tio nanoosakestest valmistatud nanokilede fotokatalüütiliste ......bakterid paljunevad suhteliselt...

Tallinna Reaalkool

TiO2 nanoosakestest valmistatud nanokilede fotokatalüütiliste

omaduste uurimine elusrakkude näitel

Uurimistöö

Markus Laars

11c

Juhendaja: Katre Juganson,

KBFI ja TTÜ doktorant

Kaasjuhendaja: õp Andrus Kangro

Tallinn 2014

Sisukord

Kasutatud lühendid .................................................................................................................. 4

Sissejuhatus ............................................................................................................................... 5

1. Kirjanduse ülevaade ............................................................................................................. 7

1.1. Nanoosakesed ................................................................................................................. 7

1.1.1. Nanoosakeste iseloomustus ja kasutusalad................................................................. 7

1.1.2. TiO2 nanoosakesed ..................................................................................................... 7

1.2. Bakterid ........................................................................................................................ 10

1.2.1. Ülevaade bakterirakust ........................................................................................... 10

1.2.2. Bakterite roll loodus- ja inimkeskkonnas ............................................................... 11

1.2.3. Bakteritest tingitud ohud tervisele .......................................................................... 12

1.2.4. Mudelorganism Escherichia coli ............................................................................ 13

1.2.5. Luminestseeruvad bakterid ..................................................................................... 13

2. Materjalid ja meetodid ....................................................................................................... 15

2.1. Uurimistöös kasutatud vahendid ................................................................................ 15

2.1.1. TiO2 nanokiled ........................................................................................................ 15

2.1.2. Escherichia coli pSLlux ......................................................................................... 16

2.2. TiO2 nanokilede mõju uurimine ................................................................................. 17

2.2.1. Katse parameetrid ................................................................................................... 17

2.2.2. Escherichia coli pSLlux’i eksponeerimine TiO2 nanokiledel ja kontrollalustel .... 17

2.2.3. Antibakteriaalse mõju hindamine ........................................................................... 18

3. Tulemused ja arutelu ......................................................................................................... 20

3.1. Katsetingimuste optimeerimine TiO2 nanokilede mõju uurimiseks ....................... 20

3.1.1. TiO2 nanokilede valik ............................................................................................... 20

3.1.2. Optimaalsete tingimuste leidmine E. coli pSLlux kultuuri ettevalmistamiseks ....... 20

3.1.3. Sobivate lahjenduste valimine E. coli pSLlux’i arvukuse määramiseks .................. 22

3.1.4. Bakteritilga räni monokristallist alustelt ja TiO2 nanokiledelt mahapesemise

efektiivsuse kontrollimine ...................................................................................... 23

3.2. TiO2 nanokilede mõju uurimine Escherichia coli pSLlux’iga .................................. 24

3.2.1. TiO2 nanokilede ja kontrollaluste mõju E. coli pSLlux’ile pimedas ........................ 24

3.2.2. TiO2 nanokilede ja kontrollaluste mõju E. coli pSLlux’ile UV-valguses ................. 25

Kokkuvõte ............................................................................................................................... 29

Kasutatud materjalid ............................................................................................................. 31

Tänuavaldused ........................................................................................................................ 34

Lisa 1 Skaneeriva elektronmikroskoobi pilt TiO2 nanokilest ............................................ 35

Lisa 2 Bakterite eksponeerimine alustele pimedas .............................................................. 36

Lisa 3 Bakterite eksponeerimine alustele UV-valguses ....................................................... 38

Lisa 4 Skaneeriva elektronmikroskoobi pilt räni monokristallist alusel ja TiO2 nanokilel

UV-kiirgusele ja pimedas eksponeeritud E. coli pSLlux rakkudest ............................ 40

Resümee ................................................................................................................................... 41

Abstract ................................................................................................................................... 42

Kasutatud lühendid

CFU – kolooniat moodustav ühik [ingl. Colony Forming Unit]

LB sööde – Luria-Bertani sööde

SEM – skaneeriv elektronmikroskoopia

TiO2 – titaandioksiid

UV-kiirgus - ultraviolettkiirgus

Sissejuhatus

Titaandioksiidi (TiO2) nanoosakesi toodetakse maailmas hinnanguliselt 550 - 5500 tonni

aastas (Piccino et al. 2012) ning need leiavad kasutust väga erinevates eluvaldkondades:

päikesekreemides ja -patareides, isepuhastuvates pindades, värvides jne (Gupta, Tripathi

2011; The Nanodatabase). Mitmetes eelnimetatud rakendustes kasutatakse TiO2 omadust

neelata lühilainelist valgust, mille käigus oksüdeeritakse orgaanilisi molekule. Kuna TiO2 on

stabiilne, odav, tõhus ja inimestele ning keskkonnale küllaltki ohutu, loetakse seda peaaegu

ideaalseks pooljuhiks. (Gupta, Tripathi 2011)

Traditsiooniliselt kasutatakse erinevate pindade desinfitseerimiseks erinevaid puhastusaineid

või UVC-kiirgusega kiiritamist, ent sellised meetodid pole pikaajaliselt efektiivsed ning

võivad põhjustada mürgistest kemikaalidest või kiirgusest tulenevaid tervisekahjustusi.

Seetõttu on TiO2 nanoosakeste üheks paljulubavaimaks rakendusalaks isepuhastuvad katted,

mis leiaksid kasutust nii meditsiinis, toiduainetetööstuses kui ka igapäevaelus aknaklaasidel.

(Kühn et al. 2003)

Eelnenud informatsiooniotsingutest lähtuvalt on käesoleva uurimistöö teemaks valitud „TiO2

nanoosakestest valmistatud nanokilede fotokatalüütiliste omaduste uurimine elusrakkude

näitel“. Senised tööd TiO2 osakestest valmistatud katete osas on näidanud vähest

antibakteriaalset toimet, mida on õnnestunud tõsta ainult TiO2 nanoosakesi lühilainelise,

inimesele kahjuliku UVC-kiirguse abil aktiveerides. Antud uurimistöö raames tehtud katsed

püüavad selgust tuua, kas uudseid TiO2 nanoosakestest valmistatud kilesid on võimalik

efektiivselt kasutada neid bioloogiliselt vähemkahjustava UVA-kiirgusega aktiveerides.

Käesoleva töö eesmärkideks on uurida, kas anataasi faasis TiO2 nanoosakesed omavad

antibakteriaalset toimet, milline on UVA-kiirguse toime bakteritele, ning kas TiO2

nanoosakesi on võimalik UVA-kiirgusega aktiveerida, saamaks tõhusamat bakteritsiidset

mõju. Uurimistöös püstitati hüpotees: kui anataasi faasis TiO2 nanoosakestest valmistatud

6

kilesid UVA-kiirgusega ergastada, siis nende antibakteriaalne toime on tõhusam, kui ainult

UVA-kiirgusel või TiO2 nanokiledel pimedas.

Uurimistöö käigus tutvutakse TiO2 nanoosakeste eripäraga ja bakteri kui elusraku mudeliga

ning õpitakse baktereid laboratoorsetes katsetes kasutama, nende arvukust hindama. Töö

tulemused on abiks TiO2 nanoosakestel põhinevate bioaktiivsete pindade väljatöötamisel.

Uurimistöö on jaotatud kolmeks suuremaks peatükiks. Esimeses peatükis on ülevaade

teemakohasest kirjandusest, kus käsitletakse nanoosakesi ja keskendutakse täpsemalt TiO2

nanoosakestele ning antakse ülevaade bakterist kui elusraku mudelist. Teises peatükis

kirjeldatakse uurimistöö metoodikat ja kasutatud materjale. Kolmandas peatükis esitatakse

saadud katsetulemused ning arutletakse nende üle.

Uurimistöö allikateks on varasemad uurimused TiO2, fotokatalüüsi ja bakterite kohta ning

meetodeid käsitlevad juhised.

7

1. Kirjanduse ülevaade

1.1. Nanoosakesed

1.1.1. Nanoosakeste iseloomustus ja kasutusalad

Nanoosakesed on osakesed, mille vähemalt üks mõõde jääb vahemikku 1 - 100 nm. Taoliste

osakestega on inimesed ja keskkond kokku puutunud juba aegade algusest saadik. Looduses

tekivad nanoosakesed näiteks vulkaanipursete või metsatulekahjude käigus, aga ka viirused ja

valgud jäävad nanomõõtmetesse. Viimasel sajandil on eelnevatele lisandunud sünteetilised

ehk tööstuslikult toodetud nanoosakesed, mida kasutatakse üha enam täite- ja

kattematerjalides, pooljuhtides, katalüsaatorites, mikroelektroonikas, ilutoodetes ja

ravimikandjatena. (Kahru, Lippmaa 2010)

Nanoosakesi kasutatakse erinevates toodetes eelkõige seetõttu, et nende väikestest

mõõtmetest tulenevalt omandavad nad tavasuuruses osakestest erinevad füüsikalised ja

keemilised omadused. Mida väiksem on osake, seda suurem on tema eripind, seetõttu on

suurem ka osakese reaktiivsus teiste ainetega (Nanotehnoloogia tumedam külg). Sellest, et

sama aine võib omandada nanosuuruses täiesti uued omadused, võib võita nii tööstus kui ka

meditsiin, sest tooted muutuvad väiksemateks, kergemateks ja efektiivsemateks (Kändler

2009). Loodetakse, et nanotehnoloogia toob uusi läbimurdeid näiteks kergemate ja

tugevamate materjalide loomisel, looduskeskkonna puhastamisel, toksiliste kemikaalide

asendamisel, päikesepatareide efektiivsuse tõstmisel ja vähiravis (Kahru, Lippmaa 2010).

Taolised ootused on suurendanud sünteetiliste nanoosakeste tootmist – üheks

enimtoodetavaks nanoosakeseks on kujunenud titaandioksiid, mida toodetakse maailmas juba

550 - 5500 tonni aastas (Piccino et al. 2012).

1.1.2. TiO2 nanoosakesed

Titaandioksiidi nanoosakesi kasutatakse enim päikesekreemides ja kattevahendites, kus nende

ülesandeks on pakkuda kaitset UV-kiirguse eest. Veel on nanosuuruses TiO2 osakesed

kasutusel valge pigmendina mitmesugustes värvides, mille hulka kuuluvad ka toiduvärvid,

8

ning lisandina plastikutes ja tsemendis. Lisaks eelnevatele püütakse TiO2 nanoosakesi

kasutada päikesepatareides ja isepuhastuvates pindades, ent need valdkonnad on alles

arenemisjärgus. (Gupta, Tripathi 2011; Piccino et al. 2012; Weir et al. 2012; The

Nanodatabase)

Joonis 1. Titaandioksiidi osakeste fotokatalüütilise aktiveerimise skeem.

