereits von BETTS u. KING (1991) und KUNG (1968)

beschrieben (vgl. Kap. 2.2.4.). Die gebildete Substanz wurde jedoch mittels Massen-und

Infrarot-Spektrometrie als 3,3′,5,5′-Tetramethoxydiphenochinon identifiziert, welches von

dem 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol sowohl in seiner molekularen Masse


67

(M = 304 g/mol) als auch durch das Masse/Ladungsverhältnis seines Molekülions (m/z 304)

unterschieden werden kann.

Es lässt sich somit daraus schließen, dass in den Pökellaken die weitere Oxidation des

Syringoldimers zu seinem Chinon nicht erfolgte, dass es aber trotzdem zur Ausbildung der

Kristalle kam, die vor der Vermessung der Proben mit HPLC-UV/VIS aus diesen entfernt

werden mussten, um ein Verstopfen der HPLC-Säule zu verhindern.

Abbildung 20 Mikroskopische Aufnahme der in der Pökellake gebildeten Kristalle aus 3,3′,5,5′-

Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (56-fache Vergrößerung)

4.1.3. Guajakol und Oxidationsprodukte

Wie bei der chromatographischen Trennung von Syringol und seinen Oxidationsprodukten,

erfolgte die Analyse von Guajakol und den dazugehörigen Reaktionsprodukten mittels HPLC-

UV/VIS aus den Pökellaken und den Fleischextrakten unter unterschiedlichen Bedingungen.

Auch in diesem Fall war dies durch die geringen Konzentrationen an Reaktionsprodukten und

durch die hohe Matrixbelastung in den Fleischextrakten begründet. Die Bestimmung der


68

Guajakolgehalte aus den Fleischextrakten wurde bei 272 nm durchgeführt, während die

Oxidationsprodukte bei 330 nm detektiert wurden (Abb. 21)

Abbildung 21 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 6-Nitrosoguajakol (a), Guajakol (b), 4-

Nitroguajakol (c), 6-Nitroguajakol (d), 4-Methylguajakol (als interner Standard, IS) und einem

Matrixpeak (M) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L Guajakol (Ausgangskonzentration), 500 mg/L

Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt

60 mg/kg Guajakol (Ausgangskonzentration), 100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach

simulierter Verdauung bei 272 nm (B) und der gleiche Fleischextrakt gemessen bei 330 nm (C)

Auf diese Weise ließen sich von Guajakol (b) sowohl aus den Pökellaken als auch aus den

Fleischextrakten jeweils drei Oxidationsprodukte abtrennen, die unter Verwendung von LC-


69

MS und GC-MS als 6-Nitrosoguajakol (a), 4-Nitroguajakol (c) und 6-Nitroguajakol (d)

identifiziert werden konnten.

Die Analyse dieser Verbindungen mittels HPLC-DAD ergab die in Abbildung 22

dargestellten UV-Spektren, die auch für diese Substanzen die Bestimmung bei einer

Wellenlänge von 330 nm begründeten, um störende Matrixeffekte der Fleischextrakte zu

umgehen und eine möglichst empfindliche Bestimmung zu ermöglichen.

Abbildung 22 UV/VIS-Spektren von Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-

Nitroguajakol

Auch in den Pökellaken, die Guajakol als zu untersuchenden Analyten enthielten, bildete sich

ähnlich wie bei den Versuchen mit Syringol während des Erhitzens der Laken bei 80 °C ein

brauner Niederschlag, der vor der Vermessung mittels HPLC-UV/VIS abfiltriert werden

musste. Dieser Niederschlag löste sich in Methanol und wurde in gelöster Form mit HPLC-

UV/VIS und LC-MS untersucht. Mit beiden Analyseverfahren konnte jedoch unter den


70

verwendeten Bedingungen keine Detektion weiterer Substanzen und somit keine weitere

Charakterisierung des Niederschlages erfolgen. Des Weiteren erhöhten sich durch das Lösen

des Niederschlages die Gehalte der bereits identifizierten Oxidationsprodukte oder des

Guajakols nicht, sodass davon auszugehen ist, dass es sich bei dem Niederschlag nicht um

kristallisierte Anteile von Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol oder 6-Nitroguajakol

handelte.

Die Ergebnisse der Analyse der Oxidationsprodukte mittels LC-MS konnte durch weitere

Untersuchungen mit GC-MS abgesichert werden.

Zunächst erfolgte die Identifikation des präparativ aus den Pökellakeproben und

Fleischextrakten isolierten 6-Nitrosoguajakols (M = 153g/mol).

Zusätzlich zu dem Molekülion mit m/z 152 ([M-H]-) im LC-MS-Spektrum fand sich ein

intensives Fragmention bei m/z 137, welches für den Verlust von 15 u durch die Abspaltung

von [CH3] aus der Methoxygruppe in ortho-Position zur phenolischen Hydroxygruppe sprach

(Abb. 23 A).

Auch im GC-MS-Spektrum (Abb. 23 B) zeigte sich ein Molekülion bei m/z 153 ([M]+) und

ein Fragment bei m/z 138. Außerdem bildete sich ein Fragment bei m/z 123, welches durch

den Verlust von 30 u zustande kam, der wiederum auf die Abspaltung von [NO]

zurückzuführen war. Diese Fragmentierung ist charakteristisch für para- und ortho-

Nitrosoguajakol, wie sie durch KNOWLES et al. (1974a) beschrieben worden ist. Im

Gegensatz zu para-substituiertem 4-Nitrosoguajakol bildet ortho-substituiertes 6-

Nitrosoguajakol keine intensiven Fragmente bei m/z 139 und m/z 124 (KNOWLES et al.

1974a). Da beide Fragmente im GC-MS-Spektrum der untersuchten Substanz fehlten bzw.

nur in relativ geringer Intensität vorhanden waren, wurde davon ausgegangen, dass es sich bei

der vorliegenden Verbindung um 6-Nitrosoguajakol handelte.


71

Abbildung 23 Massenspektrum des Molekülions von 6-Nitrosoguajakol (isoliert aus der Fleischprobe

(400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 152 detektiert mit ESI-MS im negativen

Ionenmodus ([M-H]-) (A); Massenspektrum des Molekülions von 6-Nitrosoguajakol mit m/z 153

detektiert mit GC-MS ([M]+) (B)

Das aus den Proben isolierte Nitroguajakol wurde durch den Vergleich der dazugehörigen

Massenspektren mit den von KITANOVSKI et al. (2014) ermittelten

massenspektrometrischen Daten identifiziert. Der genannte Autor untersuchte die

Photonitrierung von Guajakol in wässrigem Medium und identifizierte die entstehenden

Oxidationsprodukte als 4-Nitroguajakol, 6-Nitroguajakol und 4,6-Dinitroguajakol mittels

HPLC-ESI-MS. Es zeigte sich, dass sich para- und ortho-substituiertes Nitroguajakol

hinsichtlich ihrer Fragmentierungsmuster unterscheiden und daher eine nähere

Charakterisierung der beiden Verbindungen mit m/z 168 ([M-H]-) möglich war (Abb. 24 A

und 25 A).

Sowohl 6- als auch 4-Nitroguajakol zeigten im LC-MS-Spektrum intensive Fragmente bei

m/z 153 und m/z 123 (Abb. 24 B und 25 B), welche durch den Verlust von 15 u bzw. 45 u

durch die Abspaltung von [CH3] bzw. den gleichzeitigen Verlust von [CH3] und [NO]

entstehen. Zusätzlich fanden sich im Spektrum von 6-Nitroguajakol Fragmentionen bei

m/z 125 und m/z 107, welche die Unterscheidung dieser Verbindung von ihrem Isomer 4-

Nitroguajakol ermöglichten. Gebildet wurden die beiden Fragmente durch den Verlust von


72

[CO] (28 u) von dem Fragment bei m/z 153 und die Abspaltung von [NO2] und [CH3], d.h.

insgesamt 61 u, vom Molekülion (m/z 168 ([M-H]-)).

Abbildung 24 Massenspektren des Molekülions von 4-Nitroguajakol (isoliert aus der Fleischprobe

(400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 168 (A) und seines Fragmentions mit

m/z 153 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des

Molekülions von 4-Nitroguajakol mit m/z 169 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)

Der Verlust von [NO] (30 u) vom Molekülion m/z 169, welcher typisch für die

Fragmentierung von Nitroaromaten ist (MCLAFFERTY u. TURECEK 1995), zeigte sich in

den GC-MS-Spektren beider Nitroguajakole (Abb. 24 C und 25 C). Die Bildung dieser

Fragmente, sowie die des Fragmentes bei m/z 123 in Folge der Abspaltung von [NO2] (46 u)

(MCLAFFERTY u. TURECEK 1995; LAMBERT et al. 2012) im GC-MS-Spektrum von 4-

Nitroguajakol ist bereits von DIMMEL et al. (1996) beschrieben worden. Die Fragmentierung

von [NO2] konnte durch Bildung eines Fragmentes bei m/z 138 (Abb. 25 B) im LC-MS-

Spektrum von 6-Nitroguajakol bestätigt werden.


73

Abbildung 25 Massenspektren des Molekülions von 6-Nitroguajakol (isoliert aus der Fleischprobe

(400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 168 (A) und seines Fragmentions mit

m/z 153 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des

Molekülions von 6-Nitroguajakol mit m/z 169 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)

Das GC-MS-Spektrum von 6-Nitroguajakol unterschied sich vom dem des 4-Nitroguajakol

durch die Entstehung der beiden Fragmente bei m/z 124 und m/z 152, außerdem fehlte ein

intensives Fragment bei m/z 123 (Abb. 25 C). Das erste der beiden zusätzlichen Fragmente

lässt sich unter Verweis auf das zugehörige LC-MS-Spektrum (Abb. 25 B) durch den Verlust

von [CH3] und [NO] erklären, während das zweite Fragment mit m/z 152 aus der Abspaltung

von 17 u im Zuge des Verlustes von [OH] resultierte.

Die UV-Spektren der Oxidationsprodukte 6-Nitroguajakol und 4-Nitroguajakol (Abb. 22)

entsprachen denen der bereits von KITANOVSKI et al. (2014) veröffentlichten, wobei 4-

Nitroguajakol von 6-Nitroguajakol (Maximum bei 295 nm) durch die Bildung eines


74

Maximums bei der Wellenlänge 349 nm zu unterscheiden ist. Beide Verbindungen wiederum

grenzen sich bezüglich ihrer UV-Spektren deutlich von 6-Nitrosoguajakol ab, welches eine

Maximum von 317 nm und eine breite Schulter zwischen 360 nm und 400 nm aufweist.

4.1.4. 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol und ihre Oxidationsprodukte

Die Detektion der Oxidationsprodukte von 4-Methylguajakol und 4-Methylsyringol erfolgte

im Gegensatz zu der Analyse der Reaktionsprodukte von Syringol bzw. Guajakol

ausschließlich bei einer Wellenlänge von 272 nm, da die gesuchten Verbindungen bei 330 nm

nicht detektierbar waren, wie versuchsweise Messungen der Pökellaken und des

Fleischextraktes bei dieser Wellenlänge ergaben.

Wie aus den HPLC-UV/VIS-Chromatogrammen für die Pökellake und den Fleischextrakt

unter Zusatz von 4-Methylguajakol ersichtlich (Abb. 26 A und B), war in beiden Matrices

jeweils ein Oxidationsprodukt (PL 1 bzw. F 1) nachweisbar.

Abbildung 26 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 4-Methylguajakol (4-MG), 4-Methylsyringol (als

interner Standard, IS), einem Matrixpeak (M) und zwei Oxidationsprodukten von 4-Methylguajakol

(PL 1, F 1) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L 4-Methylguajakol (Ausgangskonzentration),

100 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A);

Fleischextrakt (enthielt 60 mg/kg 4-Methylguajakol (Ausgangskonzentration), 100 mg/kg

Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter Verdauung bei 272 nm (B)


75

Die unterschiedlichen Retentionszeiten (PL 1: RT = 32 min; F 1: RT = 22 min) dieser beiden

Produkte schienen hierbei größtenteils auf die unterschiedlichen HPLC-Bedingungen

zurückzuführen zu sein, welche für die Pökellaken bzw. Fleischextrakte für die Messung mit

HPLC-UV/VIS verwendet wurden (Kap. 3.4.1.1.), da die fraktionierten und aufgereinigten

Produkte, wenn sie jeweils unter einheitlichen Bedingungen in HPLC-ESI-MS appliziert

wurden, stets auch gleiche Retentionszeiten aufwiesen (Retentionszeit jeweils 25 min).

Die Bildung eines Molekülions bei m/z 182 ([M-H]-) war in den LC-MS Spektren beider

Produkte nachweisbar (Abb. 27 A und Abb. 28 A).

Abbildung 27 Massenspektren des Molekülions von PL 1 mit m/z 182 (A) und seines Fragmentions

mit m/z 167 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des

Molekülions von PL 1 mit m/z 183 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)


76

Für das Oxidationsprodukt PL 1 erfolgte weiterhin der Zerfall in die Fragmente m/z 167,

m/z 139 und m/z 137 (Abb. 27 B), welche durch den Verlust von 15 u, 43 u und 45 u

entstanden. Während das GC-MS-Spektrum des Produktes PL 1 die Bildung des Molekülions

bei m/z 183 [M]+ bestätigte, unterschieden sich die gebildeten Fragmente mit m/z 166,

m/z 153, m/z 135 und m/z 121 (Abb. 27 C) deutlich von den im LC-MS-Spektrum zu

findenden.

Für das Produkt F 1 stimmten im GC-MS-Spektrum weder das Molekülion (m/z 153), noch

dessen Fragmente (m/z 138, m/z 110) (Abb. 28 B) mit den GC-MS-Daten für PL 1 (Abb.

27 C) überein. Auch das für F 1 im LC-MS-Spektrum auftretende Molekülion mit m/z 182

([M-H]-) (Abb. 28 A) wurde durch das dazugehörige GC-MS-Spektrum nicht bestätigt (Abb.

28 B). Aus diesen Gründen war die Identifizierung der beiden gebildeten Produkte anhand der

Fragmentierungsmuster letztlich nicht möglich, auch wenn das unter LC-MS-Bedingungen

gebildete Molekülion von PL 1 und F 1 mit m/z 182 [M-H]-, welches zumindest für PL 1

durch GC-MS bestätigt werden konnte, die Bildung von 6-Nitro-4-Methylguajakol (molare

Masse M = 183 g/mol) vermuten lässt.

Abbildung 28 Massenspektren des Molekülions von F 1 mit m/z 182 detektiert mit ESI-MS im

negativen Ionenmodus ([M-H]-) (A); Massenspektrum des Molekülions von F 1 mit m/z 153 detektiert

mit GC-MS ([M]+) (B)


77

Auch die in der Pökellake und im Fleischextrakt gebildeten Oxidationsprodukte von 4-

Methylsyringol konnten anhand der GC-MS- und LC-MS-Daten nicht identifiziert werden.

Während in der Pökellake vier dieser Reaktionsprodukte nachgewiesen werden konnten

(QL 1, QL 2, QL 3, QL 4; Abb. 29 A), wurden aus dem Fleischextrakt lediglich zwei

Produkte isoliert (R 1 und R 2; Abb. 29 B). Das Produkt R 1 coeluierte mit Matrix aus dem

Fleischextrakt, wodurch der Substanzpeak fast vollständig von dem Matrixpeak überlagert

wurde.

Abbildung 29 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 4-Methylsyringol (4-MS), 4-Methylguajakol (als

interner Standard, IS), Matrixpeak (M) und Oxidationsprodukten von 4-Methylsyringol (QL 1/ QL 2/

QL 3/QL 4, R 1/R 2) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L 4-Methylsyringol

(Ausgangskonzentration), 100 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei pH 3 bei

272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 100 mg/kg 4-Methylsyringol (Ausgangskonzentration),

100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter Verdauung bei 272 nm (B)

Die fraktionierten und aufgereinigten Produkte wurden sowohl der Analyse mittels LC-MS

als auch GC-MS unterzogen, wobei die in Tabelle 9 aufgeführten Molekülionen und

Fragmente detektiert werden konnten.


