tierärztliche hochschule hannover vorkommen und
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorkommen und Verbreitung von Serotypen bei Streptococcus-suis-Isolaten in Deutschland
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Thea Louise Prüfer
Hannover
Hannover 2017
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
Institut für Mikrobiologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
2. Gutachterin: PD Dr. Isabel Hennig-Pauka
Tag der mündlichen Prüfung: 01.11.2017
Meinen Eltern
Teilergebnisse dieser Dissertation wurden auf folgenden Fachkonferenzen präsentiert: Tagung der DVG-Fachgruppe Bakteriologie und Mykologie „Mikrobiologie in der Tiermedizin GESTER-HEUTE-MORGEN“ vom 31. August bis 02. September 2016 in Jena Vortrag: Prüfer T. L., Rohde J., Willenborg J., Valentin-Weigand P. Vorkommen und Verbreitung bei Streptococcus suis Isolaten in Norddeutschland 3rd International Workshop on Streptococcus suis 08. September 2016 am Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig Posterbeitrag: Prüfer L., Rohde J., Willenborg J., Valentin-Weigand P. Occurence and distribution of serotypes in Streptococcus suis isolates in Northern Germany
Inhalt
1 Einleitung ............................................................................ 11
2 Literaturübersicht ............................................................... 15
2.1 Klinische Bedeutung ............................................................................. 15
2.2 Speziesbeschreibung und -abgrenzung ................................................ 18
2.2.1 MALDI-TOF MS ..................................................................................... 21
2.3 Serotypen .............................................................................................. 22
2.3.1 Vorkommen und Verbreitung ................................................................. 22
2.3.2 Kapselausprägung ................................................................................. 24
2.3.3 Klassische Serotypisierung .................................................................... 26
2.3.4 PCR-basierte Serotypisierung ................................................................ 27
2.4 Sequenztypen ....................................................................................... 30
2.4.1 Multi-Locus-Sequenz-Typisierung .......................................................... 30
2.4.2 Verbreitung von Sequenztypen .............................................................. 33
2.5 Virulenz-assoziierte Faktoren und Virulenzmarker ................................ 34
2.6 Antibiotikatherapie und Resistenzlage .................................................. 38
2.7 Prävention und Vakzinierung ................................................................ 41
3 Material und Methoden ....................................................... 45
3.1 Material ................................................................................................. 45
3.1.1 Chemikalien, Nährmedien, Pufferlösungen, Verbrauchsmaterial und
Geräte .................................................................................................... 45
3.1.2 Herkunft der verwendeten S.-suis-Isolate .............................................. 45
3.1.3 Referenz- und Kontrollstämme ............................................................... 48
3.1.4 Oligonukleotide (Primer)......................................................................... 48
3.2 Methoden .............................................................................................. 48
3.2.1 Kulturelle Verfahren und Asservierung ................................................... 48
3.2.2 Serotypisierung im Koagglutinationsverfahren ....................................... 48
3.2.3 Transmissionselektronenmikroskopie .................................................... 49
3.2.4 Molekularbiologische Methoden ............................................................. 49
3.2.5 Empfindlichkeitsprüfung im Boullion-Mikrodilutionsverfahren ................. 60
3.2.6 Statistische Methoden ............................................................................ 61
4 Ergebnisse .......................................................................... 63
4.1 Etablierung der modifizierten zweistufigen S.-suis-Multiplex-PCR
zur Typisierung von S.-suis-Isolaten ..................................................... 63
4.2 Verbreitung von S.-suis-Serotypen in Deutschland ............................... 67
4.2.1 Herkunft der Isolate ................................................................................ 67
4.2.2 Verbreitung einzelner Serotypen ............................................................ 69
4.2.3 Virulenzmarker-Profile bei unterschiedlichen Serotypen ........................ 72
4.3 S.-suis-Isolate aus unterschiedlichen Lokalisationen ............................ 72
4.3.1 Virulenzmarker bei Isolaten aus unterschiedlichen Lokalisationen ........ 73
4.3.2 Vergleich der Serotypen-Verteilungen zwischen Kohorte A und B ......... 73
4.3.3 Serotypen-Vorkommen bei invasiven Isolaten ....................................... 73
4.3.4 Serotypen-Vorkommen bei Lungen-Isolaten .......................................... 78
4.3.5 Serotypen-Vorkommen bei Carrier-Isolaten ........................................... 79
4.4 Nicht-typisierbare Isolate ....................................................................... 80
4.4.1 Absicherung der Spezieszugehörigkeit .................................................. 81
4.4.2 Untersuchung im Koagglutinationsverfahren .......................................... 81
4.4.3 Untersuchung der Kapselausbildung ..................................................... 83
4.4.4 Multi-Locus-Sequenz-Typisierung .......................................................... 90
4.5 Antibiotika-Resistenzen bei S.-suis-Isolaten ......................................... 95
4.5.1 Resistenzlage in der Gesamtpopulation ................................................. 97
4.5.2 Assoziation zwischen Resistenz und Lokalisation im Tier ...................... 98
4.5.3 Assoziation zwischen Resistenz und Serotyp ...................................... 101
4.5.4 Multiresistente S.-suis-Isolate .............................................................. 101
4.6 Zusammengefasste Ergebnisse .......................................................... 104
5 Diskussion ........................................................................ 105
5.1 Typisierung von S.-suis-Isolaten ......................................................... 105
5.2 Herkunft der Isolate ............................................................................. 107
5.3 Verbreitung der Serotypen in der Gesamtpopulation .......................... 108
5.3.1 Invasive Isolate .................................................................................... 110
5.3.2 Lungen-Isolate ..................................................................................... 113
5.3.3 Carrier-Isolate ...................................................................................... 114
5.4 Virulenzmarker-Profile bei verschiedenen Serotypen ......................... 115
5.5 Assoziation zwischen Virulenzmarkern und Lokalisation im Tier ........ 116
5.6 Nicht-typisierbare Isolate und deren Kapselexpression ...................... 117
5.6.1 Multi-Locus-Sequenz-Typisierung ........................................................ 120
5.7 Resistenzlage bei S.-suis-Isolaten in Deutschland .............................. 123
5.7.1 Resistenzraten bei Isolaten aus unterschiedlichen Lokalisationen ....... 128
5.7.2 Antibiotikaresistenzen bei verschiedenen Serotypen ........................... 130
5.7.3 Multiresistente S.-suis-Isolate .............................................................. 131
6 Zusammenfassung ........................................................... 133
7 Summary ........................................................................... 135
8 Literaturverzeichnis .......................................................... 137
9 Anhang .............................................................................. 163
9.1 Tabellenverzeichnis ............................................................................ 183
9.2 Abbildungsverzeichnis......................................................................... 185
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Erläuterung 16S rRNA 16 S ribosomale Ribonukleinsäure 16S rRNA Gen, welches für die 16 S ribosomale
Ribonukleinsäure codiert A. bidest. Aqua bidestillata A. dest. Aqua destillata AMG Arzneimittelgesetz AMPI Ampicillin AMOCLA Amoxicillin/Clavulansäure ANI engl.: Average Nucleotid Identity aroA Gen, welches für das Enzym 5-
Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase codiert
BHI engl.: brain heart infusion bp Basenpaare (engl.: base pairs) BVL Bundesamt für Verbraucherschutz und
Lebensmittelsicherheit CC Klonaler Komplex (engl. Clonal Complex) CEFT Ceftiofur CEPH Cephalexin CLSI Clinical & Laboratory Standards Institute COLI Colistin cpn60 Gen, welches für das 60-kDa
Chaperonin codiert cps2 Gen, welches für Serotyp 2 oder 1/2
codiert cps9 Gen, welches für Serotyp 9 codiert cps-Gene Gene, welche für die Synthese des
Kapselpolysaccharids codieren CPS Kapselpolysaccharid (engl.: capsular
polysaccharide) CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid DLV Double-Locus-Variante dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate dpr Gen, welches für ein mutmaßliches
Peroxid-Resistenz-Protein codiert E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin-Tetraazetat-Natriumsalz EF engl.: extracellular factor ENRO Enrofloxacin
epf Gen, welches für EF codiert ERYT Erythromycin EU Europäische Union FLOR Florfenicol gdh Gen, welches für die
Glutamatdehydrogenase codiert gDNA genomische DNA GENT Gentamicin gki Gen, welches für die Glukokinase codiert HCl Chlorwasserstoffsäure (Salzsäure) kbp Kilobasenpaare (engl.: kilo base pairs) MHK Minimale Hemmstoffkonzentration min Minute(n) MRP engl.: muramidase-released protein mrp Gen, welches für MRP codiert mutS Gen, welches für ein DNA-Mismatch-
Reparaturenzym codiert NaCl Natriumchlorid NCBI National Center for Biotechnology
Information NCCLS National Committee for Clinical
Laboratory Standards NCLs engl.: novel cps loci PBS engl.: phosphate buffered saline PCR Polymerasekettenreaktion (engl.:
polymerase chain reaction) PENI Penicillin G PRRSV Engl.: Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Virus recA Gen, welches für einen homologen
Rekombinationsfaktor codiert recN Gen, welches für ein Rekombinations-
und Reparaturprotein codiert RNase A Ribonuklease A S. suis Streptococcus suis sec Sekunde(n) SLV Single-Locus-Variante sly Gen, welches für Suilysin codiert sodA Gen, welches für die Superoxid-
Distmutase codiert SPEC Spectinomycin
spp. Spezies ST Sequenztyp(en) TBE Tris-Borat-EDTA TE Tris-EDTA TEM Transmissionselektronenmikroskopie TEN Tris-EDTA-NaCl TETR Tetracyclin THB Todd-Hewitt-Bouillon thrA Gen, welches für die Aspartokinase bzw.
Homoserin-Dehydrogenase codiert TIAM Tiamulin TILM Tilmicosin Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TRISUL Trimethoprim/Sulfamethoxazol USA United States of America vgl. Vergleiche WHO World Health Organisation
Einleitung
11
1 Einleitung
Streptococcus suis (S. suis) ist ein wichtiger Infektionserreger von Septikämien,
Meningitiden und Arthritiden beim Ferkel mit weltweit großer wirtschaftlicher
Bedeutung in der Schweineproduktion (GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014). Es
handelt sich außerdem um einen Zoonose-Erreger, der auch beim Menschen
schwerwiegende Krankheitsverläufe verursacht. Die Zahl an Berichten über
S.-suis-Infektionen beim Menschen ist in den letzten 20 Jahren steigend. In China
gab es 1998 und 2005 zwei große Ausbrüche beim Menschen
(GOTTSCHALK et al. 2007). Aus den genannten Gründen ist das Interesse an der
Erforschung dieses Erregers in den vergangenen zwei Jahrzehnten enorm
angestiegen.
Innerhalb der Art besteht eine große Stammvarianz hinsichtlich der Kapselantigene
und, möglicherweise damit korrelierend, der Virulenz (OKURA et al. 2013). Die
Kapselantigene bilden die Grundlage der Serotypisierung in der S.-suis-Diagnostik.
Bisherige Untersuchungen hinsichtlich Pathogenität und Immunprophylaxe beziehen
sich vor allem auf den Serotyp 2 und in geringerem Umfang auf den Serotyp 9
(WISSELINK et al. 2002, BEINEKE et al. 2008, BAUMS et al. 2009, BÜTTNER
et al. 2012), denen bisher in deutschen Schweinehaltungen die größte Bedeutung
beigemessen wurde (ALLGAIER et al. 2001, BAUMS et al. 2003). Es sind aber bis
zu 35 verschiedene Serotypen dieser Streptokokkenart bekannt (PERCH et al. 1983,
GOTTSCHALK et al. 1989, 1991a, 1991b, HIGGINS et al. 1995). Bei einigen ist
zumindest in Bezug auf die Referenzstämme dieser Serotypen die Zugehörigkeit
dieser Stämme zur Art S. suis umstritten (HILL et al. 2005, LE TIEN et al. 2013,
NOMOTO et al. 2015). Über die Existenz weiterer Serotypen von S. suis gibt es
Untersuchungen, die solches belegen oder nahe legen (PAN et al. 2015,
ZHENG et al. 2015, 2017, QIU et al. 2016).
Die letzte veröffentlichte Studie zu Serotypen von S.-suis-Feldisolaten aus
Deutschland wurde 2006 durchgeführt (SILVA et al. 2006). Sie umfasste aber
Methoden bedingt nur die Typisierung von wenigen Serotypen (1 oder 14, 2 oder 1/2,
7 und 9). Ziel der vorliegenden Studie war es daher, Erkenntnisse zum aktuellen
Vorkommen verschiedener S.-suis-Serotypen in Deutschland, vorrangig in
Norddeutschland, zu gewinnen.
Einleitung
12
Die Serotypisierung von S. suis wird traditionell als Koagglutination oder als
Kapselquellungsreaktion nach Neufeld durchgeführt (NEUFELD 1902,
GOTTSCHALK et al. 1993). Beide Verfahren setzen die Verfügbarkeit von im
Versuchstier erzeugten Antiseren für die verschiedenen Serotypen voraus.
Kreuzreaktionen, Spontanagglutination und nicht typisierbare Isolate sind dabei
häufige Probleme. Die Durchführung ist arbeits- und zeitaufwendig und stark von der
Erfahrung des Untersuchers abhängig.
In neueren Untersuchungen haben zwei voneinander unabhängige Arbeitsgruppen
ein System zur vollständigen molekularbiologischen Serotypbestimmung aller bis
dahin bekannten Serotypen von S. suis vorgestellt (KERDSIN et al. 2014,
OKURA et al. 2014). Die zweistufige Multiplex-PCR von OKURA et al. 2014 wurde
als methodische Grundlage für die vorliegende Arbeit ausgewählt.
Die Bekämpfung der S.-suis-Infektionen beruht einerseits auf der Antibiotikatherapie
andererseits auf der Immunprophylaxe. Es ist bisher nicht gelungen, eine Serotypen
übergreifende Vakzine herzustellen, so dass vornehmlich mit bestandspezifischen
Vakzinen gearbeitet wird (SEGURA 2015). Bisher sind nur Ganzzell-
Bakterienextrakte als Vakzine erhältlich, die nur einen Serotyp-spezifischen oder
sogar nur einen Stamm-spezifischen Schutz bieten. Auch diese Vakzinen sollten
hinsichtlich des Antigens bestmöglich charakterisiert sein, weshalb eine
Identifizierung der darin verwendeten Serotypen in jedem Einzelfall wünschenswert
ist, nicht zuletzt um ein Wiederaufflammen einer Infektion durch das Auftreten eines
neuen Serotyps im Bestand nachvollziehen zu können. Eine aktuelle Beschreibung
der in Deutschland vorherrschenden Serotypen ist deshalb auch insofern interessant,
dass die Impfstoffherstellung gegebenenfalls auf andere Serotypen ausgeweitet
werden sollte oder dass sich durch den Vakzinen-Einsatz in den letzten Jahren die
Verteilung zu Gunsten anderer Serotypen verschoben hat.
Vor dem Hintergrund des weltweit ansteigenden Vorkommens von Antibiotika-
Resistenzen spricht die WHO von einer Bedrohung der globalen öffentlichen
Gesundheit. Dadurch ergibt sich die dringende Notwendigkeit der Einrichtung
nationaler Handlungspläne zur Überwachung und Bekämpfung der Ausbreitung von
Resistenzen (WHO 2016). Neben dem seit 2006 geltenden EU-weiten Verbot des
Antibiotikaeinsatzes als Leistungsförderer in der Tierhaltung wurde 2015 mit der
Deutschen Antibiotika-Resistenzstrategie 2020 die Bekämpfung der Verbreitung von
Einleitung
13
Antibiotikaresistenzen politisch gefestigt (VERORDNUNG (EG) Nr. 183/2005, DIE
BUNDESREGIERUNG 2015). In die 16. Novelle des Arzneimittelgesetzes, die 2014
in Kraft trat, wurde außerdem die Reduktion des Antibiotikaeinsatzes in der
Tierhaltung mit aufgenommen (AMG 1976). Da der Einsatz von Antibiotika mit einem
erhöhten Risiko der Resistenzbildung korreliert (HAO et al. 2014), soll eine
Reduktion und ein zielgerichteter Einsatz die Verbreitung und das Entstehen neuer
Resistenzen minimieren.
In vitro erweisen sich S.-suis-Isolate als sensibel gegenüber vielen Antibiotika mit
Ausnahme von Tetracyclin und Erythromycin. Aus einzelnen Ländern werden auch
Resistenzen gegen Antibiotika der β-Laktam-Klasse beschrieben
(WISSELINK et al. 2006, HENDRIKSEN et al. 2008). Eine aktuelle Untersuchung der
Antibiotika-Empfindlichkeit von S.-suis-Isolaten könnte Aufschluss über die
Resistenzlage dieses Erregers in Deutschland liefern und war daher ein weiteres Ziel
der vorliegenden Arbeit.
Literaturübersicht
15
2 Literaturübersicht
2.1 Klinische Bedeutung
S. suis ist Erreger von verschiedenen Erkrankungen beim Schwein. Sein natürliches
Habitat ist der obere Respirationstrakt und dort vor allem die Tonsillen und
Nasenhöhlen, darüber hinaus auch der Genital- und Verdauungstrakt
(BAELE et al. 2001, GOTTSCHALK 2012). Der natürliche Infektionsweg erfolgt über
die respiratorische Route. Die Eintragung in einen Bestand kann durch
asymptomatische Trägertiere, sogenannte Carrier, erfolgen. Ferkel können sich bei
ihren Muttersauen während oder nach der Geburt über die besiedelte
Vaginalschleimhaut oder über die respiratorische Route infizieren
(CLOUTIER et al. 2003, GOTTSCHALK 2012). In der Regel führt dann eine
horizontale Übertragung über direkten Nase-zu-Nase-Kontakt oder über Aerosole zur
Ausbreitung im Bestand (CLOUTIER et al. 2003). S. suis gehört als natürlicher
Besiedler und Bewohner von Schleimhäuten zur normalen Mikroflora der Schweine
(BAUMS u. VALENTIN-WEIGAND 2009, SEGURA et al. 2017). So kommen
zumindest avirulente S.-suis-Stämme praktisch in jeder Schweineherde
natürlicherweise vor (SEGURA et al. 2017). Die Bakterien können bei einer
Temperatur von 22-25 °C bis zu acht Tage in den Ausscheidungen überleben,
werden aber durch herkömmlich in der Schweinehaltung verwendete
Desinfektionsmittel zuverlässig abgetötet (CLIFTON-HADLEY et al. 1984).
Im Einzelnen kann S. suis Meningitiden und Septikämien mit plötzlichen Todesfällen
vor allem bei jungen Schweinen auslösen, aber auch Arthritiden, Pneumonien,
Endokarditiden oder gelegentlich andere Erkrankungen (z.B. Aborte) bei Schweinen
verursachen und führt dadurch weltweit zu bedeutenden wirtschaftlichen Verlusten in
der Schweineproduktion (HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990, STAATS et al. 1997,
GOTTSCHALK et al. 2010, 2012, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014). Eine
Meningitis entsteht in der Regel in Folge einer Bakteriämie (BERTHELOT-
HERAULT et al. 2001, 2005), kann aber in Einzelfällen auch ohne vorher ersichtliche
Bakteriämie plötzlich auftreten. Auch perakute Verläufe mit plötzlichen Todesfällen
ohne vorherige klinische Symptome kommen vor (SANFORD u. TILKER 1982). Die
Rolle von S. suis als primärer Akteur in der Pathogenese von Pneumonien ist
umstritten, da der Erreger oft zusammen mit anderen bakteriellen oder auch viralen
Literaturübersicht
16
Erregern im Zusammenhang mit dem „Porcine Respiratory Disease Complex“
(PRDC) aus den betroffenen Lungen isoliert wird (REAMS et al. 1996,
STAATS et al. 1997, MACINNES u. DESROSIERS 1999, HEATH u. HUNT 2001,
BROCKMEIER et al. 2002). Außerdem kann S. suis auch häufig von klinisch
gesunden Schweinen isoliert werden, die als asymptomatische Träger zur
Verbreitung des Erregers beitragen (BRETON et al. 1986, BRISEBOIS et al. 1990).
Diese Tiere können in ihrem oberen Respirationstrakt sowohl avirulente als auch
virulente Stämme tragen (BAELE et al. 2001, MACINNES et al. 2008).
Die Verbreitung des Erregers in der gesamten weltweiten Schweinepopulation
beträgt bezogen auf die Bestände geschätzt annähernd 100%. Allerdings liegt die
Inzidenz an Erkrankungen in der Regel unter 5%. Ohne Therapie können
Mortalitätsraten von bis zu 20% auftreten (GOTTSCHALK 2012). Oft sind wenige
Wochen alte Ferkel betroffen. Die Tiere entwickeln initial meist hohes Fieber (bis
42,5 °C). Im weiteren Verlauf können die Tiere zentralnervöse Ausfallserscheinungen
wie Gleichgewichtsstörungen, Ruderbewegungen in Seitenlage, Opisthotonus,
Nystagmus oder generalisierte Krämpfe als Folge einer Meningitis oder Lahmheit
durch Arthritis zeigen. In perakuten Fällen sterben die Tiere ohne klinische
Anzeichen (GOTTSCHALK 2012).
S. suis konnte neben Schweinen und Wildschweinen auch aus anderen
Säugetierspezies und Vögeln isoliert werden (KEYMER et al. 1983,
HOMMEZ et al. 1988, DEVRIESE 1991, DEVRIESE u. HAESEBROUCK 1992,
DEVRIESE et al. 1990, 1992, 1994, HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990,
HIGGINS et al. 1990, MUCKLE et al. 2010). Dass der Erreger zoonotisches Potential
hat, ist durch verschiedene sporadische Fälle von Meningitis oder Endokarditiden
beim Menschen bestätigt worden (LUTTICKEN et al. 1986, ARENDS u. ZANEN
1988, TROTTIER et al. 1991). 1968 wurde S. suis erstmals als Zoonoseerreger
beschrieben (PERCH et al. 1968). Seitdem wurden weltweit mehr als 1600 Fälle
bekannt. Die tatsächliche Prävalenz liegt vermutlich deutlich höher, da der Erreger
beim Menschen oft nicht oder falsch identifiziert wird (DONSAKUL et al. 2003,
GOTTSCHALK 2012, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014). In Vietnam ist S. suis
der häufigste und in anderen südostasiatischen Ländern einer der häufigsten
Verursacher von Meningitis beim Erwachsenen (SUANKRATAY et al. 2004,
HUI et al. 2005, IP et al. 2007, MAI et al. 2008, WERTHEIM et al. 2009). Als Folge
der Meningitis treten oft Hörverluste auf (VAN SAMKAR et al. 2015a, 2015b). Auch
Literaturübersicht
17
für Endokarditis, Pneumonie, Peritonitis, Arthritis oder andere Erkrankungen
(z.B. Cellulitis, Rhabdomyolysis, Spondylodiscitis, Uveitis, Endophthalmitis) kann
S. suis verantwortlich sein. Oft stehen diese mit einer Septikämie in Verbindung
(ARENDS u. ZANEN 1988, HUANG et al. 2005, WERTHEIM et al. 2009). Auch
perakute Verläufe in Form des „Streptococcal Toxic Shock-Like Syndrome“ (STSLS)
mit hoher Mortalität sind beschrieben (TANG et al. 2006, CHEN et al. 2007). In China
kam es 1998 in der Provinz Jiangsu und 2005 in der Provinz Sichuan zu zwei großen
Ausbrüchen. 1998 waren 25 Menschen betroffen, von denen 14 starben
(TANG et al. 2006). 2005 waren bei dem Ausbruch in Sichuan mehr als 200
Menschen betroffen, wovon knapp 20% der Patienten an den Folgen der Infektion
verstarben (YU et al. 2006, GOTTSCHALK et al. 2007, 2010). Von den Betroffenen,
die ein STSLS entwickelten, starben mehr als 60% (YE et al. 2006). Zunehmend
werden S.-suis-Infektionen beim Menschen vor allem in asiatischen Ländern
beobachtet (WERTHEIM et al. 2009), während sie in den westlichen Ländern eher
sporadisch auftreten (GOTTSCHALK et al. 2007). 2010 infizierten sich bei einem
Ausbruch in Nordthailand 171 Menschen mit S. suis (THONGKAMKOON
et al. 2017). Ein erhöhtes Risiko für solch eine Infektion tragen Menschen, die im
engen Kontakt mit Schweinen leben oder arbeiten oder mit deren rohen Produkten
während der Verarbeitung oder durch Verzehr in Kontakt kommen
(GOTTSCHALK et al. 2007, 2010, WERTHEIM et al. 2009). Der Weg der Infektion
führt beim Menschen über den Kontakt von verletzten Hautregionen mit infektiösen
Tieren oder Tierprodukten oder über den oralen Weg beim Verzehr
von nicht oder unzureichend gegartem Schweinefleisch (FONGCOM et al. 2001,
WERTHEIM et al. 2009). Das endemische Auftreten von S.-suis-Infektionen beim
Menschen in Süd-Ost-Asien, vor allem in Thailand und Vietnam, kann auf
verschiedene Ursachen zurückgeführt werden: auf die hohe Dichte der
Schweinehaltung, die oft noch als Hinterhofhaltung im direkten Kontakt zu den dort
lebenden Menschen praktiziert wird, auf wenig Infektionsschutz der Arbeiter an
Schlachthöfen, auf den weit verbreitenden Direktverkauf von Schweinefleisch
und -produkten über Frischmärkte und auf den Verzehr von möglicherweise
infiziertem, rohem oder ungenügend gegartem Schweinefleisch
(WERTHEIM et al. 2009, GOTTSCHALK et al. 2010). In vielen Europäischen
Ländern gab es auch bereits Berichte über S.-suis-Infektionen beim Menschen
(ARENDS u. ZANEN 1988, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014, VAN
Literaturübersicht
18
SAMKAR et al. 2015a, 2015b). In einigen Fällen wurde die Infektion von Jägern auf
den Kontakt mit infizierten Wildschweinen zurückgeführt und es wurde damit gezeigt,
dass Wildschweine ein Reservoir für S. suis darstellen (BONMARCHAND et al. 1985,
BAUMS et al. 2007).
2.2 Speziesbeschreibung und -abgrenzung
S. suis gehört zu den grampositiven, fakultativ anaeroben Kokken. Die Kokken liegen
in vivo häufig paarweise, gelegentlich in kurzen Ketten oder auch einzeln. Die
meisten Stämme zeigen eine α-Hämolyse auf Rinder- und Schafblut-Agar nach
24-stündiger Bebrütung bei 37 °C unter aeroben Bedingungen. Einige Stämme
wachsen bevorzugt unter mikroaerophilen Bedingungen (HOMMEZ et al. 1986,
HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014).
Zunächst kann die Spezies S. suis über verschiedene biochemische Test
eingegrenzt werden: S. suis zeigt kein Wachstum auf 6,5% NaCl-Agar, ist negativ in
der Voges-Proskauer-Reaktion (Bildung von Acetoin) und zeigt Säurebildung aus
Trehalose oder Salicin (HOMMEZ et al. 1986, HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990,
GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014). Weitere biochemische Eigenschaften können
zur vorläufigen Eingrenzung der Spezies verwendet werden. Ein kommerzielles
API® Test-System ist ebenfalls erhältlich, welches aber in manchen Fällen Isolate
falsch identifiziert (GOTTSCHALK et al. 2010, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014).
Mit rein biochemischen Untersuchungen lässt sich die Spezies S. suis folglich nicht
eindeutig abgrenzen (HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990).
In den 1950er Jahren wurden aus den Niederlanden und England erstmals Fälle von
S.-suis-Infektionen beim Schwein in Europa beschrieben (JANSEN u. VAN
DORSSEN 1951, GOTTSCHALK 2012). 1933 beschrieb Rebecca Lancefield eine
Einteilung von Streptokokken in Gruppen (Lancefield-Gruppen), die auf den
unterschiedlichen Antigeneigenschaften der Kohlenhydratzusammensetzung der
bakteriellen Zellwand beruht (LANCEFIELD 1933). 1963 ordnete de Moor
Streptokokken-Isolate von septikämischen Ausbrüchen bei Schweinen den neuen
Lancefield-Gruppen R, S, RS und T zu (DE MOOR 1963). Elliot und Windsor zeigten
später, dass de Moor`s Gruppen R und S zur Lancefield-Gruppe D gehörten und die
der Einteilung von de Moor zu Grunde liegenden Antigeneigenschaften von der
Kapsel der Bakterien herrührten und nicht von der Zellwand (ELLIOTT et al. 1977).
Literaturübersicht
19
Für die von de Moor definierten Gruppen R und S schlugen sie deshalb die
Bezeichnungen Serotyp 1 und Serotyp 2 vor und ordneten diese einer neuen
Spezies Streptococcus suis zu (ELLIOTT u. TAI 1978). Die Zugehörigkeit zur
Lancefield-Gruppe D ist nach wie vor fraglich. 1987 wurde die Speziesbezeichnung
Streptococcus suis offiziell eingeführt (KILPPER-BALZ R 1987). De Moors Gruppen
RS und T wurden später in Serotyp 1/2 und 15 umbenannt (PERCH et al. 1983,
GOTTSCHALK et al. 1989). In den folgenden Jahren und Jahrzehnten wurden
weitere Serotypen beschrieben, sodass für eine lange Zeit von 35 verschiedenen
Serotypen (1/2, 1-34) dieser Spezies ausgegangen wurde (PERCH et al. 1983,
GOTTSCHALK et al. 1989, 1991a, 1991b, HIGGINS et al. 1995).
Für den molekularbiologischen Nachweis von S. suis, inklusive der bis dahin
beschriebenen 35 Serotypen, entwickelten OKWUMABUA et al. (2003) eine PCR auf
Grundlage des Gens für die Glutamatdehydrogenase (gdh). Dieser
molekularbiologische Nachweis von gdh wird bis heute zur S.-suis-Diagnostik
genutzt und wurde auch in verschiedene Multiplex-PCRs zur Speziesdiagnose für
S. suis integriert (SILVA et al. 2006, KERDSIN et al. 2012, 2014). Dennoch sind in
Einzelfällen S.-suis-Isolate über diese Methode nicht korrekt identifiziert worden
(GOTTSCHALK et al. 2013). Außerdem wurde beschrieben, dass auch Isolate von
anderen Streptokokken-Spezies wie Streptococcus gallolyticus, Streptococcus
gallinaceus oder Streptococcus ovis fälschlicherweise über diesen gdh-Nachweis als
S. suis identifiziert wurden (LE TIEN et al. 2012, ISHIDA et al. 2014).
Durch Analysen der 16S rRNA-Sequenzen der 35 Serotypen und ihres
Haushaltsgens cpn60 konnten Serotyp 32 und 34 als Streptococcus orisratti
reklassifiziert werden (BROUSSEAU et al. 2001, HILL et al. 2005). 2013 wurde
mehrfach ein S.-suis-Stamm mit dem so bezeichneten Serotyp 21/29 von klinisch
gesunden Schweinen isoliert, der mit beiden Antiseren 21 und 29 agglutinierte
(LIU et al. 2013). Die klare Abgrenzung der Spezies S. suis gestaltet sich
zunehmend schwierig, denn durch neuere taxonomische Analysen wurden einige
zuvor mit klassischen Methoden als S. suis identifizierte Stämme von der Spezies
abgegrenzt (HILL et al. 2005, LE TIEN et al. 2013, BAIG et al. 2015). Stämme, die
mit biochemischen Methoden, früheren molekularbiologischen Tests und zum Teil
anhand klinischer Symptome zunächst der Spezies S. suis zugeordnet wurden, aber
nach aktuellen taxonomischen Analysen anhand von genetischen Methoden von der
Literaturübersicht
20
Spezies abgegrenzt werden mussten, werden auch als „S. suis-like strains“
bezeichnet (OKURA et al. 2016).
Das Haushaltsgen recN, welches für ein Rekombinations- und Reparatur-Protein
kodiert, hat sich als geeignet für die Speziesdifferenzierung von Streptokokken
erwiesen, da es einerseits genug Variabilität zwischen den verschiedenen
Streptokokken-Spezies zeigt und anderseits nur geringe Unterschiede innerhalb
einer Spezies (GLAZUNOVA et al. 2010). Weitere phylogenetische Untersuchungen
anhand von recN ergaben, dass dieses Gen im Gegensatz zu anderen
Haushaltgenen wie sodA und cpn60 oder Analysen der 16S rRNA die nach aktueller
taxonomischer Lage von der Spezies abweichenden Isolate zuverlässig abgrenzen
kann (BAIG et al. 2015, OKURA et al. 2016). Durch Untersuchungen mittels DNA-
DNA-Hybridisierung und Sequenzvergleichen der Haushaltsgene recN und sodA
wurde die Zugehörigkeit von Serotyp 20, 22, 26 und 33 zur Spezies S. suis
angezweifelt (LE TIEN et al. 2013). Das recN-Gen wurde Basis einer neuen Spezies-
spezifischen PCR zur Identifizierung von S. suis, welche die Serotypen 20, 22, 26
und 32-34 abgrenzt (ISHIDA et al. 2014) und wurde auch Grundlage einer
„Loop-mediated Isothermal Amplification“ (LAMP) Methode zum Direktnachweis von
S. suis in rohem Schweinfleisch (ARAI et al. 2015). Für diese sechs Serotypen wurde
schon früher über 16S-rRNA-Sequenzanalysen (CHATELLIER et al. 1998) und
cpn60-Sequenzanalysen (BROUSSEAU et al. 2001) gezeigt, dass diese sich
genetisch deutlich von den anderen 29 Serotypen abgrenzen. Für die Serotypen 20,
22 und 26 wurde die Zugehörigkeit zu einer neuen Spezies Streptococcus parasuis
vorgeschlagen (NOMOTO et al. 2015). Auch Analysen der Ganz-Genom-
Sequenzierungen von 390 S.-suis-Isolaten ergaben 2015, dass diese drei Serotypen
stärker separiert von den anderen Serotypen sind (BAIG et al. 2015). Zu dem
Serotyp-33-Referenzstamm, der von einem erkrankten Lamm isoliert wurde, gibt es
die Vermutung, dass dieser einer neuen Spezies zugeordnet werden kann, die eher
Wiederkäuer als Wirt bevorzugt. Kürzlich wurde die Zuordnung zu einer neuen
Spezies Streptococcus ruminantium vorgeschlagen (TOHYA et al. 2017).
Verschiedene „S. suis-like strains“, die von erkrankten Rindern, Schafen und Ziegen
isoliert wurden, wurden mittels „Average Nucleotide Identity“ (ANI) ebenfalls dieser
neu vorgeschlagenen Spezies zugeordnet (OKURA et al. 2016).
Ende 2014 wurde ein neuer Serotyp Chz in China beschrieben (PAN et al. 2015). Die
molekulargenetischen Entdeckung von insgesamt 16 neuen CPS-Loci (NCLs) gibt
Literaturübersicht
21
einen Hinweis auf die Existenz von mindestens 16 weiteren neuen Serotypen
(LIU 2014, ZHENG et al. 2015, QIU et al. 2016). Aktuell wurden zusätzlich zum
Serotyp Chz und den NCLs 1-16 vier weitere NCLs (NCL 17-20) beschrieben. Das
Vorkommen weiterer NCLs kann nicht ausgeschlossen werden (ZHENG et al. 2017).
Die Charakterisierung von Isolaten anhand ihres Serotyps kann unterstützend für
eine Beurteilung der Virulenz herangezogen werden, da die Kapsel bei S. suis einen
wichtigen Virulenzfaktor darstellt (SMITH et al. 1999, CHABOT-ROY et al. 2006). Es
ist aber bekannt, dass auch unbekapselte S.-suis-Stämme vorkommen, die unter
anderem bei Endokarditiden von Schweinen eine Rolle zu spielen scheinen. Unter
gewissen Umständen scheint die Kapsellosigkeit einen Vorteil dar zu stellen
(PEDERSEN et al. 1981, 1984, HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990, TANABE
et al. 2010, LAKKITJAROEN et al. 2011, 2014). Unbekapselte Stämme zeigen z.B.
hohe Adhäsionseigenschaften zu Säugetierzellen und besitzen die Fähigkeit Biofilme
zu bilden (BONIFAIT et al. 2010). Es ist auch möglich, dass ein Stamm in vivo von
einem unbekapselten zu einem bekapselten Phänotyp wechselt
(AUGER et al. 2016).
2.2.1 MALDI-TOF MS
Die „Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry“
(MALDI-TOF MS) Technik bietet die Möglichkeit in hohen Durchsatzraten
mikrobiologische Isolate zu identifizieren. Für S. suis wurden Quoten von 96,9%
korrekter Identifizierung beschrieben. Hierzu wurde in einer Untersuchung zunächst
die herkömmliche S.-suis-MALDI-Biotyper-Datenbank mit zusätzlichen klinischen
S.-suis-Isolaten von Serotyp 2, 7 und 9 ergänzt (PEREZ-SANCHO et al. 2015). Für
die Evaluierung wurde als Referenzmethode der gdh-Nachweis via PCR genutzt
(OKWUMABUA et al. 2003). Da diese PCR-Methode auch die reklassifizierten
Serotypen 32 und 34, die zur Reklassifizierung vorgeschlagenen Serotypen 20, 22,
26 und 33, sowie zum Teil andere Streptokokken-Spezies als S. suis identifiziert, ist
sie als Evaluierung für die MALDI-TOF MS basierte Identifizierung allerdings nur
bedingt geeignet (OKURA et al. 2016). Eine Identifizierung mittels MALDI-TOF MS
erfolgt auf Ebene der Spezies S. suis und beinhaltet keine weitere Differenzierung
von z.B. Serotypen.
Literaturübersicht
22
2.3 Serotypen
2.3.1 Vorkommen und Verbreitung
Insgesamt betrachtet gehört der Großteil der weltweit von Schweinen isolierten
S.-suis-Isolate zu Serotyp 1 bis 9. Serotyp 2 ist weltweit der am häufigsten aus
Erkrankungsfällen isolierte Serotyp (GOTTSCHALK 2012). Dieser Serotyp ist in circa
75% der Fälle auch verantwortlich für S.-suis-Infektionen beim Menschen gefolgt von
Serotyp 14 (2%). Andere Serotypen, die im Zusammenhang mit Erkrankungen beim
Menschen berichtet wurden sind 1, 4, 5, 16, 21 und 24 (GOTTSCHALK et al. 2010,
GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014).
Neben Serotyp 2 sind weitere in vielen Ländern häufig vorkommende Serotypen
beim Schwein die Serotypen 3, 4, 5, 7, 8 und 1/2 (FITTIPALDI et al. 2009,
WEI et al. 2009, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014, OKURA et al. 2016).
Serotyp 9 ist einer der häufigsten Serotypen in einigen europäischen Ländern
(WISSELINK et al. 2000, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014). Dass diese von
erkrankten Schweinen häufig isolierten Serotypen, abgesehen von Serotyp 2, bisher
gar nicht oder selten von menschlichen Erkrankungsfällen isoliert werden konnten,
könnte zumindest beim Menschen auf eine Serotyp-spezifische Virulenz hinweisen.
Serotyp-2-Stämme könnten nach dieser Theorie virulenter sein als andere und ein
größeres Potential besitzen, Menschen zu infizieren (GOYETTE-
DESJARDINS et al. 2014).
Zum Teil gibt es aber große geografische Unterschiede im Serotypen-Vorkommen.
Während in Europa Serotyp 2 in Frankreich, Italien und Spanien dominiert, ist
Serotyp 9 der häufigste in den Niederlanden, Belgien, Österreich und Spanien. Im
Vereinigten Königreich hingegen gehören neben Serotyp 2 auch Serotyp 1 und 14 zu
den häufigsten (GOGOLEWSKI et al. 1990, BERTHELOT-HERAULT et al. 2000,
WISSELINK et al. 2000, HEATH u. HUNT 2001, TARRADAS et al. 2001, VELA
et al. 2005, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014). Zwischen 2002 und 2013 war in
Kanada Serotyp 3 neben 2 der zweithäufigste Serotyp und in den USA mit kleinem
Abstand sogar der häufigste. Möglicherweise besitzen die Serotyp-2-Stämme in
Nordamerika ein geringeres Virulenzpotential als eurasische Serotyp-2-Stämme
(GOTTSCHALK u. SEGURA 2000, GOTTSCHALK et al. 2010). Im
südamerikanischen Brasilien ist Serotyp 1/2 der am zweithäufigsten isolierte Serotyp.
Literaturübersicht
23
Serotyp 4 gehört in asiatischen Ländern ebenfalls mit zu den drei häufigsten
Serotypen beim Schwein. Zu beachten ist, dass in Thailand und Vietnam die meisten
Studien mit Isolaten von gesunden Tieren, also mit Beprobungen am Schlachthof,
durchgeführt wurden und nicht mit Isolaten von klinischen Fällen. Trotz
vergleichsweise hoher Prävalenz von S.-suis-Infektionen beim Menschen, wurden in
Asien insgesamt wenige epidemiologische Studien zu S. suis bei Schweinen
durchgeführt (GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014). Serotyp 7 wurde in früheren
Studien in Skandinavien und auch in einer deutschen Studie vermehrt von
Schweinen mit Bronchopneumonie isoliert (PERCH et al. 1983,
AARESTRUP et al. 1998). Die lokale Häufigkeit verschiedener Serotypen ist aber
keineswegs konstant, sondern verschiebt sich kontinuierlich. So sank die Häufigkeit
von Serotyp 2 in Kanada seit den 90er Jahren und auch die Bedeutung von Serotyp
14 im Vereinten Königreich ist im neuen Jahrtausend wieder geringer als noch in den
90er Jahren (HIGGINS u. GOTTSCHALK 2000, HEATH u. HUNT 2001).
Bei Isolaten von gesunden Schweinen oder von anderen Tieren herrscht eine
deutlich größere Serotypen-Diversität als bei Isolaten von klinisch erkrankten Tieren.