Allikas: Macwan et al. 2011

TiO2 kasutamine mitmetes eeltoodud rakendustes põhineb selle materjali omadusel neelata

lühilainelist valgust. Neeldumise käigus ergastatakse elektron (e-) valentstsoonist

juhtivustsooni ning tekib elektron-auk paar (joonis 1). Tekkinud auk (h+) on võimeline

oksüdeerima pinnal olevat vett hüdroksüülradikaalideks (•OH). Need on omakorda võimelised

oksüdeerima enamikke orgaanilisi molekule. Seetõttu omab TiO2 tugevat fotokatalüütilist

toimet, mille käigus orgaanilised molekulid oksüdeeritakse peamiselt süsihappegaasiks ja

veeks. (Macwan et al. 2011)

1.1.2.1. TiO2 kristallstruktuurid

Titaandioksiidil on kolm põhilist kristallstruktuuri – anataas, rutiil ja brukiit. Need kristall-

struktuurid erinevad omavahel elementide ruumilise paigutuse poolest, mis toob endaga kaasa

selle, et sama keemilise koostisega aine omadused sõltuvad selle struktuurist. Nimetatud

kristallstruktuuridest on kõige stabiilsem rutiil, mis jääb stabiilseks enamikel temperatuuridel

ja rõhkudel kuni 60 kbar. Rutiili faasis olevate TiO2 osakeste fotokatalüütilised omadused on

9

üsna kehvad, mistõttu kasutatakse neid enamjaolt valge pigmendina. Kõige reaktiivsemad on

anataasi kristallstruktuuriga TiO2 osakesed, sest sellises kristallstruktuuris on elektronide

liikuvus parem, madal dielektriline konstant ja kristallid on hõredamad, lisaks on anataasi

faasis kõrgem Fermi nivoo. Eeltoodud omadused võimaldavadki anataasi faasis olevaid TiO2

nanoosakesi kasutada fotokatalüütilistel eesmärkidel. Brukiidi faasis olevad TiO2 osakesed on

küll reaktiivsemad kui rutiili struktuuriga, ent nende reaktiivsus pole nii kõrge kui anataasi

faasis olevatel TiO2 osakestel, mistõttu neid on vähem uuritud. Kõrgematel temperatuuridel

muutub anataasi ning brukiidi faasis olevate TiO2 kristallstruktuur stabiilsemaks rutiiliks.

(Gupta, Tripathi 2011; Macwan et al. 2011)

TiO2 kui pooljuhil on üsna lai keelutsoon – anataasil, rutiilil ja brukiidil on see vastavalt 3,2;

3,02 ja 2,96 eV (Gupta, Tripathi 2011). Elektroni viimiseks valentstsoonist juhtivustsooni

tuleb TiO2 osakest seega ergastada vastavalt lainepikkusega alla 388; 411 ja 419 nm, mis kõik

jäävad UV-kiirguse ja nähtava valguse piirialasse. Seega ilmnevad TiO2 fotokatalüütilised

omadused eriti hästi, kui seda ergastada UV-kiirgusega, ent fotokatalüüsiks sobib

suurepäraselt Päikese valgus, mille spekter sisaldab samuti UV-piirkonda (Moan 2004).

1.1.2.2. TiO2 nanokiled

Antimikroobsete pindade väljatöötamine on muutunud meditsiinis äärmiselt oluliseks, sest

need aitavad steriliseerida töövahendeid ning hoiavad seeläbi ära infektsioone. Taoliste

pindade valmistamiseks püütakse kasutada erinevaid põhimõtteid, näiteks töötatakse välja

selliseid pindasid, mille külge bakterid ei saa kinnituda, mis sisaldavad oma olemuselt

antibakteriaalsed ühendeid, mille antibakteriaalsed omadused saadakse pinda modifitseerides

või mõne füüsikalise teguriga mõjutades. Kõigi eelnimetatud lähenemiste korral on püütud

kasutada ka erinevaid nanoosakesi, näiteks TiO2 nanoosakestega kaetud pindasid saab

lühilainelise kiirgusega aktiivseks muuta. (Campoccia et al. 2013)

TiO2 nanoosakestega saab pindu katta erinevatel meetoditel. Käesolevas uurimistöös

kasutatud nanokiled valmistati vurrkatmise [ing. spin-coating] meetodil. Vurrkatmist

kasutatakse erineva kujuga objektide õhukese kilega katmiseks. Meetod põhineb lahuse

kandmisel pöörlevale alusele, kus vedelik kandub tsentrifugaaljõu mõjul üle aluse.

Keerlemise käigus saavutab kile ühtlase paksuse, mis kile kiire moodustumise tõttu on hästi

reprodutseeritav. (Saarva 2013)

10

Sõltuvalt nanoosakeste sünteesiskeemist võivad neist valmistatud nanokiled sisaldada

orgaanilisi ühendeid, mis on nanoosakeste pinnale füüsikaliselt ja/või keemiliselt

adsorbeerunud. Taolised ühendid võivad osutuda katses kasutatavatele bakteritele

kahjulikuks, mistõttu tuleb need pesemise või kuumutamise teel eemaldada. Kuumutamine

aitab ka nanoosakesi pinnale kinnitada ning muudab kiled erinevatele keskkonnatingimustele

vastupidavamaks. (Saarva 2013)

1.2. Bakterid

1.2.1. Ülevaade bakterirakust

Erinevalt päristuumsetest rakkudest puudub bakteritel membraanidega piiritletud rakutuum

ning nad kuuluvad prokarüootide rühma. Bakterid on üherakulised organismid, nende

mõõtmed jäävad enamasti vahemikku 0,1 kuni 25 µm. Nad saavad elada üksikult, kuid sageli

jäävad pärast pooldumist omavahel seotuks ning moodustavad ahelaid või rakukogumikke.

Väliskuju järgi saab baktereid jaotada kuude rühma: kera-, pulk-, keeritsbakterid, spiraalsed

bakterid ning punguvad ja jätketega bakterid. (Sarapuu 2002: 72)

Kõik bakterirakud on ümbritsetud rakumembraaniga, mis koosneb valkudest ning lipiididest

ja on ehituselt sarnane päristuumsete organismide rakumembraanidega. Membraani katab

rakukest, mis koosneb valdavalt polüsahhariididest, kuid selle ehituses on ka liitlipiide ja

valke. Rakukesta peamine ülesanne on bakterit kaitsta väliskeskkonna mõjude eest. Mõnedel

bakteritel on kest kaetud karvakestega, mille abil bakterid seostuvad üksteisega ning

kinnituvad pindadele. (Sarapuu 2002: 73)

Vastavalt testile, mille esimest korda sooritas Christian Gram 1884. aastal, liigitatakse

bakterid grampositiivseteks ja -negatiivseteks. Testis värvitakse baktereid kristallvioletiga

ning pestakse seejärel 95% etanooliga. Grampositiivsetelt bakteritelt värvi maha pesta ei

õnnestu ning need jäävad mikroskoobis vaadelduna tumedateks, samas gramnegatiivsed

bakterid on peale pesu värvunud heledalt violetseteks. Selline erinevus on tingitud bakterite

ehituslikest iseärasustest – grampositiivsetel bakteritel on ainult üks membraan, mida katab

paks peptidoglükaanikiht, mis aitabki kristallvioleti värvust säilitada. Gramnegatiivsetel

bakteritel on kaks membraani: sise- ja välismembraan, mille vahel on periplasmaatiline ruum,

kus asuvad mitmed ensüümid ja valgud. Peptidoglükaanikiht on gramnegatiivsetel bakteritel

õhuke ja asub kahe membraani vahel. (Kivisaar 2000)

11

Bakterite rakutuuma asendab tuumapiirkond, kus paikneb ühest DNA molekulist koosnev

rõngjas kromosoom, milles geenide arv ulatub kuni kuue tuhandeni. Lisaks rõngas-

kromosoomile on bakteri tsütoplasmas tihti väiksemad DNA rõngad ehk plasmiidid, milles

sisalduvatelt geenidelt sünteesitakse bakteri kasvukeskkonnale eripäraseid ensüüme. Need

aitavad lagundada ümbritsevas keskkonnas olevaid orgaanilisi aineid, mis on vajalik bakteri

toitumiseks, aga ka kahjulike ainete lagundamiseks. Geenid võivad liikuda rõngas-

kromosoomidest plasmiididesse ja vastupidi. (Sarapuu 2002:74)

Bakteritel puuduvad membraanidest koosnevad rakustruktuurid ja nendega ümbritsetud

organellid, tsentrosoom ja tsütoskelett (ibid.). Kõikides bakterirakkudes on ribosoomid, mis

asuvad tsütoplasmas vabalt (Hain et al. 2012: 103).

Bakterid paljunevad pooldumise teel, sellele eelneb raku kasvamine, varuainete süntees ja

rõngaskromosoomi kahekordistumine. Pooldumisel nöördub rakumembraan koos kestaga

sisse ning moodustub kaks umbes samasuurt tütarrakku. Bakterid paljunevad suhteliselt

kiiresti – soodsates kasvutingimustes pooldub enamus baktereid 1 kuni 2 tunniga. Eriti kiiresti

kasvavad bakterid poolduvad iga 20 minuti järel. (Sarapuu 2002:75)

1.2.2. Bakterite roll loodus- ja inimkeskkonnas

Bakterid on kohastunud eluks peaaegu kõikides Maal leiduvates tingimustes ning neil on

ökosüsteemides väga tähtis roll. Ehkki bakterid suudavad lagundada ka elusorganisme, on nad

eelkõige tähtsad just jääkainete ja surnud organismide lagundamisel. Bakterid moodustavad

koos teiste heterotroofsete organismidega laguahelaid, kus oksüdeeritakse orgaanilised ained

anorgaanilisteks aineteks. Neil on oluline osa näiteks mulla tekkel – bakterid lagundavad

pinnasesse sattunud organismide elutegevuse jääkproduktid lihtsamateks ühenditeks, mille

tulemusena tekib huumus. (Sarapuu 2002: 77)

Mõned mullas elavad bakterid osalevad lämmastiku aineringes. Õhulämmastikku (N2) enamik

organisme siduda ei suuda, kuid liblikõieliste juuremügarates olevad lämmastikku siduvad

bakterid suudavad lämmastikule liita vesinikku, moodustades taimedele omastatavat

ammoniaaki. (Hain et al. 2012: 111)

Bakteritel on tähtis roll ka seedimisel: inimesel aitavad jämesooles elavad bakterid lõhustada

mitmeid orgaanilisi aineid, mida inimese seedeensüümid lagundada ei suuda. Sõraliste

12

põhitoiduks on taimed, mistõttu nende seedekulglas olevad bakterid aitavad taimerakkude

kestades olevat tselluloosi lagundada. (Sarapuu 2002: 78)

Baktereid püütakse kasutada ka otseselt inimeste hüvanguks. Neid on aastasadu rakendatud

toiduainetööstuses käärimisprotsessis, et valmistada juustu, hapukurke, veini, äädikat jne.