78

Probematrix Oxidationsprodukt

(Vgl. Abb. 29)

Molekülionen ([M-

H]-) und Fragmente

mit LC-ESI-MS

(m/z)

Molekülionen

([M]+) und

Fragmente mit GC-

MS (m/z)

Pökellake

QL 1 (RT 3,5 min) 167.0 [M-H]-, 152.0,

139.1, 125.1 Nicht detektiert

QL 2 (RT 4,2 min) 168.0 [M-H]-, 153.0,

137.9, 125.0

170.1 [M]+, 155.0,

127.0, 112.1

QL 3 (RT 5,0 min)

180.9 [M-H]-, 165.9,

150.9

182.1 [M]+, 181.0,

167.0;

QL 4 (RT 10,3 min)

198.0 [M-H]-, 182.9,

183.0, 168.0, 152.9,

135.9

182.1 [M]+, 181.0,

167.0;

182.1 [M]+, 181.0,

169.1, 154.1, 138.1

Fleischextrakt

R 1 (RT 4,5 min) 181.1 [M-H]-, 165.9

121.3 [M-H]-

182.1 [M]+, 181.0,

167.0

R 2 (RT 5,3 min) 152.9 [M-H]-, 138.1,

123.2, 110.0

154.1 [M]+, 139.0,

111.1

Tabelle 9 Retentionszeiten (HPLC-UV/VIS) und Molekülionen/Fragmente (LC-ESI-MS und GC-MS)

der aus der Pökellake bzw. aus dem Fleischextrakt isolierten Oxidationsprodukte von 4-

Methylsyringol, die Bezeichnung der Oxidationsprodukte sowie ihre Retentionszeiten beziehen sich

auf die HPLC-UV/VIS-Chromatogramme in Abbildung 29

Zunächst war zu bemerken, dass mit Ausnahme der Produkte QL 2 und QL 4 die erhaltenen

LC-MS Daten durch die Analyse mit GC-MS dahingehend bestätigt werden konnten, dass die

gebildeten Molekülionen und Fragmente (unter Berücksichtigung von [M-H]- für LC-ESI-MS

im negativen Ionenmodus und [M]+ für GC-MS) nahezu identische m/z-Verhältnisse


79

aufwiesen. Im Falle von QL 4 konnten sich die mit LC-MS ermittelten Daten für das

Molekülion durch die Analyse mittels GC-MS nicht bestätigen lassen.

Das LC-MS-Spektrum des Produktes QL 2 zeigte jeweils um 2 u erniedrigte m/z-Verhältnisse

für das Molekülion bzw. die Fragmentionen als das GC-MS-Spektrum (Tabelle 9). Dieselben

massenspektrometrischen Daten konnten bereits für ein Oxidationsprodukt von Syringol in

der Pökellake („uv“; siehe Kap. 4.1.2.) ermittelt werden. Des Weiteren wiesen beide

Verbindungen („uv“ und QL 2) dasselbe chromatographische Verhalten (Vgl. Abb. 16 A und

29 A) und nahezu identische UV-Spektren auf, die sich lediglich durch die Ausbildung einer

Schulter bei 320 nm bis 360 nm im UV-Spektrum von QL 2 unterschieden (siehe Abb. 30)

Abbildung 30 UV/VIS-Spektren des Oxidationsproduktes „uv“ von Syringol aus der Pökellake und

des Oxidationsproduktes QL 2 von 4-Methylsyringol aus der Pökellake

Es kann somit davon ausgegangen werden, dass es sich bei den beiden Reaktionsprodukten

„uv“ und QL 2 um ähnliche Verbindungen handelt, deren Identität jedoch nicht geklärt

werden konnte.

Auch die weiteren Oxidationsprodukte des 4-Methylsyringols QL 1, QL 3, QL 4, R 1 und R 2

konnten auf Grundlage der in Tabelle 9 aufgeführten Molekülionen und Fragmente und

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

200 250 300 350 400 450 500

Inte

nsi

tät

(mV

)

Wellenlänge (nm)

Syringol

Oxidationsprodukt

"uv"

QL 2


80

aufgrund des Mangels an Literaturdaten über die Oxidationsprodukte von 4-Methylsyringol,

die zur vergleichenden Auswertung herangezogen werden könnten, nicht näher identifiziert

werden. Weitere Untersuchungen sind daher erforderlich, die sich mit der Strukturaufklärung

dieser Verbindungen (z. B. mit Hilfe von NMR-Verfahren) befassen, um näheren Aufschluss

über die Natur der in der Pökellake und im Fleischextrakt aus 4-Methylguajakol und 4-

Methylsyringol gebildeten Oxidationsprodukte zu erhalten.

4.2. Oxidation von Syringol und Guajakol im wässrigen Reaktionsmodell und in

der Fleischmatrix

4.2.1. Methodenentwicklung und Wiederfindungsraten

In früheren Untersuchungen, die sich mit der Isolation von Methoxyphenolen und ihren

Derivaten aus geräucherten Fleisch- bzw. Fischprodukten befassten, wurden stets

Extraktionsmethoden verwendet, die entweder ein Erhitzen der Probenmatrix im Zuge der

Wasserdampfdestillation (BALTES u. SÖCHTIG 1979; PÖHLMANN et al. 2012) oder das

Einstellen stark basischer bzw. alkalischer pH-Werte erforderten. Die Erhöhung bzw.

Erniedrigung des pH-Wertes während der Extraktion diente hierbei zunächst dem

Proteinaufschluss der Fleischmatrix und war anschließend Voraussetzung für die

Fraktionierung der Phenole auf Grundlage unterschiedlicher Aziditäten. Für die

durchzuführende Diethyletherextraktion wurde der pH-Wert des Fleischextraktes mit

Natronlauge bis auf 12 angehoben, d.h. ein stark basisches Milieu geschaffen, bevor er mit

konzentrierter Salzsäure auf 2 abgesenkt wurde (LUSTRE u. ISSENBERG 1970; KNOWLES

et al. 1975b). Auch die erst später entwickelte Extraktionsmethode von Nitrosophenolen aus

Fleischprodukten mittels Ethylacetat erforderte die Einstellung eines pH-Wertes von 2 mit

Schwefelsäure (HOFMANN 1990).

Die Oxidation der Methoxyphenole in der Fleischmatrix wurde bereits in verschiedenen

Studien untersucht. Hierfür erfolgte die Analyse der geräucherten und gepökelten

Fleischproben zunächst direkt nach ihrer Herstellung, nach ihrem Erhitzen (z. B. durch

Braten) und nach ihrer simulierten Verdauung mit der oben beschriebenen Methode der

Fraktionierung basierend auf unterschiedlichen Aziditäten und Diethyletherextraktion

(KNOWLES et al. 1974b, 1975b). Im Zuge der Extraktion wurden somit alle Proben starken


81

pH-Veränderungen unterzogen, was zum einen eine verstärkte Oxidation der zu

extrahierenden Methoxyphenole mit in der Probe vorliegendem Nitrit oder aber die

Weiterreaktion der während des eigentlichen Versuches (z. B. Braten, simulierte Verdauung)

gebildeten Oxidationsprodukte bewirkt haben könnte.

Da mit den genannten Extraktionsmethoden bisher keine nitrosierten Methoxyphenole in der

Fleischmatrix nachgewiesen werden konnten (bzw. ihr Nachweis durch KNOWLES et al.

(1974b) letztlich durch spätere umfangreichere Untersuchungen nicht abgesichert werden

konnte (KNOWLES et al. 1975b)), war es nötig für eigene Untersuchungen eine neue

Methodik zu entwickeln.

Die in dieser Studie entwickelte Methodik, die auf der Extraktion der Analyten mittels

Methanol beruht, ermöglichte die schonende Isolierung der Methoxyphenole sowie ihrer

Oxidationsprodukte ohne die Einstellung stark basischer oder saurer pH-Werte, um das

Weiterreagieren der gebildeten Produkte bzw. einen verstärkten Abbau der Phenole während

der Extraktion zu verhindern.

Die Wiederfindungsraten der vier Methoxyphenole sowie der aus der Pökellake isolierten

Oxidationsprodukte von Syringol und Guajakol sind in Tabelle 10 dargestellt. Die Analyten

wurden der rohen Fleischmatrix ohne Zugabe von Nitrit oder Ascorbinsäure zugesetzt. Die

Fleischproben wurden anschließend erhitzt (80 °C) bzw. die simulierte Verdauung wurde

durchgeführt und die Analyten mittels Methanolextraktion isoliert. Die Wiederfindungsraten

der vier Methoxyphenole lagen für die erhitzten Proben zwischen 41,3 % und 54,3 % und

stiegen für die Proben, die zusätzlich der simulierten Verdauung unterzogen wurden, auf 54,2

% bis 58,4 % an. Auch bei den Oxidationsprodukten lagen die Wiederfindungsraten für die

Proben mit simulierter Verdauung (mit Ausnahme von 6-Nitrosoguajakol und 6-

Nitroguajakol) deutlich über denen der auf 80 °C erhitzten Proben. Die bessere

Extrahierbarkeit aus den „verdauten“ Proben lässt sich durch einen besseren Proteinaufschluss

durch das Ansäuern mit Salzsäure und die Zugabe der Pepsinlösung erklären, welcher eine

verminderte Bindung der Analyte durch die Fleischproteine bewirkt haben könnte. Dass eine

starke Bindung von Proteinen wie Lysin durch die im Räucherrauch enthaltenen Phenole

auftritt, wurde bereits durch CHEN u. ISSENBERG (1972) bewiesen.


82

Analyt

Erwartete

Konzentration

des Analytena

nach Zusatz zu

der

Fleischmatrix

[mg/kg]

Nachgewiesene

Menge des

Analytena nach

Zusatz zu der

Fleischprobe,

Erhitzten auf

80 °C und

Extraktion aus

der

Fleischmatrix

[mg/kg]

WFRb des

Analytena nach

Zusatz zu der

Fleischprobe,

Erhitzten auf

80 °C und

Extraktion aus

der

Fleischmatrix

[%]

Nachgewiesene

Menge des

Analytena nach

Zusatz zu der

Fleischprobe,

Erhitzten auf

80 °C,

simulierter

Verdauung und

Extraktion aus

der

Fleischmatrix

[mg/kg]

WFRb des

Analytena nach

Zusatz zu der

Fleischprobe,

Erhitzten auf

80 °C,

simulierter

Verdauung und

Extraktion aus

der

Fleischmatrix

[%]

Syringol 100,00 45,94±2,98c 46,0 54,16±5,69d 54,2

Guajakol 60,00 24,76±1,91c 41,3 32,52±2,69d 54,2

4-Methylsyringol 100,00 54,29±5,04c 54,3 58,41±3,32d 58,4

4-Methylguajakol 60,00 26,82±0,68c 44,7 32,91±2,37d 54,6

Nitrososyringol 12,77 0,31±0,06c 2,4 0,40±0,06c 3,2

3,3′,5,5′-

Tetramethoxy-

1,1′-biphenyl-

4,4′-diol

5,96 1,07±0,25c 17,9 2,30±1,48c 38,6

Nitrosyringol 4,20 1,91±0,27c 45,5 2,28±0,23c 54,3

6-

Nitrosoguajakol 11,03 < NWGc,e 0,0 < NWGc,e 0,0

4-Nitroguajakol 1,36 0,77±0,07c 56,6 0,80±0,07c 58,6

6-Nitroguajakol 0,46 0,20±0,02c 43,6 0,17±0,01c 35,9

aStandardlösungen der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-Methylguajakol oder 4-Methylsyringol, oder

Lösungen des jeweiligen Oxidationsproduktes nach dessen Extraktion und Aufreinigung aus der Pökellake

mittels Festphasenextraktion (SPE); b Wiederfindungsrate (WFR) = [Nachgewiesene Menge des Analytena nach

Zusatz zu der Fleischprobe und Extraktion aus der Fleischmatrix [mg/kg]] x 100 / [Erwartete Konzentration des

Analytena nach Zusatz zu der Fleischmatrix [mg/kg]]. c,d Stichprobenanzahl ( c n = 6, d n = 5). e < NWG : Wert

liegt unterhalb der Nachweisgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.))

Tabelle 10 Wiederfindungsraten (WFR) der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol

und 4-Methylguajakol sowie der Oxidationsprodukte von Syringol und Guajakol aus der Fleischmatrix


83

Autoren früherer Studien, die sich mit der Extraktion von Rauchphenolen und ihren

Oxidationsprodukten aus der Fleischmatrix beschäftigten, berichteten ebenfalls von niedrigen

Wiederfindungsraten, die eine quantitative Bestimmung selbiger verhinderten und machten

hauptsächlich die Proteinbindung der Phenole sowie eine gewisse Selektivität der

verwendeten Methodik hierfür verantwortlich (GILBERT u. KNOWLES 1975; KNOWLES

et al. 1975a, b).

Wie aus den in Tabelle 10 dargestellten Daten ersichtlich wird, waren vor allem die

nitrosierten Reaktionsprodukte 6-Nitrosoguajakol und Nitrososyringol nicht bzw. in sehr

geringem Umfang extrahierbar (Wiederfindungsraten von 0,0 % und 2,4 %/ 3,2 %), nachdem

sie der Fleischmatrix zugesetzt und diese wie bereits beschrieben behandelt worden war. Eine

mögliche Erklärung hierfür wäre die bereits angeführte Bindung dieser Produkte an die

Fleischmatrix. Außerdem lässt sich eine Weiterreaktion der zugesetzten Verbindungen

während der Versuchsdurchführung (Erhitzen auf 80 °C und simulierte Verdauung) nicht

ausschließen, auch wenn kein Zusatz von Nitrit oder Ascorbinsäure zu den Proben erfolgte.

Da die Bildung der Oxidationsprodukte jedoch in den in Kapitel 4.2.3. und 4.2.5.

ausgewerteten Versuchen nachgewiesen werden konnte, ist davon auszugehen, dass diese

Produkte unter den dort aufgeführten Bedingungen in extrahierbarer Form vorlagen.

Ergänzend zu den Experimenten, deren Ergebnisse in Tabelle 10 dargestellt sind, erfolgten

weitere Untersuchungen, die die Abhängigkeit der Extrahierbarkeit von 6-Nitrosoguajakol

und Nitrososyringol von der Dauer des Erhitzens der Fleischprobe sowie den hierfür

verwendeten Temperaturen zeigen sollten. Die rohen Fleischproben wurden nach dem Zusatz

jeweils eines der beiden Analyten zunächst für 30 min auf 80 °C oder für 45 min oder 30 min

auf 60 °C erhitzt und anschließend die Extraktion der Substanzen durchgeführt. Auch für

diese Versuche lagen die Wiederfindungsraten der beiden Nitrosophenole zwischen 0,0 %

und 2,2 % und unterschieden sich somit nicht von den in Tabelle 10 dargestellten

Ergebnissen, was zu dem Schluss führt, dass die Extrahierbarkeit nicht wesentlich durch die

Erhitzungsdauer bzw. –temperatur beeinflusst wurde.


84

4.2.2. Die Oxidation von Syringol in Pökellaken in Abhängigkeit vom pH-

Wert und der Ascorbinsäurekonzentration

4.2.2.1. Ergebnisse

Um den Abbau des Dimethoxyphenols Syringol und die Bildung möglicher

Oxidationsprodukte im wässrigen Milieu zu untersuchen wurden verschiedene Pökellaken

hergestellt, denen neben Syringol (200 mg/L) und 1,66 % Nitritpökelsalz (enthielt 0,9 %

NaNO2) auch jeweils 100 mg/L oder 500 mg/L Ascorbinsäure zugesetzt wurden. Der NaNO2-

Gehalt lag somit konstant bei 150 mg/L und entsprach der nach der

Zusatzstoffzulassungsverordnung geforderten Höchstmenge für den Einsatz in

Fleischerzeugnissen. Das Antioxidationsmittel Ascorbinsäure wurde in zwei

unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt, um seinen möglichen Einfluss auf die in der

Pökellake ablaufende Oxidation des Syringols durch Nitrit zu untersuchen.

Zunächst wurden die Pökellaken auf 80 °C für 40 min erhitzt, um die Oxidation nach

Hitzeeinwirkung, wie sie im Zuge der Lebensmittelverarbeitung z. B. beim Braten oder

Heißräuchern erfolgt, nachzustellen, anschließend wurden die Laken auf einen pH von 3

eingestellt und für 1 h bei 40 °C erhitzt, um Bedingungen zu simulieren wie sie im sauren

Milieu des Magens vorliegen. Beide Versuchsabläufe dienten der Simulation von

Reaktionsbedingungen wie sie später auch in ähnlicher Weise für die Versuche in der

Fleischmatrix hergestellt wurden und sollten die Oxidation des Syringols im wässrigen Milieu

darstellen ohne mögliche hemmende Einflüsse durch die Probenmatrix Fleisch.