Sonst eher seltenere Serotypen und auch nicht-typisierbare Isolate kommen bei den
Träger-Tieren vermehrt vor (LIU et al. 2013, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014,
ZHENG et al. 2015, OKURA et al. 2016).
Für einige europäische Länder wie Dänemark, Belgien, Frankreich, Deutschland,
Italien und das Vereinigte Königreich, die eine bedeutende Schweineproduktion
betreiben, liegen Berichte über die Verteilung von Serotypen beim Schwein zum Teil
deutlich mehr als ein Jahrzehnt zurück (WISSELINK et al. 2000, MARIE et al. 2002).
In Deutschland war 1997 in 48 getesteten Isolaten Serotyp 9 der häufigste bei
klinisch erkrankten Tieren. Ähnlich verhielt es sich für Isolate aus Belgien und den
Niederlanden. In Frankreich, Italien und Spanien war Serotyp 2 der häufigste
(WISSELINK et al. 2000). Aktuellere Daten aus Spanien zeigen, dass sich die
Serotypen-Verteilung dort später zu Gunsten von Serotyp 9 verschoben hat
(VELA et al. 2003, TARRADAS et al. 2004, LUQUE et al. 2010). In den Niederlanden
war Serotyp 9 zwischen 2002 und 2007 nach wie vor dominierend
(SCHULTSZ et al. 2012). Interessanterweise zeigte sich Serotyp 14 nur im
Vereinigten Königreich als bedeutsamer Serotyp, nämlich dort als der dritthäufigste
in den Jahren 1987 bis 1996 (WISSELINK et al. 2000).
Literaturübersicht
24
Für Deutschland liegt die aktuellste publizierte Studie zur Serotypen-Verteilung auch
bereits mehr als 10 Jahre zurück. In einer Untersuchung von insgesamt 210
S.-suis-Isolaten aus den Jahren 1996 bis 1998 und 2001 bis 2004, die vorrangig aus
Deutschland stammten, wurde unter anderem der Serotyp PCR-basiert untersucht.
Mittels PCR konnten damals die Serotypen 1 oder 14 und 2 oder 1/2, die sich jeweils
molekulargenetisch nicht voneinander unterscheiden lassen, sowie die Serotypen 7
und 9 nachgewiesen werden. Insgesamt konnten 109 Isolate keinem dieser
Serotypen zugeordnet werden, sodass diese als nicht-typisierbar bezeichnet wurden.
Serotyp 2 war mit 24,7% der häufigste Serotyp, gefolgt von Serotyp 9 (10%) und 7
(8,6%). Innerhalb der beinhalteten invasiven Isolate gehörte ein Großteil zu
Serotyp 2 (45,3%) und 9 (24%), während Serotyp 7 am häufigsten bei den Isolaten
aus der Lunge gefunden wurde, gefolgt von Serotyp 2 (SILVA et al. 2006).
Es konnte gezeigt werden, dass Schweine durchaus auch mehr als einen Serotypen
tragen können (FLORES et al. 1993) oder verschiedene Stämme von dem gleichen
Serotyp beherbergen. Allerdings ist sehr wahrscheinlich jeweils nur ein Stamm
Auslöser der Erkrankung im Einzeltier (CLOUTIER et al. 2003, MAROIS et al. 2007).
Für einen Ausbruch im Bestand können aber durchaus genetisch unterschiedliche
Stämme mit ggf. auch unterschiedlichen Serotypen verantwortlich sein (HIGGINS u.
GOTTSCHALK 1990, REAMS et al. 1996).
Die Prävalenz der neu entdeckten NCLs 1-20 und des Serotyps Chz wurde bisher
wenig untersucht, da die Entdeckung dieser Kapseltypen noch ganz jung ist
(QIU et al. 2016, ZHENG et al. 2017). Insgesamt wird das Vorkommen dieser
Kapseltypen recht gering sein, denn man kann davon ausgehen, dass sie sich
jeweils hinter einem Teil der nicht-typisierbaren Isolate der Studien von vor 2016
verbergen könnten. Innerhalb der jüngst beschriebenen NCLs scheinen insgesamt
NCL 3 und 7 relativ häufig vorzukommen, wobei sich die Prävalenzen in den Studien
aus China und Kanada unterscheiden (QIU et al. 2016, ZHENG et al. 2017).
2.3.2 Kapselausprägung
Verschiedene Studien mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) konnten
zeigen, wie unterschiedlich die Ausprägung der Polysaccharidkapsel von
S.-suis-Isolaten abhängig von verschiedenen Faktoren sein kann.
QUESSY et al. (1994) zeigten mit Untersuchungen an polykationisch Ferritin-fixierten
Literaturübersicht
25
Isolaten, dass die Kapseldicke von virulenten S.-suis-Serotyp-2-Stämmen bei
in-vivo-Experimenten in Ratten zunimmt, was die Bakterien gegen Phagozytose
schützt. BONIFAIT et al. (2010) veröffentlichten eine Untersuchung an
nicht-typisierbaren S.-suis-Isolaten. Nach Übernachtkultivierung in THB und einer
polykationischen Ferritin-Fixierung wurde die Kapselausprägung im Vergleich mit
verschiedenen Serotyp-2-Stämmen mittels TEM betrachtet. Während die
Serotyp-2-Stämme eine dicke und dichte Kapsel zeigten, prägte keiner der nicht-
typisierbaren Stämme eine nur annähernd so dicke und dichte Kapsel aus. Nur
wenige und kurze Fasern waren zu sehen (BONIFAIT et al. 2010).
GOTTSCHALK et al. (2013) zeigten später, dass hinter den nicht-typisierbaren
Isolaten, die sich oft stark hydrophob verhalten, in vielen Fällen unbekapselte
Stämme stecken. Es ist allerdings unklar, ob sie die Kapsel erst durch die Isolierung
und Kultivierung verlieren oder auch im Tier schon unbekapselt sind.
Aktuellere Untersuchungen konnten allerdings bei einigen nicht-typisierbaren
S.-suis-Isolaten via TEM eine Kapsel nachweisen (ZHENG et al. 2015). Diese Isolate
waren sowohl im Koagglutinationsverfahren als auch mit PCR nicht-typisierbar. 78
nicht-typisierbare Isolate wurden untersucht. 53 wurden als sehr wahrscheinlich
bekapselt eingestuft. Die Kapseldicke zeigte allerdings große Varianz zwischen den
Stämmen. Die schmalste Kapsel zeigte eine Dicke von 15-25 nm, während die
dickste Kapsel mit 70-90 nm gemessen wurde. Als Referenz wurde ein
Serotyp-2-Stamm mit einer Kapseldicke von 110-130 nm verwendet. Die Dichte der
Kapseln wurde nicht erwähnt. Die nicht-typisierbaren Isolate mit Kapsel konnten
mittels PCR verschiedenen neuen cps-Loci (NCLs) zugeordnet werden. Auch die 25
nicht-typisierbaren Stämme ohne sichtbare Kapsel in der TEM wurden diesen NCLs
zugeteilt. Die Autoren stellten die Vermutung an, dass auch diese Stämme, da sie
den Nasopharynx gesunder Schweine besiedeln konnten, eventuell eine sehr dünne
Kapsel ausbildeten, die ggf. durch die Ferritin-Stabilisierung kollabiert war oder in
ihrer Ausprägung unterhalb des Detektionslimits lag. Möglich sei aber auch eine
fehlerhafte Polysaccharid-Produktion aufgrund eines defekten cps-Gen-Clusters
(ZHENG et al. 2015). Darauf aufbauend veröffentlichten QIU et al. (2016) eine
weitere Untersuchung, in der 49 nicht-typsierbare Isolate nach dem gleichen Schema
untersucht wurden. 47 der 49 Isolate zeigten eine Kapsel, die in ihrer Dicke selbst
innerhalb der einzelnen NCLs variierte. Drei Isolate wurden als sehr wahrscheinlich
unbekapselt beurteilt. Da die cps-Loci dieser nicht-typisierbaren Isolate untersucht
Literaturübersicht
26
wurde, konnte festgestellt werden, dass auch diese drei keine Defekte auf dem
Kapsellocus zeigten (QIU et al. 2016).
2.3.3 Klassische Serotypisierung
Die Wichtigkeit der Serotypisierung von S. suis begründet sich damit, die
unterschiedliche Verbreitung verschiedener Serotypen mit zum Teil sehr
unterschiedlich ausgeprägter Prävalenz und Virulenz besser beurteilen zu können
(HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990, OKURA et al. 2014). Die Serotypisierung ist vor
allem für klinische Isolate relevant, da sie weitere Informationen über die Virulenz
des jeweiligen Stamms liefern kann (GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014).
Klassisch erfolgt die Serotypisierung von S. suis entweder durch eine
Kapselquellungsreaktion nach Neufeld, bei der die Vergrößerung der Kapsel nach
Mischung mit Antikörper-haltigem Serum von immunisierten Kaninchen unter dem
Lichtmikroskop beobachtet werden kann, mittels kapillarem Präzipitationstest oder
mit einem Koagglutinationstest (NEUFELD 1902, GOTTSCHALK et al. 1989, 1993).
Für diese Verfahren müssen die entsprechenden Antiseren für die Referenzstämme
der zu testenden Serotypen in Kaninchen produziert werden. Der
Koagglutinationstest (GOTTSCHALK et al. 1993) wird von vielen Laboren bevorzugt
durchgeführt. Kreuzreaktionen treten beim Koagglutinationsverfahren zwischen
verschiedenen Kapseltypen, wie zwischen 1/2 mit 1 oder 2, zwischen 6 mit 16,
zwischen 2 und 22 sowie zwischen 1 und 14 auf und erschweren die exakte
Serotypisierung (PERCH et al. 1981, GOTTSCHALK et al. 1989, HIGGINS u.
GOTTSCHALK 1990, GOTTSCHALK u. SEGURA 2000). Bei Feldisolaten variieren
die Kreuzreaktionen für einige Serotypen (GOTTSCHALK 2012, GOYETTE-
DESJARDINS et al. 2014, SOARES et al. 2014). Die klassische Serotypisierung
bringt einige Nachteile mit sich: Für die Tests werden Antiseren aus Versuchstieren
(Kaninchen) verwendet werden. Neben den ethischen Problemen kommt ein großer
Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand für die Präparation der Seren hinzu. Die
Durchführung dieser Test ist fehleranfällig und sollte so nur durch erfahrene
Untersucher und Labore durchgeführt werden. Neben den erwähnten
Kreuzreaktionen treten außerdem immer wieder auto-, poly- oder nicht-
agglutinierende Stämme auf, die deshalb keinem Serotyp zugeordnet werden
können (GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014, OKURA et al. 2014, ZHENG
Literaturübersicht
27
et al. 2017). Auch Nicht-S.-suis-Stämme können mit den Serotyp-Antiseren
reagieren, weshalb der Serotypisierung eine eindeutige Speziesdiagnose
vorausgehen sollte (GOTTSCHALK 2012).
Das Auftreten von serologisch nicht-typisierbaren Stämmen ist lange bekannt
(HAN et al. 2001, MAROIS et al. 2007, MESSIER et al. 2008, GOTTSCHALK
et al. 2013, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014, OKURA et al. 2014). Ursache
dafür kann sein, dass es sich um neue, bisher nicht beschriebene Serotypen handelt
oder dass betreffende Stämme keine oder eine defiziente Kapsel ausbilden oder sich
durch Mutationen die Antigeneigenschaften der Kapsel verändert haben
(GOTTSCHALK 2012, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014, ZHENG et al. 2017).
Sowohl Genaustausche, große Insertionen oder Deletionen, als auch kleinere
Mutationen können eine Änderung der phänotypischen Eigenschaften bewirken und
damit zu einem veränderten Verhalten im Agglutinationstest führen, wie es bereits für
Pneumokokken beschrieben wurde (MORONA et al. 1999, LAKKITJAROEN
et al. 2014, YUN et al. 2014, ZHENG et al. 2017). Mittels TEM konnte für einige
nicht-typisierbare Stämme gezeigt werden, dass sie schwach oder komplett
unbekapselt sind. Diese Stämme zeigen in der Regel starke hydrophobe
Eigenschaften (BONIFAIT et al. 2010, GOTTSCHALK et al. 2013). Vielen
serologisch nicht-typisierbaren Stämme kann mittels PCR anhand ihrer Kapselgene
einer der bekannten Serotypen oder NCLs zugeordnet werden (OKURA et al. 2014,
ZHENG et al. 2017). Offen bleibt die Frage, ob diese Stämme bereits während der
Infektion des Wirtes unbekapselt waren oder ihre Kapsel durch Deletionen oder
Insertionen im Kapsellocus während der Isolierung aus dem Patienten oder der
Kultivierung im Labor verloren haben (GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014).
2.3.4 PCR-basierte Serotypisierung
Die phänotypische Ausprägung der einzelnen Serotypen basiert auf den
unterschiedlichen Antigeneigenschaften ihrer jeweiligen Kapselpolysaccharide
(STAATS et al. 1997). Das Kapselpolysaccharid wird über den Wzx/Wzy-Weg
synthetisiert (OKURA et al. 2014). Codiert wird die Synthese der
Kapselpolysaccharide durch die cps-Gene auf einem einzelnen Genlocus
(SMITH et al. 1999, 2000). Analysen der gesamten cps-Gencluster aller Serotypen
ergaben, dass alle Serotypen und NCLs bis auf Serotyp 1/2 und 2 sowie 1 und 14
Literaturübersicht
28
spezifische cps-Gene tragen (OKURA et al. 2013, QIU et al. 2016). Das Serotyp-
spezifische wzy-Gen ist in verschiedenen PCR-Analysen Ausgangspunkt für die
molekulargenetische Serotypisierung (LIU et al. 2013, OKURA et al. 2014,
BAI et al. 2015, QIU et al. 2016). Die cps-Gene von Serotyp 1/2 und 2 sowie von 1
und 14 ähneln sich jeweils zu sehr, um eine molekulargenetische Differenzierung zu
ermöglichen (KERDSIN et al. 2012, LIU et al. 2013, OKURA et al. 2013).
Neben Multiplex-PCRs, welche die häufig vorkommen Serotypen identifizieren
(SILVA et al. 2006), wurden in den letzten Jahren verschiedene Multiplex-PCRs
veröffentlicht, die alle bis dahin bekannten Serotypen molekularbiologisch
identifizieren können (LIU et al. 2013, KERDSIN et al. 2014, OKURA et al. 2014).
OKURA et al. (2014) veröffentlichten eine Multiplex-PCR in zwei Schritten, mit der
die ursprünglichen 35 Serotypen von S. suis anhand spezifischer Kaspelgene
typisiert werden können. Die Methode wurde mit der Testung von 483 Isolaten von
erkrankten und gesunden Tieren sowie von Menschen, die 30 verschiedene
Serotypen repräsentierten, validiert. Alle Isolate waren in der Identifizierungs-PCR
positiv für gdh (OKWUMABUA et al. 2003) und wurden damit der Spezies S. suis
zugeordnet. Der Serotyp wurde zuvor jeweils mittels Koagglutinationverfahren
bestimmt. 126 Isolate waren mittels Koagglutinationtest nicht typisierbar.
Die Typisierung nach OKURA et al. (2014) erfolgt in zwei aufeinanderfolgenden
PCRs. In der ersten PCR, der sogenannten „grouping-PCR“, werden die Isolate
anhand verschiedener Kapselgene in sieben übergreifende Gruppen (I-VII) eingeteilt.
Zielgene sind hierbei diejenigen Gene, die bei allen Kapseltypen einer Gruppe
gemeinsam vertreten sind und gleichzeitig bei den Kapseltypen der anderen jeweils
sechs Gruppen nicht vorkommen. Je nach Gruppe ergibt sich ein spezifisches
Bandenmuster, das aus einer internen Amplifikationskontrolle (16S-rRNA-
Genfragment) und einer (Gruppe I, II, IV, V und VI) bzw. zwei (Gruppe III) Banden
besteht. Gruppe VII, welche die Serotypen 31, 32 und 34 beinhaltet, hat hierbei keine
spezifische Gruppenbande, sodass nur die Amplifikation der internen
Amplifikationskontrolle zu sehen sein sollte. Die darauf folgende sogenannte
„typing-PCR“ identifiziert anschließend über das Serotyp-spezifische wzy-Gen den
Kapseltyp innerhalb der Gruppe. Die Auswahl der jeweiligen Zielgene erfolgte
anhand von vorangegangenen Cluster-Analysen aller cps-Gene
(OKURA et al. 2013). Als interne Amplifikationskontrolle wurde ein 1,5 kbp großes
Fragment des 16S-rRNA-Gens ausgewählt (DORSCH u. STACKEBRANDT 1992).
Literaturübersicht
29
In 95,5% der Fälle stimmte der mittels PCR ermittelte Kapseltyp mit dem zuvor im
Koagglutinationstest bestimmten Serotyp überein (OKURA et al. 2014). Die
restlichen 4,5% der phänotypisch charakterisierten Isolate waren allerdings mit der
PCR nicht typisierbar. Als mögliche Erklärungen wurden Diskrepanzen an den
Primer-Bindungsstellen oder neue Kapseltypen mit Kreuzreaktionen zu bekannten
Serotypen vermutet. Von den 126 Isolaten, die in der Koagglutination nicht
typisierbar waren, konnte für 52 der Kapseltyp in der PCR ermittelt werden. Bei drei
dieser Isolate konnte mittels TEM gezeigt werden, dass diese keine Kapsel ausbilden
und außerdem Mutationen auf dem Kapsellocus zeigen (OKURA et al. 2014).
Polyagglutination im klassischen Koagglutinationsverfahren zeigte ein Isolat, bei dem
genetisch ein Mosaik-Gen-Cluster von zwei verschiedenen Serotypen (21 und 29)
gefunden wurde (LIU et al. 2013). 74 Isolate konnten weder mittels Koagglutination
noch mittels PCR typisiert werden. Die meisten dieser Isolate zeigten phänotypisch
eine Autoagglutination. Möglicherweise handelte es sich um unbekapselte Stämme
mit Deletionen auf dem Kapsellocus, welche die Zielgene der PCR mit einschließen,
oder es handelt sich um bisher unbekannte Kapsel- respektive Serotypen
(OKURA et al. 2014).
Allgemein konnte die Anzahl an nicht-typisierbaren S.-suis-Isolaten in den letzten
Jahren durch die Möglichkeit der molekularbiologischen Typisierung verringert
werden. S.-suis-Stämme, die durch Mutationen die Antigeneigenschaften ihrer
Kapsel verändert haben, eine defekte Kapsel ausbilden oder sogar komplett
unbekapselt sind, können molekularbiologisch typisiert werden, sofern die
Mutationen nicht die Primer-Bindungsstellen des oder der spezifischen Zielgene der
jeweiligen Methode (meist wzy) betreffen. Dennoch kommen immer wieder Isolate
von sowohl gesunden als auch von erkrankten Tieren vor, die weder serologisch
noch mit den bekannten PCR-Methoden typisiert werden können
(OKURA et al. 2014, ZHENG et al. 2015, QIU et al. 2016). Gründe dafür können zum
Beispiel sein: das Vorkommen von bis vor kurzem unbekannten Kapseltypen (NCLs),
das Vorkommen von bisher noch nicht bekannten Kapseltypen oder die vollständige
Deletion des Kapsellocus, die gleichzeitig auch phänotypisch zum Verlust der Kapsel
führt (ZHENG et al. 2015, 2017, QIU et al. 2016).
Literaturübersicht
30
2.4 Sequenztypen
2.4.1 Multi-Locus-Sequenz-Typisierung
Insgesamt stellt sich die Spezies S. suis genetisch sehr heterogen dar. Die
Epidemiologie dieser Spezies ist sehr komplex (VELA et al. 2003) und deren
Evolution ein stetig fortlaufender Prozess. Da sich nicht nur S.-suis-Stämme
verschiedener Serotypen, sondern auch diese mit gleichem Serotyp genetisch divers
darstellen (BLUME et al. 2009, PRINCIVALLI et al. 2009, GOTTSCHALK 2012),
bedarf es neben der Serotypisierung und dem Nachweis von verschiedenen
Virulenzmarkern noch einer anderen Charakterisierungsmethode, die sich besser für
eine langfristige epidemiologische Betrachtung eignet.
Die Multi-Locus-Sequenz-Typisierung (MLST) ist eine Methode zur Charakterisierung
von Bakterienisolaten und wird als Hilfsmittel genutzt, um die Populationsstrukturen
einer Spezies, klonale Verwandtschaften einzelner Bakterienstämme, sowie die
epidemiologische Situation und das krankheitsauslösende Potential von einzelnen
Bakterien näher zu beleuchten (SPRATT 1999, URWIN u. MAIDEN 2003). Diese
Methode wurde bereits für verschiedene Bakterienspezies eingeführt (ENRIGHT u.
SPRATT 1998, 1999, MAIDEN et al. 1998, ENRIGHT et al. 2000, 2001
DINGLE et al. 2001). MLST stellt eine Weiterentwicklung der Multi-Locus-Enzym-
Elektrophorese (MLEE) dar. Bei der MLST werden anders als bei der MLEE die
Allele der unterschiedlichen Haushaltsgene nicht mehr indirekt über die
elektrophoretische Mobilität ihrer Genprodukte differenziert, sondern direkt via
Nukleotidsequenzierung ermittelt. MLST ist daher eine Methode, die weltweit
einheitliche und vergleichbare Daten zur Populationsstruktur und Epidemiologie von
Bakterienspezies liefert und deren Sequenzdaten über das Internet ausgetauscht
und verglichen werden können. Die Wahl der Gene basiert darauf, dass für
Verwandtschaftsanalysen von Bakterienstämmen einer Spezies solche Gene
geeignet sind, die keinem starken Selektionsdruck unterliegen und die bei ihnen
auftretenden Mutationen neutral und zufällig sind. Im Gegensatz zu anderen DNA-
basierten Methoden wie z.B. dem Vergleich von 16S-rRNA-Sequenzen, erlaubt
MLST eine globale epidemiologische Langzeit-Betrachtung (MAIDEN 2006,
BREHONY et al. 2007). Die große Anzahl an möglichen Sequenztypen aus der
Kombination der einzelnen Allele der sieben Haushaltsgene macht es äußerst
unwahrscheinlich, dass ein Allelprofil zufällig doppelt auftritt, d.h. ohne dass die
Literaturübersicht
31
Bakterienisolate Klone sind. Die Länge der internen DNA-Fragmente der jeweiligen
MLST-Gene wird in der Regel auf 450-500 bp festgelegt, da diese Sequenzlänge mit
einem Primerpaar noch zuverlässig sequenziert werden kann (ENRIGHT u. SPRATT
1999, SPRATT 1999).
KING et al. (2002) veröffentlichten ein MLST-Schema für S. suis. Für diese MLS-
Typisierung werden die Fragmente von sieben S.-suis-Haushaltgenen mittels PCR
amplifiziert und anschließend deren Nukleotidsequenzen durch Sequenzierung
ermittelt. Mutationen auf diesen Haushaltsgenen sind größtenteils neutral. Für jedes
dieser Genfragmente wird die Nukleotidsequenz einer jeweiligen Allelnummer
zugeordnet. Die Kombination aller sieben Allele eines Isolats bestimmt den
Sequenztyp (ST). Nur eine einzige Basenabweichung bedeutet schon ein neues Allel
und jede neue Kombination der Allele bedeutet einen neuen Sequenztyp. Isolate mit
demselben ST werden zu einem Klon gezählt. Die sieben Haushaltsgene für das
S.-suis-MLST-Schema sind: cpn60, dpr, recA, aroA, thrA, gki und mutS.
Das S. suis-MLST-Schema wurde von denselben Autoren genutzt, um 294
S.-suis-Isolate von sowohl erkrankten als auch gesunden Tieren, die aus neun
verschiedenen Ländern stammten, zu charakterisieren. Diese erste Untersuchung
von S.-suis-Isolaten mit MLST bildete die Grundlage der seither fortgeführten
S.-suis-MLST-Datenbank, in die Forschungsgruppen aus der ganzen Welt ihre
Sequenzierungsergebnisse und Informationen zu den Isolaten eintragen können.1 In
der untersuchten Sammlung von 294 Isolaten waren 28 verschiedene Serotypen
vertreten. Durch die Untersuchung dieser 294 Isolate ergaben sich zwischen 32 und
46 verschiedene Allele pro Genlocus, wodurch sich in den unterschiedlichen
Kombinationsmöglichkeiten eine theoretische Anzahl von mehr als 1,6·1011
Sequenztypen ergibt. Nachgewiesen wurden in dieser Sammlung aber nur 92 dieser
Sequenztypen. 74 ST waren nur durch jeweils ein Isolat vertreten, während sich bei
18 ST jeweils mehrere Isolate in der Sammlung fanden. ST1 war mit 141 Isolaten
aus sechs verschiedenen Ländern der weitaus häufigste. Durch Clusteranalysen der
ST-Daten ergaben sich für 37 der ST klonale Komplexe (CC), aufgrund derer man
auf Verwandtschaften und damit ggf. auf Pathogenität, Virulenz und Herkunft der
Isolate schließen kann. Den größten Komplex stellte der CC1 mit insgesamt 165
Isolaten von 14 verschiedenen ST dar. Bei dem CC1 handelt es sich womöglich um
1 http://pubmlst.org/ssuis/ Kurator: Adrian Whatmore
Literaturübersicht
32
einen sehr erfolgreichen klonalen Komplex, der sich rasch weltweit ausgebreitet hat.
Dieser Komplex beinhaltet hauptsächlich invasive Isolate, die Septikämien,
Meningitiden oder Arthritiden verursachten.
Eine wichtige Feststellung in diesem Zusammenhang war, dass ein ST zum Teil
Isolate mit vielen verschiedenen Serotypen beinhalten kann und Isolate mit
demselben Serotyp oft zu verschiedenen ST gehören und somit einen
grundverschiedenen genetischen Hintergrund haben. Diese Entdeckung zeigt, dass
der Serotyp als alleiniges Merkmal nicht ausreichend für Verwandtschaftsanalysen in
der S.-suis-Population ist. Der gleiche Serotyp konnte sogar bei Isolaten gefunden
werden, die sich auf allen sieben Loci unterschieden und somit genetisch sehr weit
voneinander entfernt waren (KING et al. 2002). Das lässt vermuten, dass
möglicherweise ein horizontaler Austausch von Kapselgenen in der
S.-suis-Population stattfindet, wie es bereits für Streptococcus pneumoniae
beobachtet wurde (COFFEY et al. 1998). Ein solcher Serotypen-Switch könnte auch
die Dominanz der invasiven Serotyp-14-Stämme im Vereinigten Königreich erklären.
Die Serotyp 14 Isolate gehörten größtenteils zum ST1, der ansonsten von
Serotyp-2-Isolaten dominiert wurde und wird. Möglich wäre, dass der erfolgreiche
Genotyp des ST1 unter einem Selektionsdruck seinen Serotyp von 2 zu 14
gewechselt hat (KING et al. 2002).
Die Untersuchung von S.-suis-Referenzstämmen der Serotypen 20, 22, 26, 32 - 34
ergab, dass jeweils eines oder mehrere der Haushaltsgene nicht amplifiziert werden
konnten (KING et al. 2002). Für diese Serotypen wurde bereits gezeigt, dass sie
genetisch weiter entfernt sind von den übrigen Serotypen (BROUSSEAU et al. 2001).
Auch für andere divergente S.-suis-Isolate wurde gezeigt, dass Diskrepanzen
zwischen deren genomischer DNA und den Primersequenzen für die MLST bestehen
(BAIG et al. 2015). Weiterhin beschreiben ZHENG et al. (2015), dass in ihren
Untersuchungen von 78 nicht-typisierbaren Isolaten vier Isolate keinem Sequenztyp
zugeordnet werden konnten, da eines der Haushaltsgene nicht in der PCR
amplifiziert werden konnte. Die Spezies-Zuordnung dieser Isolate geschah durch
biochemische Tests, vergleichende Analysen von 16S rRNA, recN und gdh.
Insgesamt scheint MLST geeigneter zu sein, epidemiologische Fragestellungen und
Verwandtschaftsanalysen bei der Spezies S. suis durchzuführen, als andere
Methoden, die sich oftmals auf bestimmte Virulenzmarker dieser Spezies beziehen.
Literaturübersicht
33
So wurde auf das Vorhandensein von Suilysin, MRP, EF oder auch die
Polysaccharidkapsel als Virulenz- oder Pathogenitätsfaktor hin untersucht und darauf
aufbauend wurden einzelne Phäno- oder Genotypen epidemiologisch untersucht.
S. suis stellt sich aber immer mehr als eine sehr diverse Spezies heraus
(ALLGAIER et al. 2001, KING et al. 2002), sodass die Epidemiologie innerhalb der
Population noch wenig aufgeklärt ist. MLST wird mittlerweile weltweit genutzt, um
S.-suis-Isolate genotypisch zu charakterisieren (GOYETTE-DESJARDINS
et al. 2014). Die MLST-Online-Datenbank zählte bis zum Januar 2017 bereits über
830 ST.2
2.4.2 Verbreitung von Sequenztypen
Im Gegensatz zu den sehr heterogenen S.-suis-Isolaten von Schweinen gruppieren
sich die Isolate vom Menschen, die in vielen Fällen zum Serotyp 2 gehören, in nur
wenige klonale Komplexe (KING et al. 2002, KERDSIN et al. 2011,
SCHULTSZ et al. 2012, GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014, HATRONGJIT
et al. 2016, SEGURA et al. 2017). ST1 ist der am meisten mit Erkrankungen bei
Schwein und Mensch assoziierte ST in Europa (außer den Niederlanden mit ST20),
Asien und Argentinien. In China ist daneben noch ST7 weit verbreitet, der auch
Verursacher der beiden Ausbrüche beim Menschen war. In Nord-Amerika
dominieren ST25 und ST28, die auch in Japan und Thailand vorkommen. ST104 und
ST101 werden in Thailand vermehrt bei S.-suis-Infektionen von Menschen isoliert
(GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014, SEGURA et al. 2017). Die Verbreitung der
wichtigsten ST von Serotyp 2 zeigt Abbildung 1.
2 http://pubmlst.org/ssuis/ Kurator: Adrian Whatmore
Literaturübersicht
34
Abbildung 1: Weltweite Verteilung wichtiger Sequenztypen von S.-suis-Serotyp-2-Isolaten von Mensch und Schwein (SEGURA et al. 2017)
2.5 Virulenz-assoziierte Faktoren und Virulenzmarker
Zu dem Thema Virulenz-assoziierte Faktoren bei S. suis gibt es in der Literatur zum
Teil kontoverse Diskussionen. Zunächst sollte definiert werden, was man unter
Virulenz, virulenten und avirulenten S.-suis-Stämmen versteht. Oft werden die Isolate
anhand der klinischen Information zum Patienten eingeteilt. Weiterhin können
Infektionsversuche im Versuchstier Hinweise zur Virulenz eines Bakterienstammes
liefern. Zuletzt kann über das Screening verschiedener Virulenzmarker im
Erregergenom versucht werden, Rückschlüsse auf die Virulenz zu ziehen. Der
Vergleich zwischen Knock-out-Mutante und Wildtyp im Tierversuch oder in
in-vitro-Experimenten (z.B. Phagozytoseassays) soll dann die Bedeutung eines
bestimmten Virulenz-assoziierten Faktors zeigen (SEGURA et al. 2017).
Viele potentielle Virulenzfaktoren wurden in den vergangenen Jahrzehnten der
S.-suis-Forschung beschrieben, jedoch wurde bisher kein absolut essentieller und
universeller Faktor gefunden. Die Virulenz verschiedener Stämme der
S.-suis-Spezies scheint vielmehr multifaktoriell bedingt zu sein. Dennoch wurden
verschiedene Zellwand-assoziierte oder sezernierte Faktoren beschrieben, die eine
Literaturübersicht
35
wichtige Funktion an verschiedenen Stellen der Pathogenese, wie z.B. der
Kolonisierung des Wirtes, der Durchbrechung von epithelialen Barrieren, dem
Überleben im Blutkreislauf, der Auslösung von Entzündungsreaktionen und
Septikämie oder dem Eindringen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) einnehmen
(FITTIPALDI et al. 2012).
In der Regel tragen die von erkrankten Tieren isolierten Stämme eine Kapsel
(ZHENG et al. 2017). Das Kapselpolysaccharid (CPS) scheint somit ein wichtiger
Virulenzfaktor zu sein. Unter anderem verhindert das CPS die Phagozytose und die
Abtötung durch Neutrophile Granulozyten, Monozyten und Makrophagen und ist
somit ein wichtiger Faktor für das Überleben im Blutkreislauf und den inneren
Organen des Wirtes. Gezeigt wurde dies im Speziellen für Serotyp-2-Isolate
(CHARLAND et al. 1998, SMITH et al. 1999, SEGURA et al. 2004, CHABOT-
ROY et al. 2006, GOTTSCHALK 2012). Dennoch sind einige bekapselte Stämme
avirulent und auch unbekapselte Stämme können Erkrankungen im Tier
verursachen. Das zeigt, dass für das Überleben im Blutkreislauf des Wirtes noch
weitere Faktoren begünstigend sein müssen (CHARLAND et al. 1996, BAUMS u.
VALENTIN-WEIGAND 2009). Es wurde gezeigt, dass das CPS für die Adhäsion an
Epithelzellen des oberen Respirationstraktes, die den ersten Schritt der
Kolonisierung darstellt, hinderlich ist (LALONDE et al. 2000). Unbekapselte Stämme
zeigten deutlich höhere Adhäsionseigenschaften an Epithelzellen
(BENGA et al. 2004). Möglicherweise wird die Ausbildung der Kapsel zu diesem
Zeitpunkt der Infektion herab reguliert und an anderen Stellen in der Pathogenese
wieder hoch reguliert (GOTTSCHALK u. SEGURA 2000, FITTIPALDI et al. 2012).
Experimentell konnte gezeigt werden, dass ein unbekapseltes Isolat, isoliert von
einem Schwein mit Endokarditis, nach mehreren in-vivo-Passagen wieder eine
Kapsel ausbilden kann und damit wieder eine volle Virulenz entwickelte. In diesem
Fall war die Kapsellosigkeit des Stamms durch eine Punktmutation auf dem
Kapsellocus bedingt, die im Laufe der in-vivo-Passagen repariert wurde
(AUGER et al. 2016). Circa ein Drittel der Fälle von S. suis bedingter Endokarditis
werden durch unbekapselte Stämme verursacht. In diesem Zusammenhang wurde
beschrieben, dass diese Stämme eine erhöhte Adhärenz an Thrombozyten zeigen
(LAKKITJAROEN et al. 2011). Für unbekapselte Stämme und für Stämme, deren
Kapselproduktion herab reguliert ist, wurde weiterhin gezeigt, dass diese in der Lage
sind Biofilme auszubilden (TANABE et al. 2010, WANG et al. 2011).
Literaturübersicht
36
Die Virulenz zwischen verschiedenen S.-suis-Stämmen mit unterschiedlichen
Serotypen oder auch mit gleichem Serotyp ist sehr variabel. Auch wenn das weltweit
große Vorkommen von Serotyp-2-Stämmen in Assoziation mit Erkrankungen bei
Schweinen und Menschen auf eine erhöhte Virulenz dieses Serotyps hinweist
(WISSELINK et al. 2000), kommen auch weniger virulente oder sogar avirulente
Serotyp-2-Stämme vor. Das weist darauf hin, dass neben der Kapsel auch andere
Virulenz-assoziierte Faktoren eine Rolle spielen müssen (VECHT et al. 1991). Für
eine volle Virulenz sind vermutlich mehrere verschiedene Faktoren in Kombination
verantwortlich (GOTTSCHALK u. SEGURA 2000).
Verschiedene Oberflächen-assoziierte Zellwandkomponenten wie Peptidoglycane,
Teichonsäure oder Lipoteichonsäure spielen als Virulenzfaktoren eine Rolle, indem
sie z.B. in Mechanismen zur Resistenz gegen Phagozytose oder antimikrobielle
Peptide, zur Adhärenz an Wirtzellen oder zur Induktion einer übersteigerten
Entzündungsreaktion involviert sind (FITTIPALDI et al. 2008a, 2008b). Pili, die als
Adhäsine fungieren, können damit ebenso als Virulenzfaktoren bezeichnet werden
(HOLDEN et al. 2009, FITTIPALDI et al. 2010).
Sekretorische Faktoren scheinen ebenfalls eine wichtige Rolle für die Virulenz eines
Stammes zu spielen. So wirkt das von S. suis sezernierte Hämolysin (Suilysin),
welches durch das Gen sly kodiert wird, zytotoxisch auf Epithel- und Endothelzellen,
sowie auf Phagozyten und spielt damit sowohl bei der Invasion in die Epithelzellen im
Zuge der Kolonisierung, beim Überleben des Erregers im Wirt, als auch beim
Eindringen in das ZNS eine Rolle (GOTTSCHALK et al. 1995, GOTTSCHALK u.
SEGURA 2000, LALONDE et al. 2000, VANIER et al. 2004, CHABOT-
ROY et al. 2006, BENGA et al. 2008, LECOURS et al. 2011, TAKEUCHI et al. 2014).
Neben verschiedenen Zellwandkomponenten des Bakteriums soll auch Suilysin die
Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen und somit die
Entzündungsreaktion z.B. bei einer Septikämie begünstigen können
(LUN et al. 2003, SEGURA et al. 2006). Allerdings ist auch dieser Faktor nicht
essentiell für die Pathogenese, denn auch nicht-Suilysin-produzierende Stämme
können die Blutbahn des Wirtes erreichen und schwerwiegende Erkrankungen
auslösen (GOTTSCHALK 2012). So produzieren z.B. die nordamerikanischen
virulenten Serotyp-2-Stämme in der Regel kein Suilysin (GOTTSCHALK et al. 1998).
Literaturübersicht
37
Obwohl die Signifikanz verschiedener so bezeichneter Virulenz-assoziierten
Faktoren nicht sicher bewiesen werden konnte, werden sie als Virulenzmarker für
den Vergleich von S.-suis-Stämmen genutzt, so z.B. das Muramidase-released
Protein (MRP), der Extracellular Factor (EF) oder Suilysin (VECHT et al. 1991,
JACOBS et al. 1994, SMITH et al. 1997). Für EF kodiert das Gen epf und für MRP
das Gen mrp (SMITH et al. 1992, 1993). Von beiden Proteinen existieren
unterschiedliche Varianten, die sich in ihrem molekularen Gewicht unterscheiden
(SMITH et al. 1993, SILVA et al. 2006). Der molekulargenetische Nachweis dieser
Virulenzmarker ist möglich (SILVA et al. 2006). EF ist häufig assoziiert mit den
Serotypen 2, 1/2, 1 und 14, während er bei anderen Serotypen, auch bei denen, die
häufig aus invasivem Geschehen isoliert werden, wie Serotyp 9, gar nicht vorkommt.
Neben den genannten vier Serotypen wurde EF bisher nur noch bei Serotyp 15
festgestellt (WISSELINK et al. 2000). MRP wurde bei nahezu allen Serotypen, aber
bei weitem nicht regelmäßig nachgewiesen (LUQUE et al. 1999,
WISSELINK et al. 2000, FITTIPALDI et al. 2009).
Dennoch treten auch Infektionen mit Stämmen auf, die keinen dieser
Virulenzfaktoren ausbilden (GOTTSCHALK u. SEGURA 2000). Isogene Mutanten
ohne MRP, EF und/oder Suilysin zeigten in Experimenten die gleiche Virulenz wie ihr
jeweiliger Wildtyp. Trotzdem zeigt sich zumindest in Europa und Asien eine positive
Korrelation zwischen Ausbildung dieser Proteine und Virulenz der Stämme
(TARRADAS et al. 2001, SILVA et al. 2006, WEI et al. 2009). EF und MRP kommen
in Europa bei einem Großteil der virulenten Serotyp-2-Stämme vor
(WISSELINK et al. 2000). Suilysin kommt bei vielen Serotyp-2-Stämmen in Europa
vor, aber längst nicht bei allen virulenten S.-suis-Isolaten (SEGERS et al. 1998,
OKWUMABUA et al. 1999, KING et al. 2001). In vielen nordamerikanischen und
auch in manchen europäischen virulenten S.-suis-Isolaten konnten diese Proteine
nicht nachgewiesen werden, weshalb man bei Abwesenheit dieser Virulenz-
assoziierten Faktoren nicht automatisch von einem avirulenten Stamm ausgehen
kann (GOTTSCHALK et al. 1998, BERTHELOT-HERAULT et al. 2000, FITTIPALDI
et al. 2009).
Weltweit wird zusätzlich zur Serotypisierung das Screening von Suilysin, MRP und
EF bzw. der jeweils codierenden Gene genutzt, um die Epidemiologie
des Erregers näher aufzuklären (GOTTSCHALK et al. 1998, WISSELINK et al. 2000,
Literaturübersicht
38
SILVA et al. 2006, WEI et al. 2009). So zeigt sich in der Vergangenheit bei virulenten
Serotyp-2-ST1-Stämmen konstant der Genotyp sly+ mrp+ epf+ (SEGURA et al. 2017).
Infektionsversuche mit Mutanten legen nahe, dass neben den beschriebenen auch
noch weitere Virulenz-assoziierte Faktoren existieren (SMITH et al. 1996). Für das
Enzym Arginin-Deiminase, welches durch das Gen arcA, früher auch als adiS
bezeichnet, kodiert wird, konnte eine Rolle beim Überleben unter Stressbedingungen
gezeigt werden. Die Ammoniumproduktion aus Arginin, die durch das
Arginin-Deiminase-System katalysiert wird, schützt die Bakterien in einer
sauren Umgebung (WINTERHOFF et al. 2002, GRUENING et al. 2006). In einer
Untersuchung von 42 S.-suis-Serotyp-2- und -9-Stämmen war arcA in allen Fällen
nachweisbar (WINTERHOFF et al. 2002).