Geenitehnoloogia areng on viinud selleni, et bakteritel lastakse toota mitmesuguseid ravimeid,

näiteks antibiootikume või valke nagu insuliin või antikehad. Lisaks on bakterid leidnud palju

kasutust keskkonnakaitses, kuna nad suudavad lagundada reovees olevaid jääkaineid või

likvideerida naftareostust. (Hain et al. 2012: 112-113)

1.2.3. Bakteritest tingitud ohud tervisele

Maailmas sureb ligi kolmandik inimestest nakkushaigustesse, millest suurem osa on

põhjustatud viiruste või bakterite poolt. Samas on ainult väike osa bakteritest võimelised

haigusi esile kutsuma, neid nimetatakse patogeenseteks. Patogeenseid baktereid saab jagada

peamiselt kolme gruppi: obligatoorsed patogeenid, mis paljunevad ainult

peremeesorganismis; fakultatiivsed patogeenid, mis paljunevad keskkonnas ja põhjustavad

haigusi kokkupuutel nõrgestatud organismiga; ning oportunistlikud patogeenid, mis on

üldjuhul peremeesorganismile ohutud, kuid võivad haigusi põhjustada vigastatud või nõrga

immuunsüsteemiga organismides. Mõned patogeensed bakterid on spetsialiseerunud kindlale

liigile või perekonnale, teised võivad haigusi põhjustada üsna erinevates organismides.

(Alberts et al. 2002: 1423-1427)

Patogeenne bakter võib temale lähimast mittepatogeensest bakterist erineda vaid mõne geeni

poolest, mida kutsutakse virulentseteks geenideks. Sellised geenid kodeerivad kaht tüüpi

valke – toksiine, mis interakteeruvad otse peremeesraku struktuursete või signaalvalkudega ja

kutsuvad esile patogeeni paljunemiseks soodsa rakulise vastuse; ning valke, mis aitavad

toksiine märklaudrakuni transportida. (Alberts et al. 2002: 1427-1428)

Ehkki bakteritel on eukarüootidega palju sarnasusi, leidub nende DNA replikatsioonis,

transkriptsioonis, translatsioonis ja metabolismis piisavalt erinevusi. Selleks, et patogeenseid

baktereid hävitada, kasutatakse antibiootikume, mille molekulid seonduvad kindlate

bakteriaalsete ensüümidega ja inhibeerivad seeläbi eelnimetatud protsesse. Samas on kiirelt

paljunevad bakterid võimelised ka kiirelt evolutsioneeruma ja selle käigus antibiootikumide

vastu resistentseteks muutuma. Bakterid kasutavad ravimite vastu resistentsuse saavutamiseks

13

kolme peamist strateegiat: nad toodavad ensüüme, mis lagundavad ravimi; nad muudavad

ravimi molekulaarset märklauda nii, et ravimimolekul ei saa sinna enam seonduda; või nad

takistavad ravimi jõudmist märklauani näiteks ravimit endast välja pumbates. Kui patogeenne

bakter on leidnud efektiivse mooduse resistentsuse saavutamiseks, siis levib selleks vajalik

geen üsna kiiresti kogu populatsioonis ning võib edasi kanduda ka teist liiki bakteritele.

Taoline resistentsust tagav strateegia võib antibiootikumide vale kasutamise korral välja

kujuneda ka normaalsesse mikrofloorasse kuuluvates bakterites ning levida neilt edasi

patogeensetele bakteritele. Seega on vaja pidevalt välja töötada uusi ravimeid või võtta

kasutusele teistsuguseid strateegiaid, et patogeensete bakterite vastu võidelda. (Alberts et al.

2002: 1429, 1452-1453)

1.2.4. Mudelorganism Escherichia coli

Elusorganismid on oma ehituselt äärmiselt keerukad, mistõttu on nende uurimisel levinud

mudelorganismide kasutamine. Molekulaarbioloogias on keskseks mudelorganismiks

kujunenud pulgakujuline gramnegatiivne bakter Escherichia coli, mis looduslikult elab

inimese ja teiste selgroogsete soolestikus, ent teda on üsna lihtne ka laboritingimustes

kasvatada. Evolutsiooniliselt on E. coli kohandunud eluks erinevates keemilistes tingimustes

ja ta paljuneb soodsates keskkonnatingimustes väga kiiresti. Molekulaarses mõttes on

E. coli’s toimuvad protsessid enim uuritud ning suurem osa meie teadmistest eluks vajalike

põhimehhanismide kohta (DNA replikatsioon, transkriptsioon, translatsioon) pärinevad

E. coli’ga läbiviidud uuringutest. (Alberts et al. 2002: 27-28)

1.2.5. Luminestseeruvad bakterid

Evolutsiooni käigus on mõned Vibrio ja Photobacterium’i perekonda kuuluvad bakteriliigid

omandanud võime eritada sinakasrohelist valgust ehk bioluminestseeruda. Sellist nähtust

võimaldab lutsiferaasi poolt katalüüsitav ensüümreaktsioon, kus substraadina kasutatakse

taandatud flaviinmononukleotiidi, hapnikku ja pikaahelalisi aldehüüde ning tekivad

flaviinmononukleotiid, pikaahelaline karboksüülhape, vesi ja eraldub valguskvant.

Luminestseerumine on bakteritele küllaltki energiakulukas, sest vajaminevad elektronid

saadakse elektrontransportahelast ja ATP sünteesist. Tõenäoliselt on bakterite võime

bioluminestseeruda arenenud välja sümbioosi eesmärgil – taolised bakterid helendavad ainult

kalade valgusorganites või mõnel potentsiaalsel toiduallikal. (Prescott et al. 1999: 477)

14

Lisaks looduslikult bioluminestseeruvatele bakteritele on konstrueeritud ka baktereid, millesse

on sisse viidud geenid, mis neid luminestseeruvateks muudavad. Sellistes bakterites asetseb

lutsiferaasi kodeeriva geeni järjestus tavaliselt mõne regulatoorse valgu promootori järel,

millest tingituna korreleerub bakterite arvukus otseselt nende poolt emiteeritava valgusega.

Seega on võimalik selliseid luminestseeruvaid baktereid kasutada näiteks mõne aine

toksilisuse hindamiseks – mida vähem bakterikultuur valgust hiilgab, seda vähem sisaldab see

elujõulisi baktereid. Lutsiferaasi kodeeriva geeni järjestust on võimalik asetada ka mõne

kindla molekuli äratundmisega seotud valgu promootori järele. Viimasel juhul saadakse

biosensor, mille poolt emiteeritava valguse hulk sõltub vastava molekuli kontsentratsioonist

keskkonnas. (Ivask et al. 2007)

15

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Uurimistöös kasutatud vahendid

2.1.1. TiO2 nanokiled

Uurimistöös kasutati Urmas Joost’i poolt Tartu Ülikooli Füüsika Instituudis sünteesitud TiO2

nanoosakestest valmistatud õhukesi kilesid, mida vaadeldi eelnevalt skaneeriva

elektronmikroskoopiaga (SEM; FEI Helios 600, EDX detektoriga, Oxford Instruments;

Lisa 1). Kontrollina kasutati räni monokristallist (1 0 0) (Sigma-Aldrich) aluseid, mis on

keemiliselt inertsed ning ei avalda bakteritele mõju (joonis 2).

Joonis 2. Uurimistöös kasutatud räni monokristallist alused (vasakul, hallikad) ja TiO2

nanokiledega kaetud alused (paremal, sinakad).

Allikas: Autori foto

TiO2 nanokilede valmistamiseks sünteesiti esmalt Urmas Joost’i poolt Tartu Ülikooli Füüsika

Instituudis sool-geel meetodil TiO2 nanoosakesed. Lähteaineteks olid kommertsiaalselt

saadaval olevad reagendid titaan(IV)butoksiid, para-tolueensulfoonhape, atsetüülatsetoon ja

n-butanool. Dünaamilise valguse hajutamise meetodil mõõdeti sünteesitud osakeste

diameetriks alla 10 nm ning osakeste suurusjaotus oli küllaltki ühtlane. Ramani spektritest

nähtus, et sünteesitud TiO2 osakesed on anataasi kristallstruktuuriga. (Joost et al. 2014)

TiO2 õhukesed kiled valmistati räni monokristallist alustele. Selleks lõigati esmalt räni

monokristallist alused mõõtmetega umbes 1x1 cm. TiO2 nanoosakeste suspensioon kanti

16

süstla abil alustele 0,5 minuti jooksul vurrkatmise meetodil, aluse pöörlemissagedus 3000

pööret minutis. Moodustunud õhukesi kilesid kuumutati muhvelahjus (Nabertherm

L5/11/S27), tõstes temperatuuri kiirusega 100 °C/h ning lastes iga tunni möödudes

temperatuuril ühtlustuda 1 h, kilesid kuumutati kuni 400 °C. Seejärel pesti kilesid

ultrahelivannis (80 kHz, 30%, 30 °C) deioniseeritud veega 10 minutit, et eemaldada osakeste

pinnalt peale kuumutamist allesjäänud adsorbeerunud orgaanilised molekulid.