Die Quantifizierung der entstandenen Reaktionsprodukte Nitrososyringol, Nitrosyringol und

„uv“ erfolgte mit Hilfe von 5-Nitroguajakoläquivalenten. In allen Pökellaken bildete sich

zusätzlich zu diesen Reaktionsprodukten ein dunkel-violetter Niederschlag, der zunächst für

die Durchführung der Probenmessung mittels HPLC-UV/VIS abfiltriert werden musste und

letztendlich als kristallisiertes 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol identifiziert

werden konnte. Da die Kristalle im wässrigen Medium nicht löslich waren, konnte mit der

verwendeten Methode keine quantitative Bestimmung dieser Verbindung erfolgen. Da sich

jedoch in allen Pökellaken eine relativ große Menge des Niederschlages bildete, wurde seine

Entstehung unter verschiedenen Reaktionsbedingungen untersucht.


85

Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen sind in Tabelle 11 zusammenfassend

dargestellt.

Zeitpunkt der visuellen

Kontrolle nach

Probenherstellung

Pökellake A Pökellake B Pökellake C

80 °Ca 7 °Cb 24 °Cc 80 °Ca 7 °Cb 24 °Cc 80 °Ca 7 °Cb 24 °Cc

1 h +++ - - - - - - - -

3 h +++ - - - - - - - -

5 h +++ - + - - - - - -

24 h +++ + ++ ++ - - - - -

Pökellake A: enthält 50 mg/L Syringol, 1,66 % Nitritpökelsalz (150 mg/L NaNO2) und 100 mg/L Ascorbinsäure;

Pökellake B: enthält 50 mg/L Syringol und 1,66 % Nitritpökelsalz (150 mg/L NaNO2); Pökellake C: enthält

50 mg/L Syringol und 100 mg/L Ascorbinsäure; a Pökellake auf 80 °C erhitzt für 40 min, anschließend im

Dunkeln gelagert; bPökellake nicht erhitzt und sofort nach Herstellung bei 7 °C in Dunkeln gelagert; c Pökellake

nicht erhitzt und sofort nach Herstellung bei 24 °C in Dunkeln gelagert. +++ = starker Niederschlag,

++ = mittlerer Niederschlag, + = schwacher Niederschlag, - = kein Niederschlag

Tabelle 11 Bildung eines Niederschlages aus 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol-Kristallen

in Pökellaken unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen

Aus der Darstellung in Tabelle 11 wird deutlich, dass sich das kristallisierte Syringoldimer

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol fast ausschließlich in den Pökellaken bildete,

die neben Syringol auch NaNO2 und Ascorbinsäure enthielten, wobei das Erhitzen der Lake

eindeutig einen fördernden Einfluss auf die Niederschlagsbildung hatte. Der Zusatz der

Ascorbinsäure in diesen Proben könnte sich durch die zwangsläufig damit verbundene

Erniedrigung des pH-Wertes ebenfalls begünstigend auf die Oxidation des Phenols durch das

Nitrit ausgewirkt haben. Beim ausschließlichen Einsatz von Syringol und Ascorbinsäure

(Pökellake C) war keine Kristallbildung nachweisbar. Enthielt die Lake nur Syringol und

NaNO2 war die Bildung des Niederschlages selbst nach dem Erhitzen erst nach 24 h

nachweisbar.

Nachdem auf diese Weise die Bedingungen für die Entstehung des Dimers untersucht worden

waren, wurden die einleitend beschriebenen Pökellakeversuche durchgeführt, deren

Ergebnisse in Abbildung 31 graphisch dargestellt sind.


86

Abbildung 31 Gehalte an Syringol, Nitrososyringol, Nitrosyringol und der nicht identifizierten

Verbindung “uv” in auf 80 °C erhitzten Pökellaken und Pökellaken, deren pH anschließend mit

Salzsäure auf 3 eingestellt und die für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden (sd). Die Pökellaken enthielten

200 mg/L Syringol (Ausgangskonzentration), 150 mg/L NaNO2 und 100 mg/L oder 500 mg/L

Ascorbinsäure (ASC). (Mittelwerte ± SD, n = 6). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen

signifikant unterschiedliche Gehalte derselben Substanz in den verschiedenen Pökellaken (P < 0,05).

(Die Gehalte der nicht identifizierten Substanz “uv” wurden nicht auf signifikante Unterschiede

überprüft.) (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.10)

Es zeigte sich, dass in den Pökellaken, die 100 mg/L Ascorbinsäure enthielten, nach dem

Erhitzen auf 80 °C nur noch 84 mg/L Syringol nachweisbar waren, was bedeutet, dass 58 %

des in einer Ausgangskonzentration von 200 mg/L vorliegenden Syringols abgebaut worden

waren. Wurde der pH anschließend mit Salzsäure auf 3 erniedrigt und die Proben für 1 h auf

40 °C erwärmt, wurde das Syringol vollständig umgesetzt.

Im Gegensatz dazu wurden in den Laken, die 500 mg/L Ascorbinsäure enthielten durch das

Erhitzen bei 80 °C 86 % des Syringols abgebaut, während nach dem Einstellen des pH-

Wertes auf 3 immerhin noch 9 mg/L (4,5 %) des Syringols nachgewiesen werden konnten.

Die Pökellaken mit den zwei unterschiedlichen Ascorbinsäurekonzentrationen unterschieden


87

sich auch hinsichtlich ihres pH-Wertes. Die Laken mit 100 mg/L Ascorbinsäure wiesen einen

initialen pH-Wert von 4,7 auf, wohingegen ein Gehalt von 500 mg/L Ascorbinsäure den pH

auf 4,3 absenkte.

Bezüglich der Bildung von Nitroso- und Nitrosyringol in den Pökellaken mit 100 mg/L

Ascorbinsäure zeigten sich zwischen den Proben, die auf 80 °C erhitzt wurden und denen,

welche anschließend bei pH 3 für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden, keine signifikanten

Unterschiede.

4.2.2.2. Diskussion

GERLING u. TERNES (2014) berichteten bereits über den pH-abhängigen Abbau von α-

Tocopherol und α-Tocotrienol in Pökellaken, die neben Nitritpökelsalz auch unterschiedliche

Mengen an Ascorbinsäure enthielten. Bezugnehmend auf die Untersuchungen dieser Autoren

ist es naheliegend, dass der vermehrte Verlust von Syringol in den Laken mit 500 mg/L

Ascorbinsäure größtenteils dem (zwangsläufig) erniedrigten pH-Wert aufgrund der höheren

Ascorbinsäurekonzentration zuzuschreiben war. Gleichzeitig bedingte der erhöhte pH-Wert

der Laken mit 100 mg/L Ascorbinsäure einen geringeren Verbrauch an Syringol. Wie

Untersuchungen von W. R. LICHT et al. (1988) zeigten, förderte die Erhöhung der

Reaktionstemperatur bei pH 3 im wässrigen Milieu die Bildung nitrosierender Stickoxid-

Verbindungen wie z. B. N2O3 aus Nitrit und führt gleichzeitig zu einem erhöhten Verbrauch

von Ascorbinsäure. Ascorbinsäure hemmt wiederum die Nitrosierung anderer Verbindungen

wie z. B. Amine.

Folglich ist der vollständige Verlust an Syringol in den Pökellaken mit 100 mg/L

Ascorbinsäure bei pH 3 nach dem Erwärmen auf 40 °C auf einen verminderten protektiven

Effekt der Ascorbinsäure durch deren eigenen verstärkten Abbau zu erklären.

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass Syringol in den Proben mit 100 mg/L

Ascorbinsäure nach der simulierten Verdauung vollständig abgebaut wurde, war es

bemerkenswert, dass es unter diesen Bedingungen verglichen mit den Proben, die nur auf

80 °C erhitzt wurden, nicht zur vermehrten Bildung der beiden Oxidationsprodukte

Nitrososyringol und Nitrosyringol kam. Da auch von der nicht identifizierten Verbindung

„uv“ im Vergleich zu den anderen Proben keine größeren Mengen gebildet wurden, liegt


88

daher der Schluss nahe, dass das Syringol vermehrt zu seinem Dimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-

1,1′-biphenyl-4,4′-diol oxidiert worden war, welches in großen Mengen kristallisierte, jedoch

aufgrund dieses Auskristallisierens nicht quantitativ erfasst werden konnte.

Autoren früherer Studien, die sich mit der Nitrosierung von Methoxyphenolen in

Raucharomapräparaten befassten, machten die schnelle Oxidation der Nitrosophenole zu den

korrespondierenden Nitrophenolen für das Misslingen des Nachweises dieser Nitrosophenole

verantwortlich (KNOWLES et al. 1975b). Neuere Untersuchungen von JEWELL et al. (2014)

zeigten jedoch, dass die Bildung nitrierten ortho-Phenylphenols im wässrigen Milieu bei pH

3,5 nicht durch Oxidation des nitrosierten ortho-Phenylphenols erfolgte, sondern dass sich

ersteres gleichzeitig aber unabhängig von letzterer Verbindung bildete. Auch VIONE et al.

(2004) bewiesen, dass unter ähnlichen Reaktionsbedingungen Nitrophenol nicht durch weitere

Oxidation von gleichzeitig gebildetem Nitrosophenol entsteht. Die Ergebnisse der in

Abbildung 31 dargestellten Versuche stimmen mit den Ergebnissen dieser Autoren überein.

Enthielten die Pökellaken 500 mg/L Ascorbinsäure, führte die pH-Absenkung auf pH 3 und

das Erwärmen bei 40 °C zwar zu einer vermehrten Bildung von Nitrososyringol, die

Konzentration von Nitrosyringol zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zu dessen

Konzentration im Vergleich zu den Proben, welche lediglich auf 80 °C erhitzt worden waren.

Folglich bedingte der erhöhte Gehalt an Nitrososyringol nicht den gleichzeitigen Anstieg der

Nitrosyringolkonzentration, wie es der Fall gewesen wäre, wenn letztere Verbindung durch

Oxidation des ersten gebildet werden würde.

Auch die Auswertung der in Abbildung 32 dargestellten Halbstufenpotentiale von

Nitrososyringol und Nitrosyringol bestätigen die Annahme, dass die beiden

Oxidationsprodukte unabhängig voneinander gebildet wurden, denn mit einem

Halbstufenpotential von 767 mV ist Nitrosyringol leichter oxidierbar als Nitrososyringol mit

einem Halbstufenpotential von 938 mV. Es scheint daher unwahrscheinlich, dass die

Weiteroxidation von Nitrososyringol zu Nitrosyringol bevorzugt abläuft, wie von KNOWLES

et al. (1975b) ursprünglich vermutet worden ist.


89

Abbildung 32 Voltammogramme von Syringol, Nitrosyringol und Nitrososyringol (Intervall: 50 mV,

n = 1); Halbstufenpotentiale von Syringol (577 mV), Nitrososyringol (938 mV) und Nitrosyringol

(767 mV) berechnet mit nicht-linearer Regression nach Bildung des dekadischen Logarithmus von U

(GraphPad.Prism® 6.0 Software)

4.2.3. Die Oxidation von Syringol in der Fleischmatrix nach Erhitzen und

simulierter Verdauung in Abhängigkeit vom Nitrit- und

Sauerstoffgehalt

4.2.3.1. Ergebnisse

Die Oxidation von Syringol in der Fleischmatrix wurde mit Hilfe von Fleischproben

untersucht, die jeweils 100 mg/kg Ascorbinsäure als Antioxidationsmittel sowie 100 mg/kg

Syringol enthielten. Zunächst wurde der Einfluss verschiedener Nitritkonzentrationen auf den

Abbau des Phenols und die Entstehung von Oxidationsprodukten ermittelt. Hierfür wurde

zum einen die durch die Zusatzstoffzulassungsverordnung vorgegebene Höchstmenge an

NaNO2 (150 mg/kg im Fleischerzeugnis) verwendet, zum anderen wurde die Hälfte dieser

Konzentration (75 mg/kg) und eine Konzentration von 400 mg/kg NaNO2 appliziert, um

vergleichend den Effekt dieser erniedrigten bzw. stark erhöhten Nitritkonzentration zu


90

erforschen. Zusätzlich zu dem Erhitzen der Fleischproben bei 80 °C erfolgte deren

anschließende simulierte Verdauung unter Bedingungen ähnlich denen des Magenmilieus.

Der Einsatz von Salzsäure bewirkte hierbei den Abfall des pH-Wertes in der Fleischmatrix

von 6,2 auf 3,6.

Neben den schon in der Pökellake (Kap. 4.2.2.) vorliegenden Oxidationsprodukten

Nitrososyringol und Nitrosyringol konnte aus den Fleischproben ebenfalls das Syringoldimer

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol isoliert werden. Nach der Methanolextraktion

lag das Dimer in gelöster Form vor, d.h. es konnte mittels HPLC-UV/VIS die Detektion

sowie seine quantitative Bestimmung erfolgen. Letztendlich kann jedoch nicht ausgeschlossen

werden, dass Anteile dieser Verbindung auch in der Fleischmatrix auskristallisierten und in

dieser –in Wasser und Methanol unlöslichen- Form nicht extrahiert werden konnten.

Im Gegensatz zu Nitrosyringol und Nitrososyringol welche mit Hilfe von 5-

Nitroguajakoläquivalenten quantifiziert wurden, erfolgte die Quantifizierung des Dimers

wegen vergleichbaren UV-Spektren (Abb. 15) und der strukturellen Ähnlichkeit der beiden

Substanzen mittels Syringoläquivalenten. Aufgrund der Tatsache, dass der im Rahmen dieser

Studie mittels Spektrophotometrie bestimmte molare Extinktionskoeffizienten von 3,3′,5,5′-

Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (ε = 8223,99 L*cm/mol bei einer Wellenlänge von

272 nm) um das 7,6-fache größer war als der von Syringol (ε = 1087,31 L*cm/mol bei einer

Wellenlänge von 272 nm) (siehe Anhang 8.9.), resultierte die anhand von

Syringoläquivalenten vorgenommene Gehaltsbestimmung des Dimers in den Fleischproben in

höheren errechneten Gehaltswerten als den tatsächlich vorliegenden, was im Hinblick auf die

in Abbildung 33 A und 33 B dargestellten Ergebnisse berücksichtigt werden muss.

In den Fleischproben mit unterschiedlichen NaNO2-Konzentrationen, die zunächst auf 80 °C

erhitzt wurden (Abb. 33 A I-III), war als einziges Oxidationsprodukt 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-

1,1′-biphenyl-4,4′-diol nachweisbar, wobei dessen Gehalte in diesen Proben sich nicht

signifikant voneinander unterschieden.

Signifikant mehr Syringol wurde aus den Proben isoliert, die 75 mg/kg NaNO2 enthielten,

nämlich 67 % des in einer Ausgangskonzentration von 100 mg/kg zugesetzten

Dimethoxyphenols, während in den Proben mit 150 mg/kg bzw. 400 mg/kg NaNO2 lediglich

57 % bzw 52 % des eingesetzten Syringols nachweisbar waren.


91

Abbildung 33 Gehalte an Syringol, 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol, Nitrososyringol

und Nitrosyringol in erhitzten (80 °C) Fleischproben, denen jeweils 100 mg/kg Syringol, 100 mg/kg

Ascorbinsäure und unterschiedliche Konzentrationen an NaNO2 bzw. Sauerstoff zugesetzt wurden (A)

und in den gleichen Proben nach deren simulierter Verdauung (B und C). Die Proben enthielten

weiterhin: 75 mg/kg NaNO2 (I/Ia), 150 mg/kg NaNO2 (II/IIa), 400 mg/kg NaNO2 (III/IIIa),

150 mg/kg NaNO2 und Eiklar (IV/IVa), 150 mg/kg NaNO2 und Eischnee (Luft) (V/Va), 150 mg/kg

NaNO2 und Eischnee (O2) (VI/VIa). Unterschiedliche Buchstaben oberhalb einer Substanz innerhalb

einer Versuchsgruppe (verschiedene NaNO2-Gehalte (I(a)-III(a)); verschiedene Eiklar- bzw.

Eischneezusätze (IV(a)-VI(a))) kennzeichnen signifikant unterschiedliche Gehalte derselben Substanz

innerhalb dieser Gruppe (P < 0,05). (Mittelwerte ± SD, I-VI und IVa-VIa (n = 6), Ia-IIIa (n = 4)). *

Werte liegen zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.). (vgl. auch

Messwerttabellen im Anhang unter 8.11.)


92

Nachdem die Fleischproben der simulierten Verdauung unterzogen worden waren, konnten

neben dem Syringoldimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol ebenfalls

Nitrososyringol und Nitrosyringol extrahiert werden (Abb. 33 B und C, Ia-IIIa).

Die Konzentrationen aller drei Reaktionsprodukte waren hierbei am höchsten in den

Fleischproben mit 400 mg/kg NaNO2, was mit dem gleichzeitigen Abfall des nachgewiesenen

Syringolgehaltes auf 14 % der Ausgangskonzentration verbunden war.