In der Literatur werden für S. suis bisher mehr als 100 potentielle Virulenzfaktoren
diskutiert, von denen 37 als entscheidend für die Virulenz benannt werden. Dennoch
zeigte sich, dass diese entdeckten Virulenzfaktoren nicht allgemeingültig auf alle
S.-suis-Stämme bezogen werden können. Die Spezies S. suis ist so heterogen, dass
vermutlich jeweils verschiedene Virulenzfaktoren ein und dieselbe Funktion erfüllen
können. Dies bezeichnet man als Redundanz (SEGURA et al. 2017).
Schlussendlich darf man bei der Betrachtung der Virulenz auch die individuelle
Empfänglichkeit des Wirtes nicht außer Acht lassen (FITTIPALDI et al. 2012). So
spielen Herdenfaktoren bei der klinischen Manifestation der Erkrankung ebenso eine
Rolle wie die Virulenz des einzelnen Isolates (MARTINEZ et al. 2002).
2.6 Antibiotikatherapie und Resistenzlage
Die Wahl des Antibiotikums für die Therapie der S.-suis-Infektion sollte je nach
Ergebnis der Empfindlichkeitsprüfung, der Art der Erkrankung, der möglichen
Verabreichungsform sowie der realistisch erreichbaren Wirkstoffkonzentrationen im
betroffenen Gewebe erfolgen (GOTTSCHALK 2012). Für die Behandlung von
S.-suis-Infektionen beim Menschen werden Penicilline oder auch Ceftriaxone
eingesetzt, zum Teil kombiniert mit einer Dexamethason-Therapie (MAI et al. 2008,
WERTHEIM et al. 2009, GOTTSCHALK et al. 2010). Weiterhin werden bei humanen
Streptokokken-Infektionen häufig Makrolid-Antibiotika eingesetzt (OH et al. 2017).
Für die Behandlung beim Schwein werden vorrangig β-Laktam-Antibiotika wie
Literaturübersicht
39
Penicillin G, Amoxicillin oder auch Ampicillin eingesetzt (VARELA et al. 2013,
HERNANDEZ-GARCIA et al. 2017). Untersuchungen ergaben, dass der Erreger in
Europa in den allermeisten Fällen empfindlich gegenüber Penicillinen,
Aminopenicillinen und Cephalosporinen der dritten und vierten Generation ist
(AARESTRUP et al. 1998, MARTEL et al. 2001, HENDRIKSEN et al. 2008).
Vereinzelt wird jedoch auch über Penicillin-Resistenzen in einigen europäischen
Ländern berichtet, die jedoch geographische Unterschiede zeigen. Während Isolate
aus dem Vereinigten Königreich, Frankreich und den Niederlanden keine
Resistenzen gegen Penicillin zeigten, wurden in Portugal mit 13% und Polen mit
8,1% relativ hohe Anteile festgestellt (HENDRIKSEN et al. 2008). Die Rate an
Ampicillin- oder Amoxicillin-empfindlichen Isolaten bewegt sich insgesamt um die
90%-Marke (GOTTSCHALK 2012). In europäischen Ländern ist die Resistenzlage
gegenüber β-Laktam-Antibiotika insgesamt als günstig einzuschätzen, da die
Resistenzraten oft sehr gering sind (VARELA et al. 2013, EL GARCH et al. 2016).
Im Gegensatz dazu wird weltweit von zum Teil extrem hohen Resistenzraten von
S. suis gegenüber Tetracyclinen, Makrolidantibiotika wie Erythromycin, Lincosaminen
wie Clindamycin und Sulfonamiden berichtet (VARELA et al. 2013,
EL GARCH et al. 2016). In Europa wurde ein hohes Niveau von Tetracyclin- und
Erythromycin-Resistenzen festgestellt (HENDRIKSEN et al. 2008, EL GARCH
et al. 2016). Eine weitere Studie zeigte ein - wenn auch geringes - Vorkommen von
Gentamicin- (1,3%) und Spectinomycin- (3,6%) Resistenzen, sowie Resistenzraten
von 6% für Trimetroprim/Sulfamethoxazol. Die Resistenzrate für Tetracyclin lag auch
in dieser Studie über 75% (WISSELINK et al. 2006). In Spanien zeigten sich mehr
als 95% der untersuchten Stämme resistent gegenüber Tetracyclin und 75%
gegenüber Erythromycin (VARELA et al. 2013). In Deutschland waren 90%
gegenüber Tetracyclin resistent (VARELA et al. 2013). Die in den vergangenen
Jahrzehnten angestiegenen Resistenzraten gegenüber Tetracyclinen, Makroliden
und Lincosamiden werden mit einem großflächigen Einsatz dieser Antibiotika in der
Tierhaltung in Verbindung gebracht (VELA et al. 2005, VARELA et al. 2013). So
wurde z.B. Tylosin, ein Makrolidantibiotikum, in Dänemark lange Zeit als
Wachstumsförderer eingesetzt (AARESTRUP 1999) und auch Tetracyclin wurde
massenhaft in der Schweineindustrie eingesetzt (AARESTRUP 1999, VAN
RENNINGS et al. 2015, OH et al. 2017).
Literaturübersicht
40
Weltweit wird das Thema Antibiotikaresistenzen mittlerweile auch politisch sehr ernst
genommen und verschiedene Agenden wurden initiiert. Die WHO und die
Europäische Kommission sprachen sich in der Vergangenheit für ein validiertes,
harmonisiertes und kontinuierliches Resistenz-Monitoring aus (WHO 2015,
EUROPEAN COMMISSION 2011). Dazu ist es notwendig, dass die Datenerhebung
über ein gut erprobtes, weltweit einheitliches und vergleichbares Verfahren
stattfindet. Für die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung gilt die MHK-Bestimmung als
Goldstandard (EL GARCH et al. 2016). Für die weitere Vergleichbarkeit sollte die
Interpretation der MHK-Werte auch einheitlich nach festgelegten Grenzwerten
erfolgen. Im Zuge des Veth-Path-Projektes wurde neben anderen Erregern des
Respirationstraktes auch S.-suis-Isolate aus verschiedenen europäischen Ländern
im Mikrodilutionsverfahren untersucht. Die erste Studie enthielt Isolate aus den
Jahren 2002 bis 2006, die Folgestudie Isolate von 2009 bis 2012
(DE JONG et al. 2014, EL GARCH et al. 2016). Die Interpretation der MHK-Werte im
Veth-Path-Projekt erfolgte anhand der CLSI-Grenzwerten (EL GARCH et al. 2016).
Bei sehr vielen Antibiotika sind aber u.a. für S. suis bisher gar keine Grenzwerte
definiert worden. In diesen Fällen ist es sinnvoll, die MHK-Wert-Verteilungen zu
veröffentlichen, wie es in einigen Studien zu sehen ist (VELA et al. 2005, DE
JONG et al. 2014, EL GARCH et al. 2016, OH et al. 2017). Das Gesamtfazit der
Datenerhebungen aus dem Veth-Path-Projekt zu S. suis war, dass sich die
Resistenzlage des Erregers über den untersuchten Zeitraum kaum verändert hat
(EL GARCH et al. 2016). Die regelmäßige Untersuchung und Überwachung der
Resistenzentwicklung bei S. suis ist enorm wichtig. Sie ermöglicht nicht nur die Wahl
eines geeigneten Antibiotikums zur Therapie, sondern auch die bessere
Einschätzung des Risikos eines Therapieversagens beim Menschen
(VARELA et al. 2013).
Für den Fall der Infektion einzelner Schweine in einer Herde sollte ein vorher gut
überlegtes und geplantes Handlungsprotokoll vorliegen. Je nach Situation sollte
entschieden werden, ob Einzeltiere behandelt werden (parenteral) oder ob die
gesamte Gruppe mittels Antibiotikagabe über das Futter oder das Wasser behandelt
wird (VARELA et al. 2013). Letzteres empfiehlt sich, wenn mehrere Tiere erkrankt
sind und ein akuter Ausbruch mit ZNS-Symptomatik und/oder plötzlichen Todesfällen
vorliegt, um der Infektion der anderen Tiere vorzubeugen. Für die initiale Behandlung
empfehlen sich β-Laktam-Antibiotika wie Penicillin G oder Amoxicillin
Literaturübersicht
41
(BYRA et al. 2011). Dennoch sollte unverzüglich eine vollständige Diagnostik mit
Isolierung und Kultivierung des Erregers stattfinden und eine
Antibiotika-Resistenztestung durchgeführt werden (REAMS et al. 1993,
BUNDESTIERÄRZTEKAMMER 2015). Nach dem Ergebnis der Resistenztestung
richtet sich die Auswahl eines geeigneten Antibiotikums für die weitere Therapie.
Weiterhin sollte bei der Wahl des Antibiotikums darauf geachtet werden, ob eine
Zulassung für die vorliegende Erkrankung und Tierart besteht. Für die Art der
Applikation ist die Pharmakokinetik des Präparates entscheidend
(VARELA et al. 2013). Eine zusätzliche Begleittherapie mit entzündungshemmenden
und schmerzlindernden Medikamenten ist indiziert (MACINNES u. DESROSIERS
1999).
2.7 Prävention und Vakzinierung
Vor dem Hintergrund der steigenden Antibiotika-Resistenzen und der damit
verbunden Konsequenz, den Antibiotikaeinsatz zukünftig radikal minimieren zu
müssen, rückt die Vakzinierung als alternative Therapie bzw. Prävention vermehrt in
den Fokus der S.-suis-Forschung. Bisher ist es allerdings noch nicht gelungen eine
Vakzine zu entwickeln, die den heterogenen Erreger S. suis in seiner weltweiten
Ausbreitung effektiv bekämpfen kann (SEGURA 2015). Neben wenigen kommerziell
erhältlichen Impfstoffen werden viel häufiger autogene Vakzinen hergestellt und
verwendet. Dabei handelt es sich in der Regel um Ganzell-Vakzinen. Es existieren
Impfschemata sowohl für die Muttersauen als auch für die Ferkel selbst. Eine
passive Immunität durch maternale Antikörper sollte durch die aktive Immunisierung
der Ferkel unterstützt werden, da ansonsten ab spätesten sechs Wochen nach der
Geburt kein ausreichender Schutz besteht (BAUMS et al. 2010, SEGURA 2015). Der
Erfolg der Vakzinierung von Saug- oder Absatzferkeln kann allerdings maßgeblich
durch maternale Antikörper reduziert werden (BAUMS et al. 2010). Vor diesem
Hintergrund gilt es das Impfprogramm an den betreffenden Betrieb anzupassen. In
den meisten Fällen wird im Feld eine zweifache intramuskuläre Vakzinierung der
Ferkel im Abstand von circa 14 Tagen durchgeführt (SEGURA 2015). Die
Wirksamkeit der Impfungen wird jedoch als sehr unterschiedlich beschrieben und ein
Impfversagen ist nicht selten (REAMS et al. 1996, HALBUR et al. 2000, SEGURA
2015). Teilweise gab es sogar widersprüchliche Ergebnisse mit denselben Vakzine-
Literaturübersicht
42
Kandidaten. Diese resultierten aber ggf. daraus, dass die Methoden zu Messung des
Impfschutzes nicht standardisiert sind (ESGLEAS et al. 2009, FENG et al. 2009).
Für die Herstellung einer erfolgreichen stallspezifischen Vakzine ist es besonders
wichtig im Voraus den virulenten Bakterienstamm in der Herde zu identifizieren und
möglichst genau bezüglich seiner Antigenstruktur (Kapselpolysaccharid und
mögliche immunogene Proteine wie MRP, EF oder auch Suilysin) zu
charakterisieren. Weiterhin beeinflussen die Art der Totimpfstoffherstellung sowie
das Adjuvans oder auch die Art der Applikation die Wirksamkeit der Vakzine
(SEGURA 2015). Eine starke Einschränkung der Effizienz dieser Art der Prophylaxe
bedeutet die Tatsache, dass bisher durch eine Impfung keine Kreuz-Protektion
gegenüber verschiedenen S.-suis-Stämmen besteht (BAUMS u. VALENTIN-
WEIGAND 2009). Mit einer konjugierten Serotyp-2-CPS-Vakzine konnten hohe
Antikörpertiter im Schwein erreicht werden. Diese waren jedoch Serotyp-2-spezifisch
und schützten im Belastungsversuch nicht gegen einen Serotyp-9-Stamm
(BAUMS et al. 2009, BAUMS u. VALENTIN-WEIGAND 2009). Eine Subunitvakzine,
die MRP und EF enthielt, zeigte Schutz gegen MRP- und EF-positive Serotyp-2-
Stämme. Viele andere invasive Stämme bilden diese Proteine aber nicht aus und
waren somit für die Vakzine nicht empfindlich (WISSELINK et al. 2001). Auch
Subunitvakzinen bestehend aus anderen Antigenen, wie z.B. Suilysin, zeigten
Schutz gegen Serotyp-2-Stämme. Diese waren jedoch nie wirksamer als die
Ganzzell-Vakzine (BÜTTNER et al. 2012).
Im Gegensatz zur relativen guten Wirksamkeit der Serotyp-2-Vakzinen, zeigten
bisherige Studien mit Serotyp-9-Ganzzellvakzinen, sowohl gegenüber dem
homologen Stamm, als auch gegenüber einem heterologen Stamm aus demselben
CC, nur sehr begrenzten oder sogar gar keinen Schutz (BÜTTNER et al. 2012,
DEKKER et al. 2012). Lediglich die Mortalität konnte durch die Impfung gesenkt
werden. Aber weder die Kolonisierung des Erregers im Wirt, noch die Erkrankung der
Tiere, noch die Übertragung des Erregers konnte durch eine Impfung vermieden
werden (DEKKER et al. 2012). Dieses Impfversagen war vermutlich damit zu
erklären, dass die Serotyp-9-Vakzine im Gegensatz zur Serotyp-2-Vakzine nur eine
geringe Antikörper-Produktion auslöste (BÜTTNER et al. 2012). Diese
Studienergebnisse passen laut BÜTTNER et al. (2012) mit den Meldungen über
persistierende oder rezidivierende Serotyp-9-Infektionen in Europa, die trotz
Vakzinierung mit autogenen Vakzinen auftreten, zusammen.
Literaturübersicht
43
Insgesamt bleibt es eine bisher ungelöste Herausforderung eine Vakzine zu
entwickeln, die einen Schutz gegen gleich mehrere der verschiedenartigen
S.-suis-Stämme bieten kann, da der Erreger selbst innerhalb eines Serotyps
ausgesprochen vielgestaltig ist (SEGURA 2015). Für Serotyp-2-Vakzinen wurde
zwar schon beschrieben, dass durchaus ein Schutz gegen heterologe Stämme
besteht, diese gehörten aber zum gleichen Sero- und Pathotyp bzw. ST
(WISSELINK et al. 2001).
Für eine geeignete Prophylaxe bleibt weiterhin zu beachten, dass neben der Virulenz
des Bakterienstammes auch andere Faktoren eine Rolle für die Ausprägung der
Erkrankung und deren Ausbreitung in der Herde spielen, so z.B. der Immunstatus
des Wirtes, der Kontakt zwischen infizierten und nicht-infizierten Tieren im Bestand,
Immunsuppression durch andere Infekte (z.B. mit PRRSV) oder Stressfaktoren
(Überbelegung, schlechtes Stallklima), sowie andere Umgebungs- und
Managementfaktoren. Diese Faktoren gilt es zu minimieren, um einem Ausbruch
vorzubeugen (GOTTSCHALK 2012). Ein Rein-Raus-Verfahren mit regelmäßigen
Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen des Stalls und der Geräte, eine
Schadnager und Parasitenbekämpfung, sowie die Supplementierung von Vitamin E
und Selen sind Möglichkeiten der Vorbeugung (DEE et al. 1993).
Material und Methoden
45
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Chemikalien, Nährmedien, Pufferlösungen, Verbrauchsmaterial und Geräte
Alle in der vorliegenden Arbeit verwendeten Materialien, Geräte und
Software-Programme sind im Anhang in den Tabellen 13-18 aufgelistet.
3.1.2 Herkunft der verwendeten S.-suis-Isolate
Zwischen dem 24.04.2015 und dem 05.12.2016 wurden für die vorliegende Arbeit
S.-suis-Isolate aus verschiedenen Quellen akquiriert. Zum einen wurden alle Isolate
aus Probeneinsendungen zur Routine-Diagnostik ins Institut für Mikrobiologie der
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verwendet. Dabei wurde S. suis nicht nur
in klinisch relevanten Fällen isoliert, sondern zum Teil auch als Begleitkeim ohne
augenscheinliche klinische Bedeutung gewonnen. Zum anderen wurden speziell für
diese Arbeit Probennahmen angefordert. Zuletzt wurden auch einige Isolate anderer
Labore integriert, die zur Typisierung eingesandt worden waren.
Die Identifizierung als S. suis erfolgte anhand der kulturellen Eigenschaften und der
im Weiteren beschriebenen PCR-Methoden. Dieser Arbeit lag kein spezifischer
Beprobungsplan zu Grunde. Die S.-suis-Isolate aus der oben beschriebenen
Sammlung wurden für die vorliegende Arbeit berücksichtigt, wenn Angaben zum
Probenmaterial und zur Herkunft bekannt waren und die Isolate aus der
Bundesrepublik Deutschland stammten. Eingesendet wurden die Isolate von 56
Praxen und Laboren aus der Bundesrepublik Deutschland. Bei mehrfacher oder sich
wiederholender Einsendung von S.-suis-Isolaten aus demselben Betrieb wurde nur
ein Isolat für diese Arbeit berücksichtigt, sobald die Isolate den gleichen Kapseltyp
und die gleichen Virulenzgene in der Untersuchung mittels PCR zeigten. Dadurch
sollte verhindert werden, dass die Bewertung der Serotypen-Verteilung durch die
Häufigkeit der Probennahmen beeinflusst wird.
Um die aktuellen Serotyp-Prävalenzen von S. suis in Deutschland epidemiologisch
zu beurteilen, erfolgte ein Vergleich mit der Sammlung von SILVA et al. 2006. In der
Material und Methoden
46
genannten Studie waren insgesamt 210 S.-suis-Isolate aus Deutschland, Österreich
und Holland aus den Jahren 1996 bis 1998 (n=72) und 2001 bis 2004 (n=138) aus
dem Routinebetrieb der diagnostischen Mikrobiologie gesammelt worden. Die Studie
wurde wie die vorliegende Studie am Institut für Mikrobiologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Dementsprechend beinhaltete die
Isolate-Sammlung insgesamt vorrangig Isolate aus Einsendungen an die hiesige
Diagnostikabteilung.
Im Nachhinein wurden die Isolate anhand ihres Isolationsortes im Wirt und der
Hintergrundinformationen zur Klinik in verschiedene Gruppen eingeteilt
(vgl. Abbildung 2). Wie einleitend erwähnt findet eine erste Besiedlung des Wirtes
Schwein in erster Linie naso-pharyngeal statt. Wurden S.-suis-Isolate aus den
Nasenhöhlen oder von den Tonsillen gewonnen, während die Tiere keinerlei
Symptome einer S.-suis-Infektion zeigten, so wurden diese als Carrier-Isolate
eingestuft. Dass sich darunter nicht nur avirulente, sondern auch potentiell
invasionsfähige Stämme befanden, ist zu vermuten, denn bei der Manifestation einer
S.-suis-Infektion spielt neben der Virulenz des Bakterienstamms auch die
Abwehrlage des Wirtes eine Rolle. Zu der Gruppe der Carrier-Isolate wurden
weiterhin auch die von der Genitalschleimhaut der Schweine isolierten Stämme
gezählt, sofern die Tiere asymptomatisch waren.
Wurden die Isolate aus Bronchial- oder Lungengewebe gewonnen, während das Tier
Zeichen einer (Broncho-) Pneumonie, aber gleichzeitig keine Anzeichen für eine
Invasion des Erregers in tiefere Organsysteme via Blutbahn zeigte, so wurden diese
in die Gruppe der potentiell Lungen-pathogenen S.-suis-Isolate eingeordnet. Hierbei
kann aber nicht sicher davon ausgegangen werden, dass das jeweilige S.-suis-Isolat
überhaupt an dem Lungen-pathogenen Geschehen beteiligt war oder ob andere
Erreger oder nicht-infektiöse Faktoren ursächlich waren. Dies kann nur angenommen
werden.
Die dritte Gruppe umfasste alle invasiven systemischen Isolate, d.h. all diejenigen,
die über die Besiedlung des Lungengewebes hinaus in den Blutkreislauf des Wirtes
gelangt waren und von dort aus ggf. auch in andere Organsysteme vorgedrungen
waren. So waren in dieser Gruppe Isolate aus dem ZNS, aus den Gelenken, aus
dem Herz, aus dem Blut oder aus anderen inneren Organen wie Milz und Leber
enthalten. Diese Gruppe ist auf Grund ihrer Isolierungsorte am klarsten definiert,
Material und Methoden
47
denn nur tatsächlich invasive Isolate erreichen die benannten Organe. Eine
dementsprechende Einteilung wurde für die in der Studie von SILVA et al. 2006
enthaltenen Isolate bereits durchgeführt. Die damalige Zuordnung der Isolate wurde
übernommen.
Abbildung 2: S.-suis-Invasionsschema A: Carrier-Isolate B: Lungen-Isolate C: invasive Isolate
Material und Methoden
48
3.1.3 Referenz- und Kontrollstämme
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Referenz- und Kontrollstämme sind im
Anhang in Tabelle 19 und 20 aufgelistet.
3.1.4 Oligonukleotide (Primer)
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Primer sind im Anhang in Tabelle 21
aufgelistet. Bestellt wurden die Primer bei eurofins Genomics.3 Die einzelnen Primer
wurden auf eine Endkonzentration von 100 µM in sterilem Wasser aufgelöst und bei -
20°C gelagert.
3.2 Methoden
3.2.1 Kulturelle Verfahren und Asservierung
Die in der Routine-Diagnostik identifizierten S.-suis-Isolate, sowie zum Teil
S.-suis-verdächtige Isolate, wurden für diese Arbeit ausgewählt und gesammelt.
Dazu wurden die Erreger auf Blutagar kultiviert. Die Kulturen wurden 24 Stunden,
nach Bedarf auch 48 Stunden, aerob bei 37°C bebrütet. In Einzelfällen war eine
mikroaerophile Bebrütung angezeigt. Damit die Isolate für mögliche weitere
Untersuchungen zu Verfügung standen, wurden diese als Gyzerinkulturen bei -80°C
asserviert. Reinheitskontrollen wurden jeweils durchgeführt.
3.2.2 Serotypisierung im Koagglutinationsverfahren
Ein Teil der in der vorliegenden Arbeit verwendeten S.-suis-Isolate wurde
phänotypisch im Koagglutinationsverfahren untersucht. Diese Untersuchungen führte
unsere Kooperationspartnerin Dr. Hilde Smith in Wageningen, Niederlande, durch.
Untersucht wurde mit Antiseren für Serotyp 1/2 und 1-28, da für die seltener
vorkommenden Serotypen 29-34 keine Antiseren zur Verfügung standen.
3 https://www.eurofinsgenomics.eu
Material und Methoden
49
3.2.3 Transmissionselektronenmikroskopie
Die nicht-typisierbaren Isolate aus der vorliegenden Arbeit wurden mittels
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) hinsichtlich ihrer phänotypischen
Kapselausbildung untersucht. Die Untersuchungen wurden in Kooperation mit Prof.
Manfred Rohde am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH in
Braunschweig durchgeführt. Anhand der entstandenen Aufnahmen wurde eine
vergleichende Bewertung der Kapseldicke und -dichte und eine daraus resultierende
Gesamtbewertung der Kapsel bei den einzelnen Isolaten vorgenommen. Die
Bewertung geschah im Vergleich mit einem Serotyp-2-Referenzstamm (St10) sowie
dessen unterschiedlichen kapsellosen Mutanten (10ΔccpA, 10ΔcpsEF) sowie der
komplementierten Kapsel-Mutante (c10ΔccpA). Jene wurden im Zuge der Studie von
WILLENBORG et al. (2011) nach der gleichen Methode, durch den gleichen
Untersucher, am gleichen Untersuchungsort und nach dem gleichen Protokoll
untersucht (Abbildung 14).
3.2.4 Molekularbiologische Methoden
3.2.4.1 S.-suis-ID-PCR
Die phänotypisch für S. suis verdächtigen Kulturen wurden routinemäßig im
Diagnostikbetrieb des Instituts für Mikrobiologie mit einer Multiplex-PCR untersucht.
Diese diente zum Nachweis der Spezies S. suis mittels gdh-Nachweis und dem
Nachweis der gegebenenfalls zusätzlich vorhandenen Virulenz-Marker epf, sly, mrp
und arcA. Das Verfahren basiert auf der von SILVA et al. 2006 publizierten Multiplex-
PCR und benutzt die dort veröffentlichten Primersequenzen. Für die vorliegende
Studie wurden die routinemäßig generierten Ergebnisse aus dieser PCR miterfasst
und in einigen Fällen wurden die zusätzlich für die vorliegende Studie eingesendeten
Isolate auch mit dieser Methode untersucht.
Material und Methoden
50
3.2.4.2 Multiplex-PCR in zwei Schritten zur Identifizierung von S. suis sowie zum Nachweis der Serotypen 1/2 und 1-34
3.2.4.2.1 Vorbereitung
Die zu untersuchenden Isolate wurden jeweils als Reinkultur über Nacht aerob oder
bei Bedarf mikroaerophil bei 37°C auf Blutagar als dreifach fraktionierter Ausstrich
angezüchtet. Von der gewachsenen Reinkultur wurde am Folgetag wenig
Koloniematerial mit einer sterilen Einmalimpföse in 300 µl hochreinem, DNA-freien
Wasser im 1,5-ml-Eppendorf-Gefäß suspendiert, bis eine gerade sichtbare Trübung
entstand, die ungefähr dem McFarland-Standard von 0,5 entsprach. Die Probe
wurde anschließend 10 Minuten bei 100 Watt in der Mikrowelle aufgekocht.
Anschließend wurden die Bakterienlysate wiederum 10 Minuten bei -80 °C Schock
gefroren und danach wieder bei Raumtemperatur aufgetaut, um die Bakterienzellen
noch effektiver aufzuschließen, sodass die DNA als Template für die PCR frei lag.
Die PCR wurde auf Eis ansetzt, wenn mehr als zehn Proben bearbeitet wurden.
Es wurden zwei getrennte PCRs, die sogenannte S.-suis-grouping-PCR und die
sogenannte S.-suis-typing-PCR, angesetzt, die im Folgenden beschrieben werden.
3.2.4.2.2 Primer und Primer-Premixe
Die in den PCRs verwendeten Primer und Primer-Premixe sind Tabelle 21 und 22 zu
entnehmen. Die Gruppen- und Serotyp-spezifischen Primersequenzen beruhen auf
denen von OKURA et al. (2014). Um eine Speziesdiagnose zu integrieren, wurde ein
Primerpaar für ein 1247 bp großes recN-Fragment entworfen. Das von
ISHIDA et al. (2014) genutzte 336 bp große recN-Fragment eignete sich aufgrund
der Größenähnlichkeit zu anderen Fragmenten in der PCR nicht zur Integration in die
S.-suis-grouping-PCR.
3.2.4.2.3 S.-suis-grouping-PCR
Die S.-suis-grouping-PCR diente zur Identifizierung der „wahren“ S.-suis-Isolate
mittels Nachweis des Haushaltsgens recN und gleichzeitig zur Eingruppierung des
Isolats in eine von sieben übergeordneten Serotypen-Gruppen. Zunächst wurde das
jeweilige PCR-Protokoll mit den Probenbezeichnungen ausgefüllt und die Mengen
Material und Methoden
51
der einzelnen Reagenzien wurden errechnet. Die Mengenangaben der einzelnen
Reagenzien sind Tabelle 1 zu entnehmen. Die Reagenzien wurden in der
Reihenfolge der Tabelle von oben nach unten zusammen pipettiert, wobei die
Polymerase zuletzt hinzu gegeben wurde. Von diesem vorbereiteten Mastermix
wurden je 20 µl auf die vorbereiteten PCR-„Hütchen“ aufgeteilt. Anschließend
wurden je 5 µl des jeweiligen Bakterienlysates als Template hinzu pipettiert. Als
Positivkontrolle wurde ein vorbereiteter gDNA-Mix verwendet, der aus der gDNA der
Referenzstämme hergestellt wurde. Als Negativkontrolle wurde hochreines, DNA-
freies Wasser verwendet.
Tabelle 1: Mengenangaben der Reagenzien in der S.-suis-grouping-PCR S.-suis-grouping-PCR
Substanz Menge je Probe in µl Steriles Wasser 9,4 µl
5x Phusion® HF Buffer 5 µl
dNTP 0,5 µl
Primer-Premix-grouping 5 µl
Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase 0,1 µl
DNA-Template 5 µl
Das Cycler-Programm für die S.-suis-grouping-PCR beinhaltete folgende Schritte:
1. Initialisierung bei 94 °C für 3 min
2. Denaturierung bei 94°C für 30 sec
3. Primer-Annealing bei 60 °C für 90 sec
4. Elongation bei 72°C für 45 sec
5. Finale Elongation bei 72°C für 5 min
Schritt 2 bis 4 wurden 30-mal wiederholt. Zuletzt erfolgte ein Herabkühlen auf 10 °C.
3.2.4.2.4 S.-suis-typing-PCR
Nach Auswertung der S.-suis-grouping-PCR wurde eine zweite PCR, die S.-suis-
typing-PCR, zur exakten Bestimmung des Kapseltyps durchgeführt. Je nachdem, in
welche übergeordnete Gruppe das Isolat in der S.-suis-grouping-PCR eingeordnet
wurde, folgte eine der Gruppen-spezifischen S.-suis-typing-PCRs I bis VII. Für jede
dieser S.-suis-typing-PCRs wurde im Vorfeld ein eigener Primer-Premix vorbereitet.
Material und Methoden
52
Der Ansatz der Reagenzien ist Tabelle 2 zu entnehmen. Er erfolgte in gleicher Art
wie für die S.-suis-grouping-PCR. Für jede der sieben unterschiedlichen
S.-suis-typing-PCRs wurde ein speziell dafür vorbereiteter gDNA-Mix als
Positivkontrolle verwendet.
Tabelle 2: Mengenangaben der Reagenzien in der S.-suis-typing-PCR S.-suis-typing-PCR
Substanz Menge je Probe in µl Steriles Wasser 9,4 µl
5x Phusion® HF Buffer 5 µl
dNTP 0,5 µl
Primer Premix typing I, II, III, IV, V, VI oder VII 5 µl
Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase 0,1 µl
DNA-Template 5 µl
Das Cycler-Programm entsprach dem der S.-suis-grouping-PCR außer der
Annaeling-Temperatur, die hier 58 °C betrug.
3.2.4.2.5 Gelelektrophorese
Wenn nicht anders erwähnt, wurden die PCR-Produkte in dieser Arbeit in einem
2%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid (0,0002 mg/ml Endkonzentration) in einem
0,5xTBE-Puffer inklusive Ethidiumbromid (0,0002 mg/ml Endkonzentration)
aufgetrennt und sichtbar gemacht. Die PCR-Produkte wurden mit einem 6xDNA-
Ladepuffer versetzt und jeweils 12 µl des Proben-Ladepuffer-Gemischs mit einer
Pipette in eine Geltasche appliziert. Für circa 15 Proben wurde jeweils eine DNA-
Leiter mitgeführt. Anschließend an die Beladung des Gels wurde die Gelkammer
geschlossen und eine Spannung von 180 V bei 400 mA angeschlossen. Die
beladenen Bereiche des Agarosegels wurden nach 80 min unter UV-Licht mittels
Geldokumentationgerät ausgewertet und dokumentiert.
Material und Methoden
53
3.2.4.2.6 Auswertung der S.-suis-grouping-PCR
Die Auftrennung der PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese und die
Dokumentation der Resultate erfolgten wie oben beschrieben. Zur Beurteilung der
Bandenmuster kann Tabelle 3 herangezogen werden.
Tabelle 3: Beurteilung der Amplifikate in der S.-suis-grouping-PCR (OKURA et al. 2014) Größe des Amplikons
(bp) Gen Beurteilung
1542 bis 1553 16S rRNA Interne Amplifikations-Kontrolle
1247 recN DNA-Reparaturprotein: alle „wahren“ S. suis-Serotypen (negativ bei Serotyp 20, 22, 26, 32, 33, 34)
933 cps3G, cps13G, cps18G Gruppe I (Serotyp 3, 13, 18)
823 cps1Q, cps1/2P, cps2P, cps6Q, cps14P, cps16R, cps27P
Gruppe II (Serotyp 1, 2, 1/2, 6, 14, 16, 27)
583 und 146 cps21R, cps28P, cps29Q, cps30N Gruppe III (Serotyp 21, 28, 29, 30)
455 ps4F-G, cps5F-G, cps7F-G, cps17G-H, cps19G-H, cps23F-G
Gruppe IV (Serotyp 4, 5, 7, 17, 19, 23)
264 cps8E, cps15E, cps20E, cps22E, cps25E Gruppe V (Serotyp 8, 15, 20, 22, 25)
146
Gruppe III: cps21G, cps28F, cps29G, cps30F
Gruppe VI: cps9F, cps10F, cps11F, cps12F,
cps24G, cps26H, cps33G
Gruppe III (Serotyp 21, 28, 29, 30)
Gruppe VI (Serotyp 9, 10, 11, 12, 24, 26, 33)
kein cps-Genfragment Gruppe VII (Serotyp 31, 32, 34)
Voraussetzung für eine Zuordnung zur Spezies S. suis war der positive Nachweis
von 16S rRNA. Aber auch nicht S.-suis-Spezies können ein Amplifikat zeigen. Der
Nachweis dieses Genfragmentes diente nur als interne Amplifikationskontrolle. Bei
allen bekannten Serotypen außer den Serotypen 20, 22, 26, 32, 33, 34 musste aus
diesem Grund zusätzlich recN nachweisbar sein. Die Proben zeigten je nach cps-
Gruppe, in die sie gehören, eine bzw. zwei (Gruppe III) spezifische Banden. Nur für
Gruppe VII wurde kein spezifisches cps-Fragment amplifiziert. Alle S.-suis-
verdächtigen Proben mussten, wenn sie in der S.-suis-grouping-PCR nur 16S rRNA
nachweisbar war, in der S.-suis-typing-PCR Gruppe VII getestet werden, unabhängig
davon ob recN nachweisbar war oder nicht, denn Serotyp 32 und 34 haben kein
recN. Allerdings werden diese beiden Serotypen nach aktuellem Wissensstand nicht
mehr zur Spezies S. suis gezählt, sondern wurden als Streptococcus orisratti
reklassifiziert (HILL et al. 2005). Isolate der Serotypen 20, 22, 26 und 33 sollten
Material und Methoden
54
ebenso keine recN-Bande aufweisen. Auch sie werden nicht mehr
zu den „wahren“ S.-suis-Serotypen gezählt (LE TIEN et al. 2013, ISHIDA et al. 2014,
NOMOTO et al. 2015). Zur Auswertung kann das Schema aus Abbildung 3 benutzt
werden.
Abbildung 3: Schema der S.-suis-grouping-PCR M: Molecular Weight Marker (DNA-Leiter für die Gelelektrophorese) Pg: Positivkontrolle für die S.-suis-grouping-PCR I: Gruppe I (Kapseltypen 3, 13, 18) II: Gruppe II (Kapseltypen 1, 2, 1/2, 6, 14, 16, 27) III: Gruppe III (Kapseltypen 21, 28, 29, 30) IV: Gruppe IV (Kapseltypen 4, 5, 7, 17, 19, 23) V: Gruppe V (Kapseltypen 8, 15, 20a, 22a, 25) VI: Gruppe VI (Kapseltypen 9, 10, 11, 12, 24, 26a, 33a) VII: Gruppe VII (Kapseltypen 31, 32a, 34a) a kein recN-Amplifikat (1247 bp)
3.2.4.2.7 Auswertung der S.-suis-typing-PCR
Wieder sollte bei allen Proben 16S rRNA nachweisbar sein. Dieses Amplifikat diente
wie in der grouping-PCR als interne Kontrolle. Anhand der spezifischen cps-Bande
konnte der Kapsel-, respektive Serotyp bestimmt werden. Als Serotyp-spezifisch hat
sich das Gen für die Wzy-Polymerase erwiesen, weshalb dieses als Zielgen in der
typing-PCR benutzt wird (OKURA et al. 2014). Bei der Bestimmung der Kapseltypen
muss angemerkt werden, dass Serotyp 2 und Serotyp 1/2 dieselbe cps-Bande
Material und Methoden
55
haben, da ihre cps-Genloci nahezu identisch sind. Aus dem gleichem Grund haben
Serotyp 1 und 14 dieselbe cps-Bande (OKURA et al. 2014). Für die Serotypen 32, 33
und 34 wurde zusätzlich zum wzy-Gen noch jeweils ein weiteres cps-Gen als Zielgen
integriert, sodass der Nachweis des Kapseltyps hierbei über jeweils zwei Banden
erfolgte.
Zeigte ein Isolat sowohl in der grouping-PCR als auch in der typing-PCR Gruppe VII
nur eine 16S-rRNA-Bande, dann wurde es als nicht zur Spezies S. suis zugehörig
beurteilt, da weder ein Kapseltyp noch das speziesspezifische Gen recN
nachgewiesen werden konnte. War zwar recN, aber in der typing-PCR keine
Serotyp-spezifische cps-Bande nachweisbar, dann wurde das Isolat als nicht-
typisierbares S.-suis-Isolat beurteilt.
Da an der typing-PCR im Vergleich zu OKURA et al. (2014) keine Modifikationen
bezüglich Zielgenen und Primer vorgenommen wurden, kann die Auswertung
anhand deren Schemas vorgenommen werden (vgl. Abbildung 4).
Abbildung 4: Schema der S.-suis-typing-PCR nach OKURA et al. (2014)
3.2.4.2.8 Positivkontrollen
Um als Positivkontrolle nicht die jeweils möglichen Serotypen als Referenzstämme
einzeln mitführen zu müssen, wurde die genomische DNA (gDNA) der
Material und Methoden
56
Referenzstämme vom Serotyp 1-34 extrahiert und für die jeweilige PCR ein gDNA-
Mix hergestellt, der als Positivkontrolle mitgeführt wurde. Die gDNA wurde durch
Phenol-Chloroform-Extraktion gewonnen.
Für den gDNA-Mix-grouping wurden die gDNAs von je einem exemplarischen
Serotyp pro Gruppe mit hochreinem Wasser mit einer jeweiligen Konzentration von
0,2 ng/µl zusammen pipettiert, in 5 µl Aliquots für jeweils eine PCR-Reaktion
aufgeteilt und bei -20 °C asserviert. Für die gDNA-Mix-typing der Gruppen I bis VII
wurden die gDNAs der Serotypen aus der jeweiligen Gruppe nach gleichem Schema
zusammen pipettiert. Sowohl die gDNA als auch die gDNA-Mixe sollten nicht mit
einem Reagenzglasschüttler, sondern nur durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren
durchmischt werden, da die empfindliche gDNA sonst durch die Scherkräfte
degradieren könnte.
Da in der S.-suis-typing-IV-PCR bei der Verwendung des gDNA-Mixes kein
Amplifikat für Serotyp 4 entstand, mussten für diesen Serotyp jeweils 10 ng der
gDNA oder alternativ das Bakterienlysat des Referenzstammes als zusätzliche
Positivkontrolle mitgeführt werden (vgl. Abbildung 5).
3.2.4.2.9 Phenol-Chloroform-Extraktion zur Gewinnung bakterieller gDNA
Die gDNA der Referenzstämme von Serotyp 1-34 wurde extrahiert, um zum einen
die beschrieben Multiplex-PCR im hiesigen Labor zu etablieren, und zum anderen,
um für die jeweilige PCR gDNA-Mixe als Positivkontrolle vorzubereiten. Dazu wurden
zunächst die 34 Referenzstämme (Tabelle 19) auf Blutagar kultiviert. Von diesen
Kulturen wurden jeweils wenige Kolonien unter sterilen Bedingungen in 10 ml THB-
Boullion überimpft. Die Flüssigkulturen wurden bei 37°C unter aeroben Bedingungen
über Nacht inkubiert. Der Deckel des Kulturröhrchens wurde nur locker verschlossen,
sodass eine Luftzufuhr möglich war. Am Folgetag wurden die Kulturen zentrifugiert,
das Bakterienpellet gewonnen und in 550 µl 2xTEN-Puffer inklusive Lysozym und
10 µl RNase A resuspendiert. Nach 30 Minuten Inkubation im Wasserbad bei 37°C
wurden jeweils 15 µl 20%iges SDS und 10 µl Proteinase K zugegeben und sehr
vorsichtig gemischt, um ein Scheren der DNA zu vermeiden. Es folgte eine weitere
Stunde im Wasserbad bei 37°C. Anschließend wurden jeweils 125 µl 4 M NaCl-
Lösung und 80 µl auf 50°C erhitztes 1%iges CTAB hinzugegeben, gemischt bis eine
Material und Methoden
57
homogene milchige Trübung entstanden war und für 10 Minuten bei 65 °C im
Wasserbad erhitzt.
Zur Trennung von DNA und den denaturierten Proteinen wurden jeweils 780 µl
Chloroform/Isoamylalkohol hinzugegeben und vorsichtig gemischt. Die Ansätze
wurden zentrifugiert. Es waren dann zwei Phasen sichtbar, die durch einen dünnen
weißen Film getrennt waren. Die obere visköse durchsichtige Phase, in der die gDNA
enthalten war, wurde vorsichtig unter dem Abzug mit einer Pipette abgenommen und
in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die Restflüssigkeit wurde verworfen. Dieser
Trennungsvorgang wurde weitere zwei Mal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
wiederholt, um die gDNA gründlich von den denaturierten Proteinen frei zu waschen.
Zuletzt wurden zur Fällung der gDNA jeweils 500 µl Isopropanol hinzugegeben und
es folgte eine weitere Zentrifugation. Anschließend wurde der Überstand verworfen.