2.1.2. Escherichia coli pSLlux

Uurimistöös valiti mudelorganismiks Escherichia coli MC1061 (pSLlux; Ivask et al. 2009),

millesse on sisse viidud geneetiline info luminestsentsvalguse tootmiseks (lutsiferiin-

lutsiferaas süsteem) ning antibiootikumi ampitsilliini vastu resistentsuse saamiseks. Taoliselt

modifitseeritud bakteri eeliseks on võimalus viia katseid läbi mittesteriilsetes tingimustes, sest

hiljem on teda võimalik välja selekteerida ampitsilliini sisaldavas söötmes ning hinnata

arvukust lähtuvalt kultuuri luminestseerumisest.

2.1.2.1. Escherichia coli pSLlux kultuuri kasvatamine

E. coli pSLlux kultuuri kasvatamiseks kanti pisut säilituskultuuri Luria-Bertani (LB)

tardsöötmega Petri tassidele ning kasvatati üleöö 30 °C juures. Steriilse keskkonna tagamiseks

lisati söötmele 100 µg/ml ampitsilliini. TiO2 nanokilede mõju uurimiseks külvati mõned Petri

tassile kasvanud kolooniad ümber 100 µg/ml ampitsilliini sisaldavasse LB vedelsöötmesse,

kasvutingimusi (temperatuur, loksutamine, aeg) optimeeriti ning kultuuri juurdekasvu

hindamiseks mõõdeti optilist tihedust spektrofotomeetriga 600 nm juures ning

luminomeetriga emiteeritud valguse hulka.

2.1.2.1.1. Luria-Bertani sööde

LB sööde sisaldab vähe suhkruid ja palju anorgaanilisi aineid ning seda kasutatakse laialdaselt

E. coli kasvatamisel. Selle koostis võimaldab bakteritel kasvada kindla tiheduseni, seejärel

saab kasvu limiteerivaks faktoriks see, et suhkrud saavad otsa ning bakterid peavad hakkama

toituma aminohapetest. Kui kõik orgaanilised toitained saavad otsa, jääb alles ohtralt

anorgaanilisi toitaineid. (Sezonov et al. 2007)

LB vedelsöötme valmistamiseks lahustatakse 1 liitris destilleeritud vees 10 g trüptooni, 5 g

pärmiekstrakti, 10 g NaCl. Lahuse neutraliseerimiseks lisatakse 1 M NaOH lahust. Seejärel

17

sööde steriliseeritakse autoklaavides seda 25 minutit temperatuuril 120 °C. (Sezonov et al.

2007)

2.1.2.1.2. Luria-Bertani tardsöötmega Petri tasside ettevalmistamine

LB tardsöötme valmistamiseks lisati eelmises alapunktis toodud retsepti alusel valmistatud

LB vedelsöötmesse enne autoklaavimist 1,5 % agarit. Steriliseeritud sööde tardub

toatemperatuuril, mistõttu tuleb see enne Petri tassidele valamist vesivannil üles sulatada.

E. coli pSLlux’i selekteerimiseks lasti söötmel jahtuda umbes 40 °C-ni ning lisati sellesse

100 µg/ml ampitsilliini. Seejärel valati igale Petri tassile 20 ml söödet ning lasti

toatemperatuuril tarduda. Ampitsilliini sisaldavaid LB tardsöötmega Petri tasse hoiti 4 °C

juures ning kasutati bakterite külvamiseks kuni nädala jooksul peale valmistamist.

2.1.2.2. Escherichia coli pSLlux kultuuri ettevalmistamine TiO2 nanokilede mõju uurimiseks

TiO2 nanokilede mõju uurimiseks tsentrifuugiti 10 ml punktis 2.1.2.1 kirjeldatud viisil

tihedaks kasvatatud kultuuri kiirusega 3500xg 22 °C juures 10 minutit, et koguda kokku

bakterirakud. Supernatant eemaldati ning bakteritelt LB söötme pesemiseks suspendeeriti

sadet 10 ml 0,9% NaCl lahuses. Tsentrifuugimist ning pesu korrati samade parameetrite

juures ning bakterikultuur viidi 0,9% NaCl-ga tiheduseni 107-10

8 rakku/ml.

2.2. TiO2 nanokilede mõju uurimine

2.2.1. Katse parameetrid

Katse viidi läbi kliimakambris kahel erineval päeval. Kliimakambri temperatuur oli katse

vältel 25 °C ning suhteline õhuniiskus 90%, et minimeerida bakterisuspensiooni aluselt

aurustumist. Kliimakambrisse oli paigaldatud UV lamp spektrivahemikuga 300-400 nm,

spektri maksimumiga 355 nm juures.

2.2.2. Escherichia coli pSLlux’i eksponeerimine TiO2 nanokiledel ja kontrollalustel

TiO2 nanokilede mõju uurimiseks kanti 10 µl punktis 2.1.2.2. kirjeldatud meetodil

valmistatud E. coli pSLlux’i bakterisuspensiooni vastavalt TiO2 õhukese kilega kaetud

alustele ja räni monokristallist kontrollalustele. Alustel olevat bakterisuspensiooni

eksponeeriti UV-kiirgusele esimesel korral 0, 5, 10 ja 15 minutit kahes paralleelis ning teisel

korral 0, 5, 10, 15 ja 20 minutit kolmes paralleelis. Võrdluseks hoiti samas mahus

18

bakterisuspensiooni TiO2 õhukese kilega kaetud alustel ja räni monokristallist kontrollalustel

kliimakambris sama temperatuuri ja õhuniiskuse juures pimedas esimesel korral kahes

paralleelis 15 minutit ja teisel korral kolmes paralleelis 20 minutit.

2.2.3. Antibakteriaalse mõju hindamine

2.2.3.1. Bakterisuspensiooni alustelt pesemine ja tardsöötmele külvamine

Pärast bakterite eksponeerimist erinevatele punktis 2.2.2. toodud tingimustele asetati alused

ümarapõhjalisse polüpropüleenist tuubi, mis sisaldas 1 ml 0,9% NaCl lahust. Bakterite alustelt

pesemiseks tuube loksutati Vortex’il 5 minutit võimsuse 5 juures. Pesemise efektiivsust

kontrolliti, lisades 1 mL 0,9% NaCl lahusesse 10 µL sama bakterisuspensiooni, mida kanti

alustele. Peale loksutamist valmistati saadud suspensioonidest 10-, 100- ja 1000-kordsed

lahjendused, mis külvati punktis 2.1.2.1.2. ettevalmistatud LB tardsöötmega Petri tassidele.

Petri tass jagati neljaks sektoriks, igasse sektorisse pipeteeriti 15 µl vastavat lahjendust

(joonis 3), mis hõõruti steriilse spaatliga sektori piires ringjate liigutustega laiali, alustades

kõige lahjemast lahjendusest (1000x) ning liikudes järjest kontsentreerituma suspensiooni

poole (1x).

Joonis 3. Bakterisuspensiooni lahjenduste tardsöötmele külvamise skeem.

Allikas: Autori andmed.

2.2.3.2. Bakterite arvukuse määramine

Bakterite arvukuse määramiseks inkubeeriti eelmises punktis LB tardsöötmega Petri tassidele

külvatud baktereid üleöö 37 °C juures pimedas. Väljakasvanud bakterikolooniaid loeti kahest

järjestikkusest sektorist, millel kolooniate arv jäi võimalusel vahemikku 10-300. Kolooniate

lugemisel võeti arvesse ainult need, mis pimedas helendasid, et vältida võimalike keskkonnast

söötmele sattunud ampitsilliinile resistentsete bakterite lugemist. Bakterite arvukuse

hindamiseks arvutati kolooniat moodustavate ühikute (CFU) arv ühes milliliitris, nagu on

10x 100x

1x 1000x

19

kirjeldatud standardis ISO 7218:2008 (Microbiology, 2008). Selleks sisestati loetud

kolooniate arv järgnevasse valemisse:

dV

CN

*1,1*

, kus

C on kahe loetud sektori kolooniate summa,

V on sektorile külvatud lahjenduse ruumala (antud katses 0,015 ml) ja

d on lahjenduskordaja. Antud katses lisati väikseima lahjenduse korral 10 µl alusel olnud

bakterisuspensiooni 1 ml 0,9% NaCl, sel juhul lahjenduskordaja 10010

1000

l

ld

.

20

3. Tulemused ja arutelu

3.1. Katsetingimuste optimeerimine TiO2 nanokilede mõju uurimiseks

3.1.1. TiO2 nanokilede valik

Käesolevas uurimistöös valiti potentsiaalselt antibakteriaalseteks pindadeks TiO2

nanoosakestest valmistatud õhukesed kiled, sest senised tööd TiO2 nanoosakeste vallas on

näidanud, et tegemist on stabiilse, odava, tõhusa ning keskkonnale küllaltki ohutu materjaliga

(Gupta, Tripathi 2011). Samas on TiO2 nanoosakesi võimalik lühilainelise kiirgusega

aktiveerida (Macwan et al. 2011) ja leidub mõningaid töid, kus on uuritud nendest valmistatud

õhukeste kilede antibakteriaalset toimet. Taolistes uurimustes on küll näidatud, et TiO2

nanokiled omavad UVA kiirgusega aktiveerides antibakteriaalset efekti, ent üldjuhul pole

suudetud hävitada kõiki baktereid (Kühn et al. 2003; Armelao et al. 2007; Wang et al. 2009;

Aminedi et al. 2013) või on bakterite hävitamiseks kulunud aeg üsna pikk (Sunada et al. 2003;

Yeung et al. 2009; Cushnie et al. 2010). Seega on endiselt vaja leida sellise koostisega TiO2

nanokile, mille antibakteriaalne mõju avalduks lühikese aja jooksul.

Antud uurimistöös valiti TiO2 nanokiled U. Joosti ja kolleegide (Joost et al. 2014) poolt

sünteesitud õhukeste kilede hulgast. Eelkatsed sooritati 400 °C-ni ja 500 °C-ni kuumutatud

õhukeste kiledega ning selgus, et 400 °C-ni kuumutatud pesemata õhuke kile sisaldab veel

bakteritele toksilisi orgaanilisi ühendeid ning on bakteritele surmav ka pimedas teostatud

ekspositsiooni korral. 400 °C-ni kuumutatud ja ultrahelivannis deioniseeritud veega pestud

kilede efektiivsus ei erinenud olulisel määral 500 °C-ni kuumutatud pesemata kilede

efektiivsusest (K. Jugansoni avaldamata andmed), mistõttu antud uurimistöös võeti kasutusele

400 °C-ni kuumutatud ja ultrahelivannis deioniseeritud veega pestud TiO2 nanokiled.