Die Menge an gebildetem 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol verringerte sich

durch den Einsatz von 150 mg/kg NaNO2 um das 4-fache von 662,3 mg/kg

(Syringoläquivalente) auf 167,2 mg/kg (Abb. 33 B Ia-IIIa) und auch die Gehalte der beiden

anderen Reaktionsprodukte Nitrososyringol und Nitrosyringol lagen bei Verwendung der

niedrigeren Nitritkonzentration in signifikant geringeren Gehalten vor (Abb. 33 C Ia-IIIa).

Der Einsatz von 75 mg/kg NaNO2 führte nur im Falle von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-

biphenyl-4,4′-diol zu einem weiteren Absinken des Gehaltes auf 60,3 mg/kg

(Syringoläquivalente), während die Konzentrationen von Nitrososyringol und Nitrosyringol

im Vergleich zu den Proben mit 150 mg/kg NaNO2 nicht signifikant abnahmen.

Des Weiteren wurde unter den Bedingungen der simulierten Verdauung bei allen drei

Nitritkonzentrationen signifikant mehr 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol gebildet

als in den Fleischproben, die lediglich auf 80 °C erhitzt worden waren, obwohl nur für die

Proben mit 400 mg/kg NaNO2 eine deutliche Verminderung der Syringolkonzentration im

Vergleich der erhitzten mit den „verdauten“ Proben nachgewiesen werden konnte.

Wurden die Fleischproben mit 150 mg/kg NaNO2 nach dem Erhitzen auf 80 °C und vor ihrer

simulierten Verdauung für 7 Tage bei 7 °C im Dunkeln gelagert, zeigten sich bezüglich der

Konzentrationen an Syringol und der drei Oxidationsprodukte keine signifikanten

Unterschiede zu den nicht gelagerten Proben.

Zusammenfassend lässt sich daher feststellen, dass die Verwendung von 400 mg/kg NaNO2

nach der simulierten Verdauung der Fleischproben in einem verstärktem Abbau des Syringols

unter vermehrter Bildung der drei Oxidationsprodukte 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-

4,4′-diol, Nitrososyringol und Nitrosyringol resultierte, dass sich unter gleichen Bedingungen

jedoch auch in den Proben mit geringeren Nitritkonzentrationen alle drei Produkte

nachweisen ließen.


93

Für die Untersuchung des Effektes unterschiedlicher Sauerstoffkonzentration in der

Fleischprobe auf die Oxidation von Syringol, wurden verschiedene Fleischschäume

hergestellt. Für die Zubereitung dieser Fleischschäume wurde Eischnee verwendet, der

entweder mit Luft oder Sauerstoff aufgeschlagen und anschließend unter die Fleischmasse

gehoben wurde. Die auf diese Weise zubereiteten Fleischproben sollten als Versuchsmodelle

für die v. a. in der traditionellen französischen Küche hergestellten Fleischmousses und –

parfaits dienen, deren Zubereitung unter Zusatz von aufgeschlagenem Eiklar bzw.

aufgeschlagener Sahne erfolgt.

Die durchgeführten Untersuchungen schlossen wie bei den vorherigen Proben mit

unterschiedlichen Nitritkonzentrationen das Erhitzen der Fleischproben auf 80 °C sowie die

anschließende simulierte Verdauung ein. Nitrit wurde den Proben gleichbleibend in einer

Konzentration von 150 mg/kg zugesetzt. Für den direkten Vergleich wurden außerdem

Proben hergestellt, die anstelle des Eischnees unaufgeschäumtes Eiklar enthielten.

Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abbildung 33 A, B, C, IV(a)-VI(a) dargestellt.

Auch in diesen Fleischproben ließ sich nach dem Erhitzen auf 80 °C das Syringoldimer

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol als einziges Oxidationsprodukt nachweisen

(Abb. 33 A IV-VI), wobei sich für die Proben mit unterschiedlichem Sauerstoffgehalten keine

signifikanten Unterschiede in der Konzentration dieser Substanz zeigten.

In den Fleischschäumen aber auch in den Fleischproben, die lediglich unaufgeschäumtes

Eiklar enthielten, kam es während der simulierten Verdauung zur Bildung der

Oxidationsprodukte 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol, Nitrososyringol und

Nitrosyringol (Abb. 33 B und C, IVa-VIa). Obwohl für die drei mit Eiklar hergestellten

Fleischproben hierbei kein verstärkter Abbau von Syringol nachgewiesen werden konnte, ließ

sich in den Fleischproben, die das aufgeschäumte Eiklar enthielten, eine vermehrte Bildung

aller drei Reaktionsprodukte feststellen. Unterschiede zwischen den Proben, die den mit

Sauerstoff oder den mit Luft aufgeschlagenen Eischnee enthielten, gab es jedoch keine.

Auch in den mit Eiklar zubereiteten Fleischproben wurde unter der simulierten Verdauung

mehr 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol gebildet als in den lediglich auf 80 °C

erhitzten Proben.


94

Es lässt sich somit zusammenfassend feststellen, dass in Fleischschäumen die Entstehung von

Oxidationsprodukten des Syringol unter Bedingungen, wie sie bei der Verdauung im

Magenmilieu vorliegen, vermehrt stattfand. Es zeigte sich hierbei jedoch kein signifikanter

Unterschied zwischen den mit Sauerstoff oder lediglich mit Luft aufgeschäumten

Fleischproben.

4.2.3.2. Diskussion

In früheren Studien, die sich mit der Nitrosierung der Methoxyphenole des Räucherrauches in

gepökelten Fleischproben nach deren Erhitzen sowie der simulierten Verdauung befassten,

konnten weder die Bildung nitrosierter noch nitrierter Produkte des Syringols nachgewiesen

werden (KNOWLES et al. 1974b, 1975b). Die Autoren vermuteten, dass die nitrosative

Demethylierung oder Weiteroxidation der entstandenen Produkte während der

Verdauungsexperimente für das Fehlen nitrosierter Reaktionsprodukte verantwortlich wären.

Auch HOFMANN (1990) ging davon aus, dass die Weiteroxidation der entstandenen

Nitrosophenole während der Extraktion oder das Vorliegen von nicht extrahierbaren

Chinonen einen Nachweis der Nitrosophenole verhinderten.

Da es jedoch in der vorliegenden Studie gelang, sowohl Nitrososyringol als auch

Nitrosyringol aus der Fleischmatrix zu isolieren, können die oben angeführten Annahmen

nicht bestätigt werden. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass in den durchgeführten

Experimenten lediglich die Oxidation jeweils eines Rauchphenols untersucht worden ist,

während die Untersuchungen der genannten Autoren stets die Oxidation eines heterogenen

Phenolgemisches beinhalteten, das dem Fleisch in Form von Räucherrauch zugesetzt wurde.

Außerdem erfolgte die Isolation der Oxidationsprodukte in dieser Studie unter Verwendung

milderer Extraktionsbedingungen, die die Extraktion ohne Einstellung stark basischer oder

saurer pH-Werte ermöglichten.

Der förderliche Effekt von Sauerstoff auf die Oxidation von Syringol unter gleichzeitiger

Einwirkung von Nitrit und Ascorbinsäure kann bezugnehmend auf die

Untersuchungsergebnisse von ARCHER et al. (1975) und W. R. LICHT et al. (1988) erklärt

werden. Die Autoren untersuchten den Einfluss verschiedener pH-Werte und

Sauerstoffgehalte auf die Nitrosierung von Aminen durch Nitrit. Unter anaeroben


95

Bedingungen verhinderte Ascorbinsäure die Bildung von Nitrosaminen nahezu vollständig,

indem sie nitrosierende Stickoxide wie N2O3 zu NO reduzierte. Erfolgte jedoch der Zusatz

von Sauerstoff zu dem Reaktionssystem, wurde die Ascorbinsäure innerhalb kurzer Zeit

vollständig oxidiert und verlor auf diese Weise ihre antinitrosierende Wirkung. Zusätzlich

wurde durch den Sauerstoff NO zu den nitrosierenden Stickoxiden regeneriert. Ein saures

Reaktionsmilieu unterstützte zusätzlich die Bildung reaktiver Stickoxide und förderte auf

diese Weise die Nitrosaminbildung.

Unter dem Arbeitstitel „Die Wechselwirkung zwischen Sauerstoff, Ascorbinsäure und

Carnosolsäure in mousseartigen feinen Fleischwaren“ (Autoren: M. Althaus-Fahjen, W.

Ternes) wurden Untersuchungen zu den Wechselwirkungen zwischen Sauerstoff und

Ascorbinsäure in auf gleiche Art hergestellten Fleischschäumen durchgeführt. Es zeigte sich,

dass die Ascorbinsäurekonzentration in den Fleischschäumen, die mit Sauerstoff

aufgeschlagenes Eiklar enthielten, im Vergleich zu den Fleischproben, die mit Stickstoff oder

Luft aufgeschäumtes Eiklar enthielten, um mehr als 50 % abnahm.

Folglich kann die vermehrte Bildung der drei Oxidationsprodukte des Syringol durch das

Aufschäumen der Fleischproben mit Eischnee zum einen durch die verminderte antioxidative

Wirkung der Ascorbinsäure, sowie die durch die vermehrte Bildung nitrosierender Stickoxide

aus dem zugesetzten Nitrit begründet werden.

4.2.4. Die Oxidation von Guajakol in Pökellaken in Abhängigkeit vom pH-

Wert und der Ascorbinsäurekonzentration

4.2.4.1. Ergebnisse

Die Oxidation von Guajakol in Pökellaken wurde unter denselben Bedingungen wie die

Oxidation des Syringol untersucht (vgl. Kap. 4.2.2.). Die Quantifizierung der

Reaktionsprodukte erfolgte mit Hilfe von 5-Nitroguajakoläquivalenten.

Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente sind in Abbildung 34 graphisch dargestellt.


96

Abbildung 34 Gehalte an Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol in auf

80 °C erhitzten Pökellaken und Pökellaken, deren pH anschließend mit Salzsäure auf 3 eingestellt und

die für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden (sd). Die Pökellaken enthielten 200 mg/L Guajakol

(Ausgangskonzentration), 150 mg/L NaNO2 und 100 mg/L oder 500 mg/L Ascorbinsäure (ASC).

(Mittelwerte ± SD, n = 6). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikant unterschiedliche

Gehalte derselben Substanz in den verschiedenen Pökellaken (P < 0,05). (vgl. auch Messwerttabellen

im Anhang unter 8.10)

Unabhängig von den Ascorbinsäuregehalten der auf 80 °C erhitzten Pökellaken wurden 30 %

des Guajakols abgebaut, sodass von einer Ausgangskonzentration von 200 mg/L Guajakol nur

noch 141 mg/L bei 100 mg/L Ascorbinsäure in der Pökellake bzw. 142 mg/L bei 500 mg/L

Ascorbinsäure nachweisbar waren. Die Umsetzung des Methoxyphenols erfolgte in den

Laken, die 100 mg/L Ascorbinsäure enthielten, überwiegend unter Bildung von 6-

Nitrosoguajakol, wobei sich bei pH 3 nach dem Erwärmen für 1 h bei 40 °C die Menge dieser

Verbindung in den Laken von 51,8 mg/L auf 112,8 mg/L mehr als verdoppelte. Auch die

Konzentration der anderen beiden Oxidationsprodukte 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol

nahm verglichen zu den lediglich auf 80 °C erhitzten Proben von 3,3 mg/L auf 5,6 mg/L bzw.

von 2,4 mg/L auf 15,7 mg/L signifikant zu.


97

Wurden 500 mg/L Ascorbinsäure in den Pökellaken eingesetzt, stiegen die Gehalte aller drei

Oxidationsprodukte ebenfalls signifikant an, wenn die Proben auf pH 3 eingestellt und

anschließend für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden. Allerdings verringerte sich die Konzentration

an Guajakol in diesen Proben lediglich auf 83,9 mg/L anstatt auf 27,6 mg/L wie es in den

Proben mit 100 mg/L Ascorbinsäure der Fall war. Während die Menge an gebildetem 6-

Nitrosoguajakol bei einem Zusatz von 100 mg/L Ascorbinsäure unter vergleichbaren

Bedingungen stets größer war als in den Proben mit 500 mg/L Ascorbinsäure, zeigte sich für

6-Nitroguajakol der entgegengesetzte Effekt. Die Konzentration an 4-Nitroguajakol nahm nur

für die auf pH 3 eingestellten Proben mit 500 mg/L Ascorbinsäure im Vergleich zu den

Proben mit 100 mg/L Ascorbinsäure signifikant zu. Für die Proben, die lediglich auf 80 °C

erhitzt wurden, gab es keine Unterschiede zwischen den Proben mit den beiden

unterschiedlichen Gehalten an Ascorbinsäure hinsichtlich des gebildeten 4-Nitroguajakols.

Hohe Gehalte an Ascorbinsäure (500 mg/L) in der Pökellake verhinderten somit die Bildung

von 6-Nitrosoguajakol im Vergleich zu den Laken, die eine geringere Konzentration an

Ascorbinsäure (100 mg/L) enthielten. Gleichzeitig förderte die höhere

Ascobinsäurekonzentration die Bildung von 6-Nitroguajakol und unter Bedingungen ähnlich

denen des Magenmilieus auch die Entstehung von 4-Nitroguajakol.

4.2.4.2. Diskussion

Der hemmende Effekt hoher Ascorbinsäurekonzentrationen auf die Nitrosierung anderer

Verbindungen wie z. B. Amine im wässrigen Milieu wurde bereits durch andere Autoren

beschrieben (MIRVISH 1975; BARTSCH et al. 1988) und konnte sogar in gepökeltem

Schweinefleisch nachgewiesen werden (MOTTRAM et al. 1975).

Der vermehrte Abbau von Guajakol und damit einhergehend die verstärkte Bildung aller drei

Oxidationsprodukte bei pH 3 ist in Anlehnung an die Untersuchungen von W. R. LICHT et al.

(1988) durch den erhöhten Ascorbinsäureabbau und die geförderte Entstehung nitrosierend

wirkender Stickoxide im sauren Milieu zu erklären.


98

Da eine vermehrte Bildung von 6-Nitrosoguajakol nicht mit der gleichzeitigen Zunahme der

Reaktionsprodukte 6-Nitroguajakol und 4-Nitroguajakol verbunden war (vgl. Abb. 34

100 mg/L ASC sd und 500 mg/L ASC sd) bestätigt dies die Annahme, dass die Nitrierung des

Guajakols nicht über die Weiteroxidation nitrosierter Zwischenprodukte, sondern -wie schon

durch VIONE et al. (2004) für Phenol beschrieben- unabhängig von der Nitrosierung erfolgt.

Abbildung 35 Voltammogramme von 4-Nitrosophenol, Phenol, 2-Nitrophenol und 4-Nitrophenol (A);

Guajakol, 6-Nitroguajakol, 6-Nitrosoguajakol und 4-Nitroguajakol (B) und Syringol, Nitrosyringol

und Nitrososyringol (Intervall: 50 mV, n = 1); Halbstufenpotentiale von Phenol (1114 mV), 4-

Nitrosophenol (939 mV), 2-Nitrophenol (1201 mV), 4-Nitrophenol (1241 mV), Guajakol (706 mV), 6-

Nitroguajakol (854 mV), 6-Nitrosoguajakol (916 mV), 4-Nitroguajakol (949 mV), Syringol (577 mV),

Nitrosyringol (767 mV) und Nitrososyringol (938 mV) berechnet mit nicht-linearer Regression nach

Bildung des dekadischen Logarithmus von U (GraphPad.Prism® 6.0 Software)


99

Verglichen mit den Ergebnissen zum oxidativen Abbau von Syringol in den Pökellaken (Kap.

4.2.2.) wurde Guajakol unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen in weitaus geringerem

Umfang abgebaut als Syringol. Die Halbstufenpotentiale dieser beiden Methoxyphenole

zeigten (Abb. 35 B und C), dass Syringol mit einem Halbstufenpotential von 577 mV leichter

oxidierbar war, als Guajakol mit einem Halbstufenpotential von 706 mV, was die vermehrte

Umsetzung von Syringol unter gleichen Oxidationsbedingungen erklären könnte.

Des Weiteren ließ sich feststellen, dass 6-Nitrosoguajakol (im Gegensatz zu Nitroso- und

Nitrosyringol (Abb. 35 C)) ein niedrigeres Halbstufenpotential aufweist als 4-Nitroguajakol

(Abb. 35 B). Das Halbstufenpotential für ebenfalls untersuchtes 4-Nitrosophenol war sogar

kleiner, als die Potentiale der beiden nitrierten Phenolderivate (Abb. 35 A). Somit ließ sich

eine generell leichtere Oxidierbarkeit der Nitro(methoxy)phenole im Vergleich zu den

Nitroso(methoxy)phenolen wie sie beim Syringol auftrat, für Guajakol und Phenol nicht

bestätigen.