Es schlossen sich wiederum ein Waschschritt in 70%igem Ethanol und ein weiterer
Zentrifugationsschritt an. Der Überstand wurde abgesaugt und übrig blieb ein
kleines, z.T. mit bloßem Auge nicht erkennbares gDNA-Pellet, was unter der sterilen
Werkbank Luft getrocknet wurde. Anschließend wurde die gDNA in 50 µl hochreinem
Wasser aufgenommen. Die jeweilige Konzentration der gDNA wurde mit einem
Mikroplatten-Spektralphotometer bestimmt. Es wurden 10 ng/µl Gebrauchslösungen
hergestellt.
3.2.4.2.10 Multi-Locus-Sequenz-Typisierung (MLST)
Mit Hilfe der MLST wurden in der vorliegenden Studie nur diejenigen Isolate
untersucht, denen mittels PCR kein Kapseltyp zugeordnet werden konnte. Diese
Isolate sollten mit Hilfe dieser Untersuchung näher charakterisiert werden und ihre
Verwandtschaft untereinander und zu anderen S.-suis-Isolaten, die in die MLST-
Datenbank integriert sind, sollte analysiert werden.4 Für die Durchführung wurde sich
an dem für S. suis publizierten MLST-Verfahren orientiert (KING et al. 2002). Die
jeweiligen Primer für die Amplifikation der sieben Genfragmente sind in Tabelle 21
aufgelistet. Für die Amplifikation des mutS-Genfragments wurden in einem Fall
alternative Primer verwendet (REHM et al. 2007). Der PCR-Ansatz erfolgte wie in
Tabelle 4 dargestellt.
4 http://pubmlst.org/ssuis/ Kurator: Adrian Whatmore
Material und Methoden
58
Tabelle 4: Ansatz der Reagenzien für die MLST-PCRs Substanz Menge je Probe in µl
Steriles Wasser 28,75 µl
10x ThermoPol® Buffer 5 µl
dNTPs 1 µl
Vorwärts-Primer (5µM) 2,5 µl
Rückwärts-Primer (5µM) 2,5 µl
Taq DNA Polymerase 0,25 µl
DNA-Template 10 µl
Das Thermocycler-Programm wurde wie folgt eingestellt:
1. Initialisierung bei 95 °C 2 min
2. Denaturierung bei 95°C 60 sec
3. Primer-Annealing bei 50(dpr/mutS/recA)/52(cpn60/thrA)/55(aroA/gki)°C 60 sec
4. Elongation bei 68°C 60 sec
5. Finale Elongation bei 68°C 5 min
Schritt 2 bis 4 wurden 30-mal wiederholt. Zuletzt erfolgte ein Herabkühlen auf 10 °C.
Anschließend wurden 10 µl je Probe mittels Gelelektrophorese darauf geprüft, ob das
gewünschte PCR-Produkt korrekt amplifiziert wurde.
3.2.4.2.11 DNA-Aufreinigung aus PCR-Produkten
Eine DNA-Aufreinigung aus PCR-Produkten erfolgte als Vorbereitung für die
Sequenzierung. In der vorliegenden Arbeit wurde dies für die MLST sowie im
Einzelfall für die Verifizierung einzelner Serotypisierungs-Ergebnisse genutzt. Die
Aufreinigung wurde mit dem herkömmlichen Kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
von MACHEREY-NAGEL nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
Material und Methoden
59
3.2.4.2.12 DNA-Aufreinigung aus Agarosegelen
In Einzelfällen entstanden bei der Amplifikation der MLST-Genfragmente zusätzlich
unspezifische Ampflifikate, die bei der oben beschriebenen DNA-Aufreinigung das
eigentliche Amplifikat kontaminiert und die Sequenzierung gestört hätten. Um in
diesen Fällen die DNA-Fragmente aus Agarosegelen aufzureinigen, wurden die
entsprechenden unter UV-Licht fluoreszierenden Banden mit einem Skalpell
möglichst eng umschnitten und aus dem Gel herausgelöst. Die ausgeschnittenen
Fragmente wurden einzeln in Eppendorf Gefäße verbracht. Die weitere Bearbeitung
erfolgte mit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up von MACHEREY-NAGEL gemäß
Herstellerangaben.
3.2.4.2.13 Sequenzanalyse
Für die Bestimmung der Sequenztypen mussten die Nukleotidsequenzen der mittels
PCR gewonnenen MLST-Gene bestimmt werden. Dafür wurden die PCR-Amplifikate
nach oben beschriebener Aufreinigung an die Firma Seqlab in Göttingen5 zur
Sequenzierung im Sanger-Sequencing-Verfahren geschickt. Es wurde für jedes
Fragment jeweils eine Sequenzierung mit dem Vorwärts- und mit dem
Rückwärtsprimer durchgeführt. Die Sequenzen wurden dann mit Hilfe der Clone
Manager Software mit den Referenzsequenzen der S.-suis-MLST-Online-Datenbank
verglichen und in die Online-Datenbank eingepflegt.6 Bei der Auswertung der
Sequenzierungsergebnisse wurde darauf geachtet, dass die Qualität gut war, d.h.
frei von Hintergrundrauschen und fraglichen Basen, sowie mit ausreichend starker
Amplitude der einzelnen Peaks. Es wurden stets die Vorwärts- und
Rückwärtssequenz mit der Referenzsequenz verglichen. In Zweifelsfällen wurde das
Genfragment erneut in der PCR amplifiziert und anschließend die Sequenzierung
wiederholt. Das Einpflegen der Ergebnisse in die Online-Datenbank erfolgte stets
erst nach einer Prüfung der Sequenzen durch den zuständigen Administrator.
5 https://www.microsynth.seqlab.de/home-de.html 6 http://pubmlst.org/ssuis/ Kurator: Adrian Whatmore
Material und Methoden
60
3.2.4.2.14 Auswertung der MLST-Daten
Eine Auswertung der MLST-Daten der eigens eingepflegten Isolate und der bereits
typisierten Isolate aus der Online-Datenbank erfolgte mit Hilfe des BURST-
Algorithmus mit dem Softwareprogramm eBURST.v3. Grundlagen zur Auswertung
der MLST-Daten mittels BURST-Algorithmus sind unter 2.4.1 erläutert. Das
Programm wurde so eingestellt, dass nur diejenigen ST miteinander verbunden
werden, die Single-Locus-Varianten (SLV) eines anderen ST darstellen, da diese
Verbindungen mit einer relativ großen Sicherheit eine epidemiologische enge
Beziehung darstellen. Double-Locus-Varianten (DLV) wurden nicht dargestellt.
Zusätzlich wurde die Verwandtschaft der 21 mittels MLST untersuchten nicht-
typisierbaren Isolate untereinander durch den Neighbour-Joining-Algorithmus
geprüft. Die Online-Software iTOL ermöglichte einen Vergleich aller sieben
Gensequenzen der 21 Isolate. Der Neighbour-Joining-Algorithmus fasst dabei jeweils
die Isolate zu Clustern zusammen, deren Sequenzen am ähnlichsten sind und
konstruiert so ein Dendrogramm. Auf der vertikalen Achse werden dabei die
verschiedenen Isolate präsentiert, während auf der horizontalen Achse die
genetische Distanz der einzelnen Isolate dargestellt wird. Im Dendrogramm
kennzeichnet der Ort des Verbindungsstrichs zweier Isolate oder Cluster die
jeweilige errechnete genetische Ähnlichkeit.
3.2.4.2.15 MALDI-TOF-MS
Eine Untersuchung der aus den Isolaten gewonnenen Kulturen mittels MALDI-TOF-
MS wurde angewendet, um die Speziesdiagnose bei nicht-typisierbaren
S.-suis-Isolaten zusätzlich zur PCR-basierten Identifikation abzusichern. Die
Anwendung des MALDI-TOF (Biotyper) erfolgte nach Angaben des Herstellers
Bruker Daltronics GmbH, Bremen, mittels „direct-smear“-Verfahren ohne Extraktion.
Das Gerät verwendete als Datenbank die MBT-BAL-5989-MSP Library.
3.2.5 Empfindlichkeitsprüfung im Boullion-Mikrodilutionsverfahren
Für die in der vorliegenden Studie verwendeten S.-suis-Isolate wurde jeweils eine
Empfindlichkeitsprüfung als Boullion-Mikrodilutionstest gegenüber verschiedenen
Material und Methoden
61
antimikrobiellen Wirkstoffen durchgeführt. Die Empfindlichkeitsprüfung wurde mit den
MICRONAUT-S Mikrotiterplatten der Firma MERLIN durchgeführt. Ansatz und
Auswertung erfolgte nach Kriterien des CLSI (CLSI 2012). Das Testsystem wurde
wöchentlich mit den im Anhang erwähnten Kontrollstamm überprüft. Die Beurteilung
der MHK-Werte geschah anhand der festgelegten Grenzwerte des CLSI, soweit
diese für bestimmte Antibiotika-Organ-Kombinationen für S. suis vorlagen (CLSI
2013, 2015). Die Grenzwerte für die Beurteilung in sensibel, intermediär und
resistent können sich nach Stand der Forschung ändern. Deshalb wurden in dieser
Arbeit sowohl die ermittelten MHK-Werte als auch ihre Bewertung in
Empfindlichkeitskategorien anhand der derzeit vorhandenen Grenzwerte angegeben.
Die in dieser Studie erwähnten MHK50- und MHK90-Werte sind errechnete Größen,
die zur Beschreibung von MHK-Wert-Verteilungen und somit auch zum Vergleich von
Resistenzdaten zwischen verschiedenen Erregerpopulationen dienen können. Der
MHK50-Wert gibt hierbei die niedrigste Konzentration des Antibiotikums an, bei der
sich mindestens 50% der Isolate empfindlich gegenüber dem Antibiotikum zeigten,
also je nach Wirkweise des Antibiotikums in ihrem Wachstum gehemmt oder sogar
abgetötet wurden. Entsprechend zeigt der MHK90-Wert die niedrigste Konzentration
an, bei der mindestens 90% der untersuchten Erregerpopulation gehemmt werden.
Für die Ermittlung dieser Werte ist es vorteilhaft, die ermittelten Daten in einer
Tabelle nach Wirkstoffen und unterschiedlichen MHK-Werten zu ordnen wie für die
vorliegende Untersuchung durchgeführt wurde (vgl. Tabelle 9). Der MHK50-Wert
entspricht dann der MHK, die bei 0,5·n ermittelt wurde, wobei n die Anzahl der
untersuchten Isolate ist. Die MHK von 0,9·n entspricht dann dem MHK90-Wert
(SCHWARZ et al. 2010).
3.2.6 Statistische Methoden
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem SAS-Enterprise Guide. Es
wurde ausschließlich der exakte Test nach Fisher angewendet. Das statistische
Signifikanzniveau p wurde auf p≤0,05 festgelegt.
Weiterhin wurde eine Abstufung des Signifikanzniveaus vorgenommen:
* = signifikant (0,01 < p ≤ 0,05)
** = sehr signifikant (0,001 < p ≤ 0,01)
*** = hoch signifikant (p ≤ 0,001)
Ergebnisse
63
4 Ergebnisse
4.1 Etablierung der modifizierten zweistufigen S.-suis-Multiplex-PCR zur Typisierung von S.-suis-Isolaten
Für die Etablierung der beschriebenen Multiplex-PCR zur molekulargenetischen
Serotypisierung von S.-suis-Isolaten wurden zunächst die in Tabelle 19 aufgeführten
S.-suis-Referenzstämme von Serotyp 1-34 mit dieser Methode untersucht. Für jeden
Referenzstamm wurde die zweistufige PCR jeweils mit gDNA und mit einfachen
Bakterienlysaten als Template durchgeführt. Nach gelelektrophoretischer
Auftrennung der PCR-Produkte ergaben sich die nach OKURA et al. 2014 erwarteten
Banden für die S.-suis-grouping-PCR und S.-suis-typing-PCR (Abbildung 3 und 5).
Die in die S.-suis-grouping-PCR integrierten Primer für recN zeigten die erwartete
Spezifität. Für die getesteten S.-suis-Referenzstämme Serotyp 1-34 ergab sich ein
entsprechendes 1247 bp großes Amplifikat für alle Serotypen außer für die
Serotypen 20, 22, 26, 32-34. Damit erwiesen sich die eigens entworfenen Primer als
geeignet für die Abgrenzung dieser ehemaligen S.-suis-Serotypen zu den wahren
S.-suis-Serotypen, vergleichbar mit den Primern in der recN-PCR nach
ISHIDA et al. 2014.
Die als Positivkontrollen hergestellten gDNA-Mixe zeigten die erwarteten Banden mit
einer Einschränkung für den gDNA-Mix der S.-suis-typing-PCR von Gruppe IV, bei
dem keine Bande für Serotyp 4 amplifiziert wurde (Abbildung 5). Aus diesem Grund
musste in dieser PCR, wie in der Beschreibung der Methode erwähnt, der
Referenzstamm von Serotyp 4 gesondert als Positivkontrolle mitgeführt werden.
Ergebnisse
64
Abbildung 5: Auswertung der S.-suis-typing-PCR nach der Gelelektrophorese. Es wurden die S.-suis-Referenzstämme der Serotypen 1-34 untersucht. M: Molecular Weight Marker (DNA-Leiter für die Gelelektrophorese) PI – PVII: Positivkontrolle für S.-suis-typing-PCR I – VII
(Für Serotyp 4 muss eine einzelne Kontrolle mitgeführt werden) 1 – 34: Referenzstämme der Serotypen 1 – 34
Um die bereits erfassten Ergebnisse der routinemäßig im Diagnostiklabor des
Instituts für Mikrobiologie durchgeführten PCR-basierten Typisierung von
S.-suis-Isolaten für diese Studie nutzen zu können, wurden stichprobenartig Isolate,
die mit dieser PCR-Methode als Serotypen 1 oder 14, 2 oder 1/2, 4, 7 und 9
bestimmt werden konnten, zusätzlich in der neu eingeführten zweistufigen S.-suis-
Multiplex-PCR untersucht. Hierbei ergab sich eine vollständige Übereinstimmung der
Typisierungsergebnisse beider PCR-Methoden, welche auf unterschiedlichen
Primersequenzen basieren.
Da das Koagglutinationsverfahren mit Serotyp-spezifischen Antiseren als Gold-
Standard für die Serotypisierung von S.-suis-Isolaten gilt, wurde für jeden in der
Sammlung vorkommenden Serotyp je ein Feldisolat zufällig ausgewählt und zur
Testung im Koagglutinationsverfahren zu unserer Kooperationspartnerin Dr. Hilde
Smith nach Wageningen, Niederlande, geschickt. Da keine Antiseren für die
Serotypen 29, 30 und 31 zu Verfügung standen, konnte von diesen Serotypen kein
exemplarisches Feldisolat im Koagglutinationsverfahren untersucht werden. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Serotypen 1 und 14 sowie 2 und 1/2
können, wie erwähnt, mittels PCR nicht voneinander unterschieden werden. Deshalb
wurde zunächst für Serotyp 1 oder 14 und für Serotyp 2 oder 1/2 jeweils ein Isolat für
Ergebnisse
65
die Untersuchung im Koagglutinationsverfahren ausgewählt. Die Serotypisierung
ergab, dass es sich bei dem Isolat 2015/03720/01/04 um Serotyp 14 handelte. Aus
diesem Grund wurde ein weiteres Isolat (2016/04142/03/03) untersucht, das mittels
PCR Serotyp 1 oder 14 zugeordnet wurde. Dieses konnte dann phänotypisch als
Serotyp 1 typisiert werden. Das Isolat 2015/02554/03/05, mittels PCR als Serotyp 2
oder 1/2 bestimmt, wurde phänotypisch als Serotyp 2 typisiert. Auf weitere
Untersuchungen von Serotyp 2 oder 1/2 Isolaten, um ggf. einen Serotyp-1/2-Isolat zu
identifizieren, wurde verzichtet, da dieser Serotyp insgesamt deutlich seltener
vorkommt als Serotyp 2 (vgl. 2.3.1).
Das zuerst für die exemplarische Überprüfung von Serotyp 15 ausgewählte Isolat
2016/01741/09/30 sowie das zuerst für Serotyp 28 ausgewählte Isolat
2015/03881/02/02 zeigten Autoagglutination, sodass diese phänotypisch nicht-
typisierbar blieben. Deshalb wurde für diese beiden Serotypen jeweils ein weiteres
Isolat zur Überprüfung ausgewählt. Die Untersuchung des Isolates
2015/04246/01/09, welches mittels PCR als Serotyp 10 identifiziert wurde, ergab die
phänotypische Zuordnung zu Serotyp 9. Daraufhin wurde ein weiteres Isolat
(2016/01289/03/04), welches mittels PCR als Serotyp 10 identifiziert wurde,
untersucht. Dieses Isolat zeigte eine Polyagglutination mit den Antiseren für Serotyp
10, 9, 21 und 22. Um das PCR-Ergebnis für die beiden Isolate, in dem diese Isolate
eindeutig dem Serotyp 10 und nicht dem Serotyp 9 zugeordnet wurden, zu
verifizieren, wurde jeweils das Serotyp-spezifische wzy-Genfragment aus der
entsprechenden S.-suis-typing-PCR aufgereinigt und sequenziert. Das gleiche
Verfahren wurde für die zwei weiteren Serotyp-10-Isolate 2015/04716/02/02 und
2016/00408/03/04 aus der Feldisolate-Sammlung und für den Referenzstamm von
Serotyp 10 durchgeführt. Die erhaltenen Sequenzen wurden mittels Hilfe der
GenBank-BLAST-Suche untersucht und es ergab sich eine hundertprozentige
Übereinstimmung mit dem cps10M-Gen (wzy) des S.-suis-Stamms 4417 in der
Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Accession-
Number: JX986799), einem Serotyp 10-Isolat.7 Für die genannten Isolate konnte
auch nach mehrfacher Wiederholung weder mit der in dieser Arbeit neu eingeführten
mehrstufigen S.-suis-Multiplex-PCR, noch mit der bisher routinemäßig in der
Diagnostik der Instituts für Mikrobiologie eingesetzten S.-suis-Typisierungs-PCR ein
7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene
Ergebnisse
66
Amplifikat für Serotyp 9 erzeugt werden. Die beiden PCR-Methoden basieren hierbei
auf unterschiedlichen Serotyp-spezifischen Zielsequenzen.
Für alle weiteren getesteten Isolate ergab sich eine vollständige Übereinstimmung
der phänotypischen Serotypisierung mit der PCR-basierten Typisierung.
Tabelle 5: Stichprobenartige Überprüfung der PCR-Ergebnisse für S.-suis-Isolate
Isolat Kapseltyp (genotypisch) Kapseltyp (phänotypisch)a
2015/03720/01/04 1 oder 14 14 2016/04142/03/03 1 oder 14 1 2015/02554/03/05 2 oder 1/2 2 2015/02137/08/05 3 3 2015/06009/01/01 4 4 2015/03598/02/07 5 5 2015/04296/01/01 7 7 2015/03050/01/02 8 8 2015/04208/02/03 9 9b
2016/04630/01/01 9 9 2015/04246/01/09 10e 9c
2016/01289/03/04 10e 10, 9, 21, 22 2016/03610/03/03 11 11 2016/00402/06/06 12 12 2016/03962/03/06 13 13 2016/01741/09/30 15 Autod
2016/04444/01/02 15 15 2016/01728/01/01 16 16 2016/04146/12/12 17 17 2016/01717/01/01 18 18 2016/00843/01/01 19 19 2015/04639/01/02 21 21 2015/06010/02/02 23 23 2015/05085/01/01 24 24 2015/03881/02/02 28 Autod
2016/04031/01/02 28 28 a durchgeführt von Dr. Hilde Smith, Central Veterinary Institute of Wageningen University Research;
getestet mit Seren für die Serotypen 1-28 b im ersten Versuch negativ mit allen Seren 1-28 c auch nach Wiederholung keine Agglutination mit Serum 10 d Autoagglutination e die Sequenzierung des PCR-Produkts ergab eine 100%-Übereinstimmung mit dem wzy-Gen von
Serotyp 10 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)
Ergebnisse
67
4.2 Verbreitung von S.-suis-Serotypen in Deutschland
4.2.1 Herkunft der Isolate
4.2.1.1 Kohorte A
SILVA et al. (2006) veröffentlichten eine Studie, in der 210 S.-suis-Isolate, die
vorrangig aus Deutschland stammten, auf ihren Serotyp hin untersucht wurden. Ein
Großteil der Isolate wurde zur Routinediagnostik in das Institut für Mikrobiologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover in den Jahren 1996 bis 1998 sowie 2001 bis
2004 eingesendet. Mit der damaligen Multiplex-PCR konnten nur die Serotypen 2
oder 1/2, 1 oder 14, 7 und 9 detektiert werden. So blieben über 50% der Isolate nicht
typisierbar. In der vorliegenden Studie wurden diese damals nicht-typisierbaren
Isolate mit der hier neu etablierten Multiplex-PCR nachuntersucht und zusätzlich
wurden die Ergebnisse für die bereits typisierten Isolate stichprobenartig überprüft.
Dabei stimmten in allen Fällen die damaligen Typisierungsergebnisse für die
Serotypen 2 oder 1/2, 1 oder 14, 7 und 9 mit denen der aktuellen Überprüfung
überein. Allerdings wurden drei der damals nicht-typisierbaren Isolate mit der neuen
PCR dem Serotyp 2 oder 1/2 und ein weiteres dem Serotyp 1 oder 14 zugeordnet.
Um eine gute Vergleichbarkeit zwischen der damaligen S.-suis-Isolate-Sammlung, im
Folgenden als Kohorte A bezeichnet, und der aktuellen S.-suis-Isolate-Sammlung,
im Folgenden als Kohorte B bezeichnet, zu schaffen, wurden aus Kohorte A
zunächst diejenigen Isolate ausgeschlossen, die nicht aus Deutschland stammten.
Hierbei handelte es sich um jeweils zwei Isolate aus Österreich und aus den
Niederlanden. Weiterhin wurden die Isolate ausgeschlossen, bei denen aus den
Hintergrundinformationen klar hervorging, dass diese aus demselben Betrieb
stammten und sie gleichzeitig den gleichen Serotyp und das gleiche Profil an
Virulenzgenen (epf, sly, mrp) zeigten. Nach derselben Maßgabe wurde, wie im
Methodenteil beschrieben, auch für Kohorte B gesammelt. Außerdem wurden aus
Kohorte A diejenigen Isolate ausgeschlossen, für die recN nicht nachgewiesen
werden konnte. Diese sechs Isolate blieben auch gleichzeitig nicht-typisierbar mit der
neuen Multiplex-PCR. Nach aktuellen Erkenntnissen gehören diese Isolate nicht
mehr zur Spezies S. suis und wurden deshalb für die vorliegende Studie nicht weiter
berücksichtigt. So blieben für Kohorte A 189 S.-suis-Isolate aus Deutschland,
innerhalb derer die Verteilung der einzelnen Serotypen betrachtet wird.
Ergebnisse
68
Die genaue Herkunft konnte für 154 dieser Isolate nachvollzogen werden
(Abbildung 6). Von den restlichen Isolaten ist nur bekannt, dass sie aus Deutschland
stammten. Die Isolate kamen vorrangig aus Nord-West-Deutschland mit einer
Konzentration auf Gebiete in Nordrhein-Westfalen und Niedersachsen. Nur wenige
Isolate stammten aus dem süddeutschen Raum, während aus dem Osten
Deutschlands bis auf Thüringen keine Isolate in Kohorte A integriert waren.
4.2.1.2 Kohorte B
Zwischen Ende April 2015 und Anfang Dezember 2016 konnten für Kohorte B
insgesamt 522 S.-suis-Isolate, die der oben genannten Definition entsprechen,
gesammelt werden. Für 498 dieser Isolate konnte die genaue Herkunft innerhalb
Deutschlands via Postleitzahl nachvollzogen werden. Bei den restlichen 24 Isolaten
war nur bekannt, dass sie aus Deutschland stammten. Ein Großteil der Isolate
stammte auch hier aus Nord-West-Deutschland, aber in geringerem Umfang waren
auch Isolate aus dem Nord-Osten sowie aus südlicheren Regionen Deutschlands
integriert. Die genaue Verteilung der Isolate kann Abbildung 6 entnommen werden.
A B
Abbildung 6: Herkunft von S.-suis-Isolaten innerhalb Deutschlands A: 154 S.-suis-Isolate aus Kohorte A (1996-1998 und 2001-2004) B: 498 S.-suis-Isolate aus Kohorte B (2015-2016) Legende: Anzahl der Isolate
Ergebnisse
69
4.2.2 Verbreitung einzelner Serotypen
Die Ergebnisse der PCR-basierten Serotypisierung der Isolate aus Kohorte A und
aus Kohorte B sind in Tabelle 6 als absolute und relative Häufigkeiten der einzelnen
getesteten Serotypen aufgeführt.
4.2.2.1 Kohorte A
Die prozentuale Verteilung der einzelnen Serotypen in Kohorte A sind in Abbildung 7
und Tabelle 6 dargestellt. Der mit Abstand häufigste Serotyp in Kohorte A war
Seroytp 2 oder 1/2 mit 26,46%. Weitere, weniger häufige Serotypen waren Serotyp 9
(11,11%), Serotyp 4 (10,05%), Serotyp 7 (8,99%), Serotyp 3 (7,41%), Serotyp 5
(6,35%) und Serotyp 1 oder 14 (5,29%). Weiterhin kamen in Kohorte A die Serotypen
8, 11, 12, 13, 15, 16, 21, 23, 24, 29, 30 und 31 vor, deren relative Häufigkeit mit
jeweils unter 3% allerdings sehr gering war. Einige dieser Serotypen wurden in
Kohorte A nur einmal gefunden. Der Anteil an nicht-typisierbaren Isolaten (nt) betrug
8,99%.
Abbildung 7: Anteile von S.-suis-Serotypen in Deutschland in Kohorte A. Es wurden auf das Vorkommen der Serotypen 1/2 und 1-34 untersucht. Kohorte A: 1996 – 1998 und 2001 – 2004 (SILVA et al. 2006) nt: nicht-typisierbare Isolate
1 und 14
2 und 1/
2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 21 23 24 28 29 30 31 nt0
10
20
30Kohorte A (n=189)
Serotyp
Isol
ate
[%]
Ergebnisse
70
4.2.2.2 Kohorte B
In Kohorte B (Abbildung 8, Tabelle 6) zeigte sich Serotyp 2 oder 1/2 ebenfalls als der
häufigste Serotyp mit 20,69%, dicht gefolgt von Serotyp 9 mit 16,86%. In der
Häufigkeit absteigend folgten dann Serotyp 7 (12,26%), Serotyp 4 (10,34%),
Serotyp 8 (5,36%), Serotyp 3 (4,98%) und Serotyp 1 oder 14 (4,79%). Die nicht mehr
als S. suis geltenden Serotypen 20, 22, 26 und 32-34 sowie die Serotypen 6, 12 und
25-27 kamen nicht vor. Die nicht-typisierbaren Isolate hatten einen Anteil von 4,21%.
Abbildung 8: Anteile von S.-suis-Serotypen in Deutschland in Kohorte B. Es wurden auf das Vorkommen der Serotypen 1/2 und 1-34 untersucht. Kohorte B: 2015 - 2016 nt: nicht-typisierbare Isolate
1 und 14
2 und 1/
2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 21 23 24 28 29 30 31 nt0
5
10
15
20
25Kohorte B (n=522)
Serotyp
Isol
ate
[%]
Ergebnisse
71
Tabelle 6: Prävalenz von S.-suis-Serotypen in Deutschland aus verschiedenen Zeiträumen
Serotyp Kohorte Aa Kohorte Bb
n [%] n [%] 1 oder 14 10 5,29 25 4,79 2 oder 1/2 50 26,46 108 20,69
3 14 7,41 26 4,98 4 19 10,05 54 10,34 5 12 6,35 14 2,68 6 0 0 0 0 7 17 8,99 64 12,26 8 4 2,12 28 5,36 9 21 11,11 88 16,86
10 0 0 4 0,77 11 2 1,06 5 0,96 12 3 1,59 0 0 13 1 0,53 2 0,38 15 5 2,65 7 1,34 16 1 0,53 9 1,72 17 0 0 1 0,19 18 0 0 10 1,92 19 0 0 7 1,34 20 0 0 0 0 21 4 2,12 6 1,15 22 0 0 0 0 23 1 0,53 4 0,77 24 1 0,53 3 0,57 25 0 0 0 0 26 0 0 0 0 27 0 0 0 0 28 0 0 10 1,92 29 1 0,53 10 1,92 30 1 0,53 2 0,38 31 5 2,65 13 2,49 32 0 0 0 0 33 0 0 0 0 34 0 0 0 0 nt 17 8,99 22 4,21 ∑ 189 100 522 100
a Kohorte A: 1996 – 1998 und 2001 – 2004 (SILVA et al. 2006) b Kohorte B: 2015 - 2016 nt: nicht-typisierbare Isolate
Ergebnisse
72
4.2.3 Virulenzmarker-Profile bei unterschiedlichen Serotypen
Bis auf eine Ausnahme trugen alle Serotyp-2- oder -1/2-Isolate aus Kohorte A und B
mindestens einen der Virulenzmarker mrp oder sly. Epf kam nur in Kombination mit
den Serotypen 1 oder 14 und 2 oder 1/2 vor und nur zusammen mit mrp und sly. In
Kohorte B zeigten 17 der 25 Serotyp-1- oder -14-Isolate den Genotyp epf+ mrp+ sly+.
Bei allen 17 handelte es sich um invasive Isolate. Von insgesamt 108 Serotyp-2-
oder -1/2-Isolaten in Kohorte B konnten 45 Isolate diesem Genotyp zugeordnet
werden. Bis auf ein Lungen-Isolat gehörten auch diese zur invasiven Gruppe. Bei
Serotyp 2 oder 1/2 konnte am zweithäufigsten der Genotyp mit nur mrp
nachgewiesen werden (43/108). Die Isolate gehörten fast zu gleichen Teilen zu den
invasiven Isolaten (22) und zu den Lungen-Isolaten (20). Ein Isolat wurde der
Carrier-Gruppe zugeordnet. Der Genotyp epf- mrp+ sly+ wurde insgesamt 15-mal
nachgewiesen. Alle Isolate stammten hierbei aus einer systemischen Lokalisation.
Serotyp 2 oder 1/2 in Kombination mit epf- mrp- sly+ kam siebenmal vor.
Bei Serotyp 9 war der Genotyp mit sowohl sly als auch mrp dominierend und kam in
Kohorte A sogar nahezu ausschließlich vor. In Kohorte B gehörten 69 von insgesamt
88 Serotyp-9-Isolaten zum Genotyp epf- mrp+ sly+. Davon wurden mit Ausnahme von
fünf Lungen-Isolaten alle weiteren in die invasive Gruppe eingeordnet. Am
zweithäufigsten wurde Serotyp 9 in Verbindung mit nur sly festgestellt (12/88). Auch
dieser Genotyp kam mit einer Ausnahme fast ausschließlich bei den invasiven
Isolaten vor. Serotyp 9 in Verbindung mit epf- mrp+ sly- kam nicht vor. Insgesamt
siebenmal wurde Serotyp 9 ohne Virulenzmarker nachgewiesen, darunter viermal
aus einer invasiven Lokalisation. Sly kam auch bei vielen anderen Serotypen (3, 4, 5,
7, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 21, 23, 28) und sogar teilweise bei nicht-typisierbaren
Isolaten vor. Mrp wurde zusätzlich zu oben erwähnten Serotypen auch bei den
Serotypen 3, 4, 5, 7, 8, 11, 15, 16, 17, 23, 28 und 30 gefunden.
4.3 S.-suis-Isolate aus unterschiedlichen Lokalisationen
Anhand ihrer Lokalisation im Tier ließen sich die Isolate innerhalb beider Kohorten
grob in drei Gruppen unterteilen (vgl. Abbildung 2).
Ergebnisse
73
4.3.1 Virulenzmarker bei Isolaten aus unterschiedlichen Lokalisationen
In der Gruppe der invasiven Isolate aus Kohorte B wurde epf jeweils hoch signifikant
(p<0,0001) häufiger nachgewiesen als bei den Lungen-Isolaten (1/74) und bei den
Carrier-Isolaten (0/45). Mrp kam sowohl im Vergleich mit den Lungen-Isolaten, als
auch im Vergleich mit den invasiven Isolaten hoch signifikant seltener in der Carrier-
Gruppe vor (p<0,0001). Die Verteilung zwischen invasiven und Lungen-Isolaten
unterschied sich nicht signifikant. Sly kam bei den invasiven Isolaten hoch signifikant
seltener vor als bei den Lungen-Isolaten (p=0,0004) aber signifikant häufiger als bei
den Carrier-Isolaten (p=0,0013). Auch bei den Carrier-Isolaten wurde sly hoch
signifikant seltener als bei den Lungen-Isolaten nachgewiesen (p<0,0001).
4.3.2 Vergleich der Serotypen-Verteilungen zwischen Kohorte A und B
In Kohorte A waren 70 und in Kohorte B 353 invasive Isolate enthalten. In Kohorte A
entsprach das gut einem Drittel der gesamten Population, während in Kohorte B zwei
Drittel der Gesamtpopulation invasive Isolate waren. Aus diesen Gründen wurde ein
direkter Vergleich des Serotypen-Vorkommens in den beiden Kohorten nur innerhalb
der jeweiligen Gruppe gezogen und nicht zwischen den Gesamtpopulationen der
Kohorten. Die Anteile der einzelnen Serotypen wurden jeweils auf die Anzahl an
Isolaten in der Gruppe bezogen. Tabelle 25 zeigt die Prävalenzen der Serotypen der
beiden Kohorten innerhalb der einzelnen Gruppen.
4.3.3 Serotypen-Vorkommen bei invasiven Isolaten
Die Ergebnisse für die invasiven Isolate sind in Abbildung 9 dargestellt. Es zeigte
sich, dass in beiden Kohorten Serotyp 2 oder 1/2 der häufigste Serotyp war. Jedoch
unterschieden sich die Anteile hoch signifikant (p=0,0006). Während Serotyp 2 oder
1/2 in Kohorte A noch einen Anteil von knapp 45% ausmachte, waren es in Kohorte
B nur noch knapp 24%. Damit hatte in Kohorte B Serotyp 2 oder 1/2 einen fast gleich
großen Anteil wie Serotyp 9 (22,38%).
Der Anteil von Serotyp 9 war über die Jahre annähernd konstant geblieben. In
Kohorte A betrug er 25,71%. Die Anteile der Serotypen 4 und 7 sind angestiegen,
wenn auch nicht ganz signifikant.
Ergebnisse
74
Insgesamt zeigte sich in beiden Kohorten eine deutliche Dominanz der Serotypen
1 oder 14, 2 oder 1/2 bis 9 (mit Ausnahme von Serotyp 6, der überhaupt nicht
vorkam). Die restlichen Serotypen kamen in Kohorte A gar nicht und in Kohorte B in
sehr geringer Anzahl vor. Der Anteil an nicht-typisierbaren Isolaten war in beiden
Kohorten sehr gering (<3%).
1 und 14
2 und 1/
2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 21 23 24 28 29 30 31 nt0
10
20
30
40
50Kohorte A (n=70)Kohorte B (n=353)
***
Serotyp
Isol
ate
[%]
Abbildung 9: Anteile von S.-suis-Serotypen bei invasiven Isolaten in Deutschland aus verschiedenen Zeiträumen. Es wurden auf das Vorkommen der Serotypen 1/2 und 1-34 untersucht. Kohorte A: 1996 – 1998 und 2001 – 2004 (SILVA et al. 2006) Kohorte B: 2015 - 2016 nt: nicht-typisierbare Isolate
4.3.3.1 ZNS- und Gelenkisolate
Innerhalb der Gruppe der invasiven Isolate wurden zusätzlich die nur aus dem ZNS-
sowie die nur aus Gelenken stammenden Isolate gesondert betrachtet. In Kohorte A
waren dies 48 ZNS- und zwölf Gelenk-Isolate, in Kohorte B 232 ZNS- und 48
Gelenk-Isolate (Tabelle 26). Somit waren die Anteile der ZNS- (68,57% bzw.
65,72%) und Gelenk-Isolate (17,14 bzw. 13,60%) an den jeweiligen gesamten
invasiven Isolaten in beiden Kohorten recht vergleichbar. Das zeigt, dass die
Serotypen-Verteilungen der jeweils gesamten invasiven Isolate in beiden Kohorten in
Ergebnisse
75
ähnlichem Umfang durch ZNS-, Gelenk- und andere invasive Isolate beeinflusst
wurden.
4.3.3.1.1 Vergleich der Serotyp-Prävalenzen zwischen den Kohorten
Beide Kohorten haben bezogen auf die invasiven Isolate einen vergleichbaren Anteil
an ZNS- und Gelenk-Isolaten. Der hoch signifikante Rückgang von Serotyp 2
oder 1/2 war in der Untergruppe der reinen ZNS-Isolate noch deutlicher zu erkennen
(p=0,0002) als in der Gesamtbetrachtung der invasiven Isolate. Auch Serotyp 1 oder
14 zeigten bei den ZNS-Isolaten einen signifikanten Rückgang (p=0,0316). Der
Anstieg an Serotyp 4 innerhalb dieser Gruppe war annähernd signifikant (p=0,0588).
Ebenso zeigte sich eine Zunahme der Anteile von Serotyp 7 und 8 im ZNS. Das
Vorkommen von Serotyp 9 und 5 im ZNS war über die Zeit annähernd gleich
geblieben. Im Gegensatz zu Kohorte A waren in Kohorte B auch einige der
selteneren Serotypen im ZNS vertreten (Abbildung 10).
Innerhalb der Untergruppe der Gelenkisolate zeigten sich zwischen den Kohorten
keine signifikanten Unterschiede, allerdings waren jeweils auch nur wenige
Gelenkisolate enthalten.
Ergebnisse
76
Abbildung 10: Anteile von S.-suis-Serotypen bei ZNS-Isolaten in Deutschland aus verschiedenen Zeiträumen. Es wurden auf das Vorkommen der Serotypen 1/2 und 1-34 untersucht. Kohorte A: 1996 – 1998 und 2001 – 2004 (SILVA et al. 2006) Kohorte B: 2015 - 2016 nt: nicht-typisierbare Isolate
4.3.3.1.2 Assoziationen zwischen Serotypen und Gewebetropismus
Betrachtet man die Anteile der Serotypen innerhalb von Kohorte B im Vergleich
zwischen ZNS- und Gelenkisolaten (Abbildung 11), so fällt auf, dass Serotyp 1 oder
14 hauptsächlich aus Gelenken isoliert wurde und kaum aus dem ZNS. Diese
Verteilungen unterschieden sich höchst signifikant (p<0,0001). In Kohorte A
unterschieden sich die relativen Anteile von Serotyp 1 oder 14 zwar auch stark
zwischen ZNS- (8,33%) und Gelenk-Isolaten (25%), allerdings war der Unterschied
aufgrund der geringen Stichprobenzahlen nicht signifikant.
Innerhalb von Kohorte A bestand weiterhin ein signifikanter Unterschied zwischen
dem Anteil nicht-typisierbarer Isolate aus ZNS und Gelenk (p=0,0373). Alle 48
ZNS-Isolate konnten typisiert werden. Hingegen konnten zwei aus zwölf
Gelenk-Isolaten keinem Serotyp zugeordnet werden. Dieselbe Tendenz, dass
1 und 14
2 und 1/
2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 21 23 24 28 29 30 31 nt0
20
40
60Kohorte A (n=48)Kohorte B (n=232)
***
*
Serotyp
Isol
ate
[%]
Ergebnisse
77
ZNS-Isolate (0,86%) seltener nicht-typisierbar waren als Gelenk-Isolate (2,08%),
zeichnete sich auch in Kohorte B ab. In Kohorte B zeigte sich außerdem eine nahezu
signifikante Tendenz, dass die invasiven Serotyp-4-Isolate zum Großteil aus dem
ZNS stammten und nur in einem einzigen Fall aus einem Gelenk (p=0,0588). Serotyp
9 hatte in Kohorte B exakt den gleichen Anteil an den ZNS-Isolaten wie Serotyp 2
oder 1/2, während im Gelenk Serotyp-2- oder -1/2-Isolate ein wenig häufiger
vorkamen als die Serotypen 1 oder 14 sowie 7 und 9. Serotyp 7 war in Kohorte B
sowohl bei den ZNS-Isolaten nach den gleichhäufig vorkommenden Serotypen 9 und
2 oder 1/2, als auch bei den Gelenkisolaten nach Serotyp 2 oder 1/2 und Serotyp 1
oder 14 der dritthäufigste Serotyp.
Abbildung 11: Anteile von S.-suis-Serotypen bei ZNS- und Gelenk-Isolaten in Kohorte B. Es wurden auf das Vorkommen der Serotypen 1/2 und 1-34 untersucht. Kohorte B: 2015 - 2016 nt: nicht-typisierbare Isolate
1 und 14
2 und 1/
2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 21 23 24 28 29 30 31 nt0
10
20
30ZNS (n=232)Gelenk (n=48)
***
Serotyp
Isol
ate
[%]
Ergebnisse
78
4.3.4 Serotypen-Vorkommen bei Lungen-Isolaten
Innerhalb der Gruppe der Lungen-Isolate bestand in beiden Kohorten ein breiter
verteiltes Vorkommen verschiedener Serotypen im Vergleich zu den invasiven
Isolaten, d.h. dass vermehrt auch die Serotypen zwischen Serotyp 10 und 33
vorkamen (Abbildung 12). Auch die Anteile an nicht-typisierbaren Isolaten lagen mit
8,11% (Kohorte A) bzw. 6,84% (Kohorte B) höher als bei den invasiven Isolaten.
Dennoch dominierten auch hier die Serotypen 2 oder 1/2 bis 9 (mit Ausnahme von
Serotyp 6, der wiederum nicht vertreten war).