3.1.2. Optimaalsete tingimuste leidmine E. coli pSLlux kultuuri ettevalmistamiseks

TiO2 nanokilede antibakteriaalse toime määramise katse läbiviimiseks vajalikud seadmed

asusid Tartu Ülikooli Füüsika Instituudi laboratooriumis, ent bakterikultuuri ettevalmistamine

viidi läbi steriilsetes tingimustes Tallinnas Keemilise ja Bioloogilise Füüsika Instituudi

21

Keskkonnatoksikoloogia laboratooriumis. Selleks, et leida tingimused, mille juures E. coli

pSLlux kultuur on TiO2 nanokiledele eksponeerimise alguseks kasvufaasis, viidi läbi eelkatse,

kus värskesse LB vedelsöötmesse lisati erinevates kogustes tihedaks kasvatatud

bakterikultuuri. Baktereid kasvatati paralleelselt 30 °C juures loksutil ning toatemperatuuril

seisvas tuubis ja nende kasvukõverad leiti kultuuri optilise tiheduse (joonis 4A) ja

luminestsentsi (joonis 4B) mõõtmiste alusel.

Joonis 4. LB vedelsöötmesse erinevas koguses külvatud bakterikultuuri kasvamine ajas

(A) optilise tiheduse järgi (mõõdetud 600 nm juures); (B) emiteeritud valgushulga järgi.

Punktid tähistavad kolme mõõtmise keskmist tulemust, veapiirid standardhälvet. Sinisega on

tähistatud 10 ml LB söötmesse külvatud kultuurid, mis kasvasid toatemperatuuril seisvas

tuubis. Rohelisega on tähistatud 5 ml LB söötmesse külvatud kultuurid, mis kasvasid 30 °C

juures loksutil.


Jooniselt 4 on näha, et kasvufaasis oleva E. coli pSLlux kultuuri kasvu hindamiseks sobivad

optilise tiheduse ja luminestsentsi mõõtmine võrdselt hästi. Teisalt kui bakterid on saavutanud

oma maksimaalse tiheduse ehk jõudnud statsionaarsesse faasi, siis optiline tihedus jääb

22

esialgu püsima (joonis 4A), aga emiteeritava valguse hulk hakkab ajas langema (joonis 4B).

Järelikult on antud uurimistöö seisukohast kasulikum enne E. coli TiO2 nanokiledele

eksponeerimist mõõta kultuuri poolt emiteeritava valguse hulka kahes ajapunktis – kui

hilisemal ajahetkel luminestseerub kultuur varasemast rohkem, siis on kultuur endiselt

kasvufaasis ja sobib katse läbiviimiseks.

Erinevate kasvutingimuste võrdlemisel nähtub, et loksutil 30 °C juures kasvanud bakterid

tarbivad söötmes olevad toitained ära ja jõuavad statsionaarsesse faasi umbes 10 tunniga, ent

toatemperatuuril kasvav kultuur ei saavuta samasugust tihedust ka 22 tunni möödudes.

Eelkatses söötmesse lisatud erinevad bakterikogused maksimaalse tiheduse saavutamise

kiirust oluliselt ei muutnud. Tulenevalt sellest, et katseid TiO2 nanokilede mõju uurimiseks

sooviti alustada päevasel ajal, otsustati E. coli pSLlux kultuuri ette kasvatada toatemperatuuril

seisvas tuubis.

3.1.3. Sobivate lahjenduste valimine E. coli pSLlux’i arvukuse määramiseks

Bakterite arvukuse hindamisel on oluline, et neid tardsöötmele külvates kasvaksid välja

eraldiseisvad kolooniad, mida on võimalik kokku lugeda. Eelkatsete tulemusena leiti, et

sobivaim on jagada LB tardsöötmega Petri tass 4 sektoriks, millelest igale saab külvata 15 µl

vastava bakterisuspensiooni 102-, 10

3-, 10

4- või 10

5-kordset lahjendust (joonis 5). Bakterite

ühtlase kasvu tagamiseks sektori piires hõõruti bakterisuspensioon steriilse spaatliga

söötmesse ning kasvatati üleöö 30 °C juures.

Joonis 5. LB tardsöötmele külvatud Escherichia coli pSLlux suspensiooni lahjendustest

väljakasvanud kultuurid (A) pildistatuna päevavalguses, (B) pildistatuna pimedas ruumis.

Allikas: Autori fotod.

23

3.1.4. Bakteritilga räni monokristallist alustelt ja TiO2 nanokiledelt mahapesemise

efektiivsuse kontrollimine

Bakterid kinnituvad erinevate pindadega kokkupuutel sageli nende külge ja moodustavad

biofilmi (Sarapuu 2002: 73). Samas võivad nad erinevast materjalist pindade külge kinnituda

erineva tugevusega, mis võib esile kutsuda vigu katsetulemuste tõlgendamisel. Sellest

tulenevalt otsustati uurida, kui efektiivselt õnnestub E. coli pSLlux bakteritilka katses

kasutatavatelt TiO2 nanokiledelt ja räni monokristallist alustelt maha pesta. Pesemisel

tekkivate kadude määramiseks lisati 10 µl bakterisuspensiooni vastavalt räni monokristallist

alustele ja TiO2 nanokiledele, mida seejärel pesti 0,9% NaCl lahusega. Paralleelselt lisati

sama kogus bakterisuspensiooni otse 0,9% NaCl lahusesse. Alustelt pestud ja otse NaCl

lahusesse lisatud bakterite arvukuse määramise tulemused on toodud joonisel 6.

Joonis 6. Bakterite arvukus (CFU/ml) esialgses bakterisuspensioonis (roheline), räni

monokristallilt mahapestud tilgas (tumesinine) ja TiO2 nanokilelt mahapestud tilgas (hall).

Tulbad tähistavad kolme lugemise keskmist tulemust, veapiirid standardhälvet.


Joonisel 6 on näha, et bakterite arvukus esialgses suspensioonis ja katsetes kasutatavatelt

alustelt mahapestud bakteritilgas erineb vea piires. Seega võib järeldada, et uurimistöösse

valitud pesemise protseduur on edukas ning räni monokristallist aluste ega TiO2 nanokilede

külge jäävate bakterite hulk katsetulemusi märkimisväärselt ei mõjuta.

24

3.2. TiO2 nanokilede mõju uurimine Escherichia coli pSLlux’iga

3.2.1. TiO2 nanokilede ja kontrollaluste mõju E. coli pSLlux’ile pimedas

Antud uurimistöös püstitatud hüpoteesi üheks osaks oli, et TiO2 nanoosakestest valmistatud

kiled ei avalda bakteritele lühikese aja jooksul märgatavat mõju, kui neid ei eksponeerita UV

kiirgusele. Hüpoteesi kontrollimiseks eksponeeriti E. coli pSLlux’i TiO2 nanokiledele ja räni

monokristallist alustele pimedas 20 minuti jooksul.

20-minutilise ekspositsiooni lõppedes oli tardsöötmetele külvatud bakterisuspensiooni-

tilkades bakterite arvukus visuaalsel hinnangul pisut väiksem kui 0 minutit eksponeeritud

alustel (lisa 2.1.). Samas oli bakterite arvukus kõikide töötluste korral endiselt üsna kõrge

ning ei sõltunud märkimisväärselt kasutatud aluse materjalist.

Joonis 7. 20 min pimedas räni monokristallist alustel (tumesinine) ja TiO2 nanokiledel (hall)

eksponeeritud E. coli pSLlux bakterisuspensiooni kolooniat moodustavate ühikute arv

võrreldes 0 min alustel eksponeeritud bakterisuspensiooni kolooniat moodustavate ühikute

arvuga. Tulbad tähistavad vähemalt kolme lugemise keskmist tulemust, veapiirid

standardhälvet.


Joonisel 7 on toodud bakterite arvukuse määramisel saadud tulemused (lugemise andmed on

lisas 2.2.). Bakterite arvukuse võrdlemisel võeti aluseks (100%) 0 min alustel eksponeeritud

25

bakterisuspensiooni CFU, millest lähtuvalt arvutati teistel alustel ellu jäänud bakterite arvukus

protsendina esialgsest CFU-st. Kontrolliga võrreldes vähenes bakterite arvukus 20 minuti järel

nii TiO2 nanokiledel (alles 39,7% CFU/ml) kui räni monokristallist alustel (alles 38,5%

CFU/ml). Samas jäi 20-minutilise pimedas läbiviidud ekspositsiooni järel TiO2 nanokiledelt

ja räni monokristallist alustelt pestud bakterisuspensioonitilkades bakterite arvukuse erinevus

vea piiresse ehk aluse materjalist bakterite arvukuse vähenemine ei sõltunud. Väiksem

bakterite arvukus 20-minutilise ekspositsiooni järel võib olla tingitud sellest, et 20 minutiga

hakkas 10 µl suurune bakterisuspensioonitilk kõrgest suhtelisest õhuniiskusest (90%)

hoolimata kuivama ning osad bakterid hukkusid kuivamise tõttu.

Tulenevalt sellest, et 20-minutilise pimedas läbiviidud ekspositsiooni järel bakterite arvukus

aluse materjalist ei sõltunud, leidis kinnitust uurimistöös püstitatud hüpoteesi osa, kus väideti,

et TiO2 nanoosakestest valmistatud kiled ei avalda bakteritele lühikese aja jooksul märgatavat

mõju kui neid ei eksponeerita UV kiirgusele.

3.2.2. TiO2 nanokilede ja kontrollaluste mõju E. coli pSLlux’ile UV-valguses

Käesolevas uurimistöös püstitatud hüpoteesi peamiseks osaks oli, et TiO2 nanoosakestest

valmistatud kilede ergastamisel UV-kiirgusega on nende antibakteriaalne toime tõhusam kui

ainult UV-kiirgusel. Hüpoteesi kontrollimiseks eksponeeriti E. coli pSLlux’i TiO2

nanokiledele ja räni monokristallist alustele 20 minuti jooksul UV-valguses. Antibakteriaalse

toime kiiruse hindamiseks määrati bakterite arvukus alusele kantud bakterisuspensiooni-

tilkades iga 5 minuti järel.