4.2.5. Die Oxidation von Guajakol in der Fleischmatrix nach Erhitzen und

simulierter Verdauung in Abhängigkeit vom Nitrit- und

Sauerstoffgehalt

4.2.5.1. Ergebnisse

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Oxidation von Guajakol in der Fleischmatrix in

Proben mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen bzw. in Fleischschäumen sind in Tabelle

12 zusammenfassend dargestellt.

Aus den Proben konnten jeweils zwischen 30,1 % und 57,4 % bzw. zwischen 18,07 mg/kg

und 34,46 mg/kg des in einer Konzentration von 60 mg/kg den Fleischproben zugesetzten

Guajakols extrahiert werden.


100

Konzentration des Analyten in der Fleischprobe in mg/kgc

Fleischprobe Guajakol 6-Nitroso-

guajakol

4-Nitro-

guajakol

6-Nitro-

guajakol

Fleischprobea enthält 150 mg/kg NaNO2

erhitzt auf 80°C für 45 min 23,23±1,72 < NWG < NWG < NWG

Fleischprobea enthält 150 mg/kg NaNO2

nach simulierter Verdauung 30,02±3.61 < NWG < NWG < NWG

Fleischprobea mit 400 mg/kg NaNO2

erhitzt auf 80°C für 45 min 28,72±3,38 < NWG < NWG < NWG

Fleischprobea mit 400 mg/kg NaNO2 nach

simulierter Verdauung 24,77±4,88 0,52±0,04 0,58±0,08 0.16±0,03

Fleischprobea mit 150 mg/kg NaNO2,

erhitzt auf 80°C für 45 min und

anschließender Lagerung bei 7 °C für 7 d

28,65±4,45 < NWG < NWG < NWG

Fleischprobeb mit 20 % w/w Eiklar, erhitzt

auf 80°C für 45 min 33,93±2,76 < NWG < NWG < NWG

Fleischprobeb mit 20 % w/w Eiklar nach

simulierter Verdauung 18,07±7,39 < NWG < NWG < NWG

Fleischschaumb mit 20 % w/w Eischnee

(Luft)e, erhitzt auf 80°C für 45 min 31,73±2,39 < NWG < NWG < NWG


(Luft)e, nach simulierter Verdauung 30,82±3,36 0,13±0,03d < NWG < NWG


(Sauerstoff)f, erhitzt auf 80°C für 45 min 32,96±4,70 < NWG < NWG < NWG


(Sauerstoff)f nach simulierter Verdauung 34,46±5,38 0,21±0,04 < NWG < NWG

a Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 60 mg/kg Guajakol und 100 mg/kg ASC; b

Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 60 mg/kg Guajakol, 100 mg/kg ASC und 1,66 %

Nitritpökelsalz (150 mg/kg NaNO2);c Konzentration von 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-

Nitroguajakolbestimmt mittels 5-Nitroguajakoläquivalenten, (Mittelwerte ± SD, n = 6); d Wert liegt zwischen

Nachweis und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.), e Eischnee aufgeschlagen mit Luft, f Eischnee

aufgeschlagen unter Sauerstoffatmosphäre; < NWG : Wert liegt unterhalb der Nachweisgrenze

Tabelle 12 Gehalte an Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol in den

Fleischproben (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.11.)


101

Es schien jedoch kein Zusammenhang zwischen der extrahierten Menge an Guajakol und der

Bildung von Reaktionsprodukten in den Proben zu bestehen, da aus den Fleischproben mit

niedrigen Gehalten an extrahiertem Guajakol mehrheitlich keine Oxidationsprodukte isoliert

werden konnten. Im Gegensatz dazu ließen sich aus den Proben mit 400 mg/kg NaNO2 nach

deren simulierter Verdauung 24,77 mg/kg bzw. 41,3 % des Guajakols isolieren, obwohl sich

in diesen Proben alle drei Oxidationsprodukte nachweisen ließen. Es ist daher wahrscheinlich,

dass die unterschiedliche Extrahierbarkeit im Zusammenhang mit der unterschiedlichen

Probenmatrix der verschieden zubereiteten (z. B. Zusatz von Eiweiß bzw. Eischnee) bzw.

aufgearbeiteten (Erhitzen auf 80 °C bzw. anschließende simulierte Verdauung) stand, die eine

mehr oder weniger starke Bindung des Guajakols mit der Fleischmatrix verursachte.

Weiterhin ist es möglich, dass das Guajakol anderweitig reagierte und dieser

Reaktionsprozess mit den verwendeten Methoden nicht erfasst werden konnte.

Bei der Analyse der Fleischproben, die jeweils 150 mg/kg bzw. 400 mg/kg NaNO2 enthielten,

ließen sich nur in den Proben mit 400 mg/kg NaNO2, die nach ihrem Erhitzen auf 80 °C der

simulierten Verdauung unterzogen wurden, Oxidationsprodukte des Guajakols nachweisen.

Bei den Oxidationsprodukten handelte es sich um 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-

Nitroguajakol, welche in Konzentrationen von 0,52 mg/kg, 0,58 mg/kg und 0,16 mg/kg

(Konzentrationen jeweils bestimmt anhand von 5-Nitroguajakoläquivalenten) extrahiert

wurden.

Die Lagerung der Fleischproben mit 150 mg/kg NaNO2 für 7 Tage bei 7 °C nach ihrem

Erhitzen bei 80 °C und vor ihrer simulierten Verdauung führte im Vergleich zu den nicht

gelagerten Proben zu einem erhöhten Gehalt an extrahiertem Guajakol aber auch in diesen

Proben ließen sich keine Reaktionsprodukte nachweisen.

In den Fleischschäumen wurde während der simulierten Verdauung nur 6-Nitrosoguajakol

gebildet. Die Konzentration war hierbei in den Fleischproben, die das unter

Sauerstoffatmosphäre aufgeschlagene Eiweiß enthielten mit 0,21 mg/kg signifikant höher als

in den Proben, denen der mit Luft aufgeschlagene Eischnee zugesetzt wurde (0,13 mg/kg).

Zusätzlich zu den selbst hergestellten Fleischproben wurden industriell hergestellte, gepökelte

und unter Verwendung von Tannenholzrauch geräucherte Proben von Schwarzwälder


102

Schinken untersucht. Aus diesen Proben konnten zwar sowohl nach dem Erhitzen auf 80 °C

als auch nach der simulierten Verdauung die beiden Methoxyphenole Guajakol und 4-

Methylguajakol extrahiert werden (identifiziert mittels GC-MS), die Isolation etwaiger

Oxidationsprodukte dieser beiden Verbindungen war mit der in dieser Studie verwendeten

Extraktionsmethode jedoch nicht möglich.

4.2.5.2. Diskussion

Der Nachweis von 6-Nitrosoguajakol in der Fleischmatrix erfolgte erstmalig im Rahmen

dieser Studie. Aus gepökelten und geräucherten Fleischprodukten konnten nach deren

Erhitzen durch Braten und/oder anschließender simulierter Verdauung bereits die beiden in

ortho- bzw. para-Position nitrierten Guajakolderivate 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol

isoliert werden (KNOWLES et al. 1974b). Hinsichtlich der Bildung nitrosierter

Oxidationsprodukte des Guajakols konnten jedoch in denselben Untersuchungen keine

eindeutigen Ergebnisse erzielt werden. So wurde die Entstehung von vermeintlichem 6-

Nitroso-4-methylguajakol und 6-Nitroso-4-propylguajakol in späteren Untersuchungen nicht

bestätigt (KNOWLES et al. 1974b, 1975b).

Auch in der vorliegenden Studie wurden bei Nitritkonzentrationen, wie sie nach der

Zusatzstoffzulassungsverordnung für Fleischerzeugnisse vorgeschrieben sind (150 mg/kg

NaNO2), keine Oxidationsprodukte des Guajakols nachgewiesen, worin die erzielten

Ergebnisse mit den Untersuchungen anderer Autoren übereinstimmen (KNOWLES et al.

1974b, 1975b; HOFMANN 1990). Der Zusatz von Eischnee zu den Fleischproben führte

jedoch zur Bildung von 6-Nitrosoguajakol, auch wenn die gesetzlich vorgeschriebene

Höchstmenge von 150 mg/kg NaNO2 eingehalten wurde. Eine erhöhte

Sauerstoffkonzentration förderte hierbei die Entstehung dieser Verbindung während der

simulierten Verdauung. In Anlehnung an die für die Oxidation von Syringol in den

Fleischschäumen erzielten Ergebnisse (Kap. 4.2.3.), ist davon auszugehen, dass auch die

Oxidation von Guajakol indirekt durch den oxidativen Abbau von Ascorbinsäure und die

Regeneration nitrosierend wirkender Stickoxide aus NO unterstützt wurde (ARCHER et al.

1975; W. R. LICHT et al. 1988). Folglich ist die Bildung dieses Oxidationsproduktes in

Fleischschäumen (z. B. Fleischmousses und –parfaits), die in ähnlicher Weise wie die in


103

dieser Studie verwendeten Fleischproben hergestellt werden (EHLERT et al. 1980), möglich,

besonders unter Bedingungen, wie sie während der Verdauung im Magen vorliegen.

5. Zusammenfassung

104

5. Zusammenfassung


Die Oxidation der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-

Methylguajakol in Pökellaken und in erhitzter Fleischmatrix

Die Räucherung von Lebensmitteln gehört zu den ältesten Konservierungsverfahren, welches

auch in der heutigen Lebensmittelherstellung eine breite Anwendung findet. Dies ist neben

den antioxidativen auch den geschmacksgebenden Eigenschaften der Rauchinhaltsstoffe

zuzuschreiben, wobei bezüglich dieser Eigenschaften besonders die phenolischen

Verbindungen hervorzuheben sind, welche vor allem durch den pyrolytischen Abbau des

Holzbestandteils Lignin entstehen. Innerhalb dieser Phenolfraktion spielen die

Methoxyphenole Syringol und Guajakol sowie ihre alkylsubstituierten Derivate aufgrund

ihrer starken aromatisierenden und antioxidativen Wirkung und ihrer hohen Konzentrationen

im Rauch aber auch in den geräucherten Fleischprodukten eine bedeutende Rolle.

Obwohl die Konzentrationen dieser vier Methoxyphenole in Lebensmitteln, Räucherrauch

und Raucharomen in Abhängigkeit von verschiedenen Räucherverfahren, Holzarten,

Räucherprodukten und anderen lebensmitteltechnologischen Faktoren bereits intensiv

untersucht worden sind, liegen bezüglich ihrer Oxidation in Fleischprodukten bisher wenige

und teilweise widersprüchliche Daten vor. Der Abbau der Phenole und die Bildung von

Oxidationsprodukten sind von besonderer Bedeutung, wenn den Lebensmitteln neben dem

Räucherrauch auch Nitritpökelsalz zugesetzt wird, wie es beim Pökeln der Fall ist. Neben den

lebensmitteltechnologisch als positiv zu bewertenden Eigenschaften der Pökelung, wie der

Konservierung, der Aromatisierung und der Umrötung des gepökelten Fleisches wurden im

Zusammenhang mit diesem Konservierungsverfahren auch negative Effekte, wie die Bildung

von kanzerogenen Nitrosaminen nachgewiesen. Da das Räuchern und die Pökelung von

Fleischerzeugnissen oft als miteinander kombinierte Herstellungsverfahren für

5. Zusammenfassung

105

Fleischerzeugnisse auftreten, besteht folglich die Möglichkeit der Nitrierung bzw.

Nitrosierung der durch den Rauch in das Fleisch eingebrachten phenolischen Verbindungen.

Für verschiedene Nitrosophenole ist bereits ein fördernder Effekt auf die Nitrosaminbildung

nachgewiesen worden und auch die Nitrosophenole selbst weisen teilweise genotoxische

Wirkungen auf. Daher ist die Aufklärung des Abbaus der vier Methoxyphenole Guajakol,

Syringol, 4-Methylguajakol und 4-Methylsyringol in geräucherten und gepökelten

Fleischerzeugnissen hinsichtlich der damit gegebenenfalls verbundenen Bildung solcher

nitrosierten bzw. nitrierten Oxidationsprodukte von besonderem Interesse.

Ziel dieser Studie war es daher, die Oxidation dieser vier Verbindungen in selbst hergestellten

Fleischproben zu untersuchen, sowie gebildete Oxidationsprodukte zu isolieren und zu

identifizieren. Des Weiteren wurden Pökellaken hergestellt, mit Hilfe derer die Oxidation im

wässrigen Modell unter ähnlichen Bedingungen, wie den in den Fleischproben hergestellten,

untersucht werden sollte. Hierfür wurden zunächst geeignete HPLC-UV/VIS, GC-MS sowie

HPLC-MS Methoden entwickelt, um die chromatographische Trennung sowie die sichere

Identifikation der Phenole und der aus den Pökellaken und Fleischproben isolierten

Substanzen zu gewährleisten. Die Entwicklung einer schonenden Extraktionsmethode für die

Oxidationsprodukte der Phenole aus der Fleischmatrix wurde durchgeführt, da die in

vorherigen Studien verwendeten Methoden bisher keine sichere und erfolgreiche Extraktion

eventuell gebildeter Nitrosophenole ermöglichten.

Sowohl aus den Pökellaken als auch aus den Fleischproben gelang die Extraktion der

Oxidationsprodukte von Syringol und Guajakol, welche mittels GC-MS und LC-ESI-MS als

6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol, 6-Nitroguajakol, Nitrososyringol, Nitrosyringol und

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol identifiziert werden konnten. Mit Ausnahme

von 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol wurde die Bildung der genannten

Oxidationsprodukte im Rahmen dieser Studie erstmalig in der Fleischmatrix nachgewiesen.

Die Untersuchung ihrer Entstehung in Abhängigkeit vom pH-Wert und der

Ascorbinsäurekonzentration in Pökellaken bzw. von der Nitrit-und Sauerstoffkonzentration in

Fleischproben wurde auf diese Weise das erste Mal durchgeführt.

5. Zusammenfassung

106

Auch im Falle von 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol wurden verschiedene

Oxidationsprodukte aus beiden Probenmatrices isoliert, deren Identität jedoch nicht aufgeklärt

werden konnte.

Die Pökellaken, die unter Zugabe der Phenole, 1,66 % Nitritpökelsalz (150 mg/kg NaNO2)

und unterschiedlichen Konzentrationen des Antioxidationsmittels Ascorbinsäure hergestellt

wurden, wurden zunächst für 40 min auf 80 °C erhitzt und anschließend für 1 h bei pH 3 und

40 °C erwärmt. Erstes Verfahren sollte der Simulation des Erhitzens während der Herstellung

des Räucherproduktes z. B. durch das Heißräuchern bzw. Braten dienen, während das

Absenken des pH-Wertes sowie das Erwärmen der Laken die Bedingungen, wie sie während

der Verdauung im Magen herrschen, nachstellen sollten.

Es zeigte sich, dass Ascorbinsäure bei einer Konzentration von 500 mg/L in der Pökellake im

Vergleich zu einem Ascorbinsäurezusatz von 100 mg/L nach dem Erhitzen auf 80 °C zu

einem verstärkten Abbau von Syringol aber nicht von Guajakol führte. Eine Erniedrigung des

pH-Werts auf 3 förderte den Abbau des jeweiligen Phenols, wobei dies (mit Ausnahme der

Proben, die Syringol und 100 mg/L Ascorbinsäure enthielten) bezogen auf 6-Nitrosoguajakol,

4-Nitroguajakol, 6-Nitroguajakol und Nitrososyringol stets mit einer vermehrten Bildung der

jeweiligen Oxidationsprodukte verbunden war.

Auch die Fleischproben, die neben den Phenolen ebenfalls Ascorbinsäure als

Antioxidationsmittel enthielten, wurden auf 80 °C erhitzt und anschließend der simulierten

Verdauung durch Zugabe von Salzsäure und Pepsin sowie dem Erwärmen auf 40 °C für 1 h

unterzogen. Hierbei sollte der Effekt unterschiedlicher Nitritkonzentrationen in den

Fleischproben auf die Oxidation der Phenole bestimmt werden. Weiterhin wurden

Fleischschäume, die mit Luft oder unter Sauerstoffatmosphäre aufgeschlagenen Eischnee

enthielten, auf die Entstehung der Oxidationsprodukte hin untersucht.