Zwischen den beiden Kohorten bestanden gewisse Unterschiede bei der Prävalenz
der einzelnen Serotypen, dennoch ergab sich keine Signifikanz. In Kohorte A war
Serotyp 4 mit 17,57% der häufigste Serotyp. Diese Information entstand erst durch
die Nachtypisierung der Isolate aus der Studie von SILVA et al. 2006. Auch in
Kohorte B war Serotyp 4 mit 13,68% immerhin der zweithäufigste Serotyp nach
Serotyp 2 oder 1/2 (18,80%). In Kohorte A folgten auf Serotyp 4 die Serotypen 2 oder
1/2, 3 und 7 mit jeweils knapp 15%. Mit 8,11% folgte dann Serotyp 5, während der
Anteil an Serotyp 9 mit unter 5% deutlich geringer war als bei den invasiven Isolaten
und in gleichem Maß vorkam wie Serotyp 31. In Kohorte B folgten auf die Serotypen
2 oder 1/2 (18,80%) und 4 (13,68%) die Serotypen 8 und 3 mit jeweils um die 10%.
Damit war das Vorkommen von Serotyp 8 in Kohorte B größer als noch in Kohorte A,
während wiederum Serotyp 3 in Kohorte A noch etwas häufiger war. Ebenso war das
Vorkommen von Serotyp 7 (7,69%) und Serotyp 5 (3,42%) in Kohorte B jeweils
geringer als in Kohorte A. Der Anteil an Serotyp 9 war mit knappen 6% in Kohorte B
zwar etwas höher als in Kohorte A (4,05%), aber dennoch im Vergleich mit der
Gruppe der invasiven Isolate recht gering. Sowohl die Anteile an Serotyp 1 oder 14,
als auch der Serotypen 10-31 lagen in beiden Kohorten jeweils unter 5% für die
betreffenden Serotypen. Einige dieser Serotypen kamen sogar gar nicht oder nur in
einer der Kohorten vor.
Ergebnisse
79
Abbildung 12: Anteile von S.-suis-Serotypen bei Lungen-Isolaten in Deutschland aus verschiedenen Zeiträumen. Es wurden auf das Vorkommen der Serotypen 1/2 und 1-34 untersucht. Kohorte A: 1996 – 1998 und 2001 – 2004 (SILVA et al. 2006) Kohorte B: 2015 - 2016 nt: nicht-typisierbare Isolate
4.3.5 Serotypen-Vorkommen bei Carrier-Isolaten
In der Gruppe der Carrier-Isolate zeigte sich in beiden Kohorten eine recht
homogene Verteilung der Serotypen, ohne dass einzelne Serotypen sich als
besonders dominant heraus stellten (Abbildung 13). Beide Kohorten hatten im
Vergleich mit den beiden anderen Gruppen einen recht hohen Anteil an nicht-
typisierbaren Isolaten. Dennoch war dieser Anteil in Kohorte B (11,54%) geringer als
in Kohorte A (20,0%). Während in Kohorte A Serotyp 2 oder 1/2 mit 17,78% der
häufigste war, führte Serotyp 29 Kohorte B mit 15,38% an. Damit war der Anteil an
Serotyp 29 in Kohorte B signifikant höher als in Kohorte A (p=0,0347).
Wenige Serotypen, die bei den invasiven oder Lungen-Isolaten vertreten waren,
kamen in der Gruppe der Carrier-Isolate in der einen oder anderen Kohorte gar nicht
vor. Allerdings sollte die Beurteilung der Carrier-Gruppe für beide Kohorten vor dem
Hintergrund der recht kleinen Stichprobengrößen (n=45 bzw. 52) erfolgen.
1 und 14
2 und 1/
2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 21 23 24 28 29 30 31 nt0
5
10
15
20Kohorte A (n=74)Kohorte B (n=117)
Serotyp
Isol
ate
[%]
Ergebnisse
80
Abbildung 13: Anteile von S.-suis-Serotypen bei Carrier-Isolaten in Deutschland aus verschiedenen Zeiträumen. Es wurden auf das Vorkommen der Serotypen 1/2 und 1-34 untersucht. Kohorte A: 1996 – 1998 und 2001 – 2004 (SILVA et al. 2006) Kohorte B: 2015 - 2016 nt: nicht-typisierbare Isolate
4.4 Nicht-typisierbare Isolate
In Kohorte B fielen 22 Isolate damit auf, dass sie auch mit der neu etablierten
Multiplex-PCR keinem der Serotypen 1/2 oder 1-34 zugeordnet werden konnten.
Obwohl diese Isolate insgesamt nur einen geringen Anteil an Kohorte B hatten, sollte
der Frage nachgegangen werden, aus welchem Grund diese nicht-typisierbar
blieben. Prozentual waren bei den invasiven Isolaten nur wenige nicht-typisierbar,
aber dennoch stammten acht Isolate aus einem invasiven Geschehen. Wie oben
beschrieben war der Anteil bei den Lungen-Isolaten etwas größer und vor allem bei
den Carrier-Isolaten war das anteilige Vorkommen dieser nicht-typisierbaren Isolate
nicht zu vernachlässigen. Deshalb wurden die 22 nicht-typisierbaren Isolate aus
Kohorte B mittels verschiedener Untersuchungen näher charakterisiert.
1 und 14
2 und 1/
2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 21 23 24 28 29 30 31 nt0
5
10
15
20
25Kohorte A (n=45)Kohorte B (n=52)
*
Serotyp
Isol
ate
[%]
Ergebnisse
81
4.4.1 Absicherung der Spezieszugehörigkeit
Durch Untersuchung mittels MALDI-TOF MS wurde die Zugehörigkeit der nicht-
typisierbaren Isolate zur Spezies S. suis bestätigt. Weiterhin zeigten alle in dieser
Arbeit berücksichtigten Isolate ein gdh- und ein recN-Amplifikat, so auch die 22 nicht-
typisierbaren Isolate aus Kohorte B.
4.4.2 Untersuchung im Koagglutinationsverfahren
Auch im Koagglutinationsverfahren konnte keinem der 22 nicht-typisierbaren Isolate
ein Serotyp zugeordnet werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Sieben
Isolate zeigten eine Autoagglutination, zwei Isolate zeigten Polyagglutination, d.h. sie
reagierten mit mehreren Antiseren. Die restlichen 13 Isolate zeigten keine Reaktion
mit den einzelnen Seren.
Ergebnisse
82
Koho
rte B
: 201
5 - 2
016
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Ergebnisse
83
4.4.3 Untersuchung der Kapselausbildung
Da die 22 Isolate mit den genannten Untersuchungen weder genotypisch noch
phänotypisch typisierbar waren, sollte deren Kapselausprägung mittels
Elektronenmikroskopie untersucht werden. Die elektronenmikroskopischen
Aufnahmen sind in Abbildung 15 dargestellt. Die einzelnen Beurteilungen der
Kapseln sind in Tabelle 8 gezeigt. Keines der 22 nicht-typisierbaren Isolate zeigte
eine ähnlich starke Kapselausbildung wie der Vergleichsstamm St10, aber zwei
Isolate zeigten eine Kapselausbildung, die mit der der komplementierten Mutante
c10ΔccpA vergleichbar war (WILLENBORG et al. 2011). Sechs der Isolate zeigten
eine eher mittelmäßige Kapselausbildung, die sich in ihrer Dichte und zum Teil auch
in ihrer Dicke geringer darstellte als die der komplementierten Mutante c10ΔccpA,
aber dennoch stärker als bei den kapsellosen Mutanten. Bei neun Isolaten war die
Kapsel wenig dicht und die Länge der „Fasern“ zusätzlich recht gering, sodass von
einer defekten Kapselausbildung ausgegangen werden muss. Die Kapselstruktur
entsprach in diesen Fällen weitestgehend der der kapsellosen Mutanten (10ΔccpA,
10ΔcpsEF). Bei vier Isolaten waren nur sehr vereinzelt relativ kurze „Fasern“ auf der
Oberfläche der Bakterienzellen zu erkennen, sodass bei diesen mit großer
Wahrscheinlichkeit das Kapselbildungsvermögen hochgradig gestört war. Eines der
Isolate zeigte tatsächlich gar keine „Fasern“ auf der Oberfläche und wurde damit als
unbekapselt beurteilt.
Ergebnisse
84
Abbildung 14: Kapseldarstellung im TEM nach WILLENBORG et al. (2011)
Ergebnisse
85
2016/01183/05/05 2016/01991/01/01
2016/02985/02/03 2016/04144/09/09
2016/04646/02/05 2016/00037/10/10
Abbildung 15: Beschriftung folgt unterhalb der vollständigen Abbildung.
Ergebnisse
86
2016/01635/01/01 2016/03495/01/01
2015/06015/09/25 2016/01739/04/09
2016/02027/01/02 2016/02992/01/02
Abbildung 15 Fortsetzung
Ergebnisse
87
2015/04406/01/02 2016/02253/01/01
2016/02284/04/04 2016/03829/04/12
2016/03290/20/20 2015/03487/01/01
Abbildung 15 Fortsetzung
Ergebnisse
88
2016/01990/01/01 2016/04145/13/13
2015/02796/01/09 2016/03188/04/17
Abbildung 15: TEM-Aufnahmen der 22 nicht-typisierbaren S.-suis-Isolate aus Kohorte B Der Maßstab entspricht 0,2 µm.
Ergebnisse
89
Tabelle 8: Beurteilung der Kapselausprägung bei nicht-typisierbaren S.-suis-Isolaten aus Kohorte B
Stammbezeichnung Kapseldicke [nm] Interpretation Dichte Dicke ∑
St10a 100-150 ++++ ++++ ++++ 10ΔccpAa 30-50 ++ + + c10ΔccpAa 60-90 +++ +++ +++ 10ΔcpsEFa 30-40 + + +
2016/04646/02/05 70-95 +++ +++ +++ 2016/04144/09/09 80-130 ++ ++++ +++ 2016/01183/05/05 70-100 ++ +++ ++ 2016/03495/01/01 60-100 ++ +++ ++ 2015/06015/09/25 50-70 ++ ++ ++ 2016/00037/10/10 70-85 ++ ++ ++ 2016/01991/01/01 70-80 ++ ++ ++ 2016/02985/02/03 50-65 ++ ++ ++ 2016/01635/01/01 60-75 + ++ + 2016/01739/04/09 25-40 ++ + + 2016/02027/01/02 20-35 ++ + + 2015/03487/01/01 30-50 + + + 2015/04406/01/02 25-40 + + + 2016/02253/01/01 30-55 + + + 2016/02284/04/04 25-35 + + + 2016/02992/01/02 50-70 + + + 2016/03290/20/20 30-45 + + + 2016/01990/01/01 25-55 (+) + (+) 2016/03829/04/12 40-55 (+) + (+) 2015/02796/01/09 20-25 + (+) (+) 2016/04145/13/13 20-25 + (+) (+) 2016/03188/04/17 0 - - -
Kohorte B: 2015 – 2016 a untersucht durch WILLENBORG et al. (2011) Dichte: ++++ sehr dicht / +++ dicht / ++ mittel dicht / + wenig dicht / (+) sehr wenig dicht / - keine Fasern Dicke: (Für die Bewertung wurde der größte gemessene Wert benutzt.) ++++ ≥ 120 nm / +++ 90-119 nm / ++ 60-89 nm / + 30-59 nm / (+) ≤ 29 nm / - keine Fasern Gesamtbeurteilung (∑): (Mittelwert aus Beurteilung der Dichte und Dicke. Bei unklarem Ergebnis wurde die niedrigere Beurteilung gewählt.) ++++ sehr gut ausgebildete Kapsel / +++ gut ausgebildete Kapsel / ++ mittelmäßig ausgebildete Kapsel / + defekt ausgebildete Kapsel / (+) sehr defekt ausgebildete Kapsel / - keine Kapsel
Ergebnisse
90
4.4.4 Multi-Locus-Sequenz-Typisierung
Alle 22 nicht-typisierbaren Isolate wurden mittels Multi-Locus-Sequenz-Typisierung
untersucht. Damit sollte einerseits die Zugehörigkeit zur Spezies S. suis zusätzlich
verifiziert werden und andererseits sollte untersucht werden, ob diese Isolate
untereinander eine gewisse Verwandtschaft zeigten und/oder ob sie sich unter
Einbezug der S.-suis-MLST-Online-Datenbank in bestimmte klonale Komplexe
einordnen ließen.8
4.4.4.1 Zuordnung zu Sequenztypen
21 der 22 Isolate konnte mit dem genannten Verfahren nach KING et al. (2002) ein
Allelprofil und ein Sequenztyp (ST) zugeordnet werden, wobei in einem Fall für die
Amplifikation des mutS-Genfragments alternative Primer nach REHM et al. (2007)
verwendet werden mussten. Einem der 22 Isolate konnte kein komplettes Allelprofil
zugeordnet werden, da sich das thrA-Genfragment nicht amplifizieren ließ. Somit
konnte diesem Isolat kein Sequenztyp (ST) zugeordnet werden. Den anderen 21
Isolaten wurde ein ST zugeordnet.
Zwei Isolate gehörten zu jeweils einem bereits bekannten ST, während die restlichen
19 Isolate neue Sequenztypen repräsentierten. Die meisten dieser Isolate zeigten
mindestens auf einem Genlocus ein bisher noch nicht beschriebenes Allel. In drei
Fällen ergab sich der neue ST ausschließlich durch neue Kombinationen von bereits
bekannten Allelen. Die Zuordnung der Allelnummern und des jeweiligen
Sequenztyps erfolgte durch Adrian Whatmore, einem der Administratoren der
S.-suis-MLST-Datenbank. Die Zuordnung der ST sowie einer individuelle Isolat-ID für
jedes Isolat ist Tabelle 7 zu entnehmen.
4.4.4.2 Analyse mittels Neighbour-Joining
Mittels Neighbour-Joining-Algorithmus wurden die MLST-Sequenzdaten bezüglich
Ähnlichkeiten verglichen und ein Dendrogramm gezeichnet (Abbildung 16). Die
Auswertung zeigt, dass aufgrund des recht geringen Ähnlichkeitsmaßes die nicht-
typisierbaren Isolate untereinander keine engere Verwandtschaft erkennen lassen. 8 http://pubmlst.org/ssuis/ Kurator: Adrian Whatmore
Ergebnisse
91
Abbildung 16: Dendrogramm der nicht-typisierbaren Isolate Erstellt nach einer Analyse mittels Neighbour-Joining.
4.4.4.3 Nicht-typisierbare Isolate im Vergleich mit der gesamten S.-suis-MLST-Datenbank
Mit dem eBURST-Algorithmus wurden die 831 unterschiedlichen Sequenztypen aus
der S.-suis-MLST-Onlinedatenbank (Stand Januar 2017) inklusive der 21 MLS-
typisierten Isolate aus dieser Studie anhand ihrer Allelprofile analysiert. Der
Algorithmus gruppiert ST, die sich nur in einem Allel unterscheiden, in gemeinsame
klonale Komplexe (CC). Abbildung 17 zeigt eine Übersicht dieser Auswertung, einen
sogenannten Populations-Schnappschuss. Die sich nur in einem Allel
unterscheidenden ST, auch als Single-Locus-Varianten (SLV) bezeichnet, sind
jeweils durch Linien miteinander verbunden. Im Zentrum eines jeden CC befindet
sich jeweils der ST mit den meisten SLV, bei dem angenommen wird, dass er der
primäre Gründer des jeweiligen CC ist. Dieser ST gibt dem jeweiligen Komplex auch
seinen Namen.
Es ist zu sehen, dass ein Großteil der 831 ST - durch schwarze Punkte
repräsentiert - sich keinem CC anschloss. Den größten CC stellte CC1 dar. Bei
einem weiteren größeren CC war ST16 der Primäre Gründer. Dieser CC16
versammelte drei Subgruppengründer unter sich, nämlich ST17, 15 und 87. Das
Ergebnisse
92
Isolat 2016/03188/04/17 aus der vorliegenden Studie gehörte zum ST87
(vgl. Tabelle 7). Diesem ST gehörten zwei weitere Isolate in der Datenbank an, die
aus Dänemark bzw. den Niederlanden stammten (vgl.Tabelle 27). Diese beiden
Isolate trugen wie noch einige weitere SLV und DLV von ST87 den Serotyp 8.
Insgesamt kamen sowohl bei den SLV als auch bei den DLV von ST87 Carrier-,
Lungen- oder invasive Isolate mit unterschiedlichen Serotypen vor, die aus
unterschiedlichen europäischen und asiatischen Ländern stammen. Außer dem
gehäuften Vorkommen von Serotyp 8 waren keine offensichtlichen Gemeinsamkeiten
bei diesen Isolaten erkennbar.
Der ST826 eines weiteren Isolates aus der vorliegenden Studie (2015/02796/01/09)
gruppierte sich in den CC94. Das Isolat 2015/02796/01/09 wurde als einziger
Vertreter dem ST826 zugeordnet. Unter anderem stand der ST826 über eine DLV
mit dem Komplex 104 in Verbindung, dem auch humanpathogene Isolate aus
Thailand zugeordnet wurden. Das erwähnte Isolat aus dieser Studie stammte jedoch
nicht aus einem invasiven Geschehen, sondern aus einem Pneumonie-Fall beim
Schwein.
Die ST der weiteren 19 untersuchten Isolate zeigten keine SLV zu anderen ST und
gehören damit auch keinem CC an. Zum Teil zeigten sich aber Double-Locus-
Varianten (DLV), d.h. die ST unterschieden sich in ihrem Allel auf zwei der sieben
Genloci. In Tabelle 27 sind die ST der Isolate aus dieser Studie aufgelistet, bei denen
sich SLV oder DLV zeigten. Bei SLV und mit geringerer Wahrscheinlichkeit auch bei
DLV kann von einer evolutionären Verwandtschaft zwischen den betreffenden
Isolaten ausgegangen werden. Aus diesem Grund wurden in Tabelle 27 auch die
jeweils zu dem ST gehörenden Isolate und die dazugehörigen
Hintergrundinformationen aus der S.-suis-MLST-Datenbank zusammengestellt.
Diejenigen ST der 21 Isolate, die keine SLVs oder DLVs hatten, wurden nicht in die
Tabelle aufgenommen.
Ergebnisse
93
Abbildung 17: eBURST-Analyse (Population Snapshot) der gesamten S.-suis-MLST-Datenbank Stand der MLST-Datenbank vom 27.01.2017 Die schwarzen Punkte repräsentieren einzelne ST. Die schwarzen Linien verbinden einen ST mit seinen SLV (Single Locus Variants). blaue Kreise: Gründer der Klonalen Komplexe gelbe Kreise: Gründer von Subgruppen
Ergebnisse
94
Abbildung 18: Klonaler Komplex 16 Der Ausschnitt aus der eBURST-Analyse der gesamten S.-suis-MLST-Datenbank (27.01.2017) zeigt CC16 mit seinem primären Gründer ST16 und seinen Subgruppengründern, zu denen auch ST87 gehört. Die schwarzen Linien verbinden einen ST mit seinen SLV (Single Locus Variants).
Abbildung 19: Klonaler Komplex 94 Der Ausschnitt aus der eBURST-Analyse der gesamten S.-suis-MLST-Datenbank (27.01.2017) zeigt CC94 mit dem primären Gründer ST94 und seinen Subgruppengründer. Die schwarzen Linien verbinden einen ST mit seinen SLV (Single Locus Variants). ST826 ist eine SLV des ST94.
Ergebnisse
95
4.5 Antibiotika-Resistenzen bei S.-suis-Isolaten
In der vorliegenden Studie wurden alle 522 Isolate im Mikrodilutionsverfahren auf
ihre Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antibiotika untersucht. In vier Fällen
gelang der Test trotz wiederholtem Ansatz nicht, da die betreffenden Isolate kein
entsprechendes Wachstum im verwendeten Flüssigmedium zeigten. In ein paar
weiteren Fällen wurden nur einzelne Antibiotika nicht beurteilt, da das Ergebnis nicht
absolut eindeutig war und die Beurteilung der Gesamt-Resistenzlage dadurch nicht
verfälscht werden sollte. Daraus ergeben sich die z.T. geringgradig divergierenden
Gesamtstichprobenzahlen in Tabelle 9 und 28. Die Antibiotika Apramycin,
Cefquinom, Clindamycin und Neomycin waren nur bis Mitte 2015 in das Testsystem
integriert, weshalb die Stichprobengröße hierbei deutlich kleiner war als bei den
anderen Antibiotika.
Ergebnisse
96
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Ergebnisse
97
4.5.1 Resistenzlage in der Gesamtpopulation
In Tabelle 9 sind die Ergebnisse der Empfindlichkeitsprüfungen für die einzelnen
Antibiotika dargestellt. Für die untersuchten Verdünnungsstufen der Antibiotika ist
jeweils die Anzahl der Isolate, deren MHK dieser Stufe entspricht, eingetragen. Für
jedes getestete Antibiotikum wurden aus der Gesamtheit der Isolate der MHK50-Wert
und der MHK90-Wert berechnet. In Tabelle 10 sind die Antibiotika aufgeführt, zu
denen das CLSI Grenzwerte für S. suis oder Streptococcus spp. allgemein beim
Schwein definiert hat, von denen die Beurteilung eines Isolates in sensibel,
intermediär oder resistent abgeleitet werden soll (CLSI 2013, 2015). Die Beurteilung
gemäß CLSI richtet sich nach den unterschiedlichen Tierarten und den betroffenen
Organen/Geweben, aus denen ein Bakterium isoliert worden ist, sowie danach,
welche Konzentration des Antibiotikums im jeweiligen Gewebe in situ überhaupt
erreicht werden kann. Deshalb muss einschränkend erwähnt werden, dass die
Grenzwerte für S. suis lediglich für Atemwegsinfektionen beim Schwein definiert
wurden und somit maximal einen hinweisenden Charakter für die Interpretation der
Resistenzlage von z.B. ZNS- oder Gelenksisolaten besitzen.
Weiterhin sind in Tabelle 10 die Interpretationen der Daten aus der MHK-Testung der
Isolate-Sammlung dargestellt. Gegenüber Amoxicillin/Clavulansäure und
Enrofloxacin zeigten sich jeweils mehr als 99% der Isolate als sensibel. Bei
Florfenicol, Ampicillin und Ceftiofur waren dies immer hin noch mehr als 98% und bei
Penicillin G noch knapp 97%. Hingegen waren nur 37,33% der Isolate gegenüber
Erythromycin sensibel und sogar nur 4,84% gegenüber Tetracyclin.
Ergebnisse
98
Tabelle 10: Klinische MHK-Grenzwerte nach CLSI für S. suis bei respiratorischen Erkrankungena und Resistenzlage der S.-suis-Isolate aus 2015-2016 Antimikrobieller Wirkstoff Interpretation des MHK-Wertes
(µg/ml) nach CLSI 2015b MHK-Interpretation
S.-suis-Isolate 2015-2016
sensibel intermediär resistent S (%) I (%) R (%)
Amoxicillin/Clavulansäure ≤8/4 16/8 ≥32/16 99,81 0,19 0 Ampicillin ≤0,5 1 ≥2 98,46 0,77 0,77 Ceftiofur ≤2 4 ≥8 98,05 0,78 1,17 Enrofloxacin ≤0,5 1 ≥2 99,02 0,39 0,59 Erythromycin ≤0,25 0,5 ≥1 37,33 0 66,67 Florfenicol ≤2 4 ≥8 98,84 1,16 0 Penicillin G ≤0,25 0,5 ≥1 96,91 1,35 1,74 Tetracyclin ≤0,5 1 ≥2 4,84 12,96 82,20 a für Amoxicillin/Clavulansäure wurden die Grenzwerte für andere Organismen außer
Staphylokokken angewendet und für Erythromycin wurden die Grenzwerte für Streptococcus spp. angewendet (CLSI 2013)
b für Amoxicillin/Clavulansäure und Erythromycin wurden die Grenzwerte nach CLSI 2013 übernommen, da für 2015 keine definiert wurden
4.5.2 Assoziation zwischen Resistenz und Lokalisation im Tier
Anhand der unter 3.1.2 erläuterten Einteilung der Isolate in drei Gruppen aus
unterschiedlichen Lokalisationen wurden auch die MHK-Werte der Isolate noch
einmal gesondert ausgewertet. So sind in Tabelle 28 zusätzlich zu den MHK50- und
MHK90-Werten der Gesamtpopulation auch die der einzelnen Gruppen errechnet
worden. Die unterschiedliche Stichprobengröße der einzelnen Gruppen sollte immer
mit berücksichtigt werden. Für die Antibiotika Apramycin, Cefquinom, Clindamycin
und Neomycin wurde aufgrund der geringen Stichprobengröße auf die Berechnung
der MHK50- und MHK90-Werte in den Gruppen der Lungen- und Carrier-Isolate
verzichtet.
Für folgende Antibiotika ergaben sich keine Abweichungen der Werte im Vergleich
der Gruppen: Amoxicillin/Clavulansäure, Ampicillin, Colistin, Florfenicol, Gentamycin,
Spectinomycin, Tetracyclin und Tilmicosin.
Bei den Antibiotika Ceftiofur, Cephalotin, Enrofloxacin, Penicillin G, Tiamulin und
Trimethoprim/Sulfamethoxazol zeigten sich geringfügige Unterschiede in den MHK90-
Werten zwischen den einzelnen Gruppen. Die Werte unterschieden sich allerdings
jeweils nur um eine Verdünnungsstufe. Bei Ceftiofur lag der MHK90-Wert bei den
Ergebnisse
99
Lungen-Isolaten um eine Verdünnungsstufe niedriger als bei invasiven und
Carrier-Isolaten. Bei Enrofloxacin und Cephalotin lag der MHK90-Wert der
Carrier-Isolate niedriger als jener der anderen beiden Gruppen. Hingegen war der
Wert bei Penicillin G, Tiamulin und Trimethoprim/Sulfamethoxazol bei den invasiven
Isolaten niedriger als bei den Carrier-Isolaten, sowie im Fall der beiden
erstgenannten Wirkstoffe auch gegenüber den Lungen-Isolaten. Bei Erythromycin
zeigten die Gruppen der Lungen- und Carrier-Isolate einen erhöhten MHK50-Wert im
Vergleich zu den invasiven Isolaten.
In Tabelle 11 wurden die MHK-Daten aus den drei Gruppen anhand der CLSI-
Grenzwerte interpretiert. Mit Ausnahme des Antibiotikums Amoxicillin/Clavulansäure,
für welches überhaupt nur ein einziges Isolat von insgesamt 518 Isolaten als nicht
sensibel beurteilt wurde, lässt sich eine Tendenz erkennen, dass sich die invasiven
Isolate zu einem größeren Anteil sensibel gegenüber den einzelnen Antibiotika
verhielten als die Lungen- und die Carrier-Isolate. Im Umkehrschluss zeigten die
Carrier- und Lungen-Isolate auch einen noch größeren Anteil resistenter Isolate
gegenüber Tetracyclin und Erythromycin als die invasiven Isolate.
Gegenüber Penicillin G waren in der invasiven Gruppe signifikant mehr Isolate
sensibel als in der Lungen-Gruppe (p=0,0043). Im Vergleich mit der invasiven
Gruppe wurden sowohl in der Lungen- (p=0,0034) als auch in der Carrier-Gruppe
(p=0,002) signifikant mehr Isolate als intermediär beurteilt. Bei Ampicillin gab es in
der Carrier-Gruppe signifikant mehr intermediär beurteilte Isolate als in der invasiven
Gruppe (p=0,0163). Die Resistenzrate bei Ceftiofur lag sowohl in der Lungen-Gruppe
mit p=0,0470 als auch in der Carrier-Gruppe mit p=0,0440 signifikant höher im
Vergleich mit der invasiven Gruppe. Die Carrier-Gruppe hatte gegenüber der
invasiven Gruppe signifikant weniger Ceftiofur sensible Isolate (p=0,0062). Bei
Erythromycin waren in der Carrier-Gruppe sowohl im Vergleich mit der invasiven
Gruppe (p=0,0132) als auch mit der Lungen-Gruppe (p=0,0487) signifikant mehr
Isolate resistent.
Ergebnisse
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Ergebnisse
101
4.5.3 Assoziation zwischen Resistenz und Serotyp
Bei der Auswertung der MHK-Daten fiel auf, dass die nicht-typisierbaren Isolate bei
verschiedenen β-Laktam-Antibiotika vermehrt Resistenzen im Vergleich mit häufig
vorkommenden Serotypen wie 2 oder 1/2 und 9 zeigten. So verhielten sich
gegenüber Penicillin (p=0,0038), Ampicillin (p=0,0254) und Ceftiofur (p=0,0006)
signifikant weniger Isolate in der nicht-typisierbaren Gruppe sensibel als in der
Gruppe der Serotyp-2- oder -1/2-Isolate. Zum Teil zeigten die nicht-typisierbaren
Isolate hierbei Resistenzen gegenüber gleich mehreren β-Laktam-Antibiotika. Bei
den häufiger vorkommenden Serotypen (2 oder 1/2, 9, 4, 7, 8, 3, 1 oder 14) waren
die Resistenzraten die β-Laktam-Antibiotika und Enrofloxacin betreffend sehr ähnlich.
Bei Tetracyclin lag die Resistenzrate bei Serotyp 8 mit 96,4% recht hoch im
Vergleich mit den anderen Serotypen (70-80%), es zeigte sich aber keine
Signifikanz. Der Anteil an Tetracyclin sensiblen Serotyp-9-Isolaten (0%) unterschied
sich signifikant (p=0,0342) vom Anteil sensibler Serotyp-2- oder -1/2-Isolate (5,56%).
4.5.4 Multiresistente S.-suis-Isolate
Auf der Grundlage einer phänotypischen Empfindlichkeitsprüfung bezeichnet man
diejenigen Isolate als multiresistent, die gegen drei oder mehr Antibiotika aus
verschiedenen Antibiotikaklassen resistent sind (SCHWARZ et al. 2010). Zwölf der
518 untersuchten Isolate zeigten Mehrfachresistenzen gegenüber drei oder mehr
Antibiotika verschiedener Wirkstoffklassen (Tabelle 12). Das entspricht 2,32%.
Zumeist werden nur ein oder wenige Vertreter einer Antibiotikaklasse in die
Resistenzprüfung mit einbezogen, auf deren Grundlage dann auf das
Resistenzverhalten des Erregers gegenüber anderen Vertreter derselben Klasse
geschlussfolgert werden kann. Bei einigen Antibiotikaklassen, wie z.B. den
β-Laktam-Antibiotika, gibt es allerdings auch Resistenzen, die nicht auf alle Vertreter
dieser Klasse bezogen werden können, sondern nur auf Untergruppen. In diesen
Fällen sollten die Resistenzen gegenüber einzelnen Untergruppen in den
Antibiotikaklassen gesondert Beachtung finden (SCHWARZ et al. 2010). So zeigt
Tabelle 12, dass sich die multiresistenten Isolate in der hiesigen Untersuchung mal
gegenüber nur einem, in anderen Fällen aber gegenüber mehreren Vertretern der
β-Laktam-Antibiotika resistent verhielten.
Ergebnisse
102
Alle zwölf Isolate waren resistent gegenüber Tetracyclin und Erythromycin. Ein Isolat
(2015/02796/01/02) zeigte zusätzlich Resistenzen gegenüber Enrofloxacin, ein
Fluorchinolon, und Ceftiofur als einen Vertreter der β-Laktam-Antibiotika, sodass es
insgesamt gegenüber vier der getesteten Antibiotikaklassen als resistent zu
beurteilen ist. Zehn der zwölf Isolate zeigten zusätzlich zu Tetracyclin und
Erythromycin auch Resistenzen gegenüber einem oder mehreren Vertretern der
β-Laktame. Ein anderes der zwölf Isolate (2016/01739/04/09) verhielt sich den
β-Laktam-Antibiotika gegenüber sensibel, zeigte aber neben einer Tetracyclin- und
Erythromycin-Resistenz auch eine Enrofloxacin-Resistenz.
Wie angesprochen wurde nur ein einziges der 518 untersuchten Isolate gegenüber
Amoxicillin/Clavulansäure als nicht sensibel beurteilt. Dieses Isolat
2016/01991/01/01, ein nicht-typisierbares Isolat aus dem ZNS, wurde mit einer MHK
von 16/8 µg/ml als intermediär gegenüber Amoxicillin/Clavulansäure beurteilt.
Weiterhin zeigte das Isolat als einziges in der Sammlung extrem hohe MHK-Werte
bei den β-Laktam-Antibiotika. So war die MHK für Penicillin G, Ampicillin und
Ceftiofur jeweils größer oder gleich der getesteten Maximalkonzentration des
jeweiligen Wirkstoffs.
Fünf der zwölf Isolate stammten aus der Lunge, vier zählten zu den invasiven
Isolaten und drei zu den Carrier-Isolaten. Prozentual an der untersuchten
Gesamtzahl pro Gruppe waren das 1,14% multiresistente invasive Isolate, 4,5%
multiresistente Lungen-Isolaten und 5,77% multiresistente Carrier-Isolaten. Die drei
Carrier-Isolate zeigten sich im Gegensatz zu den invasiven und Lungen-Isolaten
sensibel gegenüber Penicillin G und den getesteten Aminopenicillinen.
Fünf der zwölf Isolate waren nicht-typisierbar, drei Isolate hatten den Serotyp 16,
zwei Serotyp 21 und jeweils ein Isolat Serotyp 11 oder 18. Von den vier invasiven
Isolaten war ein Isolat nicht-typisierbar, die anderen drei gehörten zu Serotyp 11, 16
bzw. 21. Bei den fünf Lungen-Isolaten waren zwei nicht-typisierbar, zwei gehörten zu
Serotyp 16 und eines zu Serotyp 18. Von drei Carrier-Isolaten waren zwei nicht-
typisierbar und eines gehörte zu Serotyp 21.
Ergebnisse
103
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Ergebnisse
104
4.6 Zusammengefasste Ergebnisse
Eine Multiplex-PCR für die molekulargenetische Serotypisierung von S.-suis-Isolaten
wurde im Zuge der vorliegenden Arbeit etabliert (OKURA et al. 2014). Für die
Spezies-Identifikation wurde zusätzlich der Nachweis des recN-Gens integriert. Im
Zeitraum von 2015 bis 2016 wurden damit 522 S.-suis-Isolate untersucht
(Kohorte B). Weiterhin wurden die nicht-typsierbaren Isolate aus der Sammlung von
(SILVA et al. 2006) mit der neu etablierten Methode nachuntersucht. Für den
Vergleich mit Kohorte B blieben danach 189 Isolate aus dem Zeitraum zwischen
1996 – 1998 und 2001 – 2004 (Kohorte A). Der Vergleich der Kohorten zeigte, dass
der Anteil an Serotyp 2 oder 1/2 bei den invasiven Isolaten hoch signifikant
zurückgegangen ist. In Kohorte B waren die Serotypen 2 oder 1/2 zusammen mit
Serotyp 9 aber weiterhin die am häufigsten isolierten invasiven Serotypen beim
Schwein. Die Anteile anderer Serotypen wie 7 und 4 sind allerdings angestiegen.
Die Untersuchung der Isolate hinsichtlich verschiedener Virulenzmarker ergab, dass
epf ausschließlich bei den Serotypen 1 oder 14 sowie 2 oder 1/2 vorkam und hoch
signifikant mit der Gruppe der invasiven Isolate assoziiert war. Sowohl mrp als auch
sly wurden bei Carrier-Isolaten signifikant seltener nachgewiesen als bei klinischen
Isolaten.
22 von 522 Isolaten aus Kohorte B blieben nicht-typisierbar. Untersuchungen mittels
TEM zeigten, dass einige der Isolate eine Polysaccharidkapsel ausbildeten. Andere
hingegen zeigten eine defekte oder gar keine Kapselbildung. Die MLST dieser
Isolate zeigte die Zugehörigkeit zu einer Vielzahl verschiedener Sequenztypen (ST).
Der Großteil dieser ST wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals beschrieben.
Die Untersuchung von 518 Isolaten aus Kohorte B im Mikrodilutionsverfahren lieferte
einen Überblick über die aktuelle Situation der Antibiotikaresistenzen bei deutschen
S.-suis-Isolaten. Die Resistenzraten bei den β-Laktam-Antibiotika waren sehr gering
(0 bis 1,7%). Gegenüber Tetracyclin waren hingegen 82,2% und gegenüber
Erythromycin 66,7% der Isolate resistent. Carrier-Isolate fielen zum Teil mit erhöhten
Resistenzraten gegenüber einzelnen Antibiotika, insbesondere im Vergleich mit
invasiven Isolaten, auf.
Diskussion
105
5 Diskussion
5.1 Typisierung von S.-suis-Isolaten
Die Grundlage für die vorliegende Arbeit bildete die Etablierung einer geeigneten
Methode, um S.-suis-Isolate serotypisieren zu können. Die Serotypisierung ist ein
weltweit genutztes Mittel, um S.-suis-Isolate zu charakterisieren und deren
Epidemiologie nachzuvollziehen. Die Feststellung von Serotyp-Prävalenzen in
verschiedenen geographischen Gebieten, die Beobachtung von Verschiebungen
dieser Prävalenzen im Laufe der Zeit und die Untersuchung von Zusammenhängen
zwischen bestimmten Serotypen und ihrer Pathogenität bilden die Grundlage für eine
effektive Bekämpfung der Infektion sowie den Schutz empfänglicher Wirtspezies, vor
allem dem Schwein und dem Menschen.
Die klassische Serotypisierung wird weltweit nur in wenigen Laboren durchgeführt.
Sie setzt eine Produktion von Hyperimmunseren im Versuchstier voraus. Schon aus
diesem Grund besteht ein dringender Bedarf nach geeigneten Ersatzverfahren.
Außerdem ist das klassische Verfahren sehr zeitaufwändig und auch fehleranfällig,
weshalb es nur von erfahrenen Untersuchern durchgeführt werden sollte.
Einige in den letzten Jahren veröffentlichte PCR-basierte Prüfverfahren ermöglichen
eine schnelle und zuverlässige Serotypisierung auf molekulargenetischer Ebene. Die
für diese Arbeit ausgewählte zweistufige Multiplex-PCR erwies sich als geeignet, da
sie alle bis zu Beginn dieser Arbeit bekannten Serotypen von S. suis identifizieren
kann (OKURA et al. 2014). Durch die einfache Durchführbarkeit können problemlos
auch mehrere Isolate innerhalb eines Tages typisiert werden. Im Vergleich zur
klassischen Serotypisierung ist dieses Verfahren quasi in jedem Prüflabor leicht zu
etablieren und durchzuführen. Außerdem hält sich der Kostenaufwand in tragbaren
Grenzen.
Um eine molekulargenetische Identifizierung der Spezies S. suis zu integrieren,
wurden Primer für ein recN-Genfragment entworfen. RecN erwies sich einerseits als
zuverlässig die früheren Serotypen 20, 22, 26 und 32 bis 34 von den „wahren“
Serotypen abzugrenzen und anderseits konnten so auch nicht-typisierbare
S.-suis-Isolate erfasst werden (ISHIDA et al. 2014). Damit wird z.B. die Erfassung
von phänotypisch spärlich oder unbekapselten Isolaten möglich. Die Integration
dieser Spezies-spezifischen recN-Primer ermöglicht die Detektion von
Diskussion
106
„wahren“ S.-suis-Isolaten, die auf Basis ihres Kapsellocus nicht typisiert werden
konnten, wenn diese z.B. zu neuen Serotypen gehören oder Mutationen und
Deletionen ein Binden der Kapselgen-Primer verhindern. Der Wissensstand über
gerade diese Gruppe der auf klassischem Wege nicht-typisierbaren Isolate ist noch
gering. Dennoch werden unbekapselte Isolate aber mit Endokarditis-Fällen in
Verbindung gebracht, was deren klinische Bedeutung hervorhebt
(PEDERSEN et al. 1984).
Die zusätzlich routinemäßig durchgeführte PCR zum Nachweis von gdh, sly, mrp, epf
und adiS diente in der vorliegenden Arbeit als zusätzliche Bestätigung der
Speziesdiagnose. Alle Isolate, die ein Amplifikat für recN zeigten, trugen auch gdh
und in den allermeisten Fällen auch mindestens adiS. Andersherum gab es aber
auch Fälle, in denen die Isolate für gdh ein positives Ergebnis zeigten, aber weder
recN noch die Banden für die früheren Serotypen aufwiesen. Diese Isolate wurden
als nicht zur Spezies S. suis zugehörig gewertet und folglich nicht in diese Arbeit
integriert. Dass der gdh-Nachweis mittels PCR nicht zu hundert Prozent spezifisch
für S. suis ist, wurde bereits in der Literatur beschrieben (OKWUMABUA et al. 2003,
LE TIEN et al. 2012, ISHIDA et al. 2014). Da in der Sammlung der Feldisolate keiner
der früheren Serotypen 20, 22, 26 und 32 bis 34 nachgewiesen wurde, enthält die
Sammlung nur Isolate, die recN-positiv sind und somit nach aktuellem Kenntnisstand
zu den „wahren“ S.-suis-Isolaten gezählt werden.
Aus dem Grund, dass das Koagglutinationsverfahren nach wie vor als Goldstandard
in der Serotypisierung von S. suis gilt, wurde zusätzlich zur Überprüfung der
Referenzstämme jeweils mindestens ein Isolat pro Serotyp aus der Feldisolate-
Sammlung durch unsere Kooperationspartnerin Dr. Hilde Smith überprüft. Das
Auftreten von zwei autoagglutinierenden Stämmen, die mittels PCR als Serotyp 15
bzw. 28 bestimmt wurden, zeigt einen weiteren Vorteil der molekulargenetischen
Typisierung gegenüber der konventionellen Serotypisierung. So konnte auch das
ausgewählte Serotyp-9-Isolat erst im zweiten Versuch typisiert werden.