Visuaalse hinnangu alusel (lisa 3.1.) võib väita, et TiO2 nanokiled omavad UV-kiirgusega

ergastades märkimisväärset antibakteriaalset toimet – 10-minutilise ekspositsiooni järel

kasvab aluselt pestud bakterisuspensioonitilgast kontrolliga võrreldes välja tunduvalt vähem

bakterikolooniaid, 15-minutilise ekspositsiooni järel on alles jäänud vaid üksikud kolooniad

ning 20-minutilise ekspositsiooni järel on bakterid kaotanud võime moodustada tardsöötmele

kolooniaid. Räni monokristallil UV-kiirgusele eksponeeritud bakterite puhul on samuti näha

ajast sõltuvat antibakteriaalset toimet, ent oma ulatuselt on see tunduvalt väiksem kui TiO2

nanokiledel UV-kiirguses.

Joonisel 8 on toodud bakterite arvukuse määramisel saadud tulemused (lugemise andmed on

lisas 3.2.). Bakterite arvukuse võrdlemisel võeti aluseks punktis 3.2.1. toodud 0 min

26

vastavatel alustel eksponeeritud bakterisuspensiooni CFU. Joonisel väljendub selgelt UV-

kiirguse ning TiO2 nanokilede toime ajas. Nimelt avaldus TiO2 nanokilede antibakteriaalne

mõju juba pärast 5-minutilist eksponeerimist, kui räni monokristallilt pestud

bakterisuspensioonitilgaga võrreldes oli TiO2 nanokilelt pestud bakterisuspensioonitilgas

baktereid 49,5% vähem. Aja jooksul vähenes UV-kiirguse mõjul TiO2 nanokiledel olevas

bakterisuspensioonis koloonia moodustamise võimega bakterite hulk veelgi – 10 minuti

möödudes oli bakterite arvukus 1,6% esialgsest, 15 minuti möödudes 0,5% ja 20 minuti

möödudes ei moodustunud tardsöötmele külvatud bakterisuspensioonitilkadest enam ühtegi

kolooniat.

Joonis 8. Räni monokristallist alustel (sinine) ja TiO2 nanokiledel (hall) UV-kiirgusele

eksponeeritud E. coli pSLlux bakterisuspensiooni kolooniat moodustavate ühikute arv

võrreldes 0 min alustel eksponeeritud bakterisuspensiooni kolooniat moodustavate ühikute

arvuga. Tulbad tähistavad vähemalt kolme lugemise keskmist tulemust, veapiirid

standardhälvet.


Räni monokristallist alustel, kus bakteritsiidselt mõjus ainult UV-kiirgus, kahanes bakterite

arvukus võrreldes TiO2 nanokiledega palju aeglasemalt (joonis 8) ning pärast 20-minutilist

eksponeerimist oli räni monokristallist alustelt pestud bakterisuspensioonitilkades alles 11,3%

bakteritest. Samas ei olnud selles katses nähtud mõju seletatav ainult tilga kuivamisega, sest

74.1%

52.3%

41.5%

11.3%

24.6%

1.6%

0.5%

0.0%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 min 5 min 10 min 15 min 20 min

Ekspositsiooniaeg

E. c

oli

pSL

lux

arvu

kus

võrr

eld

es

kon

tro

llig

a (e

ksp

on

ee

ritu

d 0

min

),

% C

FU/m

l

Eksponeeritud Si alustele

Eksponeeritud TiO₂ nanokiledele

27

võrreldes pimedas räni monokristallil läbi viidud ekspositsiooniga (joonis 7) oli 20 minuti

möödudes bakterite arvukus üle 3 korra madalam.

UV-kiirguses läbiviidud ekspositsiooni käigus täheldati antibakteriaalset mõju nii räni

monokristallist alustel kui TiO2 nanokiledel, kusjuures viimastel oli efekt tunduvalt suurem.

Arvestades seda, et soodsates tingimustes kahekordistub E. coli pSLlux’i arvukus 1 tunniga

(joonis 4) ning optimaalsetes tingimustes võib pooldumiseks vajaminev aeg olla veelgi lühem,

võib 15 minutit TiO2 nanokiledel UV-kiirgusele eksponeeritud bakterikultuuri arvukus heasse

kasvukeskkonda sattudes jõuda vähem kui 8 tunniga 0,5%-lt tagasi esialgse arvukuseni ehk

100%-ni. Seega omab antibakteriaalsete pindade väljatöötamise seisukohast olulist rolli vaid

tulemus, kus tardsöötmele ei moodustu enam ühtegi bakterikultuuri. Selline tulemus saadi

käesolevas uurimistöös bakterikultuuri 20 minutit TiO2 nanokiledel UV-kiirgusele

eksponeerides, kusjuures kinnitust leidis püstitatud hüpotees, mille kohaselt TiO2

nanoosakestest valmistatud kilede ergastamisel UV-kiirgusega on nende antibakteriaalne

toime tõhusam kui ainult UV-kiirgusel.

Tulenevalt sellest, et TiO2 nanokilede mõju avaldus ainult neid UV-kiirgusega ergastades,

võib eeldada, et UV-kiirguse energia aktiveeris TiO2 nanoosakesed, mille tulemusena need

omandasid võime läbi viia fotokatalüütilisi protsesse. Varasemalt on kirjanduses pakutud, et

fotokatalüütilise oksüdatsiooni käigus tekkivad hüdroksüülradikalid reageerivad bakterite

rakumembraanidega ning kahjustavad neid (Foster et al. 2011). Kuna antud uurimistöös oli

E. coli pSLlux’i välismembraan TiO2 nanokile pinnaga vahetus kokkupuutes, siis kehtis

taoline mehhanism suure tõenäosusega ka selle töö raames läbiviidud katsetes.

Paralleelselt käesolevas uurimistöös tehtud katsetega viis Meeri Visnapuu Tartu Ülikooli

Füüsika Instituudis samadel alustel samade tingimuste juures läbi ekspositsiooni E. coli

pSLlux’iga, mida ta peale eksponeerimist visualiseeris skaneeriva elektronmikroskoobiga

(lisa 4.). Saadud SEM-i piltidel on näha, et bakterite kuju ja välimus ei muutu ajas oluliselt,

kui neid eksponeerida pimedas TiO2 nanokiledele või räni monokristallist alustele pimedas

või UV-kiirguses. Teisalt on 20 minutit TiO2 nanokiledel UV-kiirgusele eksponeeritud

bakterite morfoloogia märgatavalt erinev ning tundub, et bakterirakk on laiali valgunud, mis

viitab suurtele membraanikahjustustele. Täiendavalt vaadeldi bioloogiliste membraanide

koosseisus kõrgelt esindatud küllastunud ja küllastumata rasvhapete lagunemist UV-kiirguse

toimel samade TiO2 nanokilede pinnal röntgenfotoelektronspektroskoopia (XPS) tehnikaga.

Selle meetodiga nähti, et rasvhapped oksüdeeruvad ning lagunevad juba 10-minutilise

28

ekspositsiooni tagajärjel, mis kinnitab veelgi seda, et TiO2 nanokiled omavad antibakteriaalset

toimet, kuna nad kahjustavad rakumembraane. Siiski ei saa rasvhapete lagunemise tulemusi

otse üle kanda bakterirakkudele, kuna viimastel on olemas erinevad kaitsemehhanismid

raskete keskkonnatingimustega toimetulekuks. (Visnapuu 2014)

Käesoleva töö tulemusena võib järeldada, et uuritud TiO2 nanoosakestest valmistatud

õhukesed kiled omavad UVA-kiirgusega aktiveerides kiiresti avalduvat tugevat

antibakteriaalset mõju. Nende kilede antibakteriaalse toime mehhanism seisneb bakteriraku

membraani kahjustamises, mille tulemusena bakterirakk hävib. Kuna UV-kiirguse

puudumisel uuritud TiO2 nanokiled rakkudele kahjulikku mõju ei omanud, siis on taolistel

kiledel kõrge potentsiaal isepuhastuvate katetena näiteks meditsiinis või toiduainetetööstuses.

29

Kokkuvõte

Titaandioksiidi nanoosakesed leiavad kasutust väga erinevates rakendustes, mis sageli

põhinevad TiO2 omadusel neelata lühilainelist valgust, mille käigus oksüdeeritakse orgaanilisi

molekule. Üheks hetkel arenemisjärgus olevaks TiO2 nanoosakeste rakendusalaks on

isepuhastuvad katted, mis leiaksid kasutust nii meditsiinis, toiduainetetööstuses kui ka

igapäevaelus aknaklaasidel.

Käesoleva töö eesmärkideks oli uurida, kas anataasi kristallstruktuuriga TiO2 nanoosakestest

valmistatud õhukesed kiled omavad antibakteriaalset toimet, milline on UVA-kiirguse toime

bakteritele, ning kas TiO2 nanoosakestest valmistatud õhukesi kilesid on võimalik UVA-

kiirgusega aktiveerida, saamaks tõhusamat antibakteriaalset toimet. Uurimistöös püstitatud

hüpotees leidis kinnitust: ergastades TiO2 nanoosakestest valmistatud kilesid UVA-

kiirgusega, on nende antibakteriaalne toime tõhusam, kui ainult UVA-kiirgusel või TiO2

nanokiledel pimedas.

Hüpoteesi tõestamiseks eksponeeriti Escherichia coli pSLlux bakterikultuuri TiO2

nanokiledel UVA-kiirgusele. Kontrollidena kasutati UVA-kiirgusele eksponeeritud E. coli

pSLlux bakterikultuuri räni monokristallist alustel ning bakterikultuuri TiO2 nanokiledel ja

räni monokristallist alustel pimedas. Ekspositsiooni lõppedes külvati bakterid LB

tardsöötmele ning analüüsiti nende arvukust.

Saadud katsetulemused näitasid selgelt, et UVA-kiirgus annab uuritud TiO2 nanokiledele

bakteritsiidse toime, sest juba viie minutiga vähenes bakterite arvukus TiO2 nanokiledel

märgatavalt rohkem kui räni monokristallist alustel. 20-minutilise ekspositsiooni järel TiO2

nanokilel enam elujõulisi baktereid ei leidunud, samas räni monokristallist alustel oli alles

umbes kümnendik bakteritest. Ilma UV-kiirgusega ergastamata TiO2 nanokiledel märgatav

antibakteriaalne toime puudus, seega oli UV-kiirgus vajalik TiO2 nanoosakeste

fotokatalüütiliseks aktiveerimiseks. Võrreldes saadud tulemusi teiste samalaadsete uuringute

tulemustega pakuti välja, et TiO2 nanokilede antibakteriaalse toime mehhanism seisneb

bakteriraku membraani kahjustamises.