Während sich 6-Nitrosoguajakol zusammen mit 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol nur

unter den Bedingungen der simulierten Verdauung bei stark erhöhten Nitritkonzentrationen

von 400 mg/kg in den Fleischproben bildeten, war 6-Nitrosoguajakol als einziges

Oxidationsprodukt des Guajakols auch in den mit Luft und Sauerstoff aufgeschäumten

Fleischproben, welchen lediglich 150 mg/kg NaNO2 zugesetzt wurde, nach deren simulierter

Verdauung nachweisbar.

5. Zusammenfassung

107

Das Produkt 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol bildete sich in allen

Fleischproben, wobei unter den Bedingungen der simulierten Verdauung stets mehr dieses

Syringoldimers entstand, als nach dem alleinigen Erhitzen auf 80 °C. Je höher hierbei die

Nitritkonzentration war, desto mehr dieser Verbindung wurde gebildet, wobei sich dessen

Konzentration bei 400 mg/kg NaNO2 in der Fleischprobe im Vergleich zu den Proben mit

150 mg/kg um das 4-fache erhöhte. Für die Produkte Nitrososyringol und Nitrosyringol,

welche nur nach der simulierten Verdauung der Fleischproben vorlagen, zeigte sich ebenfalls

eine Vervielfachung der Konzentration in den Proben mit 400 mg/kg NaNO2 im Vergleich zu

den Proben mit 150 mg/kg NaNO2 bzw. der Hälfte dieser Konzentration (75 mg/kg NaNO2).

Die Applikation der gesetzlich nach Zusatzstoffzulassungsverordnung erlaubten

Höchstmenge von 150 mg/kg NaNO2 im Fleischerzeugnis (oder der Hälfte dieser

Konzentration) ohne gleichzeitige Zugabe von Eischnee führte folglich nur beim Syringol zur

Bildung von Oxidationsprodukten. In Fleischschäumen, wie sie z. B. in der traditionellen

französischen Küche hergestellt werden (Fleischmousses und –parfaits), ist jedoch auch bei

einer Nitritkonzentration von 150 mg/kg während der Verdauung die Nitrosierung von

Guajakol möglich.

Da besonders im Falle von Syringol und seinem im Fleisch bevorzugt gebildetem

Reaktionsprodukt 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol bereits deren antioxidative

und für Syringol auch antinitrosierende Wirkungen nachgewiesen wurden, ist gerade beim

Einsatz dieses v.a. beim Räuchern mit Hartholz gebildetem Methoxyphenols von einem

lebensmitteltechnologisch positiven Effekt auszugehen. Da bezüglich der Wirkung der

Oxidationsprodukte von Guajakol wenige Daten vorliegen, sind vor der Bewertung dieses

Methoxyphenols weitere Untersuchungen erforderlich.

Die Bildung der in dieser Studie nachgewiesenen Oxidationsprodukte ist bei der Entwicklung

lebensmitteltechnologischer Verfahren, besonders bei dem Einbringen von sauerstoffhaltigen

Schäumen, wie sie bei der Herstellung von Fleischmousses und –parfaits verwendet werden,

zu berücksichtigen. Dies sollte besonders im Hinblick darauf geschehen, dass selbst wenn im

geräucherten und gepökelten Fleischprodukt kein Nachweis der jeweiligen Reaktionsprodukte

erfolgt, sogar bei der Verwendung gesetzlicher vorgegebener Nitrithöchstmengen eine

Bildung selbiger im Magenmilieu nach Auswertung der Ergebnisse dieser Studie als

wahrscheinlich zu betrachten ist.

6. Summary

108

6. Summary


The oxidation of the methoxyphenols syringol, guaiacol, 4-methylsyringol and 4-

methylguaiacol in curing brine and in heated meat matrix

The smoking of food products is one of the oldest preservation methods, which is used also

for modern food processing. This is caused mainly by the antioxidant and flavoring properties

of the smoke constituents such as phenolic compounds formed by the pyrolysis of lignin.

Because of their high concentration in smoke and in smoked food products the most important

components of the phenolic fraction are the methoxyphenols syringol, guaiacol and their

alkylated derivatives.

Although the contents of this methoxyphenols in smoked foods, smoke and smoke flavorings

were studied in dependence of smoking conditions, kind of wood and kind of food products

little information are available about the oxidation of these compounds in the meat matrix.

The oxidation and degradation of these phenols are of particular interest, if smoking is applied

to cured meat products, because the nitration or nitrosation of smoke derived phenols is

possible. For many nitrosophenols an enhancing effect to nitrosamine formation had been

determined and even the nitrosophenols themselves can develop genotoxicity.

Therefore the investigation of oxidative degradation of the four methoxyphenols guaiacol,

syringol, 4-mehylguaiacol and 4-methylsyringol is of specific interest regarding the formation

of nitrated or nitrosated reaction products in cured and smoked meat.

Because of these considerations the aim of the present study was to analyze the oxidation of

these methoxyphenols by extraction and identification of their associated oxidation products

formed in curing brine and meat matrix. Therefore HPLC-UV/VIS, GC-MS and LC-MS

methods were developed to enable the chromatographic separation and identification of the

6. Summary

109

extracted compounds. In addition a extraction method had to be used, because extraction

methods of earlier studies seemed to be not applicable for the isolation of formed

nitrosophenols from meat matrix.

In this study the extraction of the oxidation products of guaiacol and syringol was performed,

which were identified by GC-MS and LC-ESI-MS as 6-nitrosoguaiacol, 4-nitroguaiacol, 6-

nitroguaiacol, nitrososyringol, nitrosyringol and 3,3′,5,5′-tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-

diol. With exception of 4-nitroguaiacol and 6-nitroguaiacol the formation of these reaction

products was determined for the first time in meat matrix.

In addition the investigation of their formation under different oxidation conditions such as

different concentrations of ascorbic acid and pH-values in the curing brines as well as

different amounts of sodium nitrite or oxygen contents in the meat matrix had not been

performed yet.

Although oxidation products of 4-methylsyringol and 4-methylguaiacol were extracted from

curing brine and meat samples, it was not possible to identify these isolated compounds in this

study.

The brines were prepared by addition of the phenols, 1,66 % curing salt (containing 0,9 %

NaNO2), and different concentrations of ascorbic acid. The brines were heated to 80 °C for

40 min and afterwards the pH was adjusted to 3 with hydrochloric acid and the samples were

heated to 40 °C for 1 hour. The first procedure was applied in order to simulate heating during

food processing such as hot smoking or frying while the second experiment was made to

simulate reaction conditions during gastric digestion.

It was shown that a concentration of 500 mg/L ascorbic acid in the brine led to a higher

degradation of syringol if the samples were heated to 80 °C compared to the brines which

contained 100 mg/L ascorbic acid. For guaiacol no differences appeared comparing these two

batches. Lowering the pH to 3 following simulated digestion enhanced the degradation of

both methoxyphenols and formation of the oxidation products 6-nitrosoguaiacol, 4-

nitroguaiacol, 6-nitroguaiacol and nitrososyringol (with exception of the brines, which

contained syringol and 100 mg/L ascorbic acid).

The meat samples, which contained the phenols, ascorbic acid at a constant concentration of

100 mg/kg and different contents of NaNO2 were heated to 80 °C. Afterwards simulated

6. Summary

110

digestion was applied to the samples by addition of hydrochloric acid and pepsin and by

heating at 40 °C for 1 hour. In addition meat mousses were prepared containing 150 mg/kg

NaNO2, ascorbic acid and foamed egg whites, which were foamed with air or under oxygen

atmosphere in order to determine the effect of different oxygen contents on phenol oxidation

in meat matrix.

Whereas 6-nitrosoguaiacol, 4-nitroguaiacol and 6-nitroguaiacol were successfully isolated

from the batches containing 400 mg/kg sodium nitrite after simulated digestion, in the meat

mousses only 6-nitrosoguaiacol was formed during simulated digestion.

Formation of the dimer 3,3′,5,5′-tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol was determined in all

meat samples, while nitroso- and nitrosyringol were isolated only after the digestion

experiments. Furthermore application of simulated digestion after heating at 80 °C enhanced

the generation of the syringol dimer.

After simulated digestion the concentration of 3,3′,5,5′-tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol

in the samples which contained 400 mg/kg NaNO2 raised to the fourfold compared to the

samples which contained only 150 mg/kg NaNO2 and also the concentration of

nitrososyringol and nitrosyringol was highest in the samples with 400 mg/kg NaNO2 as well.

In conclusion application of the legally allowed level of nitrite (150 mg/kg in meat products

following the german food additive law) without further addition of foam led to product

formation only in case of syringol, while formation of 6-nitrosoguaiacol was determined in

the meat mousses after simulated digestion even at 150 mg/kg NaNO2.

For syringol and its main reaction product in meat matrix, the dimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-

1,1′-biphenyl-4,4′-diol, antioxidative properties had been determined. Since syringol is one of

the most important flavoring components of smoke, its specific application in smoke-derived

products during meat processing could be one possible implementation to exploit the

beneficial properties of this compound and its predominant oxidation product.

Further investigations on the oxidation of guaiacol in cured and smoked meat are required,

since the formation of its oxidation products was also shown in meat mousses at moderate

sodium nitrite levels after simulated digestion in this study.

In summary oxidation of the smoke phenols and formation of the associated reaction products

should be considered an important aspect of food processing especially for the production of

oxygen containing meat mousses and parfaits.

7. Literaturverzeichnis

111


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"Zusatzstoff-Zulassungsverordnung vom 29. Januar 1998 (BGBl. I S. 230, 231), die zuletzt

durch Artikel 3 der Verordnung vom 21. Mai 2012 (BGBl. I S. 1201) geändert worden ist"

Stand: Zuletzt geändert durch Art. 3 V v. 21.5.2012 I 1201

8. Anhang

124

8. Anhang

8.1. Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

Abs Absorbance

ASC Ascorbinsäure

BG Bestimmungsgrenze

DAD Diode Array Detection (Dioden Array Detektion)

ECD Electrochemical Detection (Elektrochemische

Detektion)

entsp. entspricht

ESI Elektrospray-Ionisation

GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie

HPLC High performance liquid chromatography

(Hochleistungsflüssigchromatographie)

h Stunde

Kap. Kapitel

L Liter

LC-MS Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie

M molare Masse

µL Mikroliter

min Minute

mg Milligramm

mV Millivolt

m/z Masse/Ladungs-Verhältnis

NWG Nachweisgrenze

pH potentia hydrogenii (pH-Wert)

rpm Rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

SD Standard Deviation (Standardabweichung)

8. Anhang

125

sd simulated digestion (simulierte Verdauung)

Tab. Tabelle

TIC Total Ion Chromatogram

U Spannung

UV Ultraviolett

„uv“ nicht identifizierte Verbindung (vgl. Kap. 4.1.2.)

vgl. vergleiche

WFR Wiederfindungsrate

8.2. Glossar

Fleischmousse mit Schlagsahne oder Eischnee hergestellte

Fleischschaumspeise

Nitrosierende Stickoxide aus Stickstoff und Sauerstoff bestehende

Verbindungen (z. B. N2O3), die mit anderen

Verbindungen wie z. B. Aminen und Phenolen

unter Nitrosierung bzw. Nitrierung selbiger

reagieren

Fleischparfait aus einer feinen Farce zubereitete Fleischspeise,

die durch Unterschlagen von Eischnee oder Sahne

locker gehalten wird

8.3. Chemikalienliste

Chemikalien Hersteller/Lieferant

Acetonitril (HPLC- und LC-MS-Grade) Fisher Scientific, Loughborough, UK

Ammoniaklösung 30-33 %, reinst Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,

Deutschland

8. Anhang

126

Ammoniumhydrogencarbonat LC-MS Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland

Ascorbinsäure (L(+)) ≥ 99 % p.a. Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,

Deutschland

Chloroform 99+ % Fisher Scientific, Loughborough, UK

Essigsäure Supra 100 % ROTIPURAN® Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,

Deutschland

Ethanol Fisher Scientific, Loughborough, UK

Guajakol (2-Methoxyphenol) 98 % TCI Chemicals, Tokio, Japan

Helium 5.0, 99,99 % Linde AG, Pullach, Germany

Methanol HPLC-Grade Fisher Scientific, Loughborough, UK

4-Methylguajakol (4-Methyl-2-

Methoxphenol) > 98 %

TCI Chemicals, Tokio, Japan

4-Methylsyringol (4-Methoxy-2,6-

Dimethoxyphenol) > 97 %

TCI Chemicals, Tokio, Japan

Natriumchlorid ≥ 99,5 % Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,

Deutschland

Natriumnitrit ≥ 99 % Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,

Deutschland

5-Nitroguajakol 98 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland

2-Nitrophenol 98 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland

4-Nitrophenol > 99,5 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland

2-Nitroso-5-methoxyphenol 98 % Molekula, Newcastle upon Tyne, UK

4-Nitrosophenol > 98 % TCI Chemicals, Tokio, Japan

Pepsin 0,7 Ph. Eur.-E/mg Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,

Deutschland

Phenol ≥ 99,5 % p.a. TCI Chemicals, Tokio, Japan

8. Anhang

127

Salzsäure, rauchend 37 %, p.a.

ROTIPURAN®

Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,

Deutschland

Sauerstoff (g) 5.0, 99,99 % Linde AG, Pullach, Germany

Stickstoff (g) 5.0, 99,99 % Linde AG, Pullach, Germany

Syringol (2,6-Dimethoxyphenol) 99 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland

TEAOH (Tetraethylammoniumhydroxid) 25

% (w/w)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland

8. Anhang

128

8.4. Geräteliste

Gerät Modell/ Hersteller

Analysenwaage Kern 770/G. Kern & Sohn GmbH, Albstadt,

Deutschland

Elektrochemischer Detektor 641 VA-Detektor/ 650 Electrochemical

Detector, Metrohm AG, Herisau, Schweiz

Eurochrom® Software Eurochrom® Software (Version 2.05),

Knauer, Berlin, Deutschland

GC-Chromatograph/ -Detektor 3300/3400 Varian Gas Chromatograph,

Agilent Technologies, Santa Clara, CA,

USA;

Finnigan Mat SSQ 710 Mass Spectrometer,

Thermo Fisher Scientific Inc., Bonn,

Deutschland

GC-Säule DB-5, 60 m, 0,250 mm (i.d.), 0,25 μm Film,

Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA

GC-MS Software ICIS EXECUTIVE® Software Version 8.2.1.,


Deutschland

GraphPad.Prism®Software GraphPad.Prism®Software (Version 6.0),

GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA

HPLC-DAD-Detektor Well Chrom DAD K-2700, Well Chrom

LAMP K-2701, Knauer GmbH, Berlin,

Deutschland

HPLC-Interface Boxen Interface Box, Knauer GmbH, Berlin,

Deutschland

HPLC-Pumpe Maxistar K-1000, Knauer, Berlin,

Deutschland

HPLC-Säule (Messung Pökellaken) NUCLEODUR C-18 ISIS® (250 mm x.

8. Anhang

129

4,6 mm (i.d.), 5 µm; Macharey-Nagel GmbH

& Co. KG, Düren, Deutschland

HPLC-Säule + Vorsäule (Messung

Fleischextrakt)

NUCLEODUR C-18 ISIS® (150 mm x.

3 mm (i.d.), 3 µm; Macharey-Nagel GmbH


HPLC-UV/VIS-Detektor Jasco 875 Intelligent UV/VIS Detector,

JASCO Labor- und Datentechnik GmbH,

Groß-Umstadt, Deutschland

Laborwaage 1205 MP (bis 2 Kg) Satorius, Satorius

AG, Göttingen, Deutschland

LC-MS Pumpe Waters 616 Gradienten Pumpe, Waters

GmbH, Eschborn, Deutschland

LC-MS Autosampler Waters 171 Plus Autosampler, Waters

GmbH, Eschborn, Deutschland

LC-MS Detektor Finnigan LCQ Classic Mass Spectrometer,


Deutschland

LC-MS Säule NUCLEODUR C-18 ISIS® (150 mm x.