Bei der Serotypisierung der Serotyp-10-Isolate gab es kontroverse Ergebnisse. Eines
der Isolate agglutinierte gleich mit mehreren Seren (9, 10, 21 und 22), während das
andere wiederholt nur mit Serum 9 agglutinierte. Eine Sequenzierung der PCR-
Produkte verifizierte jedoch das PCR-Ergebnis. Vermutlich weist die Kapsel von
Serotyp 10 in ihrer Antigenstruktur gewisse Ähnlichkeiten mit der Kapsel anderer
Diskussion
107
Serotypen auf, sodass es zum Teil zu Kreuzreaktionen mit anderen Seren, wie z.B.
mit dem von Serotyp 9, kommen kann. Das Vorkommen von Kreuzreaktionen
zwischen verschiedenen Serotypen ist in der Literatur beschrieben. Vermutlich
begründen sich diese darin, dass sich die CPS-Strukturen der verschiedenen
Serotypen doch teilweise sehr ähnlich sind (THONGKAMKOON et al. 2017).
Dass drei von insgesamt 26 im Koagglutinationverfahren untersuchten Feldisolaten
aufgrund von Autoagglutination oder Polyagglutination auf klassischem Wege nicht-
typisierbar waren, lässt vermuten, dass sich unter den restlichen Feldisolaten in der
vorliegenden Studie weitere befinden, die nur mittels PCR typisierbar sind, z.B.
solche, die keine oder eine defekte Kapsel ausbilden. Dahin gehende
Beobachtungen wurden bereits von OKURA et al. (2014) beschrieben.
5.2 Herkunft der Isolate
In beiden Kohorten stammten die gesammelten Feldisolate weitestgehend aus dem
Routinebetrieb des Diagnostiklabors am Institut für Mikrobiologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Betriebe, aus denen die Einsendungen
stammten, waren in beiden Kohorten vorrangig im Nord-Westen Deutschlands
angesiedelt (vgl. Abbildung 6). Da Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen eine
hohe Dichte an Schweine haltenden Betrieben besitzen (HEINRICH-BÖLL
STIFTUNG u. BUND FÜR UMWELT UND NATURSCHUTZ DEUTSCHLAND), ist
das vermehrte Probenaufkommen aus diesen Regionen folgerichtig (Abbildung 20).
Insofern repräsentieren die untersuchten 522 Isolate recht gut die Gesamtheit der
(nord-) deutschen S.-suis-Population, da in Gebieten mit einer hohen Dichte an
Schweinehaltungen auch dementsprechend vermehrt beprobt und eingesendet wird.
Eine „erzwungene“ Vergleichmäßigung der Probenzahlen bezogen auf die einzelnen
Gebiete würde das Gesamtbild des Serotypen-Vorkommens womöglich stark
verzerren. Insgesamt wurde mit der Sammlung aus Kohorte B deutschlandweit ein
etwas größeres Gebiet abgedeckt, was sich mit dem deutlich größeren
Probenumfang erklären lässt. Die Vergleichbarkeit der beiden Kohorten bezüglich
der Herkunft der Isolate ist durch das identische Kerngebiet dennoch gegeben.
Diskussion
108
Abbildung 20: Schweinedichte in Deutschland Aus dem Fleischatlas 2016 (HEINRICH-BÖLL STIFTUNG u. BUND FÜR UMWELT UND NATURSCHUTZ DEUTSCHLAND).
5.3 Verbreitung der Serotypen in der Gesamtpopulation
Durch die Nachtypisierung aller bis dahin nicht-typisierten Isolate aus Kohorte A
konnten letztlich die Serotypen-Verteilungen von zwei Kohorten gegenüber gestellt
werden, deren zu Grunde liegenden Sammlungen von Isolaten mehr als 10 Jahre
auseinander lagen. Dennoch wurden die Serotyp-Prävalenzen in den
Gesamtverteilungen nicht direkt miteinander verglichen, da sich zeigte, dass sich die
Anteile von invasiven, Lungen- und Carrier-Isolaten an der jeweiligen
Gesamtpopulation zwischen den Kohorten recht stark unterschieden. So schien ein
Vergleich der Kohorten innerhalb dieser drei Gruppen viel sinnvoller.
Die relativen Häufigkeiten für die Serotypen 1 oder 14, 2 oder 1/2, 7 und 9 in
Kohorte A unterschieden sich in geringem Maße von den veröffentlichten Zahlen von
SILVA et al. (2006), da die in 3.1.2 erwähnten Kriterien zu Grunde gelegt wurden und
dadurch einige der Isolate nicht berücksichtigt werden konnten. Über das
Vorkommen anderer Serotypen war allerdings in der Studie von SILVA et al. (2006)
Diskussion
109
Methoden bedingt nichts bekannt. Erkenntnisse darüber lieferte erst die
Nachtypisierung in der vorliegenden Studie mittels neu etablierter Multiplex-PCR.
Insgesamt kann man feststellen, dass beide Kohorten von den Serotypen 1 oder 14
bis 9 dominiert wurden. Auch waren in beiden Kohorten die Serotypen 2 oder 1/2 die
am häufigsten isolierten Serotypen, gefolgt von Serotyp 9. Diese Feststellungen
entsprechen den Angaben früherer Studien und spiegeln die weltweit
vorherrschende Bedeutung von Serotyp 2, sowie die in einigen europäischen Länder
wie den Niederlanden und Deutschland ebenfalls starke Bedeutung von Serotyp 9
wider (WISSELINK et al. 2000, SILVA et al. 2006, SCHULTSZ et al. 2012,
GOYETTE-DESJARDINS et al. 2014). Serotyp-2-Stämme sind weltweit nicht nur die
Hauptverursacher von verlustreichen Erkrankungen beim Schwein, sondern
verursachen auch die meisten S.-suis-Infektionen bei Menschen (GOYETTE-
DESJARDINS et al. 2014). S. suis zählt in einigen asiatischen Länder zu den
häufigsten Ursachen einer Meningitis beim Erwachsenen (MAI et al. 2008,
WERTHEIM et al. 2009), tritt aber auch in europäischen Ländern immer wieder als
Zoonoseerreger auf (VAN SAMKAR et al. 2015a, 2015b). Das Infektionsrisiko für den
Menschen durch andere Serotypen sollte aber nicht unterschätzt werden. So waren
in der Vergangenheit verschiedene andere Serotypen, darunter auch Serotyp 9,
Auslöser humaner S.-suis-Infektionen (KERDSIN et al. 2015). Der in Thailand
isolierte Serotyp-9-Stamm wurde dem ST16 zugeordnet. Diesem ST gehören auch
circa 85% der niederländischen Serotyp-9-Isolate an (KERDSIN et al. 2015).
Möglicherweise tragen damit einige dieser Stämme auch humanpathogenes
Potential.
Die Einteilung der Isolate in die Gruppen der invasiven Isolate, Lungen-Isolate und
Carrier-Isolate erfolgte wie in 3.1.2 beschrieben. Durch diese Art der Einteilung kann
allerdings nicht sicher auf die Virulenz eines Isolats geschlossen werden. Oft wird
zwar versucht, die Virulenz eines S.-suis-Isolats anhand klinischer Erscheinungen im
Tier einzustufen (SEGURA et al. 2017), dabei muss aber bedacht werden, dass eine
solche Einteilung das wahre Bild der Virulenz einzelner Isolate möglicherweise
verzerrt. In vielen Fällen werden Carrier-Isolate von den Tonsillen klinisch gesunder
Schweine z.B. am Schlachthof gewonnen, oder, wie in der vorliegenden Studie,
größtenteils aus Nasentupfern von klinisch unauffälligen Schweinen. Auch wenn
diese Tiere keine Anzeichen einer Infektion zeigten, ist davon auszugehen, dass
nicht alle Isolate tatsächlich avirulent sind. Wenn andere prädisponierende Faktoren
Diskussion
110
hinzukommen würden, könnte der ein oder andere Stamm möglicherweise doch eine
Infektion auslösen (GOTTSCHALK u. SEGURA 2000). Unter den Lungen-Isolaten
wiederum könnten sich auch avirulente Stämme befinden. So könnten diese als
Carrier-Isolat aus dem oberen Respirationstrakt passiv in die Lunge verschleppt
worden sein. In den meisten Fällen wurde S. suis nicht als einziges Pathogen aus
den betreffende Lungen isoliert, weshalb die Möglichkeit, dass die respiratorische
Symptomatik durch andere Lungen-pathogene Erreger ausgelöst wurde, keinesfalls
zu vernachlässigen ist. Ob der isolierte S.-suis-Stamm im einzelnen Fall überhaupt
an der Entstehung einer Pneumonie beteiligt war, ist nicht sicher bewiesen. Lediglich
die Gruppe der invasiven Isolate ist klar definiert. Die Isolate haben die Fähigkeit
gezeigt ins Blut und von dort in weitere, für S. suis typische Lokalisationen
vorzudringen (systemische Infektionen) und haben die für S.-suis-Infektionen
klassischen Krankheitsverläufe verursacht.
5.3.1 Invasive Isolate
In beiden Kohorten wurden die invasiven Isolate nur von wenigen Serotypen
dominiert. Dies entspricht den Angaben aus der Literatur (HERNANDEZ-
GARCIA et al. 2017). Am auffälligsten zeigte sich in der vorliegenden Untersuchung
(Kohorte B) der hoch signifikante Rückgang der Serotypen 2 oder 1/2 im Vergleich
zu Kohorte A. Serotyp-2-Stämme hatten bislang in Deutschland den größten Anteil
an invasiven S.-suis-Infektionen beim Schwein. Noch deutlicher zeigte sich diese
rückläufige Bedeutung der Serotypen 2 oder 1/2 bei der gesonderten Betrachtung
der ZNS-Isolate. Für die Bekämpfung der S.-suis-Infektionen bzw. den
prophylaktischen Schutz der Schweinebestände wurden und werden stallspezifische
Impfstoffe auf Grundlage eines vorher isolierten Bakterienstamms hergestellt und die
Tiere damit vakziniert. Im Gegensatz zu den Serotyp-9-Vakzinen werden Serotyp-2-
Impfungen als durchaus wirksam beschrieben (BAUMS et al. 2009,
BÜTTNER et al. 2012, SEGURA 2015). Der deutliche Rückgang der Serotypen 2
oder 1/2 im Vergleich der Kohorten unterstützt diese These. Auch andere Autoren
stellten die Vermutung an, dass durch erfolgreiche Vakzinierung die Serotyp-2-
Stämme in Europa bereits etwas zurückgedrängt werden konnten
(BÜTTNER et al. 2012).
Diskussion
111
Auf der anderen Seite zeigte sich in der hiesigen Studie eine gewisse Zunahme
anderer Serotypen, die ein invasives Krankheitsgeschehen auslösten. So scheint der
Rückgang der Serotypen 2 oder 1/2 zu Gunsten von Serotyp 7 und 4 verlaufen zu
sein. Diese, vor allem Serotyp 4, haben an Bedeutung als Meningitiserreger
gewonnen. Somit sollte zukünftig auch diesen Serotypen Aufmerksamkeit bei der
Bekämpfung der S.-suis-Infektionen zu Teil werden.
Die Prävalenz von Serotyp 9 stellte sich hingegen als sehr stabil dar. Das wiederum
könnte mit der eingeschränkten bzw. ausbleibenden Wirksamkeit von
Serotyp-9-Vakzinen zusammenhängen. BÜTTNER et al. (2012) vermuteten, dass
das vermehrte Aufkommen von Serotyp-9-Infektionen in Europa
(WISSELINK et al. 2000, SILVA et al. 2006) durch die erfolgreiche Vakzinierung von
Serotyp-2-Stämmen zustande kam. Dergleichen konnte in der vorliegenden Arbeit
nicht bestätigt werden. So scheinen derzeit zumindest eher andere Serotypen, wie
Serotyp 7 und 4, von dem Serotyp-2-Rückgang zu profitieren. Eine weitere mögliche
Erklärung für die stabile Serotyp-9-Prävalenz wäre, dass die autogenen Serotyp-9-
Vakzinen, wenn auch nicht so effektiv wie die Serotyp-2-Impfungen, zumindest dazu
beitragen, dass sich Serotyp-9-Stämme in den vergangenen 10 Jahren in
Deutschland nicht weiter ausgebreitet haben. In Kohorte B zeigte sich die derzeit
gleichwertig wichtige Bedeutung der Serotypen 2 oder 1/2 und Serotyp 9 als invasive
Infektionserreger für Schweine in Deutschland. Es herrscht nicht mehr die große
Dominanz der Serotypen 2 oder 1/2 wie noch vor mehr als 10 Jahren, sondern
zunehmend gewinnen auch andere Serotypen an Bedeutung.
Der Rückgang der Serotypen 1 oder 14 war bei der gesonderten Betrachtung der
ZNS-Isolate ebenfalls signifikant, was zeigt, dass diese Serotypen an Bedeutung als
Meningitiserreger verloren haben. So kamen in Kohorte B die Serotypen 1 oder 14
auch signifikant weniger unter den ZNS-Isolaten vor als unter den Gelenk-Isolaten.
Da sich dieselbe Tendenz auch schon in Kohorte A zeigte, kann man schlussfolgern,
dass die Serotypen 1 oder 14 möglicherweise einen gewissen Gewebetropismus
zum Gelenk entwickelt haben. Serotyp 4, und in geringerem Ausmaß auch die
Serotypen 9 und 3, scheinen hingegen eine etwas höhere Affinität zum ZNS als zum
Gelenk zu haben.
Dass in Kohorte B im Gegensatz zu Kohorte A auch vereinzelt invasive Isolate mit
insgesamt sehr seltenen Serotypen vorkamen, könnte ein Hinweis darauf sein, dass
Diskussion
112
auch S.-suis-Stämme mit bisher selteneren Serotypen an Virulenz und damit an
Invasivität gewonnen haben. Allerdings könnte auch die geringe Stichprobengröße in
Kohorte A der Grund sein, weshalb diese Serotypen dort nicht in der Gruppe der
invasiven Isolate gefunden wurden.
Insgesamt sollte man bei der Betrachtung von Serotyp-Prävalenzen nicht außer Acht
lassen, dass S.-suis-Stämme unter einem starken Selektionsdruck möglicherweise in
der Lage sind ihren Serotyp zu wechseln. Ein solcher Serotypen-Switch ist bei
Pneumokokken beschrieben worden (COFFEY et al. 1998) und wird in der Literatur
auch als mögliches Phänomen bei S.-suis-Stämmen im Vereinigten Königreich
diskutiert (KING et al. 2002). Übertragen auf die vorliegenden Ergebnisse dieser
Studie könnte das bedeuten, dass der durch Impfungen auf Serotyp 2 lastende
Selektionsdruck einen Serotypen-Switch hin zu Serotyp 4, 7 und ggf. weiteren
Serotypen bewirkt haben könnte.
Auffällig war weiterhin, dass der Anteil an nicht-typisierbaren Isolaten in der Gruppe
der invasiven Isolate in beiden Kohorten im Vergleich mit den Lungen- und
Carrier-Isolaten sehr gering war. Geht man davon aus, dass ein Großteil der Isolate
nicht-typisierbar ist, da sie keine Kapsel ausbilden, bekräftigt diese Beobachtung die
These, dass die Kapsel einen wichtigen Virulenzfaktor für S. suis darstellt und
entscheidend zur Invasionsfähigkeit der Isolate beiträgt.
Die vorliegende Arbeit liefert mit der molekulargenetischen Serotypsierung von
insgesamt 522 und davon 353 invasiven S.-suis-Isolaten wichtige epidemiologische
Daten, um die aktuelle Verbreitung verschiedener Serotypen in Deutschland
einschätzen zu können. Die hier erwähnten Beobachtungen können unter anderem
helfen den Fokus in der Bekämpfung von S.-suis-Infektionen mittels Vakzinen richtig
zu setzen bzw. anzupassen. Die Entwicklung neuer Vakzinen kann so zielgerichteter
erfolgen (vgl. auch SEGURA 2015). Vor dem Hintergrund, dass vermehrt auch
andere Serotypen wie Serotyp 4 oder 7 an klinischer Bedeutung gewonnen haben,
sollten auch diese Serotypen bei der Herstellung autogener Impfstoffe berücksichtigt
werden.
Diskussion
113
5.3.2 Lungen-Isolate
In der Gruppe der Lungen-Isolate zeigte sich in beiden Kohorten ein breiter verteiltes
Vorkommen verschiedener Serotypen. Dennoch dominierten die Serotypen 2
oder 1/2 bis 9. Möglicherweise sind diese Serotypen eher in der Lage, den
Respirationstrakt zu infizieren. Allerdings kann in beiden Kohorten nicht sicher
ausgeschlossen werden, dass der respiratorischen Symptomatik bei den beprobten
Schweinen nicht eine andere Ätiologie zu Grunde lag. Inwieweit die in diese Gruppe
eingeordneten Isolate eine Rolle bei der Entstehung einer Pneumonie spielten, kann
nicht beurteilt werden. Oft ist S. suis nur einer von vielen weiteren Faktoren, die an
der multifaktoriellen Ätiologie des „Porcine Respiratory Disease Complex“ (PRDC)
beteiligt sind (BROCKMEIER et al. 2002, OPRIESSNIG et al. 2011). Die Gruppe der
Lungen-Isolate spiegelt deswegen nur vage die wirkliche Population der Isolate
wider, die an der Entstehung einer Pneumonie beteiligt waren.
Die Prävalenzen der einzelnen Serotypen variierten zwar in gewissem Maß zwischen
den Kohorten, dennoch ergaben sich keine signifikanten Unterschiede. Das weist
darauf hin, dass die Verteilung der Serotypen innerhalb dieser Gruppe relativ stabil
zu sein scheint. In der S.-suis-Population der Lungen-Isolaten herrscht offensichtlich
kein starker Selektionsdruck, wie es in der invasiven Gruppe durch die
Serotyp-2-Vakzinierung der Fall zu sein scheint. Als Grundlage für Autovakzinen
werden in der Regel diejenigen Stämme verwendet, die ein invasives Geschehen
verursachen, und nicht diejenigen, die den Respirationstrakt betreffen oder keine
Klinik auslösen. Vor diesem Hintergrund ist das breitere Vorkommen anderer
Serotypen sowie nicht-typisierbarer Isolate erklärbar.
Hervorzuheben bleibt, dass in Kohorte A keine direkte Assoziation zwischen
Serotyp 7 und der Gruppe der Lungen-Isolate abzulesen war, was in der zu Grunde
liegenden Studie von SILVA et al. (2006) vermutet wurde. Durch die Nachtypisierung
von Isolaten im Zuge der vorliegenden Arbeit stellte sich sogar heraus, dass
Serotyp 4 der häufigste Serotyp innerhalb der Kohorte A war. Die
Serotypen 2 oder 1/2, 3 und 7 kamen allerdings nur geringfügig weniger vor. In
Kohorte B war das Vorkommen von Serotyp 7 sogar noch geringer, sodass nicht von
einer hervorstechenden Bedeutung dieses Serotyps innerhalb der Population der
Lungen-Isolate gesprochen werden kann (vgl. Abbildung 12). Kohorte B wurde durch
die Serotypen 2 oder 1/2 angeführt, gefolgt von Serotyp 4. So scheinen die fünf
Diskussion
114
zuletzt genannten Serotypen zusätzlich zum ihrem Potential ein invasives
Erkrankungsgeschehen auszulösen auch in höherem Maße als andere Serotypen für
Infektionen des Respirationstraktes verantwortlich zu sein. Interessanterweise
scheint Serotyp 9 in der Lunge keine herausragende Bedeutung zu haben, obwohl
dieser bei invasiven Infektionen eine wichtige Rolle spielt.
5.3.3 Carrier-Isolate
In der Gruppe der Carrier-Isolate zeigte sich in beiden Kohorten eine recht
homogene Verteilung verschiedener Serotypen. Es war keine Dominanz der
Serotypen 2 oder 1/2 bis 9 zu erkennen. Eine ähnlich breite Verteilung verschiedener
Serotypen und solcher, die eher selten von erkrankten Schweinen isoliert wurden,
wurde auch bei einer Untersuchung von Isolaten gesunder Schweine in Thailand
festgestellt (THONGKAMKOON et al. 2017). Die Carrier-Gruppe spiegelt die
Grundpopulation von S. suis wider. Aus dieser Grundpopulation heraus haben sich
vermutlich innerhalb der einzelnen Serotypen virulente Stämme entwickelt und
Nischen als Lungen-pathogene oder sogar invasive Isolate belegt.
In beiden Kohorten war der Anteil an nicht-typisierbaren Isolaten in der Carrier-
Gruppe mit Abstand am höchsten im Vergleich mit den invasiven und den
Lungen-Isolaten. Daraus könnte man schlussfolgern, dass ein Großteil der nicht-
typisierbaren Isolate avirulent ist. Das wiederum könnte auf eine fehlende oder
mangelhaft ausgebildete Polysaccharidkapsel, die als wichtiger Virulenzfaktor gilt,
zurückgeführt werden. Die Ergebnisse der TEM würden diese These unterstützen.
Von den insgesamt sechs nicht-typisierbaren Carrier-Isolaten zeigten drei eine
defekte, zwei eine sehr defekte und eines sogar gar keine Kapselausbildung
(vgl. Tabelle 8). Da in beiden Kohorten nur eine recht kleine Anzahl an Carrier-
Isolaten vorlag, können diese Vermutungen aber nicht verallgemeinert werden. Dies
müsste in einer umfangreicheren Sammlung an Carrier-Isolaten überprüft werden.
Dass nicht-typisierbare Isolate vor allem bei gesunden Schweinen, also Carriern,
vorkommen ist bekannt (SOARES et al. 2014, SEGURA et al. 2017,
THONGKAMKOON et al. 2017). Hinter einigen nicht-typisierbaren Carrier-Isolaten
aus der vorliegenden Studie verbergen sich womöglich auch Vertreter der in den
letzten Jahren neu beschriebenen NCLs oder sogar bisher gar nicht beschriebene
Serotypen. Vermutlich wurden diese NCLs auch deshalb erst in den letzten Jahren
Diskussion
115
beschrieben, da zunehmend auch Isolate von gesunden Schweinen untersucht
wurden und werden. Diese NCLs, respektive Serotypen, wurden womöglich zu
einem früheren Zeitpunkt noch nicht entdeckt und beschrieben, da Isolate ohne
klinische Bedeutung wenig oder gar nicht untersucht wurden. Mittels Ganz-Genom-
Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Carrier-Isolate vermehrt mobile
genetische Elemente tragen und eher zu Rekombination neigen (BAIG et al. 2015,
SEGURA et al. 2017). Möglicherweise ist dies der Fall, da sich diese Subpopulation
von S. suis immer wieder neu an sich ändernde Umgebungsfaktoren anpassen muss
und damit unter einem höheren Selektionsdruck steht als die invasiven Isolate.
Das signifikant vermehrte Vorkommen von Serotyp 29 in Kohorte B gegenüber
Kohorte A könnte vermuten lassen, dass sich dieser Serotyp in (Nord-)Deutschland
in den letzten Jahren gewissermaßen als Serotyp der Carrier-Tiere etabliert hat.
Dafür würde auch sprechen, dass bei den Lungen-Isolaten nur ein sehr kleiner Anteil
an Serotyp-29-Isolaten vorkam und sich unter den invasiven Isolaten kein einziges
Serotyp-29-Isolat befand. Serotyp-29-Isolate scheinen somit eher avirulent zu sein.
Bei der Betrachtung der Abbildung 13 fällt weiterhin auf, dass der Anteil der
Serotypen 2 oder 1/2 in Kohorte A höher lag als in Kohorte B, auch wenn nicht
signifikant. Ursächlich dafür könnte sein, dass in Kohorte A einige potentiell invasive
Isolate unwissentlich mit in die Carrier-Gruppe eingeordnet wurden, weil
möglicherweise der Vorbericht unauffällig war oder nur unvollständige klinische
Hintergrundinformationen vorlagen. Die Vorberichte zu den beprobten Tieren und
deren Herden aus Kohorte A standen für die vorliegende Arbeit nicht mehr zur
Verfügung, sodass die Eingruppierung der Isolate in die drei Gruppen von
SILVA et al. (2006) übernommen wurden.
5.4 Virulenzmarker-Profile bei verschiedenen Serotypen
Auch wenn in der Vergangenheit gezeigt wurde, dass Virulenzmarker (bzw. die dafür
codierenden Gene) wie Suilysin (sly), MRP (mrp) oder EF (epf) S.-suis-Isolate nicht
zuverlässig in virulente und avirulente Stämme einteilen, können sie dennoch
hinweisenden Charakter für das mögliche Virulenzpotential eines Stammes haben.
Außerdem kann das Erstellen eines Virulenzmarkerprofils zusätzlich zur
Serotypisierung helfen, bestimmte dominante Genotypen der Spezies
herauszufiltern. In der vorliegenden Untersuchung kamen Serotyp 2 oder 1/2 am
Diskussion
116
häufigsten in der Kombination mit allen drei Virulenzmarkern (epf+ mrp+ sly+) vor, am
zweithäufigsten mit nur mrp. Ähnliches konnte für deutsche S.-suis-Isolate bereits in
der Studie von SILVA et al. (2006) beobachtet werden. Der Genotyp
cps2 epf+ mrp+ sly+ kommt weltweit vorranging bei ST1 und ST7 vor, während die
nord-amerikanischen Serotyp-2-Stämme, die vorrangig dem ST25 angehören, in der
Regel keinen dieser Virulenzmarker aufweisen (GOYETTE-
DESJARDINS et al. 2014). Dennoch sind diese Stämme durchaus virulent
(GOTTSCHALK u. SEGURA 2000, FITTIPALDI et al. 2009). Dass epf in der
vorliegenden Arbeit nur im Zusammenhang mit Serotyp 2 oder 1/2 und Serotyp 1
oder 14 nachgewiesen wurde, entspricht auch früheren Beobachtungen
(WISSELINK et al. 2000). Sowohl mrp als auch sly konnten in der vorliegenden
Untersuchung bei vielen verschiedenen Serotypen nachgewiesen werden. Diese
Beobachtungen decken sich mit den Angaben aus der Literatur (LUQUE et al. 1999,
WISSELINK et al. 2000, FITTIPALDI et al. 2009). Ähnlich wie in der Studie von
SILVA et al. (2006) dominierte Serotyp 9 betreffend auch in der aktuellen Kohorte B
der Genotyp cps9 epf- mrp+ sly+, gefolgt von cps9 epf- mrp- sly+.
5.5 Assoziation zwischen Virulenzmarkern und Lokalisation im Tier
Epf zeigte sich in der vorliegenden Arbeit als hoch signifikant assoziiert mit den
invasiven Isolaten. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass epf gleichzeitig nur in
Verbindung mit den Serotypen 2 oder 1/2 sowie 1 oder 14 vorkam und diese
Serotypen jeweils zum Großteil zu den invasiven Isolaten zugeordnet wurden. Bei
einem Nachweis von epf kann so mit relativ großer Wahrscheinlichkeit davon
ausgegangen werden, dass es sich um ein invasives Isolat handelt. Die Anteile von
mrp unterschieden sich zwischen invasiven und Lungen-Isolaten nicht signifikant,
aber der Anteil an mrp bei den Carrier-Isolaten war jeweils hoch signifikant geringer.
Daraus lässt sich schlussfolgern, dass mrp zwar auch bei avirulenten Isolaten
vorkommen kann, also alleine nicht ausreichend für eine volle Virulenzausgeprägung
ist, aber dennoch, möglicherweise in Kombination mit anderen Virulenzfaktoren, eine
wichtige Rolle bei invasiven oder Lungen-pathogenen Isolaten spielt. Sly scheint bei
den Lungen-Isolaten sogar eine noch größere Bedeutung zu haben als bei invasiven
Isolaten. Bei den Carrier-Isolaten kommt dieser Virulenzmarker wiederum sehr bis
hoch signifikant seltener vor als bei invasiven und Lungen-Isolaten.
Diskussion
117
Insgesamt zeigt sich, dass Carrier-Isolate zwar nachweislich weniger häufig die
untersuchten Virulenzmarker tragen, aber zumindest mrp und sly dennoch auch bei
diesen Isolaten vorkommen können. Aus der Literatur ist bekannt, dass der
Nachweis der Virulenzmarker alleine nicht zwingend auf einen virulenten Stamm
hinweist (vgl. 2.5). Dennoch war in der vorliegenden Arbeit zumindest epf ein
zuverlässiger Indikator für die Invasivität der Isolate.
5.6 Nicht-typisierbare Isolate und deren Kapselexpression
Die Zugehörigkeit der nicht-typisierbaren Isolate aus Kohorte B zur Spezies S. suis
wurde durch verschiedene Untersuchungen (MALDI-TOF MS, gdh-Nachweis,
recN-Nachweis) abgesichert. Damit wurde bestätigt, dass es sich bei diesen Isolaten,
zumindest nach aktuellem Kenntnisstand der Wissenschaft, tatsächlich um
S.-suis-Isolate handelt (OKWUMABUA et al. 2003, LE TIEN et al. 2013,
PEREZ-SANCHO et al. 2015).
Die molekulargenetische Typisierung von S.-suis-Isolaten macht es möglich, einen
sehr großen Anteil an Isolaten zu serotypisieren; der Anteil an nicht-typisierbaren
Isolaten ist im Vergleich zur klassischen Serotypisierung dadurch deutlich gesunken
(OKURA et al. 2014, ZHENG et al. 2017). Der Hintergrund dabei ist, dass die
molekulargenetische Serotypisierung auf das Vorhandensein bestimmter
Serotyp-spezifischer Kapselgene abzielt. Solange diese Gene intakt sind, d.h. keine
Mutationen das Binden der Primer verhindert, spielt es für die Typisierung keine
Rolle, ob der Bakterienstamm aus anderen Gründen seine phänotypische
Kapselstruktur verloren hat. Da in der vorliegenden Studie kein kontinuierlicher
Methodenvergleich zwischen phänotypischer und genotypischer Serotypisierung
vorgenommen wurde, bleibt offen, ob die Anzahl an phänotypisch typisierbaren
Isolaten tatsächlich geringer gewesen wäre als die der genotypisch typisierbaren
Isolate. Dies ist aber anzunehmen.
Festzuhalten bleibt, dass in der aktuellen Untersuchung (Kohorte B) insgesamt nur
ein kleiner Anteil an Isolaten (22/522) mit der gewählten PCR-Methode nicht
typisierbar war. Da die Isolate auch phänotypisch nicht-typisierbar waren
(vgl. Tabelle 7), wurde die Ausbildung der Kapsel mittels TEM untersucht. Zum
Vergleich wurden die TEM-Aufnahmen aus den Untersuchungen von
WILLENBORG et al. (2011) herangezogen, da diese unter gleichen
Diskussion
118
Laborbedingungen erstellt wurden. Einschränkend muss man erwähnen, dass
andere Untersuchungen sowohl für Serotyp-2-Stämme als auch für andere
Serotypen durchaus divergierende Einschätzungen bei der Bewertung der
Kapselausbildung von S.-suis-Isolaten ergaben. So interpretierten einige Autoren
schon wenige „Fasern“ als normal ausgebildete Kapsel, während andere
in ähnlichen Fällen von unbekapselten Isolaten sprachen (BONIFAIT et al. 2010,
GOTTSCHALK et al. 2013, ZHENG et al. 2015, QIU et al. 2016). Da in diesen
Studien teilweise mit verschiedenen Protokollen für die Kultivierung und Vorbereitung
der Stämme sowie für die Fixierung gearbeitet wurde, sind diese TEM-Aufnahmen
nicht direkt mit denen aus der vorliegenden Studie vergleichbar. Allein die Art des
Mediums sowie Art und Dauer der Kultivierung können die Kapselausprägung
maßgeblich beeinflussen (QUESSY et al. 1994).
In der vorliegenden Untersuchung zeigten interessanterweise zwei der nicht-
typisierbaren Isolate eine recht gute und sechs weitere zumindest eine mittelmäßig
gut ausgebildete Polysaccharidkapsel. Dies könnte darauf hinweisen, dass es sich
um neue Serotypen, d.h. nicht um die Serotypen 1/2 und 1-34, handelt. Das
Vorkommen neuer Serotypen wurde in den vergangenen Jahren bereits in der
Literatur beschrieben (ZHENG et al. 2017). OKURA et al. (2016) schlussfolgerten
aus der Tatsache, dass bisher schon relativ viele Serotypen bei der Spezies S. suis
bekannt sind und immer wieder neue entdeckt werden, dass die Evolution der
CPS-Gene ständig fortlaufend ist.
Immerhin fünf der acht invasiven nicht-typisierbaren Isolate gehörten zu denen mit
mittelmäßiger Kapselausbildung. Wenn man davon ausgeht, dass die
Polysaccharidkapsel einen wichtigen Virulenzfaktor für S. suis darstellt und damit zur
Invasivität beiträgt, könnte dies die Vermutung unterstützen, dass es sich bei den
Isolaten, die im TEM deutliche kapselartige Strukturen zeigten, um neue Serotypen
handelt. Allerdings wurde die Kapselausprägung bei den weiteren drei
nicht-typisierbaren Isolaten aus der invasiven Gruppe als defekt beurteilt. Dies
wiederum weist darauf hin, dass die Kapsel, wenn auch ein wichtiger, dennoch kein
essentieller Virulenzfaktor zu sein scheint. Diese Feststellung machten bereits auch
andere Autoren (CHARLAND et al. 1996, BAUMS u. VALENTIN-WEIGAND 2009).
In der Literatur werden neben den genannten zahlreiche weitere potentielle
Virulenz-assoziierte Faktoren diskutiert (SEGURA et al. 2017).
Diskussion
119
Eines der 22 nicht-typisierbaren Isolate zeigte sich in der Untersuchung mittels TEM
tatsächlich als komplett unbekapselt (vgl. Abbildung 15). Vier Isolate zeigten eine
äußerst defekte Kapselausbildung mit nur wenigen sichtbaren „Fasern“. Weitere
insgesamt neun Isolate zeigten eine defekte Kapselausbildung, die derer der
kapsellosen Mutanten ähnelte. Mutmaßlich könnten bei allen diesen Isolaten
Mutationen auf dem Kapsellocus vorliegen, die dazu führen, dass weder eine Kapsel
ausgebildet werden kann, noch sie mittels PCR typisierbar sind. Im Detail könnte das
bedeuten, dass das PCR-Zielgen wzy bei diesen Bakterienstämmen Mutationen
aufweist, sodass die spezifischen Primer in der PCR nicht binden können. Ebenso
würde eine komplette Deletion des Kapsellocus dazu führen, dass ein Isolat weder
phäno- noch genotypisch typisierbar wäre. Eine weitere denkbare Variante wäre,
dass es sich um neue, bisher unentdeckte Serotypen handelt oder um jüngst
beschriebene NCLs, die mit der genutzten PCR-Methode noch nicht erfasst werden
konnten. Bei diesen Isolaten könnte dann aus anderen Gründen, wie z.B. Mutationen
oder Deletionen auf anderen Kapselsythesegenen oder einer Herabregulation der
Kapselsynthese, keine korrekte Kapsel ausgebildet werden. Ggf. wären diese Isolate
mit PCR-basierten Methoden, die auf die neu entdeckten Kapsellocus-Varianten
abzielen, einem der neu beschrieben Serotypen zuzuordnen (QIU et al. 2016).
Zwei der 22 nicht-typisierbaren Isolate wurden aus dem Herz isoliert. Das Isolat
2016/02985/02/03 stammte direkt von einer Herzklappe, das Isolat
2016/03495/01/01 allerdings vom Herzbeutel. Letzteres kann damit korrekterweise
nicht als ein Herz assoziiertes Isolat angesprochen werden. Allerdings kann auch
nicht ausgeschlossen werden, dass der Bakterienstamm auch innerhalb des
Herzens, also auf den Herzlappen vorkam. Der Literatur nach kann eine fehlende
Kapsel für S.-suis-Isolate einen Vorteil z.B. bei der Endokarditis-Pathogenese
bedeuten (LAKKITJAROEN et al. 2011). Allerdings zählen die beiden genannten
nicht-typisierbaren Herz-Isolate nach den Untersuchungen der Kapsel im TEM
durchaus zu den bekapselten Isolaten (vgl. Tabelle 8). Dennoch wäre es denkbar,
dass diese Isolate in vivo ihre Kapselsynthese herabreguliert hatten
(FITTIPALDI et al. 2012), was in der Endokarditis-Pathogenese einen Vorteil
bedeuten kann. Während der in-vitro-Kultivierung, die der TEM-Untersuchung voraus
ging, könnte die Kapselsynthese dann wieder hochreguliert worden sein. Ein
derartiges Off- und On-Switchen der Kapselausbildung durch reversible Mutationen
wurde bereits in der Literatur beschrieben (AUGER et al. 2016). Neben den zwei
Diskussion
120
genannten Herz-Isolaten, die mittels PCR nicht-typisierbar blieben, waren in
Kohorte B weitere 26 Isolate von Herzklappen oder aus dem Herzbeutel integriert. Es
wäre durchaus möglich, dass sich unter diesen Isolaten phänotypisch kapsellose
Varianten befinden. Diese sind zwar molekulargenetisch alle einem Serotyp
zuzuordnen gewesen, aber dennoch könnte die phänotypische Ausbildung der
Kapsel gestört oder herabreguliert sein. OKURA et al. (2014) haben diesbezüglich
beschrieben, dass durchaus ein gewisser Anteil an mittels PCR typisierbaren
Isolaten im Koagglutinationsverfahren nicht-typisierbar bleiben, was auf eine gestörte
Kapselausbildung oder einen Verlust der Kapsel hinweisen könnte.
5.6.1 Multi-Locus-Sequenz-Typisierung
21 der 22 nicht-typisierbaren Isolate, die mittels MLST untersucht wurden, konnte ein
komplettes Allelprofil zugeordnet werden. Für ein Isolat schlugen die Versuche, das
thrA-Genfragment zu amplifizieren, fehl. In der Literatur ist dieses Phänomen, dass
die Amplifikation eines oder mehrere MLST-Gene bei S. suis nicht gelingt, an
verschiedener Stelle beschrieben (KING et al. 2002, BAIG et al. 2015,
ZHENG et al. 2015). Zum einen wurde dies bei den „früheren“ Serotypen
(Serotyp 20, 22, 26, 32-34), aber auch bei den „wahren“ Serotypen
(Serotyp 1/2, 1-19, 21, 23-25, 27-31) beobachtet. Vor diesem Hintergrund muss die
Spezieszugehörigkeit des nicht MLS-typisierbaren Isolates in dieser Studie nicht
angezweifelt werden.
Zwei der 21 Isolate wurden jeweils einem aus der Datenbank bekannten ST
zugeordnet, während für die restlichen 19 Isolate neue ST benannt wurden.9 Um zu
überprüfen, ob die 21 nicht-typisierbaren Isolate nähere Verwandtschaften
untereinander aufweisen, wurde auf Basis der MLST-Gensequenzen mittels
Neigbour-Joining-Algorithmus ein Dendrogramm erstellt. Dieses zeigt insgesamt,
dass die betreffenden Isolate nur sehr weit entfernt verwandt sind. Daraus lässt sich
schlussfolgern, dass die nicht-typisierbaren Isolate aus dieser Studie keinen eigenen
Cluster innerhalb der gesamten untersuchten S.-suis-Population darstellen. Vielmehr
scheint es, dass diese sehr versprengt in der Gesamtpopulation vorkommen.
Eventuell entstehen im Zuge der rasch fortschreitenden Evolution des Erregers
9 http://pubmlst.org/ssuis/ Kurator: Adrian Whatmore
Diskussion
121
immer wieder neue nicht-typisierbare Stämme mit völlig unterschiedlichem
epidemiologischem Hintergrund. Auch könnten diese Ergebnisse darauf hinweisen,
dass sich eine Verwandtschaft zwischen S.-suis-Isolaten keinesfalls aufgrund ihrer
Kapseleigenschaften ablesen lässt, sondern dass vermutlich innerhalb weniger
Generationen ein Kapselverlust oder auch ein Serotypen-Switch vollzogen werden
kann. Auch die Ergebnisse aus der Studie von KING et al. (2002) lassen die
Vermutung zu, dass Kapselgene bei S. suis eventuell sogar horizontal ausgetauscht
werden können, wie es für Streptococcus pneumoniae bereits beschrieben wurde
(COFFEY et al. 1998, KING et al. 2002).
Diese These wird auch durch die Ergebnisse der eBURST-Analyse unterstützt.
Keines der untersuchten Isolate wies über SLVs auf eine nähere verwandtschaftliche
Beziehung zu den anderen hier untersuchten Isolaten auf. Jedoch ergaben sich bei
zwei Isolaten anhand ihres ST näher verwandtschaftliche Beziehungen zu
anderen ST, repräsentiert durch unterschiedliche Isolate aus der Datenbank.
Tabelle 27 zeigt aber auch, dass innerhalb eines CC und sogar innerhalb
desselben ST Isolate mit unterschiedlichen Serotypen vorkommen. Außerdem
stammen die Isolate trotz ihrer Ähnlichkeiten auf Basis der MLST-Gene teilweise aus
geographisch weit voneinander entfernten Gebieten aus der ganzen Welt.
Das könnte dafür sprechen, dass es sich dabei um CCs handelt, deren ST
evolutionär eher älter sind. Durch verschiedene Studien, in denen S.-suis-Feldisolate
serotypisiert und mittels MLST charakterisiert wurden, konnte in der Vergangenheit
schon die umfängliche geno- und phänotypische Diversität dieser Spezies gezeigt
werden. Die Diversität zeigt sich sowohl zwischen verschiedenen, als auch innerhalb
desselben Serotyps (KING et al. 2002, SEGURA et al. 2017).