30

Uurimistöö käigus kogutud andmete põhjal saab järeldada, et töös kasutatud TiO2 nanokiled

omavad kõrget potentsiaali isepuhastuvate katetena näiteks meditsiinis või

toiduainetetööstuses.

Antud töö edasiarendusena tuleks uurida samade kilede toimet teistele bakteriliikidele

veendumaks, et antibakteriaalne toime on universaalne. Lisaks tuleks meditsiinirakenduste

puhul viia läbi katsed imetajate rakukultuuridega, et välistada TiO2 nanokiledest tulenevad

ohud tavatingimustes. Selgitamaks välja uuritud TiO2 nanokilede täpset antibakteriaalset

mehhanismi, tuleks jätkata fotokatalüütilise mehhanismi-alaseid uuringuid. Kuigi töös

kasutatud TiO2 nanokiled olid kirjanduses varem uuritud kiledega võrreldes väga efektiivsed,

võib alternatiivse suunana keskenduda veelgi efektiivsemate antibakteriaalsete pindade

väljatöötamisele.

31

Kasutatud materjalid

Alberts, B., Johnson, A.; Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2002) Molecular

biology of the cell, fourth edition. New York: Garland Science.

Aminedi, R., Wadhwa, G., Das, N., Pal, B. (2013) Shape-dependent bactericidal activity of

TiO2 for the killing of Gram-negative bacteria Agrobacterium tumefaciens under

UV torch irradiation. Environmental Science and Pollution Research, nr 20(9),

lk 6521-6530.

Armelao, L., Barreca, D., Bottaro, G., Gasparotto, A., Maccato, C., Maragno, C.,

Tondello, E., Štangar, U. L., Bergant, M., Mahne, D. (2007) Photocatalytic and

antibacterial activity of TiO2 and Au/TiO2 nanosystems. Nanotechnology, nr 18(37),

artikkel 375709.

Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. (2013) A review of the biomaterials

technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials, nr 34(34), lk 8533-8554.

Cushnie, T. P. T., Robertson, P. K. J., Officer, S., Pollard, P. M., Prabhu, R., McCullagh, C.,

Robertson, J. M. C. (2010) Photobactericidal effects of TiO2 thin films at low

temperatures – A preliminary study. Journal of Photochemistry and Photobiology A:

Chemistry, nr 216 (2-3), lk 290-294.

Foster, H. A., Ditta, I. B., Varghese, S., Steele, A. (2011) Photocatalytic disinfection using

titanium dioxide: spectrum and mechanism of antimicrobial activity. Applied

Microbiology and Biotechnology, nr 90(6), lk 1847-1868.

Gupta, S. M., Tripathi, M., (2011) A review of TiO2 nanoparticles. Chinese Sci Bull, nr 56,

lk 1639−1657.

Hain, E., Happonen, P., Holopainen, M., Sotkas, P., Tenhunen, A., Tihtarinen-Ulmanen, M.,

Venäläinen, J. (2012) Bioloogia gümnaasiumile 1. Tallinn: Avita.

http://link.springer.com/journal/11356

32

Ivask, A., Kahru, A., Virta, M. (2007) Recombinant whole-cell bioreporter systems based on

beetle luciferases. Handbook of Biosensors and Biochips. West Sussex, England: John

Wiley & Sons Ltd, lk 163-172.

Ivask, A., Rõlova, T., Kahru, A. (2009) A suite of recombinant luminescent bacterial strains

for the quantification of bioavailable heavy metals and toxicity testing. BMC

Biotechnology, nr 9(41), lk 1-15.

Joost, U., Saarva, A., Visnapuu, M., Nõmmiste, E., Utt, K., Saar, R., Kisand, V. (2014)

Purification of titania nanoparticle thin films: Triviality or a challenge? Ceramics

International, nr 40(5), lk 7125-7132.

Kahru, A., Lippmaa, E. (2010) Nanode ilu ja valu. Horisont, nr 3, lk 8-14.

Kivisaar, M. (2000) Bakteriraku ehitus ja metabolismi regulatsiooni üldpõhimõtted. Loetud:

http://www.ebc.ee/loengud/maia_gen/bf1.htm, 12.02.2014.

Kändler, T. (2009) Metallilised nanoosakesed ei ole elusolenditele ohutud. Loetud:

http://epl.delfi.ee/news/melu/metallilised-nanoosakesed-ei-ole-elusolenditele-

ohutud.d?id=51182308, 8.12.2013.

Kühn, K. P., Chaberny, I. F., Massholder, K., Stickler, M., Benz, V. W., Sonntag, H.-G.,

Erdinger, L. (2003) Disinfection of surfaces by photocatalytic oxidation with titanium

dioxide and UVA light. Chemosphere, nr 53(1), lk 71-77.

Macwan, D. P., Dave, P. N., Chaturvedi, S. (2011) A review on nano-TiO2 sol–gel type

syntheses and its applications. Journal of Materials Science, nr 46(11), lk 3669-3686.

Microbiology; Microbiology of food and animal feeding stuffs, 2008. General requirements

and guidance for microbiological examinations : EVS-EN ISO 7218:2008. Tallinn :

Standardiamet

Moan, J. (2004) Visible Light and UV Radiation. Loetud: http://www.uio.no/studier/emner/

matnat/fys/FYS3610/h04/undervisningsmateriale/Moan7.pdf, 20.02.2014

Nanotehnoloogia tumedam külg. Eesti Looduse kodulehekülg. Loetud:

http://www.eestiloodus.ee/uudised300.html, 08.12.2013.

http://www.ebc.ee/loengud/maia_gen/bf1.htm

http://epl.delfi.ee/news/melu/metallilised-nanoosakesed-ei-ole-elusolenditele-ohutud.d?id=51182308

http://epl.delfi.ee/news/melu/metallilised-nanoosakesed-ei-ole-elusolenditele-ohutud.d?id=51182308

http://link.springer.com/journal/10853

http://www.uio.no/studier/emner/%20matnat/fys/FYS3610/h04/undervisningsmateriale/Moan7.pdf

http://www.uio.no/studier/emner/%20matnat/fys/FYS3610/h04/undervisningsmateriale/Moan7.pdf

http://www.eestiloodus.ee/uudised300.html

33

Piccino, F., Gottschalk, F., Seeger, S., Nowack, B. (2012) Industrial production quantities and

uses of ten engineered nanomaterials in Europe and the world. Journal of Nanoparticle

Research, nr 14(9), artikkel 1109.

Prescott, L. M., Harley, J. P., Klein, D. A. (1999) Microbiology, fourth edition. The United

States of America: McGraw-Hill Companies.

Saarva, A. (2013) Titaandioksiidi nanoosakeste puhastamine : bakalaureusetöö. Tartu Ülikool,

Tartu.

Sarapuu, T. (2002) Bioloogia gümnaasiumile 1 osa. Tartu: Eesti Loodusfoto.

Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. (2007) Escherichia coli physiology in Luria-

Bertani broth. Journal of Bacteriology, vol 189, nr 23, lk 8746-8749.

Sunada, K., Watanabe, T., Hashimoto, K. (2003) Studies on photokilling of bacteria on TiO2

thin film. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, nr 156(1),

lk 227-233.

The Nanodatabase. Loetud: http://nanodb.dk/material/titandioxid, 18.02.2014.

Visnapuu, M. Nano-TiO2 kilede antibakteriaalsus. Bioloogiliste proovide TEM. Ettekanne

KBFI Keskkonnatoksikoloogia laboratooriumi seminaril. Tallinn: 05.02.2014.

Wang, R.-M., Wang, B.-Y., He, Y.-F., Lv, W.-H., Wang, J.-F. (2009) Preparation of

composited Nano-TiO2 and its application on antimicrobial and self-cleaning coatings.

Polymers for Advanced Technologies, nr 21(5), lk 331-336.

Weir, A., Westerhoff, P., Fabricius, L., Hristovski, K., von Goetz, N. (2012) Titanium dioxide

nanoparticles in food and personal care products. Environmental Science & Technology,

nr 46(4), lk 2242-2250.

Yeung, K. L., Leung, W. K., Yao, N., Cao, S. (2009) Reactivity and antimicrobial properties

of nanostructured titanium dioxide. Catalysis Today, nr 143(3-4), lk 218-224.

http://nanodb.dk/material/titandioxid

34

Tänuavaldused

Käesolev töö teostati Keemilise ja Bioloogilise Füüsika Instituudi Keskkonnatoksikoloogia

Laboratooriumi In vitro ja ökotoksikoloogia grupis.

Kõige rohkem tahan tänada oma juhendajat KBFI ja TTÜ doktoranti Katre Juganson’i, kes

aitas leida vajalikke teoreetilisi materjale, ette valmistada katseid ning vastas lahkelt kõikidele

küsimustele.

Soovin tänada ka KBFI Keskkonnatoksikoloogia Laboratooriumi juhatajat Anne Kahru’t ning

Tartu Ülikooli Füüsika Instituudi vanemteadurit Vambola Kisand’it, kes lubasid mul enda

laborites töötada.

Väga suur tänu KBFI vanemteadurile Angela Ivask’ile, kelle geneetiliselt muundatud

bakterikultuuri katsetes kasutati ning kes aitas lahendada kõikvõimalikke probleeme.

Tänan Tartu Ülikooli Füüsika Instituudi doktoranti Urmas Joost’i, kes sünteesis vajalikud

nanokiled, valmistas UV-lambi, aitas katsevahendeid kasutada ning vastas rõõmuga kõikidele

küsimustele.

Tänan KBFI teadurit Monika Mortimer’i, kes jagas enda teadmisi ning aitas probleemidele

lahendusi leida.

Tänusõnad kuuluvad ka Tartu Ülikooli doktorandile Meeri Visnapuu’le, kes aitas kaasa

katsete läbiviimisel ning tegi bakteritest pildid skaneeriva elektronmikroskoobiga.