3 mm (i.d.), 3 µm; Macharey-Nagel GmbH


LC-MS Software XCalibur 1.3 software, Thermo Fisher

Scientific Inc., Bonn, Deutschland;

Tune Plus 1.3 software, Thermo Fisher

Scientific Inc., Bonn, Deutschland

Mikroskop MBS-10, LOMO PLC, St. Petersburg,

Russland

Moulinette Krups Moulinette, Krups GmbH, Frankfurt

am Main, Deutschland

pH-Elektrode SE 102 N, Knick GmbH, Berlin,

Deutschland

pH-Meter 766 Calimatic, Knick GmbH, Berlin,

8. Anhang

130

Deutschland

Pipetten 1-5 mL: Carl Roth GmbH & Co KG,

Karlsruhe, Deutschland;

10-100/100-1000 µL: GILSON, Middleton,

USA

Pipettenspitzen SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht,

Deutschland

Probengläschen und Schraubkappen 2 mL / 4 mL AMBVIAL AMBER

Rotilabo®, Carl Roth GmbH & Co KG,

Karlsruhe, Deutschland

Schraubdeckelgläser DURAN® 100 mL Schraubdeckelgläser mit

DL 45 Schraubkappen, Schott AG,

Mitterteich, Deutschland

Spektrophotometer Uvikon 930 Spektrophotometer, Kontron

AG, Augsburg, Deutschland

SPE-Kartuschen LiChrolut® EN Kartuschen (40-120 µm,

200 mg), Merck-Hitachi®, Darmstadt,

Deutschland

Stabhomogenisierer Ultra-Turrax®, Janke & Kunkel, IKA®

Werke GmbH & Co. KG, Staufen,

Deutschland

Statistik Software SAS Statistical Analysis Program (SAS für

Windows) Version 9.3, SAS Institute Inc.,

Cary, NC, USA

Ultraschallbad DT 106 BANDELIN SONOREX

DIGITEC, Berlin, Deutschland

Wasserbad Köttermann, Hänigsen, Deutschland

Zentrifuge Sigma Laborzentrifuge 3K30, Sigma

Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz,

Deutschland

8. Anhang

131

8.5. HPLC-UV/VIS-Chromatogramm der vier Methoxyphenole Syringol,

Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol unter Verwendung der

HPLC-Bedingungen für die Pökellaken (vgl. Kap. 4.1.1.)

HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von Syringol (A), Guajakol (B), 4-Methylsyringol (C) und 4-

Methylguajakol (D) unter Verwendung der HPLC-Bedingungen für die Pökellaken, Konzentration der

Phenole jeweils 125 mg/L

8. Anhang

132

8.6. HPLC-UV/VIS-Chromatogramm der vier Methoxyphenole Syringol,

Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol unter Verwendung der

HPLC-Bedingungen für die Fleischextrakte (vgl. Kap. 4.1.1.)

HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von Syringol (A), Guajakol (B), 4-Methylsyringol (C) und 4-

Methylguajakol (D) unter Verwendung der HPLC-Bedingungen für die Fleischextrakte, Konzentration

der Phenole: Syringol und 4-Methylsyringol jeweils 20 mg/kg, Guajakol und 4-Methylguajakol

jeweils 12 mg/kg

8. Anhang

133

8.7. Übersicht der für die Identifizierung der aus den Pökellaken bzw.

Fleischproben isolierten Verbindungen verwendeten Analyseverfahren (vgl.

Kap. 4.1.)

Verfahren zur Analyse bzw. zur Aufarbeitung der untersuchten Verbindung

Verbindung (Matrix) Analytische

HPLC-UV/VIS

(vgl. Kap. 3.4.)

Präparative HPLC-

UV/VIS

(vgl. Kap. 3.5.1.)

LC-ESI-MS

(vgl. Kap. 3.5.6.)

GC-MS

(vgl. Kap. 3.5.5.)

Syringol (Pökellakea) + + -d +

Syringol (Fleischprobeb) + + -d +

Nitrososyringol

(Pökellakea) + + + +

Nitrososyringol

(Fleischprobeb) + + + ●

„uv“ (Pökellakea) + + + +

Nitrosyringol


Nitrosyringol

(Fleischprobeb) + + + ●

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-

1,1′-biphenyl-4,4′-diol

(Pökellakea)

-c -c -c + (gelöst in

Chloroform)

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-

1,1′-biphenyl-4,4′-diol

(Fleischprobeb)

+ + + +

Guajakol (Pökellakea) + + -d +

Guajakol (Fleischprobeb) + + -d +

6-Nitrosoguajakol


6-Nitrosoguajakol

(Fleischprobeb) + + + +

4-Nitroguajakol


4-Nitroguajakol


8. Anhang

134

6-Nitroguajakol


6-Nitroguajakol


4-Methylguajakol

(Pökellakea) + + -d +

4-Methylguajakol

(Fleischprobeb) + + -d +

PL 1a (4-Methylguajakol

vgl. Kap. 4.1.4.) + + + +

F 1b (Methylguajakol

vgl. Kap. 4.1.4.) + + + +

4-Methylsyringol

(Pökellakea) + + -d +

4-Methylsyringol

(Fleischprobeb) + + -d +

Oxidationsprodukte von

4-Methylsyringol (siehe

Kap. 4.1.4.)

+ + Siehe Tabelle 9 in Kap. 4.1.4.

a Verbindung isoliert aus der Pökellake (100 mg/L ASC sd); b Verbindung isoliert aus der Fleischprobe

(400 mg/kg NaNO2, nach der simulierten Verdauung; + Bestimmung mittels des Analyseverfahrens erfolgt; ●

Bestimmung aufgrund zu geringer Gehalte der isolierten Analyten mit Analyseverfahren nicht möglich (vgl.

Kap. 4.1.);-c Bestimmung mittels HPLC wegen Kristallisation nicht möglich (vgl. Kap. 4.1.2.);-d Bestimmung

mittels LC-ESI-MS im sauren Eluenten nicht möglich (vgl. Kap. 4.1.1.)

8. Anhang

135

8.8. Vergleichende Darstellung der LC-ESI-MS Spektren bzw. GC-MS Spektren

der aus der Pökellaken bzw. aus den Fleischproben isolierten

Oxidationsprodukte 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und

Nitrososyringol (vgl. Kap. 4.1.)

1. LC-MS-Spektren von 6-Nitrosoguajakol aus der Pökellake und aus der

Fleischprobe

LC-MS-Spektren von 6-Nitrosoguajakol nach seiner Isolierung aus der Pökellake (100 mg/L ASC sd)

(A) und aus der Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) (B) (vgl. Anhang 8.7.)

8. Anhang

136

2. GC-MS-Spektren von 6-Nitroguajakol aus der Pökellake und aus der

Fleischprobe

GC-MS-Spektren von 6-Nitroguajakol nach seiner Isolierung aus der Pökellake (100 mg/L ASC sd)


8. Anhang

137

3. LC-MS-Spektren von Nitrososyringol aus der Pökellake und aus der

Fleischprobe

LC-MS-Spektren von Nitrososyringol nach seiner Isolierung aus der Pökellake (100 mg/L ASC sd)


8. Anhang

138

8.9. Messwerttabellen zur Berechnung des molaren Extinktionskoeffizienten von

Syringol und 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (vgl. Kap. 3.5.4.

und 4.2.3.1.)

Syringol

Probe Nr. Extinktiona Molarer Extinktionskoeffizientb in Abs Mittelwert ± SD

1 0,34 1048,41 1087,31 ± 36,63

2 0,34 1039,72

3 0,37 1130,76

4 0,36 1116,43

5 0,36 1101,24

a Extinktion gemessen bei 272 nm und einer Konzentration von 50 mg/L Syringol in Chloroform (entspr. einer

Stoffmengenkonzentration von 3,24675 * 10-4 mol/L); b berechnet nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz:

ε = E/c * d in L*cm/mol (ε = molarer Extinktionskoeffizient; E = Extinktion; c = Stoffmengenkonzentration in

mol/L; d = Schichtdicke der Küvette (1 cm))

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol

Probe Nr. Extinktiona Molarer Extinktionskoeffizientb Mittelwert ± SD

1 1,20 7364,70 8223,99 ± 691,35

2 1,25 7658,74

3 1,34 8222,15

4 1,53 9333,83

5 1,40 8540,54

a Extinktion gemessen bei 272 nm und einer Konzentration von 50 mg/L 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-

4,4′-diol in Chloroform (entspr. einer Stoffmengenkonzentration von 1,63399 * 10-4 mol/L); bberechnet nach

dem Lambert-Beerschen-Gesetz: ε = E/c * d in L*cm/mol (ε = molarer Extinktionskoeffizient; E = Extinktion;

c = Stoffmengenkonzentration in mol/L; d = Schichtdicke der Küvette (1 cm))

8. Anhang

139

8.10. Messwerttabellen der Gehalte an Guajakol und Syringol sowie ihrer

Oxidationsprodukte in den Pökellaken (vgl. Kap. 4.2.2. bis 4.2.5.)

1. Gehalte an Guajakol und seinen Oxidationsprodukten in Pökellaken mit

unterschiedlichen Ascorbinsäurekonzentrationen

Konzentration Analyt in mg/L

(Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6)

Pökellakea Guajakol 6-Nitroso-guajakolc 4-Nitro-guajakolc 6-Nitro-guajakolc

100 mg/L ASC, 80 °C 140,85 ± 9,94 51,76 ± 8,83 3,27 ± 0,70 2,43 ± 2,18

100 mg/L ASC,

80 °C + simul. Verd.b 27,64 ± 9,07 112,78 ± 18,35 5,59 ± 1,70 15,71 ± 4,42

500 mg/L ASC, 80 °C 142,38 ± 8,54 13,41 ± 4,46 4,10 ± 1,66 14,26 ± 1,16

500 mg/L ASC,

80 °C + simul. Verd.b 83,92 ± 9,13 80,02 ± 22,00 7,84 ± 0,87 19,26 ± 1,44

a alle Pökellaken enthalten eine Ausgangskonzentration von 200 mg/L Guajakol und 1,66 % Nitritpökelsalz (0,9

% NaNO2, entspr. 150 mg/L NaNO2 in der Pökellake); b Pökellaken nach Erhitzen auf 80 °C (40 min) und

simulierter Verdauung (pH 3, 40 °C, 1 h); c Konzentration in 5-Nitroguajakoläquivalenten

8. Anhang

140

2. Gehalte an Syringol und seinen Oxidationsprodukten in Pökellaken mit

unterschiedlichen Ascorbinsäurekonzentrationen

Konzentration Analyt in mg/L


Pökellakea Syringol

Nitrososyringolc Nitrosyringolc „uv“c

100 mg/L ASC, 80 °C 84,09 ± 7,88 13,55 ± 1,46 1,05 ± 0,65 14,36 ± 3,97

100 mg/L ASC,

80 °C + simul. Verd.b < NWG 14,78 ± 2,32 1,08 ± 0,62 23,34 ± 7,62

500 mg/L ASC, 80 °C 27,78 ± 8,75 3,66 ± 1,00 3,89 ± 1,20 28,73 ± 8,40

500 mg/L ASC,

80 °C + simul. Verd.b 9,08 ± 6,23 19,16 ± 4,07 4,73 ± 0,79 38,49 ± 9,86

a alle Pökellaken enthalten eine Ausgangskonzentration von 200 mg/L Syringol und 1,66 % Nitritpökelsalz (0,9

% NaNO2, entspr. 150 mg/L NaNO2 in der Pökellake); b Pökellaken nach Erhitzen auf 80 °C (40 min) und

simulierter Verdauung (pH 3, 40 °C, 1 h); c Konzentration in 5-Nitroguajakoläquivalenten; < NWG : Wert liegt

unterhalb der Nachweisgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.)

8. Anhang

141

8.11. Messwerttabellen der Gehalte an Guajakol und Syringol sowie ihrer

Oxidationsprodukte in den Fleischproben (vgl. Kap. 4.2.2. bis 4.2.5.)

1. Gehalte an Guajakol und seinen Oxidationsprodukten in Fleischproben mit

unterschiedlichen NaNO2-Konzentrationen

Konzentration Analyt in mg/kg


Fleischprobe mit

unterschiedlichen

Nitritkonzentrationena

Guajakol 6-Nitroso-guajakolc 4-Nitro-guajakolc 6-Nitro-guajakolc

150 mg/kg NaNO2, 80 °C 23,23±1,72 < NWG < NWG < NWG

150 mg/kg NaNO2,

80 °C + simul. Verd.b 30,02±3,61 < NWG < NWG < NWG

400 mg/kg NaNO2, 80 °C 28,72±3,38 < NWG < NWG < NWG

400 mg/kg NaNO2,

80 °C + simul. Verd.b 24,77±4,88 0,52±0,04 0,58±0,08 0,16±0,03

150 mg/kg NaNO2,

80 °C + simul. Verd.b und

Lagerung (7 °C, 7 Tage)

28,65±4,45 < NWG < NWG < NWG

a alle Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 60 mg/kg Guajakol und 100 mg/kg ASC; b

Fleischproben nach Erhitzen auf 80 °C (45 min) und simulierter Verdauung (Salzsäure + Pepsin, 40 °C, 1 h); c

Konzentration in 5-Nitroguajakoläquivalenten; < NWG : Wert liegt unterhalb der Nachweisgrenze (siehe Tab. 6

in Kap. 3.4.1.4.)

8. Anhang

142

2. Gehalte an Guajakol und seinen Oxidationsprodukten in Fleischproben mit

Zusatz von Eiklar bzw. Eischnee



Fleischprobea mit Zusatz

von Eiklar/ Eischnee

Guajakol 6-Nitroso-guajakolc 4-Nitro-guajakolc 6-Nitro-guajakolc

Eiklar, 80 °C 33,93±2,76 < NWG < NWG < NWG

Eiklar, 80 °C + simul.

Verd.b 18,07±7,39 < NWG < NWG < NWG

Eischnee Luft, 80 °C 31,73±2,39 < NWG < NWG < NWG

Eischnee Luft,

80 °C + simul. Verd.b 30,82±3,36 0,13±0,03d < NWG < NWG

Eischnee O2, 80 °C 32,96±4,70 < NWG < NWG < NWG

Eischnee O2,

80 °C + simul. Verd.b 34,46±5,38 0,21±0,04 < NWG < NWG

a alle Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 60 mg/kg Guajakol, 100 mg/kg ASC und 1,66 %

Nitritpökelsalz (0,9 % NaNO2, entspr. 150 mg/kg NaNO2 in der Fleischprobe); b Fleischproben nach Erhitzen

auf 80 °C (45 min) und simulierter Verdauung (Salzsäure + Pepsin, 40 °C, 1 h); c Konzentration in 5-

Nitroguajakoläquivalenten; d Wert liegt zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap.

3.4.1.4.); < NWG : Wert liegt unterhalb der Nachweisgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.)

8. Anhang

143

3. Gehalte an Syringol und seinen Oxidationsprodukten in Fleischproben mit

unterschiedlichen NaNO2-Konzentrationen


(Mittelwert ± Standardabweichung)

Fleischprobe mit

unterschiedlichen

Nitritkonzentrationena

Syringol Nitrososyringol c Nitrosyringol c 3,3′,5,5′-

Tetramethoxy-

1,1′-biphenyl-

4,4′-diol d

75 mg/kg NaNO2, 80 °Ce 66,56 ± 3,55 < NWG < NWG 2,75 ± 0,82

75 mg/kg NaNO2,

80 °C + simul. Verd.b,f 59,78 ± 3,63 0,11 ± 0,06g 0,08 ± 0,02g 60,29 ± 11,11


150 mg/kg NaNO2,

80 °C + simul. Verd.b,f 50,36 ± 9,12 0,13 ± 0,02g 0,21 ± 0,05 167,18 ± 25,07


400 mg/kg NaNO2,

80 °C + simul. Verd.b,f 14,40 ± 2,70 0,46 ± 0,04 2,27 ± 0,28 662,25 ± 61,87

150 mg/kg NaNO2,

80 °C + simul. Verd.b,e und

Lagerung (7 °C, 7 Tage)

37,60 ± 7,75 0,14 ± 0,02g 0,34 ± 0,13 286,04±117,74

a alle Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 100 mg/kg Syringol und 100 mg/kg ASC; b

Fleischproben nach Erhitzen auf 80 °C (45 min) und simulierter Verdauung (Salzsäure + Pepsin, 40 °C, 1 h); c

Konzentration in 5-Nitroguajakoläquivalenten; d Konzentration in Syringoläquivalenten; e n = 6; f n = 4; g Wert

liegt zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.)

8. Anhang

144

4. Gehalte an Syringol und seinen Oxidationsprodukten in Fleischproben mit

Zusatz von Eiklar bzw. Eischnee



Fleischprobea mit Zusatz

von Eiklar/ Eischnee

Syringol Nitrososyringolc Nitrosyringolc 3,3′,5,5′-

Tetramethoxy-

1,1′-biphenyl-

4,4′-diold

Eiklar, 80 °C 65,08±4,70 < NWG < NWG 13,78±1,77

Eiklar, 80 °C + simul.