Das nicht-typisierbare Isolat 2016/03188/04/17 aus der vorliegenden Studie wurde
dem ST87 zugeordnet. Der ST87 ist ein Subgruppengründer aus dem CC16, einem
Komplex, dem einige invasive Serotyp-9-Isolate aus Europa zugeordnet wurden
(BÜTTNER et al. 2012). In der MLST-Datenbank befanden sich zwei weitere Isolate
mit ST87, eines aus Dänemark und eines aus den Niederlanden (Tabelle 27). Beide
Isolate haben den Serotyp 8. Das Isolat 2016/03188/04/17 zeigte als einziges der
untersuchten Isolate in dieser Studie sicher keine Kapsel im TEM. Womöglich hat der
vorliegende Bakterienstamm durch Mutationen, die das wzy-Gen mit einschließen,
sein Kapselbildungsvermögen verloren. In der von ST87 gegründeten Subgruppe
kommt Serotyp 8 relativ häufig, aber nicht ausschließlich vor. Serotyp-9-Isolate
Diskussion
122
fanden sich allerdings keine, die über eine SLV mit ST87 in Verbindung standen. Das
gibt einen weiteren Hinweis darauf, dass Serotyp und ST bei S.-suis-Isolaten nicht
regelmäßig korrelieren.
Obwohl gewisse Merkmale, wie z.B. das zoonotische Potential bei Isolaten
bestimmter ST und damit auch in bestimmten CC gehäuft vorkommen, kann via
MLST dennoch nicht direkt auf das Virulenzpotential eines ST oder Isolats
geschlossen werden. In der vorliegenden Studie stand ein Lungen-Isolat vom
Schwein über eine DLV in Verbindungen zum CC104, der u.a. auch zwei invasive
Isolate vom Menschen beinhaltet. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein ST tatsächlich
aus einem anderen ST entstanden ist, ist allerdings bei DLVs auch geringer
einzuschätzen als bei SLVs. Tabelle 27 zeigt, dass sowohl innerhalb eines CC als
auch innerhalb eines ST durchaus Isolate mit sehr unterschiedlicher Virulenz
vorkommen. Die Isolate stammen von asymptomatischen Carriern bis hin zu Tieren
mit Meningitis. Somit kann die Zuordnung eines Isolats zu einem ST lediglich
Hinweise, aber keine konkrete Voraussage zum Virulenzpotential des Isolats liefern,
und das auch nur, wenn weitere Isolate desselben ST in die Datenbank eingepflegt
sind.
Dennoch konnten dem in dieser Studie vorkommenden ST85, vertreten durch ein
Isolat aus einem Uterustupfer nach Abort (2016/02992/01/02) und einem
Abort-Isolat, ebenfalls aus Deutschland aus dem Jahre 1996
(LÄMMLER u. WEIß 1997), über eine DLV ein weiteres Isolat aus dieser Studie
zugeordnet werden (2016/02027/01/02). Aus dem Zervixtupfer einer Sau stammend
schien dieses Isolat dieselbe Affinität zum Genitaltrakt aufzuweisen. Aus dieser
Beobachtung resultiert der Verdacht, dass die Isolate enger miteinander verwandt
sind und die Affinität zum Genitaltrakt ein gemeinsames Merkmal ist. Möglicherweise
fehlt nur der gemeinsame Verwandte in der Datenbank, der die ST über SLVs
verbinden könnte. Auch im Dendrogramm, welches mittels Neigbour-Joining erstellt
wurde, fiel auf, dass sich die Isolate 2016/02992/01/02 und 2016/02027/01/02 in
einem Cluster anordneten, auch wenn das geringe Ähnlichkeitsmaß darauf hinweist,
dass eine Vielzahl von Generationen die beiden Isolate trennt.
Diskussion
123
5.7 Resistenzlage bei S.-suis-Isolaten in Deutschland
Resistenzmonitoring bildet die essentielle Grundlage für einen
verantwortungsbewussten und gezielten Einsatz von Antibiotika in der Zukunft. Es ist
wichtig die Resistenzlage der bakteriellen Krankheitserreger zu kennen und deren
Entwicklung zu beobachten, um weiterhin erfolgreich mit Antibiotika therapieren zu
können (WALLMANN u. HEBERER 2014). Außerdem ermöglicht der gezielte Einsatz
von Antibiotika insgesamt eine Reduktion des Antibiotika-Einsatzes, wodurch die
schnelle Verbreitung von Resistenzen reduziert werden soll. Derzeit mangelt es für
viele Krankheitserreger noch an validen Daten zu den Prävalenzen der
Antibiotikaresistenzen. Verschiedene nationale und internationale Monitoring-
Programme versuchten in der Vergangenheit diese Lücken für verschiedene Erreger
zu schließen und erhoben unter anderem auch Daten zu Resistenzen bei
S.-suis-Isolaten (BVL 2015, PUBLIC HEALTH AGENCY OF SWEDEN AND
NATIONAL VETERINARY INSTITUTE 2015, EL GARCH et al. 2016). Ein häufig
genannter Kritikpunkt ist, dass die vorhandenen Daten zu Resistenzen aus
verschiedenen Studien oft durch verschiedene Methoden generiert wurden und
dadurch nicht vergleichbar sind. Für die Erzeugung und Interpretation der MHK-
Daten stehen verschiedene Leitlinien zur Verfügung.
In der vorliegenden Studie konnten für 518 von den insgesamt 522 S.-suis-Isolaten
aus den Jahren 2015 bis 2016 via Mikrodilutionsverfahren MHK-Werte für
verschiedene Antibiotika, die in der Nutztierpraxis Einsatz finden, ermittelt werden
(vgl. Tabelle 9). Wie in 3.1.2 erläutert, wurden nur in den Fällen mehrere Isolate
desselben Betriebs für die Sammlung ausgewählt, sofern es sich um Isolate mit
verschiedenem Serotyp und/oder verschiedenem Virulenzmarkerprofil handelte.
Insofern wurde damit gleichzeitig auch vermieden, dass in der Resistenztestung ein
Stamm mehrfach mit in die Auswertung einfloss. EL GARCH et al. (2016) wählten
aus diesem Grund in ihrer Studie ebenfalls nur ein Isolat pro Betrieb aus, bei vielen
anderen publizierten Untersuchungen ist es aber ungewiss, ob dieser
Verzerrungsfaktor berücksichtigt wurde. Das könnte im Einzelfall zu einer
Überrepräsentation bestimmter Resistenzprofile führen.
Die ermittelten MHK-Daten mit eventuellen antibiotischen Vorbehandlungen in
Verbindung zu bringen ist in der vorliegenden Untersuchung nicht gelungen, da die
Anamnesebögen diesbezüglich nicht kontinuierlich ausgefüllt wurden. Anhand der
Diskussion
124
vorgegeben Grenzwerte des CLSI konnten für die β-Laktam-Antibiotika Penicillin G,
Amoxicillin/Clavulansäure, Ampicillin, Ceftiofur, für Enrofloxacin aus den Klasse der
Fluorchinolone, für Erythromycin, einem Vertreter der Makrolidantibiotika, für
Tetracyclin sowie für Florfenicol Resistenzraten berechnet werden
(CLSI 2013, 2015). Einschränkend muss gesagt werden, dass die vom CLSI
definierten Grenzwerte für S. suis sich nur auf Atemwegsinfektionen beziehen.
Inwieweit die hier ermittelten MHK-Werte tatsächlich auch eine geeignete Grundlage
für die Therapie von S. suis als Meningitis-, Arthritis oder Septikämieerreger bieten,
kann deshalb nicht gesagt werden.
In praxi werden S.-suis-Infektionen beim Schwein vorrangig mit β-Laktamen wie
Ampicillin, Amoxicillin/Clavulansäure oder seltener auch mit Cephalosporinen der
dritten Generation behandelt (VARELA et al. 2013, DAY et al. 2015). Tabelle 10
zeigt, dass der in der vorliegenden Arbeit untersuchte Pool an S.-suis-Isolaten aus
Deutschland zum Großteil sensibel gegenüber den β-Laktam-Antibiotika ist. Trotz der
häufigen Anwendung von Antibiotika dieser Klasse bei Infektionen mit S. suis scheint
folglich kein starker Selektionsdruck zu entstehen, der eine Verschiebung zu
Gunsten der β-Laktam-resistenten Isolate bewirkt. Zwischen 96,9% (Penicillin G) und
99,9% (Amoxicillin/Clavulansäure) der untersuchten Isolate waren sensibel
gegenüber den vier erwähnten β-Laktam-Antibiotika. Nur einzelne Isolate verhielten
sich intermediär oder resistent gegenüber Penicillin G, Amoxicillin/Clavulansäure,
Ampicillin oder Ceftiofur. Dies spiegelt auch die Ergebnisse anderer europäischer
Studien und Monitoringprogramme wider (VELA et al. 2005, VAN HOUT et al. 2016).
Die Resistenzlage von S. suis hat sich in den vergangenen Jahren nicht
nennenswert verändert (HENDRIKSEN et al. 2008, DE JONG et al. 2014, EL
GARCH et al. 2016). Allerdings gibt es dennoch Berichte, dass sich die MHK-Werte
der Isolate in den vergangenen Jahren z.B. für Penicillin erhöht haben und damit die
epidemiologischen Grenzwerte überschritten wurden. So zählten in Bezug auf
Penicillin G in einer belgischen Studie von 2013 nur noch gut 50% der untersuchten
Isolate zum sogenannten Wildtyp, obwohl nach klinischen Grenzwerten vom CLSI
nur 1% der Isolate als resistent beurteilt wurde (CALLENS et al. 2013). Auch andere
Autoren berichten, dass sich über die vergangenen Jahre ein Anstieg in den
MHK-Werten gegenüber verschiedener Antibiotikaklassen bei S.-suis-Isolaten
erkennen lässt, der sich bei Betrachtung der epidemiologischen Cut-Off-Werte
abzeichnet, hingegen nach der Beurteilung der MKH-Werte anhand klinischer
Diskussion
125
Grenzwerte nicht zu erkennen ist (HERNANDEZ-GARCIA et al. 2017). Das zeigt,
dass der Vergleich von MHK-Werten zwar für die Prognose des Therapieerfolgs nicht
hilfreich ist, aber dennoch nützlich für die Überwachung von Resistenzentwicklung
sein kann.
Innerhalb des europäischen Resistenzmonitoring-Projektes VetPath wurden
verschiedene respiratorische Erreger bei Rind und Schwein mit dem nach CLSI
standardisierten Mikrodilutionsverfahren auf ihre Empfindlichkeit gegenüber
verschiedenen Antibiotika getestet (DE JONG et al. 2014, EL GARCH et al. 2016). In
der vorliegenden Studie wurde die MHK-Bestimmung ebenso wie im VetPath-Projekt
nach den CLSI-Standards durchgeführt (CLSI 2013, 2015). Darauf basierend lassen
sich die Ergebnisse der Studien durchaus vergleichen, auch wenn man beachten
muss, dass im VetPath-Projekt Isolate aus verschiedenen europäischen Ländern
zusammengefasst betrachtet wurden. Von den insgesamt 151 dort untersuchten
S.-suis-Isolaten stammten nur 21 aus Deutschland. Die anderen Isolate stammten
aus Belgien (25), Spanien (25), Polen (22), den Niederlanden (19), Frankreich (19),
dem Vereinigten Königreich (17) und Dänemark (3) (EL GARCH et al. 2016). Eine
gewisse Verschleierung von eventuellen geographischen Unterschieden kann
dadurch nicht ausgeschlossen werden (EL GARCH et al. 2016). Die vorliegende
Arbeit ist durch die große Anzahl an untersuchten Isolaten (n=518) aussagekräftig in
Bezug auf die Resistenzlage von (nord-) deutschen S.-suis-Isolaten.
Neben der guten Empfindlichkeit gegenüber β-Laktam-Antibiotika, waren die meisten
Isolate in der vorliegenden Studie auch sensibel gegenüber Enrofloxacin und
Florfenicol, beides Breitspektrumantibiotika, die in der Schweinehaltung eingesetzt
werden. Aus anderen europäischen Ländern sind für Fluorochinolone wie
Enrofloxacin und für Florfenicol ebenfalls niedrige Resistenzraten beschrieben
(VELA et al. 2005, WISSELINK et al. 2006, CALLENS et al. 2013, VAN
HOUT et al. 2016). Abweichend dazu lagen die Resistenzraten gegenüber
Florfenicol (30,4%) und Enrofloxacin (10,9%) in einer koreanischen Untersuchung
z.B. deutlich höher (OH et al. 2017). In Korea wird Enrofloxacin allerdings auch im
großen Maß gegen E.-coli-Infektionen beim Schwein eingesetzt (OH et al. 2017).
Wie weltweit aus verschiedenen Quellen berichtet wird, wurden auch in der hiesigen
Studie bei einem Großteil der untersuchten Isolate Erythromycin- (66,67%) und
Tetracyclin-Resistenzen (82,20%) festgestellt. In anderen Studien lag die
Diskussion
126
Tetracyclin-Resistenzrate ebenfalls um die 80% (WISSELINK et al. 2006,
DE JONG et al. 2014, VAN HOUT et al. 2016). Zum Teil wurden die 80%, teilweise
sogar die 90% überschritten (VELA et al. 2005, VARELA et al. 2013,
SOARES et al. 2014, EL GARCH et al. 2016, OH et al. 2017). Die hohen
Resistenzraten gegenüber Tetracyclinen können dadurch erklärt werden, dass diese
Antibiotikaklasse in der Vergangenheit weit verbreitet, teilweise massenhaft in der
Nutztierhaltung Einsatz fand (VELA et al. 2005, VARELA et al. 2013). Antibiotika
dieser Klasse zählen zu den älteren Molekülen und fanden in der Vergangenheit
teilweise sogar Verwendung als Wachstumsförderer in der Schweinemast
(OH et al. 2017). Zwar werden diese Antibiotika in der Regel nicht bei S.-suis-
Infektionen eingesetzt, aber bei vielen anderen häufigen Erkrankungen beim
Schwein und anderen landwirtschaftlichen Nutztieren. Auch in Deutschlands
Schweinehaltungen sind Tetracycline die am meisten angewendeten Antibiotika
(VAN RENNINGS et al. 2015).
Erythromycin betreffend werden in der Literatur steigende Resistenzraten berichtet.
Während in Europa die Raten zwischen 8 bis 75% schwanken, werden aus Korea
Raten von über 80% berichtet (VARELA et al. 2013, OH et al. 2017). Vor dem
Hintergrund der beträchtlichen Makrolid-Resistenzen bei S. suis sollte zukünftig auch
in der Humanmedizin auf den Einsatz von Makrolidantibiotika zur Therapie der
S.-suis-Infektionen verzichtet werden (OH et al. 2017), auch wenn S.-suis-Isolate
vom Menschen zum Teil eine geringere Resistenzrate gegenüber Erythromycin
zeigten (HOA et al. 2011). Im Gegensatz zu Tetracyclinen zählten Makrolidantibiotika
wie Erythromycin in der Vergangenheit allerdings nicht zu den meist verwendeten in
deutschen Schweinebetrieben (VAN RENNINGS et al. 2015).
In der Literatur werden für S. suis weiterhin nennenswerte Resistenzraten gegenüber
Clindamycin, Spectinomycin und Sulfonamiden beschrieben (VELA et al. 2005,
WISSELINK et al. 2006, VARELA et al. 2013). Da für diese Antibiotika aber bisher
keine MHK-Grenzwerte für S. suis vom CLSI definiert wurden, konnten in der
vorliegenden Studie keine Resistenzraten berechnet werden. Clindamycin wurde
außerdem im Laufe der Studie aus dem Testlayout entfernt, sodass nur 46 Isolate
auf ihre dahingehende Empfindlichkeit getestet werden konnten. Die Betrachtung der
MHK-Verteilung bei Spectinomycin zeigt, dass ein Großteil der Isolate sehr hohe
Konzentrationen des Antibiotikums noch toleriert. Die MHK-Verteilung bei
Trimethoprim/Sulfamethoxazol zeigt, dass ein sehr großer Teil der untersuchten
Diskussion
127
Isolate gegenüber Konzentrationen von ≤ 0,25/4,75 empfindlich war. Im Vergleich mit
einer anderen europäischen Studie scheinen die S.-suis-Isolate aus Deutschland
folglich eine etwas bessere Empfindlichkeit gegenüber
Trimethoprim/Sulfamethoxazol zu zeigen (EL GARCH et al. 2016).
Weiterhin wird in der Literatur eine bimodale Verteilung der MHK-Werte bei
Tilmicosin, Tylosin und Lincomycin angesprochen. Diese Verteilungsmuster könnten
dafür sprechen, dass es sich um erworbene Resistenzmechanismen handelt
(EL GARCH et al. 2016). Das bedeutet, dass S.-suis-Isolate ursprünglich
möglicherweise sensibel gegenüber diesen Antibiotika waren und sich mittlerweile
jeweils eine zweite resistente Subpopulation gebildet hat. Tylosin und Lincomycin
wurden in der vorliegenden Studie nicht getestet, dafür aber mit Erythromycin ein
anderer Vertreter der Makrolidantibiotika und mit Clindamycin ein anderer Vertreter
der Lincosamide. Sowohl bei Erythromycin als auch bei Clindamycin kann man in der
vorliegenden Studie von einer bimodalen Verteilung sprechen (vgl. Tabelle 9). Für
Tilmicosin lässt sich ebenso eine zweigipflige Verteilung erkennen. Von einer
multimodalen MHK-Wert-Verteilung u.a. bei Erythromycin, Tilmicosin, Lincomycin,
Tiamulin und Spectinomycin wird auch noch an anderer Stelle berichtet
(HERNANDEZ-GARCIA et al. 2017). Auch wenn sich der MHK50- und MHK90-Wert
nicht sonderlich gut für die Beschreibung von bi- oder trimodalen Verteilungen
eignen, kann es dennoch ein Indiz für eine bimodale Verteilung sein, wenn die
beiden Werte weit auseinander liegen (SCHWARZ et al. 2010). Dies war allerdings
weder in der VethPath-Studie noch in der vorliegenden Untersuchung der Fall
(EL GARCH et al. 2016).
Zusammenfassend kann man sagen, dass sich weltweit ähnliche Tendenzen bei
Resistenztestungen von S.-suis-Isolaten zeigen. Die Resistenzlage bei den
deutschen S.-suis-Isolaten scheint derzeit stabil zu sein. Dies deckt sich auch mit
den Aussagen der Autoren aus der europäischen VetPath Studie
(EL GARCH et al. 2016). Dennoch variieren die Daten im europäischen und
weltweiten Vergleich. Zum Teil wird z.B. von einem deutlich höheren Aufkommen von
Resistenzen gegenüber β-Laktam-Antibiotika in einigen europäischen Ländern
berichtet (HENDRIKSEN et al. 2008). Das betont die Wichtigkeit einer
kontinuierlichen, einheitlichen, nationalen und internationalen Überwachung von
Antibiotikaresistenzen. Gewisse geographische Unterschiede bezüglich der
Resistenzraten und -muster bei S. suis sind vermutlich durch den Einsatz
Diskussion
128
unterschiedlicher Antibiotika und dessen Ausmaße bedingt (SEITZ et al. 2016). Ein
schleichender Anstieg der MHK-Werte, wie er in einer englischen Studie beobachtet
wurde (HERNANDEZ-GARCIA et al. 2017), könnte ein erster Hinweis auf eine
fortschreitende Resistenzentwicklung bei S. suis sein und sollte darum überwacht
werden.
5.7.1 Resistenzraten bei Isolaten aus unterschiedlichen Lokalisationen
Durch die in den Methoden beschriebene Erhebung von klinischen
Hintergrundinformationen zu den Isolaten konnten die Isolate in drei verschiedene
Gruppen eingeteilt werden (vgl.3.1.2). Tabelle 11 stellt dar, dass sich bei den
untersuchten S.-suis-Isolaten eine Tendenz dahingehend abzeichnet, dass Isolate
aus der Lunge, und in noch stärkerem Maß Isolate von Carriern, höhere
Resistenzraten aufweisen als invasive Isolate. Während sich die MHK50- und
MHK90-Werte (Tabelle 28) größten Falls in einer Verdünnungsstufe unterscheiden
und daraus kleine klare Assoziation zu einer der drei Gruppen entsteht, zeigt
Tabelle 11 aber, dass sich die die Resistenzraten teilweise signifikant unterscheiden.
An dieser Stelle muss angemerkt werden, dass die beobachteten signifikanten
Unterschiede dadurch beeinflusst werden könnten, dass der Mikrodilutionstest einer
gewissen methodischen Schwankungsbreite von ± einer Verdünnungsstufe
unterliegt. Dadurch könnten die Klassifizierungen in sensibel, intermediär und
resistent unter Umständen variieren.
Gegenüber Ceftiofur und Erythromycin z.B. waren signifikant mehr Lungen- und
Carrier-Isolate resistent als invasive Isolate. Ebenso waren gegenüber Penicillin G in
der Lungen-Gruppe signifikant weniger Isolate sensibel. Für die Antibiotika Ampicillin,
Ceftiofur, Enrofloxacin, Erythromycin, Penicillin G und Tetracyclin lässt sich
insgesamt die Tendenz erkennen, dass invasive Isolate niedrigere Resistenzraten
zeigen als Lungen- und Carrier-Isolate bzw. eher sensibel sind und dass
Carrier-Isolate oft sogar noch höhere Resistenzraten zeigen als Lungen-Isolate. Da
gegenüber Amoxicillin/Clavulansäure und Florfenicol ohnehin keines der Isolate in
dieser Sammlung resistent war und nur ein (Amoxicillin/Clavulansäure) bzw. sechs
(Florfenicol) Isolate intermediär beurteilt wurden, konnte für diese beiden Wirkstoffe
keine derartige Beobachtung gemacht werden.
Diskussion
129
Diese Ergebnisse zeigen einerseits, dass die Resistenzlage bei invasiven
S.-suis-Isolaten vergleichsweise günstig zu beurteilen ist und verhältnismäßig viele
Isolate (über 99%) sensibel gegenüber den gegen S.-suis-Infektionen eingesetzten
Antibiotika sind. Andererseits zeigen die Ergebnisse auch, dass S.-suis-Isolate, die
aus den Lungen der Schweine isoliert wurden, und vor allem Isolate von
asymptomatischen Carriern gegenüber einigen Antibiotika signifikant häufiger
Resistenzen zeigen. Wenn man nun die Möglichkeit in Betracht zieht, dass diese
Stämme z.B. durch Mutation oder Rekombination zur Invasion befähigt wären,
könnten diese so zu therapieresistenten Ausbrüchen in schweinehaltenden Betrieben
führen.
Es ist bei vielen Bakteriengruppen, so auch bei S. suis zu beobachten, dass
avirulente Isolate ein größeres akzessorisches Genom haben. Sie leisten es sich,
„Gene zu bevorraten“, um sich verschiedenen, wechselnden Lebensräumen
anpassen zu können. Invasive Isolate hingegen haben diese Energie
verbrauchenden Genombalast abgeworfen, weil ihr Lebensraum besser und enger
charakterisiert ist (WEINERT et al. 2015). Es wird vermutet, dass viele apathogene
Keime, zu denen man die Carrier-Population von S. suis hinzu zählen könnte, einen
Pool an Resistenzen besitzen, den sie über horizontalen Gentransfer an pathogene
Keime, sowohl innerhalb einer als auch zwischen verschiedenen Bakterienspezies,
weitergeben können (WALLMANN u. HEBERER 2014, HUANG et al. 2016).
Konträr zu den hier dargestellten Ergebnissen berichteten (OH et al. 2017), dass in
ihrer Untersuchung in Korea sowohl die MHK50- und MHK90-Werte als auch die
Resistenzraten bei den Schlachthofschweinen, die man mit den Carriern aus der
vorliegenden Studie vergleichen könnte, niedriger lagen als bei den erkrankten
Tieren. Andere wiederum konnten keine signifikanten Unterschiede bei den
Resistenzraten der invasiven Isolate im Vergleich mit den Carrier-Isolaten feststellen
(MARIE et al. 2002, HUANG et al. 2016). Aus dem GERM-Vet-Programm ist
allerdings bekannt, dass S.-suis-Isolate aus dem ZNS und dem muskuloskelettalen
System gegenüber den meisten Antibiotika sensibel waren mit Ausnahme von
Tetracyclin und Trimethoprim/Sulfamethoxazol, was wiederum den in dieser Studie
gewonnenen Eindruck bestätigt, dass invasive Isolate seltener Resistenzen zeigen
(SCHWARZ et al. 2007). Jüngst berichtete auch eine Studie aus England über
vermehrte Resistenzraten bei nicht-klinischen Isolaten im Vergleich zu klinischen
Diskussion
130
Isolaten in Bezug auf Cephalosporine, Penicilline, Tetracycline und potenzierte
Sulfonamide (HERNANDEZ-GARCIA et al. 2017).
5.7.2 Antibiotikaresistenzen bei verschiedenen Serotypen
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die nicht-typisierbaren Isolate
gegenüber einigen β-Laktam-Antibiotika vermehrt resistent bzw. seltener sensibel
waren als die große Gruppe der Serotyp-2 oder -1/2-Isolate. Bei Florfenicol zeigten
sie sich im Vergleich mit Serotyp 9 weniger sensibel. Gegenüber Tetracyclin
wiederum waren die Serotyp-9-Isolate signifikant weniger sensibel als die
Serotyp-2- oder -1/2-Isolate. Diesen Signifikanzen sollte keine zu hohe Bedeutung
beigemessen werden, da, wie bereits erwähnt, schon geringe testbedingte
Schwankungen die Beurteilung in sensibel, intermediär und resistent verändern
können und sich dadurch die jeweiligen Raten gegebenenfalls schnell verändern.
Aus der Literatur ist wenig zu Assoziationen zwischen einzelnen Serotypen von
S. suis und Antibiotikaresistenzen bekannt. OH et al. (2017) konnten eine signifikante
Korrelation zwischen einer Erythromycin-Resistenz und den Serotypen 3, 2 und 1/2
feststellen. Dabei sollte man allerdings berücksichtigen, dass in dieser Studie die
genannten Serotypen auch am weitaus häufigsten vorkamen und die Prävalenz der
Erythromycin-Resistenz mit 88,8% insgesamt sehr hoch lag. Letztlich wurde bisher
auch keine plausible Erklärung für diese Korrelation gefunden. In einer anderen
Studie wurden Clindamycin- und Chloramphenicol-Resistenzen mit Serotyp 2
assoziiert (LI et al. 2012). In einer spanischen Untersuchung waren Serotyp-9-Isolate
signifikant resistenter gegenüber Tylosin und Clindamycin (VELA et al. 2005). Auch
hier betraf es damit wieder den mit Abstand häufigsten Serotyp (64,9%) in der
Studie, was eventuell dafür sprechen könnte, dass die Resistenzraten in dieser
Gruppe überrepräsentiert dargestellt werden. Nicht jeder statistische Test
berücksichtigt die unterschiedliche Stichprobengroße der zu vergleichenden Gruppen
ausreichend. Interpretiert wurden die MHK-Werte in letzterer Untersuchung auch
nicht nach CLSI-Kriterien, sondern mit Hilfe der Grenzwerte des NCCLS und der
French Society of Microbiology for human strains. Auch in einer älteren Studie wurde
eine Korrelation zwischen Resistenz und Serotyp beschrieben. So waren dänische
Serotyp-2-Isolate weniger resistent gegenüber Lincomycin und Spiramycin als
andere Serotypen (AARESTRUP et al. 1998). MARIE et al. (2002) beschrieben
Diskussion
131
ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen Serotyp 2 und anderen Serotypen bei
den Doxycyclin- und Makrolidresistenzraten. In einer brasilianischen Studie konnte
keine Korrelation zwischen bestimmten Serotypen und Resistenztypen beobachtet
werden (SOARES et al. 2014).
Durch die wenigen und uneinheitlichen Ergebnisse bezüglich einer möglichen
Assoziation zwischen bestimmten Serotypen und bestimmten Resistenzen, könnte
man die Hypothese aufstellen, dass es sich hierbei um Scheinkorrelationen handelt,
denen kein kausaler Zusammenhang zu Grunde liegt. Dies müsste systematisch
geprüft werden.
5.7.3 Multiresistente S.-suis-Isolate
In der vorliegenden Studie fielen einzelne multiresistente Isolate auf. Insgesamt war
der Anteil an multiresistenten Isolaten mit circa 2% in der hiesigen Untersuchung
gering. Allerdings könnte sich die Zahl erhöhen, wenn weitere Antibiotika in die
Resistenzprüfung mit einbezogen würden. Das Vorkommen multiresistenter
S.-suis-Stämme wird auch in der Literatur beschrieben. Jüngst berichteten
OH et al. (2017) von über 40% multiresistenten Isolaten in einer Untersuchung in
Korea.
Alle zwölf multiresistenten Isolate aus der hiesigen Studie zeigten die bei S. suis
häufig vorkommenden Resistenzen gegenüber Tetracyclin und Erythromycin
(vgl. 5.7). Elf dieser Isolate zeigten aber zusätzlich Resistenzen gegenüber einem
oder mehreren Vertretern der β-Laktame. Resistenzen gegenüber dieser
Antibiotikaklasse, die vorrangig zur Therapie von S.-suis-Infektionen eingesetzt wird,
können den Therapieerfolg maßgeblich negativ beeinflussen. Im Fall des Isolates
2016/01991/01/01, welches nicht nur gegenüber vier Antibiotikaklassen, sondern
auch gegenüber fast allen überprüften β-Laktamen resistent war, sind die
Behandlungsmöglichkeiten stark eingeschränkt. Dieser invasive S.-suis-Stamm, der
aus dem ZNS isoliert wurde, fiel weiterhin dadurch auf, dass er als einziger sogar die
maximal getesteten Antibiotikakonzentrationen von Penicillin G und Ampicillin
tolerierte. Möglicherweise würde dieser Stamm sogar noch viel höhere
Konzentrationen tolerieren. Weiterhin fiel auf, dass sich das erwähnte Isolat als
einziges in der hiesigen Sammlung als nicht sensibel, sondern intermediär
gegenüber Amoxicillin/Clavulansäure verhielt. Vergleichbar befanden sich unter den
Diskussion
132
im VetPath-Projekt untersuchten Isolaten auch ein paar wenige „Ausreißer“, deren
MHK-Werte gegenüber den restlichen Isolaten deutlich höher lagen
(EL GARCH et al. 2016).
Prozentual waren in der Gruppe der invasiven Isolate am wenigsten multiresistente
Isolate, während der Anteil in der Gruppe der Lungen-Isolate und der Carrier-Isolate
jeweils etwas höher lag. Auch wenn dies nur eine Tendenz darstellt, ist es
vergleichbar mit der Beobachtung der gesamten Resistenzlage in den drei Gruppen
(vgl. 5.7.1). Bei einer Untersuchung brasilianischer Isolate von gesunden Schweinen
wurden bis auf eine Ausnahme alle 260 Isolate als „multidrug“ resistent bezeichnet
(SOARES et al. 2014). Auch wenn die Definition sich hierbei auf drei oder mehr
Wirkstoffe und nicht auf Wirkstoffklassen bezog und zum Teil andere Antibiotika als
in der vorliegenden Studie getestet wurden, könnte dies dennoch ein Hinweis sein,
dass Carrier-Isolate potentiell mehr Resistenzen ausbilden (vgl. 5.7.1). Auch nach
Beurteilung anhand von epidemiologischen Cut-Off-Werten gehören nicht-klinische
Isolate signifikant seltener zum Wildtyp (HERNANDEZ-GARCIA et al. 2017).
Antimikrobielle Resistenzen erhöhen die Überlebenschancen der nicht-klinischen
Isolate in ihrem natürlichem Habitat, dem oberen Respirationstrakt. Solange die
Resistenzen nur die avirulenten Isolate tragen, birgt das kein Risiko, aber die
Möglichkeit des horizontalen Genaustauschs zwischen avirulenten und virulenten
Isolaten darf nicht unberücksichtigt bleiben. Außerdem können auch vermeintlich
nicht-invasive Stämme möglicherweise unter bestimmten Voraussetzungen, wie
einer reduzierten Immunität des Wirtes, eine systemische Erkrankung auslösen
(HERNANDEZ-GARCIA et al. 2017).
Zusammenfassung
133
6 Zusammenfassung
Thea Louise Prüfer
Vorkommen und Verbreitung von Serotypen bei Streptococcus-suis-Isolaten in Deutschland
Infektionen mit S. suis stellen weltweit ein großes wirtschaftliches Problem in der
Schweinehaltung dar. Durch das zoonotische Potential des Erregers kommt es auch
beim Menschen immer wieder zu schwerwiegenden Erkrankungen, teilweise mit Todesfolge. Die Serotypisierung der Isolate kann dabei helfen, die Epidemiologie
dieses heterogenen Erregers nachzuvollziehen, virulente Stämme zu
charakterisieren und geeignete Therapie- und Prophylaxeverfahren einzuleiten. Seit
mehr als 10 Jahren wurden keine Daten über die Verbreitung der verschiedenen S.-suis-Serotypen in Deutschland veröffentlicht. Aus diesem Grund war es Ziel der
vorliegenden Arbeit einen aktuellen Überblick über das Vorkommen verschiedener
Serotypen in deutschen Schweinehaltungen zu erlangen. Im Zuge der weltweit
steigenden Antibiotikaresistenzen sollte durch die Untersuchung der Isolate im Mikrodilutionsverfahren weiterhin ein Eindruck über die aktuelle Lage der Resistenzen innerhalb der Spezies S. suis gewonnen werden.
Zwischen April 2015 und Dezember 2016 wurden insgesamt 522 S.-suis-Isolate, die
schwerpunktmäßig aus Nordwestdeutschland stammten, für die vorliegende Arbeit untersucht. Nach molekulargenetischer Serotypisierung der Isolate mit einer im Zuge
dieser Studie etablierten Multiplex-PCR konnten 500 Isolate einem der bekannten
Serotypen zugeordnet werden (OKURA et al. 2014). Um einen Eindruck über die
Entwicklung der Serotypen-Verbreitung in Deutschland zu bekommen, wurde ein Vergleich zu einer älteren Sammlung an S.-suis-Isolaten gezogen
(SILVA et al. 2006). Es zeigte sich, dass die Serotypen 2 oder 1/2 nach wie vor die
am häufigsten isolierten invasiven Serotypen in Deutschland sind (23,5%). Allerdings kommen diese heute hoch signifikant seltener als invasiver Erreger vor als noch vor
mehr als 10 Jahren. Damit waren diese nicht viel häufiger in der aktuellen Sammlung
vertreten als Serotyp 9 (22,4%). Dies könnte auf einen Erfolg der Prophylaxe durch
autogene Serotyp-2-Vakzinen hinweisen. Während der Anteil an Serotyp 9 im Vergleich der beiden Zeiträume annähernd stabil blieb (25,7% und 22,4%), fiel der
Rückgang an Serotyp 2 oder 1/2 bei den invasiven Isolaten vor allem zu Gunsten
von Serotyp 7 (15,3%) und 4 (9,4%) aus. Diese Ergebnisse zeigen, dass aktuell in
Deutschland vermehrt auch andere Serotypen außer Serotyp 2 und 9 an Bedeutung
Zusammenfassung
134
als invasive Infektionserreger beim Schwein gewonnen haben und deshalb bei der
Bekämpfung bzw. Prophylaxe berücksichtigt werden sollten. Ein Großteil der mittels PCR feststellbaren 35 Serotypen konnte bei jeweils mindestens einem Tier aus ZNS,
Gelenk, Blut oder anderen inneren Organen isoliert werden. Das zeigt, dass potentiell viele der beschriebenen Serotypen von S. suis als invasive
Infektionserreger auftreten können. Bei den Isolaten von gesunden Schweinen war der relative Anteil an nicht-typisierbaren Isolaten aus beiden Zeiträumen
verhältnismäßig hoch (20% und 11,5%) im Vergleich mit den klinischen Isolaten. Die
Anteile der einzelnen Serotypen waren in dieser Gruppe recht homogen verteilt.
Die 22 nicht-typisierbaren Isolate aus der aktuellen Sammlung wurden weiteren
Untersuchungen unterzogen. Mittels TEM konnte gezeigt werden, dass einige der
Isolate durchaus eine Polysaccharidkapsel ausbildeten. Das könnte darauf
hinweisen, dass es sich bei den betreffenden Isolaten um neue Serotypen von S. suis handelt. Andere dieser Isolate zeigten wiederum keine oder eine defekte
Kapselbildung. Dies könnte ein Hinweis auf Mutationen im Kapsellocus sein, welche
die Nicht-Typisierbarkeit begründen könnten. Mittels MLST konnte gezeigt werden,
dass die nicht-typisierbaren Isolate keine eigene klonale oder verwandte Gruppe darstellen, sondern versprengt in der S.-suis-Population vorzukommen scheinen.
Um einen Überblick über die derzeitige Lage der Antibiotikaresistenzen zu erhalten, wurden 518 der S.-suis-Isolate im Mikrodilutionsverfahren auf ihre Empfindlichkeit
gegenüber verschiedenen Antibiotika untersucht. Die Resistenzlage des Erregers hat sich im Vergleich mit älteren Untersuchungen in Deutschland insgesamt nicht
nennenswert verändert. Ein Großteil der Isolate zeigte Resistenzen gegenüber
Tetracyclin (82,2%) und Erythromycin (66,7%). Gegenüber den bei S.-suis-Infektionen eingesetzten β-Laktam-Antibiotika wie Ampicillin (0,8%),
Amoxicillin/Clavulansäure (0%), Penicillin G (1,7%) oder auch Ceftiofur (1,2%) waren
nur wenige Isolate resistent. Allerdings konnte gezeigt werden, dass Carrier-Isolate
einige Antibiotika betreffend signifikant häufiger Resistenzen ausbilden als invasive Isolate. Auch der Anteil an multiresistenten Isolaten lag bei den Carrier-Isolaten
vergleichsweise höher. Damit stellt diese Gruppe über eine mögliche horizontale
Weitergabe von Resistenzgenen ein potentielles Risiko für die Verbreitung von Resistenzen in der S.-suis-Population dar. Eine fortlaufende, standardisierte
Überwachung der Resistenzentwicklung ist vor dem Hintergrund der enormen
Bedeutung des Erregers in der Schweinehaltung und dem humanpathogenen
Potential angezeigt.
Summary
135
7 Summary
Thea Louise Prüfer
Occurence and distribution of serotypes in Streptococcus suis isolates in Germany
Infections with S. suis present a major and worldwide economic risk in pig
husbandry. The zoonotic potential of the pathogen increasingly leads to severe
diseases within humans as well, occasionally even with fatal outcome. Serotyping of
the isolates can help to understand the epidemiology of this pathogen as well as to
characterize virulent strains and initiate suitable therapeutic and prophylactic actions.
For more than ten years no data on the prevalence of the different serotypes of
S. suis has been published in Germany. Thus it was one of the aims of the present
study to provide a current overview on the prevalence of different S. suis serotypes in
German pig husbandry. In the course of worldwide increasing antimicrobial
resistances in bacterial pathogens, up to date knowledge of the occurrence of
antibiotic resistances in S. suis is vitally important. Therefore the antibiotic
susceptibility of current S. suis isolates was determined in this study using a broth
microdilution method.
Between April 2015 and December 2016, 522 S. suis isolates, which were collected
primarily from the north-western parts of Germany, were investigated for this study.
By serotyping of the isolates with a multiplex-PCR, which had been established for
this study, it was possible to assign 500 isolates to one of the known serotypes
(OKURA et al. 2014). In order to obtain an overview of the potential shift of serotype
prevalence within Germany, older data on S. suis isolates served as a point of
comparison (SILVA et al. 2006). Results of the comparison showed that serotypes 2
or 1/2 still present the majority of invasive serotypes in German S. suis isolates
(23,5%). However, their occurrence as an invasive pathogen decreased highly
significantly and these two serotypes are nowadays more seldom than ten years ago.
Their frequency within the present collection of isolates now was not significantly
higher than that of serotype 9 isolates (22,4%). This might indicate that prevention
strategies implementing autogenous serotypes 2 vaccines successfully eliminated
this serotypes from pig farms. Whilst the proportion of serotype 9 was stable between
both time periods (25,7% and 22,4%), the reduction of serotype 2 or 1/2 within the
Summary
136
invasive isolates boosted other serotypes, mainly serotype 7 (15,3%) and 4 (9,4%).
The results showed an increasing number of different serotypes other than serotype
2 and 9, which gained in relevance as an invasive infectious agent in pigs and thus
have to be considered in view of therapy and prophylaxis. A majority of the 35
serotypes, which were detectable through PCR, could be isolated from the central
nervous system (CNS), joints, blood or other inner organs of at least one pig. This
shows that many of the described serotypes of S. suis could potentially occur as
invasive infectious agents. Compared to the clinical isolates, those from healthy pigs
showed a relatively high proportion of non-typeable isolates in both time periods
(20% and 11,5%) and a greater overall variability of serotypes.
The 22 non-typeable isolates of the current collection were investigated more closely.
By TEM, it was possible to show that some isolates still express a polysaccharide
capsule. These results could indicate towards an emergence of new serotypes of
S. suis within the respective isolates. However, other isolates presented defective
capsules or showed no capsule at all. This is potentially a result of mutations within
the capsule locus, which could explain the failure to serotype these isolates. MLST
proved that the non-typeable isolates do not form a clonal or related group, but rather
occur dispersed within the S. suis population.
In order to obtain an overview of the current situation of antibiotic resistances, 518 of
the S. suis isolates were investigated by broth microdilution for their susceptibility to
different antimicrobials. The comparison of the results with data from older studies
showed no significant changes in the resistance pattern of this pathogen in Germany.
A majority of the isolates was resistant to Tetracyclin (82,2%) and Erythromycin
(66,7%). Only few isolates showed resistance to β-lactam antibiotics i.e. Ampicillin
(0,8%), Amoxicillin/Clavulansäure (0%), Penicillin G (1,7%) or Ceftiofur (1,2%), which
are used for treating S. suis infections. However, carrier isolates had developed
significantly more resistances to some specific antibiotics compared to invasive
isolates. Similarly, the proportion of multiresistent isolates in carrier isolates was
comparatively higher than in clinical isolates. Hence, this group of isolates entails a
potential risk for the proliferation of antibiotic resistances in the S. suis population
through a possible horizontal transfer of resistance genes. An ongoing, standardized
monitoring of the development of resistances is indispensable due to the enormous
significance of this pathogen in pig husbandry and its zoonotic potential.