Käesolevat tööd finantseerisid Eesti Teadusagentuur (grandid IUT23-5, IUT2-25,

SF0690063s08), Eesti Teadusfond (grant 8561), Eesti Nanotehnoloogiate Arenduskeskus

(EU29996), ERDF projektid (‘‘IRGLASS’’ 3.2.1101.12 0027, ‘‘TRIBOFILM’’ 3.2.1101.12-

0028, “Nano-Com” 3.2.1101.12-0010, „High-technology Materials for Sustainable

Development” TK117, “Mesosystems: Theory and Applications” TK114) ja doktorikool

“Funktsionaalsed materjalid ja tehnoloogiad” (ETF projekt 1.2.0401.09-0079).

35

Lisa 1 Skaneeriva elektronmikroskoobi pilt TiO2 nanokilest

Allikas: Joost et al. 2014

36

Lisa 2 Bakterite eksponeerimine alustele pimedas

Lisa 2.1. Pimedas TiO2 nanokiledele ja räni monokristallist alustele eksponeeritud E.

coli pSLlux’i kolooniad tardsöötmel.

Fotodel kujutatud kolooniad kasvatati tardsöötmel üleöö 30 °C juures alustelt pestud E. coli

pSLlux’i tilga lahjendustest. Fotod valiti kolme paralleeli hulgast nii, et need iseloomustaks

enim keskmist tulemust. Fotod on tehtud pimedas.

Autori fotod

Lisa 2.2. Pimedas TiO2 nanokiledele ja räni monokristallist alustele eksponeeritud

E. coli pSLlux’i arvukuse hindamine

0 min, räni monokristallist alusel 0 min, TiO2 nanokilel

Kolooniate arv

CFU/ml %

Kolooniate arv

CFU/ml % 102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

1. katse N/A 198 23 N/A 1.34*10

7 101.6 N/A 72 9 N/A 4.91*10

6 81.0

N/A 198 16 N/A 1.30*107 98.4 N/A 103 16 N/A 7.21*10

6 119.0

2. katse

N/A N/A 151 17 1.02*108 90.3 N/A N/A 78 15 5.64*10

7 71.0

N/A N/A 171 20 1.16*108 102.7 N/A N/A 100 8 6.55*10

7 82.4

N/A N/A 179 20 1.21*108 107.0 N/A N/A 186 6 1.16*10

8 146.6

Keskmine 100.0 100.0

Standardhälve 6.2 31.8

*N/A – antud lahjenduse juures kolooniate arvu ei loetud

37


Kolooniate arv

CFU/ml %

Kolooniate arv

CFU/ml % 102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

2. katse

N/A N/A 69 4 4.42*107 39.2 N/A N/A 30 7 2.24*10

7 28.2

N/A N/A 76 18 5.70*107 50.5 N/A N/A 73 4 4.67*10

7 58.8

N/A N/A 40 8 2.91*107 25.8 N/A N/A 33 9 2.55*10

7 32.1

Keskmine 38.5 39.7



38

Lisa 3 Bakterite eksponeerimine alustele UV-valguses

Lisa 3.1. TiO2 nanokiledel ja räni monokristallist alustel UV-kiirgusele eksponeeritud

E. coli pSLlux’i kolooniad tardsöötmel.

Fotodel kujutatud kolooniad kasvatati tardsöötmel üleöö 30 °C juures alustelt pestud E. coli

pSLlux’i tilga lahjendustest. Fotod valiti kolme paralleeli hulgast nii, et need iseloomustaks

enim keskmist tulemust. Fotod on tehtud pimedas.

Autori fotod

Lisa 3.2. TiO2 nanokiledel ja räni monokristallist alustel UV-kiirgusele eksponeeritud

E. coli pSLlux’i arvukuse hindamine


Kolooniate arv

CFU/ml %

Kolooniate arv

CFU/ml % 102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

1. katse N/A 115 17 N/A 8.00*10

6 60.7 140 15 2 N/A 9.39*10

5 15.5

N/A 165 19 6 1.12*107 84.6 170 17 1 N/A 1.13*10

6 18.7

2. katse

N/A N/A 143 17 9.70*107 86.0 N/A N/A 44 3 2.85*10

7 35.9

N/A N/A 104 13 7.09*107 62.9 N/A N/A 47 4 3.09*10

7 38.9

N/A N/A 135 7 8.61*107 76.3 N/A 157 27 0 1.12*10

7 14.0

Keskmine 74.1 24.6



39


Kolooniate arv

CFU/ml %

Kolooniate arv

CFU/ml % 102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

1. katse N/A 69 12 2 4.91*10

6 37.2 52 5 N/A 1 3.45*10

5 5.70

N/A 106 11 1 7.09*106 53.8 15 N/A 1 N/A 9.09*10

4 1.50

2. katse

N/A N/A 94 9 6.24*107 55.4 91 15 2 N/A 6.42*10

5 0.81

N/A N/A 84 10 5.70*107 50.5 4 0 0 N/A 2.42*10

4 0.03

N/A N/A 107 13 7.27*107 64.5 7 1 N/A N/A 4.85*10

4 0.06

Keskmine 52.3 1.62




Kolooniate arv

CFU/ml %

Kolooniate arv

CFU/ml % 102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

1. katse N/A 37 4 N/A 2.48*10

6 18.9 0 0 0 N/A 0.00 0.00

N/A 119 15 N/A 8.12*106 61.6 6 2 1 N/A 4.85*10

4 0.80

2. katse

N/A N/A 68 10 4.73*107 41.9 0 0 N/A N/A 0.00 0.00

N/A N/A 67 13 4.85*107 43.0 170 20 N/A N/A 1.15*10

6 1.45

N/A N/A 72 6 4.73*107 41.9 4 0 N/A N/A 2.42*10

4 0.03

Keskmine 41.5 0.46




Kolooniate arv

CFU/ml %

Kolooniate arv

CFU/ml % 102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

102x

lahj.

103x

lahj.

104x

lahj.

105x

lahj.

2. katse

N/A 93 4 N/A 5.88*106 5.2 0 0 N/A N/A 0.0 0.00

N/A 148 25 5 1.05*107 9.3 0 0 N/A N/A 0.0 0.00

N/A N/A 33 3 2.18*107 19.4 0 0 N/A N/A 0.0 0.00

Keskmine 11.3 0.00



40

Lisa 4 Skaneeriva elektronmikroskoobi pilt räni

monokristallist alusel ja TiO2 nanokilel UV-kiirgusele ja

pimedas eksponeeritud E. coli pSLlux rakkudest

Allikas: Visnapuu 2014

41

Resümee

Viimastel aastakümnetel on nanotehnoloogiad väga kiiresti arenenud. Võrreldes tavasuuruses

materjalidega on uudsetel nanomaterjalidel suurusest sõltuvad füüsikalised ja keemilised

omadused (nt suurem eripind, kvantefektid). Titaandioksiidi nanoosakesed on kasutust

leidnud väga erinevates rakendustes alates värvidest isepuhastuvate pindade ning

päikesepatareideni. Mitmetes sellistes rakendustes kasutatakse nano-TiO2 omadust neelata

lühilainelist kiirgust, mille käigus tekkivad hüdroksüülradikaalid võivad oksüdeerida

orgaanilisi ühendeid.

Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida TiO2 nanokilede toimet UV-valguses.

TiO2 nanokilede toime uurimiseks kasutati rekombinantset bioluminestseeruvat bakterit

Escherichia coli MC1061 (pSLlux), mille suspensiooni tilk asetati nanokilele, mida seejärel

eksponeeriti UV-kiirgusele 20 minutit. Kontrollidena eksponeeriti baktereid TiO2

nanokiledele pimedas ja keemiliselt inertsetele räni monokristallist alustele pimedas ja UV-

valguses. Pärast eksponeerimist pesti bakterid alustelt maha ning külvati agarsöötmetele.

Bakterite arvukust hinnati kolooniate kokku lugemisega.

Katsetulemused näitasid, et UV-kiirgusel on 20 minutilise ekspositsiooni järel üsna nõrk

antibakteriaalne mõju, ent kui kombineerida seda TiO2 nanokiledega, kaotavad bakterid sama

ajaga võime tardsöötmele kolooniaid moodustada. Pimedas läbiviidud kontrollkatse

antibakteriaalset mõju praktiliselt ei omanud. Tõenäoliselt põhjustas TiO2 nanokilede

antibakteriaalset mõju nende võime bakteriraku membraanikomponente fotokatalüütiliselt

lagundada. Uurimistöö põhjal saab väita, et töös kasutatud TiO2 nanokilede fotokatalüütilisel

aktiveerimisel omandavad need tugeva bakteritsiidse toime. Töö käigus kogutud andmete

põhjal saab järeldada, et töös kasutatud TiO2 nanokiled omavad kõrget potentsiaali

isepuhastuvate katetena.

42

Abstract

Antibacterial effects of photocatalytic nanoparticulate TiO2 thin films

Over the past few decades nanotechnology has developed rapidly. Compared with bulk

materials, novel nanomaterials size-dependant physico-chemical properties (e.g., higher

specific surface area, quantum effects). Currently, titanium dioxide nanoparticles (nano-TiO2)

have found use in wide range of applications from pigments to self-cleaning surfaces, solar

cells and sunscreens. Many of these applications exploit the ability of nano-TiO2 to absorb

short-wavelength light resulting in generation of reactive hydroxyl radicals that can oxidize

organic compounds.

The aim of the current work was to observe the antibacterial effects of nano-TiO2 thin films

under UV light.

The photocatalytic activity of nano-TiO2 films against recombinant constitutively

bioluminescent bacterium Escherichia coli MC1061 (pSLlux) was studied by adding a small

drop of bacterial suspension onto the film and exposing the samples to UV light for 20

minutes. Silicon wafers under UV light and respective treatments in dark were used as

controls. After incubation on the surfaces the colony forming ability of the bacteria was

estimated by plate count method.

The results of this study showed that UV light alone had only mild antibacterial effect in 20

minutes but in combination with nano-TiO2 thin films the bacteria completely lost their ability

to form colonies. For control, incubation of bacteria in the dark had only slight effect on

bacterial colony forming potential. The antibacterial effect of nano-TiO2 thin films was likely

caused by decomposition of membrane components. Hence, it can be concluded that

photocatalytic activation of nano-TiO2 thin films results in a significant antibacterial effect;

thus, the tested nano-TiO2 thin films have a strong potential as coatings for self-cleaning

surfaces.

tio nanoosakestest valmistatud nanokilede fotokatalüütiliste ......bakterid paljunevad suhteliselt...

Documents