Verd.b 53,01±13,49 0,08±0,04e 0,18±0,03 113,36±25,70

Eischnee Luft, 80 °C 58,96±2,77 < NWG < NWG 14,23±3,64

Eischnee Luft,

80 °C + simul. Verd.b 51,92±3,79 0,21±0,06 0,37±0,13 236,68±73,08

Eischnee O2, 80 °C 53,43±3,59 < NWG < NWG 4,86±1,95

Eischnee O2,

80 °C + simul. Verd.b 47,49±4,52 0,21±0,07 0,38±0,16 256,27±79,00

a alle Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 100 mg/kg Syringol, 100 mg/kg ASC und 1,66 %

Nitritpökelsalz (0,9 % NaNO2, entspr. 150 mg/kg NaNO2 in der Fleischprobe); b Fleischproben nach Erhitzen

auf 80 °C (45 min) und simulierter Verdauung (Salzsäure + Pepsin, 40 °C, 1 h); c Konzentration in 5-

Nitroguajakoläquivalenten; d Konzentration in Syringoläquivalenten; e Wert liegt zwischen Nachweis- und

Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.)

9. Abbildungsverzeichnis

145


Abbildung 1 Bildung von Syringol und Guajakol während des pyrolytischen Ligninabbaus

(mod. nach WITTKOWSKI (1985)) .......................................................................................... 8

Abbildung 2 Mesomeriestabilisierung eines Phenols durch die phenolische Hydroxygruppe

(nach ZEECK et al. (2005)) ..................................................................................................... 10

Abbildung 3 Radikalkettenabbruch durch Phenoxyradikale (nach BARCLAY et al. (1997))12

Abbildung 4 Radikalische Dimerisierung eines Phenols durch C-C bzw. C-O Kopplung in

saurem und basischem wässrigem Reaktionsmedium (mod. nach KOBAYASHI u.

HIGASHIMURA (2003) und SUN et al. (2010)) .................................................................... 21

Abbildung 5 Strukturformel des Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-

diol und seines Chinons 3,3′,5,5′-Tetramethoxydiphenochinon (nach ADELAKUN et al.

(2012) und BETTS u. KING (1991)) ....................................................................................... 22

Abbildung 6 Umsetzung von HNO2 im sauren Milieu ........................................................... 25

Abbildung 7 Redoxreaktion der Ascorbinsäure mit Nitrit (TERNES 2008) .......................... 28

Abbildung 8 Mechanismus für die inhibitorsche Wirkung von Ascorbinsäure auf die

Nitrosaminbildung durch nitrosierende Stickoxide im offenen, aeroben System (mod. nach W.

R. LICHT et al. (1988)) ............................................................................................................ 29

Abbildung 9 Extraktionsschema für die Methoxyphenole und ihre Oxidationsprodukte aus

der Fleischmatrix ...................................................................................................................... 40

Abbildung 10 Beispiel für eine Kalibriergerade von Guajakol unter den für die

Pökellakeproben verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (272 nm) ................................. 43


Pökellakeproben verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (272 nm) ................................. 44


Fleischextrakte verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (330 nm) .................................... 44

Abbildung 13 Schema des Gradientensystems für die Elution der Methoxyphenole Syringol,

Guajakol, 4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol, 5-Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-


146

methoxyphenol mittels HPLC-ESI-MS (Eluent A: Wasser/Acetonitril (90:10, v/v), Eluent B:

Wasser/Acetonitril (50:50, v/v), enthalten jeweils Ammoniumhydrogencarbonat

(n = 0,01 mol/L)) ...................................................................................................................... 53

Abbildung 14 HPLC-ESI-MS-Chromatogramm (TIC-Modus) von 2-Nitroso-5-

methoxyphenol (m/z 152) (I), Syringol (m/z 153) (II), Guajakol (m/z 123) (III), 5-

Nitroguajakol (m/z 168) (IV), 4-Methylsyringol (m/z 167) (V) und 4-Methylguajakol

(m/z 137) (VI) im negativen Ionenmodus [M-H]- .................................................................... 57

Abbildung 15 UV/VIS-Spektren von Syringol, 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′- . 60

Abbildung 16 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von Nitrososyringol (I), Syringol (II),

Nitrosyringol (III), 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (IV), einem nicht

identifizierten Oxidationsprodukt (uv), 4-Methylguajakol (als interner Standard, IS) und

einem Matrixpeak (M) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L Syringol

(Ausgangskonzentration), 500 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei

pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 100 mg/kg Syringol (Ausgangskonzentration),

100 mg/kg Ascorbinsäure und 150 mg/kg NaNO2) nach simulierter Verdauung bei 272 nm

(B) und der gleiche Fleischextrakt gemessen bei 330 nm (C) ................................................. 61

Abbildung 17 Massenspektren des Molekülions von Nitrososyringol (isoliert aus der

Pökellake (100 mg/L ASC sd)) mit m/z 182 (A) und seines Fragmentions mit m/z 167 (B)

detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions

von Nitrososyringol mit m/z 183 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C) ........................................ 63

Abbildung 18 Massenspektren des Molekülions von Nitrosyringol (isoliert aus der Pökellake

(100 mg/L ASC sd)) mit m/z 198 (A) und seines Fragmentions mit m/z 183 (B) detektiert mit

ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions von

Nitrosyringol mit m/z 199 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C) ................................................... 64

Abbildung 19 Massenspektren des Molekülions von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-

4,4′-diol (isoliert aus der Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit

m/z 305 (A) und seines Fragmentions mit m/z 290 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen

Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-

biphenyl-4,4′-diol mit m/z 306 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C) ........................................... 65


147

Abbildung 20 Mikroskopische Aufnahme der in der Pökellake gebildeten Kristalle aus

3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (56-fache Vergrößerung) ............................... 67

Abbildung 21 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 6-Nitrosoguajakol (a), Guajakol (b), 4-

Nitroguajakol (c), 6-Nitroguajakol (d), 4-Methylguajakol (als interner Standard, IS) und

einem Matrixpeak (M) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L Guajakol

(Ausgangskonzentration), 500 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei

pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 60 mg/kg Guajakol (Ausgangskonzentration),

100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter Verdauung bei 272 nm

(B) und der gleiche Fleischextrakt gemessen bei 330 nm (C) ................................................. 68

Abbildung 22 UV/VIS-Spektren von Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-

Nitroguajakol ............................................................................................................................ 69

Abbildung 23 Massenspektrum des Molekülions von 6-Nitrosoguajakol (isoliert aus der

Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 152 detektiert mit

ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-) (A); Massenspektrum des Molekülions von 6-

Nitrosoguajakol mit m/z 153 detektiert mit GC-MS ([M]+) (B) .............................................. 71

Abbildung 24 Massenspektren des Molekülions von 4-Nitroguajakol (isoliert aus der

Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 168 (A) und seines

Fragmentions mit m/z 153 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-);

Massenspektrum des Molekülions von 4-Nitroguajakol mit m/z 169 detektiert mit GC-MS

([M]+) (C) ................................................................................................................................. 72

Abbildung 25 Massenspektren des Molekülions von 6-Nitroguajakol (isoliert aus der

Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 168 (A) und seines


Massenspektrum des Molekülions von 6-Nitroguajakol mit m/z 169 detektiert mit GC-MS

([M]+) (C) ................................................................................................................................. 73

Abbildung 26 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 4-Methylguajakol (4-MG), 4-

Methylsyringol (als interner Standard, IS), einem Matrixpeak (M) und zwei

Oxidationsprodukten von 4-Methylguajakol (PL 1, F 1) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L

4-Methylguajakol (Ausgangskonzentration), 100 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2)

nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 60 mg/kg 4-Methylguajakol


148

(Ausgangskonzentration), 100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter

Verdauung bei 272 nm (B) ....................................................................................................... 74

Abbildung 27 Massenspektren des Molekülions von PL 1 mit m/z 182 (A) und seines


Massenspektrum des Molekülions von PL 1 mit m/z 183 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C) .. 75

Abbildung 28 Massenspektren des Molekülions von F 1 mit m/z 182 detektiert mit ESI-MS

im negativen Ionenmodus ([M-H]-) (A); Massenspektrum des Molekülions von F 1 mit

m/z 153 detektiert mit GC-MS ([M]+) (B) ............................................................................... 76

Abbildung 29 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 4-Methylsyringol (4-MS), 4-

Methylguajakol (als interner Standard, IS), Matrixpeak (M) und Oxidationsprodukten von 4-

Methylsyringol (QL 1/ QL 2/ QL 3/QL 4, R 1/R 2) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L 4-

Methylsyringol (Ausgangskonzentration), 100 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2)

nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 100 mg/kg 4-Methylsyringol

(Ausgangskonzentration), 100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter

Verdauung bei 272 nm (B) ....................................................................................................... 77

Abbildung 30 UV/VIS-Spektren des Oxidationsproduktes „uv“ von Syringol aus der

Pökellake und des Oxidationsproduktes QL 2 von 4-Methylsyringol aus der Pökellake ........ 79

Abbildung 31 Gehalte an Syringol, Nitrososyringol, Nitrosyringol und der nicht

identifizierten Verbindung “uv” in auf 80 °C erhitzten Pökellaken und Pökellaken, deren pH

anschließend mit Salzsäure auf 3 eingestellt und die für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden (sd).

Die Pökellaken enthielten 200 mg/L Syringol (Ausgangskonzentration), 150 mg/L NaNO2

und 100 mg/L oder 500 mg/L Ascorbinsäure (ASC). (Mittelwerte ± SD, n = 6).

Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikant unterschiedliche Gehalte derselben

Substanz in den verschiedenen Pökellaken (P < 0,05). (Die Gehalte der nicht identifizierten

Substanz “uv” wurden nicht auf signifikante Unterschiede überprüft.) (vgl. auch

Messwerttabellen im Anhang unter 8.10) ................................................................................ 86

Abbildung 32 Voltammogramme von Syringol, Nitrosyringol und Nitrososyringol (Intervall:

50 mV, n = 1); Halbstufenpotentiale von Syringol (577 mV), Nitrososyringol (938 mV) und

Nitrosyringol (767 mV) berechnet mit nicht-linearer Regression nach Bildung des

dekadischen Logarithmus von U (GraphPad.Prism® 6.0 Software) ........................................ 89


149

Abbildung 33 Gehalte an Syringol, 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol,

Nitrososyringol und Nitrosyringol in erhitzten (80 °C) Fleischproben, denen jeweils

100 mg/kg Syringol, 100 mg/kg Ascorbinsäure und unterschiedliche Konzentrationen an

NaNO2 bzw. Sauerstoff zugesetzt wurden (A) und in den gleichen Proben nach deren

simulierter Verdauung (B und C). Die Proben enthielten weiterhin: 75 mg/kg NaNO2 (I/Ia),

150 mg/kg NaNO2 (II/IIa), 400 mg/kg NaNO2 (III/IIIa), 150 mg/kg NaNO2 und Eiklar

(IV/IVa), 150 mg/kg NaNO2 und Eischnee (Luft) (V/Va), 150 mg/kg NaNO2 und Eischnee

(O2) (VI/VIa). Unterschiedliche Buchstaben oberhalb einer Substanz innerhalb einer

Versuchsgruppe (verschiedene NaNO2-Gehalte (I(a)-III(a)); verschiedene Eiklar- bzw.

Eischneezusätze (IV(a)-VI(a))) kennzeichnen signifikant unterschiedliche Gehalte derselben

Substanz innerhalb dieser Gruppe (P < 0,05). (Mittelwerte ± SD, I-VI und IVa-VIa (n = 6), Ia-

IIIa (n = 4)). * Werte liegen zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in

Kap. 3.4.1.4.). (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.11.) ...................................... 91

Abbildung 34 Gehalte an Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol

in auf 80 °C erhitzten Pökellaken und Pökellaken, deren pH anschließend mit Salzsäure auf 3

eingestellt und die für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden (sd). Die Pökellaken enthielten

200 mg/L Guajakol (Ausgangskonzentration), 150 mg/L NaNO2 und 100 mg/L oder

500 mg/L Ascorbinsäure (ASC). (Mittelwerte ± SD, n = 6). Unterschiedliche Buchstaben

kennzeichnen signifikant unterschiedliche Gehalte derselben Substanz in den verschiedenen

Pökellaken (P < 0,05). (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.10) .......................... 96

Abbildung 35 Voltammogramme von 4-Nitrosophenol, Phenol, 2-Nitrophenol und 4-

Nitrophenol (A); Guajakol, 6-Nitroguajakol, 6-Nitrosoguajakol und 4-Nitroguajakol (B) und

Syringol, Nitrosyringol und Nitrososyringol (Intervall: 50 mV, n = 1); Halbstufenpotentiale

von Phenol (1114 mV), 4-Nitrosophenol (939 mV), 2-Nitrophenol (1201 mV), 4-Nitrophenol

(1241 mV), Guajakol (706 mV), 6-Nitroguajakol (854 mV), 6-Nitrosoguajakol (916 mV), 4-

Nitroguajakol (949 mV), Syringol (577 mV), Nitrosyringol (767 mV) und Nitrososyringol

(938 mV) berechnet mit nicht-linearer Regression nach Bildung des dekadischen Logarithmus

von U (GraphPad.Prism® 6.0 Software)................................................................................... 98

10. Tabellenverzeichnis

150


Tabelle 1 Merkmale verschiedener Räucherverfahren (modifiziert nach TERNES et al. (2005)

.................................................................................................................................................... 6

Tabelle 2 Gehalte von Guajakol und Guajakolderivaten sowie Syringol und Syringolderivaten

im Räucherrauch verschiedener Hart- und Weichholzarten (a KJÄLLSTRAND et al. (2000); b

KJÄLLSTRAND u. PETERSSON (2001a)) ............................................................................. 9

Tabelle 3 Strukturformeln und pKS-Werte (a RAGNAR et al. (2000)) vier wichtiger

Methoxyphenole des Räucherrauches ...................................................................................... 10

Tabelle 4 Gehalte an Guajakol, 4-Methylguajakol und Syringol, sowie der

Gesamtphenolgehalt (Summe der Gehalte an Guajakol, 4-Methylguajakol, Syringol, Eugenol

und trans-Isoeugenol) in geräucherten Minisalamis und Brühwürstchen in Abhängigkeit von

der Holzart und dem bei der Wurstherstellung verwendeten Darmtyp (a :HITZEL et al.

(2013b);b :PÖHLMANN et al. (2013b)) .................................................................................. 16

Tabelle 5 HPLC-Bedingungen für die Analyse der Pökellake bzw. des Fleischextraktes ...... 42

Tabelle 6 Nachweisgrenzen (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG) der Methoxyphenole in

den Pökellaken und in den Fleischproben nach dem Erhitzen auf 80 °C; HPLC-Bedingungen

siehe Kap. 3.4.1.1.; a NG und BG bestimmt bei 272 nm; b NG und BG bestimmt bei 330 nm 47

Tabelle 7 HPLC-ESI-MS Bedingungen für die chromatographische Trennung und

massenspektrometrische Detektion von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol, 4-

Methylguajakol, 5-Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-methoxyphenol mittels HPLC-ESI-MS... 52

Tabelle 8 Molekülionen und Fragmente von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-

Methylguajakol detektiert mit LC-ESI-MS und GC-MS ......................................................... 58

Tabelle 9 Retentionszeiten (HPLC-UV/VIS) und Molekülionen/Fragmente (LC-ESI-MS und

GC-MS) der aus der Pökellake bzw. aus dem Fleischextrakt isolierten Oxidationsprodukte

von 4-Methylsyringol, die Bezeichnung der Oxidationsprodukte sowie ihre Retentionszeiten

beziehen sich auf die HPLC-UV/VIS-Chromatogramme in Abbildung 29 ............................. 78


151

Tabelle 10 Wiederfindungsraten (WFR) der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-

Methylsyringol und 4-Methylguajakol sowie der Oxidationsprodukte von Syringol und

Guajakol aus der Fleischmatrix ................................................................................................ 82

Tabelle 11 Bildung eines Niederschlages aus 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol-

Kristallen in Pökellaken unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen ............................... 85

Tabelle 12 Gehalte an Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol in

den Fleischproben (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.11.) .............................. 100

11. Danksagung

152

11. Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Dr. W. Ternes für die intensive fachliche

Betreuung und Beratung sowie für seine vertrauensvolle Unterstützung.

Des Weiteren möchte ich mich beim gesamten Arbeitskreis Chemische Analytik und im

Besonderen bei Frau Dr. Astrid Drotleff für ihre fachlichen Ratschläge und bei Frau Jutta

Barras-Akhnoukh, Frau Julia Hausmann und Herrn Alexander Krybus für ihre

Hilfsbereitschaft und freundschaftliche Zusammenarbeit bedanken.

Von ganzem Herzen danke ich meiner Mutter Anneliese und meinem Mann Lars, die stets an

mich geglaubt haben und auch in schwierigen Phasen immer für mich da waren und ohne

deren Unterstützung diese Arbeit wahrscheinlich nie zustande gekommen wäre.

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