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Gesetze und Verordnungen:
AMG (1976) Gesetz über den Verkehr mit Arzneimitteln (Arzneimittelgesetz). vom 24. Aug. 1976 Bundesgesetzbl. I. S. 3394 VERORDNUNG (EG) Nr. 183/2005 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES vom 12. Januar 2005 ABl. L 35 vom 8.2.2005, S. 1
Anhang
163
9 Anhang
Tabelle 13: Verwendete Chemikalien Chemikalie Hersteller Artikelnummer
Agarose for gel electrophoresis Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf 840004
Blutagar Oxoid Deutschland GmbH, Wesel PB0123
Borsäure Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 6943
Brain Heart Infusion Broth BD Deutschland, Heidelberg 221812
Bromphenolblau Merck KgaA, Darmstadt 1081220025
Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 9161
Chloroform Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe T901
D (+) Glucose Monohydrat (für Kryomedium)
VWR International GmbH, Hannover 1.08342.1000
di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
Merck KgaA, Darmstadt 1065860500
di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4x2H2O) Merck KgaA, Darmstadt 1065800500
DNA Ladder 100bp New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main N3231
EDTA (Ethylendiamin-tetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat) Titrierkomplex III
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 8043
Ethanol 96% vergällt Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe T171.4
Ethanol unvergällt Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 9065
Ethidiumbromid Lösung (10 mg/ml)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München E1510
Glycerin (100%ig) Merck KgaA, Darmstadt 104093
Glycerol Merck KgaA, Darmstadt 356352
HCl Merck KgaA, Darmstadt 113136
Isoamylalkohol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe T870
Isopropanol (2-Propanol) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe T902
Lysozym Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München L6876
Anhang
164
Chemikalie Hersteller Artikelnummer
Methanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe KK39
Mikrotiterplatte Mikronaut-S Großtiere 2
MERLIN Gesellschaft für mikrobiologische Diagnostika mbH, Bornheim-Hersel
REF E1-083-100
Mueller-Hinton-II-Boullion BD Deutschland, Heidelberg 212322
Natriumchlorid (NaCl) Merck KgaA, Darmstadt 137017
Natronlauge (NaOH) Merck KgaA, Darmstadt 109137
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren 740609
Nukleotide, dNTP-Set Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe K039
Pferdeblut, lysiert Oxoid Deutschland GmbH, Wesel SR0048C
Pferdeserum WDT-Serumwerk, Memsen -
Phenol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 0038
Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase inklusive Phusion® HF Buffer
New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main M0530L
Proteinase K Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 7528.3
Ribonuclease A (Rnase A) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München? R6513
Roti® Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe A156
SDS (Dodecylsulfat Natriumsalz) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 0183
Taq DNA Polymerase with ThermoPol® Buffer
New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main M0267S
Todd Hewitt-Bouillon Omnilab Laborzentrum GmbH & Co.KG, Gehrden 5419114
Transporttupfer in Amies-Medium mit Aktivkohle
Check Diagnostics GmbH, Westerau 30MW171
TRIS (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 5429
Wasser, steril, Molecular Biology Reagent
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München W4502
Xylencyanol Merck KgaA, Darmstadt 1105900005
Anhang
165
Tabelle 14: Verwendete Verbrauchsmaterialien Material Bezugsquelle Artikelnummer
Einmal-Impfösen, steril VWR International GmbH, Hannover 612-9359
Einmal-Kanülen, 1,20 x 40 mm
MediQuick Arzt- und Krankenhausbedarfshandel GmbH, Osnabrück
413-180
Einmal-Skalpell Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe T997.1
EU 8-tube strip (0,2 ml) BIOplastics, Landgraaf, Niederlande
K77101
EU Optical robust flat 8-Cap Strip
BIOplastics, Landgraaf, Niederlande
B79701-1
Greiner round bottom tubes 12 ml
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Z617865
Kryo-Röhrchen Thorbi® mit Außengewinde, steril
National Lab GmbH, Kälte- und Temperiertechnik, Mölln LCR2ANSMY
Küvetten Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe EXP1.1
Parafilm Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München P7793-1EA
Pipettenspitzen 10 µl, mit Filter
Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf 770005
Pipettenspitzen 1000 µl mit Filter
Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf 770400
Pipettenspitzen 1000 µl, blau STARLAB GmbH, Hamburg S1111-6001
Pipettenspitzen 20 µl, mit Filter
Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf VT0220
Pipettenspitzen 200 µl, gelb STARLAB GmbH, Hamburg S1111-1006
Pipettenspitzen 200 µl, mit Filter
Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf 770280
Pipettenspitzen 300 µl, mit Filter
Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf VT0250
Reagiergefäß 1,5 ml Sarstedt AG & Co Kommanditgesellschaft, Nümbrecht
690001
Reagiergefäß 2,0 ml Sarstedt AG & Co Kommanditgesellschaft, Nümbrecht
695500
Röhre 50ml, 114x28mm Sarstedt AG & Co Kommanditgesellschaft, Nümbrecht
62.547.254
Watteträger MediQuick Arzt- und Krankenhausbedarfshandel GmbH, Osnabrück
979-2120
Anhang
166
Tabelle 15: Verwendete Lösungen und Puffer Puffer/Lösung Zusammensetzung
2x TEN-Puffer mit Lysozym
Tris/HCl (ph 8,0) 25 mM EDTA (ph 8,0) 10 mM NaCl 150 mM Lysozym 10 mg/ml
6x DNA- Ladepuffer
5 ml Bromphenolblau (1%ig) 5 ml Xylencyanol (1%ig) 6 ml Glycerin (100%ig) A. dest. ad 20 ml
Bromphenolblau 1%ig 1 mg Bromphenolblau A. bidest. ad 100 ml
Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) 24 ml Chloroform 1 ml Isoamylalkohol Bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
CTAB 10%ig 5 g CTAB 0,7 M NaCl ad 50 ml Autoklavieren
DNA-Leiter für die Gelelektrophorese 10 µl TE 1 µl DNA Ladder 100 bp 1 µl 6x DNA- Ladepuffer
dNTP
10 µl dATP (100mM) 10 µl dCTP (100mM) 10 µl dGTP (100mM) 10 µl dTTP (100mM) Steriles Wasser ad 100 µL
EDTA 0,5 M pH 8,0
93,07 g EDTA (Titrierkomplex III) A. bidest. ad 450 ml pH Wert mit NaOH einstellen A. bidest. ad 500 ml Autoklavieren
Elektrophorese-TBE-Puffer 200 ml TBE-Stammlösung (10 M) A. dest. ad 4 l + 80 µl Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml)
Ethanol 80%ig 80 ml Ethanol unvergällt A. bidest. ad. 100 ml
Lysozym 100 mg/ml 100 mg Lysozym in 1 ml sterilem Wasser lösen Bei -20°C lagern.
NaCl-Lösung 0,9%ig 0,9 g NaCl A. bidest. ad 100 ml Autoklavieren
Anhang
167
Puffer/Lösung Zusammensetzung
NaCl-Lösung, 4 M
500 ml A. bidest. Vorlegen 233,76 g NaCl A. bidest. ad 100 ml Autoklavieren
PBS pH 7,2
NaCl 8,5 g Na2HPO4 1,28 g Na2HPO4x2H2O 0,156 g A. dest. ad 1 l
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) oder fertig von ROTH
25 ml Phenol 24 ml Chloroform 1 ml Isoamylalkohol Erst nach 24 Stunden verwenden. Bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
Proteinase K 20 mg/ml 20 mg Proteinase K in 1 ml sterilem A. bidest. Lösen Bei -20°C lagern.
RNase 1 mg/ml 1 mg Ribonuclease A in 1 ml sterilem Wasser lösen Bei -20°C lagern.
SDS, 20%ig 20 g SDS A. bidest. ad 100 ml
TBE-Agarosegele, 2%ig mit Ethidiumbromid
17,5 ml TBE-Stammlösung (10 M) 7 g Agarose A. dest. ad 350 ml Bis zur vollständigen Lösung in der aufkochen. Nach Abkühlung auf 55°C Zugabe von 7 µL Ethidiumbromid.
TBE-Puffer (0,5 M) mit Ethidiumbromid für die Gelelektrophorese
200 ml TBE-Stammlösung (10 M) A. dest. ad 4 l dazu 80 µL Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml)
TBE-Stammlösung (10 M)
108 g Tris 55 g Borsäure 3,72 g EDTA A. dest. ad 1 l Bis zur kompletten Lösung durchmischen.
TE-Puffer Tris/HCl (pH 7,4) 10 mM EDTA (pH 8,0) 1mM A. bidest, autoklaviert
Anhang
168
Puffer/Lösung Zusammensetzung
Tris/HCl 1 M
etwas A. bidest. vorlegen 121,4 g Tris mit HCl den pH-Wert einstellen A. dest. ad 1 l Autoklavieren
Xylencyanol 1%ig 1 mg Xylencyanol A. bidest. ad 100 ml
Tabelle 16: Selbst hergestellte Nährmedien Nährmedium Zusammensetzung
Müller-Hinton-II-Bouillon mit lysiertem Pferdeblut
Müller-Hinton-II-Bouillon 4% Pferdeblut, lysiert
Kryomedium 1 Teil Glycerin 1 Teil BHI-Boullion 2 Teile Pferdeserum mit 6% Glucose
Anhang
169
Tabelle 17: Verwendete Geräte Gerät Firma
Brutschrank Heraeus Holding GmbH, Hanau
Bunsenbrenner Juchheim Laborgeräte GmbH, Bernkastel Kues
Eismaschine Ziegra GmbH, Isernhagen
Elektrophoresekammer für Agarosegele Gator Horizontal Typ A2 (2300 ml) Fisher Scientific GmbH, Schwerte
EPOCH Mikroplatten Spektralphotometer BioTek, Bad Friedrichshall
Gefrierschrank -20°C Liebherr-International Deutschland GmbH, Biberach an der Riß
Gefrierschrank -80°C Panasonic Marketing Europe GmbH, Hamburg
Gel Doc 1000 Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Gel Doc Multianalyst Geldokumentation Bio-Rad Laboratories
Magnetrührer Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach
MALDI-TOF microflex Bruker Daltronics GmbH, Bremen
Mehrkanalpipette 1250 µl für Resistenztestung INTEGRA Biosciences GmbH, Biebertal
Mikrowelle Samsung Electronics GmbH, Schwalbach / Ts.
Mikrozentrifuge 5424 Eppendorf AG, Hamburg
Mikrozentrifuge Heraeus pico Heraeus Holding GmbH, Hanau
Perfection V800 Photo Film- und Fotoscanner EPSON Deutschland GmbH, Meerbusch
Photometer für Resistenztestung Biochrom Ltd., Cambridge, UK
Pipetten, 0,5-10 µl, 2-20 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl
Gilson, Inc., Middleton, USA, Eppendorf AG, Hamburg
Präzisionswaage Sartorius AG, Göttingen
Reagenzglasschüttler REAX 2000 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach
Reservoirs für Resistenztestung MERLIN Gesellschaft für mikrobiologische Diagnostika mbH, Bornheim-Hersel
Spannngsgerät Microcomputer Electrophoresis Power Supply Consort Kreutz Laborgeräte
Thermal Cycler T100TM Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Waage Mettler-Toledo GmbH, Gießen
Wasserbad GFL Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel
Werkbank NuAire, Plymouth, USA
Zentrifuge Hereaeus Megafuge 16R Heraeus Holding GmbH, Hanau
Anhang
170
Tabelle 18: Verwendete Software und Anwendungsprogramme Software/Anwendungsprogramm Firma
Clone Manager 9 Professional Edition © 1994-2013 Scientific & Educational Software
eBURST v3 The Department of Infectious Disease Epidemiology, Imperial College London
Gen5 1.11 Microplate Reader and Imager Software BioTek
iTOL v3.6 biobyte solutions
LCMHKScan in Labcontrol Ticono GmbH
PLZ-Diagramm 3.5 Klaus Wessiepe - Softwareentwicklung und Vertrieb
Primer3 (v. 0.4.0) open source
Prism 5 for Windows Version 5.03 © 1992-2010 GraphPad Software, Inc.
Quantity One Analysis Software Bio-Rad Laboratories
SAS Enterprise Guide 7.1 © SAS Institute Inc.
Tabelle 19: S.-suis-Referenz- und Kontrollstämme S. suis #Serotyp Referenz Stammbezeichnung
S. suis Baums P 1/7
S. suis Baums T15
S. suis #1 Baums DSM 9683
S. suis #2 Baums DSM 9682
S. suis #3 Baums A5140-3/96
S. suis #4 Baums P180-5145/1
S. suis #5 Baums A1881/1/97
S. suis #6 Gottschalk 2524
S. suis #7 Baums I4627G
S. suis #8 Baums A2883/2/97
S. suis #9 Baums A3286/94
S. suis #10 Hilde Smith cps 10
S. suis #11 Gottschalk 12814
S. suis #12 Gottschalk 8830
S. suis #13 Gottschalk 10581
S. suis #14 Gottschalk 13730
S. suis #15 Gottschalk NCTC 10446
S. suis #16 Gottschalk 2726
S. suis #17 Gottschalk 93A
Anhang
171
S. suis #Serotyp Referenz Stammbezeichnung
S. suis #18 Gottschalk NT77
S. suis #19 Hilde Smith cps 19
S. suis #20 Gottschalk 86-5192
S. suis #21 Gottschalk 14A
S. suis #22 Gottschalk 88-1861
S. suis #23 Gottschalk 89-2479
S. suis #24 Gottschalk 88-5299A
S. suis #25 Hilde Smith cps 25
S. suis #26 Gottschalk 89-4109-1
S. suis #27 Gottschalk 89-5259
S. suis #28 Gottschalk 89-590
S. suis #29 Gottschalk 92-1191
S. suis #30 Gottschalk 92-14000
S. suis #31 Gottschalk 92-4172
S. suis #32 Gottschalk EA 1172.91
S. suis #33 Gottschalk EA 1832.92
S. suis #34 Gottschalk 92-2742
Tabelle 20: Kontrollstamm für die MHK-Wertbestimmung im Mikrodilutionsverfahren Keimart Stammbezeichnung
Enterococcus faecalis ATCC 29212 / DSM 2570
Tabelle 21: Verwendete Primer
Nr. Oligoname Sequenz (5`->3`) Amplikon (bp) Referenz
Primer für die S.-suis-grouping-PCR
1 Ss16sRNA_f GAGTTTGATCCTGGCTCAG 1542-1553 [A] 2 Ss16sRNA_r AGAAAGGAGGTGATCCAGCC [A] 3 SsGroupI_f TGGTTCAAATATCAATGCTC 933 [A] 4 SsGroupI_r ATTGGTTGTGAGTGCATTG [A] 5 SsGroupII_f TCAAAATACGCACCTAAGGC 823 [A] 6 SsGroupII_r CACTCACCTGCCCCAAGAC [A]
7 SsGroupIII_f TGATTTGGGTGAGACCATG 583 [A]
8 SsGroupIII_r CTCATGCTGGATAACACGT [A]
9 SsGroupIV_f ACAGTCGGTCAAGATAATCG 455 [A]
10 SsGroupIV_r TCAGCTTGGGTAATATCTGG [A]
11 SsGroupV_f GGAAAGATGGAGGACCAGC 265 [A]
Anhang
172
Nr. Oligoname Sequenz (5`->3`) Amplikon (bp) Referenz
12 SsGroupV_r CCAACCAGACTCATATCCCC [A]
13 SsGroupVI_F2_f GACGCACCAAGTGATATGCC 146 [A]
14 SsGroupVI_R2_r GGTCCGACAATAGCCATTTC [A]
15 SsGroupIII_F1_f GATGCCCCAAGCGATATGCC 146 [A]
16 SsGroupIII_R1_r GGACCAACAATGGCCATCTC [A]
17 SsRECN_f GCAATAGCAATGACTTGTGG 1247 [D]
18 SsRECN_r ACAGGGGATTGAAGTAGCTG [D]
Primer für die S.-suis-typing PCR
19 SsTypeI_3_f GGTTTTGATTGGTCTAGTTG 214 [A]
20 SsTypeI_3_r CTCTAAAGCTCGATATCTAC [A]
21 SsTypeI_13_f TATGGTTAAAGGTGGAACTG 408 [A]
22 SsTypeI_13_r CCTTGTATATATTCCCTCCA [A]
23 SsTypeI_18_f TAATGGGATAGTTGCGTTAC 617 [A]
24 SsTypeI_18_r ATACATAAAGTTGTCCTGCG [A]
25 SsTypeII_2_1/2_f TTAGCAACGTTGCCAATAAG 173 [A]
26 SsTypeII_2_1/2_r AATCCTCCATTAAAACCCTG [A]
27 SsTypeII_6_f GCTCACTATTTTTACATTACAC 278 [A]
28 SsTypeII_6_r TATTACTCCGCCAAATACAG [A]
29 SsTypeII_1_14_f TTAGACAGACACCTTATAGG 386 [A]
30 SsTypeII_1_14_r CTAGCTTCGTTACTTGATTC [A]
31 SsTypeII_16_f AAGGTTATCCACGAAAGATG 494 [A]
32 SsTypeII_16_r TCCGGCAATATTCTTTCAAG [A]
33 SsTypeII_27_f AGACACTGCTTGCATTATTG 655 [A]
34 SsTypeII_27_r TCAGAATTACTTCCTGTTGC [A]
35 SsTypeIII_21_f TATCATATTGAGAATCTTCCC 160 [A]
36 SsTypeIII_21_r TTGCGTAGCATACAAAGTTC [A]
37 SsTypeIII_28_f ATTATGTTGGTTGCAGAAGG 272 [A]
38 SsTypeIII_28_r CGACTCAATTGTTGTAGTAG [A]
39 SsTypeIII_29_f TTCTGGGATTTTAGGAATGC 415 [A]
40 SsTypeIII_29_r CATGAAATACGCACTTGTAC [A]
41 SsTypeIII_30_f TATTGCACTAGCTTCAGAAC 568 [A]
42 SsTypeIII_30_r TGCATCCATAGTTGTATTCG [A]
43 SsTypeIV_4_f GACTATCTGTATACCCAAAC 903 [A]
44 SsTypeIV_4_r TCCTTCCAAGTATTCTCTAG [A]
45 SsTypeIV_5_f ATCTTAGGAATGATTCGGAC 720 [A]
46 SsTypeIV_5_r ACCAGATATCTGAGCAAATG [A]
47 SsTypeIV_7_f AACTACCTACCTGAACTTTG 566 [A]
Anhang
173
Nr. Oligoname Sequenz (5`->3`) Amplikon (bp) Referenz
48 SsTypeIV_7_r AGTCTAAAAGTGATCGAGTC [A]
49 SsTypeIV_17_f TAGCATCAGTTTATACGAGG 455 [A]
50 SsTypeIV_17_r TAGTTTATCTGTGACACACC [A]
51 SsTypeIV_19_f GTGTCGCAAATCAAGTATTG 348 [A]
52 SsTypeIV_19_r AAGCTAGTACAACAAGCATG [A]
53 SsTypeIV_23_f TAATGTATGCTCTGTCACTG 221 [A]
54 SsTypeIV_23_r AACGAAACGGAATAGTTTGC [A]
55 SsTypeV_8_f AAATAAGGTAGGAGCTACTC 446 [A]
56 SsTypeV_8_r ATCCAACCTTAGCTTTCTGT [A]
57 SsTypeV_15_f ATCGTTTTGAGATTGAGTGG 542 [A]
58 SsTypeV_15_r TAAACGGATTCGGTTACTCA [A]
59 SsTypeV_20_f TGTGGATTTCTGGGATAATC 698 [A]
60 SsTypeV_20_r TGTGGACGAATTACTACTTG [A]
61 SsTypeV_22_f GCATTATCAGGATTCTTTCC 296 [A]
62 SsTypeV_22_r CCAATTGGGTGTTCAAAAAG [A]
63 SsTypeV_25_f GTTTGCTCCGATCATAATAG 174 [A]
64 SsTypeV_25_r CCAGTAAAAGGACTCAATAC [A]
65 SsTypeVI_9_f GAAAGTAGGTATATCTCAGC 368 [A]
66 SsTypeVI_9_r GGGCTATTAAAACTCCTATC [A]
67 SsTypeVI_10_f TTTCCCATTTGCTTATGGAC 633 [A]
68 SsTypeVI_10_r GGAATAAAAACGATTGGGAG [A]
69 SsTypeVI_11_f ATGCGATTGCAACAATTGAC 833 [A]
70 SsTypeVI_11_r AGGCATGAGTAATACATAGG [A]
71 SsTypeVI_12_f AACAGGTATTTCAGGATTGC 131 [A]
72 SsTypeVI_12_r CTCGGATAAAGATAATCAGC [A]
73 SsTypeVI_24_f TACTGAGATTTATTGGGACG 224 [A]
74 SsTypeVI_24_r AAGCGATTGGATTACATTGC [A]
75 SsTypeVI_26_f TTATACCGAAATTTTGTTGCC 472 [A]
76 SsTypeVI_26_r CGTCAATCATATAAAGTGGG [A]
77 SsTypeVI_33_f GATGTTTTCAACAGGTGTAC 710 [A]
78 SsTypeVI_33_r CAAAGTACCTATTTTCAGCG [A]
79 SsTypeVII_31_wzy_f ACAATCGTTTCTGCAATACG 842 [A]
80 SsTypeVII_31_wzy_r GATGAAAACATCGTTGGTAG [A]
81 SsTypeVII_31_sugar_f ATCAGTAGTGGGAATAGTTG 423 [A]
82 SsTypeVII_31_sugar_r TTTACTGTTTTTCGACCGTG [A]
83 SsTypeVII_32_wzy_f AACCGCTGTTGAATTAAGAG 570 [A]
84 SsTypeVII_32_wzy_r TTCGTTAGTTGAACTGTTCC [A]
85 SsTypeVII_32_sugar_f TAGGACTATGGTTCCTAATG 342 [A]
Anhang
174
Nr. Oligoname Sequenz (5`->3`) Amplikon (bp) Referenz
86 SsTypeVII_32_sugar_r TATTCTAGTTCAAGTCGCTC [A]
87 SsTypeVII_ 34_wzy_f AAGTTTCATTCGAGGACTTC 246 [A]
88 SsTypeVII_34_wzy_r GTATATAACACCGCAAGAAG [A]
89 SsTypeVII_34_sugar_f ATACAGTGATGTCTTGCAAC 701 [A]
90 SsTypeVII_34_sugar_r ATTGCTTTTTGACAATCGGC [A]
Primer für S.-suis-MLST-PCR
91 Ss_dpr_f CGTCTTTCAGCCCGCGTCCA 336 [B]
92 Ss_dpr_r GACCAAGTTCTGCCTGCAGC [B]
93 Ss_thrA_f GATTCAGAACGTCGCTTTGT [B]
94 Ss_thrA_seq_f a AAGAATGGATCATCAACCGT 336 [B]
95 Ss_thrA_r AAGTTTTCATAGAGGTCAGC [B]
96 Ss_cpn60_f TTGAAAAACGTRACKGCAGGTGC 318 [B]
97 Ss_cpn60_r ACGTTGAANbGTACCACGAATC [B]
98 Ss_recA_f TATGATGAGTCAGGCCATG 354 [B]
99 Ss_recA_r CGCTTAGCATTTTCAGAACC [B]
100 Ss_gki_f GGAGCCTATAACCTCAACTGG 321 [B]
101 Ss_gki_r AAGAACGATGTAGGCAGGATT [B]
102 Ss_aroA_f TTCCATGTGCTTGAGTCGCTA 366 [B]
103 Ss_aroA_r ACGTGACCTACCTCCGTTGAC [B]
104 Ss_mutS_f CGCAGAGCAGATGGAAGATCC 339 [B]
105 Ss_mutS_r CCCATAGCTGTTTTGGTTTCATC [B]
106 mutS_new_f AAGCAGGCAGTCGGCGTGGT 339 [C]
107 mutS_new_r AGTACAAACTACCATGCTTC [C] [A]: OKURA et al. 2014 / [B]: KING et al. 2002 / [C]: REHM et al. 2007 / [D]: vorliegende Arbeit a genutzt als Vorwärts-Primer zum Sequenzieren b hier N statt I nach KING et al. 2002
Anhang
175
Tabelle 22: Verwendete Primer-Premixe
Bezeichnung des Primer-Premix Menge der jeweiligen Primer (100 µM) für 1 ml Primer-Premix
Primer-Premix-grouping je 10 µl Primer Nr. 3-18 0,5 µl Primer 1 und 2 steriles Wasser ad 1 ml
Primer-Premix-typing-I je 10 µl Primer Nr. 19-24 0,5 µl Primer 1 und 2 steriles Wasser ad 1 ml
Primer-Premix-typing-II je 10 µl Primer Nr. 25-34 0,5 µl Primer 1 und 2 steriles Wasser ad 1 ml
Primer-Premix-typing-III je 10 µl Primer Nr. 35-42 0,5 µl Primer 1 und 2 steriles Wasser ad 1 ml
Primer-Premix-typing-IV je 10 µl Primer Nr. 43-54 0,5 µl Primer 1 und 2 steriles Wasser ad 1 ml
Primer-Premix-typing-V je 10 µl Primer Nr. 55-64 0,5 µl Primer 1 und 2 steriles Wasser ad 1 ml
Primer-Premix-typing-VI je 10 µl Primer Nr. 65-78 0,5 µl Primer 1 und 2 steriles Wasser ad 1 ml
Primer-Premix-typing-VII je 10 µl Primer Nr. 79-90 0,5 µl Primer 1 und 2 steriles Wasser ad 1 ml
Anhang
176
Tabelle 23: S.-suis-Serotypen in Deutschland zwischen 2015 und 2016 aus verschiedenen Lokalisationen im Tier
Serotyp Invasive Isolate Lungen-Isolate Carrier-Isolate n [%] n [%] n [%]
1 oder 14 24 6,80 1 0,85 0 0 2 oder 1/2 83 23,51 22 18,80 3 5,77
3 15 4,25 11 9,40 0 0 4 33 9,35 16 13,68 5 9,62 5 7 1,98 4 3,42 3 5,77 6 0 0 0 0 0 0 7 54 15,30 9 7,69 1 1,92 8 10 2,83 12 10,26 6 11,54 9 79 22,38 7 5,98 2 3,85 10 3 0,85 1 0,85 0 0 11 3 0,85 0 0 2 3,85 12 0 0 0 0 0 0 13 1 0,28 0 0 1 1,92 15 3 0,85 1 0,85 3 5,77 16 3 0,85 4 3,42 2 3,85 17 0 0 1 0,85 0 0 18 5 1,42 5 4,27 0 0 19 3 0,85 3 2,56 1 1,92 20 0 0 0 0 0 0 21 1 0,28 3 2,56 2 3,85 22 0 0 0 0 0 0 23 3 0,85 1 0,85 0 0 24 2 0,57 1 0,85 0 0 25 0 0 0 0 0 0 26 0 0 0 0 0 0 27 0 0 0 0 0 0 28 5 1,42 1 0,85 4 7,69 29 0 0 2 1,71 8 15,38 30 1 0,28 0 0 1 1,92 31 7 1,98 4 3,42 2 3,85 32 0 0 0 0 0 0 33 0 0 0 0 0 0 34 0 0 0 0 0 0 nt 8 2,27 8 6,84 6 11,54 ∑ 353 100 117 100 52 100
nt: nicht-typisierbare Isolate
Anhang
177
Tabelle 24: S.-suis-Serotypen in Deutschland zwischen 1996 und 2004a aus verschiedenen Lokalisationen im Tier
Serotyp Invasive Isolate Lungen-Isolate Carrier-Isolate n [%] n [%] n [%]
1 oder 14 8 11,43 1 1,35 1 2,22
2 oder 1/2 31 44,29 11 14,86 8 17,78
3 2 2,86 11 14,86 1 2,22
4 2 2,86 13 17,57 4 8,89
5 2 2,86 6 8,11 4 8,89
6 0 0 0 0 0 0
7 5 7,14 11 14,86 1 2,22
8 0 0 2 2,70 2 4,44
9 18 25,71 3 4,05 0 0
10 0 0 0 0 0 0
11 0 0 1 1,35 1 2,22
12 0 0 1 1,35 2 4,44
13 0 0 1 1,35 0 0
15 0 0 0 0 5 11,11
16 0 0 0 0 1 2,22
17 0 0 0 0 0 0
18 0 0 0 0 0 0
19 0 0 0 0 0 0
20 0 0 0 0 0 0
21 0 0 2 2,70 2 4,44
22 0 0 0 0 0 0
23 0 0 1 1,35 0 0
24 0 0 0 0 1 2,22
25 0 0 0 0 0 0
26 0 0 0 0 0 0
27 0 0 0 0 0 0
28 0 0 0 0 0 0
29 0 0 0 0 1 2,22
30 0 0 1 1,35 0 0
31 0 0 3 4,05 2 4,44
32 0 0 0 0 0 0
33 0 0 0 0 0 0
34 0 0 0 0 0 0
nt 2 2,86 6 8,11 9 20
∑ 70 100 74 100 45 100 nt: nicht-typisierbare Isolate a SILVA et al. 2006
Anhang
178
Tabelle 25: Prävalenz von S.-suis-Serotypen in Deutschland aus verschiedenen Lokalisationen und Zeiträumen Serotyp Invasive Isolate Lungen-Isolate Carrier-Isolate
Kohorte A
Kohorte B
p-Werta Kohorte A
Kohorte B
p-Werta Kohorte A
Kohorte B
p-Werta
1 und 14 8 24 1 1 1 0 2 und 1/2 31 83 0,0006 11 22 8 3
3 2 15 11 11 1 0 4 2 33 0,0939 13 16 4 5 5 2 7 6 4 4 3 6 0 0 0 0 0 0 7 5 54 0,0883 11 9 1 1 8 0 10 2 12 0,0840 2 6 9 18 79 3 7 0 2
10 0 3 0 1 0 0 11 0 3 1 0 1 2 12 0 0 1 0 2 0 13 0 1 1 0 0 1 15 0 3 0 1 5 3 16 0 3 0 4 1 2 17 0 0 0 1 0 0 18 0 5 0 5 0 0 19 0 3 0 3 0 1 20 0 0 0 0 0 0 21 0 1 2 3 2 2 22 0 0 0 0 0 0 23 0 3 1 1 0 0 24 0 2 0 1 1 0 25 0 0 0 0 0 0 26 0 0 0 0 0 0 27 0 0 0 0 0 0 28 0 5 0 1 0 4 29 0 0 0 2 1 8 0,0347 30 0 1 1 0 0 1 31 0 7 3 4 2 2 32 0 0 0 0 0 0 33 0 0 0 0 0 0 34 0 0 0 0 0 0 nta 2 8 6 8 9 6 ∑ 70 353 74 117 45 52
a p-Wert nach exaktem Test von Fisher; angegeben soweit ≤10% (0,1) nt: nicht-typisierbare Isolate Kohorte A: 1996 – 1998 und 2001 – 2004 (SILVA et al. 2006) Kohorte B: 2015 - 2016
Anhang
179
Tabelle 26: S.-suis-ZNS- und -Gelenk-Isolate aus verschiedenen Zeiträumen Serotyp Kohorte A Kohorte B Kohortenvergleich
ZNS Gelenk ZNS Gelenk p-Werta ZNS Gelenk p-Werta p-Werta p-Werta
1 und 14 4 3 4 11 <0,0001 0,0316 2 und 1/2 25 5 55 13 0,0002
3 2 0 12 0 4 1 0 26 1 0,0588 0,0588 5 1 0 6 1 6 0 0 0 0 7 3 1 35 9 8 0 0 8 0 9 12 1 55 8 10 0 0 3 0 11 0 0 1 1 12 0 0 0 0 13 0 0 1 0 15 0 0 3 0 16 0 0 1 1 17 0 0 0 0 18 0 0 4 1 19 0 0 3 0 20 0 0 0 0 21 0 0 0 1 22 0 0 0 0 23 0 0 3 0 24 0 0 1 0 25 0 0 0 0 26 0 0 0 0 27 0 0 0 0 28 0 0 4 0 29 0 0 0 0 30 0 0 0 0 31 0 0 5 0 32 0 0 0 0 33 0 0 0 0 34 0 0 0 0 nta 0 2 0,0373 2 1 0,0990 ∑ 48 12 232 48
a p-Wert nach exaktem Test von Fisher; angegeben soweit ≤10% (0,1) nt: nicht-typisierbare Isolate Kohorte A: 1996 – 1998 und 2001 – 2004 (SILVA et al. 2006) Kohorte B: 2015 - 2016
Anhang
180
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Anhang
183
9.1 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Mengenangaben der Reagenzien in der S.-suis-grouping-PCR ......... 51
Tabelle 2: Mengenangaben der Reagenzien in der S.-suis-typing-PCR ............. 52
Tabelle 3: Beurteilung der Amplifikate in der S.-suis-grouping-PCR ................... 53
Tabelle 4: Ansatz der Reagenzien für die MLST-PCRs ....................................... 58
Tabelle 5: Stichprobenartige Überprüfung der PCR-Ergebnisse für
S.-suis-Isolate ..................................................................................... 66
Tabelle 6: Prävalenz von S.-suis-Serotypen in Deutschland aus
verschiedenen Zeiträumen ................................................................. 71
Tabelle 7: Nicht-typisierbare Isolate aus Kohorte B ............................................. 82
Tabelle 8: Beurteilung der Kapselausprägung bei nicht-typisierbaren
S.-suis-Isolaten aus Kohorte B ........................................................... 89
Tabelle 9: MHK-Wert-Verteilung von S.-suis-Isolaten aus Deutschland von
2015 bis 2016 ..................................................................................... 96
Tabelle 10: Klinische MHK-Grenzwerte nach CLSI für S. suis bei
respiratorischen Erkrankungen und Resistenzlage der
S.-suis-Isolate aus 2015-2016 ............................................................ 98
Tabelle 11: Resistenzraten der S.-suis-Isolate zwischen 2015 und 2016 aus
unterschiedlichen Isolationsquellen .................................................. 100
Tabelle 12: Multiresistente S.-suis-Isolate ........................................................... 103
Tabelle 13: Verwendete Chemikalien .................................................................. 163
Tabelle 14: Verwendete Verbrauchsmaterialien .................................................. 165
Tabelle 15: Verwendete Lösungen und Puffer .................................................... 166
Tabelle 16: Selbst hergestellte Nährmedien ........................................................ 168
Tabelle 17: Verwendete Geräte ........................................................................... 169
Tabelle 18: Verwendete Software und Anwendungsprogramme ......................... 170
Tabelle 19: S.-suis-Referenz- und Kontrollstämme ............................................. 170
Anhang
184
Tabelle 20: Kontrollstamm für die MHK-Wertbestimmung im
Mikrodilutionsverfahren ..................................................................... 171
Tabelle 21: Verwendete Primer ........................................................................... 171
Tabelle 22: Verwendete Primer-Premixe ............................................................. 175
Tabelle 23: S.-suis-Serotypen in Deutschland zwischen 2015 und 2016 aus
verschiedenen Lokalisationen im Tier ............................................... 176
Tabelle 24: S.-suis-Serotypen in Deutschland zwischen 1996 und 2004 aus
verschiedenen Lokalisationen im Tier ............................................... 177
Tabelle 25: Prävalenz von S.-suis-Serotypen in Deutschland aus
verschiedenen Lokalisationen und Zeiträumen................................. 178
Tabelle 26: S.-suis-ZNS- und -Gelenk-Isolate aus verschiedenen Zeiträumen ... 179
Tabelle 27: Informationen zu Isolaten der in der Studie festgestellten
Sequenztypen (ST) ........................................................................... 180
Tabelle 28: MHK50 und MHK90-Werte von S.-suis-Isolaten aus Deutschland
von 2015 bis 2016 aus verschiedenen Isolationsquellen .................. 182
Anhang
185
9.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Weltweite Verteilung wichtiger Sequenztypen von S.-suis-Serotyp-2-Isolaten von Mensch und Schwein ......................... 34
Abbildung 2: S.-suis-Invasionsschema .................................................................... 47
Abbildung 3: Schema der S.-suis-grouping-PCR ..................................................... 54
Abbildung 4: Schema der S.-suis-typing-PCR nach OKURA et al. (2014)............... 55
Abbildung 5: Auswertung der S.-suis-typing-PCR nach der Gelelektrophorese. ..... 64
Abbildung 6: Herkunft von S.-suis-Isolaten innerhalb Deutschlands ....................... 68
Abbildung 7: Anteile von S.-suis-Serotypen in Deutschland in Kohorte A. .............. 69
Abbildung 8: Anteile von S.-suis-Serotypen in Deutschland in Kohorte B. .............. 70
Abbildung 9: Anteile von S.-suis-Serotypen bei invasiven Isolaten in
Deutschland aus verschiedenen Zeiträumen. ..................................... 74
Abbildung 10: Anteile von S.-suis-Serotypen bei ZNS-Isolaten in Deutschland
aus verschiedenen Zeiträumen. .......................................................... 76
Abbildung 11: Anteile von S.-suis-Serotypen bei ZNS- und Gelenk-Isolaten in
Kohorte B. ........................................................................................... 77
Abbildung 12: Anteile von S.-suis-Serotypen bei Lungen-Isolaten in
Deutschland aus verschiedenen Zeiträumen. ..................................... 79
Abbildung 13: Anteile von S.-suis-Serotypen bei Carrier-Isolaten in Deutschland
aus verschiedenen Zeiträumen. .......................................................... 80
Abbildung 14: Kapseldarstellung im TEM nach WILLENBORG et al. (2011) ............ 84
Abbildung 15: TEM-Aufnahmen der 22 nicht-typisierbaren S.-suis-Isolate aus
Kohorte B ............................................................................................ 88
Abbildung 16: Dendrogramm der nicht-typisierbaren Isolate ..................................... 91
Abbildung 17: eBURST-Analyse (Population Snapshot) der gesamten S.-suis-MLST-Datenbank.................................................................... 93
Abbildung 18: Klonaler Komplex 16 ........................................................................... 94
Abbildung 19: Klonaler Komplex 94 ........................................................................... 94
Abbildung 20: Schweinedichte in Deutschland ........................................................ 108
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich sehr herzlich bei allen Personen bedanken, die
mich in der Vorbereitung und Durchführung dieser Arbeit unterstützt haben.
Ich danke ausdrücklich Herrn Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand für die Möglichkeit an
einem so spannenden Thema arbeiten zu dürfen und für seine fachlich sehr
kompetente Betreuung. Er verstand es in hervorragender Weise, mich auf eine
menschliche und freundliche Art zu konstruktiver Arbeit anzuleiten und zu motivieren.
Durch die Zeit am Institut für Mikrobiologie konnte ich mich beruflich weiter
entwickeln und qualifizieren. Ich weiß diese Betreuung sehr zu schätzen.
Ein großer Dank geht an meine Betreuerin, Frau Dr. Judith Rohde, die mich von
Beginn an in jeglichen Angelegenheiten meiner Arbeit beraten hat und immer eine
Antwort auf meine Fragen wusste. Besonders schätze ich, dass sie jederzeit ein
offenes Ohr für mich hatte und mir immer sehr zeitnah weiterhelfen konnte. Sie war
dabei sowohl verständnisvoll als auch konstruktiv.
Außerdem möchte ich mich bei PD Dr. Jörg Willenborg bedanken, der mich von
Beginn an in jegliche molekularbiologische Methoden, die für meine Arbeit
grundlegend waren, im Detail eingearbeitet hat. Er hat sich stets die Zeit genommen,
mit mir die Planung und Durchführung der Versuche genau durchzugehen und
ebenso die Ergebnisse zu besprechen und war dabei immer ein sehr kompetenter
und freundschaftlicher Ratgeber.
Ich danke auch unseren Kooperationspartnern, Frau Dr. Hilde Smith, University of
Wageningen, Niederlande, sowie Herrn Prof. Dr. Manfred Rohde, Helmholtz Zentrum
für Infektionsforschung in Braunschweig, die mit ihren Untersuchungen zu den
Ergebnissen beigetragen haben und diese Arbeit dadurch bereichert und komplettiert
haben.
Weiterhin danke ich Frau Dr. Jutta Verspohl unter anderem dafür, dass sie mir für
meine Arbeit den zeitlichen und räumlichen Platz im Diagnostiklabor ermöglicht hat,
bei dem Akquirieren von Isolaten immer unterstützend und hilfsbereit mitgewirkt hat
und auch stets ein offenes Ohr für meine Fragen und Probleme hatte. Ich habe mich
dabei auch menschlich immer sehr gut aufgehoben gefühlt.
Allen Tierarztpraxen und Laboren, die Isolate eingesendet und entsprechende
Hintergrundinformationen zu den Isolaten zur Verfügung gestellt haben, gilt mein
Dank. Ohne diese Bereitschaft wäre die Studie nicht in dieser Form zu verwirklichen
gewesen.
Ein ganz besonderer Dank geht auch an Jörg Merkel, der mir nicht nur bei der
Bewältigung der riesigen Datenmengen eine wirklich große Hilfe war, sondern auch
für jegliche Fragen bezüglich der Bedienung verschiedenster Software-Programme
geduldig zur Verfügung stand und auch immer einen Lösungsweg gefunden hat.
Damit hat er essentiell zum Gelingen der Arbeit beigetragen.
Ich danke außerdem allen Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie an der
Tierärztlichen Hochschule Hannover. Alle waren stets hilfsbereit und haben mir bei
der Bewältigung verschiedenster Aufgaben und Probleme geholfen. Die
Freundlichkeit und Hilfsbereitschaft aller ist ein großes Gut an diesem Institut.
Zuletzt bedanke ich mich noch bei meiner Familie. Danke an meine Mutter, die für
mich beruflich und persönlich mein größtes Vorbild ist, danke an meinen Vater, der
mir immer alles ermöglicht hat und mich in allem unterstützt, danke an meine
Schwester, die mir immer zur Seite steht und danke an Björn, der mit mir alles
gemeinsam bewältigt, mich unterstützt und entlastet.